KR20210018639A - 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체 - Google Patents

자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20210018639A
KR20210018639A KR1020190096167A KR20190096167A KR20210018639A KR 20210018639 A KR20210018639 A KR 20210018639A KR 1020190096167 A KR1020190096167 A KR 1020190096167A KR 20190096167 A KR20190096167 A KR 20190096167A KR 20210018639 A KR20210018639 A KR 20210018639A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
endometrial
complex
mixture
collagen
hyaluronic acid
Prior art date
Application number
KR1020190096167A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102286779B1 (ko
Inventor
홍인선
구수경
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
대한민국(질병관리청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가천대학교 산학협력단, 대한민국(질병관리청장) filed Critical 가천대학교 산학협력단
Priority to KR1020190096167A priority Critical patent/KR102286779B1/ko
Publication of KR20210018639A publication Critical patent/KR20210018639A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102286779B1 publication Critical patent/KR102286779B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/33—Fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3808—Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 자궁내막손상 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 자궁내막복합체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 자궁내막복합체는 생체적합성 및 생분해성이 있는 히알루론산 및 콜라겐 스캐폴드(scaffold)에 전분화능이 있는 자궁내막 줄기세포, 혈관 형성을 촉진하는 혈관내피세포 및 콜라겐 합성을 촉진하여 상처 치유에 중요한 역할을 하는 섬유아세포가 부착되어 실제 자궁내막과 유사한 형태를 지니고 있고, 다양한 성장인자를 분비하며 자궁내막 손상 동물 모델에서 손상된 조직을 재생하는 효과가 있으므로 자궁내막 손상으로 인해 발생하는 불임의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체{Endometrial complex for treating endometrial damage, manufacturing method of endometrial complex and endometrial complex using the same}
본 발명은 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체에 관한 것이다.
최근 고령화 사회와 함께 출산을 하는 산모의 나이가 높아지면서 불임/난임이 증가하고 있으며, 산업화로 인한 환경오염과 여성의 사회진출 등으로 인해 여성이 받는 스트레스가 증가하면서, 임신율이 크게 낮아지고 있는 실정이다. 일반적으로 알려진 여성 불임 또는 난임의 원인으로는 배란장애, 수정란의 이송 장애 및 착상장애 등이 있으며, 그 중 착상장애에 의한 불임은 아직까지 명확한 해결 방법이 없는 실정이다.
정상적인 임신과정은 수정, 착상 및 태아발달의 순서로 진행되는데, 수정란의 착상에서 수정란의 질과 자궁내막의 두께 및 수용성(receptivity) 여부가 매우 중요한 요인이라 할 수 있다. 특히, 자궁내막과 관련하여, 수정란이 자궁 안쪽으로 이동하여 착상을 시도할 때 첫 번째로 확인하는 것은 자궁내막의 두께인데, 자궁내막의 두께는 최소 7mm 이상이 되어야 하며 건강한 여성은 10-14 mm 정도라고 알려져 있다.
자궁내막(endometrium)은 자궁 내 공간의 선을 이루는 세포로서 배아의 착상(implantation)에 중요한 역할을 한다. 자궁내막은 성장인자(growth factor)와 사이토카인(cytokine)을 분비하여 배아가 착상하고 발달하는 환경을 제공하며 여성호르몬인 에스트로겐과 프로게스테론의 조절에 의하여 모양적, 기능적으로 일정한 주기에 따라 변화를 일으킨다.
비가역적인 자궁내막의 손상은 자궁수술, 결핵 감염 또는 자궁내막 감염 등에 의하여 발병되며, 자궁내막에 섬유화된 흉터를 발생시켜 습관성 유산과 불임/난임의 원인이 된다. 특히, 상기의 여러 가지 원인으로 자궁내막이 손상되면 자궁의 기능이 저하되고 정상적인 수준의 두께를 유지하기가 어려워져, 착상이 제대로 이루어지지 않거나 착상이 되더라도 배아의 발달이 정상적으로 이루어지지 않게 된다.
이러한 자궁내막의 손상은 세포 또는 조직 재료 공학적인 치료법을 필요로 한다. 자궁내막 손상의 세포 치료 연구는 설치류 모델에서 콜라겐과 골수 줄기세포를 이용하여 치료한 보고가 있으나, 치료 기간이 3달 이상 필요로 하는 것으로 보고되어 한계가 있다 (Ding L et al., Biomaterials, 2014, 35 (18): 4888-4900). 이에, 효과적으로 자궁내막 손상을 치료할 수 있는 방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
조직공학(Tissue Engineering)이란 세포를 생체 적합한 기질에 3차원적으로 배양하여 세포-기질 복합체를 제조하고 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 학문이다. 조직공학의 기본적인 원리는, 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 배양하여 필요한 양만큼 증식시키고, 증식된 세포를 다공성 구조를 가지는 생분해성 고분자로 이루어진 스캐폴드(scaffold)에 이식하여 일정 기간 체외 배양한 후 이 세포/고분자 구조물을 다시 인체 내에 이식하는 것이다.
이와 같이 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 생분해성 고분자인 스캐폴드의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할도 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성(biocompatible)이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 조직으로서 본연의 기능과 역할을 충분히 수행하게 되면 원하는 시간에 생체 내에서 완전히 분해되어 사라질 수 있는 생분해성(biodegradable)을 지녀야 한다. 현재 임상에서 생분해성 천연고분자로서 히알루론산 또는 콜라겐을 널리 사용하고 있다.
한편, 히알루론산(Hyaluronic acid)은 다당류의 복합체로서 폴리사카라이드가 디사카라이드(disaccharide), β-1,4-D-글루쿠로닉산-β-1,3-N-아세틸-D-글루코사민(β-1,4-D-glucuronic acid-β-1,3-N-acetyl-Dglucosamine)의 반복적인 구조로 이루어져 있으며 체내에 존재하는 물질이다. 히알루론산은 세포 내 지지체를 구성하는 중요한 물질로서 세포 및 조직의 모양을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 콜라겐(collagen)은 인체의 경조직(뼈, 치아) 및 연조직(연골, 피부, 인대, 근육)을 이루는 유기물의 주된 성분으로, 원활한 조직재생에 필수적인 성분이다. 따라서, 이러한 히알루론산 또는 콜라겐 고분자를 이용하여 인체의 손상된 조직 및 장기를 효과적으로 재생하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell)는 자궁내막 조직에서 유래한 성체줄기세포(Adult stem cells, ASCs)의 한 종류로, 배아 이외의 조직에서 분리, 배양된 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSCs)라고도 불린다. 중간엽줄기세포는 분리 배양된 경우, 배양 접시에 부착되어 자라며, CD105, CD73, CD90을 발현하며 CD45, CD34, CD14, CD79, HLA-DR을 발현하지 않고, 간단한 조작으로 중배엽성 조직 (뼈, 연골, 지방)으로 분화될 수 있어야 한다(Fukuchi Y et al., Stem Cells 22:649~658, 2004; Wulf GG et al., Tissue. Eng. 10:1136~1147, 2004; Dominnici M et al., Cytotherapy 8:315~317, 2006). 하지만, 최근의 연구에 의하면 이들 세포는 중배엽뿐 아니라 외배엽(주로 신경세포) 혹은 내배엽(간세포, 췌장세포 등) 으로도 분화할 수 있음이 밝혀져서 간엽줄기세포 또한 전분화능(Multipotency)을 가지는 것으로 인정되고 있다.
혈관내피세포(vascular endothelial cell)는 혈관형성에 관여하는 세포로서 여러가지 사이토카인이나 성장인자 또는 호르몬 등에 의해 혈관형성이 이루어지는 곳으로 이동하여 자체에서 분비되는 인자들에 의해 혈관형성을 촉진한다.
섬유아세포(fibroblast)는 세포외기질(ECM)과 콜라겐을 합성하는 세포의 일종으로, 동물 조직의 구조적 골격을 형성하고, 상처 치유에 중요한 역할을 하며 동물의 결합 조직에서 가장 흔하게 발견되는 세포이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 생체적합성 및 생분해성이 있는 히알루론산 및 콜라겐 스캐폴드(scaffold)에 전분화능이 있는 자궁내막 줄기세포, 혈관 형성을 촉진하는 혈관내피세포 및 콜라겐 합성을 촉진하여 상처 치유에 중요한 역할을 하는 섬유아세포가 부착된 자궁내막복합체를 개발하였으며, 이는 자궁내막의 손상을 회복하여 착상능을 개선 시키는 것을 확인하여, 난임 또는 불임 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 목적은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 1층; 상기 제1층 상에 적층 되고, 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 2층; 및 상기 제 2층 상에 적층 되고, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 3층; 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 순차적으로 적층 하는 단계; 를 포함하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 제조방법에 의해 제조된 자궁내막복합체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 1층; 상기 제1층 상에 적층 되고, 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 2층; 및 상기 제 2층 상에 적층 되고, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 3층; 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 순차적으로 적층 하는 단계; 를 포함하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 자궁내막복합체를 제공한다.
본 발명은 자궁내막손상 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 자궁내막복합체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 자궁내막복합체는 생체적합성 및 생분해성이 있는 히알루론산 및 콜라겐 스캐폴드(scaffold)에 전분화능이 있는 자궁내막 줄기세포, 혈관 형성을 촉진하는 혈관내피세포 및 콜라겐 합성을 촉진하여 상처 치유에 중요한 역할을 하는 섬유아세포가 부착되어 실제 자궁내막과 유사한 형태를 지니고 있고, 다양한 성장인자를 분비하며 자궁내막 손상 동물 모델에서 손상된 조직을 재생하는 효과가 있으므로 자궁내막 손상으로 인해 발생하는 불임의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 제작한 자궁내막복합체의 크기와 물성을 관찰한 도이다.
도 2는 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물 및 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물에서 세포 생존능을 live and dead 분석을 통해 관찰한 도이다.
도 3은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물 및 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물에서 세포 생존능을 CCK-8 분석을 통해 광학 현미경으로 관찰한 도이다.
도 4는 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물 및 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물에서 세포 생존능을 CCK-8 분석을 통해 450nm에서 흡광도를 관찰한 도이다.
도 5는 제조한 자궁내막복합체에서 각 세포에 형질도입된 RFP(Red Fluorescent Protein) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)의 형광을 관찰한 도이다.
도 6은 제조한 자궁내막복합체에서 분비한 성장인자를 나타낸 도이다.
도 7은 제조한 자궁내막복합체에서 분비한 성장인자의 상대적 발현을 정량화하여 나타낸 도이다.
도 8은 제조한 자궁 내막 복합체를 자궁 내막이 손상된 동물 모델에 이식 후 조직병리학적 검사를 통해 손상된 자궁내막 조직이 회복된 것을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 1층;
상기 제1층 상에 적층 되고, 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 2층; 및
상기 제 2층 상에 적층 되고, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제 3층; 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체를 제공한다.
상기 자궁내막 줄기세포는 자궁내막조직에 콜라겐분해효소를 처리하여 수득할 수 있다.
상기 "자궁내막 손상"은 자궁수술, 결핵 감염, 물리적 손상 또는 자궁내막 감염 등의 원인에 의해 자궁내막의 전부 또는 일부 조직 구조의 정상적인 완전성의 파괴를 의미하는 것으로, "상처", "병변", "괴사" 및 "궤양" 등을 포함하는 것으로 의도된다. 자궁내막이 손상되면 배아가 착상될 수 없거나 비정상적 배아 발달을 야기할 수 있어, 불임의 원인이 될 수 있다.
상기 자궁내막 줄기세포, 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물은, 자궁내막 줄기세포 2×104 내지 2×105개 당 콜라겐 0.2 내지 1g이 혼합된 것일 수 있다.
상기 혈관내피세포, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물은, 혈관내피세포 2×104 내지 2×105개 당 히알루론산 0.2 내지 1g이 혼합된 것일 수 있다.
상기 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물은, 섬유아세포 2×104 내지 2×105 개 당 콜라겐 0.05 내지 0.5g 및 히알루론산 0.05 내지 0.5g이 혼합된 것일 수 있다.
상기 히알루론산은 5 내지 15% 농도일 수 있다.
상기 콜라겐은 5 내지 15% 농도일 수 있다.
상기 자궁내막복합체는 성장인자(growth factor)를 분비한다.
상기 성장인자는 EGF(epidermal growth factor), IGFBP-2(insulin-like growth factor binding protein 2), IGFBP-6(insulin-like growth factor binding protein 6), PDGF AA(platelet derived growth factor AA), PDGF AB(platelet derived growth factor AB), PDGF BB(platelet derived growth factor BB) 또는 PIGF(placental growth factor)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자궁내막복합체는 자궁내막의 손상에 의한 불임 치료용이다.
본 발명은 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 순차적으로 적층 하는 단계; 를 포함하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 자궁내막 손상 치료용 자궁내막복합체를 제공한다.
본 발명의 자궁내막 손상 치료용 자궁내막복합체는 자궁내막 줄기세포 및 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물, 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물 및 혈관내피세포, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 순차적으로 적층하여 제조하고, 이를 자궁내막의 손상된 부위에 이식하여 자궁내막 손상을 치료할 수 있다. 이러한 치료 효과는 이식된 자궁내막 줄기세포, 혈관내피세포 및 섬유아세포가 손상 조직에 병합되어 직접 분열함으로써 야기되는 것일 수 있고, 또는 이식된 세포로부터 분비되는 호르몬 및/또는 사이토카인에 의해 본래 개체에 존재하는 세포의 분화/분열이 촉진되어 야기되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 효과는 각 세포를 단독으로 이식한 경우에 비해 히알루론산 및 콜라겐을 혼합하여 이식함으로써 현저히 증가할 수 있다. 나아가, 손상된 자궁내막이 회복됨으로써, 배아의 착상률이 증가하고, 착상된 배아의 발달이 개선될 수 있다. 따라서, 상기 자궁내막복합체는 자궁내막 손상에 의한 불임 치료 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 자궁내막복합체는 자궁내막이 손상된 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당업계에 일반적인 제형으로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 손상된 자궁내막 부위에 직접 이식할 수 있다. 본 발명의 자궁내막복합체는 이식시 면역 거부 반응이 일어나지 않도록 면역반응 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 자궁내막복합체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 자궁내막복합체의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 자궁내막 줄기세포 및 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물, 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물 및 혈관내피세포, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물이 적층된 자궁내막복합체의 투여는 임의의 동물에 적용 가능하며, 동물은 인간 및 영장류 뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 자궁내막이 손상된 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 손상된 자궁 조직에 투여될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 자궁내막 줄기세포, 콜라겐 및 아가로오스 혼합물, 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스 혼합물, 혈관내피세포, 히알루론산 및 아가로오스 혼합물을 각각 제조하고 상기 3종의 혼합물을 순차적으로 적층 배양하여 자궁내막복합체를 제조하였다(도 1 참조). 3종의 혼합물 및 자궁내막복합체에는 모두 세포가 생존해있음을 확인하였고(도 2 내지 6 참조), 자궁내막복합체는 여러 성장인자를 분비하는 것을 확인하였고(도 6 및 도 7 참조), 자궁 내막 복합체를 자궁 내막이 손상된 동물 모델에 이식 후 손상된 내막이 회복되는 것을 확인하였다(도 8 참조). 따라서, 본 발명의 조성물은 실제 자궁내막과 유사한 형태를 지니고 있고, 다양한 성장인자를 분비하며 자궁내막 손상 동물 모델에서 손상된 조직을 재생하는 효과가 있으므로 자궁내막 손상으로 인해 발생하는 불임의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 자궁내막 줄기세포( endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스 혼합물의 제조
<1-1> 자궁내막 줄기세포의 수득
자궁조직(출처: 가천대학교 길병원)을 준비된 완충 용액 D-PBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Wellgene사)에 세척하였다. 세척된 자궁조직에서 분홍색으로 보이는 섬유상 물질(fibrous material)과 붉은색으로 보이는 혈관을 멸균된 핀셋과 수술용 가위로 제거하였다. 정리된 자궁조직에 미리 준비한 타입 1 콜라겐분해효소용액(Clostridium histolyticum collagenase, sigma, Co130) 10㎖를 첨가하여 수술용 가위로 1㎜3 이하의 크기로 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 자궁조직을 멸균한 500㎖ 삼각플라스크로 옮긴 후 상기 콜라겐분해효소용액을 30 내지 40㎖ 첨가하였다. 삼각플라스크의 입구를 호일로 봉하고 37℃, 100 rpm의 조건으로 고정된 항온수조에서 하루 동안 효소 반응을 시킨 후 50㎖ 원심분리용 튜브에 옮겨 담고 2500 rpm, 10분의 조건으로 원심분리 하여 상층의 세포외기질(ECM) 및 노란색 기름층을 진공펌프를 이용하여 제거하였다. 하층에 침전된 기질세포분획(stromal vascular cell fraction, SVF)을 함유한 층에 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지와 4500mg/L의 D-포도당, L-글루타민 및 110mg/L의 피루브산 나트륨이 포함된 액체(Cat#. LM 001-05, Wellgene사)를 넣고 부유시켰다. 새 50㎖ 원심분리용 튜브에 100㎛ cell strainer를 얹고 부유된 SVF를 천천히 통과시켜 여과한 후, 다시 40㎛ cell strainer에 통과시켰다. 여과된 상기 액체가 첨가된 DMEM 배지를 collagen I cellware로 옮기고 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포가 배양 접시에 부착될 때까지 배양한 후, 계대 배양 하였다.
<1-2> 자궁내막 줄기세포( endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스 혼합물의 제조
콜라겐 0.5g과 0.1M의 염산 5ml를 자석 교반기(magnetic stirrer)에 400 rpm의 조건으로 혼합하고 pH 미터(Starter 2100 pH, OHAUS)로 pH 7.4로 pH를 조정한 다음, 200㎛의 공극 크기를 가진 시린지 필터(Minisart filters 200㎛, Sartorius stedim biotech)로 여과하여 10% 콜라겐 용액을 제조하였다. 1.2%의 아가로오스 겔 용액 5ml를 전자레인지에서 45초 내지 50초간 가열하고 200㎛의 공극 크기를 가진 시린지 필터(Minisart filters 200㎛, Sartorius stedim biotech)로 여과한 후 40℃ 미온수에 중탕하였다.
상기 실시예 1-1에서 수득한 2×105개의 자궁내막 줄기세포를 상기 10% 콜라겐 용액에 혼합하고 36℃의 미온수에 중탕하였다. 상기 40℃에서 중탕한 1.2% 아가로오스 겔과 36℃에서 중탕한 10% 콜라겐 용액을 혼합하여 최종적으로 0.6% 아가로오스 겔과 5% 콜라겐의 조성이 되도록 하였다. 0.6% 아가로오스 겔과 5% 콜라겐의 혼합물, 자궁내막 줄기세포와 10% 콜라겐의 혼합물을 피펫으로 균일하게 혼합하여 6 웰 플레이트에 도말하였다. 37℃, 5% CO2 환경에서 10분간 배양하여 굳힌 후 세포에 맞는 10% 우태아혈청(WELGENE, cat. S 001-07) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(WELGENE, cat. LS 202-02)이 혼합된 DMEM/F-12 (WELGENE, cat. LM 002-08) 배지를 혼합물 위에 넣어주었다.
< 실시예 2> 섬유아세포(fibroblast), 히알루론산, 콜라겐 및 아가로오스 혼합물의 제조
콜라겐 0.25g과 0.1M의 염산 2.5ml, 히알루론산 0.25g과 1N의 수산화나트륨 2.5ml를 각각 자석 교반기(magnetic stirrer)에 400 rpm의 조건으로 혼합하고 pH 미터(Starter 2100 pH, OHAUS)를 이용하여 pH 7.4로 조정한 다음, 200㎛의 공극 크기를 가진 시린지 필터(Minisart filters 200㎛, Sartorius stedim biotech)로 여과하여 5% 콜라겐 및 5% 히알루론산이 포함된 용액을 제조하였다. 1.2%의 아가로오스 겔 용액 5ml를 전자레인지에서 45초 내지 50초간 가열하고 여과한 후 40℃ 미온수에 중탕하였다.
2×105개의 섬유아세포(Cat #. ATCC PCS-201-012)를 상기 5% 콜라겐 및 5% 히알루론산이 함유된 용액에 혼합하고 36℃의 미온수에 중탕하였다. 상기 40℃에서 중탕한 1.2% 아가로오스 겔과 36℃에서 중탕한 콜라겐 및 히알루론산을 혼합하여 최종적으로 0.6% 아가로오스 겔, 2.5% 콜라겐 및 2.5% 히알루론산의 조성이 되도록 하였다. 0.6% 아가로오스 겔, 2.5% 콜라겐 및 2.5% 히알루론산의 혼합물, 섬유아세포와 5% 콜라겐 및 5% 히알루론산의 혼합물을 피펫으로 균일하게 혼합하여 6 웰 플레이트에 도말하였다. 37℃, 5% CO2 환경에서 10분간 배양하여 굳힌 후 10% 우태아혈청(WELGENE, cat. S 001-07) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(WELGENE, cat. LS 202-02)이 혼합된 low glucose DMEM(WELGENE, cat. LM 001-11) 배지를 혼합물에 넣어주었다.
< 실시예 3> 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스 혼합물의 제조
히알루론산 0.5g과 1N의 수산화나트륨 5ml를 자석 교반기(magnetic stirrer)에 400 rpm의 조건으로 혼합하여 pH 미터(Starter 2100 pH, OHAUS)로 pH 7.4로 pH를 조정한 다음, 200㎛의 공극 크기를 가진 시린지 필터(Minisart filters 200㎛, Sartorius stedim biotech)로 여과하여 10% 히알루론산 용액을 제조하였다. 1.2%의 아가로오스 겔 용액 5ml를 전자레인지에서 45초 내지 50초간 가열하고 200㎛의 공극 크기를 가진 시린지 필터(Minisart filters 200㎛, Sartorius stedim biotech)로 여과한 후 40℃ 미온수에 중탕하였다.
2×105개의 혈관내피세포(Cat #. ATCC CRL-1730)를 상기 10% 히알루론산 용액에 혼합하고 36℃의 미온수에 중탕하였다. 상기 40℃에서 중탕한 1.2% 아가로오스 겔과 36℃에서 중탕한 히알루론산 용액을 혼합하여 최종적으로 0.6% 아가로오스 겔과 5% 히알루론산의 조성이 되도록 하였다. 0.6% 아가로오스 겔과 5% 히알루론산의 혼합물, 혈관내피세포와 10% 히알루론산 용액의 혼합물을 피펫으로 균일하게 혼합하여 6 웰 플레이트에 도말하였다. 37℃, 5% CO2 환경에서 10분간 배양하여 굳힌 후 1% 페니실린-스트렙토마이신(WELGENE, cat. LS 202-02), 배지 첨가제(Lonza, Cat. CC-4176) 및 2% 우태아혈청(WELGENE, cat. S 001-07)이 혼합된 EBM-2(Lonza, cat. CC-3156) 배지를 혼합물 위에 넣어주었다.
< 실험예 1> 실시예 1 내지 3 혼합물의 세포 생존능 평가
<1-1> Live and Dead 분석을 통한 세포 생존능 (cell viability) 평가
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 혼합물에서 세포의 생존능을 평가하기 위해 Live and Dead 분석을 수행하였다.
실시예 1 내지 3의 혼합물을 7일간 배양한 후 Live & dead 분석 키트(Invitrogen Cat #.L3224)를 이용하여 세포 생존능을 관찰하였다. Phosphate buffer saline(PBS) 10㎖에 2mM의 Ethidium homodimer-1(EthD-1) 20㎕ 및 4mM Calcein AM 5㎕을 혼합하여 시약을 제조하였다. Ethidium homodimer-1(EthD-1)은 죽은 세포를 빨간색으로 염색하며, Calcein AM은 살아있는 세포를 초록색으로 염색한다. 그 후 배양 접시에 있는 배양액을 제거하였다. 6 웰 플레이트에 1 웰 당 2㎖ 기준으로 제조한 시약을 측정할 혼합물에 처리하고, 알루미늄 호일로 배양 접시를 감싸 빛을 차단한 후 실온에서 40분간 배양하였다. 혼합물의 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 PBS를 다시 넣고 형광 현미경으로 염색 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 3종의 혼합물 모두 대부분 초록색으로 염색되어 자궁내막 줄기세포, 혈관내피세포 및 섬유아세포가 모두 생존한 것을 확인하였다.
<1-2> CCK -8 분석을 통한 세포 생존능 (cell viability) 평가
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 혼합물에서 세포의 생존능을 평가하기 위해 CCK-8 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 혼합물의 배양 배지 100㎕ 당 CCK-8 시약(Abbkine, Cat#. KTC011001) 10㎕를 첨가하였다. 그 후 4시간 동안 배양하고, 광학 현미경으로 주황색 포르마잔(formazan) 결정이 생성됨을 관찰하였다. 또한 메스(scalpel)를 이용하여 혼합물을 96 웰 플레이트의 크기에 맞게 잘라내어 반응에 사용된 시약 배지를 웰 당 100㎕ 첨가한 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 포르마잔(formazan) 결정이 형성됨을 관찰하였고, 도 4에 나타난 바와 같이, 세포 생존능이 대조군에 비해 유의할 정도로 증가하였다.
< 실시예 4> 자궁내막복합체의 제조
실시예 1 내지 3에서 제조한 혼합물을 이용하여 자궁내막복합체를 제조하고, 자궁내막복합체를 구성하는 각 세포 내에 형광 단백질이 융합된 발현벡터를 형질도입(transfection)하여 자궁내막복합체 내의 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다.
<4-1> 자궁내막 줄기세포가 포함된 혼합물
세포 내에 도입할 RFP(Red Fluorescent Protein)가 융합된 발현벡터(pcDNA3 mCherry LIC cloning vector (6B) addgene, Catalog# 30125) 1㎍ 및 혈청이 없는 Opti-mem 배지 200㎕의 혼합물, 혈청이 없는 Opti-mem 배지 200㎕ 및 리포펙타민 10㎕의 혼합물을 각각 5분간 안정화시켰다. 상기 혼합물을 섞어준 뒤 30분간 상온에서 안정화시켰다.
1×106개의 자궁내막 줄기세포가 배양된 상기 실시예 1의 자궁내막 줄기세포, 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 Dulbecco's phosphate-buffered saline(D-PBS)로 세척하고 혈청이 없는 Opti-mem 배지 5ml로 교체한 후 상기 안정화시킨 RFP가 융합된 발현벡터, 리포펙타민 및 Opti-mem 배지의 혼합물을 처리하여 섞어주었다. 24시간 동안 37℃에서 배양하여 자궁내막 줄기세포 내에 RFP가 융합된 발현벡터를 형질도입(transfection)하였다.
<4-2> 섬유아세포가 포함된 혼합물
세포 내에 도입할 GFP(Green Fluorescent Protein)가 융합된 발현벡터(pShooter™ Mammalian Expression Vector, Invitrogen, Catalog# V8212) 8000ng를 혈청이 없는 Opti-mem 배지 200㎕과 혼합하고, 혈청이 없는 Opti-mem 배지 200㎕와 리포펙타민 8㎕을 혼합한 후 각각 5분간 안정화시켰다. 상기 혼합물을 섞어준 뒤 30분간 상온에서 안정화시켰다.
1×106개의 섬유아세포가 배양된 상기 실시예 2에서 제조한 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)로 세척하고 혈청이 없는 Opti-mem 배지 5ml로 교체한 후 상기 안정화시킨 GFP가 융합된 발현벡터, 리포펙타민 및 Opti-mem 배지의 혼합물을 처리하여 섞어주었다. 24시간 동안 37℃에서 배양하여 섬유아세포 내에 GFP가 융합된 발현벡터를 형질도입(transfection)하였다.
<4-3> 혈관내피세포가 포함된 혼합물
자궁내막 줄기세포 대신 실시예 3에서 제조한 혈관내피세포를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법 및 조건으로 혈관내피세포 내에 RFP가 융합된 발현벡터를 형질도입하였다.
상기 실시예 4-1에서 제조한 RFP가 형질도입된 자궁내막 줄기세포가 포함된 혼합물, 상기 실시예 4-2에서 제조한 GFP가 형질도입된 섬유아세포가 포함된 혼합물 및 상기 실시예 4-3에서 제조한 RFP가 형질도입된 혈관내피세포가 포함된 혼합물을 순차적으로 적층 하여 굳힌 후 형광 현미경으로 RFP 또는 GFP의 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 자궁내막 줄기세포가 포함된 혼합물에서는 빨간색의 형광이, 섬유아세포가 포함된 혼합물에서는 초록색의 형광이, 혈관내피세포가 포함된 혼합물에서는 빨간색의 형광이 관찰되는 것을 확인하여 제조한 자궁내막복합체에 자궁내막 줄기세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포가 잘 부착되어 있는 것을 확인하였다.
< 실험예 2> 자궁내막복합체의 성장인자(growth factor) 분비 확인
상기 실시예 4에서 제조한 자궁내막복합체가 손상된 자궁내막 조직 재생과 배아의 발달에 중요한 역할을 하는 성장인자들의 분비 여부를 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, Abnova사의 Lot 616177052 키트를 상온에서 녹이고, Growth factor membrane을 대조군 및 자궁내막복합체용으로 각 웰에 넣어주었다. 블로킹 완충용액 2㎖을 막이 있는 웰에 각각 넣어 준 후 30분간 상온에서 배양한 후 블로킹 완충 용액을 제거하였다. 대조군은 자궁내막 줄기세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포를 0.1%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 배지 1㎖에 넣고 총 3㎖의 대조군 시료를 준비하였다. 상기 실시예 4에서 제조한 자궁내막복합체는 6 웰 플레이트에 1.5×105 cell/well로 하루 동안 배양하고 0.1%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 배지 2㎖를 넣어 총 3㎖의 자궁내막복합체 시료를 준비하였다. 준비된 대조군 및 자궁내막복합체 시료 1㎖를 막이 있는 웰에 넣고 4℃의 환경에서 하루 동안 배양한 후 1차 완충 용액 2㎖로 5분간 3회, 2차 완충 용액 2㎖로 5분간 2회 세척하였다. 1차 항체 1㎖를 막에 넣고 4℃의 환경에서 하루 동안 배양한 후 다시 세척하였다. 그 후 2차 항체 2㎖를 각 웰에 넣고 2시간 동안 상온에서 배양하였다. 생체분자영상시스템(LAS-4000)으로 측정 후 이미지분석프로그램으로 정량화하였다.
그 결과, 자궁내막복합체는 EGF(epidermal growth factor), IGFBP-2(insulin-like growth factor binding protein 2), IGFBP-6(insulin-like growth factor binding protein 6), PDGF AA(platelet derived growth factor AA), PDGF AB(platelet derived growth factor AB), PDGF BB(platelet derived growth factor BB) 또는 PIGF(placental growth factor)의 성장인자를 대조군에 비해 유의하게 높은 농도로 분비하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 제조한 자궁내막복합체가 손상된 자궁내막 조직 재생에 효과적임을 나타낸다.
< 실험예 3> 자궁내막복합체의 자궁내막 손상 복원 평가
상기 실시예 4에서 제조한 자궁내막복합체가 자궁내막 손상의 치료에 효과적인지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 7주령의 암컷 면역결핍 NSG 마우스의 자궁에 2% 트리클로로아세트산(TCA) 용액을 150㎕의 용량으로 투여하여 자궁 내막의 손상을 유발하였다. 자궁 내막이 손상된 면역 결핍마우스에 제작한 자궁 내막 복합체를 질 부위를 통해 이식하고, 10일 후 마우스를 부검하여 자궁 조직을 적출하였다. 적출된 자궁 조직을 H&E 염색을 수행하여 손상된 자궁 내막 조직의 복원 정도를 평가하였다. 또한, 상기 실험예 4와 같이 RFP 또는 GFP의 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 자궁 내막 복합체가 이식된 자궁 내막의 손상 부위 회복 능력이 내막 손상만 유발한 대조군(Non-complex) 및 세포가 없는 복합체(cell-free complex)만 이식한 군에 비해 자궁내막 및 상피세포의 두께가 월등히 증가하고, 빨간색 및 초록색 형광을 관찰할 수 있어 이식한 자궁내막복합체 내의 세포들이 잘 생존해 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 자궁내막복합체의 손상된 자궁내막을 치료하여 복구하는 능력이 뛰어남을 의미한다.

Claims (11)

  1. 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제1층;
    상기 제1층 상에 적층 되고, 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제2층; 및
    상기 제2층 상에 적층 되고, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 포함하는 제3층; 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자궁내막 줄기세포, 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물은, 자궁내막 줄기세포 2×104 내지 2×105개 당 콜라겐 0.2 내지 1g이 혼합된 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포, 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물은, 섬유아세포 2×104 내지 2×105 개 당 콜라겐 0.05 내지 0.5g 및 히알루론산 0.05 내지 0.5g이 혼합된 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈관내피세포, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물은, 혈관내피세포 2×104 내지 2×105개 당 히알루론산 0.2 내지 1g이 혼합된 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 히알루론산은 5 내지 15% 농도인 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 콜라겐은 5 내지 15% 농도인 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 자궁내막복합체는 성장인자(growth factor)를 분비하는 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 성장인자는 EGF(epidermal growth factor), IGFBP-2(insulin-like growth factor binding protein 2), IGFBP-6(insulin-like growth factor binding protein 6), PDGF AA(platelet derived growth factor AA), PDGF AB(platelet derived growth factor AB), PDGF BB(platelet derived growth factor BB) 및 PIGF(placental growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 자궁내막복합체는 자궁내막 손상에 의한 불임 치료용인 것인, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체.
  10. 자궁내막 줄기세포(endometrial stem cell), 콜라겐 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
    섬유아세포(fibroblast), 콜라겐, 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
    혈관내피세포(vascular endothelial cell), 히알루론산 및 아가로오스의 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물을 순차적으로 적층 하는 단계; 를 포함하는, 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체의 제조방법.
  11. 제10항에 따른 제조방법에 의해 제조된 자궁내막복합체.
KR1020190096167A 2019-08-07 2019-08-07 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체 KR102286779B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190096167A KR102286779B1 (ko) 2019-08-07 2019-08-07 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190096167A KR102286779B1 (ko) 2019-08-07 2019-08-07 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210018639A true KR20210018639A (ko) 2021-02-18
KR102286779B1 KR102286779B1 (ko) 2021-08-09

Family

ID=74688721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190096167A KR102286779B1 (ko) 2019-08-07 2019-08-07 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102286779B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115814065A (zh) * 2022-12-16 2023-03-21 湖南创健医疗器械有限公司 一种高粘度胶原凝胶的制备方法及其应用
CN117801091A (zh) * 2023-12-28 2024-04-02 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100719050B1 (ko) * 2006-05-09 2007-05-16 박경찬 혈관을 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100719050B1 (ko) * 2006-05-09 2007-05-16 박경찬 혈관을 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TatsaneePhermthai et al, Reproductive Biology, 2016, 16(4), 261_268* *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115814065A (zh) * 2022-12-16 2023-03-21 湖南创健医疗器械有限公司 一种高粘度胶原凝胶的制备方法及其应用
CN117801091A (zh) * 2023-12-28 2024-04-02 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用
CN117801091B (zh) * 2023-12-28 2024-05-31 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102286779B1 (ko) 2021-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model
KR100907248B1 (ko) 분화된 어린 지방 세포와 생분해성 중합체의 이식에 의한신체의 부피 대체 방법
JP6010112B2 (ja) 不死化幹細胞及びその産生物を有効成分とする医薬組成物並びに医薬製剤
KR101472594B1 (ko) 체성에서 유래하는 복수의 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리
US20100092432A1 (en) Cell preparation containing multipotential stem cells originating in fat tissue
KR20000052709A (ko) 와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산
US10398736B2 (en) Compositions and methods for producing reconstituted skin
RU2678878C2 (ru) Композиции и способы для лечения и восстановления сухожилий
Akhavan-Tavakoli et al. In vitro differentiation of menstrual blood stem cells into keratinocytes: a potential approach for management of wound healing
KR102286779B1 (ko) 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체
CN108685948A (zh) 一种新型医用细胞修复剂的制备方法
CN107073041A (zh) 糖尿病性皮肤溃疡治疗的多功能性干细胞
Rogovaya et al. Reconstruction of rabbit urethral epithelium with skin keratinocytes
Chen et al. Robot-assisted in situ bioprinting of gelatin methacrylate hydrogels with stem cells induces hair follicle-inclusive skin regeneration
Linon et al. Engraftment of autologous bone marrow cells into the injured cranial cruciate ligament in dogs
JP2022501118A (ja) 脂肪由来幹細胞およびゼラチンを含む生体材料ならびにその製造方法
US9434923B2 (en) Preparation of parental cell bank from foetal tissue
CN113846064A (zh) 一种fgf18基因修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用
US20220233599A1 (en) Pharmaceutical composition
CN102105581B (zh) 人工肾前体及其制备方法
US20220331369A1 (en) Stem Cells Derived from Villi Adjacent to Chorionic Plate, and Tissue Regeneration Cellular Therapeutic Agent Comprising Same
KR100725133B1 (ko) 자가혈청과 태반추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및이를 이용한 피부재생용 조성물
KR102182646B1 (ko) 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물
KR101972450B1 (ko) 생체적합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법
KR100939360B1 (ko) 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을통해 인슐린 분비 세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된인슐린 분비 세포의 세포 치료제로서의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant