KR100386418B1

KR100386418B1 - 인공 피부 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100386418B1
Application number: KR10-2000-0042663A
Authority: KR
Inventors: 박경찬; 조광현; 이동윤
Original assignee: 주식회사 웰스킨
Priority date: 2000-07-25
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2003-06-02
Also published as: KR20020008676A

Abstract

본 발명은 인공피부 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 섬유아세포가 포함된 콜라겐기질 위에 표피를 제거한 진피를 결합시킨 진피대응물에 각질형성세포를 배양하여 제조한 인공피부를 제공한다. 본 발명의 인공피부는 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 가진 중층의 표피를 가져 인체피부와 유사하기 때문에, 본 발명의 인공피부를 이용하여 피부독성도 검사를 수행할 수 있을 뿐만 아니라 화상, 피부궤양 등의 피부이식에 사용할 수 있다.

Description

인공 피부 및 그의 제조방법{Skin equivalent and manufacturing method of same}

본 발명은 인공피부 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에 표피를 제거한 진피를 넣은 다음 그 위에 각질형성세포를 배양하여 제조한 인공피부에 관한 것이다.

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 각질화하는 중층 편평상피로 진피위의 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 기저층에서 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다. 각질형성세포는 분화과정을 거치면서 고유의 기능을 수행하기에 적합한 세포로 발전되어 확립된다. 이러한 분화과정은 조직학적으로 특징적인 층이 형성된다는 것과 생화학적으로 각 분화단계에서 세포에서 발현되는 독특한 단백질을 관찰함으로써 알 수 있다.

각 표피를 이루는 층에서 관찰 할 수 있는 특성으로는 하기와 같다.

유극층에서는 기저층에서 세포분열하여 이동한 각질형성세포의 크기 신장이 일어나며 또한 기저층에서 발현되는 분자량이 작은 케라틴인 K5, K14대신에 분자량이 큰 케라틴 K1, K10이 발현된다.(Nelson W, Sun TT.J Cell Biol.1983;97:244-251 ; Fuchs E, Green H,Cell.1980;19:1033-1042 ; Eicher R, Bonitz P, Sun TT,J Cell Biol.1984;78:423-427)

과립층에서는 각질형성세포의 세포질내에 케라토하이알린 과립이 관찰되는데, 이 과립에는 프로필라그린(profilaggrin)이 들어 있다. 프로필라그린은 각질형성세포가 각질층으로 이동하면서 세포질이 파괴될 때 프로필라그린이 필라그린 (filaggrin)으로 분해되어 각질층에서 케라틴 필라멘트를 응집시키는 역할을 하는 것이다.(Ford MJ,Int J Dermatol.1986;25:547-551) 분화의 최종단계에서는 트랜스글루타미네이즈 (transglutaminase)가 활성화되어 여러 단백질의 교차결합 (cross-linking)을 유도함으로써 각질형성세포막 안쪽으로 코르니피드 외피 (cornified envelop)를 형성하는데, 코르니피드 외피는 피부가 외부의 유해한 물질로부터 보호막 역할을 하는데 중요한 요소가 된다.(Thacher SM, Rice RH,Cell.1985;40:685-695) 코르니피드 외피의 전구 물질로서 알려진 것 중에 주요한 단백질인 인볼루크린(involucrin)은 유극층에서 이미 발현하기 시작하며 로리크린 (loricrin)은 과립층에서 발현한다.(Watt FM,J Invest Dermatol.1983;81:100-103 ; Mehrel T, Hohl D, Rothnagel JA,Cell.1990;61:1103-1112)

표피의 가장 바깥층인 각질층에서 각질형성세포는 핵과 세포질이 없어지고 케라틴 필라멘트와 필라그린만 남게 되며 이를 둘러싸는 코르니피드 외피가 세포막의 소실과 함께 점차로 세포막의 기능을 대신하게 된다.

피부의 각질형성세포는 일찍부터 체외배양이 가능하여 피부의 성상을 연구하고 생체조직학적으로 활용하기 위하여 광범위하게 이용되어 왔다. 초기 각질형성세포의 배양방법은 각질형성세포를 배양액 속에 잠긴 상태로 배양한 것으로, 피부의 특징인 각질화하는 중층 편평상피를 형성하지 못하고 대부분의 세포가 표피의 기저층에 해당하는 세포의 성질을 갖게 되었다. 따라서 인체 피부가 가진 성상을 그대로 반영하지 못할 뿐만 아니라 특히 분화과정에서 일어나는 생화학적인 변화를관찰하는 것은 불가능한 일 이었다.

하지만 근래에는 기존의 세포배양방법을 발전시켜 인체 피부의 표피와 유사한 표피조직을 얻을 수 있는 각질형성세포의 삼차원적 배양방법, 즉 인공피부 모델이 개발되었다.

현재 개발되어 있는 인공피부 모델 중에서 대표적인 예로는 표피를 제거한 진피위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)이 있다.(Regnier M, Prunieras M, Woodley D.Front Matrix Biol. 1981;9:4-35 ; Bell E, Sher S, Hull B, Merrill C, Rosen S, Chamson A, Asselineau D, Dubertret L, Coulomb B, Lapiere C, Nusgens B, Neveux Y.J Invest Dermatol.1983;81:2s-10s.)

인공피부가 개발된 이후 배양조건이 점차 개선됨에 따라 인공피부의 가장 중요한 요소인 표피는 각질층을 포함하여 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부의 표피와 상당히 유사해지고 있다.(Asselineau D, Bernard BA, Bailly C, Darmon M, Prunieras M.J Invest Dermatol.1986;86:181-186; Ponec M.Toxicol in Vitro.1991;5:597-606 ; Ponec M, Weerheim A, Kempenaar J, Mulder A, Gooris GS, Bouwstra J, Mommaas AM. T.J Invest Dermatol.1997;109:348-355 ; Ponec M, Gibbs S, Weerheim A, Kempenaar J, Mulder A, Mommaas AM.Arch Dermatol Res.1997;289:317-326 ; Gibbs S,Vicanova J, Bouwstra J, Valstar C, Kempenaar J, Ponec M.Arch Dermatol Res.1997;289:585-595; Gibbs S, Boelsma E, Kempenaar J, Ponec M.Cell Tissue Res.1998;292:107-114 ; Stark HJ, Baur M, Breitkreutz D, Mirancea N, Fusenig NE.J Invest Dermatol.1999;112:681-691)

그러나 현재까지 개발된 인공피부는 인체 피부와 동일하다고 할 수는 없으며 인공피부의 표피에 있어서는 분화표식자의 발현양상이나 지질의 조성, 보호막 기능 등에 있어 인체 피부의 표피와 차이를 보이고 있다. 또한 표피를 제거한 진피위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법은 진피내에 세포성분들이 존재하지 않으며, 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법은 섬유아세포가 포함되어 있지만 실제 인체 진피와는 달리 1형 콜라겐만을 포함하고 있다.

또한 대한민국 특허공고 제 90-14547호의 콜라겐을 함유하는 생조직 등가물, 대한민국 특허공고 제 96-6788의 인공피부용 키틴계 상호침투구조 필름의 제조방법, 대한민국 특허공개 제 91-8999호에서 생체 적합성 천공막 및 이의 제조방법, 대한민국 특허공고 제 97-60646호에서 삼차원적으로 재생된 인공 피부 조직 및 그 제조방법 등의 인공피부 제조방법에 대하여 콜라겐을 이용하거나 생분해성 폴리머를 이용하여 제시하고 있으나 단지 인공피부의 3차원적인 배양에만 국한된 채 인체피부의 성상을 재현 할 수 있는 인공피부를 제공하지 못하고 있다.

따라서, 체외에서 배양한 인공피부가 인체 피부의 성상을 유지하여 학문적인 연구나, 의학적인 치료용으로 적합한 인공피부 배양방법의 개발 필요성이 여전히존재하고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 인공피부 제조방법을 도시한 것이고,

도 2는 본 발명의 인공피부와 기존의 인공피부(RE-DED)의 진피대응물을 비교한 것이고,

도 3은 본 발명의 인공피부를 헤마톡실렌과 에오신으로 염색한 것을 나타내는 사진이고,

도 4는 본 발명의 인공피부의 케라틴의 분포를 항원항체반응으로 염색한 사진이고,

도 5는 본 발명의 인공피부의 인볼루크린의 분포를 항원항체반응으로 염색한 사진이고,

도 6은 본 발명의 인공피부의 로리크린의 분포를 항원항체반응으로 염색한 사진이고,

도 7은 본 발명의 인공피부의 필라그린의 분포를 항원항체반응으로 염색한 사진이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 섬유아세포가 포함된 콜라겐기질 위에 표피가 제거된 진피를 결합시킨 진피대응물을 제공한다.

본 발명은 상기 진피 대응물에 각질형성세포를 접종하여 배양한 인공피부를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부를 제조하기 위하여 진피대응물에 표피세포를, 바람직하게는 각질형성세포(keratinocyte)를 배양하였다.

상기 진피대응물은 인체피부의 표피하부에 존재하면서 표피에 영양분과 성장인자, 신호물질 등을 제공하는 역할을 수행하기 위한 대체제로 인공피부의 배양에 가장 중요한 인자이다.

본 발명의 인공피부에 바람직한 진피대응물은 섬유아세포(fibroblast)가 포함된 콜라겐과 표피가 제거된 진피가 바람직하다.

본 발명의 인공피부를 배양하기 위한 진피대응물인 섬유아세포가 포함된 콜라겐위의 진피상에서 각질형성세포를 배양하여 수득한 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 가진 중층의 표피이며, 또한 인체 피부의 표피에서처럼 표피-진피 경계부에 표피능이 존재하고 있다. 그와 함께, 인공 피부에서 표피를 제거한 진피 안에는 인체 진피에서처럼 섬유아세포가 관찰되었는데 이는 콜라겐 기질내의 섬유아세포가 진피내로 이동한 결과이다.

또한 본 발명의 인공피부는 각질형성세포의 분화양상을 분화표식자인 케라틴 1(Keratin 1), 인볼루크린(Involucrin), 로리크린(Loricrin) 및 필라그린(Filaggr in)으로 확인한 결과, 인체피부와 유사한 분화양상을 가짐을 알 수 있었다.

한편, 인체피부와 유사한 성상을 가지는 본 발명의 인공피부를 이용하여 피부의 생리학적, 분자학적 연구를 수행 할 수 있을 뿐만 아니라 통상적인 방법으로 피부접촉물질에 대한 피부독성도 검사를 수행할 수 있다. 상기 피부접촉물질은 제재나, 화장품, 섬유, 및 세제 등의 피부에 접촉하는 물질이다.

또한 본 발명의 인공피부는 통상적인 방법을 실시하여 화상, 피부궤양으로 피부가 결손된 부위에 이식함으로써 치료의 목적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 인공피부 제조방법은 하기와 같다.

(1) 세포배양과 최종 세포준비단계: 섬유아세포, 각질형성세포를 피부조직에서 분리 및 배양하는 단계.

(2) 진피대응물 제조단계: 섬유아세포가 포함된 콜라겐 위에 표피를 제거한진피를 혼합하는 단계.

(3) 각질형성세포 접종단계: 상기 진피대응물 위에 상기 세포준비단계에서 준비한 각질형성세포를 접종하는 단계.

(4) 인공피부배양단계: 상기 단계(3)에서 접종한 각질형성세포가 충분히 배양액에 잠기도록 배양액을 넣고 2일 후부터 각질형성세포들을 대기에 노출된 상태로 배양하는 단계.

상기 (1) 단계에서 섬유아세포, 각질형성세포를 분리할 수 있는 피부조직은 어느 부위의 피부도 바람직하며, 젊은 사람의 피부가 가장 바람직하다. 상기 피부조직에서 각질형성세포, 섬유아세포를 분리한 다음 각질형성 배양액, 섬유아세포 배양액에서 배양한다. 콜라겐은 콜라겐 Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅳ형 이 바람직하며 더욱 바람직하게는 Ⅰ형 콜라겐이 바람직하다. 콜라겐용액 : 구조완충용액(reconstitution buffer) : 10배 농축한 P배양액(DMEM : Ham's nutrient mixture F12 = 3 : 1)을 8 : 1 : 1 비율로 혼합하여 콜라겐 혼합물을 준비한다.

상기 (2)단계의 진피대응물 준비단계에서는 상기에서 배양한 섬유아세포를 상기에서 준비한 콜라겐 혼합물 mL 당 1 X 10⁵내지 5 X 10⁵로 포함하는 것이 바람직하다. 섬유아세포와 콜라겐혼합물을 혼합하여 밀리셀(millicell)내에 섬유아세포가 포함된 콜라겐 혼합물을 넣은 후 젤 상태가 되면 표피를 제거한 진피를 넣어 결합시켰다.

상기 단계(4)의 인공피부배양은 각질형성세포가 충분히 배양액에 잠기도록배양액을 넣고 37 ℃에서 배양한 다음 2일 후부터 밀리셀 안의 배양액을 제거하여 각질형성세포들을 대기에 노출된 상태로 37 ℃에서 7일 내지 14일간 배양한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명의 인공피부 제조는 도 1의 도시한 바와 같이 진행하여 수득하였다. 하기에 도 1을 참조하여 상세히 설명하였다.

세포배양과 최종 세포준비단계

1) 콜라겐준비

도 1의 a로 나타낸 것으로, 1형 콜라겐 용액(니타 젤라틴, 도쿄, 일본)을 구조완충용액(reconstitution buffer: 2.2 g의 NaHCO_3,4.77 g의 HEPES(200 mM)에 0.05 N NaOH를 넣어 녹이고 최종부피를 100ml에 맞춘다.) 및 10배의 P 배양액(DMEM과 Ham's nutrient mixture F12가 3:1의 비율로 섞여 있다.)과 8:1:1의 비율로 혼합하여 콜라겐 혼합물을 만들었다.

2) 섬유아세포의 일차배양

도 1의 b로 도시한 것으로, 피부 조직을 3회 이상 용액 A 완충액(30 mM Hepes, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 130 mM NaCl, 1.0 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 0.0033 mM phenol red, pH 7.4)에 세척하였다. 상기 세척한 조직을 콜라게나아제(collagenase)가 0.25 부피％ 포함된 용액 A 완충액에 넣고 CO₂배양기에서 90분간 배양시켰다. 피부 조직을 꺼내 표피와 진피를 포셉을 이용하여 분리시킨다. 분리된 진피를 트립신(trypsin)-EDTA(0.025 % - 0.01 %) 용액에 5분간 37 ℃에서 배양시킨 후 트립신을 비활성화시키기 위해서 10 % FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나고 세포를 유리시키기 위하여 5 ml 피펫으로 흡입과 배출을 반복하고 세포 부유액을 200 g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 걷어 낸 후 용액 A로 다시 5분간 세척하였다. 세포는 섬유아세포 배양액에 섞어 헤모사이토미터 (hemocytometer)에서 세포 수를 측정하였고, 배양 용기에 약 1 ×10⁴cfu/㎠ 되도록 세포를 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 세포배양액은 10 % FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 섬유아세포를 배양하였다. 세포접종 2일 후 갈아주고 5일 후에 용액 A로 1회 세척 후 다시 갈아주며, 그 후는 2일마다 용액 A로 1회 세척하고 갈아주었다. 섬유아세포가 배양 용기에 60 - 80 % 차오르면 섬유아세포를 떼서 계대배양 또는 냉동보관하였다.

3) 각질형성세포의 일차배양

도 1의 c로 도시한 것으로, 상기 2)의 섬유아세포와 동일한 방법으로 표피를 분리, 배양하고 각질형성세포 배양액으로 KGM(Clonetics, U.S.A)을 사용하였는데, 모디파이드 MCDB(modifed MCDB) 153 배지에 표피성장인자(epidermal growth factor) 10 ng/㎖, 소 뇌하수체 추출액(bovine pituitary extract) 70 ㎍/㎖, 하이드로코티 손(hydrocortisone) 0.5 ㎍/㎖, 인슐린(insulin) 5 ㎍/㎖, 페니실린(penicillin) 100 ㎍/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖, 펀자이존 (fungizone) 0.25 ㎍/㎖를 첨가한 배양액을 사용하였다. 세포가 배양 용기에 60 - 80 % 증식되면 세포를 떼어 냉동시킨다.

4) 표피를 제거한 진피의 제조

도 1의 d에 도시한 바와 같이, 채취한 중간층 피부이식편의 정상 피부를 세척한 후 칼슘과 마그네슘을 첨가하지 않은 PBS 용액내에서 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 그 후 포셉을 이용하여 표피를 진피에서 분리하였다. 표피가 분리된 진피에 남아있는 여러 세포 성분들을 없애기 위해 액체질소를 이용하여 냉동과 해동을 여러 번 반복하였다.

진피대응물 제조단계

상기에서 배양한 섬유아세포를 상기에서 준비한 콜라겐 혼합물 mL 당 3 X 10⁵로 혼합하였다. 섬유아세포가 포함된 콜라겐 혼합물 0.2 mL씩 6-웰 플레이트내의 밀리셀에 나누어 넣은 후 37 ℃ 배양기에서 30분간 배양하면 섬유아세포가 혼합된 콜라겐 기질이 형성된다. 2일 후 밀리셀 안의 콜라겐 기질 위에 상기에서 준비한 표피를 제거한 진피를 기저막 부위가 위로 향하도록 넣어 결합시켰다.

각질형성세포 접종단계

밀리셀 내의 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에 놓인 표피를 제거한 진피 위에 5 X 10⁵세포/밀리셀로 이차 계대배양한 각질형성세포를 배양액(DMEM과 Ham's nutrient mixture F12가 3:1의 비율로 혼합된 혼합물에 10 % FBS, 5 ug/mL인슐린(insulin), 1 X 10^-10M 콜레라톡신(choleratoxin), 0.4 ug/mL 하이드로코르티 손(hydrocor tisone), 5 ug/mL 트랜스페린(transferrin), 1 X 10^-11M 트리아이오도티로닌(triiodothyronine)이 첨가되어 있는 배양액)에 섞어 접종하였다.

인공피부배양단계

본 발명의 인공피부 배양은 도 1의 e에 도시한 바와 같이, 접종한 각질형성세포들이 충분히 배양액(DMEM과 Ham's nutrient mixture F12가 3:1의 비율로 혼합된 혼합물에 10 % FBS, 5 ug/mL 인슐린(insulin), 1 X 10^-10M 콜레라톡신 (choleratoxin), 0.4 ug/mL 하이드로코르티손(hydroco rtisone), 5 ug/mL 트랜스페린(transferrin), 1 X 10^-11M 트리아이오도티로닌(triiodothyronine)이 첨가되어 있는 배양액)에 잠기도록 배양액을 넣어 주고 37 ℃에서 배양하였다. 배양 2일 후부터 f와 같이 각질형성세포들을 대기에 노출된 상태로 배양하며, 배양액을 2일마다 갈아주면서 1주일 이상 배양하였다.

[비교예 1]

본 발명의 인공피부의 조직특성을 기존의 인공피부와 비교하기 위하여 현재 개발되어 있는 인공피부 모델 중에서 가장 대표적인 표피를 제거한 진피 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)으로 실시하여 인공피부를 제조하였다. 도 2의 a)는 본 발명의 인공피부배양방법으로 하단 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질(3)에서 표피를 제거한 진피(2), 각질형성 세포(1)순으로 접종하여 배양하는 것을 나타내는 것이고, 도 2의 b)는 RE-DED방법으로 표피를 제거한 진피(2) 위에 각질형성세포(1)를 배양한 것을 나타낸 것이다.

[실험예]

피부의 형태학적 특성 비교

상기 실시예와 비교예의 인공피부 조직, 정상피부조직을 5 % 포르말린에 고정한 다음 파라핀에 포매하여 블록을 만들었다. 블록을 4 - 6 ㎛로 설정한 후 헤마토 실렌(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색을 시행하여 현미경하에서 인공 피부의 형태학적 특성을 관찰한다.

그 결과는 도 3에 도시한 것으로, 헤마톡실렌과 에오신 염색 사진을 나타내었다. a, b, c는 본 발명의 인공피부의 피부조직으로 a는 전체 피부조직을, b는 a의 상부를, c는 a의 하부를 확대한 사진으로 b와 c의 화살표는 섬유아세포를 가리키고 있다. 또한 d, e, f는 본 발명의 인공피부, RE-DED 피부, 인체피부조직사진을 도시한 것이다.

헤마톡실렌-에오신 염색으로 관찰한 결과, 상기 실시예의 본 발명의 인공 피부에서는 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 가진 중층의 표피가 형성되었고, 또한 인체 피부의 표피에서처럼 표피-진피 경계부에 표피능이 관찰되었다. 그리고 본 발명의 인공 피부에서는 표피를 제거한 진피 안에 인체 진피에서처럼 섬유아세포(도 3의 b, c의 화살표)가 관찰되었는데, 이는 콜라겐 기질내의 섬유아세포가 진피내로 이동한 결과라고 할 수 있어, 기존 인공피부에 비해 본 발명의 인공피부가 거의 인체피부에 흡사함을 알 수 있었다.

피부조직의 분화표식자의 발현양상조사

상기 실시예의 인공 피부의 표피에 있어, 분화표식자의 발현양상을 알아보기 위해 면역조직화학 염색을 수행하였다. 면역조직화학 염색의 일차항체로는 케라틴 1(Keratin), 인볼루크린(Involucrin), 로리크린(Loricrin), 필라그린(Filagg rin)에 대한 항체를 사용하였다. 상기 항체들을 이용한 면역조직화학 염색은 LSAB 키트로 하기와 같이 실시하였다.

알코올과 트실렌(xylene)를 이용하여 탈파라핀 과정을 수행한 다음 내인성 과산화 효소의 활성을 저지하기 위하여 메탄올에 3 % H₂O₂를 포함된 용액에 30분간 반응시켰다.그 후 블러킹 시약(Blocking agent: 시판용) 에 5분간 반응시키고, 일차 항체를 희석하여 실온에서 1시간 또는 4 ℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 반응 종결 후 바이오틴이 융합된 이차 항체(Biotinylated secondary antibody)를 첨가하여 피부조직에 20분간 반응시킨 다음 스트렙토아비딘 페록시데이즈(Streptoavi din peroxidase)에서 다시 20분간 반응시켰다. 이어, DAB로 적정시간 정색반응을 유도하였고, 메이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 대조 염색한 후 광학현미경하에서 분화표식자의 발현양상을 관찰한다.

(1) 케라틴1 염색

도 4의 a, b, c는 케라틴으로 염색한 피부조직을 나타낸 것으로, a는 정상 인체피부조직이고, b는 실시예의 인공피부이고, c는 비교예의 RE-DED 인공피부를염색한 사진이다.

RE-DED 인공피부에서는 표피 하부 2 내지 3층을 제외하고 각질층을 포함한 전층에 발현하였지만 본 발명의 인공 피부에서는 케라틴 1이 좀더 표피 하부에서부터 발현하기 시작하여 인체 피부의 표피와 더 유사함을 알 수 있다.

(2) 인볼루크린 염색

도 5의 a, b, c는 인볼루크린으로 염색한 피부조직을 나타낸 것으로, a는 정상 인체피부조직이고, b는 실시예의 인공피부이고, c는 비교예의 RE-DED 인공피부를 염색한 사진이다.

RE-DED 인공피부에서는 각질층을 제외한 전층에서 인볼루크린이 발현하였지만 실시예의 인공 피부에서는 인볼루크린이 표피 하부 1 내지 2층을 제외하고 좀더 늦게 발현하기 시작하여 인체 피부의 표피와 더 유사함을 알 수 있다.

(3) 로리크린의 염색

도 6의 a, b, c는 로리크린으로 염색한 피부조직을 나타낸 것으로, a는 정상 인체피부조직이고, b는 실시예의 인공피부이고, c는 비교예의 RE-DED 인공피부를 염색한 사진이다.

RE-DED 인공 피부에서는 로리크린이 과립층에서 불연속적으로 약하게 발현하였지만 실시예의 인공 피부에서는 인체 피부의 표피와 거의 동일하게 과립층에서 선상으로 로리크린이 발현함을 알 수 있다.

(4) 필라그린의 염색

도 7의 a, b, c는 필라그린으로 염색한 피부조직을 나타낸 것으로, a는 정상인체피부조직이고, b는 실시예의 인공피부이고, c는 비교예의 RE-DED 인공피부를 염색한 사진이다.

RE-DED 인공 피부에서는 필라그린이 유극층 상부, 과립층, 각질층에서 부분적으로 약하게 발현하지만 실시예의 인공 피부에서는 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 과립층과 각질층에서 필라그린이 발현되고 있음을 알 수 있었다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 인공피부는 기존의 인공피부와는 대조적으로 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 가진 중층의 표피를 가져 인체피부의 형태를 유지하고 있다. 또한 정상적인 인체피부의 표피층에 특이적으로 발현하는 분화표식자의 발현이 본 발명의 인공피부에서도 동일하게 생성되었다. 따라서 본 발명의 인공피부로 피부 생물학연구나 피부독성학 연구에 재료로 제공 할 수 있을 뿐만 아니라 임상분야에 활용가능하여 피부이식에 이용 할 수 있다.

Claims

섬유아세포가 포함된 콜라겐기질 위에 표피가 제거된 진피를 결합시킨 진피대응물.
제 1항에 있어서, 상기 섬유아세포가 포함된 콜라겐기질은 콜라겐 혼합물 mL 당 1 X 10⁵내지 5 X 10⁵개의 섬유아세포를 포함하는 것인 진피대응물.
제 1항 또는 2항에 따른 진피대응물에 각질형성세포를 접종하여 배양한 인공피부.
제 3항에 있어서, 상기 인공피부는 접종한 각질형성세포를 배양액에 충분히 잠긴 상태로 배양한 후 대기에 노출된 상태로 배양한 것인 인공피부.
제 3항에 있어서, 상기 인공피부는 피부독성도 검사에 사용되는 것인 인공피부.
제 3항에 있어서, 상기 인공피부는 피부가 결손된 부위에 피부이식방법으로 사용되는 것인 인공피부.