KR101101956B1 - 조직 재생용 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐과 같은 수용성 재료를 비롯하여 다양한 재료를 이용한 3차원 조직 재생용 구조체 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 좀더 자세하게는 조직 재생을 위한 세포배양 구조체를 제조함에 있어서 3차원 형상의 조직 재생용 구조체를 극저온법으로 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

콜라겐, 수용성 재료, 조직 재생용 구조체, 제조방법, 극저온법

Description

조직 재생용 구조체 및 그 제조방법{Scaffold for tissue engineering and producing method thereof}

본 발명은 콜라겐 등의 수용성 재료를 비롯하여 다양한 재료를 이용한 3차원 조직 재생용 구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 좀더 자세하게는 조직 재생을 위한 세포배양 구조체를 제조함에 있어서 콜라겐과 같은 수용성 재료 또는 다양한 재료를 포함하는 3차원 형상의 조직 재생용 구조체를 극저온법으로 효과적으로 제조하는 방법 및 이와 같이 제조된 구조체의 조직 재생 용도에 관한 것이다.

인체 내 기관이나 조직이 손상될 경우에 세포, 약물 지지체 등을 제공하여 효과적으로 조직을 재생하고 있는데, 조직 재생용 구조체는 첫째, 임플란트 부위에서 물리적으로 안정해야 하고, 둘째, 재생 효능을 조절할 수 있는 생리 활성을 나타내어야 하며, 셋째, 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되어야 하고 넷째, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.

이와 같은 조직 재생용 구조체는 종래 일정한 강도와 형태를 갖는 고분자를 이용한 스폰지 타입, 매트릭스 형태의 나노 섬유 또는 젤 타입의 세포 배양 지지체로 제조되며, 이러한 조직 재생용 구조체(scaffold)는 특정 깊이 또는 높이를 갖는 3차원 형상의 조직을 만들기 위해 중요한 역할을 한다.

이러한 조직 재생의 뼈대로서 기능하는 구조체(scaffold)를 이식하고 자기치유능력(self-healing power)을 이용하여 생체 내에서 조직을 재생하는 기술은 재생의료 또는 조직 공학이라고 불린다.

조직 공학의 일례로 관절 연골을 재생하는 방법을 들 수 있으며, 상기 관절 연골 재생 방법은 연골 세포를 구조체로 하는 인공 보철물을 형성한 후 이 인공 보철물을 손상 부위에 이식함으로써, 손상 관절 부위에서 연골 세포가 재생되도록 하는 것이다. 상기 인공 보철물은 연골 세포 등을 시드(Seed)로 이용하여 3차원 형상으로 형성한 지지체로 이루어진다.

조직공학의 목표는 세포생물학과 재료공학기술을 조합하여 손상 조직을 치료하고 재생하는 것이다. 조직공학의 당면 문제중 하나는 세포 이동과 침윤을 지지할 수 있는 재생 가능한 3차원 구조체를 개발하는 것이다.

조직 공학에서 사용되는 조직 재생용 구조체는 고분자를 주성분으로 하며 체내 조직 중 세포외 기질(extracellular matrix)의 많은 역할을 모방한다. 즉 고분자 구조체는 부착, 증식, 분화 등과 같은 세포의 기능, 재생될 생체 조직의 구조 및 수용성 인자와 영양분 그리고 대사산물들의 확산 조절 등을 가능하게 한다. 수용성 콜라겐이나 알지네이트와 같은 천연 생체재료들은 이러한 목적에 이상적인 것으로 생각되나, 친수성으로 인하여 디자인된 3차원 구조체(scaffold) 제작이 매우 어려웠다. 콜라겐은 생체 친화성 및 조직 적합성이 우수하고, 항원성이 낮고 숙주 세포의 분화·증식을 촉진시키는 작용을 가지며, 지혈 작용을 가지며, 생체 내에서 완전히 분해 흡수되므로 의료용 재료의 소재로서 특히 우수한 특성을 가지고 있다. 그러나, 콜라겐으로 제조한 재생공학용 구조체 등은 상온에서 원하는 형태를 유지하기가 쉽지 않아서, 3차원 구조체를 제조하는데 많은 어려움이 있었다.

조직공학의 주요 목적은 조직과 기관을 재생하는 것이다. 이 목표는 그 위에 세포가 부착하고 증식할 수 있는 다공성 폴리머 또는 구조체를 제공함으로써 달성된다. 구조체 디자인은 조직 공학에서 중요한 과정이고, 다양한 기계적 기술들이 생체의학적 구조체를 제조하기 위하여 이용되고 있다. 구조체 상에 새로운 조직을 형성하는 것은 구조체의 다공성, 크기 및 3차원적 다공간 연결구조에 따라 크게 영향을 받기 때문에 이들은 매우 중요한 요소이다. 적절한 다공 구조는 충분한 수의 세포를 운반하기 위해서 필요하며, 상호 연결된 다공 구조는 영양성분 확산을 위해서 필요하다.

3차원 구조체를 형성하는데 사용되는 재료들로는 천연 폴리머, 합성 폴리머 또는 세라믹, 그리고 생분해성 폴리머 등이 있다. 보통 천연 재료들은 생체가 인식할 수 있는 고분자와 매우 유사하고 생체 내에서 대사가 가능하다. 반면 합성 폴리머는 독성을 띠기도 하고 세포에 의해 인식되지 못하는 경우도 있다. 천연 재료인 콜라겐은 조직재생 구조체 재료로서 이상적인 것으로 알려져 왔다. 그 이유는 일단 콜라겐이 풍부하고 흔하며, 생체적합성이 있기 때문이다.

일반적으로 좋은 구조체 재료는 다음의 특징을 나타내어 원하는 생물학적 반응을 일으킨다: (1) 높은 다공간 상호연결성을 갖는 다공성 구조로서 영양분과 대 사 폐기물의 원활한 흐름을 가능하게 할 것; (2) 생분해성을 나타내되 분해 속도는 조절 가능할 것; (3) 세포 접착에 적합한 표면 화학 특성과 세포 성장에 충분한 표면적을 가질 것; (4) 기계적으로 우수한 특성을 가질 것; 그리고 (5) 다양한 형태와 크기로 조작이 용이할 것. 그러나 동결건조 또는 임계점 건조를 이용하는 일반적인 3차원 콜라겐 구조체 제작 방법은 정확히 조절된 3차원 다공 구조를 제공하지 못하며, 3차원 구조의 재생 가능성은 매우 낮다. 종래 방법으로 제조된 콜라겐 구조체는 구조체 깊숙한 곳까지 한정된 산소 및 영양만을 공급할 수 있고, 결과적으로 500㎛ 이상 두께의 조직 성장을 지원할 수 없다. 이와 같은 문제는 골수 기질간 세포의 스폰지상 콜라겐 구조체로의 이동을 단면 분석한 것을 보면 분명해진다.

이러한 제조 문제를 극복하기 위하여 미리 디자인된 형틀과 저온 배출이 조합된 간접 프린팅과 같은 시도들이 있어왔다. 그러나, 미리 디자인된 형틀은 고가이고, 제조된 콜라겐 채널은 다공간 상호연결 정도가 낮았다. 더구나 저온 직접 프린팅 방법에 의한 다공성으로 디자인된 3차원 콜라겐 구조체의 제조에 있어서 정확한 다공 크기 및 연결을 조절하기는 용이하지 않다.

콜라겐 구조체 제조에서 가장 큰 장애는 콜라겐 자체의 극친수성 성질로 인한 것이다. 디자인된 콜라겐 3차원 구조체를 정확히 제조하려면 직접 플로팅/프린팅 방법이 필요하지만, 수용성 콜라겐의 친수성과 낮은 점도로 인하여 상온에서 원하는 구조의 콜라겐 가닥을 압출하는 것은 불가능하다. 나아가, 콜라겐 가닥의 구조를 조절할 수 있다고 하더라도 여러 개의 콜라겐 가닥으로 형성된 정확한 3차원 구조는 상온에서 존재할 수 없다. 왜냐하면 압출된 가닥들은 높은 친수성으로 인하 여 서로 접촉하면 쉽게 액화되어 버리기 때문이다.

공개특허 제2001-52714호는 a. 추출 콜라겐의 염산 용액을 원하는 두께로 캐스팅하여 콜라겐 용액층을 형성시키는 단계; b. 상기 콜라겐 용액층을 일단 동결하고 원하는 시간 동안 그 상태를 유지시키고 계속해서 동결 건조하는 단계; c. 상기 동결 건조된 것에 소정 시간 동안 열탈수 가교를 실시하는 단계; d. 상기 열탈수 가교가 실시된 매트릭스 중에 상기 추출 콜라겐의 염산 용액을 도입하는 단계; e. 상기 추출 콜라겐의 용액이 도입된 것을 일단 동결하고 원하는 시간 동안 그 상태를 유지시키고 계속해서 동결 건조하는 단계; g. 상기 동결 건조된 것을 압축하는 단계; 및 i. 상기 압축된 것에 소정의 시간 동안 열탈수 가교를 실시하는 단계로 구성되는 콜라겐재 및 그 제조방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 방법은 원하는 3차원 구조의 지지체를 형성하는 것이 아니라, 콜라겐 염산용액을 단지 동결건조시켜 제조하므로 생성물의 구조가 일정하지 않으며, 동결건조, 열탈수 가교, 압축 등 복잡한 과정을 통해 제조되기 때문에 제조시간과 비용이 많이 소요된다. 뿐만 아니라, 상기 방법에 의하면 스폰지 형상의 콜라겐이 형성되는데, 이 구조에는 공극은 형성되지만 공극끼리의 연결성이 부족하고 공극의 크기를 조절하기가 거의 불가능하다.

또한, 특허 제676285호는 콜라겐 용액에 공기를 주입시켜 일정한 공극을 형성하게 한 후 동결건조시켜 제조한 콜라겐 매트릭스에 관하여 개시하고 있다. 그러나, 상기 구조는 서로 다른 고분자 재료를 혼합하여 구조체를 형성하기에는 적합하 지 않다. 또한, 구조체 내에 콜라겐 섬유가 들어 있지 않으므로 용도 등에 따라 공극 구조를 달리 조절하기가 용이하지 않으며, 콜라겐 섬유로 이루어진 구조체에 비하여 세포가 잘 달라붙지 않는다.

따라서, 본 발명은 상기 문제점들을 해결하고 불규칙적인 스폰지나 매트릭스 형태가 아닌 3차원 패브릭 형상의 콜라겐 구조체를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 콜라겐, 알지네이트 등과 같은 수용성 재료 및 그 외의 다양한 재료를 이용하여 디자인된 3차원 조직 재생용 구조체를 제조하려는 것을 목적으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 공극률과 공극 크기를 조절할 수 있는 3차원 조직 재생용 구조체 제조방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

나아가, 본 발명은 조직 재생용 구조체를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 3차원 구조체를 제조하는 바이오플로터를 이용하여 구조체를 제조함에 있어서, 극저온 시스템을 이용하는 새로운 플로팅 제조방법을 발명하였다. 즉, 본 발명자들은 노즐에서 콜라겐과 같은 수용성 재료가 분출되어 구조체를 형성할 때 수용성 재료가 닿거나 쌓이게 되는 스테이지를 극저온으로 유지함으로써 상온에서 3차원 입체 형상으로 제조하기 어려운 수용성 재료 구조체를 제조할 수 있었다. 이 방법을 이용하여 본 발명자들은 수직으로 교차하는 가닥들을 층층이 쌓아 95% 이상의 다공구조(공극률)를 가진 콜라겐 구조 체를 제조하였다. 이러한 3차원 구조체는 최초의 디자인과 정확히 일치하였다.

본 발명은 수용성 재료 및 유기용매 용해성 재료 등 다양한 재료로 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법에 있어서,

그 위에 상기 재료가 올려지는 스테이지의 표면 온도를 -50~0℃로 유지하고 그 위에 상기 재료를 노즐로 분출하여 3차원 구조체를 제조하는 공정; 및

상기 제조된 3차원 구조체를 동결건조하는 공정;을 포함하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 3차원 구조체 제조공정에서 스테이지 표면 온도가 -40~-20℃임을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 재료가 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산 및 실크로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재료가 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이 트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}를 비롯한 조직공학에 사용되는 유기용매 용해성 재료 중 1종 이상의 재료로 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 유기용매 용해성 재료들은 콜라겐 등 수용성 재료와 같이 구조체 제조 중 가닥이 서로 닿을 때 용해되어 구조가 뭉개지는 현상은 없으나 본 발명의 극저온법을 이용하면 디자인된 3차원 구조체 제조가 용이하고 다공성이나 공극간 상호연결 정도 등을 조절하기가 용이해진다.

또한, 본 발명은 상기 3차원 구조체 제조공정에서 스테이지 주변의 질소 가스를 지속적으로 제거하여 수분을 조절함을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 동결건조 공정 이후 동결건조된 콜라겐 구조체의 가닥을 교차 결합시키는 공정이 부가되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 스테이지가 동결건조 실리콘 오일을 스테이지 내부로 순환시켜 온도를 유지시키는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, 공극률 90% 이상인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 3차원 구조체를 제공한다.

나아가, 본 발명은 내부에 조직 재생용 구조체 재료를 내장하는 카트리지와, 상기 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 상기 카트리지에 내장된 구조체 재료가 노즐을 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 상기 구조체 재료를 배출시키는 노즐 및 노즐을 통해 배출되는 상기 구조체 재료가 그 위에 놓여 구조체를 형성하는 스테이지를 포함하는 조직 재생용 구조체 제조장치에 있어서, 상기 스테이지의 표면 온도가 -50~0℃로 유지되도록 조절되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체 제조장치를 제공한다.

상기 스테이지는 플로터의 일 구성요소가 되도록 구성할 수 있으나, 스테이지를 제외한 구성요소들을 플로터(구조체 제조장치)로 형성하고, 스테이지는 별도로 분리하여 제조 및 사용하는 것도 가능하다.

바이오플로터는 내부에 구조체 재료를 내장하는 카트리지와, 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 카트리지에 내장된 구조체 재료가 노즐을 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 노즐을 구비한다. 상기 이송로봇에 의해 상하 및 좌우 방향으로 노즐이 이동하면서 구조체 재료를 스테이지 상에 배출하면 스테이지 상에 패브릭 구조의 다공성 형상으로 구조체가 형성된다.

냉동 조건 하에서 플로터를 이용하여 콜라겐 패브릭 구조체를 형성하는 기술이 중국 청화대학 연구팀에 의하여 2002년 발표된 적이 있었다(Scripta Materialia 46 (2002) 771.776). 그러나, 냉동 조건 하에서 플로터를 작동시키는 경우 구조체 재료를 배출하는 노즐이 막하게 되어 바라는 3차원 형상의 콜라겐 구조체를 원활히 제조하기가 매우 어렵다.

본원 발명자들은 오랜 기간의 연구 끝에 콜라겐 구조체 제조시 사용되는 스테이지를 극저온으로 유지시킴으로써 노즐이 막히는 문제를 해결함과 동시에 콜라겐 3차원 구조체를 잘 형성할 수 있음을 밝혀내었다.

이때 스테이지는 -50~0℃로 유지시키며, 바람직하게는 -40~-20℃로 유지시킨다. 그 위에 콜라겐 구조체를 형성시키는 스테이지의 온도가 하한보다 낮으면 작동시 플로터의 노즐 온도를 낮추게 되어 구조체 재료가 원활하게 배출되지 않으며, 상한보다 높은 경우에는 3차원 입체 형상의 구조체가 잘 형성되지 않고 뭉개진다.

상기 스테이지에는 온도 감지센서 및 온도 조절부재가 부착되어 있어서 원하는 온도로 고정시키거나, 또는 온도 범위를 정할 수 있고, 정해진 온도 또는 온도 범위를 벗어나는 경우에는 피드백 작용으로 온도를 적정하게 낮추거나 높일 수 있다. 온도 조절에 관한 상세한 사항은 기계 제어 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 극히 용이하게 실시하거나 재현할 수 있으므로 자세한 설명은 생략한다.

본 발명에서 콜라겐을 비롯한 수용성 구조체 재료는 콜라겐만을 의미하는 것은 아니며, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 등을 포함하며, 뿐만 아니라, 구조체 재료에서 수용성 구조체 재료 함량이 50중량% 이상인 혼합재료인 경우에도 본 발명의 제조방법을 이용하여 3차원 입체 구조체를 형성하는 것이 가능하다. 본 발명에서는 편의상 대표적인 수용성 구조체 재료로서 콜라겐을 예로 들어 발명의 구성을 설명하였으나, 반드시 콜라겐으로만 한정되는 것이 아님을 다시 한 번 강조한다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이 본 발명의 방법은 수용성 재료 외에도 PGA, PLA 등 조직공학의 구조체를 형성하는데 널리 사용되는 유기용매 용해성 재료에도 적용할 수 있는데, 본 발명의 방법을 이용하면 통공의 크기나 통공간 상호 연결정도 등을 원하는 대로 조절할 수 있고, 좀 더 거친 표면의 구조체를 형성할 수 있기 때문이다. 나아가, 상기 수용성 재료와 상기 유기용매 용해성 재료의 혼합 재료에도 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.

인체에서 가장 큰 기관으로서 피부는 침입에 대한 방어, 접촉 인지, 온도 조절 및 수분 손실 조절 등을 비롯하여 매우 중요한 기능을 수행한다. 피부는 두 개의 층으로 나뉘는데, 표피는 두꺼운 보호층을 형성하며 대부분 케라티노사이트로 구성된다. 진피는 콜라겐을 생산하는 섬유아세포, 혈관 형성 내피세포 및 기타 세포로 이루어진다. 본 발명의 3차원 콜라겐 구조체 내에서 세포 이동 효율을 평가하기 위하여 케라티노사이트/섬유아세포 혼합 배양 방법을 피부 조직 재생에 이용하였다. 구조체는 인공 피부조직 형성에 적합하였다.

새로운 3차원 콜라겐 구조체는 3차원 플로팅 시스템을 극저온 냉동 시스템과 짝지어 이용하여 제조하였다. 제조 스테이지의 온도는 비접촉 적외선 온도계(DT-8860B, CEM)를 이용하여 측정하였다. 플로팅 시스템에서 온도는 두 개의 컴프레서로 조절되며, 동결건조 실리콘 오일이 제조 스테이지 내를 순환한다. 구조물 제조에는 타입 I 콜라겐을 이용하였다. 콜라겐은 0.05M 아세트산(pH 3.2)에 용해하였고, 4.5%(w/v)로 농도를 고정하였다. 콜라겐 용액은 플로팅 시스템으로 옮겼다.

피부 조직 재생용 콜라겐 구조체 제조방법은 도 1에 나타내었다. 먼저, 최종 구조체가 약 20X20X1.5㎣가 되도록 하기 위하여 가닥 두께와 공극 크기를 선택하였 다(도 1a). 그리고 나서, 구조체는 컴퓨터로 직접 구조체 재료를 쌓아 형성하였다(도 1b). 이때 구조체 재료가 쌓이는 스테이지 및 주변 온도는 각각 -40℃와 10℃로 고정하였다. 콜라겐 용액은 300㎛ 직경 플로팅 팁을 초당 7mm 움직이도록 하여 조절된 공기압(151±5kPa) 하에서 한 층 한 층 형성하였다. 막힘을 방지하기 위하여 노즐은 실리콘고무로 코팅하였다. 압출된 콜라겐 마이크로 가닥(350㎛ 직경)은 극저온 스테이지에 닿자마자 얼었다. 제조된 구조체는 즉시 -76℃의 동결건조기에 3일 동안 넣어두었다. 그리고 나서 건조된 콜라겐 구조체를 교차 결합시키기 위하여 1~100mM의 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride) 95% 에탄올 용액에 실온에서 24시간 동안 침지하였다(도 1d). 구조체의 최종 형상은 디지털 캘리퍼 마이크로미터로 측정하였다.

최종 구조체는 콜라겐 가닥의 직경이 330㎛, 공극 크기 260㎛ 였고, 공극은 98%, 총 체적은 18.4Χ18.3Χ1.4mm³였다.

극저온 플로팅 시스템으로 제조한 3차원 콜라겐 구조체를 좀더 자세히 관찰하기 위하여 주사전자현미경을 이용하였다(도 2). 층층이 쌓아올린 콜라겐 마이크로가닥이 선명하게 보인다(도 2a). 주사전자현미경은 동결건조 과정 중 얼음 결정의 증발이 콜라겐 가닥 표면을 거칠게 한다는 것을 보여주며(도 2b), 이러한 변형은 세포 배양시 유리한데, 이는 세포 부착과 증식이 표면의 화학적 물리학적 성질에 강하게 의존하기 때문이다. 종래 몇몇 연구자들은 최적 표면 구조를 개발하기 위하여 다양한 특정 표면을 제조하여 표면 지형과 세포 부착 및 증식 사이의 관계 를 연구하였다. 그러나, 그 결과는 2차원 표면에 한정되었고 표면이 개질된 3차원 구조체로 확장하는 것은 어려웠다.

본 발명자들은 300㎛ 직경의 노즐 팁을 초당 7mm 움직이도록 하여 공극이 196±8㎛(도 2c) 및 285±6㎛(도 2d)인 3차원 콜라겐 구조체를 부가적으로 제조하였다. 이 구조체들은 각각 96.8% 및 97.7%의 공극률을 나타내었다.

일반적으로 종래의 동결건조법을 이용하여 제조한 콜라겐 스폰지 구조체의 공극 크기는 매우 다양하다(11㎛ ~ 134㎛). 스폰지형 콜라겐의 공극 크기 분포는 동결건조시 온도 하강 속도 및 콜라겐 농도에 의하여 크게 영향을 받기 때문에 종래 동결건조법을 이용하여 구조체의 공극 크기를 조절하는 것은 매우 어렵다. 그렇지만, 본 발명의 방법을 이용하면 조절된 공극 구조를 갖는 3차원 콜라겐 구조체를 용이하게 그리고 재현 가능하도록 형성할 수 있다. 동결건조 후 구조체는 약 10±2% 정도 축소된다. 이러한 축소현상은 동결건조과정 동안 가닥 내의 얼음 결정 증발 속도가 불균일하기 때문이다.

제조된 3차원 콜라겐 구조의 특성은 광학적 이미지를 이용하여 조사하였다. 시험한 변수는 공정 온도, 노즐 속도 및 노즐 크기였다(도 3). 이 시험에서 압력은 151kPa로, 콜라겐 용액 농도는 4.5%(w/v)로 고정하였다. 공정 온도가 마이크로가닥의 구조적 안정성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 콜라겐 가닥은 30% 습도 조건에서 제조되었고, 습도는 질소가스를 지속적으로 제거함으로써 유지하였다.

스테이지 온도를 -50℃보다 낮게 조절하면 콜라겐 용액은 스테이지에 닿을 때 너무 빨리 얼었다. 그러나, -50~0℃ 범위 내, 더욱 바람직하게는 -40℃ ~ -20℃ 에서는 콜라겐 가닥은 구조체를 잘 형성했고 매우 안정적이었다(도 3a, b).

스테이지 온도가 -10℃보다 높으면 가닥은 직경이 약간 커지고, 0℃보다 높으면 가닥이 불균일하게 퍼져서 3차원 구조 형성이 불가능해진다. 콜라겐 가닥 구조의 변화를 -40℃, 0℃, 10℃ 별로 도 3b에 나타내었다. 이 결과로부터 우리는 원하는 3차원 콜라겐 구조 제조에 적절한 공정 온도를 결정하였다.

일반적으로 구조체 가닥 직경의 안정도는 구조체 디자인에서 매우 중요하다. 왜냐하면 최초 세포 부착 및 증식에 영향을 주는 공극 크기는 가닥의 직경에 의해 영향을 받기 때문이다. 따라서, 다양한 공정 조건 하에서 노즐 크기와 압출 결과물 가닥 직경 간의 관계가 고려되어야 한다. 노즐 크기와 속도가 콜라겐 가닥의 직경에 미치는 영향을 도 3c에 나타내었다. 각기 다른 세 가지 크기의 노즐에서 노즐 속도가 증가되면 제조된 가닥의 직경은 감소하였다. 이 결과로부터 우리는 4~12mms^-1 속도, 더욱 바람직하게는 8mms^-1가 원하는 가닥 크기를 얻는데 적합함을 알아내었다.

동결건조 전과 후 가닥의 광학적 이미지와 주사전자현미경 이미지를 도 3d에 나타내었다. 동결건조시 수축은 3차원 구조체 제조에서 매우 중요한 변수이다. 동결건조 전과 후 제조된 구조체의 크기를 측정함으로써 동결건조 공정에서 최종 구조체가 약 7~10% 정도 수축함을 확인하였다. 이러한 수축은 구조체 내의 가닥 사이의 접촉 부분에서 일어나는 국지적 수축 현상으로 인한 것이다(도 3d의 화살표 부분). 이러한 국지적 수축은 건조 과정에서 구조체 내의 얼음 결정 증발 속도가 차 이가 있기 때문이다.

-40℃ 동결건조 및 콜라겐 농도 4.5% (w/v)에서 유도되는 수축량을 도 3e에 나타내었다. 다양한 노즐 속도로 시험한 결과 콜라겐 가닥 직경은 평균 8~12% 정도 수축하였다. 이 수축량은 유사한 농도의 콜라겐을 임계점 건조 공정으로 구조체를 제조한 Sachlos 등의 연구결과보다 낮은 수축량이다.

3차원 구조체에서 적절한 기계적 지지는 매우 중요하다. 세포 증식 동안 구조체가 그 모양을 유지할 수 없다면 조직은 심하게 변형될 것이다. 다공성 구조체의 구조는 원래의 3차원 구조와 그 재료의 기계적 성질에 의존한다. 또한, 구조체의 기계적 성질은 그 공극 구조, 가닥의 크기 및 공극 크기에 영향을 받는다. Yamada에 따르면, 보통 인간의 피부는 최대 장력 7.7 MPa와 최대 변형 100% 값을 갖는다. Hollister는 유연한 조직에는 0.4 ~ 350 MPa의 기계적 모듈러스가 적당하다고 주장했다.

본 발명의 3차원 콜라겐 구조체의 기계적 성질에 미치는 공극의 영향을 관찰하기 위하여 단축 장력(uniaxial tensile strength)을 측정하였다. 도 3f와 같이, 장력과 모듈러스는 구조체의 공극률이 증가할수록 감소하였다. 3차원 콜라겐 구조체의 최대 장력은 최대 응력 20.5%, 공극률 95.3%에서 2.8 MPa였다.

구조체의 탄성은 그 공극률과 매우 밀접한 관련이 있다. 같은 콜라겐 가닥 직경과 다른 공극 크기를 갖는 구조체에서 공극률이 약간 증가(95.3%에서 97.8%로)하면 탄성 모듈러스는 현저히 감소하며(28.1MPa에서 3.1MPa로) 강도도 현저히 감소 한다(2.8MPa에서 0.85MPa로). 탄성(모듈러스와 강도)과 공극률의 관계는 거의 직선이다. 표 1과 같이, 본 발명의 구조체의 탄성 응력은 정상적인 인간 피부(7.7 MPa)와 비교하면 비교적 낮다. 그렇지만, 구조체는 원래의 조직을 영구히 대체하려는 것이 아니라 손상된 피부 부위를 임시적으로 세포가 성장할 동안 지탱하려는 것이 목적이기 때문에 이 정도의 탄성 강도는 구조체를 형성함에 있어서는 부족하지 않다.

공극 크기 (㎛)	공극률(%)	탄성 모듈러스 (MPa)	최대 탄성 응력 (MPa)	최대 탄성 변형 (%)
92±5	95.3±1.2	28.1±3.2	2.8±1.1	20.5±3.6
196±8	96.8±1.7	15.71±4.6	1.84±0.7	22.4±4.7
285±6	97.8±1.3	3.42±2.5	0.85±0.4	25.2±3.4

*상기 표에서 콜라겐 가닥 직경은 323±12㎛임.

몇몇 연구자들이 보고한 바에 의하면, 콜라겐은 피부조직공학에서 이상적인 구조체 재료이다. 특별히 공극 크기가 약 100~200㎛이고 공극률이 90% 이상인 인 콜라겐 구조체는 화상환자의 피부 재생에 이용되어 왔다. 본 발명에 의하여 제조된 3차원 콜라겐 구조체(콜라겐 가닥 직경, 330±23㎛; 공극 크기, 190±17㎛; 공극률, 96.5%; 구조체 두께, 1.8mm)의 효과를 시험하기 위하여 케라티노사이트/섬유아세포(keratinocyte/fibroblast) 혼합배양방법으로 피부조직을 재생하였다(도 4a).

케라티노사이트/섬유아세포(keratinocyte/fibroblast) 혼합배양 2주 후 3차원 콜라겐 구조체는 도 4a와 같다. 구조체 내부로 세포의 이동 및 세포의 3차원적 분포를 평가하기 위하여 구조체 단면을 헤마토자일린과 에오신으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다(도 4b, 위). 또한, 케라티노사이트(CK-14) 항체로 면역조직화학 염색하여 단면을 조사하였다(도 4b, 가운데). 그리고 섬유아세포에 특이적인 마커인 비멘틴(vimentin)으로 염색하여 단면을 조사하였다(도 4b, 아래). 분석 결과 두 종류의 세포는 본 발명에 의한 구조체의 공극 구조로 인하여 잘 증식하여 구조체의 가운데층까지 원활히 이동하였다.

조직공학용 콜라겐 구조체를 제조하는 본 발명의 새로운 기술은 3차원 플로팅 방법에 극저온 시스템을 적용한 것이다. 이 방법을 이용하면 디자인된 형상의 구조체를 형성할 수 있고 표면이 거칠게 개질된 콜라겐 구조체를 별도의 화학적 공정 없이 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 알지네이트 또는 실크와 같은 수용성 천연재료로부터 3차원의 디자인된 구조체를 제조하는데 이용할 수 있다. 구조체를 구성하는 콜라겐 가닥은 직경 250~500㎛로 다양하게 선택 가능하고, 이 직경은 공정 변수에 따라 달라진다. 또한, 최종 구조체는 높은 공극률(> 96%)을 나타내며, 최초 디자인된 구조체에 비해 10% 미만으로 수축된다.

다양한 공극 크기와 공극률에 따른 3차원 콜라겐 구조체의 기계적 성질 시험 결과는 구조체 변수를 조절함으로써 구조체의 기계적 성질을 용이하게 조작할 수 있음을 보여준다. 나아가 인비트로 케라티노사이트/섬유아세포 혼합배양에서 세포들은 구조체 내로 원활히 이동하여 침윤되어 본 발명의 콜라겐 구조체는 피부조직 재생에 적합함을 알 수 있었다. 다양한 천연 재료를 이용한 3차원 구조체 제조에 있어서 본 발명의 방법을 이용하면 재생 가능한 3차원 구조를 생산할 수 있고, 종래 구조체의 문제점인 공극 크기 조절 및 공극간 상호 연결성이 낮은 문제점을 극복할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면 3차원 구조체 제조에 있어서 원하는 모양의 3차원 구조체를 극저온 방법으로 원활히 제조할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면 조절된 공극 크기, 공극률 및 공극간 상호연결구조를 갖는 3차원 구조체를 용이하게 그리고 재현 가능하도록 형성할 수 있다.

콜라겐, 알지네이트, 실크 등의 다양한 수용성 재료 및 PLA, PGA 등 다양한 유기용매 용해성 재료를 이용한 3차원 조직재생용 구조체 제조에 있어서, 본 발명의 방법을 이용하면 재생 가능한 3차원 구조를 생산할 수 있고, 종래 구조체의 문제점인 공극 크기 조절 및 공극간 상호 연결성이 낮은 문제점을 극복할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 이용하여 얻어진 최종 구조체는 높은 공극률(> 96%)을 나타내며, 최초 디자인된 구조체에 비해 10% 내외로 수축된다.

이하 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위에 한정되지 아니함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<극저온 3차원 플로팅 시스템>

극저온 3차원 플로팅 시스템은 3차원 로봇(DTR3-2210-T-SG, DASA Robot, South Korea)과 분배 시스템(AD-3000C, Ugin-tech, South Korea) 및 극저온 제조판재로 구성된다. 극저온 냉동 시스템은 두 개의 컴프레서와 스테이지의 온도를 낮추는 순환 실리콘 오일 및 순환 펌프로 구성된다. 스테이지의 온도는 컴프레서를 조절함으로써 ±3℃의 오차 이내로 유지된다. 스테이지의 습기를 제거하기 위하여 질소가스가 지속적으로 제거된다. 이 공정에서 노즐 내의 콜라겐 용액이 얼기 쉬우므로 플로팅 시스템의 콜라겐 용액은 25℃로 가열하였고, 노즐 팁은 스테이지로부터 온도 전도를 최소화하기 위하여 실리콘 고무로 코팅하였다. 3차원 구조 변수는 노즐 작동 속도(2, 4, 8, or 16 m^-1), 공기압(151 ± 5 kPa로 일정하게 함) 및 제작 스테이지 온도와 같은 시스템 변수를 조정함으로써 조절하였다. 본 실시예에서는 세 가지 다른 노즐(300, 400, 및 500㎛ 직경)을 이용하였다. 구조체는 20Χ20Χ2mm³로 디자인되었다.

<구조체 특성 규명>

동결건조된 콜라겐 구조체의 형상은 디지털 카메라가 장착된 광학현미경(BX FM-32; Olympus) 및 주사전자현미경M(Sirion; FEI, Hillsboro, OR)으로 관찰하였다. 관찰 전 구조체는 금으로 스퍼터링하였다. 시료 제조 및 측정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 구조체 공극률(Φ)은 Φ = 1- M/ρhs 식으로 계산하였다. 여기에서 M은 구조체의 질량이고 ρ은 콜라겐 밀도(1.3 g㎝^-3), h는 구조체 두께, 그 리고 s는 구조체의 표면적이다.

공극률이 3차원 콜라겐 구조체의 기계적 성질에 미치는 영향은 탄성을 측정하여 평가하였다. 동결건조 후 구조체를 작은 조각(8Χ20Χ1.5mm³)으로 잘랐다. 각각의 3차원 구조체에 대하여 다섯 개의 시료를 각기 다른 부위에서 얻었다. 탄성기(Top-tech 2000, Chemilab, South Korea)로 단축 시험(uniaxial test)을 수행했다. 콜라겐 구조체의 응력 대 변형 곡선(stress-strain curve)은 스트레칭 속도 0.5 mms^-1.로 기록하였다(n = 5).

<세포 분리 및 배양>

정상 인간 케라티노사이트 및 섬유아세포는 통상적인 포경수술을 통해 성인의 포피로부터 얻었고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 널리 알려진 방법으로 배양하였다. 간단히 설명하면, 포피 생검을 인산완충액 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고, 작은 조각으로 자른 후 디스파아제(dispase, Gibco) 10mg/mL 용액에서 한 시간 동안 37℃로 배양하였다. 끝이 가는 핀셋으로 진피로부터 상피층을 들어내어 0.1% EDTA(Gibco)를 포함하는 0.05% 트립신 용액에 30분간 37℃로 처리하여 케라티노사이트를 분리하였다. 케라티노사이트는 원심분리(5분)로 침전시킨 후 0.15mM 칼슘 및 보조 성장인자(KGM; Lonza)가 들어 있는 케라티노사이트 성장 배지 내에서 배양하였다. 진피는 0.2% 콜라게나아제(Sigma)로 37℃에서 한 시간 처리하여 섬유아세포를 얻었다. 섬유아세포는 원심분리(5분)로 침전시키고 섬 유아세포 성장 배지(FGM; Lonza) 내에서 배양하였다. 케라티노사이트 및 섬유아세포는 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

3차원 콜라겐 구조체 내로 세포의 이동과 침윤을 평가하기 위하여 케라티노사이트/섬유아세포 인비트로 혼합배양 방법을 이용하였다. 구조체는 생검용 펀치를 이용하여 직경 8 mm로 자르고 20ml DMEM:F12에서 오버나잇 배양하였다. 배양된 케라티노사이트와 섬유아세포(20:1 비율)는 30㎕의 KGM에 재현탁하였다. 각 구조체는 5Χ10⁵개의 세포와 함께 다섯 시간 동안 37℃로 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배지는 새로운 KGM으로 교체하고, 세포는 매일 배지를 교체하면서 일주일 동안 배양하였다. 1주 경과 후, 구조체를 스테인레스 스틸 그리드 상에 놓았다. 배양배지를 제거하고 E-배지 (DMEM 및 F12 배지가 3:1 비율로 혼합되고 10% FBS, 5mg/ml 인슐린, 5mg/ml 트랜스페린, 2Χ10^-8 M T₃, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10^-6 M 콜레라 독소, 0.4㎍/ml 하이드로코르티손이 함유됨)를 추가하였다. 그리드는 9일 동안 더 배양하였다.

<면역조직화학 염색>

고정된 시료는 파라핀에 넣고 4㎛ 두께로 절단한 후 자일렌으로 파라핀을 제거한 다음 일련의 농도 구배 에탄올로 재수화하였다. 그리고, 10mM 구연산 완충액(pH 6.0)에서 121°C, 10분간 열처리하였다. 염소 혈청으로 상온에서 10분 배양 한 후 절편은 항 CK14 일차 단일클론항체(Novocastra) 또는 비멘틴(vimentin, Dako)으로 한 시간 동안 배양한 후 패스트 레드(Fast red)로 염색하였다. 조각들을 인산완충액 생리식염수로 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 2차 항체와 함께 한 시간 동안 배양하였다. 절편은 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine, Dako)에 넣고 원하는 염색 강도가 날 때까지 배양하였다.

도 1은 3차원 콜라겐 구조체 제조방법에 관한 것이다. a, 원하는 구조체의 도식 다이어그램이다(20×20×1.5㎣); b, -40℃ 극저온 플로팅 및 공정 시스템의 도식이고(좌측), 제조된 구조체 이미지(우측); c, 제조된 3차원 구조체를 -76℃로 3일간 완전히 동결건조한 것이다. 막대 = 1mm d, 95% 에탄올 내 1~100mM EDC 용액으로 24시간 실온 처리한 구조체의 전자현미경 사진이다. 막대는 1 mm.

도 2는 본 발명에 의하여 제조된 3차원 콜라겐 구조체의 주사전자현미경 사진이다. a, 동결건조 후 공극 크기(260㎛) 및 가닥 직경(330㎛)을 나타내는 사진; b, 구조체의 표면 형상을 나타내는 사진; c 및 d, 196㎛ 공극 크기(c) 및 285㎛ 공극 크기(d)를 가지는 구조체.

도 3은 구조체 변수에 대한 제조 조건의 영향을 나타내는 데이터이다. a, 다양한 노즐 직경(300, 400 및 500㎛)과 다양한 공정 온도에 따른 가닥 직경의 균일성을 나타내는 그래프(이때 노즐 구동 속도는 4mms^-1, 압력은 151±5 kPa로 고정된 값이다); b, 콜라겐 가닥을 -40℃, 0℃ 및 10℃에 두었을 때의 사진; c, 노즐 크기와 노즐 구동 속도가 가닥 직경에 미치는 영향. 노즐 직경과 가닥 직경은 점선과 같이 1:1 상관관계가 있을 것으로 예측하였다. 노즐 속도가 증가함에 따라 가닥 직경이 감소하였다 d, 동결건조 전·후 광학 이미지 및 주사전자현미경 이미지. 화살표는 동결건조 후 수축된 부분을 나타낸다; e, 지시된 속도로 움직이는 300 및 500㎛ 노즐을 이용하여 제조된 콜라겐 가닥의 동결건조에 의해 유도된 수축량; f, 다양한 공극률(95.3, 96.8 및 97.8%)을 가지는 콜라겐 구조체의 응력 대 변형 곡선. 다른 공극 크기(각각 92, 196 및 285㎛)의 구조체는 동일 노즐 크기(300㎛) 및 플로팅 속도(7mms^-1)로 제조하였다.

도 4는 케라티노사이트와 섬유아세포 세포 배양 후 콜라겐 구조체 이미지(직경 8mm 두께 2mm) a, 광학 이미지. 막대 = 2mm; b, 헤마토자일린 및 에오신 염색한 절편(위), 사이토케라틴(CK14) 면역조직화학 염색한 절편(중간), 비멘틴 염색한 절편(아래). 하얀 부분은 콜라겐 가닥 절편이다. 막대 = 1mm.

Claims (8)

1. 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법에 있어서,

   그 위에 구조체를 형성하는 재료가 올려지는 스테이지의 표면 온도를 -50~0℃로 유지하고 그 위에 상기 재료를 노즐로 분출하여 3차원 구조체를 제조하는 공정; 및

   상기 제조된 3차원 구조체를 동결건조하는 공정;을 포함하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 3차원 구조체 제조공정에서 스테이지 표면 온도는 -40~-20℃임을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 재료는 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스 포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 3차원 구조체 제조공정에서는 스테이지 주변의 질소 가스를 지속적으로 제거하여 수분을 조절함을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
5. 청구항 1에 있어서,

   상기 동결건조 공정 이후 동결건조된 콜라겐 구조체의 가닥을 교차 결합시키는 공정이 부가되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
6. 청구항 1에 있어서,

   상기 스테이지 온도는 동결건조 실리콘 오일을 스테이지 내부로 순환시켜 온도를 유지시키는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체를 제조하는 방법.
7. 상기 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 방법으로 제조되며, 공극률 95.3% 이상, 축소율 10% 미만인 것을 특징으로 하는, 수용성 재료로 제조된 조직 재생용 3차원 구조체.
8. 내부에 조직 재생용 구조체 재료를 내장하는 카트리지와, 상기 카트리지를 상하 및 좌우 방향으로 이송시키는 이송로봇과, 상기 카트리지에 내장된 구조체 재료가 노즐을 통해 배출되도록 카트리지 내부를 가압하는 압축부재와, 상기 구조체 재료를 배출시키는 노즐 및 노즐을 통해 배출되는 상기 구조체 재료가 그 위에 놓여 구조체를 형성하는 스테이지를 포함하는 조직 재생용 구조체 제조장치에 있어서,

   상기 스테이지의 표면 온도가 -50~0℃로 유지되도록 조절되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 3차원 구조체 제조장치.

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