KR102182646B1 - 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 증식 또는 분화 개선용 조성물, 이를 이용한 증식 또는 분화 능력이 개선된 줄기세포 배양 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 처리하였을 때, WRS 단백질이 중간엽 줄기세포주의 증식능력(growth potential)을 향상시키고, WRS 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상되며, 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다. 또한, WRS 단백질에 의해 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2 및 MMP-9(Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 아울러, WRS에 의해 활성화된 줄기세포는 체내 치료 효능이 있음을 최종 확인함으로써, 상기 WRS 단백질은 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for enhancing clinical therapeutic effect of stem cells medicine}
본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase)단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동 또는 분화 개선용 조성물, 이를 이용한 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)가 되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게, 발생중인 수정란에서 유래하는 배아 유래 줄기세포와 골수 및 제대혈과 같은 여러 성체조직에 존재하고 있는 성체 줄기세포로 나눌 수 있다. 배아 줄기세포는 높은 분화 능력 및 치료 효능을 보이는 반면 윤리적인 문제와 세포 자체의 발암성으로 인하여 현재 임상적용이 많이 제한되어 있는 실정이다. 비록 분화 능력은 배아 줄기세포에 비해 떨어지지만 윤리적인 문제가 없고 발암성이 낮은 성체 줄기세포가 현재 암, 당뇨병, 난치성 질환 및 신경퇴행성 질환 등의 세포 치료제로 크게 주목받고 있을 뿐만 아니라, 유전체학 및 생물정보학의 발달과 더불어 줄기세포를 이용한 재생 의학 분야에 연구가 진행되고 있으므로 성체 줄기세포는 관련 신약 개발 및 독성 검사를 위한 플랫폼으로도 활발히 연구되고 있다.
성체 줄기세포를 활용한 질환의 치료에 있어 그 효과가 매우 제한적인 경우가 종종 보고된다. 성체 줄기세포는 체내에서 약 0.01 내지 0.001% 비율로 매우 극미량 존재하기 때문에 치료의 목적을 위해서는 체외에서 대량으로 배양하는 과정이 필수적으로 요구되는데, 성체 줄기세포를 이용한 치료제에 있어서 상이한 치료 효능은 바로 이러한 체외 배양 과정 중, 상처 부위로 이동하여 증식할 수 있는 증식능력(growth potential), 특정(표적) 세포로 분화할 수 있는 줄기세포의 분화능력(differentiation potential) 및 줄기세포성(stemness) 등과 같은 줄기세포 고유의 기능들이 저하되거나 상실되기 때문인 것으로 알려져 있다. 이러한 맥락에서 체외 배양 동안 줄기세포의 치료 효능의 저하를 억제하고, 더 나아가 치료능력을 더욱 향상시킬 수 있는 새로운 줄기세포 체외 배양법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
현재 줄기세포의 증식 및 분화를 조절하기 위해 전 세계 연구자들이 현재까지 성장인자, 호르몬, 사이토카인 등을 주입하는 다양한 화학적 방법을 개발하여 줄기세포 치료제의 분화 능력 및 치료 효능을 향상시키기 위한 연구를 진행하고 있으며, 관련하여 Paul W Burridge 등은 화학적 배양 조건의 조절을 통한 줄기세포의 분화기술에 관해 개시한 바 있으나(Nature methods, 2014), 이러한 화학적인 방법은 줄기세포 수득 효율에 한계가 있고, 고비용의 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은, 기존의 줄기세포 체외 배양법의 문제점을 개선하고자 노력하던 중, 효소 단백질인 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase)단백질을 첨가한 배지에 줄기세포를 체외 배양하였을 때 줄기세포 치료제로서의 치료 효능에 매우 중요한 역할을 하는 줄기세포의 증식(growth), 이동(migration) 및 분화 (differentiation) 능력을 크게 향상시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 증식(growth) 또는 분화(differentiation) 개선용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 증식(growth) 및 분화(differentiation) 개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생체 외에서 인간 줄기세포를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 첨가한 배지에 배양하여 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증식 및 분화 능력이 증가된 줄기세포 배양방법을 제공한다.
본 발명에서 성체줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 처리하였을 때, WRS 단백질이 중간엽 줄기세포주의 증식능력(growth potential)을 향상시키고, WRS 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상되며, 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다. 또한, WRS 단백질에 의해 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2 및 MMP-9(Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 아울러, WRS에 의해 활성화된 줄기세포는 체내 치료 효능이 있음을 최종 확인함으로써, 상기 WRS 단백질은 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 0, 100nM. 1μM 농도로 처리한 후, 줄기세포의 증식능력을 측정한 결과를 나타낸 도이다:
도 2는 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리한 후, 트랜스웰 어세이(transwell assay)를 수행하여 그 결과를 나타낸 도이다:
A: 트랜스웰 어세이(transwell assay)의 개략도(왼쪽) 및 실험결과; 및
B: 트랜스웰 어세이(transwell assay)를 수행한 결과의 농도별 사진.
도 3은 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리한 후, MMP-2/MMP-9 발현 양상을 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 측정하여 결과를 나타낸 도이다:
A: MMP-2 발현 양상의 결과; 및
B: MMP-9 발현 양상의 결과.
도 4는 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리한 후, 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화 유도 결과를 나타낸 도이다:
A: 지방세포(adipocyte)로 분화 유도한 후, alizarin red로 염색(staining)한 사진(왼쪽) 및 흡광도(500nm)를 통해 분화의 정도를 측정하여 나타낸 도표(오른쪽); 및
B: 조골세포(osteoblast)로 분화 유도한 후, alizarin red로 염색(staining)한 사진(왼쪽) 및 흡광도(570nm)를 통해 분화의 정도를 측정하여 나타낸 도표(오른쪽).
도 5는 마우스 체내에 WRS를 투여한 후 줄기세포를 분리하여 증식능력을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 마우스 체내에 WRS를 투여한 후 줄기세포를 분리하여 트랜스웰 어세이(transwell assay)를 수행한 결과 사진(왼쪽)과 WRS 투여 여부에 따른 세포의 이동능력을 측정한 결과(오른쪽)를 나타낸 도이다.
도 7은 마우스 체내에 WRS를 투여한 후 줄기세포를 분리하여 MMP-2/MMP-9 발현 양상을 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 측정하여 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 마우스 체내에 WRS를 투여한 후 줄기세포를 분리하여 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화 유도 결과를 나타낸 도이다:
A: 지방세포(adipocyte)로 분화 유도한 후, alizarin red로 염색(staining)한 사진(왼쪽) 및 흡광도(500nm)를 통해 분화의 정도를 측정하여 나타낸 도표(오른쪽); 및
B: 조골세포(osteoblast)로 분화 유도한 후, alizarin red로 염색(staining)한 사진(왼쪽) 및 흡광도(570nm)를 통해 분화의 정도를 측정하여 나타낸 도표(오른쪽).
도 9는 마우스 체내에 WRS를 투여한 후 줄기세포를 분리하여 줄기세포성(stemness)과 밀접한 연관이 있는 마커 유전자인 NANOG, OCT4 및 SOX2의 발현 양상을 Real-time PCR을 이용하여 비교 분석한 도이다.
도 10은 자궁 손상 동물 모델에 WRS에 의해 활성화된 줄기세포를 이식한 후, GFP의 면역형광 염색실험을 수행한 결과(왼쪽)와 이를 정량화한 그래프(오른쪽)를 나타낸 도이다.
도 11은 WRS에 의해 줄기세포의 치료 효능이 활성화된 줄기세포를 화학적으로 자궁 내막이 손상된 마우스에 이식 후 치료 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 증식 또는 분화 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질은 단백질 번역(translation) 과정에서 tRNA에 트립토판(typtophan)을 결합시키는 등의 핵심적인 역할을 하는 효소 단백질로 알려져 있다. 또한, 줄기세포 치료제의 치료 효능에 있어서, 주로 줄기세포의 두 가지 능력이 그 효능을 결정하는 것으로 알려져 있는데, 하나는 손상된 부위에서 증식할 수 있는 증식 능력 (growth potential)과 다른 하나는 표적 세포로 분화할 수 있는 분화 능력 (differential potential)이다.
상기 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질은 효소(enzyme) 단백질로써, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 서열번호 2로 기재되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 구체적으로, 상기 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입된 것일 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 벡터가 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 즉, 상기 발현 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물일 수 있다.
또한, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 RNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 pCDH, pECFP, 또는 pLKO 등의 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
상기 조성물은 MMP-2(Matrix metallopeptidase-2) 또는 MMP-9(Matrix metallopeptidase-9) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 실험예에서, 성체 줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase)단백질을 처리하였을 때, WRS 단백질이 중간엽 줄기세포주의 증식(growth)을 향상시키고(도 1 참조), WRS 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, WRS 단백질에 의해 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2 및 MMP-9(Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현이 현저히 증가됨과 동시에(도 3 참조), 지방유래 중간엽 줄기세포주가 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질은 줄기세포의 증식, 이동 및 분화를 증가시키므로, 상기 WRS 단백질을 체외에서 치료용 성체 줄기세포를 대량 배양하였을 때 증식(growth) 및 분화(differentiation) 능력과 같은 줄기세포 고유의 치료 성질을 개선시킬 수 있어, 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 생체 외에서 인간 줄기세포를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 첨가한 배지에 배양하여 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증식 또는 분화 능력이 증가된 줄기세포 배양방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 가장 바람직하게는 성체 줄기세포이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly), 신경, 상피 또는 피부 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있으며, 지방조직 또는 골수 유래인 것이 보다 바람직하며, 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지는 않는다.
또한, 본 발명의 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질의 처리 농도는 10nM 내지 20μM 인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단백질의 농도가 10nM 미만일 경우 줄기세포의 이동 또는 분화 효율이 저하되는 문제점이 있고, 20μM 이상이면 줄기세포에 독성이 생길 수 있는 문제점이 있다. 이러한 측면에서 본 발명인 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물에서의 WRS 단백질 농도는 50nM 내지 10μM 인 것이 바람직할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100nM 내지 1μM 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질의 처리는 48 내지 72시간 동안인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 줄기세포(stem cell)의 배양액에 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 첨가하여 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시킨 조성물을 제공하며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 지방 유래 중간엽 줄기세포주의 준비
실험에 우선하여, 지방유래 중간엽 줄기세포주(mesenchymal stem cell lines: MSCs)를 다음과 같이 준비하였다.
채취된 지방조직을 준비된 완충용액 D-PBS에 세척한 뒤, 세척된 지방조직에서 분홍색으로 보이는 부분인 fibrus material과 적색 혈관(red blood vessel)을 멸균된 핀셋과 수술용가위로 제거한 후, 정리된 지방조직에 미리 준비한 10㎖ 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액을 첨가하여 수술용 가위로 1㎜3이하의 크기로 잘게 절단하고, 절단된 지방조직을 멸균한 500㎖ 삼각플라스크로 옮긴 후 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액을 약 30㎖ - 40㎖ 정도 첨가하였다. 다음으로 삼각플라스크의 입구를 호일로 봉하고 37℃, 100rpm으로 고정된 항온수조에서 하루 동안 효소 반응시킨 후, 지방조직을 50㎖ 원심분리용 튜브(tube)에 다시 옮겨 담고 2500rpm, 10분에서 원심분리 하여 상층(supernatant)의 세포외기질 및 노란색의 기름층을 진공펌프를 이용하여 제거하였다. 다음으로, 하층에 침전된 층(stromal vascular cell fraction, SVF)에 배양 배지 DMEM을 넣어 부유시키고, 새 원심분리용 튜브(tube)에 100μm 세포 스트레이너(cell strainer)를 얹어 부유된 SVF를 천천히 통과시켰다. 여과된 SVF를 같은 방법으로 40μm 세포 스트레이너(cell strainer)에 통과시켰으며, 다시 여과된 SVF에 배양배지 DMEM을 첨가하고 collagen I cell ware 100㎜ 배양 접시로 옮긴 후 이산화탄소 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 세포가 부착할 때까지 배양하였고, 세포들이 부착된 것이 확인되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
<실험예 1> WRS 단백질의 처리를 통한 줄기세포 증식(growth) 능력 증가 확인
우선, 본 발명자들은 WRS 단백질이 줄기세포의 증식(growth)에 미치는 영향을 확인해보기 위하여 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리한 후 세포 수의 측정을 통해 세포 생존도를 측정하는 실험방법인 MTT 어세이(assay)를 다음과 같이 수행하였다.
우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주를 96 웰 플레이트(well plate)에 세포 수가 약 2 x 103 이 되도록 분주(seeding)하여 기본 배양 배지(medium)에 1% FBS(Fetal bovine serum)를 처리하고 100nM 및 1μM의 WRS 단백질(서열번호- 하기 표 1)(구입처: cloud corp.)에서 48시간 및 72시간 동안 배양하였다. 이때 배지를 매일 갈아주면서 WRS 단백질이 일정농도가 되도록 하여 처리하였다. 다음으로 MTT 솔루션(solution: (MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide agent)을 배양 배지(medium)의 1/20 볼륨이 되도록 넣어준 후 2 내지 4시간 동안 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 다시 배양배지를 제거한 후, 200μl DMSO를 넣어주고, 빛을 차단한 상태에서 상온에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 다음으로 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 MTT가 미토콘드리아에 의해 formazan으로 환원되는 정도를 흡광도 570nm로 측정하였으며, 정상세포(control cells)의 흡광도 대비 WRS 단백질이 처리된 중간엽 줄기세포주의 흡광도 퍼센트(%)로 세포의 생존성 및 세포 증식(growth)에의 영향을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, WRS 단백질이 처리 농도 및 시간 의존적으로 중간엽 줄기세포주의 증식(growth)을 증가시킴을 확인하였다(도 1의 A 및 B).
이름 서열번호 서열
WRS 아미노산 서열 서열번호 1 FYKN VVKIQKHVTF NQVKGIFGFT DSDCIGKISF PAIQAAPSFS NSFPQIFRDR TDIQCLIPCA IDQDPYFRMT RDVAPRIGYP KPALLHSTFF PALQGAQTKM SASDPNSSIF LTDTAKQIKT KVNKHAFSGG RDTIEEHRQF GGNCDVDVSF MYLTFFLEDD DKLEQIRKDY TSGAMLTGEL KKALIEVLQP LIAEHQARRK EVTDEIVK
WRS 염기 서열 서열번호 2 tcct ctgagcgccg ccgacccacc ccgtctccct ttcccactgg cacccttcat cgtctccgcc tgttcgcttt tcccgaggag agaggccccc atttttattt agcgcctgcc atgtgccaga ggctttgcgt agtgttgcac ttagtcccct caacggtaat gttagcaggc ttctccatgc ccattccaca gatgaggaaa ccgaaggg
WRS 정방향 프라이머 서열번호 3 TGCCACAGAAGCTGAAGAGG
WRS 역방향 프라이머 서열번호 4 GCCGGTGGCTCTCTCTATTC
Recombinant WRS 구입처 : Cloud-clone corp Cat NO : RPB748Hu01
<실험예 2> WRS 단백질의 처리를 통한 줄기세포 이동(migration) 능력 증가 확인
<2-1> 트랜스웰 어세이(transwell assay) 실험
본 발명자들은 WRS 단백질이 줄기세포의 이동(migration) 능력에 미치는 영향을 측정하기 위해 WRS 단백질을 처리한 후, 트랜스웰 어세이(transwell assay)실험을 수행하였다.
우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주에 100nM 및 1μM의 WRS 단백질을 매일 처리하면서 48시간 동안 배양하였다. 실험을 수행하기에 앞서 1㎖ trypsin-EDTA를 첨가하여 고루 퍼지도록 손으로 가볍게 흔들어 주고 이산화탄소 배양기에서 5분간 반응시킨 후, 배양 접시에 FBS가 첨가된 배양 배지를 2㎖ 첨가하여 Trypsin-EDTA의 작용을 중화시킨다. 배양 접시를 손으로 살살 쳐주면서 부착되어 있던 세포가 떨어지는 것을 확인하고 50㎖ 원심분리용 튜브(tube)에 옮겨 2000rpm에서 3분간 원심분리 한 후, 상층액(supernatant)을 제거하고 1㎖ 배양 배지를 첨가하여 피펫팅(pipeting)하였다. 다음으로, 12 웰 플레이트(well plate)에 1ml serum free 배지와 100nM 및 1μM의 WRS 단백질을 함께 처리하고 인설트 웰(insert well (invasion well))을 넣어준다(도 4의 A 참조). 상기 준비한 세포를 인설트 웰(insert well)에 150μl씩 넣어주고, 세포가 뭉치지 않도록 살살 흔들어 준 후, 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 인설트 웰(insert well)에 있는 배지를 버리고 새로 분주한 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; 4%)로 15분간 고정하였다. 그리고 인설트 웰(insert well)과 플레이트(plate)에 있는 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; 4%)를 버리고, 1ml DPBS로 두 번씩 세척한 후, 플레이트(plate)에 헤마톡실린(Hematosillin)을 웰(well)당 700μl씩 넣고 인설트 웰(insert well)을 반응시켰다. 이때, 빛을 차단한 상태에서 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후, 면봉으로 인설트 웰(insert well) 안쪽을 조심스럽게 닦아낸 후, 염색된 세포의 수를 정량하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, WRS 단백질의 농도 의존적으로, 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 육안 및 그래프를 통해 확인하였다(도 2의 A 및 B).
<2-2> MMP-2 및 MMP-9 발현 측정 실험
또한, 본 발명자들은 줄기세포의 이동(migration) 능력에 WRS 단백질이 미치는 영향을 더욱 구체적으로 알아보기 위해, WRS 단백질을 처리한 후, 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 알려진 MMP-2 및 MMP-9 (Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현 양상을 웨스턴 블로팅(western blotting) 실험을 수행하여 확인하였다.
우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주의 기본 배지에 1% FBS(Fetal bovine serum)를 처리하고 100nM 및 1μM의 WRS 단백질을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. WRS 단백질은 매일 배지를 갈아주면서 처리하였다. 세포가 배양된 접시(dish)에 pro-prep protein extraction 용액을 넣고 세포를 스크래퍼(scraper)를 사용하여 모아서 1.5ml 튜브(tube)로 모아둔 뒤, 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 상층액(supernatant)만을 새 튜브(tube)로 옮긴 후, BCA 용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 다음으로 10μg의 단백질에 증류수(DW)와 5X 염료(dye)를 섞어주고 99℃에서 5분간 끓인 후, SDS-PAGE 젤(gel)에 Protein marker 및 시료를 로딩(loading)한 후 20 - 40mA 전류를 걸어 50-90 분간 전기영동을 수행하여 단백질을 크기별로 분리시켰다. 그 다음, 젤(gel) 상에 존재하는 단백질을 100V에서 180분간 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨준 후(transfer), 5% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 블로킹(blocking)처리 한 후, MMP-2 및 MMP-9 (Matrix metallopeptidase-2/9)에 대한 1차 항체(primary antibody)가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음날 T-PBS로 10분씩 3번 멤브레인(membrane)을 세척한 후 2차 항체(secondary antibody)가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 반응시켰고, 2시간 후 T-PBS로 10분씩 3번 세척하여 ECL 용액을 멤브레인(membrane)에 처리하여 단백질의 발현을 필름으로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, WRS 단백질을 지방유래 중간엽 줄기세포주에 처리하였을 때, 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2(도 3의 A) 및 MMP-9(도 3의 B)의 발현이 현저히 증가하는 것을 통해, 줄기세포의 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 확인하였다(도 3).
<실험예 3> WRS 단백질의 처리를 통한 줄기세포 분화(differentiation) 능력 증가 확인
본 발명자들은 WRS 단백질을 줄기세포에 처리하였을 때, 줄기세포의 분화(differentiation) 능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리한 후, 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화 유도하였다.
우선 6 웰 플레이트(well plate)에 지방유래 중간엽 줄기세포주를 배양하다가, 세포 수가 약 70%의 용적(confluency)에 이르면 분화유도용 배지 (지방세포 분화배지: 3-isobuty-1-methylxanthine(IBMX) 0.5mM, Insulin 1μg/ml, Indomethacin 0.2mM, Dexamethasone 1μM; 조골세포 분화배지:DMEM High Glucose with β-glycerophosphate 10mM, ascorbic acid 50μM, and dexamethasone 100nM))에 1% FBS를 처리하고 3일에 한번 씩 배지를 갈아주면서 2주 정도 배양하였다. 이때, 100nM 및 1μM의 WRS 단백질을 배지를 교체할 때마다 함께 처리하였다. 다음으로 분화유도된 세포가 자라고 있는 6 웰 플레이트(well plate)에서 배지를 제거하고 2ml 멸균수를 넣고 두 번씩 세척하였다. 다음으로 세포를 고정하기 위해서 1ml 에탄올(etanol)(70%)을 넣어주고 4℃에서 30분 내지 1 시간 정도 건조시킨 후, 고정이 끝난 세포에 1㎖ D-PBS을 첨가하여 세척하고, 세포를 1㎖ alizarin red 용액을 사용하여 10분 내지 한 시간 정도 염색(staining)하였다. 그 후, 멸균수 또는 D-PBS를 이용하여 세포를 다섯 번 정도 세척한 후, 세척이 끝난 세포에 2㎖ 멸균수를 넣고 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분화 정도를 육안으로 확인하였다. 그리고 지방세포(adipocyte)의 경우는 500nm 및 조골세포(osteoblast)의 경우는 570nm에서 흡광도를 측정하여 분화의 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, WRS 단백질을 처리하였을 때 지방유래 중간엽 줄기세포주가 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 alizarin red 염색(staining)사진을 통하여 확인하였고(도 4의 A 왼쪽 및 B 왼쪽), 흡광도를 통해 분화의 정도를 측정하여 그래프화 시킨 도표를 통해서도 지방유래 중간엽 줄기세포주에 WRS 단백질을 처리하였을 때, 각 세포들로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다(도 4의 A 오른쪽 및 B 오른쪽).
<실험예 4> WRS를 마우스 체내에 투여한 후 분리한 줄기세포의 치료효과 확인
<4-1> WRS를 마우스 체내에 투여한 후 분리한 줄기세포의 증식(growth) 능력 증가 확인
체내에서 WRS의 줄기세포 증식능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 6주령의 암컷 NSG 면역결핍마우스에 정맥을 통해 3mg/kg의 용량으로 WRS를 매일 7일간 투여하였다. 투여가 끝난 마우스로부터 지방 조직을 분리 후 멸균된 수술 도구를 이용해 지방 조직을 1mm3 크기로 잘게 잘라냈다. 그 후 10% FBS and 250 U/ml type I collagenase이 포함되어 있는 DMEM 배양액에서 5시간 동안 37°C / rotating shaking 조건으로 조직을 소화(digestion)시켰다. 그 후 Digestion mixture는 100μm 사이즈의 cell strainer를 이용해 분해되지 않은 조직을 제거하고 지방 줄기세포를 분리하였다. 분리된 지방줄기세포에 MTT assay를 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, WRS에 의해 체내 지방 유래 중간엽 줄기세포주의 증식(growth)을 증가시킴을 확인하였다(도 5 참조).
<4-2> WRS를 마우스 체내에 투여한 후 분리한 줄기세포의 이동(migration) 능력 증가 확인
<4-2-1> 트랜스웰 어세이(transwell assay) 실험
WRS 단백질 투여가 줄기세포의 체내 이동(migration) 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 분리된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 이용해 트랜스웰 어세이(transwell assay)실험을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, WRS 투여에 의해 체내 지방유래 중간엽 줄기세포가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 육안 및 그래프를 통해 확인하였다(도 6 참조).
<4-2-2> MMP-2 및 MMP-9 발현 측정 실험
체내 줄기세포의 이동(migration) 능력에 WRS 투여가 미치는 영향을 더욱 구체적으로 알아보기 위하여 분리된 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 알려진 MMP-2 및 MMP-9 (Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현 양상을 웨스턴 블로팅(western blotting) 실험을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, WRS가 투여된 마우스의 지방유래 중간엽 줄기세포주에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 현저히 증가하는 것을 통해, 줄기세포의 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 확인하였다(도 7 참조).
<4-3> WRS를 마우스 체내에 투여한 후 분리한 줄기세포의 분화(differentiation) 능력 증가 확인
WRS 투여에 의해 줄기세포의 분화(differentiation) 능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분리된 지방유래 중간엽 줄기세포를 지방세포(adipocyte) 및 조골세포(osteoblast)로 분화 유도하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, WRS 투여에 의해 체내 지방유래 중간엽 줄기세포의 지방 및 조골세포 분화 능력이 크게 향상되었음을 육안 및 그래프를 통해 확인하였다(도 8 참조).
<4-4> WRS를 마우스 체내에 투여한 후 분리한 줄기세포의 줄기세포성(Stemness) 증가 확인
WRS 투여에 의해 줄기세포의 줄기세포성 (stemness)이 향상되는지 여부를 확인하기 위해 줄기세포성 조절에 중요한 역할을 하는 유전자인 NANOG, OCT4, SOX2 등의 발현 양상을 real-time PCR을 이용하여 비교 분석하였다.
그 결과 WRS가 투여된 마우스의 지방에서 분리된 중간엽 줄기세포의 NANOG, OCT4, SOX2 발현이 투여되지 않은 마우스에서 분리된 줄기세포에 비해 높아짐을 확인하였다(도 9 참조).
<실험예 5> WRS에 의해 활성화된 줄기세포의 체내 치료 효능 확인
WRS에 의해 활성화된 줄기세포를 실제 손상 부위에 이식하였을 때 손상 부위 이동 능력 및 치료 효능이 향상되었는지 검증하기 위해 7주령의 암컷 NSG 면역결핍마우스의 자궁에 2% Trichloroacetic acid (TCA) 용액을 150μl의 용량으로 투여함으로써 자궁 내막의 손상을 유발하였다. 체내에 이식한 세포의 표지 및 추적을 위해서 1×106 의 줄기세포에 형광으로 발색하는 GFP-expressing plasmid vectors를 형질주입(transfection)하고, GFP로 표지된 줄기세포를 1μM 농도의 WRS로 72시간 동안 처리함으로써 치료 효능을 향상 시켰다. 그 후, WRS로 치료 효능이 강화된 줄기세포와 처리하지 않은 줄기세포를 자궁 내막이 손상된 동물 모델에 이식하고, 손상된 자궁 내막 조직으로 줄기세포의 이동 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, WRS에 의해 치료 효능이 향상된 줄기세포의 손상 부위 이동 능력이 그렇지 않은 줄기세포에 비해 월등히 높다는 사실을 확인하였다(도 10 참조).
또한 WRS에 의해 치료 효능이 강화된 줄기세포의 자궁 손상 부위 복구 능력을 확인하기 위해 1μM 농도의 WRS로 72시간 동안 처리된 줄기세포를 자궁 내막이 손상된 면역 결핍마우스에 이식 후 thematoxylin and eosin (H&E) staining을 통해 손상된 자궁 내막 조직이 어느 정도 복구 되는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, WRS에 의해 치료 효능이 강화된 줄기세포의 자궁 손상 부위 복구 능력이 WRS가 처리되지 않은 줄기세포에 비해 월등히 높다는 사실을 확인하였다(도 11 참조).
<110> Gachon University <120> Methods and compositions for enhancing clinical therapeutic effect of stem cells medicine <130> 2019p-06-038 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS Amino acid sequence <400> 1 Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln 1 5 10 15 Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile 20 25 30 Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro 35 40 45 Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala 50 55 60 Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg 65 70 75 80 Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala 85 90 95 Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser 100 105 110 Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys 115 120 125 His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe 130 135 140 Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe 145 150 155 160 Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser 165 170 175 Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu 180 185 190 Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp 195 200 205 Glu Ile Val Lys 210 <210> 2 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS DNA sequence <400> 2 tcctctgagc gccgccgacc caccccgtct ccctttccca ctggcaccct tcatcgtctc 60 cgcctgttcg cttttcccga ggagagaggc ccccattttt atttagcgcc tgccatgtgc 120 cagaggcttt gcgtagtgtt gcacttagtc ccctcaacgg taatgttagc aggcttctcc 180 atgcccattc cacagatgag gaaaccgaag gg 212 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS forward primer sequence <400> 3 tgccacagaa gctgaagagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS reverse primer sequence <400> 4 gccggtggct ctctctattc 20

Claims (10)

  1. WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동(migration) 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 줄기세포의 줄기세포성(stemness)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 NANOG, OCT4 및 SOX2 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 MMP-2(Matrix metallopeptidase-2) 또는 MMP-9(Matrix metallopeptidase-9) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
  8. 1) 생체 외에서 인간 줄기세포를 배양하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질을 첨가한 배지에 배양하여 분화를 유도하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포의 이동을 촉진하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 1)의 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포의 이동을 촉진하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 단계 1)의 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질의 농도는 10nM 내지 20μM인 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포의 이동을 촉진하는 방법.


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