KR101472594B1

KR101472594B1 - 체성에서 유래하는 복수의 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리

Info

Publication number: KR101472594B1
Application number: KR1020087028837A
Authority: KR
Inventors: 시게요시 후지와라; 지로 기시모토; 츠토무 소마
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2014-12-15
Also published as: JP5976172B2; KR20090021340A; ES2641528T3; EP2034011A4; EP2455111B1; EP2455111A3; ES2419232T3; CN101479376A; US10344266B2; JP2013059337A; EP2034011B1; JP2015165823A; WO2008001938A1; US20090280469A1; EP2455111A2; US20160160185A1; US8563309B2; EP2034011A1; JP2013078344A; US20140106432A1

Abstract

본 발명은, 체성에서 유래하는 복수의 체성 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리의 제조 방법으로서, 상기 복수종의 체성 세포를 포함하는 배양액을 준비하고, 상기 복수종의 체성 세포 배양액을 혼합한 후, 그 혼합 세포 배양액에 Wnt 시그널 활성화제를 첨가하며, 상기 Wnt 시그널 활성화제를 함유하는 배양액을 소정 기간에 걸쳐 비평면 접촉성 배양하고, 상기 비평면 접촉성 배양한 배양물의 배지를 Wnt 시그널 활성화제 비함유 배지와 교환하여 소정 기간 더 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 복수의 체세포 중 적어도 1종은 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 방법을 제공한다.

Description

체성에서 유래하는 복수의 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리{CELL CLUSTER COMPRISING PLURAL KINDS OF CELLS DERIVED FROM SOMA WITH ABILITY TO FORM PRIMITIVE ORGAN-LIKE STRUCTURE}

본 발명은 체성에서 유래하는 복수의 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양(器官樣)을 이룰 수 있는 세포 덩어리(細胞塊)의 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 세포 덩어리에 관한 것이다.

최근의 의학의 눈부신 진보에 의해, 질환의 원인의 제거, 예컨대 암의 외과적 절제와 같은 대증요법적인 치료 기술, 또는 조직·장기의 생체 이식 기술 등에 의해, 인명을 구할 수 있는 기회는 점점 높아지고 있다. 그러나, 환부 절제에 따라, 환자는 치료 후의 QOL의 대폭적인 저하에 괴로워하는 경우가 있다. 또한, 이식 도너의 부족, 거부 반응 등 생체 이식에 의지하는 치료에도 한계가 있다. 외과적 치료 또는 불의의 사고로 손실된 조직, 기관, 장기 등을 재생시키는 것이 가능해지면, 환자의 QOL을 대폭적으로 개선할 수 있다. 또한, 재생 의료는 생체 이식이 안고 있는 문제의 해소도 도모하는 것이 가능하다. 그러한 관점에서 재생 의료에 대한 기대도는 높다.

재생 의료에서 성공을 거두고 있는 기술은, 주로 인공 피부, 인공골, 인공치 와 같은 형태면 및 기능면에서 비교적 단순한 조직이 중심이다. 재구성된 인공 피부나 인공골은 세포에 받아들여져, 조직 구축에 필요한 시그널을 제공할 수 있게 되는 경우가 있다. 그러나, 재생 의료 기술에 의한 인공 피부·인공골의 분화의 레퍼토리는 한정되어 있었다. 예컨대, 동종 케라티노사이트나 피부 섬유아세포 등은 표피로서의 구조물로 분화되고, 주위의 기관에 편입되어, 배리어 성질을 가진 각질층이나 기저막을 갖기에 이르는 경우는 있으나, 모낭이나 지방선, 한선과 같은 이차적 유도물을 파생하는 경우는 없다고 되어 있었다.

생체 조직은 통상, 자기 복제를 함과 아울러, 분화된 세포에 시그널을 보내거나 분화된 세포를 공급함으로써 조직의 항상성을 유지하는 줄기 세포적 성질을 가진 세포와, 그러한 세포로부터 각종 신호를 받거나 지령을 받는, 분화 상태에 이미 이른 체세포적 성질을 갖는 세포가 공존하여, 양자의 상호 작용에 의해 성립되어 있다. 예컨대 척추 동물의 경우, 대부분의 조직·기관 형성에 있어서 간엽계 세포와 상피계 세포 사이의 상호 작용이 필수적이다. 모낭의 경우, 간엽계 세포인 모유두 세포가 줄기 세포적 성질을 담당하고, 상피계 세포인 케라티노사이트가 털의 샤프트(모질 그 자체)로 분화하는 의미에 있어서 체세포적 성질을 갖는 세포에 상당한다.

재생 의료에 의한 기관의 형성시의 어려움은, 실제 생체 조직 내에 있어서와 같은, 미분화 상태를 유지한 줄기 세포적 성질을 갖는 세포와, 분화에 이른 세포의 공존 상태의 달성에 있다. 종래 기술에서는, 가령 상피계 세포와 간엽계 세포를 공배양해도, 모두 분화에 이르러 버리거나, 또는 모두 미분화 상태를 유지하는 것 중 어느 한쪽일 뿐이며, 생체 조직을 모방하는 것과 같은 미분화 상태와 분화 상태의 세포의 공존은 재현되고 있지 않다.

[발명의 개시]

본 발명은, 복수종의 분화된 체성 세포를 조합시켜 배양함으로써, 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리를 제공하는 것을 과제로 한다.

본원은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 체성에서 유래하는 복수의 체성 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리의 제조 방법으로서,

상기 복수종의 체성 세포를 포함하는 배양액을 준비하고,

상기 복수종의 체성 세포 배양액을 혼합한 후, 그 혼합 세포 배양액에 Wnt 시그널 활성화제를 첨가하며,

상기 Wnt 시그널 활성화제를 함유하는 배양액을 소정 기간에 걸쳐 비평면 접촉성 배양하고,

상기 비평면 접촉성 배양한 배양물의 배지를 Wnt 시그널 활성화제 비함유 배지와 교환하여 소정 기간 더 배양하는 것

을 포함하며, 여기서 상기 복수의 체세포 중 적어도 1종은 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 방법.

(2) 상기 복수종의 체성 세포가 상피계 체세포와 간엽계 체세포의 조합을 포함하고, 상기 간엽계 체세포가 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 (1)의 방법.

(3) 상기 상피계 체세포가 케라티노사이트이고, 상기 간엽계 체세포가 모유두 세포인 (2)의 방법.

(4) 상기 세포 덩어리로부터 모낭 유도 기능을 갖는 모낭이 형성되는 것인 (3)의 방법.

(5) 상기 Wnt 시그널 활성화제가 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO)인 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 방법.

(6) 상기 비평면 접촉성 배양 방법이 행잉 드롭(hanging drop) 방법인 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 방법.

(7) 체성에서 유래하는 복수의 체성 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리로서,

상기 복수종의 체성 세포를 포함하는 배양액을 준비하고,

을 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기서 상기 복수의 체세포 중 적어도 1종은 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 세포 덩어리.

(8) 상기 복수종의 체성 세포가 상피계 체세포와 간엽계 체세포의 조합을 포함하고, 상기 간엽계 체세포가 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 (7)의 세포 덩어리.

(9) 상기 상피계 체세포가 케라티노사이트이고, 상기 간엽계 체세포가 모유두 세포인 (8)의 세포 덩어리.

(10) 상기 세포 덩어리로부터 모낭 유도 기능을 갖는 모낭이 형성되는 것인 (9)의 세포 덩어리.

(11) 상기 Wnt 시그널 활성화제가 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO)인 (7) 내지 (10) 중 어느 하나의 세포 덩어리.

(12) 상기 비평면 접촉성 배양 방법이 행잉 드롭 방법인 (7) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 세포 덩어리.

(13) (9) 내지 (12) 중 어느 하나의 세포 덩어리에 후보 약제를 적용하여, 육모 효과를 갖는 약제를 스크리닝하는 방법.

(14) 상기 세포 덩어리의 c-myc, BMP4 및 IGFBP3으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 유전자의 발현량을 지표로 하는 것인 (13)의 방법.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(1)로서, DP 세포와 NHEK 세포의 염색을 도시한다.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(2)로서, 세포 덩어리에 있어서의 모유두 세포의 국재(局在)를 도시한다.

도 3은 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(3)로서, 세포 덩어리에 있어서의 세포 증식을 도시한다.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(4)로서, β-카테닌과 NHEK 세포의 염색을 도시한다.

도 5는 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(5)로서, 세포 덩어리에 있어서의 모발 케라틴 발현을 도시한다.

도 6은 본 발명의 방법에 의해 작성한 세포 덩어리의 면역 염색도(6)로서, 세포 덩어리에 있어서의 모아(毛芽) 마커 발현을 도시한다.

도 7은 본 발명의 세포 덩어리 유래의 RNA에 있어서의 각종 유전자의 발현(1)을 도시한다.

도 8은 본 발명의 세포 덩어리 유래의 RNA에 있어서의 Wnt3A 유전자의 발현을 도시한다.

도 9는 본 발명의 세포 덩어리 유래의 RNA에 있어서의 Wnt10B 유전자의 발현을 도시한다.

도 10은 본 발명의 세포 덩어리 유래의 RNA에 있어서의 각종 유전자의 발현(2)을 도시한다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명에 의해, 복수종의 체성 세포종을 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리의 제공이 가능해진다.

본 발명에서 말하는 체성 세포란, 생체의 각종 기관을 구성하는 세포로 분화되기에 이른 세포를 말하며, 미분화 상태의 줄기 세포와는 상반되는 세포를 말한다. 본 발명에서는, 2 이상의 체성 세포를 사용하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는, 상피계 세포계와 간엽계 세포의 조합, 내피계 세포와 간엽계 세포의 조합, 또는 상피계 세포와 간엽계 세포와 내피계 세포의 조합 등, 다양해도 좋다.

본 발명에 따른 세포 덩어리로 형성할 수 있는 기관으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 모낭, 폐, 신장, 간장, 췌장, 비장, 심장, 담낭, 소장, 결장, 대장, 관절, 뼈, 이, 혈관, 림프관, 각막, 연골, 후각 기관, 청각 기관 등 여러 가지 기관을 들 수 있다.

예컨대, 모낭을 형성하고 싶은 경우, 예컨대 두부(頭部) 유래의 각화 표피 세포를 상피 세포계로서, 모유두 세포를 간엽계 세포로서 사용하면 된다. 여기서 말하는 「상피계 세포」는, 피부의 표피 또는 상피의 대부분을 구성하는 세포이며, 진피에 접하는 1층의 기저 세포로부터 발생하는 것을 말한다. 상피계 세포로서는, 신생자(혹은 태아)에서 유래하는 상피계 세포, 성숙한 피부, 예컨대 휴지기 털의 표피 또는 성장기 털의 표피에서 유래하는 세포여도 좋고, 케라티노사이트의 형태인 세포의 배양물이어도 좋다. 이러한 세포는 당업자 주지의 방법에 의해 원하는 도너 동물의 피부로부터 조제할 수 있다. 「모유두 세포」란, 간엽계 세포로서 모낭 최저부에 위치하며, 모낭의 자기 재생을 위해서 모낭 상피 줄기 세포에 활성화 시그널을 보내는, 말하자면 사령탑의 역할을 담당하고 있는 세포를 말한다. 「모유두 세포」는, 예컨대 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 분획을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 조제하고, 이어서 상기 세포 현탁물을 동결 보존함으로써 모포(毛胞) 상피 세포를 사멸시킴으로써 조제할 수 있다.

또한, 예컨대, 후각 기관의 재구축에 대해서는 이하와 같이 하여 조제할 수 있다. 포유동물, 예컨대 마우스의 후각 상피 세포군의 존재 조직 부위를 추출한다. 콜라게나제 처리로 조직을 소화하고, 원심 분리하며, 침전된 세포군을 조제한다. 계속해서 콜라겐 1 또는 4로 코팅한 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 넣고, 접착성이 우수한 후각 상피 세포를 우선적으로 접착시키기 위해서 5분 정도로 빠르게 현탁액을 흡수한다. 상기 접시에 남은 상피계 세포는 세포 배양으로 이행할 수 있다. 또한 남은 세포의 대부분은 상피계 세포가 된다. 빨아올린 나머지 현탁액에는 간엽계 세포가 존재하고 있으나, 피브로넥틴 또는 젤라틴으로 코팅한 배양 접시에 현탁액을 넣고 4시간 이상, 적당한 분위기, 예컨대 37℃, 95% CO₂ 하에서 정치(靜置)함으로써, 간엽계 세포를 세포 배양에 제공하는 것이 가능해진다. 이상과 같이 조제한 상피 및 간엽계 세포는, 모낭 기관의 재구축과 동일한 기법에 의해 새로운 후각 기관 구축에 제공할 수 있다.

또한, 예컨대 신장계 구체(球體)의 재구축에 대해서는, 이하와 같이 조제할 수 있다. 포유동물, 예컨대 마우스의 신장에 존재하는 조직 부위를 추출한다. 콜라게나제 처리로 조직을 소화하고 원심 분리하며, 100 ㎛ 메쉬로 조대물(粗大物)을 제거한다. 계속해서 40 ㎛ 메쉬로 사구체를 메쉬에 모으고, 트립신 처리로 세포 현탁액을 얻는다. 콜라겐 1 또는 4로 코팅한 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 넣어 상피 세포를 우선적으로 접착시킨다. 이 처리에 의해, 본 세포의 대부분은 사구체에서 유래하는 상피계 세포가 된다.

한편, 신장의 경우, 발생시에 존재하고 있던 간엽계 세포는 생체에서는 사멸하고 있다. 따라서, 본 발명에서는 조직 재구축에 필요한 상피 간엽 상호 작용을 재차 유도하기 위해서 이하와 같은 기법을 채용할 수 있다. 상피계 세포는 상기한 신장 유래 세포를 사용한다. 또한 손실된 간엽계 세포의 대체로서, 동속(同屬)인 모유두 세포 또는 골수 유래 간엽계 줄기 세포를 사용한다. 이상과 같은 상피 및 간엽계 세포는, 모낭 기관의 재구축과 동일한 기법에 의해 새로운 신장 기관 구축에 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 세포의 기원은 그 목적에 따라, 여러 가지 포유동물을 기원으로 해도 좋으며, 한정하지 않고 인간, 침팬지, 그 외의 영장류, 가축 동물, 예컨대 개, 고양이, 축산 동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 염소, 실험용 동물, 예컨대 토끼, 래트, 마우스, 몰모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, SCID 마우스, 누드 래트 등에서 유래한다. 또한, 그 조합은 동종계여도 좋고, 이종계여도 좋으나, 동종계가 바람직하다.

본 발명에 따른 체성 세포의 배양에 유효한 배양액은 특별히 한정되는 것은 아니며, 세포 배양에 있어서 관용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 예컨대, 간엽계 세포에 대해서는, 바람직하게는 DMEM, MEM, F12, Chang 배지 등의 혈청 함유형 배지가 사용 가능하다. 이 경우, 혈청 농도는 0∼30%, 바람직하게는 10%로 하고, 필요 불가결한 인자로서, bFGF(염기성 섬유아세포 증식 인자) 및 EGF(상피 증식 인자), 2 mM L-글루타민을 첨가한다.

상피계 세포의 경우, Epilife(등록 상표), HuMedia(등록 상표)(모두 구라보사), Invitrogen SFM(Invitrogen사) 등, 무혈청형의 케라티노사이트에 대하여 최적화된 배지가 바람직하다. 케라티노사이트는 경우에 따라서는 Green법[Cell 1975 N0V; 6(3): 331-43, Serial cultivation of strain of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Rheinwalf J. G., Green H.]으로 조제할 수 있는데, 이 경우에는 그 배양에 상기 간엽계에서 사용한 혈청 함유형 배지를 사용할 수 있다. 또한, 상피계 세포, 간엽계 세포의 배양에 공통해서 사용할 수 있는 항생 물질로서는 페니실린 G, 카나마이신, 스트렙토마이신, 암포테리신 B를 들 수 있다.

본 발명에서는, 상기 복수의 체성 세포의 혼합물에 Wnt 시그널 활성화제를 첨가하여 배양을 행하는 것을 특징으로 한다. Wnt 시그널이란, β-카테닌의 핵 이행을 촉진하여, 전사 인자로서의 기능을 발휘하는 일련의 작용을 말한다. 본 시그널은 세포간 상호 작용에 기인하며, 예컨대, 어떤 세포로부터 분비된 Wnt3A라고 하는 단백이 또 다른 세포에 작용해서, 세포내의 β-카테닌이 핵 이행하여, 전사 인자로서 작용하는 일련의 흐름이 포함된다. 일련의 흐름은 상피 간엽 상호 작용을 예로 하는 기관 구축의 최초의 현상을 일으킨다. Wnt 시그널은 β-카테닌 경로, PCP 경로, Ca²⁺ 경로의 3 가지 경로를 활성화함으로써, 세포의 증식이나 분화, 기관 형성이나 초기 발생시의 세포 운동 등 각종 세포 기능을 제어하는 것으로 알려져 있다. Wnt 시그널이 갖는 그 미분화 상태 유지 기능에 의해, 분화를 억제할 목적으로 ES 세포의 배양시에 이용되고는 있으나[예컨대, Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol. 10, No. 1, Jan. 2004], 체성 세포의 배양에 있어서의 그 이용 및 효과에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.

Wnt 시그널 활성화제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 것이면 어떠한 것이어도 좋고, 예컨대 비스-인돌로(인디루빈) 화합물(BIO)((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), 그 아세톡심 유사체 BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심), 티아디아졸리딘(TDZD) 유사체(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), 옥소티아디아졸리딘-3-티온 유사체(2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온), 티에닐 α-클로로메틸케톤 화합물(2-클로로-1-(4,4-디브로모-티오펜-2-일)-에타논), 페닐 α-브로모메틸케톤 화합물(α-4-디브로모아세토페논), 티아졸 함유 요소 화합물(N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아)나 GSK-3β 펩티드 저해제, 예컨대 H-KEAPPAPPQSpP-NH₂ 등을 들 수 있다.

Wnt 시그널 활성화제의 첨가량은 특별히 제한되는 것은 아니며, Wnt 시그널 활성화, 환언하면, GSK-3의 저해가 이루어지고, 또한 세포 증식이 정지되지 않는 양이면 되며, 사용하는 약제의 종류 및 증식해야 할 세포의 종류에 의존하여, 당업자에 의해 적절하게 결정될 것이다. 예컨대, Wnt 시그널 활성화제로서 BIO를 모유두 세포에 사용하는 경우, 그 양은 예컨대 0.1 μM∼10 μM 정도가 적량일 것이지만, 물론 이러한 양에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서의 또 하나의 특징은, 상기 복수의 체성 세포의 혼합물에 Wnt 시그널 활성화제를 첨가한 것을 비평면 접촉성 배양하는 것이다. 비평면 접촉성 배양이란, 평면 접착성 세포를 접착시키지 않도록 구면(球面)을 갖는 계면 위에서 세포를 배양하는 방법이다. 비평면 접촉성 배양 방법의 예로서는, 행잉 드롭법이 있다[Keller G. M. et al., Curr. 0pin. Cell Biol., 7, 862-869 (1995)]. 행잉 드롭법(현적 배양법)이란, 배양 세포를 포함하는 배양액의 액적(일반적으로 25∼35 ㎕ 정도)을 배양 접시의 뚜껑의 천장측에 점착하고, 배양액이 낙하 또는 흘러 떨어지지 않도록 주의 깊게 뚜껑을 닫으며, 표면 장력에 의해 배양액 내의 세포를 거꾸로 된 액적의 상태로 배양하는 방법이다. 이와 같이 배양함으로써, 세포는 평면 배양 등의 경우에 있어서의 평면과의 접촉에 의해 받는 영향을 최소한으로 할 수 있다. 비평면 접촉성 배양 방법의 그 외의 예로서는, 미리 세포 접착이 될 수 없도록 표면 가공된 반구 형상의 세포 배양 접시(예컨대 스미토모 베이클라이트에서 판매되고 있는 「스페로이드」)를 이용한 형성 방법(스페로이드 형성 방법), 니트로셀룰로스 배지 내에서의 배양에 의해 부유 상태로 세포를 응집시키는 부유 방법 등이 있다.

비평면 접촉성 배양을 위한 온도·시간은 취급하는 세포의 종류나 계대 횟수에 따라 변경할 수 있으나, 예컨대 37℃에서 1∼10일간, 바람직하게는 3∼7일간 행하고, 필요하다면 적절하게 배지를 동일한 것으로 교환한다.

마지막으로 상기 배지를, Wnt 시그널 활성화제를 함유하지 않는 배양액과 교환함으로써 세포를 Wnt 시그널 부재하의 상태에서 또한 비평면 접촉성 배양한다. 이 경우도 배양 시간 및 온도도 취급하는 세포의 종류나 계대 횟수에 따라 변경할 수 있으나, 예컨대 37℃에서 1∼10일간, 바람직하게는 3∼7일간 행하고, 필요하다면 적절하게 배지를 동일한 것으로 교환한다.

본 발명에 의해, 예컨대 모낭 이식, 각 장기 이식, 및 완전한 장기에는 이르지 않으나 장기를 구성하는 미소 기관, 예컨대 각막, 신사구체, 후각 상피 조직, 연골 부위의 부분 이식 등에 유용한 세포 덩어리를 효율 좋게 인공적으로 작성하는 것이 가능해진다. 또한 인공적으로 작성한 세포 덩어리는, 약제 평가에 제공함으로써, 보다 정확하게 생체내 기관에의 약제 작용을 평가하는 것이 가능해진다. 또한 누드 마우스, SCID 마우스와 같은 면역 부전 동물에의 세포 덩어리 이식에 의해, 보다 완성도가 높은 기관 모양 조직을 작성할 수 있으며, 예컨대 인간 모낭, 마우스 신장 등을 이소적(異所的)으로 작성함으로써 신규의 약제 평가 및 유전자 기능 평가를 가능하게 하는 모델 동물의 작성이 가능해진다. 특히 세포 덩어리를 작성할 때에 세포에 유전자 도입 또는 개변을 실시함으로써 리포터를 갖는 재구축 기관을 간편하게 작성하는 것이 가능해지며, 조직 및 기관 수준에서의 생체내 분자 거동을 정확하게 파악 조사할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 덩어리에 있어서, 상피계 체세포가 케라티노사이트이고 또한 간엽계 체세포가 모유두 세포이며, 그리고 모낭 유도 기능을 갖는 모낭이 형성되는 경우, 그 세포 덩어리는, 육모 효과를 나타내는 약제의 평가, 예컨대 그러한 약제의 스크리닝에 사용할 수 있다. 예컨대, 육모 약제의 후보 약제를 이 세포 덩어리에 적용하여, 대조군과 비교해서, 세포 덩어리의 성장이 현저해지는 경우, 육모 효과를 갖는 약제라고 판정하거나, 또는 털 성장을 촉진시키는 유전자, 예컨대 c-myc의 발현의 항진을 지표로 하거나, 털 성장을 억제하는 유전자, 예컨대 BMP4, IGFBP3 유전자 등의 발현의 억제를 지표로 해서, 육모 효과의 유무를 판정할 수 있다.

모유두 세포

인간 유래 모유두 세포는 도너로부터 제공된 두피 조직으로부터 조제하였다. 진피 조직을 제거한 후, 지방 조직 내에 존재하는 모낭 부위를 실체 현미경하에서 핀셋 및 안과 가위를 이용하여 채취하였다. 채취한 모낭은 항생제가 들어 있는 배양액 안으로 옮기고, 또한 상기 현미경하에서 모유두 세포 부위를 육안으로 분리 채취하였다. 분리한 모유두 세포는 배지 내에서 10 cm 원형 디시(dish)[TRP사 제조]에서, 37℃, 95% CO₂ 하에서 1주일 이상 배양하여, 이후의 실험에 제공하였다. 사용한 배지는 Advanced-DMEM(Invitrogen), 15% 소 태아 유래 혈청, 20 ng/㎖의 bFGF, 10 ng/㎖의 EGF, 2 mM의 L-글루타민, 페니실린·스트렙토마이신·암포테리신 혼합액《100배 희석》, 3.5 ㎕/500 ㎖의 β-머캅토에탄올이다. 세포는 적절하게 동일한 조건하에서 계대 배양하였다. 계대시에는, 0.5% 트립신/EDTA 용액으로 세포 박리를 행하고, 세포를 새로운 접시에 옮겨 넣어, 동일한 조성의 신선 배지에서 계대 배양을 행하였다.

BIO(Calbiochem사)를 첨가하는 경우, DMSO(디메틸설폭사이드)로 10 mM 용해하고, 0.1∼5 μM이 되도록 첨가하였다.

케라티노사이트

인간 정상 신생아 포피 유래 케라티노사이트를 이하와 같이 해서 조제하였다. 도너로부터 채취한 포피 조직을 디스파제 효소 존재하의 PBS(-) 중에서 하룻밤 정도 4℃에서 처리하였다. 이 처리에 의해 표피만을 시트 형상으로 채취할 수 있으며, 그것을 계대시와 동일한 방법으로 0.25% 트립신 효소로 소화 조제하고, 콜라겐 처리된 배양 접시로 배지와 함께 옮겨 배양하였다. 배지로서 Humedia KG2(구라보사)를 사용하였다. 세포는 적절하게 동일한 조건하에서 계대 배양하였다. 계대시에는, 0.5% 트립신/EDTA 용액으로 세포 박리를 행하고, 세포를 새로운 접시에 옮겨 넣어, 동일한 조성의 신선 배지에서 계대 배양을 행하였다. 상기와 같이 해서 채취되어 배양된 세포를, 이후의 실험에 제공하였다.

행잉 드롭 배양

배지 구성

Advanced-DMEM(Invitrogen사) 30%, 2 mM의 L-글루타민, 페니실린·스트렙토마이신 혼합액(Invitrogen사)(100배 희석) 3.5 ㎕/500 ㎖의 β-머캅토에탄올과 Humedia KG-2(구라보사)를 1:1로 혼합하였다.

작성 방법

모유두 세포는 P3(계대수 1을 P1이라고 표기) 이상으로서 Bio 부하가 있거나 또는 없으며, 표피 각화 세포에 대해서는 P3 이내의 세포를 준비하였다.

각 세포가 1×10⁵개가 되도록, 트립신 처리 후에 각각의 배지로 희석하였다.

한 변이 10 cm인 정사각형의 배양 접시(뚜껑) 천장측에 각 배양액 25∼35 ㎕를 분주(分注)하여 혼합하고, 적당한 크기의 돔(dome)상의 물방울을 형성시켰다.

주의 깊게 뚜껑을 닫아, 배양액이 낙하하지 않도록 하여, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 배양하였다.

3일 후, 상기에서 사용한 것과 동일한 배지로, 배지 교환을 행하였다.

또한 4일간 배양한 후, 일부는 하기의 RT-PCR 해석 (1)에 제공하였다. 나머지는, 모든 배지를 Bio 없음의 조건인 배지로 교환하였다.

3일째에 동일한 배지 교환을 행하고, 7일째에 생성된 세포 덩어리를 회수하여, 하기의 면역 염색에 제공하였다.

면역 조직 형광 염색

행잉 드롭법으로 얻어진 각 세포 덩어리를 0.1% 파라포름알데히드로 5분 고정하고, 그 후의 염색에 제공하였다. 또한, 일부의 세포 덩어리는 미고정으로 OCT액에 포매하고, 저온 유지 장치(cryostat)로 동결 절편을 제작하여, 면역 조직 염색을 행하였다.

13% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBS(-) 중에서 6시간 블로킹을 행하였다.

하기 표에 나타내는 각종 일차 항체를, 상기 13% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBS(-)로 1/200으로 희석하고, 각 샘플에 첨가하여, 4시간 동안 4℃에서 반응시켰다.

0.02%의 Tween 20을 포함하는 PBS(-)로 3회 세정하였다.

상기 13% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBS(-)로 1/200으로 희석한 형광 이차 항체(EXCEL 파일 참조)를 각 샘플에 첨가하였다. 또한 DAPI(4'-6-디아미디노-2-페닐인돌)로, 세포의 핵을 청색으로 염색하였다.

형광 현미경(0LYMPUS)으로 관찰하였다.

	목적 단백	제조 회사	상세
일차 항체	CD49f	Serotec	래트 항인간/마우스 CD49f
	비멘틴	YLEM	모노클로날
	β-카테닌	Becton Dickinson	모노클로날
	명칭	제조 회사	상세
형광 이차 항체	염소 항래트 IgG TEXAS-RED 접합	Jackson ImmunoResearch	적
	토끼 항마우스 IgG ALEXAFLUOR488	Invitrogen	황

여기서, 비멘틴(vimentin)에 대한 모노클로날 항체는 모유두 세포를 특이적으로 염색하고, CD49f 폴리클로날 항체는 표피 세포를 특이적으로 염색하기 때문에, 비멘틴 항체 및 CD49f 항체의 면역 세포 염색에의 적용은, 본 실험계에서 생성한 세포 덩어리 내에서의 세포의 속성의 평가를 가능하게 한다.

도 1은 상기 현미경 관찰 결과를 도시하는 흑백 사진도이다. 이 도면의 컬러판에서는, 녹색으로의 비메틴 항체에 의한 염색, 적색으로의 CD49f 항체에 의한 염색을 확인할 수 있으며, 각각 모유두 세포, 케라티노사이트인 것을 이해할 수 있었다. 또한, 도 2에 도시하는 바와 같이 모유두 세포가 세포 덩어리의 중심부에 응집되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이들 도면의 결과, 세포가 응집화된 후에 규칙적으로 배열된 것이 관찰되어, 본 실험계에 의해 상피 세포와 간엽 세포가 규칙적으로 배열되어 있는 것을 알 수 있었다. BIO를 첨가하여 세포 덩어리를 발생시킨 후, BIO 미첨가로 배양한 세포 덩어리에 있어서, 적색으로 염색된 케라티노사이트가 가지 형상으로 규칙적으로 성장한 것을 엿볼 수 있었다. 또한 도 3은, BIO를 첨가하여 세포 덩어리를 발생시킨 경우에, 모유두가 응집하여 존재하는 중심부와, 가지 형상으로 진전하는 세포 덩어리의 선단부가, 증식 마커의 Ki67에 양성인 것을 알 수 있었다. 이상의 결과, 통상 응집시킨 체세포는 성장하지 않고 휴면 상태가 되는 것이 통례였으나, BIO의 효과에 의해 세포 덩어리에 있어서 세포의 증식이 일어난 것은 놀랄만한 지견이라고 말할 수 있다.

또한, β-카테닌 모노클로날 항체를 줄기 세포적 성질의 마킹을 위해서 사용하였다. β-카테닌은 통상의 체세포에 있어서 소량으로 세포막 근방에 존재하고 있기 때문에, 통상의 형광 면역 항체 염색에서는 미약하게밖에 검출할 수 없다. 그러나, 줄기 세포적 성질을 갖는 세포에서는, β-카테닌은 핵 내에서 전사 인자로서 작용하고 있으며, 그 양도 증가하고 있다. 또한 핵 내에 집적되어 있기 때문에, 형광 면역 항체 염색법에서도 강하게 국재(局在)하고 있는 모습을 확인할 수 있다. 본 실험에 있어서도, 세포 덩어리의 일부 특이적인 부위에서 β-카테닌이 강하게 염색되어 집적되어 있는 상황이 확인되고 있는 점에서, β-카테닌 항체에 의한 염색은 세포 덩어리 내에서의 줄기 세포적 성질을 갖는 세포의 검출에 적합하다고 말할 수 있다.

도 4는 상기 β-카테닌 모노클로날 항체 염색에 의한 현미경 관찰 결과를 도시하는 흑백 사진도이다. 이 도면의 컬러판은, β-카테닌 항체에 의한 염색 부위를 녹색, 케라티노사이트를 적색으로 나타내고 있다. 강하게 녹색으로 빛나는 부위의 β-카테닌 양성 세포가 보여지고, 세포의 줄기 세포적 성질이 나타났다. 특필해야 할 것은, 세포 덩어리의 구상(球狀) 부위에 있어서 중심부가 황색으로 빛나는 부분이 존재한 것이다. 이 부위는 β-카테닌 양성이며 또한 케라티노사이트인 것을 나타낸다. β-카테닌 양성 세포는 상기한 바와 같이 줄기 세포적 성질을 갖는 세포라고 말할 수 있다. 한편으로 세포 덩어리로부터 가지 형상으로 진전하는 케라티노사이트(적색)의 부위에는 황색으로 빛나는 부위는 없으며, 다시 말하면 동일 세포 덩어리 내에서 줄기 세포적 성질과 통상의 체세포적 성질을 갖는 세포(케라티노사이트)가 공존하고 있는 것을 관찰할 수 있다. 통상의 배양 상태에 있어서는 관찰할 수 없는 상황이며, 상피 간엽 상호 작용이 마치 생체내와 같이 재현되어, 미분화 및 분화된 세포군이 자율적으로 세포 덩어리를 형성하여 성장하고 있다고 고찰할 수 있다.

여기서 말하는 미분화 케라티노사이트란, 털 모세포와 같이 털을 구축하는 케라티노사이트를 항상 만들어내는 줄기 세포적 능력을 갖는 세포를 가리킨다. 한편으로 분화된 케라티노사이트는 증식 횟수가 한정적이며, 소위 털이 되고 있는 세포 운명이 결정되어 있는 세포를 가리킨다. 동시에 도 4의 컬러판에 있어서 녹색으로 빛나는 구체를 둘러싸는 세포는 모유두 세포라고 생각되지만, 이 세포 덩어리의 환경에 있어서 모유두 세포가 β-카테닌 양성 세포인 것은, 생체내에 있어서 모낭 형성 및 성장 개시에 Wnt 시그널이 중요한 것과 유사하며, 중요한 점이라고 말할 수 있다.

표피 각화 세포나 외모근초 세포에서 발현되는 사이토케라틴 14(K14)에 대한 항체를, 이들 세포가 모간(毛幹)으로 분화되고 있지 않는 것을 확인할 목적으로 사용하였다(적색). 모발 케라틴에 특이적으로 반응하는 AE13 모노클로날 항체(Lynch et al., J Cell Biol 103, 2593, 1986)는, 44K/46K의 산성 모발 케라틴 이량체를 인식하기 때문에, 모간으로 분화된 상태의 마킹을 위해서 사용하였다(녹색). 모발 케라틴은 통상의 표피 각화 세포에 있어서 거의 전혀 존재하지 않는 모낭 특이적인 구조 단백질이다. 도 5는 그 현미경 관찰 결과를 도시하는 흑백 사진도이다. 이 도면의 컬러판에서는, 모유두 세포와 표피 각화 세포로 제작한 세포 덩어리에서는, AE13 항체에 의해 염색되는 부분은 보여지지 않으나, BIO로 자극하면, 일부에 염색이 확인된다. 모유두 세포와 외모근초 세포로 제작한 세포 덩어리에서는, BIO의 자극이 없는 경우에서의 AE13 항체에 의해 염색되는 부분을 확인할 수 있으며, BIO의 자극에 의해 AE13 항체에 의한 염색성이 현저히 높아졌다. 한편, 모든 세포 덩어리에서 K14 항체(적색)와 AE13 항체(녹색)의 양방으로 염색되는 부위(황색으로 빛나는 부위)는 보여지지 않는 점에서, 사이토케라틴 14를 발현하는 미분화의 세포로부터 모발 케라틴을 생성하는 세포로의 변화가 일어난 것이라고 생각된다.

발모기의 모아(毛芽)에 있어서 특이적으로 발현되는(Ogawa et al., Exp Dermatol 13, 401, 2004) 인간 상피 항원에 대한 Ber-EP4 항체를, 발모기의 모아의 마킹을 위해서 사용하였다(녹색). 도 6은 그 현미경 관찰 결과를 도시하는 흑백 사진도이다. 이 도면의 컬러판에서는, 모유두 세포와 외모근초 세포로 제작한 세포 덩어리에 있어서, BIO로 자극한 경우에, Ber-EP4 항체에 의한 면역 염색성(녹색)이 명료하게 관찰되었다. K14 항체(적색)와 Ber-EP4 항체(녹색)의 양방으로 염색되는 부위(황색으로 빛나는 부위)는 보여지지 않는 점에서, 사이토케라틴 14를 발현하는 미분화의 세포로부터 Ber-EP4를 발현하는 모아로 분화된 세포로의 변화가 일어난 것이라고 생각된다.

RT-PCR 해석 (1)

각 샘플로부터 TRIZOL(Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 각 RNA 200 ng 상당을 RevTraACE(TOYOBO) 50 ㎕의 반응계에서 cDNA로 역전사하였다. 얻어진 샘플 1 ㎕로 하기의 프라이머를 이용하여, 50 ㎕의 계에서 PCR 반응을 행하였다. 사용한 효소는 KOD-DASH(TOYOBO), [95℃, 60 sec, (95℃, 30 sec; 63℃, 15 sec; 72℃, 30 sec)를 40 사이클, 72℃, 60 sec]의 반응 프로토콜을 이용하였다.

반응액 10 ㎕를 2% 아가로스 겔(COSMOBIO)/TAE 완충액 중에서 100 V로 전기 영동을 하였다. 사용한 DNA 사이즈 마커는 100 bp 래더 마커(TOYOBO)이다.

사용한 프라이머는 하기와 같으며, PCR의 결과를 도 7에 도시한다.

β-액틴은 실험 전체의 대조군으로서 이용하였다.

Lef-1은 Wnt 시그널의 하류 유전자이며, 도 7에 도시하는 바와 같이, BIO의 존재하 및 비존재하의 어떠한 경우에 있어서도 본 실험계에서 검출되었다. Lef-1의 유전자 발현이 보여지는 경우, 세포에 Wnt 시그널이 작용하고 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 실험계에서는 BIO의 첨가에 의해 세포내에 Wnt 시그널이 작동하고 있는 것을 이해할 수 있다.

SHH(Sonic Hedge Hog)는 조직 형성시에 관여하는 유전자이며, 도 7에 도시하는 바와 같이, BIO의 존재하 및 비존재하의 어떠한 경우에 있어서도 본 실험계에서는 검출되지 않았다. SHH는 Wnt 및 Lef-1의 시그널을 받아 전사 발현되는 유전자이다. 본 유전자 발현은 Wnt 시그널이 세포에 작용하고, 또한 생체내에서 일어나고 있는 것과 같은 연쇄적인 유전자 발현이 발생하고 있다는 것을 나타낸다. 동시에 SHH는 상피 간엽 사이에서의 세포간 시그널을 담당하는 단백이며, 상피 간엽 상호 작용이 일어나고 있다는 것도 동시에 시사한다.

STAT-3(SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 3)은 모낭 유도 관련 유전자이며, 도 7에 도시하는 바와 같이, BIO의 비존재하에 비하여, 존재하에서 현저하게 검출되었다. STAT-3은 줄기 세포의 자기 증식에 관여한다고 말해지는 세포내 시그널 전달 단백이다. 동(同) 유전자의 항진은, 배성 줄기 세포에서 자기 증식과 만능성 유지에 필요 불가결한 인자이며, 그 줄기 세포적 성질을 나타내는 마커 중 하나이다. 동시에 논문[Sano, S. et al., Nature Med. 11: 43-49, 2005 "Stat3 links activated keratinocytes and immunocytes required for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model."]에 기재된 바와 같이, 털의 성장기로의 이행에 매우 중요한 유전자인 점에서도, 본 실험계에서 STAT-3의 전사가 항진하는 것은, 후에 모낭으로 성장해 갈 때의 정상적인 단계를 밟고 있음이 시사된다. 동시에 STAT-3 시그널 그 자체는 BIO의 영향을 직접 받는 것은 아니다[Sato N, et al., Nat Med. 2004 Jan; 10(1): 55-63. Epub 2003 Dec 21. "Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor"]. 다시 말하면, STAT-3의 BIO 첨가시에서의 항진은 상피 간엽 상호 작용에 의해 줄기 세포 유지 시스템이 세포 덩어리 내에서 발생하고 있음을 나타낸다.

TWIST-1은 배성 간엽계 줄기 세포의 마커이며, 모유두 세포가 매우 높은 줄기 세포적 성질을 갖고 있음을 시사한다. TWIST-1은 체세포에서의 발현은 골수성 간엽 줄기 세포를 포함하는 매우 희소한 세포종으로 한정된다는 점에서, 모유두 세포는 체세포로서도 높은 줄기 세포적 성질을 갖는 세포라고 말할 수 있다. 도 7의 RT-PCR 실험에 있어서는 등량의 전 RNA를 주형으로 이용하여 RT-PCR을 하고 있다. BIO의 존재하에 발현이 저하되고 있는 것처럼 보이는 것은, 도 1 및 도 2로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, 전체 세포수에 있어서의 모유두 세포의 수가 상대적으로 저하하고 있기 때문이다. 결론적으로, 발현량의 다소를 고려한 후라도, TWIST-1 유전자를 발현하는 세포가 계속 존재하고 있는 것은, 본 실험에 있어서 줄기 세포적 능력을 가질 수 있는 모유두 세포가 계속 존재하고 있는 것을 시사하고 있다.

베르시칸(versican) 유전자는 발모 유도시에 강하게 모유두 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있는 발모 마커이다[Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), pp. 7336-7341]. 도 7의 RT-PCR 실험에 있어서는 등량의 전 RNA를 주형으로 이용하여 RT-PCR을 하고 있다. BIO의 존재하에 발현이 저하되고 있는 것처럼 보이는 것은, 도 1 및 2로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, 전체 세포수에 있어서의 모유두 세포의 수가 상대적으로 저하하고 있기 때문이다. 결론적으로, 발현량의 다소를 고려한 후라도, 베르시칸 유전자를 발현하는 세포가 계속 존재하고 있는 것은, 본 실험에 있어서 발모 유도능을 가질 수 있는 모유두 세포가 계속 존재하고 있는 것을 시사하고 있다.

각종 유전자의 발현 수준의 변화로부터, 세포 덩어리 내에서 BIO의 직접 효과에 의해, 상피 및 간엽 세포의 미분화성이 유지되고, 또한 Wnt 시그널에 의한 상피 간엽 상호 작용의 의사가 일어났다고 말할 수 있다. 또한 STAT-3과 같이 Wnt 시그널과는 관련이 없는 줄기 세포적 성질의 출현이 보여지는 점에서 BIO의 효과는 자율적인 세포간 상호 작용과 증식능을 갖는 세포 덩어리의 창출에 기여하고 있다고 말할 수 있다.

Wnt3A RT-PCR

모유두 세포는 P3(계대수 1을 P1이라고 표기)으로서 Bio 부하가 있으며, 케라티노사이트에 대해서는 P3 이내의 세포를 준비하였다.

각 세포가 3×10³개가 되도록, 트립신 처리 후에 각각의 배지로 희석하였다.

Bio(Calbiochem사)를 DMSO(디메틸설폭사이드)로 10 mM 용해하고, 0.1∼5 μM이 되도록 첨가하였다.

한 변이 10 cm인 정사각형의 배양 접시(뚜껑) 천장측에 각 배양액 25∼35 ㎕를 분주하여 혼합하고, 적당한 크기의 돔상의 물방울을 형성시켰다.

3일 후, 상기에서 사용한 것과 동일한 배지로, 배지 교환을 행하였다. 7일째에 샘플을 회수하여, 하기와 같은 RT-PCR 해석 (2)에 제공하였다(도 8의 「0일」). 또한 나머지 동일한 세포에 대해서는 배지를 Bio 없음의 조건인 배지로 교환하고, 분화 유도시키며, 3일째에 회수한 샘플을 마찬가지로 하기와 같은 RT-PCR 해석 (2)에 제공하였다(도 8의 「3일」).

RT-PCR 해석 (2)

샘플로부터 TRIZOL(Invitrogen)을 이용하여, RNA를 추출하였다. 각 RNA 200 ng 상당을 RevTraACE(TOYOBO) 50 ㎕의 반응계에서 cDNA로 역전사하였다. 얻어진 샘플 1 ㎕로 하기의 프라이머를 이용하여, 50 ㎕의 계에서 PCR 반응을 행하였다. 사용한 효소는 KOD-DASH(TOYOBO), [94℃, 2 min, (94℃, 30 sec; 63℃, 10 sec; 72℃, 30 sec)을 32 사이클, 72℃, 2 min]의 반응 프로토콜을 이용하였다.

센스 프라이머(순쇄) caggaactacgtggagatcatg (서열 번호 13)

안티센스 프라이머(역쇄) ccatcccaccaaaactcgatgtc (서열 번호 14)

반응액 10 ㎕를 2% 아가로스 겔(COSMOBIO)/TAE 완충액 중에서 100 V로 전기 영동을 하였다. 브롬화에티듐(ethidium bromide)으로 가시화한 후, 목적으로 하는 밴드를 검출하였다.

그 결과를 도 8에 도시한다. 도면 중, 화살표로 나타내고 있는 것이 Wnt3A의 밴드이다. Wnt3A는 발현 자체가 드물고, 주로 상피계 세포에 의해 발현되며, 기관 형성이나 상피계 세포-간엽계 세포의 상호 작용에 관여하는 유전자인 것으로 알려져 있다. 도면에 도시하는 바와 같이, BIO의 존재하에서 배양함으로써 Wnt 시그널을 활성화시킨 세포에 있어서는 Wnt3A의 발현은 전혀 보여지지 않았던 것에 비해서, 그 후 BIO를 제거함으로써 세포의 분화를 유도시킨 세포에서는 Wnt3A의 발현이 보여졌다. 따라서, 본 실험계에서는, BIO의 존재하에서 배양한 후, BIO를 제거하여 배양함으로써, 케라티노사이트의 분화, 나아가서는 자율적인 기관 형성이 유도되는 것이 분명해졌다.

Wnt10B RT-PCR

모유두 세포는 P3(계대수 1을 P1이라고 표기)으로서 Bio 부하가 없으며, 외모근초 세포에 대해서는 P3 이내의 세포를 준비하였다.

Bio(Calbiochem사)는 DMSO(디메틸설폭사이드)로 10 mM 용해하고, 0.1∼5 μM이 되도록 첨가하였다.

3일 후, 상기에서 사용한 것과 동일한 배지로, 배지 교환을 행하였다. 7일 후에 샘플을 회수하여, 하기와 같은 RT-PCR 해석 (3)에 제공하였다(도 9의 「7일」). 또한 나머지 동일한 세포에 대해서는 배지를 Bio가 없는 배지로 교환하여 분화 유도시키고, 10일 후와 14일 후에 회수한 샘플을 마찬가지로 하기와 같은 RT-PCR 해석 (3)에 제공하였다(도 9의 「10일」 및 「14일」).

RT-PCR 해석 (3)

샘플로부터 TRIZOL(Invitrogen)을 이용하여, RNA를 추출하였다. 각 RNA 200 ng 상당을 RevTraACE(TOYOBO) 50 ㎕의 반응계에서 cDNA로 역전사하였다. 얻어진 샘플 4 ㎕로 하기의 프라이머를 이용하여, 20 ㎕의 계에서 정량 PCR(LightCycler system, Roche)을 행하였다. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(Roche)의 반응 프로토콜[95℃, 10 sec; 63℃, 10 sec; 72℃, 15 sec를 40 사이클]을 이용하였다.

센스 프라이머(순쇄) gaagttctctcgggatttcttggatcc (서열 번호 15)

안티센스 프라이머(역쇄) cggttgtgggtatcaatgaagatgg (서열 번호 16)

그 결과를 도 9에 도시한다. 데이터는 모두, 세포 덩어리에 있어서 BIO를 부하시키고 있지 않는 경우의 3일 후의 발현량에 대한 상대적인 발현량으로서 나타내었다. Wnt10B는 모낭의 형태 형성기와 발모기에 있어서, 주로 상피계 세포에 의해 발현되며, 상피계 세포-간엽계 세포의 상호 작용에 관여하는 유전자인 것이 알려져 있다. 도면에 도시하는 바와 같이, BIO의 존재하에서 배양함으로써 Wnt 시그널을 활성화시킨 세포에 있어서는, BIO의 존재하에서 배양하는 한은 Wnt10B의 발현은, BIO의 비존재하에서 배양한 대조군과 동일한 정도밖에 보여지지 않았던 것에 비해서, 그 후 BIO를 제거함으로써 세포의 분화를 유도시킨 세포에서는, Wnt10B의 발현이 경시적으로 높아졌다. 따라서, 본 실험계에서는, BIO의 존재하에서 배양한 후, BIO를 제거하여 배양함으로써, 모낭 상피계 세포(외모근초 세포)의 분화, 나아가서는 자율적인 기관 형성이 유도되는 것이 분명해졌다.

세포 덩어리의 발모 약제 사이클로스포린 A에의 반응성

면역 억제제인 사이클로스포린 A는 부작용으로서 다모증(Lutz et al., Skin Pharmacol 7, 101, 1994)이 알려져 있는 약제이며, 발모 작용(Paus et al., Lab Invest 60, 365, 1989)이나 털 성장 촉진 작용(Taylor et al., J Invest Dermatol 100, 237, 1993)을 나타낸다는 것이 밝혀져 있다.

모유두 세포는 P3(계대수 1을 P1이라고 표기)으로서 Bio 부하가 없고, 외모근초 세포에 대해서는 P3 이내의 세포를 준비하였다.

3일 후, 사이클로스포린 A를 포함하는 상기에서 사용한 것과 동일한 배지로, 배지 교환을 행하였다. 사이클로스포린 A(Novartis사)는, 에탄올로 10 mM 용해하고, 0.1∼10 μM이 되도록 첨가하였다.

사이클로스포린 A 첨가 3일 후에 샘플을 회수하여, 하기와 같은 RT-PCR 해석 (4)에 제공하였다.

RT-PCR 해석 (4)

샘플로부터 RNeasy 키트((QIAGEN)를 이용하여, RNA를 추출하였다. 각 RNA 2,000 ng 상당을 SuperScript II(Invitrogen) 20 ㎕의 반응계에서 cDNA로 역전사하였다. 얻어진 샘플 1 ㎕로 하기의 프라이머를 이용하여, 20 ㎕의 계에서 정량 PCR(LightCycler system, Roche)을 행하였다. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(Roche)의 반응 프로토콜[95℃, 10 sec; 58℃, 10 sec; 72℃, 15 sec를 40 사이클]을 이용하였다.

BMP4

센스 프라이머(순쇄) gggcacctcatcacacgact (서열 번호 17)

안티센스 프라이머(역쇄) ggcccaattcccactccctt (서열 번호 18)

c-myc

센스 프라이머(순쇄) ttctctccgtcctcggattctctg (서열 번호 19)

안티센스 프라이머(역쇄) cagcagaaggtgatccagactctgac (서열 번호 20)

IGFBP3

센스 프라이머(순쇄) acagccagcgctacaaagtt (서열 번호 21)

안티센스 프라이머(역쇄) tagcagtgcacgtcctcctt (서열 번호 22)

그 결과를 도 10에 도시한다. 데이터는 모두, 사이클로스포린 A를 첨가하고 있지 않은 경우에 대한 상대적인 발현량으로서 나타내었다. BMP4는 모낭의 형태 형성기와 발모기에 있어서, 주로 모유두 세포에 의해 발현되며, 상피계 세포-간엽계 세포의 상호 작용에 대하여 억제적으로 작용하는 유전자인 것으로 알려져 있다[Hens et al., Development 134, 1221, 2007]. 도면에 도시하는 바와 같이, BMP4의 발현량은 60% 정도로까지 유의하게 발현이 저하되었다. 또한, c-myc은 발모기의 벌지(bulge) 영역이나 성장기의 털 모세포에서 강하게 발현되며, 모낭 상피 세포의 증식에 대하여 확실히 작용하는 유전자인 것으로 알려져 있다[Bull JJ et al., Invest Dermatol 116, 617, 2001]. 도면에 도시하는 바와 같이, c-myc의 발현은 1.5배 가까이까지 항진하였다. 또한, IGFBP3은 털 성장을 억제하는 인자로서 알려져 있고[Weger et al., J Invest Dermatol 125, 847, 2005], 휴지기에 있어서 발현이 높아진다는 것이 밝혀져 있다[Schlake et al., Gene Expr. Patterns 4, 141, 2004]. 도면에 도시하는 바와 같이, IGFBP3의 발현은 60% 정도로까지 유의하게 발현이 저하되었다. 따라서, 본 실험계에서 발모나 털 성장에 관계되는 유전자가 사이클로스포린 A에 의해 변동하는 것을 알 수 있으며, 본 실험계를 발모나 털 성장에 영향을 주는 약제의 평가에 이용하는 것이 가능한 것이 분명해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> SHISEIDO CO. LTD <120> Cell Mass Capable of Constituting Primative Organ-like Structure Comprising More Than One Somatic Cell Lines <130> T765 <150> JP2006-176763 <151> 2006-06-27 <160> 22 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 1 gctatcaacc agattcttgg cagaagg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 2 cagctgtcat tcttggacct gtacctg 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 3 ctacgagtcc aaggcacata tccactg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 4 tccaggaaag tgaggaagtc gctgtag 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 5 aagaccggcg tccagttcac tactaaag 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 6 ggtcaagtgt ttgaattctg cagagagg 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 7 tccaagttat gttggtgcac tttgtgag 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 8 tcaaacatct tgtcattgag gcctatcc 28 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 9 ggccaggtac atcgacttcc tctac 25 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 10 tctccttctc tggaaacaat gacatc 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 11 cgcgagaaga tgacccagat catg 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 12 ccacaggact ccatgcccac g 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 13 caggaactac gtggagatca tg 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 14 ccatcccacc aaaactcgat gtc 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 15 gaagttctct cgggatttct tggatcc 27 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 16 cggttgtggg tatcaatgaa gatgg 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 17 gggcacctca tcacacgact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 18 ggcccaattc ccactccctt 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 19 ttctctccgt cctcggattc tctg 24 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 20 cagcagaagg tgatccagac tctgac 26 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 21 acagccagcg ctacaaagtt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 22 tagcagtgca cgtcctcctt 20

Claims

케라티노사이트 및 모유두 세포를 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리의 제조 방법으로서,

케라티노사이트 및 모유두 세포를 포함하는 배양액을 준비하고,

상기 배양액을 혼합한 후, 그 혼합 세포 배양액에 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 Wnt 시그널 활성화제를 첨가하며,

상기 Wnt 시그널 활성화제를 함유하는 배양액을 소정 기간에 걸쳐 행잉 드롭(hanging drop) 방법 또는 스페로이드 형성 방법으로 배양하고,

상기 행잉 드롭 방법 또는 스페로이드 형성 방법으로 배양한 배양물의 배지를 Wnt 시그널 활성화제 비함유 배지와 교환하여 소정 기간 더 배양하는 것

을 포함하며, 여기서 케라티노사이트 및 모유두 세포 중 적어도 1종은 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 모유두 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 세포 덩어리로부터 모낭 유도 기능을 갖는 모낭이 형성되는 것인 방법.
제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 Wnt 시그널 활성화제가 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO)인 방법.
제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 방법이 행잉 드롭 방법인 방법.
케라티노사이트 및 모유두 세포를 포함하는 원시적인 기관 모양을 이룰 수 있는 세포 덩어리로서,

케라티노사이트 및 모유두 세포를 포함하는 배양액을 준비하고,

상기 배양액을 혼합한 후, 그 혼합 세포 배양액에 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 Wnt 시그널 활성화제를 첨가하며,

상기 Wnt 시그널 활성화제를 함유하는 배양액을 소정 기간에 걸쳐 행잉 드롭 방법 또는 스페로이드 형성 방법으로 배양하고,

상기 행잉 드롭 방법 또는 스페로이드 형성 방법으로 배양한 배양물의 배지를 Wnt 시그널 활성화제 비함유 배지와 교환하여 소정 기간 더 배양하는 것

을 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기서 상기 케라티노사이트 및 모유두 세포 중 적어도 1종은 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 세포 덩어리.
제7항에 있어서, 상기 모유두 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는 것인 세포 덩어리.
삭제
제8항에 있어서, 상기 세포 덩어리로부터 모낭 유도 기능을 갖는 모낭이 형성되는 것인 세포 덩어리.
제7항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 Wnt 시그널 활성화제가 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO)인 세포 덩어리.
제7항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 방법이 행잉 드롭 방법인 세포 덩어리.
제10항에 기재된 세포 덩어리에 후보 약제를 적용하여, 육모 효과를 갖는 약제를 스크리닝하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 세포 덩어리의 c-myc, BMP4 및 IGFBP3으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 유전자의 발현량을 지표로 하는 것인 방법.