KR101103571B1

KR101103571B1 - 피부조직 재생용 구조체 및 이를 이용한 인공피부

Info

Publication number: KR101103571B1
Application number: KR1020090089845A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 안승현; 윤현; 전욱
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2012-01-09
Also published as: KR20110032381A

Abstract

본 발명은 콜라겐 등의 조직공학용 생체적합성 재료를 이용한 피부조직 재생용 구조체에 관한 것으로서, 좀더 자세하게는 피부조직 재생을 위한 세포 배양용 구조체를 제조함에 있어서 콜라겐과 같은 생체적합성 재료를 극저온 플로팅법으로 제조한 분배 구조체 및 이를 이용한 인공피부에 관한 것이다.

피부 조직, 조직 재생용 구조체, 극저온법, 콜라겐, 인공피부

Description

피부조직 재생용 구조체 및 이를 이용한 인공피부{Scaffold for skin tissue regeneration and artificial skin using the same}

피부는 인체에서 가장 큰 기관이다. 피부는 주변 독성물질과 미생물로부터 인체를 보호하고 수분 증발을 방지한다(Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin.European Journal of Dermatology 2002, 12, 390). 일반적으로 인간의 피부는 두 개의 조직층으로 구성된다: 그 하나는 각화되고 층을 이룬 표피이고, 또 하나는 지지와 영양을 제공하는 콜라겐이 풍부한 진피 결합조직 기저층이다(Freyman, T.M, Yannas, I.V., Gibson, L.J. Cellular materials as porous scaffolds for tissueengineering. Progress in Materials Science 2001, 46, 273). 상처를 입거나 손상된 피부는 이종조직이식(xenografts), 동종이식(allografts) 및 자가이식(autografts)과 같이 다양한 원 천으로부터 재생된다. 그러나, 항원성(antigenicity) 및 주게의 제한된 면적(limited donor sites) 등으로 인해 이와 같은 피부 대체물은 피부 재생 목적을 이루기가 용이하지 않다(Boyce, S.T. Design principles for composition and performance of cultured skin substitutes. Burns 2001, 27, 523. Schul, J.T., Tompkins, R.G., Burks, J.F. Artificial Skin. Annu. Rev. Med. 2000, 51, 231. Yanas, I.V., Burke, J.F. J. Design of an artificial skin. I. Basic design principles. Biomed. Mater. Res. 1980, 14, 465. Bell, E., Ehrlich, H.P., Battle, D.J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science 1981, 211, 1052). 그리하여 피부 조직 재생에 관한 조직공학적 접근이 요구되고 있다(Langer, R., Vacanti, J.P. Tissue engineering. Science 1993, 260, 920. Yannas, I.V., Lee, E., Orgill, D.P., Skrabut, E.M., Murphy, G.F. Synthesis and characterization of a model extracellular matrix that induces partial regeneration of adult mammalian skin. Proc. Nat. Acad. Sci. 1989, 86, 933).

조직공학에서 결정적인 인자는 구조체 제조이다. 피부 재생을 유도하는 이상적인 구조체를 제조하기 위하여, 생체 재료는 뛰어난 생체적합성, 적절한 마이크로구조(예컨대 평균 공극 크기 100-200㎛와 90% 이상의 공극률), 조절 가능한 생분해성(controllable biodegradability) 및 적절한 기계적 특성을 나타내어야 한다(Chen, G.P., Ushida, Y., Tateishi, T. Scaffold design for tissue engineering. Macromolecular Biosci. 2002, 2, 67). 널리 이용되는 피부 조직 재 생용 합성 및 천연 폴리머로는 셀룰로스 유도체, 카라기난(carrageenan), 폴리아크릴산, 폴리(비닐알콜), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 실리콘, 알지네이트 및 콜라겐 등이 있다(Valenta, C., Auner, B.G. The use of polymers for dermal and transdermal delivery.Biopharm. 2004, 58, 279). 구조체의 기계적, 생물학적 기능을 향상시키기 위하여 콜라겐/키토산(Ma, L., Gao, C., Mao, Z., Zhou, J., Shen, J., Hu, X., Han, C. Collagen/chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering. Biomaterials 2003, 24, 4833), 폴리카프로락톤/콜라겐(Dai, N.T., Williamson, M.R., Khammo, N., Adams, E.F., Coombes, A.G. Composite cell support membranes based on collagen and polycaprolactone for tissue engineering of skin. Biomaterials 2004, 25, 4263) 및 폴리(락틱-코-글라이콜산)/콜라겐 하이브리드 메쉬(Chen, G., Sato, T., Ohgushi, H., Ushida, T., Tateishi, T., Tanaka, J. Culturing of skin fibroblasts in a thin PLGA-collagen hybrid mesh. Biomaterials 2005, 26, 2559)와 같은 복합 재료가 이용되고 있다.

특별히 콜라겐은 조직공학에 있어서 가장 장래성 있는 구조체 재료로 인식되고 있다. 콜라겐은 다양한 교차결합제(cross-linking agents)를 이용하여 구조체의 기계적 성질을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 뛰어난 생체적합성과 생분해성으로 인해 조직공학에 이용되고 있다(Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin Tissue Engineering for Tissue Repair and Regeneration. Tissue Engineering 2008, 14, 105).

그렇지만, 가장 천연적인 생체재료 예컨대, 알지네이트 및 실크 피브로인과 마찬가지로 콜라겐은 실온에서 가공성(processability)이 낮고 매우 높은 친수성으로 인해 직접 쾌속성형 공정(direct rapid-prototyping process)으로 제조될 때 정확히 제어된 공극 구조를 갖는 입체 콜라겐 구조체를 얻기가 어렵다. 일반적으로 다공성 3차원 콜라겐 구조체는 동결건조 및 임계점 건조방법으로 제조된다. 제조된 구조체는 광범위한 공극 크기 분포를 나타내며, 공극 구조를 제어하기가 어렵다. 이러한 문제점들을 해결하기 위하여 간접 임의형상제작(indirect solid freeform fabrication) 및 저온 직접 플로팅 방법이 사용되었다(Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszk, J.T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials 2003, 24, 1487. Xiong, Z., Yan, Y., Wang, S., Zhang, R., Zhang, C. Fabrication of porous scaffolds for bone tissue engineering via low-temperature deposition. Scripta Materialia 2002, 46, 771). 그럼에도 불구하고, 입체 콜라겐 구조체를 제조하는 이러한 방법들은 정확히 제어되는 공극 구조를 제조함에 있어서 많은 어려움이 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하고 우수한 기계적 성질을 나타냄과 아울러 공극률과 공극 크기를 조절할 수 있는 3차원 피부조직 재생용 구조체 및 이를 이용한 인공피부 또는 인공진피를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 극저온 시스템이 부가된 3차원 분배 시스템을 이용하여 공극률이 높은 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제조하였다. 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 320㎛ 두께의 콜라겐 가닥으로 이루어진 적층 구조체를 디자인하여 제조하였다. 본 발명자들은 각질세포/섬유아세포를 구조체에서 인 비트로 공동배양하여 이 구조체가 피부 조직 재생에 적합함을 밝혔다. 섬유아세포는 구조체 내에 잘 분포하였고, 각질세포는 잘 디자인된 공극 구조를 통해 원활히 이동하였으며, 구조체 상단 표면 상에서 분화하였다. 분화된 각질세포는 3차원 분배 구조체 내에서 일반 피부조직과 유사하게 각질층을 형성하였다. 또한, 가닥 사이의 세포 집적도와 각질세포의 이동은 구조체 공극 크기에 영향을 받았다.

본 발명자들은 피부세포 재생용 3차원 구조체를 제조하는 플로팅 시스템을 이용하여 구조체를 제조함에 있어서, 극저온 스테이지를 이용하는 3차원 구조체 제조방법을 이용하였다. 즉, 본 발명자들은 노즐에서 콜라겐과 같은 수용성 재료가 분출되어 구조체를 형성할 때 수용성 재료가 닿거나 적층되게 되는 스테이지를 극 저온으로 유지함으로써 상온에서 3차원 입체 형상으로 제조하기 어려운 수용성 재료 구조체를 제조할 수 있었다. 이 방법을 이용하여 본 발명자들은 수직으로 교차하는 가닥들을 층층이 쌓아 95% 이상의 다공구조(공극률)를 가진 콜라겐 구조체를 제조하였다. 이러한 3차원 구조체는 최초의 디자인과 정확히 일치하였다.

본 발명은 플로팅 시스템을 이용하여 제조되는 피부조직 재생용 3차원 구조체에 있어서, 생체적합성 재료를 표면 온도가 -50~0℃로 유지되는 스테이지에서 3차원 구조체로 제조한 후 동결건조시킨, 공극 크기 100~300㎛, 공극률 90% 이상인 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다. 스테이지 표면 온도가 너무 낮으면 플로팅 시스템의 노즐에 영향을 주어 노즐 내의 구조체 재료가 얼어버려 작동되지 않는 문제가 발생하며, 너무 높은 온도에서는 특히 콜라겐과 같은 친수성 재료로 원하는 3차원 구조체를 형성하는 것이 어려워진다. 또한, 구조체의 공극 크기가 너무 작으면 섬유아세포나 각질세포 등 세포가 증식하기 어려워지며, 너무 큰 경우에도 세포 증식 효율이 낮아진다. 공극률은 90% 미만인 경우 세포 증식이 원활하지 않다. 공극률은 93% 이상 100% 미만이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 스테이지 표면 온도가 -40~-20℃임을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 스테이지가 동결건조 실리콘 오일을 스테이지 내부로 순환시켜 온도를 유지시키는 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부조직 재생용 3차원 구조체 제조공정에서 스테이지 주변의 질소 가스를 지속적으로 제거하여 수분을 조절함을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 동결건조 공정 이후 동결건조된 구조체의 가닥을 교차 결합시키는 공정이 부가되는 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 내부에 피부조직 재생용 생체적합성 구조체 재료를 내장하는 카트리지와, 상기 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 상기 카트리지에 내장된 피부조직 재생용 생체적합성 구조체 재료가 배출부재를 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 상기 구조체 재료를 배출시키는 배출부재 및 배출부재를 통해 배출되는 상기 구조체 재료가 그 위에 놓여 구조체를 형성하는 스테이지를 포함하여 이루어지되, 상기 스테이지의 표면 온도가 -50~0℃로 유지되도록 조절되는 것을 특징으로 하는 플로팅 시스템으로 제조된 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

상기 스테이지는 플로팅 시스템의 일 구성요소가 되도록 구성할 수 있으나, 스테이지를 제외한 구성요소들을 플로팅 시스템(구조체 제조장치)으로 형성하고, 스테이지는 별도로 분리하여 제조 및 사용하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 생체적합성 구조체 재료가 콜라겐, 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 프로테인 및 실크 피부로인 및 그들의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 수용성 재료임을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생체적합성 재료로서 키틴, 케라틴, 셀룰로오스, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브리노겐, 피브로모듈린, 라미닌, 테나신, 비트로넥틴 및 그들의 유도체 및 아가로스로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생체적합성 재료가 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}를 비롯한 조직공학에 사용되는 유기용매 용해성 재료 중 1종 이상의 재료로 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 유기용매 용해성 재료들은 콜라겐 등 수용성 재료와 같이 구조체 제조 중 가닥이 서로 닿을 때 용해되어 구조가 뭉개지는 현상은 없으나 본 발명의 극저온법을 이용하면 디자인된 3차원 구조체 제조가 용이하고 공극 크기 및 다공성이나 공극간 상호연결 정도 등을 조절하기가 용이해진다.

또한, 본 발명은 상기 피부조직 재생용 3차원 구조체에 섬유아세포, 피부세 포, 혈관 형성 내피세포 및 줄기세포 중 선택된 1종 이상을 포함하여 증식시킨 인공진피를 제공한다. 상기 인공진피는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하거나, 피부 미용용 또는 성형용 목적으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인공진피를 포함하는 피부 드레싱을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인공진피를 포함하는 피부 외용제 또는 화장료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인공진피에 각질세포, 혈관 형성 내피세포 및 줄기세포 중 선택된 1종 이상을 포함하여 증식시킨 인공피부를 제공한다. 상기 인공피부는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하거나, 피부 미용용 또는 성형용 목적으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인공피부를 포함하는 피부 드레싱을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인공피부를 포함하는 피부외용제 또는 화장료를 제공한다.

상기 인공진피 및/또는 인공피부를 포함하는 피부 드레싱 재료는 붕대, 거즈, 무균 포장재료, 하이드로겔, 하이드로콜로이드 및 유사재료를 비롯하여 당업계에서 사용되는 임의의 물질일 수 있다. 본 발명의 인공진피 및/또는 인공피부는 상기 피부 드레싱 재료에 함침되거나 공유 부착되어 사용될 수 있다. 본 발명에서 "피부 드레싱"은 넓은 부위의 피부를 커버할 수 있는 피부 커버링을 포함하는 의미로 사용하였다. 상기 피부 드레싱은 노화된 피부나 여드름 피부와 같은 트러블이 있는 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에서 건강한 피부의 발생을 촉진시키 거나 상처를 치료하기 위해 사용할 수 있으며, 피부미용용 또는 성형용으로 사용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 인공피부 및/또는 인공진피를 포함하여 국소 적용 가능한 피부 외용제 또는 화장료로 사용할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 가하거나 가하지 않고 국소도포에 적합한 상기 인공피부 및/또는 인공진피를 포함하는 피부 외용제를 제조하여 상처 치료나 피부미용, 성형용도 등으로 사용 가능하다.

본 발명의 인공진피 및/또는 인공피부를 함유하는 피부외용제는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제제화할 수 있고, 인공진피 및/또는 인공피부 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 액제, 연고, 에멀젼, 겔, 크림제, 페이스트제 등의 다양한 제형으로 제제화할 수 있다. 본 발명 피부외용제의 투여량에 특별한 제한은 없으나, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병이나 상태의 정도, 약물형태 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 피부외용제는 통상 1일 0.01~100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1~100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 내지 수회 나누어 투여할 수 있다. 담체로는 피부 외용제에 사용되는 담체로서, 인공피부 및/또는 인공진피의 구조 및 기능에 악영향을 미치지 않는 것이라면 특별한 제한은 없으며, 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜 등의 폴리올, 식물성유, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 혼합물을 포함하는 용매 등이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 인공진피 및/또는 인공피부를 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 인공진피 및/또는 인공피부를 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 제제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 인공진피 및/또는 인공피부를 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 화장료에는 pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화하여 노화 피부를 개선하는 등의 용도로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 피부조직 재생용 구조체, 인공진피 또는 인공피부에 다양한 생리활성물질을 부가할 수 있다. 생리활성물질은 특별한 제한은 없으며, 상기 구조체나 인공진피, 인공피부에서 세포의 부착 및 증식에 부정적인 영향을 미치지 않는 것이면 가능하다. 구체적인 예로는 항생제, 항바이러스제, 항균제, 핵산, 펩타이드 및 단백질 중 선택된 1종 이상을 부가하여 세포를 증식시킨 재생피부조직을 제공한다. 항생제, 항바이러스제, 항균제 등은 구조체 또는 재생피부조직의 감염을 막기 위한 것이고, 단백질로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 그룹 중 선택된 것임을 특징으로 한다.

플로팅 시스템은 내부에 구조체 재료를 내장하는 카트리지와, 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 카트리지에 내장된 구조체 재료가 배출부재를 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 노즐과 같은 배출부재를 구비한다. 상기 이송로봇에 의해 상하 및 좌우 방향으로 배출부재가 이동하면서 구조체 재료를 스테이지 상에 배출하면 스테이지 상에 패브릭 구조의 다공성 형상으로 구조체가 형성된다.

냉동 조건 하에서 플로팅 시스템을 이용하여 콜라겐 패브릭 구조체를 형성하는 기술이 중국 청화대학 연구팀에 의하여 2002년 발표된 적이 있었다(Scripta Materialia 46 (2002) 771.776). 그러나, 냉동 조건 하에서 플로팅 시스템을 작동시키는 경우 구조체 재료를 배출하는 배출부재가 막하게 되어 원하는 3차원 형상의 콜라겐 구조체를 원활히 제조하기가 매우 어렵다.

본 발명자들은 오랜 기간의 연구 끝에 콜라겐과 같은 수용성 생체적합성 재료를 이용한 구조체 제조시 사용되는 스테이지를 극저온으로 유지시킴으로써 배출부재가 막히는 문제를 해결함과 동시에 3차원 구조체를 잘 형성할 수 있음을 밝혀내었다.

이때 스테이지는 -50~0℃로 유지시키며, 바람직하게는 -40~-20℃로 유지시킨다. 그 위에 콜라겐 구조체를 형성시키는 스테이지의 온도가 하한보다 낮으면 작동시 플로팅 시스템의 배출부재(예컨대 노즐) 온도를 낮추게 되어 구조체 재료가 원활하게 배출되지 않으며, 상한보다 높은 경우에는 3차원 입체 형상의 구조체가 잘 형성되지 않고 뭉개진다.

상기 스테이지에는 온도 감지센서 및 온도 조절부재가 부착되어 있어서 원하는 온도로 고정시키거나, 또는 온도 범위를 정할 수 있고, 정해진 온도 또는 온도 범위를 벗어나는 경우에는 피드백 작용으로 온도를 적정하게 낮추거나 높일 수 있다. 온도 조절에 관한 상세한 사항은 기계 제어 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 극히 용이하게 실시하거나 재현할 수 있으므로 자세한 설명은 생략한다.

본 발명에서 콜라겐을 비롯한 수용성(친수성) 구조체 재료는 콜라겐만을 의미하는 것은 아니며, 생체적합성과 생분해성을 나타내는 수용성 구조체 재료는 특별한 제한 없이 적용 가능하다. 구체적인 예를 들면, 알지네이트, 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 실크 등을 폭넓게 포함하며, 뿐만 아니라, 구조체 재료에서 수용성 구조체 재료 함량이 50중량% 이상인 혼합재료인 경우에도 본 발명의 제조방법을 이용하여 3차원 입체 구조체를 형성하는 것이 가능하다. 본 발명에서는 편의상 대표적인 수용성 구조체 재료로서 콜라겐을 예로 들어 발명의 구성을 설명하였으나, 반드시 콜라겐으로만 한정되는 것이 아님을 다시 한 번 강조한다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이 본 발명의 방법은 수용성 재료 외에도 PGA, PLA 등 조직공학의 구조체를 형성하는데 널리 사용되는 유기용매 용해성 재료에도 적용할 수 있는데, 본 발명의 방법을 이용하면 통공의 크기나 통공간 상호 연결정도 등을 원하는 대로 조절할 수 있고, 좀 더 거친 표면의 구조체를 형성할 수 있기 때문이다. 나아가, 상기 수용성 재료와 상기 유기용매 용해성 재료의 혼합 재료에도 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면 3차원 구조체 제조에 있어서 콜라겐과 같은 가공성이 좋지 않은 수용성 재료의 경우에도 원하는 모양의 피부조직 재생용 3차원 구조체를 극저온 방법으로 원활히 제조할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면 조절된 공극 크기, 공극률 및 공극간 상호연결구조를 갖는 피부조직 재생용 3차원 구조체를 용이하게 그리고 재현 가능하도록 형성할 수 있다.

콜라겐, 알지네이트, 실크 등의 다양한 수용성 재료 및 폴리락틱산(PLA), 폴리글라이콜산(PGA) 등 다양한 유기용매 용해성 재료를 이용한 3차원 조직재생용 구조체 제조에 있어서, 본 발명의 방법을 이용하면 재생 가능한 피부조직 재생용 3차원 구조체를 생산할 수 있고, 종래 구조체의 문제점인 공극 크기 조절 및 공극간 상호 연결성이 낮은 문제점을 극복할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 이용하여 얻어진 최종 구조체는 높은 공극률(> 96%)을 나타낸다.

인체에서 가장 큰 기관으로서 피부는 침입에 대한 방어, 접촉 인지, 온도 조절 및 수분 손실 조절 등을 비롯하여 매우 중요한 기능을 수행한다. 피부는 두 개의 층으로 나뉘는데, 표피는 두꺼운 보호층을 형성하며 대부분 케라티노사이트로 구성된다. 진피는 콜라겐을 생산하는 섬유아세포, 혈관 형성 내피세포 및 기타 세포로 이루어진다. 본 발명의 3차원 콜라겐 구조체 내에서 세포 이동 효율을 평가하기 위하여 케라티노사이트/섬유아세포 혼합 배양 방법을 피부 조직 재생에 이용하였다. 구조체는 인공 피부조직 형성에 적합하였다.

본 발명의 피부조직 재생용 3차원 구조체는 3차원 플로팅 시스템을 극저온 스테이지와 짝지어 이용하여 제조하였다. 본 발명의 일 실시예에서 제조 스테이지의 온도는 비접촉 적외선 온도계(DT-8860B, CEM)를 이용하여 측정하였고, 스테이지의 온도는 두 개의 컴프레서로 조절되며, 동결건조 실리콘 오일이 제조 스테이지 내를 순환한다. 본 발명의 일 실시예에서 구조물 제조에는 타입 I 콜라겐을 이용하였다. 콜라겐은 0.05M 아세트산(pH 3.2)에 용해하였고, 4.5%(w/v)로 농도를 고정하였다. 콜라겐 용액은 플로팅 시스템으로 옮겼다.

피부조직 재생용 3차원 구조체 제조방법은 아래와 같다. 먼저, 3차원 구조체를 제조하기 위하여 가닥 두께와 공극 크기를 선택하였다. 그리고 나서, 구조체는 이송로봇으로 직접 구조체 재료를 쌓아 형성하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 구조체 재료가 쌓이는 스테이지 및 주변 온도는 각각 -40℃와 10℃로 고정하였다. 본 발명의 일 실시예에서 콜라겐 용액은 300㎛ 직경 플로팅 팁을 초당 7mm 움직이도록 하여 조절된 공기압(151±5kPa) 하에서 한 층 한 층 형성하였다. 막힘을 방지하기 위하여 배출부재(일 실시예로서 노즐)은 실리콘고무로 코팅하였다. 압출된 콜라겐 마이크로 가닥(350㎛ 직경)은 극저온 스테이지에 닿자마자 얼었다. 제조된 구조체 는 즉시 -76℃의 동결건조기에 3일 동안 넣어두었다. 그리고 나서 건조된 콜라겐 구조체를 교차 결합시키기 위하여 1~100mM의 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride) 95% 에탄올 용액에 실온에서 24시간 동안 침지하였다.

콜라겐 가닥은 30% 습도 조건에서 구조체로 제조되었고, 습도는 스테이지 주변의 질소가스를 지속적으로 제거함으로써 유지하였다.

스테이지 온도를 -50℃보다 낮게 조절하면 콜라겐 용액은 스테이지에 닿을 때 너무 빨리 얼었다. 그러나, -50~0℃ 범위 내, 더욱 바람직하게는 -40℃ ~ -20℃에서는 콜라겐 가닥은 구조체를 잘 형성하며 매우 안정적이다(데이타 나타내지 않음).

스테이지 온도가 -10℃보다 높으면 가닥은 직경이 약간 커지고, 0℃보다 높으면 가닥이 불균일하게 퍼져서 3차원 구조 형성이 불가능해진다.

몇몇 연구자들이 보고한 바에 의하면, 콜라겐은 피부조직공학에서 이상적인 구조체 재료이다. 특별히 공극 크기가 약 100~200㎛이고 공극률이 90% 이상인 콜라겐 구조체는 화상환자의 피부 재생에 이용되어 왔다.

콜라겐 구조체를 포함한 피부조직 재생용 구조체를 제조하는 본 발명의 새로운 기술은 3차원 플로팅 방법에 극저온 시스템을 적용한 것이다. 이 방법을 이용하면 디자인된 형상의 구조체를 형성할 수 있고 표면이 거칠게 개질된 콜라겐 구조체를 별도의 화학적 공정 없이 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 알지네이트 또는 실크와 같은 수용성 천연재료로부터 3차원의 디자인된 구조체를 제조하는데 이용할 수 있다. 구조체를 구성하는 콜라겐 가닥은 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 직경 250~500㎛ 범위 내에서 다양하게 선택 가능하고, 이 직경은 공정 변수에 따라 달라진다. 또한, 최종 구조체는 높은 공극률(> 96%)을 나타내며, 최초 디자인된 구조체에 비해 10% 미만으로 수축된다.

이하 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위에 한정되지 아니함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하며, 당업자라면 본 발명의 기술사상을 다양하게 변형 실시할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이러한 변형 실시에도 미친다는 것은 당업자에게 자명하다.

재료 및 방법

피부세포 재생용 구조체 제조에 타입-I 콜라겐 (Matrixen-PSP; 바이오랜드, 한국)을 이용하였다. 콜라겐 용액은 0.05 M 아세트산(pH 3.2)에 고정 농도 4.5% (w/v)로 제조하였다. 점도는 정해진 시간 간격마다 기록하였다. 세 개의 복제물에 대한 평균값이 축 속도(spindle speed)로 기록되었다. 측정된 콜라겐 용액의 점도는 20℃에서 32.8 Pa·s(축 속도 = 17 mms^-1)였다. 본 발명의 일 실시예에서 콜라겐 구조체를 제조하기 위한 극저온 3차원 플로팅 시스템은 3차원 로봇 시스템(DTR3-2210-TSG; 다사로봇, 한국), 분배 시스템(AD-3000C; 유진테크, 한국) 및 극저온 제 조 스테이지로 구성되었다. 본 발명의 일 실시예에서 극저온 냉동 시스템은 두 개의 컴프레서, 스테이지를 극저온 냉동시키기 위한 순환 실리콘 오일 및 순환펌프를 포함한다. 스테이지 온도는 컴프레서를 제어하여 목표 온도 ± 3℃로 유지되었다. 스테이지에는 계속하여 질소 가스를 가하여 주위의 습기를 제거하였다. 이 과정에서 분배 시스템에 포함된 노즐 내의 콜라겐 용액은 얼기 쉬우므로 플로팅 시스템의 콜라겐 용액은 25℃로 히팅하였고, 노즐 팁은 스테이지의 온도 영향을 최소화하기 위해 실리콘 고무로 코팅하였다.

3차원 구조 변수는 노즐 이동 속도, 공기압(held constant at 151±5 kPa) 및 스테이지 온도와 같은 시스템 변수를 조작하여 조절하였다. 본 실시예에서는 시스템의 기능성을 평가하기 위하여 300㎛ 노즐을 사용하였다. 마이크로 크기의 가닥을 제조하기 위하여 콜라겐 용액을 플로팅 시스템으로 이동시켰다. 제조된 콜라겐 구조체는 즉시 동결건조기(SFDSM06; 삼원, 한국)로 옮겨 -76℃에서 3일간 보관하였다. 건조된 콜라겐 구조체는 교차결합시키기 위하여 95% 에탄올 내의 1~100mM EDC{1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride} 용액에 실온으로 24시간 동안 침지하였다. 콜라겐 구조체의 형태는 디지털 카메라가 장착된 광학현미경(BXFM-32; Olympus)과 주사전자현미경(Sirion; FEI, Hillsboro, OR)으로 관찰하였다.

주사전자현미경 관찰에 앞서 구조체는 금으로 스퍼터링하였다. 시료 제조와 측정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 구조체의 공극률(φ)은 수학식 φ = 1 M/ρhs에 따라 얻어졌고, 여기에서 M은 구조체의 질량, ρ는 콜라겐 밀도(1.3gcm^-3), h는 구조체의 두께, 그리고 s는 구조체 표면적이다. 구조체의 최종 형상은 디지털 캘리퍼 마이크로미터(Ultra-cal Ⅲ; Sylvac)로 측정하였다. 구조체의 질량은 정확한 저울(AD-4 autobalance; Perkin-Elmer, USA)로 측정하였다. 미처리한 EDC 처리 구조체의 푸리에 변환 적외선(Fourier-transformed infrared) 스펙트럼을 측정하여 교차결합 구조체 내의 에스테르기 증가와 아마이드 결합 형성을 확인하였다. 콜라겐 적외선 스펙트럼은 6700 FT-IR 분광기(Nicolet, West Point, PA, USA) 감쇠전반사(attenuated total reflection; ATR) 모드를 이용하여 측정하였다. 시료는 분말을 이용하였고, 데이타는 8cm^-1의 해상도로 4000~400cm^-1 범위에 걸쳐 30스캔 얻었다. 일반 사람 각질세포(keratinocytes)와 섬유아세포(fibroblasts)는 성인 포피세포에서 통상적인 포피절제로 분리하였고, 참고문헌과 같이 배양하였다(Green, H., Kehinde, Thomas, O. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. J. Proc. Natl. Acad. Sc. 1979, 76, 5665). 간단히 설명하면, 포피세포 생검을 PBS로 세척하고 작은 조각으로 잘라 10mg/ml 디스파아제(dispase; Gibco)로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 피부 시트를 끝이 가는 핀셋으로 진피에서 떼어내어 0.1% EDTA를 함유한 0.05% 트립신 용액(Gibco)으로 30분간 37℃에서 배양하여 각질세포를 분리하였다. 각질세포는 원심분리로 수집하고 0.15mM 칼슘 및 보충 성장인자를 함유한 각질 성장배지(keratinocyte growth medium; KGM; Lonza)에서 배양하였다. 진피는 37℃에서 한 시간 동안 0.2% 콜라겐 분해효소(Sigma)로 처리하여 섬유아세포를 하비스트하고, 원심분리한 다음 섬유아세포 성장배지(fibroblast growth medium; FGM; Lonza)에서 배양하였다.

각질세포와 섬유아세포는 모두 37℃에서 5% CO₂ 분위기로 배양하였다. 각질세포/섬유아세포 인 비트로 공동배양방법(keratinocyte/fibroblast in vitro co-culture method)을 이용하여 3차원 콜라겐 구조체 내로 세포의 이동과 침윤을 평가하였다. 구조체는 생검 펀치를 이용하여 8mm 직경으로 동그랗게 자르고 20ml의 DMEM:F12 내에서 오버나잇으로 배양하였다.

배양한 각질세포와 섬유아세포(20:1 비율)는 30㎕의 KGM에 재현탁하였고, 각 구조체는 5 × 10⁵개의 세포와 함께 5시간 동안 37℃, 5% CO² 분위기로 배양하였다. 배지는 신선한 KGM으로 갈아주었고, 세포는 매일 배지를 교체하면서 일주일간 배양하였다. 일주일 경과 후 구조체는 스테인레스 스틸 격자 위에 올려놓았다. 배양배지를 제거하고 E-배지(DMEM 및 F12 배지 3:1 비율에 10% FBS, 5mg/ml 인슐린, 5mg/ml 트랜스페린, 2 × 10^-8 M T3, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10^-6 M 콜레라 독소 및 0.4㎍/㎖ 하이드로코르티손이 함유됨)를 격자에 더하였다. 격자는 9일 동안 더 배양하였다.

시료는 파라핀 내에 고정되고 4㎛ 두께로 절편화되어 자일렌으로 파라핀을 제거하고 농도가 다른 일련의 에탄올(graded ethanol series)로 재수화되었으며, 10mM 시트르산 완충액(pH 6.0) 내에서 121℃로 10분간 열처리되었다. 절편을 염소 혈청으로 실온에서 10분간 배양한 후 CK-10 및 CK-14(Novocastra), 비멘틴(vimentin, Dako), 콜라겐 IV 및 라미닌(laminin) 5에 대한 일차 단일클론항체로 한 시간 동안 배양하고 패스트 레드(Fast Red)로 대비염색(counterstain)하였다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 결합된 2차 항체로 1시간 동안 배양하였다. 절편은 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine, Dako) 내에서 원하는 염색 강도가 나올 때까지 처리하였다.

가닥 간의 세포 집적도(cell compactness)를 관찰하기 위하여, 제조된 구조체를 1:400로 희석된 액틴-특이적 마커인 팔로이딘-알렉사-568(phalloidin-Alexa-568, Invitrogen, USA)와 함께 2시간 동안 실온에서 흔들면서 배양하였다. 구조체를 0.2% Triton X-100이 함유된 0.1M 인산완충액으로 세척하고 Vectashield (Vecta Laboratory, USA)로 마운트하였다. Olympus 형광현미경에 부착된 디지탈 카메라로 이미지를 촬영하였다.

결과

본 발명자들은 생체적합성 재료로 3차원 구조체를 제조하기 위하여 극저온 플로팅 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 3차원 로봇 시스템과 연결되어 3차원 구조를 뽑는데 이용되는 분배장치, 분배된 생체적합성 재료 용액을 빠르게 식히는 극저온 스테이지를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 극저온 스테이지 및 분배 시스템의 주변 온도는 각각 -40℃와 20℃로 고정되었다.

일반적으로 가닥 직경의 안정성(일정함)은 구조체 디자인에서 배우 중요한 변수인데, 그것은 최초의 세포 부착 및 증식에 영향을 주는 공극 크기가 각 가닥의 직경에 따라 영향을 받기 때문이다. 따라서, 다양한 가공 조건 하에서 노즐 크기와 얻어지는 가닥의 직경 사이의 관계가 고려되어야 한다. 생체적합성 재료로서 콜라겐을 이용한 실시예에서 콜라겐 가닥의 측정된 직경에 대한 노즐 크기와 속도의 효과를 도 1a에 나타내었다. 세 가지 다른 크기의 노즐로 제조된 콜라겐 가닥은 노즐 속도가 증가할수록 직경이 감소하였다. 이러한 데이타로부터 본 발명자들은 선택된 노즐과 조화하여 사용자가 결정한 가닥 크기를 얻는데 이상적인 노즐은 대략 7mm/s 내외라고 결정하였다. 본 발명의 일 실시예에서 발명자들은 3차원 콜라겐 구조체를 제조하기 위하여 분배기 속도를 7mm/s로 고정하였다. 콜라겐 용액은 공기압(P; 151±5kPa)을 제어함으로써 정렬되었고, 300㎛ 분배 니들 팁으로 플로팅되어 층층이 적층되었다. 4.5% (w/v) 콜라겐 용액이 구조체 제조에 사용되었고, 직립상 콜라겐 구조체가 제조되었다.

본 발명의 일 실시예에서는 300㎛ 플로팅 니들 팁을 7mm/s 속도로 이동하면서 공극 크기 160±8㎛(도 1b) 또는 295±6㎛(도 1c)인 입체 콜라겐 구조체를 제조하였다. 이들 구조체의 공극률은 각각 96.3% 및 97.8%였다. 도 1b 및 1c와 같이, 공극 크기는 잘 조절되었다. 도 1b의 확대된 이미지는 동결건조에 의해 충분히 거칠어진 입체 콜라겐 구조체의 표면을 보여준다. 거친 구조체 표면은 세포 부착과 증식에 매우 유리하다. 콜라겐 구조체 절단면(도 1c의 확대 이미지)은 제조된 콜라겐 가닥의 고다공성 구조를 보여준다. 구조체 형상과 콜라겐 가닥 구조에 미치는 교차결합제(cross-linking agent)의 영향을 관찰하기 위하여 동결건조된 3차원 콜 라겐 구조체를 95% 에탄올 내 1~100mM EDC 용액에 실온에서 24시간 동안 침지하였다. 도 1d는 교차결합된 콜라겐 구조체 FT-IR 스펙트럼이다. 도면에서, N-S 신축운동 피크(stretching vibration peak)는 약 3324cm^-1, 에스테르 띠는 1100cm^-1, 그리고 아마이드 띠는 1655, 1546, 1458cm^-1에 각각 나타났다. 교차결합된 콜라겐의 IR 스펙트럼은 카복시기가 콜라겐의 아미노기와 하이드록시기와 반응하여 에스테르 결합을 형성하므로 에스테르 띠가 증가하였다. FT-IR 결과는 콜라겐 구조체가 잘 교차결합되었음을 나타낸다. 도 1e는 EDC 용액에 침지된 교차결합된 콜라겐 구조체의 모습을 보여주며, 동결건조 및 교차결합 과정 중 3차원 콜라겐 구조체가 잘 유지됨을 보여준다.

피부 조직 재생에서 3차원 콜라겐 구조체의 효율성을 평가하기 위하여 각질세포/섬유아세포 공동배양 방법(keratinocyte/fibroblast co-culture method)을 이용하였다. 대조군 구조체로서, 3차원 스폰지 콜라겐 구조체(Integra; Integra Life Science, USA)를 이용하였다. 자세한 세포 배양 공정은 실시예에 기재된 것과 같다. 도 2는 각질세포/섬유아세포 공동배양 2주 후 일반 3차원 스폰지 콜라겐 구조체와 3차원 분배 콜라겐 구조체(직경, 8mm; 두께, 1.4mm)를 나타낸다. 스폰지 구조체는 매우 수축된 형태를 나타내었으며, 반면 분배 콜라겐 구조체는 수축 현상이 없었다. 도 2b 및 2c의 내부 이미지는 콜라겐 가닥 가운데 세포의 집적도를 나타낸다. 콜라겐 가닥 사이의 세포를 관찰하기 위하여, 분배 구조체를 액틴-특이적 마커인 팔로이딘-알렉사-568(phalloidin-Alexa-568)와 함께 배양하였다. 분배 구조체 상의 세포는 가닥 사이로 잘 증식하였고 160㎛ 공극 구조체의 공극을 거의 채웠다. 세포 집적도는 300㎛ 공극 구조체보다 160㎛ 공극 구조체에서 더 높았고(도 2b), 이는 피부조직 재생을 촉진하는데 필요한 적절한 공극 크기를 지시해준다.

세포 이동과 분화를 평가하기 위하여 구조체 단면을 제조하여 헤마토자일린과 에오신으로 염색한 후 광학현미경으로 직접 관찰하였다. 구조체 공극 내의 세포를 관찰하기 위하여 단면을 사이토케라틴(CK-10 및 CK-14)에 대한 항체와 비멘틴으로 염색하였다. 사이토케라틴(CK-10 및 CK-14)에 대한 항체와 비멘틴은 각각 각질세포 및 섬유아세포 특이적 마커이다. 기저막(basement membrane) 형성을 관찰하기 위하여 콜라겐 IV 및 라미닌 5를 면역조직화학 염색하였다.

도 3은 7일간 침윤배양한 결과를 나타낸다. 도면에서, 각질세포 특이적 마커인 CK-14은 양쪽 구조체에서 모두 잘 분포되어 있음을 보여주며, 세포 이동이 바닥에서 표면까지 잘 조직되어 있음을 보여준다.

뿐만 아니라, 섬유아세포 특이적 마커인 비멘틴은 3차원 스폰지 콜라겐 및 3차원 분배 콜라겐 구조체에서 잘 분포되어 있었던 반면, 각질세포 분화를 보여주는 CK-10은 양쪽 구조체에서 모두 나타나지 않았다. 그렇지만, 14일간의 기상-액상 배양(air-liquid culture)을 마친 후에 CK-14의 구조체 내 분포는 분배 구조체의 기저부터 표면까지 증식된 각질세포가 완전히 이동하였음을 보여준다. 그러나, 스폰지 구조체에서는 각질세포는 구조체 표면까지 충분히 이동하지 않았고, 아마도 이것은 스폰지 구조체 내의 상호연결성이 부족하고 공극 크기가 다양하기 때문인 것으로 예측된다(도 4). 또한, CK-10 분포에 기초하여, 분배 구조체의 정확하게 제어 된 공극 구조는 기상-액상 경계면에서 각질세포와 공기 가 충분히 접촉할 수 있도록 함으로써 일반 피부 조직과 유사한 잘 발달된 각질층(stratum corneum) 을 형성시킬 수 있다. 그렇지만, 스폰지 콜라겐 구조체에서 CK-10 염색은 구조체 전체에 산발적으로 분포되어 있었으며, 이것은 각질세포가 구조체 표면까지 완전히 이동하지 못하였으며, 그리하여 구조체 중간 부위에 분화된 각질세포 즉 각질층이 발현되었음을 가리킨다.

도 4b 및 4c와 같이, 공극 크기 160㎛ 및 공극 크기 300㎛ 분배 구조체에서는 각질세포가 기저부터 표면까지 잘 이동하였다. 그러나, 공극 크기 300㎛ 분배 구조체의 경우 각질세포는 구조체와 평행한 표면을 따라서는 충분히 이동하지 않았으며, 이는 공극 크기가 크기 때문이다(도 4c). 이 결과로부터 피부 조직을 형성하기 위해서는 적절한 공극 크기가 필요함을 확인하였다.

도 4a 내지 4c의 비멘틴 염색 결과는 스폰지 구조체와 분배 구조체 모두에서 섬유아세포가 잘 분포되어 있음을 보여준다. 그러나, 기저막을 형성하는 각질세포의 아랫부분에서 분배 구조체의 섬유아세포는 일반 피부와 유사하게 잘 분포되어 있는 반면, 스폰지 구조체에서는 그렇지 않았다.

기저막 단백질, 콜라겐 IV 및 라미닌 5 면역조직화학분석 결과가 도 5에 나타나 있다. 모든 시료에서 콜라겐 IV와 라미닌 5는 살아 있는 표피 세포층에서 발현되었으나, 일반 스폰지 구조체와 분배 구조체 사이에는 염색 강도가 명확히 다름이 관찰되었다. 이는 분배 구조체가 의학적으로 사용되던 스폰지 구조체보다 피부 조직 재생에 더 적합함을 의미한다.

도 1(a)는 가닥 직경에 미치는 노즐 크기와 속도의 관계를 나타내는 그래프이다. (b)와 (c)는 본 발명의 극저온 플로팅 시스템에 의해 제조되며, 각각 공극 크기가 약 160㎛ 및 300㎛인 콜라겐 구조체의 광학이미지와 주사전자현미경 이미지이다. (b)의 확대 이미지는 콜라겐 가닥의 표면을 나타내며, (c)의 확대된 이미지는 콜라겐 가닥의 단면을 나타낸다.(d)는 EDC로 교차결합되기 전후의 콜라겐 구조체 적외선 스펙트럼이다. 화살표는 에스테르기 피크를 나타낸다. (e)는 EDC로 교차결합된 3차원 콜라겐 구조체이다.

도 2는 각질세포와 섬유아세포로 세포배양한 이후의 콜라겐 구조체 이미지이다(직경, 8mm; 두께, 1.4mm). (a) 3차원 스폰지 콜라겐 구조체의 광학이미지; (b) 공극 크기 160㎛의 3차원 콜라겐 구조체의 광학이미지; (c) 공극 크기 300㎛의 3차원 콜라겐 구조체의 광학이미지. 내부 이미지는 팔로이딘-알렉사-568(phalloidin-Alexa-568) 형광을 나타내며, 공극 크기가 각각 160㎛ 및 300㎛인 3차원 콜라겐 구조체의 세포 집적도(cell compactness)를 나타낸다.

도 3은 7일간 침윤배양한 이후 헤마토자일린 및 에오신(H&E) 염색, 사이토케라틴 CK-10 및 CK-14면역조직화학염색, 및 비멘틴 염색 광학 이미지이다. (a) 일반 3차원 스폰지 콜라겐 구조체; (b) 300㎛ 공극 크기의 분배 콜라겐 구조체. 분배 콜라겐 구조체에서 흰 부분은 콜라겐 가닥의 단면이다.

도 4는 헤마토자일린 및 에오신(H&E) 염색, 사이토케라틴 CK-10 및 CK-14면역조직화학염색, 및 비멘틴 염색 광학 이미지이다. (a) 일반 3차원 스폰지 콜라겐 구조체; (b) 160㎛ 공극 크기의 분배 콜라겐 구조체; (c) 300㎛ 공극 크기의 분배 콜라겐 구조체. 분배 콜라겐 구조체에서, 흰 부분은 콜라겐 가닥의 단면이다.

도 5는 (a) 스폰지 콜라겐 구조체 및 (b, c) 분배 콜라겐 구조체 상에 형성된 표피 내의 콜라겐 IV 및 라미닌 5의 발현을 나타낸다.

Claims

내부에 생체적합성 재료를 내장하는 카트리지와, 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 카트리지에 내장된 생체적합성 재료가 배출부재를 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 생체적합성 재료를 배출시키는 배출부재 및 배출부재를 통해 배출되는 생체적합성 재료가 그 위에 놓여 구조체를 형성하는 스테이지를 포함하는 플로팅 시스템을 이용하여 제조되는 피부조직 재생용 3차원 구조체에 있어서,

구조체 제조시 카트리지, 이송로봇, 압축부재 및 배출부재는 상온으로 유지하되 배출부재로부터 배출되는 생체적합성 재료가 그 위에 놓이는 스테이지를 표면 온도 -50~0℃로 유지시켜 3차원 구조체로 제조한 후 동결건조시킨, 공극률 90% 이상인 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체.
청구항 1에 있어서,

상기 스테이지 표면 온도는 -40~-20℃임을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체.
청구항 1에 있어서,

상기 동결건조 이후 동결건조된 구조체의 가닥을 교차 결합시킨 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체.
청구항 1에 있어서,

상기 생체적합성 재료는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 케라틴, 셀룰로오 스, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브리노겐, 피브로모듈린, 라미닌, 테나신, 비트로넥틴, 알지네이트, 히알루론산, 실크 프로테인, 실크 피브로인 및 그들의 유도체, 아가로스, 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체.
청구항 1에 있어서,

항생제, 항바이러스제, 항균제, 핵산, 펩타이드 및 단백질 중 선택된 1종 이상이 부가되는 것을 특징으로 하는 피부조직 재생용 3차원 구조체.
상기 청구항 1 내지 5 중 선택된 어느 한 항의 피부조직 재생용 3차원 구조체에 섬유아세포, 피부세포, 혈관 형성 내피세포 및 줄기세포 중 선택된 1종 이상 을 포함하여 증식시킨 인공진피.
청구항 6에 있어서,

상기 인공진피는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하는 용도임을 특징으로 하는 인공진피.
청구항 6에 있어서,

상기 인공진피는 피부 미용용 또는 성형용 목적으로 사용하는 것임을 특징으로 하는 인공진피.
상기 청구항 6의 인공진피를 포함하는 피부 드레싱.
상기 청구항 6의 인공진피를 포함하는 피부 외용제.
상기 청구항 6의 인공진피를 포함하는 화장료.
상기 청구항 6의 인공진피에 각질세포, 혈관 형성 내피세포 및 줄기세포 중 선택된 1종 이상을 포함하여 증식시킨 인공피부.
청구항 12에 있어서,

상기 인공피부는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하는 용도임을 특징으로 하는 인공피부.
청구항 12에 있어서,

상기 인공피부는 피부 미용용 또는 성형용 목적으로 사용하는 것임을 특징으로 하는 인공피부.
상기 청구항 12의 인공피부를 포함하는 피부 드레싱.
상기 청구항 12의 인공피부를 포함하는 피부외용제.
상기 청구항 12의 인공피부를 포함하는 화장료.