KR101291830B1

KR101291830B1 - 녹각교를 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101291830B1
Application number: KR1020120011353A
Authority: KR
Inventors: 김동석; 김잔디; 정효순; 송강준
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2013-07-31

Abstract

본 발명은 녹각교(鹿角膠, CERVI CORNUS COLLA)를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제 및 인공피부 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, 다양한 아미노산과 무기질을 포함하는 당단백질의 일종인 녹각교를 진피 대체물 제조에 포함시킴으로써, 기저막 형성을 촉진하여 각질형성세포의 성장을 높이는 인공피부 제조방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 녹각교가 포함된 인공피부는 각질형성세포의 증식, 분화 또는 기저막 형성을 촉진하는 효과가 우수하므로, 피부 치료, 의학적 이식 및 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사, 화장품 효능 검사에 사용될 수 있는 효과가 있을 뿐 아니라 생리학적, 분자학적 연구에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

녹각교를 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법{CONSTRUCTION METHOD FOR ARTIFICIAL SKIN CONTAINING CERVI CORNUS COLLA}

본 발명은 녹각교(CERVI CORNUS COLLA)를 포함하는 진피 대체물 및 인공피부와 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 인체 체표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 성인의 경우 그 면적이 약 1.2 ∼ 2.3 m²에 이른다. 피부는 상층부의 표피(epidermis), 표피층 하단부의 기저막(basement membrane), 진피(dermis)로 구성된다. 표피에 비해, 진피의 두께는 부위에 따라 많은 차이가 있지만 표피의 약 3배로 알려져 있다. 표피 조직은 생화학적/형태학적 특성에 따라 구분된 4 개의 세포층으로 구성되어 있는데, 기저막에 접한 제일 하단부로부터 기저층(stratum basalis, basal cell layer), 유극층(stratum spinosum, spinous cell layer), 과립층(stratum granulosum, granular cell layer), 각질층(stratum corneum)으로 계층화되어 있어 피부 표면에는 최종 분화된 죽은 세포가 여러 겹으로 쌓여 보호막 기능을 수행하게 된다.

기저막은 제4형 콜라겐 lattice에 라미닌 및 여러 세포외 간물질이 침착된 얇은 막 형태로 기저층의 세포가 부착하고 있으며, 상처가 나면 기저막의 분해가 동반되어 기저층의 세포가 진피의 제1형 콜라겐과 접하게 되며 이때 α2β1 integrin 등을 이용하여 표피세포가 측면으로 이동하여 재상피화 (re-epithelialization)를 유도하게 된다. 진피는 크게 상층부의 섬유아세포(fibroblast)가 풍부하고 미세 혈관이 분포하는 유두층(papillary layer)과 두꺼운 콜라겐 섬유가 풍부한 세망 결합 조직(reticular connective tissue)으로 구성되어 있다. 모낭 및 여러 피부 부속 기관은 진피 깊숙이 위치하고 있어, 부분층 피부손상(partial thickness wound)처럼 표피층이 소실된 경우에도 모낭에서부터 표피세포가 자라 나와서 재상피화를 유도하게 된다.

인공피부는 피부 기능의 일부를 대신할 수 있도록 인체에 적응시킨 인공 장기라고 말할 수 있는데, 임상학적으로 볼 때 일시적으로 손상된 부위의 보호를 목적으로 하는 창상피복제(wound dressing)와 정상피부에서 채취한 섬유아세포 혹은 표피 세포를 생체 내에서 배양한 배양 피부(cultured skin equivalent)라고 하는 두 가지로 크게 나눌 수 있다. 창상피복제는 화상이나 외상 등에 의해 손상을 입은 피부가 회복할 때까지 일시적으로 환부를 보호하는 것으로, 체내로부터의 수분 누출을 방지하고 삼출액을 흡수하며, 외부로부터 잡균의 침입 및 감염을 방지하는 역할을 한다. 겔을 응용한 것 이외에 폴리우레탄막 또는 천연 다당류인 키틴 등을 이용한 다공성 막이나 돼지가죽의 동결건조물 등으로 제조되어 여러 가지 제품이 임상적으로 사용되고 있다. 배양피부는 기저막을 완전하게 보존하고 있는 상태로 이식이 가능하기 때문에 이식 후에 빠른 시일 내에 기저막의 재건이 기대되고, 통상 1회 시술로 자가이식하는 면적은 체표면적의 15% 정도이기 때문에 배양피부의 공급이 가능하지만, 그 안전성에 있어서 많은 검토가 필요하며, 제조회사에 따라 약간의 차이는 있지만, 안전성 평가(박테리아, 진균류)와 내독성 및 mycoplasma 시험을 통해 안정성 및 안전성을 검증해야 한다.

인공피부로 연구되고 있는 것 중에는 실리콘 가아제, 가교 폴리비닐알코올 스폰지, 특수직물(폴리아미드 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 레이온 섬유 등을 재료로 한 벨로아(velour)), 또 이와 같은 특수직물에 특정 단백질을 피복한 것, 실리콘 고무로 된 막, 피브린 막, 셀룰로오스 막 등이 있으나 생체와의 거부반응, 기계적 성질 및 밀착성의 결여 등의 문제점으로 인공피부로서의 충분한 기능을 발휘하지 못하고 있다.

한편, 인공피부는 주위의 자가 세포에 의한 재생능력을 상실한 광범위한 3도 이상의 화상이나, 당뇨병 등으로 인한 피부 궤양, 의약품 또는 화장품의 효능 실험 등에 사용된다. 인공피부는 손상된 인간의 피부를 대체할 수 있는 피부 대용품으로써 피부 치료나 이를 위한 의약품개발 또는 화장품의 효능을 시험하기 위한 실험재료로 매우 중요하다.

따라서 이와 같은 활용을 위해서는 자연 피부층을 모방한 구조를 갖는 인공피부의 개발이 요구되는데, 유럽의 경우 2013년부터 동물실험을 통해 만든 화장품의 판매가 전면 금지되기 때문에, 유명 해외 화장품업체들은 인공피부 개발에 많은 투자를 하고 있는 실정이다. 예를 들면, 프랑스의 로레알이 자체 개발한 ‘에피스킨’은 동물실험을 완전히 대체가능한 인공피부로 유럽 표준을 통과했으며, 미국 마텍에서 개발한 ‘에피덤’은 실제 사람 피부에 비해 너무 민감한 반응을 보여 조건부 승인만을 받은 상태이다. 현재까지 개발된 인공피부 모델 중 대표적인 방법으로는 표피가 제거된 진피위에 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법 (living skin equivalent, LSE)이 있다 (Regnier M et al, Front Matrix Biol. 1981;9:4-35;Bell E et al, J Invest Dermatol. 1983;81:2s-10s.).

그러나, 지금까지 개발된 인공피부의 경우 진피를 모방한 콜라겐 겔과 표피를 모방한 표피층 사이에 기저막이 충분히 형성되지 못하는 단점이 있으며, 초대배양(primary culture cell)을 실시함으로써 비용이 많이 들고, 대량 생산이 어렵다는 점 등의 문제점을 안고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 초대배양이 아닌 세포주(Cell line)를 사용함으로써 비용의 절감 및 대량 생산이 가능하며, 천연물질인 녹각교를 사용하여 동물실험을 대체할 수 있는 인공피부를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 히알루론산과 녹각교 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계, 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계 및 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

이에 더하여, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물을 제공한다

본 발명의 일 구현예로, 상기 진피 대체물은 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 진피 대체물은 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 진피 대체물은 녹각교 기질 혼합물 1 mL당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 진피 대체물상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대체물 6cm² 당 10,000 내지 100,000,000 개인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 인공피부는 각질형성세포의 증식, 분화 또는 기저막 형성을 촉진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 인공피부는 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 인공피부는 의학적 이식용으로 적용되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 a) 히알루론산과 녹각교 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계, b) 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계 및 c) 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 a) 단계는 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 a) 단계는 녹각교 기질 혼합물 1 mL 당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 c) 단계는 b) 단계를 통하여 제조된 진피 대체물 6 cm²당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 c)단계에서의 각질형성세포 접종 후 배양은 DMEM(Dulbeco's modified Eagle's medium)과 Ham's의 혼합 배양액(Ham’s nutrient mixture)으로 덮여있는 상태로 초기 16 내지 24시간 동안 배지에 침지시켜 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 c)단계의 초기 배양 된 각질형성세포를 12 내지 14일 동안 공기 중에 노출시켜 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물을 제공한다.

이에 더하여, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공한다.

본 발명에 따른 녹각교가 포함된 인공피부는 각질형성세포의 증식, 분화 또는 기저막 형성을 촉진하는 효과가 우수하므로, 피부 치료, 의학적 이식 및 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사, 화장품 효능 검사에 사용될 수 있는 효과가 있을 뿐 아니라 생리학적, 분자학적 연구에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 녹각교, 콜라겐, 히알루론산으로 제조된 본 발명의 진피 대체물과 대조군의 진피 대체물에서 수축정도의 차이를 나타낸 것이다.
도 2는 녹각교, 콜라겐, 히알루론산으로 제조된 본 발명의 진피 대체물로 제조된 인공피부와 대조군을 각각 배양하여 헤마톡실렌과 에오신으로 염색한 결과를 나타낸 것이다(400 배율).
도 3은 녹각교, 콜라겐, 히알루론산으로 제조된 본 발명의 진피 대체물로 제조된 인공피부와 대조군을 각각 배양하여 항원항체반응으로 염색한 PCNA와 involucrin의 분포를 나타낸 것이다(400 배율).
도 4는 녹각교, 콜라겐, 히알루론산으로 제조된 본 발명의 진피 대체물로 제조된 인공피부와 대조군을 각각 배양하여 항원항체반응으로 염색한 integrin α6 과 integrin β1의 분포를 나타낸 것이다(400 배율).

본 발명자들은 인체피부의 표피를 최대한 모방할 수 있는 인공피부를 제조하기 위하여 연구하던 중, 다양한 아미노산과 무기질을 포함하는 당단백질의 일종인 녹각교를 사용하여 인공피부의 진피 대체물을 구축할 경우, 기저막 형성을 촉진하여 각질형성세포의 성장을 높일 수 있다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

상기로부터, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 또는 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공한다.

녹각교는 각종 사슴의 각질화(角質化)된 뿔인 녹각(鹿角)을 절단하여 물로 끓여서 농축하여 만든 아교질 덩어리로써, 칼슘과 같은 13종의 무기질을 포함해서 글리신, 프롤린, 글루탐산 등의 아미노산과 콜라겐, 포도당, 과당 및 헥소사민을 함유하는 당단백질 (protein-polysaccharide)이다(Kim 등, 1973).

또한, 본 발명의 상기 진피 대체물은 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 포함할 수 있다.

상기 콜라겐은 그 종류에 제한이 없으나, 바람직하게는 I형, III형 또는 IV형 콜라겐을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 I형 콜라겐을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 진피 대체물은 녹각교가 포함됨으로써 기저막 형성이 촉진될 수 있기 때문에, 진피 대체물 제조에 포함된 녹각교는 생체 피부와 유사한 성상의 인공 피부 제조를 위한 재료로서 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, I형 콜라겐, 10 x 완충액, 10 x 배양액, 5 mg/ml 히알루론산(HA) 및 0.33 g/ml 녹각교를 혼합하여 준비한 녹각교 기질에 섬유아세포를 혼합한 뒤 분주하고, 배양기에 넣어 굳힘으로써 진피 대체물을 제조한 다음(제조예 2 참조), 제조된 진피 대체물 위에 각질형성세포를 접종하여 인공피부를 제조하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색(H&E Staining)한 결과, 본 발명의 녹각교가 포함된 인공피부가 표피의 중층화, 각질층의 발달 및 기저막 형성 효과가 있는 것으로 나타났다(실시예 1 참조).

이에 대하여, 더 자세히 알아보기 위해, 세포증식 표지자인 PCNA, 세포분화의 표지자인 involucrin, 기저막 및 표피줄기세포 표지자인 integrin-α6, integrin-β1 항체를 이용하여, 면역조직화학 염색을 수행한 결과, 본 발명의 녹각교가 포함된 진피 대체물을 이용하여 제조한 인공피부는 각질형성세포의 세포증식 뿐 아니라, 세포분화도 촉진되며, 기저막 형성 촉진 효과 또한 우수한 것으로 나타났다(실시예 2 참조).

이에 따라, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은, 히알루론산과 녹각교 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계; 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계; 및 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함한다.

상기 섬유아세포와 각질형성세포는 포유류의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 배양한 인공피부가 생체의 피부와 동등 내지는 유사한 성상을 나타내기에 적절한 분포로 생성되도록 하기 위하여, 녹각교 기질 1 ml 당 섬유아세포는 바람직하게 10,000 내지 100,000,000개를 포함할 수 있다. 본 발명의 인공피부에 있어서, 각질형성세포는 상기 진피 대체물 상에 배양되며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대체물 6 cm² 당 각질형성세포는 바람직하게 10,000 내지 100,000,000 개를 접종할 수 있다.

본 발명의 인공피부를 배양하기 위한 진피 대체물인 섬유아세포가 포함된 콜라겐, 히알루론산, 녹각교로 구성된 기질 상에 각질형성세포를 배양하여 수득한 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피이다. 또한, 본 발명에 따른 인공피부는 인체 피부의 표피에서와 같이, 표피-진피 경계부에 기저막이 존재한다.

본 발명에서 세포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 각질형성세포 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 일반적인 생체 세포 조건을 따르고, 배지 또한 생체 세포배양에 사용 가능한 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 배양 온도는 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 37℃로 할 수 있다. 배양 기간은 초기 16 시간 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 이 후 12 일 내지 14 일 동안은 공기 중에 노출시켜 배양할 수 있다. 배양 배지로서 Ham의 혼합 배양액 또는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 각질형성세포의 배양은 초기 16 시간 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 일 내지 14 일 동안은 공기 중에 노출시켜 배양하는 것이 좋다. 상기와 같이 배양 후기에 공기에 노출시켜 배양함으로써, 배양된 피부의 적절한 중층화를 유도할 수 있기 때문에 생체 내 피부와 유사한 성상의 인공피부를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 인공피부는 인간을 포함하는 포유류와 관련된 피부의 생리학적, 분자학적 연구의 수행에 유용하게 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 통상적인 방법으로 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사에도 사용될 수 있다. 상기 피부접촉물질은 외용 제재, 화장품, 섬유, 또는 세제 등의 피부에 접촉하는 모든 물질을 총칭한다. 또한 본 발명의 인공피부는 통상적인 방법에 의하여 인간을 포함하는 포유류의 화상, 창상, 피부궤양 등으로 피부가 결손된 부위 또는 당뇨병성 족부궤양 부위에 이식하기 위한 치료 목적으로 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 인공 피부는 인체를 대상으로 적용되는 것이 가장 바람직하다.

이에 더하여, 동물실험 대체로서의 효능 검사를 위한 인공피부일 경우 최대한 인공피부를 모방하는 인공피부 대용물의 제조를 통해 보다 효율적이고 자연피부에 가까운 인공피부 대용물을 제조할 수 있다. 또한, 전 세계적으로 동물보호와 복지라는 측면에서 동물실험이 사회적인 비판을 받음에 따라 동물실험을 제한하고 그 대안으로 동물실험을 대체할 수 있는 시험관 내(in vitro) 시험법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 사람 유래 세포원으로부터 배양한 인공피부를 이용한 대체시험법이 개발되고 있다. 특히 화장품 안전성 시험에 있어 인간의 질병 극복이 아닌 미용을 위한 제품 개발에 동물의 희생이 정당한가에 대한 윤리적 문제가 대두되고, 사람 배양 조직 모델을 이용한 대체시험법이 보급되면서, 유럽연합의 제7차 개정법령(Cosmetic Directive 76/768/EEC)은 2009년부터 동물실험 화장품의 생산과 판매를 금지하고 있으며, OECD 테스트 가이드라인(OECD TG 431) 에서는 인공피부를 이용한 피부 부식성 시험을 표준시험법으로 채택하고 있다.

상기로부터, 본 발명은 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물을 제공한다. 또한, 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1>

섬유아세포와 각질형성세포의 배양

10% FBS(소 태아 혈청)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, N.Y., USA) 배양액에서 각질형성 세포주 HaCaT와 섬유아세포주 CCD25SK를 각각 배양하였는데, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하여 배양하였다.

< 제조예 2>

녹각교를 포함하는 진피 대체물의 제조

녹각교를 포함하는 진피 대체물을 제조하기 위하여, 쥐꼬리에서 분리한 콜라겐을 농도가 10 mg/ml이 되도록 4℃의 0.1% 아세트산 용액에 넣고 7일 동안 교반하여 I형 콜라겐을 추출하였다. 추출한 I형 콜라겐, 10 x 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃, 200 mM HEPES), 10 x 배양액(DMEM:Ham’s nutrient mixture F12 = 3 : 1), 5 mg/ml 히알루론산(Hyaluronic Acid: HA) 및 0.33 g/ml 녹각교(시원생약(주), 충북 진천)를 준비하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 부피비율로 각각 혼합하여 실험군인 녹각교 기질 및 대조군의 진피 기질을 준비하였다.

	I형 콜라겐	10x완충액	10x배양액	히알루론산(HA)	녹각교
Collagen (대조군)	8	1	1	0	0
Collagen + HA (대조군)	7.5	1	1	0.5	0
Collagen + HA + 녹각교 (실험군)	7.5	1	1	0.4	0.1

또한, 상기 표 1과 같이 준비된 실험군 및 대조군 기질 3 ml에 3 x 10⁵개의 섬유아세포를 각각 혼합하여 24 mm transwell (Corning, Inc., USA)에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 로 설정한 배양기에 넣어 굳힘으로써 진피 대체물을 제조하였다.

< 실시예 1>

녹각교를 포함하는 진피 대체물을 이용한 인공피부의 제조 및 효과

상기 <제조예 2>에서 제조한 세 종류의 진피 대체물 위에 1 x 10⁶개의 각질형성세포를 각각 접종하여 인공피부를 제조하고, 1일 간 배양액에 침지시켜 배양하였다. 이후, 12일 동안 인공피부의 바닥을 제외하고 윗부분만 공기에 노출시켜 배양하였다. 상기 배양액으로는 DMEM과 Ham의 혼합 배양액(Ham’s nutrient mixture F12)을 3 : 1의 비율로 혼합한 용액에 5% FBS, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mg/ml 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산, 5 mg/ml 인슐린이 포함된 혼합 용액을 사용하였다. 또한, 1일 간 침지 배양 시에는 배양액에 저농도 EGF (Recombinant Human Epidermal Growth Factor, Invitrogen Co., calsbad, CA) 1 ng/ml를 첨가하였고, 12일 동안 노출 배양 시에는 고농도의 EGF (Invitrogen Co., calsbad, CA) 10 ng/ml를 첨가하였으며, 배양액을 일주일에 3회 교환하였다.

배양 12일 후, 인공피부를 10% 포름알데하이드에 고정하고, 파라핀에 포매하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색(H&E Staining)하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 녹각교가 포함된 인공피부(Collagen + HA + 녹각교)는 대조군에 비해 수축이 더 많이 일어나는 것으로 나타났다.

또한 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 살펴본 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 녹각교가 포함된 인공피부(Collagen + HA + 녹각교)는 대조군과 비교하여 표피의 중층화, 각질층의 발달 및 기저막 형성이 우수한 것으로 나타났다.

< 실시예 2>

녹각교를 포함하는 진피 대체물을 이용한 인공피부의 기저막 형성 효과

면역조직화학 염색 실험을 통해 본 발명의 녹각교를 포함하는 진피 대체물을 이용한 인공피부의 기저막 형성 효과를 알아보았다. 일차 항체로는 PCNA (Proliferating Cell Nnuclear Antigen, Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-56, Santa Cruz, CA), involucrin (Sigma chemical, St. Louis, I9018, USA), integrin-α6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-6597, Santa Cruz, CA) 및 integrin-β1(Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-9970, Santa Cruz, CA) 항체를 이용하고, 이차 항체로는 anti-goat IgG (PK-6105, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 항체를 이용하였다. 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체 기법(avidin-biotin-peroxidase complex method, UltraVision Detection System Anti-Polyvalent, HRP/DAB, Thermo Scientific, Inc., Fremont, CA)을 이용하였다.

면역조직화학 염색 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 녹각교가 포함된 진피 대체물을 이용하여 제조한 인공피부(Collagen + HA + 녹각교)는 대조군과 비교하여 각질형성세포의 세포증식 뿐 아니라, 세포분화도 촉진되어 표피의 상층부에 involucrin과 같은 구조단백질이 많이 발현되는 것으로 나타났다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 녹각교가 포함된 진피 대체물을 이용하여 제조한 인공피부(Collagen + HA + 녹각교)는 대조군과 비교하여 integrin-α6 및 integrin-β1 발현이 증가되는 것으로 나타나 효과적으로 기저막 형성이 촉진되는 것을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물.
제1항에 있어서,
상기 진피 대체물은 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진피 대체물.
히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부.
제3항에 있어서,
상기 진피 대체물은 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
제3항에 있어서,
상기 진피 대체물은 녹각교 기질 혼합물 1 mL당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
제3항에 있어서,
상기 진피 대체물상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대체물 6cm² 당 10,000 내지 100,000,000 개인 것을 특징으로 하는, 인공 피부.
제3항에 있어서,
상기 인공피부는 각질형성세포의 증식, 분화 또는 기저막 형성을 촉진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인공피부는 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인공피부는 의학적 이식용으로 적용되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부.
a) 히알루론산과 녹각교 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계;
b) 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계; 및
c) 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 및 녹각교를 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 a) 단계는 콜라겐 또는 섬유아세포를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는, 인공피부의 제조 방법.
제10항에 있어서,
상기 a) 단계는 녹각교 기질 혼합물 1 mL 당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 인공피부의 제조 방법.
제10항에 있어서,
상기 c) 단계는 b) 단계를 통하여 제조된 진피 대체물 6 cm²당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것을 특징으로 하는, 인공피부의 제조 방법.
제10항에 있어서,
상기 c)단계에서의 각질형성세포 접종 후 배양은 DMEM(Dulbeco's modified Eagle's medium)과 Ham의 혼합 배양액(Ham's nutrient mixture)으로 덮여있는 상태로 초기 16 시간 내지 24 시간 동안 배지에 침지시켜 배양하는 것을 특징으로 하는, 인공피부의 제조 방법.
제14항에 있어서,
상기 c)단계의 초기 배양 된 각질형성세포를 12 일 내지 14 일 동안 공기 중에 노출시켜 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공피부의 제조 방법.
히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물.
히알루론산 및 녹각교를 포함하는 동물실험 대체용 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부.