KR100719050B1

KR100719050B1 - 혈관을 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100719050B1
Application number: KR1020060041516A
Authority: KR
Inventors: 박경찬; 조현주; 김동석
Original assignee: 박경찬
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2007-05-16

Abstract

본 발명은 혈관을 포함하는 인공피부 제조 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물, 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 혈관이 포함된 인공피부, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인공피부는 혈관이 형성되어 있어서 생체 피부와 유사하기 때문에, 화상, 창상 및 피부궤양 등의 피부이식에 사용할 경우 생체 피부와 유사한 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

인공피부, 줄기세포, 혈관, 혈관내피 전구세포

Description

혈관을 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법{ARTIFICIAL SKIN CONTAINING BLOOD VESSELS AND CONSTRUCTION METHOD THEREOF}

도 1은 본 발명의 혈관을 포함하는 인공피부를 헤마톡실렌과 에오신으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다 (400 배율).

도 2는 본 발명의 혈관을 포함하는 인공피부에서 혈관세포의 표지자인 CD31의 분포를 항원항체반응으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다 (400 배율).

도 3은 본 발명의 혈관을 포함하는 인공피부에서 베타1-인테그린의 분포를 항원항체반응으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다 (400 배율).

도 4는 본 발명의 혈관을 포함하는 인공피부에서 혈관 형태의 튜브의 수를 세어서 비교한 그래프이다.

도 5는 CD31 면역염색을 통하여 HUVECs를 포함하는 인공피부와 EPCs를 포함하는 인공피부에 있어서의 혈관 생성을 비교한 결과이다 (400 배율).

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 혈관을 포함하는 인공피부 제조 기술에 관한 것으로, 보다 상세 하게는, 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물, 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 혈관이 포함된 인공피부, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 각질화하는 중층 편평상피로 진피위의 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 기저층에서 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다. 각질형성세포는 분화과정을 거치면서 고유의 기능을 수행하기에 적합한 세포로 발전되어 확립된다.

근래에는 기존의 단층 세포배양방법을 발전시켜 인체 피부의 표피와 유사한 표피조직을 얻을 수 있는 각질형성세포의 삼차원적 배양방법, 즉 인공피부 모델이 개발되었다. 현재 개발되어 있는 인공피부 모델 중에서 대표적인 예로는 표피를 제거한 진피위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)이 있다 (Regnier M et al, Front Matrix Biol . 1981;9:4-35 ; Bell E et al, J Invest Dermatol. 1983;81:2s-10s.).

인공피부가 개발된 이후 배양조건이 점차 개선됨에 따라 인공피부의 가장 중요한 요소인 표피는 각질층을 포함하여 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부의 표피와 상당히 유사해지고 있다.(Asselineau D et al, J Invest Dermatol. 1986;86:181-186; Ponec M. Toxicol in Vitro. 1991;5:597-606 ; Ponec M et al, J Invest Dermatol. 1997;109:348-355). 그러나, 현재까지 개발된 인공피부는 인체 피부와 동일하다고 할 수는 없으며, 대한민국 특허 제 0047869호의 젤라틴과 키틴을 함유하는 인공피부, 대한민국 특허 제 0148546의 인공피부용 키틴계 상호침투구조 필름의 제조방법, 대한민국 특허 제 0195574호에서 생체 적합성 천공막 및 이의제조방법등의 인공피부 제조방법에 대하여 콜라겐을 이용하거나 생분해성 폴리머를 이용하여 제시하고 있으나 단지 인공피부의 3차원적인 배양에만 국한된 채 인체피부의 성상을 재현 할 수 있는 인공피부를 제공하지 못하고 있다.

따라서 체외에서 배양한 인공피부가 혈관을 포함하여 피부조직에 혈액을 공급함으로써 인체 피부의 정상적인 성상을 유지하여 학문적인 연구나, 의학적인 치료용으로 적합한 혈관을 포함한 인공피부 및 그 배양방법의 개발의 필요성이 여전히 존재하고 있는 실정이다.

이와 같은 요구에 따라서, 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있도록 혈관을 포함하는 인공피부를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있도록 혈관을 포함하는 인공피부 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물, 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 혈관이 포함된 인공피부, 및 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 배양하는 것을 포함하는 인공피부 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부를 제조하기 위하여 연구하던 중, 혈관내피 전구세포를 사용하여 인공피부의 진피 대응물을 구축하면, 혈관이 형성되어 생체 피부와 유사한 성상을 그대로 재현될 수 있다는 사실을 발견하고, 이러한 사실을 이용하여 본 발명을 완성하였다.

한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물을 제공한다. 본 발명에 따른 진피 대응물은 혈관내피 전구세포에 의하여 혈관이 형성될 수 있기 때문에, 생체 피부와 동등 또는 유사한 성상의 인공 피부 제조를 위한 재료로서 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 및 상기 진피 대응물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하고, 혈관이 형성되어 생체 피부와 동등한 성상을 갖는 인공피부를 제공한다.

혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells, EPC)는 줄기세포의 분화 단계 중 수임전구세포 (Committed Progenitor Cell) 단계에 해당하여 분화할 수 있는 세포 형태가 어느 정도 한정된 줄기세포로서, 신생 혈관 형성에 참여하는 일종의 줄기 세포를 의미한다. 혈관내피 전구세포는 골수에서 유래하는 것으로, 본 발명에 있어서, 인간을 포함하는 포유류의 골수, 말초혈액 또는 제대혈 등에서 추출하여 이용할 수 있다.

본 발명의 진피 대응물 또는 인공피부에 있어서, 상기 콜라겐은 그 종류에 제한이 없으나, I형, III형 또는 IV형 콜라겐이 바람직하고, 이 중에서도 I형 콜라겐이 더욱 바람직하다. 상기 섬유아세포와 각질형성세포에는 포유류의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 혈관이 생체의 피부와 동등 내지는 유사한 성상을 나타내기에 적절한 분포로 생성되도록 하기 위하여, 콜라겐 mL 당 혈관내피 전구세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개, 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개가 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 인공피부에 있어서, 각질형성세포는 상기 진피 대응물 상에 배양되며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대응물 6 cm²당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개가 접종되어 배양된 것이 바람직하다.

본 발명의 인공피부를 배양하기 위한 진피 대응물인 혈관내피 전구세포와 섬유아세포가 포함된 콜라겐으로 구성된 진피 상에 각질형성세포를 배양하여 수득 한 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피이다. 또한, 본 발명에 따른 인공피부는 인체 피부의 표피에서와 같이, 표피-진피 경계부에 표피능이 존재한다. 또한, 본 발명에 따른 인공피부의 진피 대응물 내부에는 생체 피부의 진피에서와 같이 혈관모양의 튜브가 관찰되었는데, 이는 혈관내피 전구세포가 혈관으로 분화하여 형성된 것이다.

본 발명의 진피 대응물 또는 인공피부는 혈관의 생성을 촉진시키기 위하여 혈관생성 촉진물질이 추가로 사용되어 제조된 것일 수 있다. 상기 혈관생성 촉진 물질은 혈관 성장인자인 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 안지오텐신 II (angiotensin II, Ang II) 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 혈관생성 촉진물질은 혈관수의 증가와 더욱 발달된 형태의 혈관 형성을 위하여 적적한 양으로 사용하며, 예컨대, 인공피부 1 개 (6 cm²) 당 사용된 배지를 기준으로 혈관내피 성장인자의 경우에는 1 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 5 내지 50 ng/ml, 안지오텐신 II의 경우에는 10 내지 500 nM, 보다 바람직하게는 50 내지 200 nM을 사용하는 것이 좋다. 배지를 갈아주는 경우에는, 상기 혈관생성 촉진물질은 배지 교체시마다 상기의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 혈관을 포함하는 인공피부는 인간을 포함하는 포유류의 혈관형성과 관련된 피부의 생리학적, 분자학적 연구의 수행에 유용하게 적용될 수 있 다. 뿐만 아니라, 통상적인 방법으로 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사에도 사용될 수 있다. 상기 피부접촉물질은 외용 제재, 화장품, 섬유, 또는 세제 등의 피부에 접촉하는 모든 물질을 총칭한다. 또한 본 발명의 인공피부는 통상적인 방법에 의하여 인간을 포함하는 포유류의 화상, 창상, 피부궤양 등으로 피부가 결손된 부위 또는 당뇨병성 족부궤양 부위에 이식하기 위한 치료 목적으로 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 인공 피부는 인체를 대상으로 적용되는 것이 가장 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 혈관내피 전구세포와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관을 포함하는 인공피부의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은,

피부조직으로부터 섬유아세포 및 각질형성세포를 분리하여 배양하고, 혈관내피 전구세포를 준비하고;

콜라겐 기질에 상기 혈관내피 전구세포와 섬유아세포를 첨가하여 진피 대응물을 제조하고;

상기 진피 대응물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 섬유아세포 및 각질형성세포는 인간을 포함하는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이 바람직하며, 상기 혈관내피 전구세포는 인간을 포함하는 포유류의 골수, 말초혈액 또는 제대혈로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 세 포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 혈관내피 전구세포의 배양은 35 내지 40 ℃에서 7 내지 10 일동안 수행할 수 있다. 상기 배양에 사용된 배지는 상기 세포 배양에 통상적으로 사용되는 모든 배지를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체예에 있어서, KGM, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 또는 혈관내피 전구세포 성장 배지 (endothelial progenitor cell growth medium, EGM-2) 등을 사용할 수 있다.

상기 진피 대응물 제조 단계에 있어서, 콜라겐 mL 당 혈관내피 전구세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개, 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개를 혼합하는 것이 바람직하다. 각질형성세포는 상기 진피 대응물 상에 배양하며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대응물 6 cm² 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개를 접종 및 배양하는 것이 바람직하다.

상기 각질형성세포 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 일반적인 생체 세포 조건을 따르며, 배지 또한 생체 세포 배양에 사용 가능한 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 진피 대응물 상에서의 각질형성세포 배양시, 배양 온도는 35 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃로 할 수 있으며, 초기 16 내지 24 시간동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14 일 동안은 공기중에 노출시켜 배양하는 것이 좋다. 이와 같이 침지 배양 후 공기중에 노출하여 배양함으로써, 각질형성세포가 중층화되어 여러층을 이루게 되고, 실제 피부와 유사한 중층화된 형태의 피부 조직을 얻을 수 있게 된다.

본 발명의 인공피부 제조 방법은 혈관의 생성을 촉진시키기 위하여 혈관 성장인자인 혈관내피 성장인자(VEGF) 또는 안지오텐신 II (Ang II)와 같은 1종 이상의 혈관 생성 촉진 물질을 인공피부 1 개 (6 cm²) 당 배지를 기준으로, 혈관내피 성장인자의 경우에는 1 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 5 내지 50 ng/ml, 안지오텐신 II의 경우에는 10 내지 500 nM, 보다 바람직하게는 50 내지 200 nM을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배지를 갈아주는 경우, 상기 혈관생성 촉진물질은 배지 교체시마다 상기의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. 이와 같은 혈관 생성 촉진 물질의 첨가에 의하여 형성된 혈관수가 증가되고 더욱 발달된 형태의 혈관이 형성된 인공 피부를 얻을 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 섬유아세포와 각질형성세포의 배양 및 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)의 분리

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피 에서 분리하였다. 상기 분리 공정은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피의 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거한 후 잘게 절개하여 써모라이신 (thermolysin, Sigma chemical, St. Louis, USA) 용액에서 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 이와 같이 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하고, 각각을 트립신 용액 (Gibco, N.Y., USA)에 담아 37℃에서 15분동안 반응시킨 후, 진탕하여 단일 세포로 분리되도록 하였다. 상기의 과정을 통하여, 표피로부터 각질형성세포를, 진피로부터 섬유아세포를 분리하였다.

배양은 'Rheinwald and Green (Cell, 1975)'의 방법을 따라 수행하였다. 분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였고, 섬유아세포는 10% 소의 혈청이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유아세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하였다.

혈관내피 전구세포는 사람에서 채취된 말초혈액으로부터 기존의 방법에 따라 분리하였다 (Choi JH et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004). 혈관내피 전구세포 성장 배지 (endothelial progenitor cell growth medium; EGM-2, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였다 혈관내피 전구세포 배양시 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하였다.

실시예 2: 진피 대응물의 제조

진피보형물은 쥐꼬리로부터 분리 채취한 콜라겐 10 g을 4 ℃의 1/1000 빙초산(glacial acetic acid) 용액 1000 mL에 넣고 48 시간동안 교반하여 녹인 I형 콜라겐 용액과 10 x DMEM과 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1 (부피 기준)로 혼합하여 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL를 밀리셀(millicell)에 나누어 넣고, 각 밀리셀 당 혈관내피 전구세포 5x10⁵ 개와 섬유아세포 5x10⁵ 개를 첨가하여 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀에 3.5 ml씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 굳히는 과정으로 진피 대응물을 제조하였다 (실험군).

대조군으로서, 밀리셀 당 섬유아세포 1x10⁶ 개를 첨가하여 혼합한 콜라겐-섬유아세포 혼합액을 사용하여 상기와 같은 방법으로 진피 대응물을 제조하여 사용하였다. 상기와 같이 제조된 대조군을 도 1 내지 4에서는 'Con'으로 표시하였고, 도 5에서는 'Fibroblast'로 표시하였다.

실시예 3: 혈관을 포함하는 인공피부의 구축

상기 실시예 2에서 제조된 진피 대응물 6 cm² 위에 상기 실시예 1에서 어린아이의 포피로부터 분리한 각질형성세포 1x10⁶ 개를 접종하고, 1일간 배지에 침지시켜 배양한 다음, 다시 12 일동안 공기에 노출시켜 배양하였다. 이 때, 배양 온도는 37 ℃로 하였다. 상기 배양시, 배지로서 5 % FBS, 0.4 μg/ml 하이드로코르티손, 1 μM 이소프로테레놀, 25 μg/ml 아스코르빈산 및 5 μg/ml 인슐린을 함유하는 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다. 1일간 침지 배양시에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen Co., carlsbad, CA) 1 ng/ml를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양시에는 고농도 EGF (Invitrogen Co., carlsbad, CA) 10 ng/ml를 첨가하였다.

혈관내피 성장인자 (VEGF) 또는 안지오텐신 II (Ang II)가 혈관 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, VEGF (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA) 20 ng/ml, Ang II (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA) 100 nM, 또는 이들의 혼합물 (VEGF/Ang II)을 각각 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 배지 교환시마다 VEGF와 Ang II를 상기의 양으로 첨가하였다. 상기 실험은 동일조건으로 최소 2번 반복 실시하였다. 상기 혈관형성인자의 첨가는 각질형성세포의 배양 동안에 수행하였으며, 따라서, 그 배양 조건과 배지는 각질형성세포 배양시와 동일하게 하였다.

13일간의 배양 후 얻어진 세포를 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/chloroform/acetic acid 6:3:1)으로 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하여, 헤마톡실린 & 에오신 염색하였다 (Sigma chemical, St. Louis, USA). 이러한 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 있어서, 'vehicle'로 표시한 것은 혈관생성인자 대신에 PBS (pH 7.0)를 상기 혈관생성인자와 동량인 2.8 ul의 양으로 첨가하여 얻어진 결과를 나타내는 것이다 (도 2 내지 4에서도 동일).

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세포와 혈관내피 전구세포 (EPC)가 포함된 경우에는 대조군과 비교하여 표피의 중층화 및 각질층의 발달이 잘 되어 있었으며 기저막도 잘 형성된 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: 면역조직화학 염색

면역조직화학 염색의 일차항체로서 integrin β1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-9970, Santa Cruz, CA), platelet-endothelial cellular adhesion molecule-1 (PECAM-1 또는 CD31, clone JC70A, DAKO) 에 대한 항체를 이용하였다. 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (avidin-biotin-peroxidase complex techniques, LSAB PLUS System-HRP, DakoCytomation, K0690, Carpinteria, CA)을 사용하여 수행하였다.

혈관세포의 주요 표지자인 CD31 (platelet-endothelial cellular adhesion molecule-1)에 대한 면역조직화학염색을 실시하여 혈관 생성을 관찰한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세포와 혈관내피 전구세포가 포함된 실험군에서 모두 혈관형성이 관찰되었다. 더 나아가 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 또는 안지오텐신 II (Ang II)을 첨가한 실험군의 경우 더욱 발달된 혈관생성이 관찰되었다.

한편, 기저막의 중요성분인 integrin에 대한 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세포와 혈관내피 전구세포가 포함된 실험군에서 강한 양성소견을 관찰할 수 있었으며, 표피의 증식, 분화, 기저막 형성 등이 모두 양호한 것을 확인하였다.

실시예 5: 생성혈관의 수 측정

혈관의 밀도를 측정하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 인공피부의 절 편에서 임의의 10개의 부분을 선정하여, 1 mm² 당 CD31에 양성인 혈관상의 튜브의 개수를 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 '**'로 표시한 부분은 vehicle 처리군('vehicle'로 표시)과 비교하여 P < 0.01인 것을 나타낸 것이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세포와 혈관내피 전구세포가 포함된 실험군 중 혈관내피 성장인자 (VEGF) 또는 안지오텐신 II (Ang II)을 첨가한 실험군의 경우에 혈관 생성이 보다 증가되어 있음이 관찰되었으며, 두 인자를 같이 처리할 경우 단독 처리군 보다 더 좋은 혈관 생성 효과를 나타낸 것이 관찰되었다.

비교예 : HUVECs 첨가군과 EPCs 첨가군의 혈관 생성 비교

혈관내피 전구세포(EPCs) 대신에 인간 제대정맥 내피세포 (HUVECs; human umbilical endothelial vein cells; ATCC, Rockville, MD) 5x10⁵개를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 진피 대응물을 제조하고, 이를 이용하여 실시예 3과 동일하게 인공피부를 제작하였다. 본 발명에서 대조군으로 사용된 섬유아세포만을 포함하는 인공피부(Fibroblast), 상기에서 제조된 HUVECs를 포함하는 인공피부 (Fibroblast+HUVECs), 및 상기 실시예 3에서 제조된 본 발명의 EPCs를 포함하는 인공피부 (Fibroblast+EPCs)를 만든 후, 그 단면을 CD31에 대하여 면역염색하고, 1 mm² 크기의 10 개 부분을 임의 선발하여, 혈관형성 여부를 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 섬유아세포만을 포함하는 인공피부 'Fibroblast'의 경우는 물론이고, HUVECs를 첨가하여 제조된 'Fibroblast+HUVECs' 의 경우에도 염색된 부분이 관찰되지 않아서 혈관이 생성되지 않았음을 알 수 있다. 그러나, 본 발명과 같이 혈관내피 전구세포(EPCs)를 포함하는 인공피부 'Fibroblast+EPCs'에서는 염색된 부분이 여러 군데 발견되어 다수의 혈관이 생성되었음을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 혈관내피 전구세포를 포함하는 인공피부는 이미 형성된 혈관세포인 HUVECs를 포함하는 경우와 비교하여 혈관 생성 능력이 보다 우수함을 알 수 있으며, 따라서, 보다 생체 피부와 유사한 성상의 인공피부를 구현할 수 있음을 확인할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 혈관을 포함하는 인공피부는 혈관을 포함하여 실제 인체피부와 유사할 뿐만 아니라 혈관을 통한 혈액공급으로 상처회복에 도움을 줄 수 있기 때문에, 화상, 창상 및 피부궤양 더 나아가 당뇨병성 족부궤양 등의 피부이식에 사용할 경우 우수한 효과를 나타낼 수 있어서, 의학적 이식 용도로 매우 유용할 뿐 아니라, 피부 독성 검사 등의 각종 피부 실험용으로도 적용 가능하다.

Claims

콜라겐, 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)및 섬유아세포를 포함하는 진피 대응물.
제1항에 있어서, 콜라겐 mL당 혈관내피 전구세포 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 진피 대응물.
콜라겐, 혈관내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cells)및 섬유아세포를 포함하는 진피 대응물 및 상기 진피 대응물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하고,

혈관이 형성되어 있는 중층 구조를 갖는,

인공 피부.
제3항에 있어서, 상기 진피 대응물은 콜라겐 mL당 혈관내피 전구세포 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것인 인공 피부.
제3항에 있어서, 상기 진피 대응물 상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대응물 6 cm² 당 10,000 내지 100,000,000 개인 인공 피부.
제3항에 있어서, 혈관내피 성장인자 (VEGF) 및 안지오텐신 II (Ang II)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 혈관생성 촉진물질을 추가로 포함하는 인공 피부.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 인공 피부.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 이식용으로 적용되는 인공 피부.
피부조직으로부터 섬유아세포 및 각질형성세포를 분리하여 배양하고, 혈관내피 전구세포를 준비하고;

콜라겐에 상기 혈관내피 전구세포와 섬유아세포를 첨가하여 진피 대응물을 제조하고;

상기 진피 대응물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는,

혈관을 포함하는 인공 피부의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 섬유아세포 및 각질형성세포는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이고, 상기 혈관내피 전구세포는 포유류의 골수, 말초혈액 또는 제대혈로부터 분리한 것인, 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 진피 대응물 제조 단계는 콜라겐 mL 당 혈관내피 전구세포 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 첨가하여 수행하는 것인, 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 진피 대응물 상에서의 각질형성세포 배양 단계는 진피 대응물 6 cm² 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개를 접종 및 배양하여 수행하는 것인, 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 진피 대응물 상에서의 각질형성세포 배양 단계는 초기 16 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14 일 동안은 공기중에 노출시켜 배양하여 수행하는 것인, 제조 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진피 대응물 상에서의 각질형성세포 배양 단계에서 1종 이상의 혈관생성 촉진물질을 추가로 첨가하는 것 을 특징으로 하는, 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 혈관생성 촉진물질은 혈관내피 성장인자(VEGF) 및 안지오텐신 II (Ang II)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인, 제조 방법.