KR20090126226A - 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을 통해 인슐린 분비 세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 인슐린 분비 세포의 세포 치료제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍(reprogramming)의 과정을 통해 인슐린 분비 세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 인슐린 분비 세포의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 여성의 소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코즈 DMEM (low glucose DMEM) 배지에서 대량으로 배양한 뒤 ITS배지에서 배양하면 내배엽성 마커의 발현이 증가되며, 이러한 세포를 니코틴아마이드(nicotinamide)가 첨가된 CM배지에서 배양하면 인슐린을 분비하는 세포로 분화가 가능하다. 또한, 본 발명은 인슐린 분비의 이상으로 당뇨가 발생하는 경우, 치료의 목적으로 사용할 수 있는 세포를 reprogramming과정을 통해 대량 생산이 가능하게 되는 기반을 마련할 수 있다.

성체세포, 리프로그래밍, reprogramming, 분화, 인슐린 분비 세포, 로우 글루코즈 DMEM 배지, ITS 함유 serum-free배지, CM 배지, 세포치료제, 당뇨병

Description

여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을 통해 인슐린 분비 세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 인슐린 분비 세포의 세포 치료제로서의 용도{A method for preparing endodermal precursor cells and insulin secretion cells from women labia minora skin cell by reprogramming method, and use of reprogrammed insulin secretion cells as a cell therapy product}

본 발명은 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 분리한 성체세포를 로우 글루코즈 DMEM에서 배양하여 수득한 다분화성의 성체 줄기세포, 이를 이용하여 리프로그래밍(reprogramming)에 필요한 체외 배양 조건에서 인슐린 분비세포로의 전환을 획기적으로 증가시킬 수 있는 방법 및 상기 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 생성된 인슐인 분비세포의 당뇨병 치료 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 무한한 범위까지 분열하는 능력이 있고 다른 유형의 세포를 형성하기 위해 적합한 환경 하에서 적합한 자극을 통해 분화하는 능력을 가지는 세포이다. 줄기세포는 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지며, 다양한 질병에서 효율적인 치료수단으로 많은 연구가 행해지고 있다.

다른 유형의 세포로 분화하기 위한 줄기세포들의 다른 잠재력의 차이를 기준으로, 지금까지 배아줄기세포와 성체줄기세포 사이에 구분이 있어 왔다. 수정란 세포로부터 배아단계로, 성체 유기체로 발달하면서 줄기세포의 잠재력이 줄어든다는 것이 일반적으로 일치된 의견이다. 이러한 성질에 따라, 수정란 세포는 만능(toticpotent)이라 일컬어지고, 배아줄기세포는 전분화능(pluripotent)이라 일컬어지고, 성체줄기세포는 다능성(multipotent)이라 일컬어진다.

만능 줄기세포는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 세포이다. 만능세포는 수정란세포와 함께 초기 배아단계의 세포들을 포함한다. 전분화능은 전형적으로 분열된 배반포의 내세포덩이(intermal cell mass)로부터 얻어지는 배아줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세 가지 배엽 세포 모두로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다.

그러나, 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로,적은 범위까지 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려졌다. 따라서 조직특이 줄기세포 오직 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있는 것이다. 성체줄기세포는 중추신경계(central nervous system)(Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow)(Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina)(Science 287, 2032-2036, 2000)과 골격근(skeletal muscle)(Proc . Natl Acad . Sci . USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다. 그 예로 신경 줄기세포(neural stem cells)는 뉴런과 신경아 교세포(glial cell)로, 골수중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 중배엽 세포(mesodermal cell)로 분화가 가능하며, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)는 혈액에 관련된 세포로 분화가 가능하다. 구체적 예는, 시각장애 치료에 있어서 각막 외부의 표피 줄기세포(epithelial stem cells)(Cell 57, 201-209, 1989)는 각막이식의 새로운 방법으로 부각되고 있다(N. Engl . J. Med . 343, 86-93, 2000). 그리고 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells)의 경우 자가이식을 통한 치료에 이용할 수 있다(Blood Cells 20, 15-24, 1994).

그러나 최근에는 이들 성체 줄기세포가 같은 계통뿐만 아니라 다른 종류의 계통으로 분화됨으로써 이전에 알려졌던 것보다 성체줄기세포의 분화가 더 가능할 것으로 분석되며 이에 대한 연구가 진행 중이다. 골수조직(WO 02/064748) 또는 재생조직으로부터(WO 02/057430) 얻어진 성체줄기세포를 이용한 연구가 타겟 조직으로의 이식, 피더세포(feeder cell)층 위에서의 배양 및/또는 특정 성장인자의 존재 하에서의 배양과 같은 조건 하에서, 다른 배엽의 세포유형을 형성하기 위해 각각의 줄기세포의 분화도 일어날 수 있다는 것을 증명했다. 따라서 성체줄기세포가 따라서 성체 줄기세포가 동일 계통으로만 분화가능하다는 견해는 수정되어야만 했다. 예를 들면, 신경 줄기세포(neural stem cell)가 in vivo에서 혈액(Science 283, 534-537, 1999)과 골격근 세포(skeletal muscle cells)(Nature Neurosci. 3, 986-991, 2000)로 분화됨을 증명하였으며, 이식된 골수 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 골격근 세포(skeletal muscle cell)(Nature 401, 390-394, 1999; Science 279, 1528-1530, 1998)와 간세포(liver cell)(Science 284, 1168-1170, 1999)로 분화되었고, 뇌에 이식하였을 경우 신경 마커(neuronal marker)가 발현됨을 확인하였다(Science 290, 1779-1782, 2000; Science 290, 1775-1779, 2000).

그렇지만, 이런 줄기세포를 분리하는데 많은 어려움이 따른다. 그 예로 중추신경계(central nervous system)나 골수(bone marrow), 망막(retina), 골격근 세포(skeletal muscle cells)와 같은 부위를 인간의 몸에서 분리하기란 많은 어려움과 고통이 따르기 때문이다. 특히 중추 신경계(central nervous system)과 같은 경우는 분리하는데 위험도가 크기 때문에 사실상 불가능하다.

또한, 성체 줄기세포를 얻는다고 하여도 성체줄기세포를 이용하여 세포치료를 하기에는 역부족이다. 첫 번째 이유로 세포치료를 하기 위해서는 많은 수의 세포들이 필요한데, 지금까지 제시된 방법에서는 그에 대한 세포수를 충족할 수 없기 때문이다. 두 번째 이유는 경제성인데, 현재 제시된 연구결과는 세포 치료를 하는데 있어서 많은 재료(배지 내 포함되어 있는 cytokine 등)를 필요로 한다. 세포배양에 첨가되는 재료들은 대부분 고가의 재료이기 때문에 경제적으로 효율성이 떨어진다.

따라서, 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복할 수 있도록 줄기 세포 성격을 갖는 세포를 대량으로 증식시켜서 세포치료에 이용할 수 있는 방법을 제시하고, 보다 적은 재료를 이용하여 세포의 수를 늘린 후, 세포치료에 이용하여 더욱 경제적으로 세포치료를 할 수 있는 방안을 제시하고자 하였다.

따라서, 본 발명에서는 인간의 몸을 구성하는 기관 중 가장 접근하기 쉽고 넓은 면적을 차지하는 피부 중 소음순에 초점을 맞추었다. 성체줄기 세포를 분리할 수 있는 곳은 다양하지만 최근에 피부에서도 성체줄기 세포를 분리할 수 있다고 보고되고 있다. 처음 피부에서 다분화능을 가진 성체줄기세포를 분리한 프레다 디, 밀러(Freda D, Miller)는 설치류의 등가죽을 사용하여 줄기세포를 분리하였다. 이 줄기세포는 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 지방세포(adipocyte)로 자발적인 분화가 일어났으며, 피부의 진피에서도 성체줄기세포의 존재를 확인(Nature cell biology 3, 778-784, 2001)하였으며, 설치류의 피부에 존재하는 성체줄기세포가 모낭에 있는 진피 유두에 존재한다는 것을 증명하였다(Nature cell biology 6, 1082-1093, 2004). 2004년 시드하르탄 찬드란(Siddharthan Chandran)은 사람의 피부에서 성체줄기세포를 분리하여, 뉴런, 지방세포(astrocyte), 평활근 세포(smooth muscle cell)로 분화를 시켰으며, 지방세포(astrocyte)의 경우 칼슘 이미징(calcium imaging) 분석을 통하여 분화된 지방세포(astrocyte)의 기능을 확인하였다(The Lancet 364, 172-178, 2004). 인간의 포경수술 후 나오는 표피 조직으로부터 성체줄기세포를 분리하여 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근 세포(smooth muscle cells)로 분화시켜 사람의 피부조직에서 성체줄기세포의 존재를 확인하였다(Stem Cells 23, 727-737, 2005). 그러나 아직까지 여성의 소음순에서 성체줄기세포를 추출하고 이를 다분화능 성체줄기세포로 배양하는 것에 관하여는 개시된 바가 없다.

더욱이 상기에서 언급한 것과 같이 분리 후 대량 생산 가능한 소음순 유래 줄기세포를 이용해서 세포치료 목적의 분화조건을 확립하고 임상적용의 가능성에 관한 연구 또한 아직 보고되고 있지 않다.

당뇨병과 같이 지구상의 5% 이상의 인구가 고통받고 있는 질환의 경우 세포치료의 임상적용이 가능하다면 그 경제적 파급효과는 크다. 당뇨병은 크게 두 가지 타입으로 분류되는데 인슐린의 생산 유무에 따라 인슐린을 생산하지 못하는 ‘인슐린 의존형(제 1형)과 인슐린 분비 자체가 상대적으로 부족하거나 인슐린 리셉션에 문제가 있는 ‘인슐린 비의존형(제2형)’으로 나뉜다. 이 중 인슐린 의존형 당뇨병인 ‘1형 당뇨’는 한국의 경우 전체 당뇨 환자의 3~5%정도를 차지하고 있으며 유전적인 요인이나 자가 면역기전으로 인한 이자의 랑게르한스섬 β 세포의 파괴로 인하여 발생한다. 즉 이러한 당뇨병의 경우 인슐린의 수치가 정상적으로 유지될 수 있으면 치료가 가능하므로, 여기에 세포치료의 임상적용의 접목이 가능하다. 이러한 연구는 췌장의 아일렛(pancreatic islet)(Endocrinology. 142, 495668, 2001), 췌장의 덕트(pancreatic ducts)(J Pathol. 197, 51926, 2002)와 같은 췌장 내의 세포에서의 분화 및 골수(bone marrow)(Nature 418, 419, 2002), 신경줄기세포(neuron)(PLoS Medicine, 2, 34756, 2005), 간세포(hepatocyte)(Nat Med, 9, 596603, 2003)와 같이 췌장 외 다른 조직의 세포로부터 분화를 유도한 내용이 이미 보고 되었고 그 효과를 입증하고 있다.

하지만 상기에서 언급한 조직들로부터 인슐린을 분비하는 세포로의 분화 및 그 임상적용에 필요한 정도의 세포를 얻는 것이 힘들고 이러한 세포 자체를 인슐린 분비세포로 분화되기 전의 전구체 단계의 세포의 대량생산은 한계가 있었다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 손쉽게 체외 배양이 가능한 성체세포를 얻고, 상기 체외에서 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지 (condition I)에서 대량으로 증식시킨 후 ITS 배지 (condition II)에서 배양을 통한 reprogramming과정을 거치면서 내배엽성 마커의 발현을 증가시켰다. 또한, 이러한 세포를 니코틴아마이드가 첨가된 CM 배지에서 배양함으로써 인슐린을 분비하는 세포로 분화시켜 인슐린 분비 세포를 획득한 뒤, 상기 인슐린 분비 세포를 당뇨유발 마우스에 주입하여 인슐린 분비 능력을 확인하였다. 이러한 과정을 통해 완성된 reprogramming된 상기 내배엽 줄기세포가 인슐린 분비세포로의 분화유도를 인 비트로와 인 비보 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 여성의 소음순 유래 성체줄기세포를 인슐린 분비 세포로 분화 유도하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 분화된 인슐린 분비 세포의 세포치료제로서의 용도를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 내배엽 전구세포로부터 인슐린 분비세포로의 분화 유도하여 인슐린 분비세포의 획득이 현저히 향상되는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 생산된 인슐린 분비세포의 세포치료제로서의 용도를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫 번째 양태에서는 여성의 소음순으로부터 다분화성 성체줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

여성의 소음순 조직은 남성의 포경수술 후 나오는 표피와 그 기원이 같기 때문에 여성의 조직인 소음순에서 줄기세포를 추출하여 성체 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 규명을 통하여 남성뿐만 아니라 여성 또한 세포치료가 가능할 수 있게 되었다. 또한 소음순의 경우 조직 내에 존재하는 섬유 등의 구성비율이 적기 때문에 조직의 양에 비해 많은 수의 세포를 획득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 여성의 소음순 유래 성체줄기세포는, 여성의 소음순 조직 을 분리하여 진피조직을 얻고, 상기 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 상기 분리된 세포를 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다.

즉, 여성의 소음순 조직을 분리하여 진피를 얻고 진피에서 케라티노사이트를 블레이드로 긁어낸 다음, 상기와 같은 방법으로 얻어진 진피조직에서 세포를 분리하고 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에서 배양하여 도 2와 같은 소음순 유래 성체세포를 획득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 용액을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 성체줄기세포를 배양시키는 동안 상기 성체줄기세포의 분화능을 유지할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 두 번째 양태에서는 상기 방법으로 수득되고, 하기의 특성을 나타내는 성체세포를 제공한다:

(1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

(3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(4) 내배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명의 세 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체줄기세포를 인슐린 분비 세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다.

*본 발명의 바람직한 양태로서, 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통하여 인슐린 분비 세포로 분화 유도하는 방법은 하기 단계를 포함한다:

소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM, 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양 조건에서 배양하는 단계;

상기에서 배양된 성체 줄기세포를 DMEM/F12(1:1), 5 μg/ml 인슐린, 50 μg/ml 트랜스페린(transferrin), 30 nM 셀레늄으로 이루어진 ITS 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 ITS 배지에서 배양된 세포를 로우 글루코스 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% L-글루타민(Cambrex), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5 μM 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5 μg/ml 인슐린 및 10 mM 니코틴아마이드(nicotinamide)를 첨가한 CM배지에서 배양하여 인슐린 분비 세포로 분화 유도하는 단계.

당뇨의 치료에 관한 세포를 이용한 연구는 췌장의 아일렛(pancreatic islet)(Endocrinology. 142, 495668, 2001), 췌장의 덕트(pancreatic ducts)(J Pathol. 197, 51926, 2002)와 같은 췌장 내의 세포에서의 분화 및 골수(bone marrow)(Nature 418, 419, 2002), 신경줄기세포(neuron)(PLoS Medicine, 2, 34756, 2005), 간세포(hepatocyte)(Nat Med, 9, 596603, 2003)와 같이 췌장 외 다른 조직의 세포 등에서 이루어진 바 있다. 그러나 위에서 언급한 세포는 근원조직의 분리 자체가 어렵다는 단점을 포함하여 인슐린을 분비하는 세포로의 분화 및 그 임상적용이 가능한 만큼의 세포를 배양하는 것도 어렵다는 것이 현실이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 먼저 근원조직이 구하기 용이해야 하며, 근원조직으로부터 분리한 세포 자체의 대량 배양이 가능해야 한다. 또한 인슐린을 분비하는 세포로의 분화를 유도하는데 있어서 분화의 조건을 조절 가능하고, 이러한 분화 단계에서의 대량 배양도 용이해야 한다.

따라서 본 발명은 소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 기본 배지에서 세포를 배양하였다 (도 2). 이렇게 10% FBS가 포함된 배양 조건하에서는 분리단계에서의 소량의 소음순 유래 성체세포를 계대배양을 통해 많은 양의 세포를 증식시켰으며 이와 같은 배양액에서 소음순 유래의 성체세포는 상당히 긴 시간동안 배양이 가능하였다.

상기 소음순으로부터 분리한 성체세포는 섬유아세포(fibroblast) 모양으로 핵형 분석 결과 정상적인 염색체를 지니고 있었다(도 3).

이후 상기 로우 글루코스(low glucose) DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 기본 배양조건에서 DMEM/F12 1:1, 인슐린 (5 μg/ml)-트랜스페린 (50 μg/ml)-셀레늄 (ITS) (30 nM), 및 1 mM 글루타민으로 구성된 ITS 배지로 환경을 바꿔준다. 이와 같은 배양 조건을 통해 소음순으로부터 분리한 성체세포는 reprogramming과정을 겪게 된다. 이 때 소음순 유래 성체세포를 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)를 통해 점차 내배엽성 마커의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 즉 인슐린을 분비하는 세포로 분화되기 전 단계의 내배엽성 마커의 발현이 증가된 세포로의 변화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. ITS 배양액에서 배양하는 과정을 거친 뒤 25 mmol/l 글루코즈를 포함하고 있는 DMEM배지에 10 % FBS(fetal bovine serum), 1% L-글루타민(Cambrex), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5μM 하이드로코르티손, 5 μg/ml 인슐린 및 10 mM 니코틴아마이드(nicotinamide)를 첨가한 CM배지로 배양 조건을 바꿔주면 인슐린을 분비하는 세포로의 분화가 유도되어 인슐린(insulin)과 시펩타이드(c-peptide), 피디엑스 원(pdx-1)과 같은 마커의 발현이 증가하였다 (도 6). 또한, 이러한 인슐린은 실제로 세포를 배양하는 조건의 글로코스 농도에 따라 분비량의 변화를 확인할 수 있었고 (도 8), 이러한 결과는 실제 당뇨가 유발된 발브시 누드 마이스 (BALB C/NU mice)모델에 주입한 결과에서도 같은 반응을 확인할 수 있었다(도 9-11). 즉, 소음순 유래의 성체세포에서 분화된 인슐린 분비 세포는 동물실험에서 입증된 것처럼 인슐린의 췌장 베타세포와 같이 혈중 글루코스 농도에 따른 인슐린의 분비가 기능적으로 이루어져 내분비계 질환의 일종인 제1형의 당뇨병의 치료에 효과적임을 확인한 것이다. 이러한 결과를 통해 소음순 유래의 성체세포는 조직 자체의 획득이 용이하고 두 가지 단계의 reprogramming 조건을 확립하여 분화 전 단계의 내배엽 줄기세포를 대량으로 배양이 가능하고, 인슐린 분비 세포 분화 조건을 확립하여, 실체로 분화된 세포가 인 비보에서 정상적인 기능을 나타내므로 임상적용이 가능한 세포치료제로서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 네 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체세포가 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 인슐린 분비 세포의 당뇨병 치료를 위한 세포치료제로서의 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 당뇨병은 인슐린 의존형인 제1형의 당뇨병인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 거치면서 얻어진 인슐린 분비 세포는 치료를 위해 상기 인슐린 분비 세포를 포함하는 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및 /또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.

줄기세포를 치료제로 사용하는 경우 적절한 투여량은 10⁴-10⁶ cells/회이다.

본 발명은 여성의 소음순으로부터 분리한 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming)하는 단계를 거치면서 세포치료에 필요한 만큼 대량으로 빠르고 손쉽게 획득하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 적은 양의 조직으로부터 줄기세포를 얻고 이를 다량으로 증식시켜 다분화능 성체줄기세포를 얻을 수 있기 때문에 세포치료 있어 경제적인 효율성이 높다. 특히 본 발명은 당뇨치료가 가능한 인슐린 분비세포로의 분화를 촉진하는 기술을 확립함으로써 실제 당뇨환자의 세포치료 모델로서 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 소음순 유래 성체세포를 이용하여 내배엽 줄기세포로 유도를 하기 위한 리프로그래밍의 조건 확립

도 1은 소음순 유래 성체세포를 이용하여 보다 더 효율적으로 인슐린을 분비하는 세포로의 분화 유도를 가능하게 하는 방법을 간략적으로 도시한 것이다. 소음순 유래 성체세포를 이용하여, 경로(pathway) I의 방법을 통해서 성체세포의 리프로그래밍(reprogramming)이 가능하게 하였다. 또한, 그 과정을 거친 후에 내배엽성 전구세포의 성격을 가지는 세포가 형성이 되면서, 이를 CM이라는 배양 조 건(condition III)을 통해서 인슐린 분비세포로의 분화가 좀 더 효율적으로 가능하게 하였다. 도 1에서는 우선, condition I-III의 조건을 제시하고 있다. Condition I은 로우 글루코즈 DMEM에서 배양하는 조건(Low-glucose DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin)을 나타내고 있다. Condition II는 리프로그래밍(reprogramming) 과정으로 ITS 배지조건(DMEM/F12 + 5 μg/ml Insulin + 50 μg/ml apo-transferrin + 30 nM selenium + 1% penicillin/streptomycin)을 나타낸다. Condition III의 조건은 인슐린으로 분화를 유도하는 조건으로 CM 배지(로우 글루코스 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5 μM 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5 μg/ml 인슐린 및 10 mM 니코틴아마이드 (nicotinamide))를 나타낸다. 성체세포를 인슐린 분비세포로의 분화를 유도하기 위한 조건으로 condition II에서 condition III (CM 배지)으로 하는 pathway I이 있다. 이 Pathway에서는 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 내배엽 줄기세포를 생성한 후에 인슐린 분비세포로의 분화를 유도하고 있다. 이와 같은 방법으로 소음순에서 분리한 성체세포가 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해서 인슐린 분비세포를 좀 더 효율적으로 생산이 가능하다는 것을 제시하고 있다 (도 1).

실시예 2: 소음순 유래 줄기세포의 분리

여성 의원으로부터 40대 후반 여성의 음부 성형 및 질공 축소 시술을 받은 환자의 소음순 조직을 얻어서 이를 가지고 분리하였다. 먼저 박테리아로부터의 오염을 방지하기 위해 70% EtOH에 약 30초간 담궈 두어 소독을 한 다음, 항생제가 들 어있는 PBS로 5번 세척하였다. 응고된 혈액을 제거한 다음 1 ㎠ 크키로 소음순 조직을 절단하였다. 조직을 5 unit/ml의 디스파제 (dispase) 용액에 4℃에서 밤새 배양 (incubation)하였다. 표피는 포셉 (forcep)를 이용하여 제거하였으며, 표피와 진피 사이에 존재하는 케라티노사이트 (keratinocyte)와 분비선을 제거하기 위하여 멸균된 블레이드 (blade)로 긁어내었다. 진피 조직을 1 mm² 크기로 자른 다음 5%의 콜라게나제 (collagenase IV, Invitrogen)에서 30분~1시간 배양 (incubation)하였다. 배양 (incubation) 후 시료를 원심분리하여 디스파아제 (dispase, Invitrogen)를 제거한 후, 배지에 부유시켰다. 피펫를 이용하여 조심스럽게 피펫팅하여 조직으로부터 세포들을 분리하였다. 조직과 단일 세포들을 분리하기 위하여 70 μm 세포 스트레이너 (cell strainer, BD sciences)를 이용하여 분리시켰다. 분리된 세포를 원심분리하여 모은 후, 로우 글루코즈 DMEM (low glucose DMEM: 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin solution)에 재부유시켜 100 mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩 (seeding)하였다. 24시간 후 배지를 바꾸었다. 24시간 후의 대부분의 세포는 세포 배양 접시에 부착되어 있으며, 외형은 소음순 진피의 형태를 가지고 있었으며, 도 2과 같은 세포외형을 가지고 있었다. 배지는 2일마다 교환해주었으며 90% 세포 밀도일 때 계대 배양하였다. 이렇게 해서 얻어진 세포를 광학 현미경을 이용하여 40배(a), 100배(b), 200배(c) 확대하여 세포 모양을 관찰한 결과, 도 2와 같았다.

실시예 3: 소음순 유래 성체 줄기세포의 핵형 분석

소음순 유래 줄기세포를 로우 글루코오스 DMEM를 통해 대량으로 배양을 한 후 핵형분석을 위해 중기(metaphase) 단계에서 0.1 g/ml 콜세미드 (colcemid)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 그런 다음 트립신 처리 후 저장성(hypotonic) KCl 용액을 통해 재부유하고 37℃에서 20분 동안 항온보관 하여 메탄올(methanol):아세트산(acetic acid)의 3:1 용액에 담근 뒤 염색체를 지-밴드 스테이닝(G-band staining)을 통해 시각화 하였다.

이러한 과정의 핵형 분석을 통해서 도 3과 같이 정상 핵형을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: Pathway I 과정을 통한 성체세포의 내배엽성 전구세포의 생성 유도 및 확인

소음순에서 분리한 세포를 도 1에서 언급하고 있는 것과 같이 pathway I을 통해서 내배엽 줄기세포의 생성을 유도하였다. Pathway I은 condition I인 로우 글루코즈 DMEM에서 배양하고 있던 세포를 condition II인 ITS 조건으로 배양조건을 바꾸어서 reprogramming을 유도하는 것이다. Condition II 조건으로 바꿔준 후에, 7일 동안 내배엽 줄기세포에서 발현되는 마커들의 발현 변화를 RT-PCR방법을 사용하여 살펴보았다. Condition II조건을 통해 배양된 세포로부터 트리졸 (Trizol)을 이용하여 토탈 (total) RNA를 추출하고 이를 RNA-전사효소 (transcriptase)를 통해 cDNA를 합성한 다음 MIXL1, GATA4, SOX17, Foxa2, Cer1, GSG와 같은 내배엽성 특이 적 마커 프라이머 (primer)를 이용하여 발현양상을 확인하였다.

Condition II조건으로 변경하고, 매일 RNA를 추출하여 내배엽성 마커들을 확인하였더니, 3일 후부터 내배엽 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커들의 발현이 나타나고, 7일째까지 점차적으로 증가하는 양상을 보이고 있었다. 그러나 condition I에 비해 condition II에서는 세포의 성장 속도가 현저히 떨어지는 경향을 보이고 있었다 (도 4C).

또한, 웨스턴 블럿 분석의 경우에는 150 Mm NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% (vol/vol) 글리세롤, 0.1% (vol/vol) 트리톤 X-100, 1% (wt/vol) 노디언트(Nodient)-40 (NP-40), 0.5% (wt/vol) 소듐 디옥시콜레이트(Sodium deoxycholate), 1% (wt/vol) SDS, 1 mM 소듐 오르쏘바바데이트(Sodium orthovabadate), 1 mM β-글리세롤 포스페이트 (β-glycerol phosphate), 2.5 mM 소듐 피로포스페이트 (sodium pyrophosphate), 1 mM EDTA, 프로테아제 인히비터 칵테일(cocktail of protease inhibitors)이 혼합되어 있는 라이시스(lysis) 용액을 통해서 토탈 프로테인(total protein)을 분리한 뒤 브래드포드 프로테인 어세이 시스템(Bradford protein assay system)을 통해 정량하여 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에 로딩(loading)하였다. 그런 다음 전기영동(electrophoresis)을 통해 프로테인을 크기별로 분리한 뒤 PDVF 멤브레인에 옮긴 다음 이 멤브레인을 3% (wt/vol) 탈지분유 (non-fat dry milk)로 블로킹 (blocking)한 뒤 각각 안티가타포 (anti GATA4), 안티 폭스에이2 (anti Foxa2), 안티 삭스17 (anti SOX17)을 비롯하여 정량을 위한 안티 알파 튜불린 (anti alpha- tubulin)을 4℃에서 밤새 (overnight) 반응시켰다. 그 뒤 호울스래디쉬 페록시다제-콘쥬게이티드 세컨더리 안티바디스 (horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 1시간 반응시키고 이씨엘 케미루미네센트 (ECL chemiluminescent)를 이용하여 바이오맥스 필름 (BioMax film)에 현상하였다. 이와 같은 방법을 통해서 7일 동안 condition II에서 배양한 세포는 condition I에서와 달리 내배엽 줄기세포에서 발현되는 마커들인 GATA4와 Sox17이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 이는 면역형광염색법 (Immunocytochemistry)방법을 통해서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 pathway I을 통해서 소음순에서 분리한 성체세포가 reprogramming과정을 통해서 내배엽 줄기세포로 변환되었음을 확인할 수 있었다 (도 4)

실시예 5: Pathway I의 conditon II 과정을 거친 후 condition III ( CM 배지)조건에서의 배양을 통한 아일렛 클러스터(islet cluster) 모양의 형성

여성 소음순에서 유래된 성체세포를 인슐린 분비세포로의 분화를 유도하기 위해서 확립한 조건 중에서 pathway I과정은 condition II (ITS 배지)에서 배양하던 세포를 condition III (CM배지)로 바꾸어주는 방법을 나타내고 있다. 이 방법은 우선 condition II에서의 배양을 통해 내배엽성 마커의 발현이 증가한 것을 위의 실시 예에서 확인을 하였고, 두 번째 단계로 10 mM 니코틴아마이드를 첨가한 condition III (CM배지)으로 배양하여 인슐린 분비 세포로의 분화를 촉진시키는 것이다.

먼저, 1 × 10⁶개의 세포를 100 mm 배양 접시에 시딩 (seeding)한 뒤 condition II (ITS 배지)에서 일주일 간 배양하는데 이때, ITS 배지의 조성은 DMEM/F12 (1:1), 인슐린 5 μg/ml, 트랜스페린 50 μg/ml, 셀레늄 30 nM이었다. 일주일 후 25 mmol/l 글루코즈를 포함하고 있는 DMEM배지에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5μM 하이드로코르티손, 5 μg/ml 인슐린 및 10 mM 니코틴아마이드를 첨가한 condition III (CM배지)로 교환해주었다. CM배지로의 전환 2일 후부터 세포의 이동이 관찰되면서 점차 세포가 클러스터(cluster)되는 것을 확인할 수 있었으며 이러한 과정을 일주일간 지속하면 실제의 췌장베타세포에서 발견할 수 있는 아일렛 (islet)과 유사한 모양을 관찰할 수 있었다 (도 5).

도 5를 살펴보면 a는 condition I에서 배양한 세포의 모양이고, b는 condition II에서 배양한 세포이다. 이때 세포의 핵은 커지면서 바디(body)는 길어지는 것을 확인할 수 있었다. c는 condition III (CM배지)에서 배양한지 3일 뒤의 세포이고, d는 condition III에서 배양한지 일주일이 지난 뒤의 세포의 모습으로 condition III조건으로 배양 조건을 바꿔주면서 세포들에서 클러스터들이 점차 생기는 것을 확인할 수 있었으며 동시에 세포의 바디가 짧아지고 동그란 모양에 가까워지는 것을 확인하였다. 도 5에서 a-d는 위상차 이미지(phase contrast image)를 관찰한 것이다.

실시예 6: 소음순 유래 성체세포를 Pathway I과정인 condition II 에서 condition III 조건을 통해 췌장세포로의 분화유도 확인

여성 소음순에서 유래된 성체세포가 pathway I과정을 통해 인슐린을 분비하는 세포로 분화된 후, 일반적인 췌장베타세포 (pancreatic beta cell)의 특성과 같은 유전자 발현양상을 보이는지를 확인하기 위한 방법으로 RT-PCR과 웨스텐 블럿 분석, 면역형광염색법을 사용하였다. Condition III조건을 통해 분화된 세포로부터 트리졸을 이용하여 토탈 RNA를 추출하고, 이를 RNA-전사효소를 통해 cDNA를 합성한 다음 인슐린 (Insulin), 글루카곤 (glucagon), 소마토스태틴 (somatostatin), 판크리아틱 폴리펩타이드 (pancreatic polypeptide)과 같은 유전자의 발현 및 이를 조절하는 전사인자 (transcriptional factor)인 피디엑스원 (PDX-1), 뉴로디원(NeuroD1), 팩스식스 (Pax6) 등과 같은 유전자에 해당하는 프라이머 (primer)를 이용하여 발현양상을 확인하였다. 그 결과 베타세포 (beta cell)에서 분비하는 호르몬인 인슐린 유전자의 발현과 이에 관련된 전사인자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 도 6A를 살펴보면 1번 레인의 대조군 (positive control)으로 사용한 췌장암세포 (Capan-2)에서 발현되는 Pdx-1, Ngn3, NeuroD1과 같은 전사인자는 condition I에서는 발현되지 않지만 condition II에서 배양한 3번 레인에서는 발현되었다. 이들 전사인자의 영향에 의해 4번 레인의 condition II에서 condition III 조건으로 변경하여 배양한 세포에서는 인슐린을 비롯한 호르몬 및 췌장 특이적 유전자들이 발현되는 것을 확인하였다.

웨스턴 블럿 분석의 경우에는 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% (vol/vol) 글리세롤, 0.1% (vol/vol) 트리톤 X-100, 1% (wt/vol) 노디언트-40 (NP-40), 0.5% (wt/vol) 소듐 디옥시콜레이트, 1% (wt/vol) SDS, 1 mM 소듐 오르쏘바바데이트 (Sodium orthovabadate), 1 mM β-글리세롤 포스페이트, 2.5 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM EDTA, 프로테아제 인히비터 칵테일(cocktail of protease inhibitors)이 혼합되어 있는 라이시스(lysis) 용액을 통해서 토탈 프로테인(total protein)을 분리한 뒤 브래드포드 프로테인 어세이 시스템을 통해 정량하여 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에 로딩(loading)하였다. 그런 다음 전기영동(electrophoresis)을 통해 프로테인을 크기별로 분리한 뒤 PDVF 멤브레인에 옮긴 다음 이 멤브레인을 3% (wt/vol) 탈지분유 (non-fat dry milk)로 블로킹(blocking)한 뒤 각각 안티 인슐린 (anti insulin), 안티 피디엑스원 (anti Pdx-1)을 비롯하여 정량을 위한 안티 알파 튜불린 (anti alpha-tubulin)을 4℃에서 밤새 (overnight) 반응시켰다. 그 뒤 호울스래디쉬 페록시다제-콘쥬게이티드 세컨더리 안디바디스(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 1시간 반응시키고 이씨엘 케미루미니센트(ECL chemiluminescent)를 이용하여 바이오맥스 필름 (BioMax film)에 현상하였다.

이러한 결과를 통해 첫 번째 레인의 췌장암세포에서 발현되는 인슐린(insulin)과 피디엑스원(pdx-1)이, 두 번째와 세 번째 레인의 condition I과 condition II에서는 발현되지 않지만 네 번째 레인의 condition II에서 condition III로 변경한 경우에서 배양한 세포에서는 발현하고 있음을 확인할 수 있었다(도 6B).

인슐린 분비세포가 형성이 되었는지를 확인하기 위한 또 다른 방법으로 디티 존 스테인과 면역형광염색법을 사용하였다. 우선, 인슐린이 분비될 때의 베지클 (vesicle)에 존재하는 징크 이온 (Zn ion)을 확인할 수 있는 염색법인 디티존 스테인을 통해서 실제로 condition III (CM배지)에서 분화된 세포가 인슐린을 분비하는 지를 확인해보는 실험을 수행하였다. 이를 위해서 디티존 파우더 50 mg을 5 ml의 디엠에스오 (DMSO) 용액에 용해한 후 0.2 μm 필터로 필터한 다음 각각의 배양접시에 15분 동안 반응시켰다. 이러한 실험 결과는 도 7의 a,b를 통해 살펴보았을 때, 분화시키지 않은 세포와 분화된 세포의 경우를 비교하니 분화된 세포에서만 적갈색으로 염색된 결과를 확인할 수 있었다. 즉, 위와 같은 결과를 바탕으로 실제 condition III에서 배양하는 조건이 인슐린을 분비하는 세포로의 분화조건에 해당하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

또한, 면역형광염색법 (Immunocytochemistry)을 통해서 분화된 세포를 확인하기 위해 분화된 세포를 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 20분 동안 4℃에서 고정 (Fixation)을 하였다. 또한, 면역 형광염색법 (Immunocytochemistry)에서는 분화된 세포를 고정한 시료 (sample)를 10% 노말고트세럼 (Normal goat serum) + 0.1% 비에스에이 (BSA) + 0.3% 트리톤 엑스 백 (Triton X-100)이 포함된 피비에스 (PBS)로 블로킹 (blocking)을 한 후 안티 시펩타이드 (anti c-peptide), 안티 인슐린 (anti insulin), 안티 피디엑스원 (anti Pdx-1)을 사용하여 4℃에서 밤새(overnight) 반응시킨 후에 RT에서 anti-mouse-cy3 (Jackson Immunoresearch), anti-rabbit-FITC (Invitrogen)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI (1 μg/ml, sigma)를 사용하여 핵염색 (nuclear stain)을 하였다. 그 결과, 도 7의 c-h를 살펴 보면 췌장베타세포에서 발현되는 시펩타이드 (c-peptide)와 인슐린(insulin)이 세포질에 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인슐린의 발현을 조절하는 대표적인 단백질인 피디엑스원 (Pdx-1)이 condition III에서 배양한 세포 중 일부 세포의 핵 내에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

실시예 7: 인 비트로에서 분비된 인슐린의 기능성 확인

여성 소음순에서 유래된 성체세포를 pathway I과정을 통해 인슐린 분비세포로 분화시킨 뒤 이 세포가 분비하는 인슐린이 체내의 인슐린과 같은 기능을 가지고 있는가를 확인하기 위해서 글루코스 농도 차이에 의한 인슐린 분비량을 조사하였다. 클러스터 (cluster)를 형성한 세포를 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.1 mM NaHCO₃, 0.5% BSA (Bovine serum albumin), 10 mM 헤페스 (Hepes)로 이루어진 KRBH (Krebs-Ringer bicarbonate Hepes) 용액으로 전 워싱 (washing)한 다음 3.3 mM 글루코스가 포함된 KRBH용액으로 전 항온 처리하였다. 1시간 후 3.3 mM과 16.7 mM, 두 가지 종류의 글루코스를 포함한 KRBH용액과 10 μM KCl을 포함한 16.7 mM 글루코스 농도의 KRBH용액과 10 μM KCL을 포함하지 않은 글루코스 농도의 KRBH용액으로 30분 동안 37℃에서 항온 처리 한 후 배지에 분비된 인슐린의 양을 인슐린 ELISA Kit을 이용하여 측정하였다. 이때 토탈 프로테인 (total protein)의 양은 배양접시에 남은 세포로부터 분리하여 브래드포드 어세이 시스템을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 8의 A를 살펴보면 condition IV에서 배양한 세포의 경우에는 condition I에서 배양한 세포와 달리 글루코스 농도가 높아지면 인슐린 분비의 양도 증가하는 것을 확인할 수 있었고 이러한 결과는 췌장 암세포 (capan-2)에서의 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한, 도 8의 B에서는 condition III에서 배양한 세포가 대조군 (positive control)으로 함께 실험한 췌장암세포에서와 유사하게 KCl을 포함한 용액에서의 인슐린 분비가 증가하는 것을 확인하였고, 반면에 condition I에서 배양한 세포는 KCl의 유무에 의한 변화는 거의 없었음을 확인할 수 있었다. 다시 말해 condition II의 reprogramming 과정을 거친 후에 condition III 하에서 배양한 세포는 인슐린을 분비하는 세포로의 분화가 가능하며 이때 분비된 인슐린은 실제로 글루코스 농도에 따라 분비량이 정상적으로 조절되고 있음을 알 수 있었다 (도 8).

실시예 8: 인 비보에서의 인슐린 분비의 확인

여성 소음순에서 유래된 성체세포를 pathway I과정을 통해 인슐린 분비세포로 분화시킨 뒤, 분화된 세포가 인 비보에서도 효과적으로 작용하는지 확인하기 위해서 6주령 암컷 발브시 누드 마이스 (BALB/c-nude mice)에 200 μg/g 체중 (body weight)의 스트렙토조토신 (STZ: streptozotocin)을 주사하여 당뇨를 유발시켰다. 혈중 글루코스 수치가 250 mg/dL 이상이 되었을 때, condition I, condition II, condition II에서 condition III의 배양 조건에서 배양한 세포를 2 x 10⁶개씩 신장의 캡슐 부분에 주입 (injection)하였다. 도 9는 정상쥐와 비교하면서 각각의 배양 조건에 따른 혈당량을 비교한 그래프를 나타내고 있다. Condition II에서 III로 바꾸어 배양한 세포를 인젝션한 경우에 혈당량 수치가 낮아져서 인 비보에서도 인슐린 분비세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 또한, pathway I조건으로 분화된 세포가 인 비보에서 인슐린 분비세포가 작용을 하고 있는지를 확인하기 위해서 STZ로 혈당을 250 mg/dL 이상으로 높인 후에 분화시킨 세포를 인젝션하고 몸무게의 변화와 혈당수치를 3일 간격으로 측정하고 변화 양상을 관찰하였다. 이때의 조직을 적출하여 10% 포르말린으로 고정을 한 후에 파라핀 블록을 만들어서 4 μm간격으로 조직을 섹션하였다. 섹션한 조직을 리하이드레이션시킨 후에 인슐린 분비세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 c-peptide를 사용하여 확인하였다. H&E 스테인을 통해서 췌장세포로의 모양이 나타나고 있는 것을 확인하였고, 이 조직을 c-peptide로 염색한 결과 일부 조직에서 c-peptide가 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 토대로 하여, pathway I를 통해 인슐린 분비세포가 생성이 된 것을 확인할 수 있었다.

다음 실험으로 위에서 증명한 결과를 토대로 하여, 이번에는 STZ로 혈당 수치를 250 mg/dL 이상으로 높인 후에 위의 분화 조건으로 분화유도시킨 세포를 kidney에 인젝션을 하였다. 마우스를 총 5그룹으로 나누고 몸무게와 혈당량 수치를 측정하여 비교하였다. 도 10의 A는 몸무게의 변화를 나타내는 그래프인데, 스트렙토조토신을 주사하기 시작한 frequency 3 이후부터 증가추세이던 몸무게의 변화가 더 이상의 증가를 보이지 않는 것으로 나타났다. 이러한 양상은 세포 주입을 했던 frequency 15 이후 group 2(5)를 제외한 나머지 쥐들에서 몸무게가 유지되는 것으 로 나타났다. 도 10의 B는 혈중 글루코스 수치를 확인한 그래프인데, 스트렙토조토신을 주사하기 시작한 frequency 3 이후 혈중 글루코스 수치가 뚜렷한 증가세를 보이고 있으며 이러한 양상은 세포 주입을 했던 frequency 15 이후 다시 감소하는 양상으로 변화하였다. 특히 group2(5)의 경우에는 감소하는 양상을 보이지 않았는데 이는 몸무게의 감소가 진행된 것과 유사한 경향성을 가진다. 즉, 몸무게가 유지된 쥐들은 혈중 글루코스 수치가 정상적으로 낮아지기 시작한 것을 알 수 있다.

주입을 하지 않은 한 마리와 주입한 4마리, 총 5마리의 혈중 글루코스 수치가 기능적으로 정상인가를 확인하기 위해서 글루코스 톨러런스 테스트 (glucose tolerance test)를 수행하였다. 이러한 결과는 도 10의 C의 그래프를 보면 알 수 있는데, 24시간의 절식 뒤 1.5 mM의 글루코스를 주입한 결과 3마리의 발브시 누드 쥐에서 혈중 글루코스 수치가 정상 쥐와 같은 양상으로 상승하였다.

또한 테스트를 끝낸 발브시 누드 쥐의 신장을 적출하여 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 파라핀 블럭(paraffin block)을 만들고 4 μM로 섹션(section)한 뒤 이를 인 비트로에서의 분화 결과를 토대로 면역 형광염색법을 수행하였다. 먼저 섹션한 조직을 자일렌 (xylene)과 100% 에탄올 (ethyl alcohol), 95% 에탄올 (ethyl alcohol) 통해서 리하이드레이션 (rehydration)한 뒤 5% 노말고트세럼(Normal goat serum) +0.1% 비에스에이 (BSA)+0.3% 트리톤 엑스 백(Triton X-100a)이 포함된 피비에스(PBS)로 블로킹(blocking)을 한 후 안티 시펩타이드(anti c-peptide), 안티 인슐린 (anti insulin)을 사용하여 4℃에서 밤새(overnight) 반응을 시킨 후에 RT에서 anti-mouse-cy3 (Jackson Immunoresearch), anti-rabbit-FITC (Invitrogen)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI (sigma)를 사용하여 핵염색 (nuclear stain)을 하였다. 그 결과, 도 11의 a-j에서와 같이 췌장베타세포에서 발현되는 시펩타이드 (c-peptide)와 인슐린 (insulin)이 분화된 세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통한 결과를 바탕으로 pathway II를 통해 분화된 세포는 인 비보에서 인슐린을 분비하여 혈중 글루코스 농도를 조절할 수 있는 능력이 있다는 것을 알 수 있었다 (도 11).

도 1은 소음순으로부터 분리한 성체세포를 인슐린을 분비하는 세포로 분화를 유도시키는 방법을 간략히 나타낸 것이다. 성체세포를 pathway I의 과정을 통해 reprogramming을 유도하고, 인슐린을 분비하는 세포로 분화시키는 방법을 제시하였다. Condition I은 로우 글루코스 DMEM에서 배양하는 조건을 나타내고, condition II의 경우엔 ITS 배지 조건 (DMEM/F12 + apo-transferrin + Insulin + selenium)을 의미한다. Pathway I은 condition I에서 condition II로 바꿔주는 주는 과정을 통해 내배엽성 전구세포 형성을 유도하고, condition III (CM 배지)로 배양액을 바꾸어줌으로써 인슐린을 분비하는 세포로 분화를 유도하는 방법을 나타낸다. 이와 같은 과정을 통해 소음순에서 분리한 성체세포가 reprogramming 과정을 거쳐 인슐린을 분비하는 세포로 분화가 유도된다는 것을 보여주고 있다.

도 2는 소음순으로부터 분리한 성체세포의 모습을 배율별로 현미경으로 관찰한 모습을 나타내고 있다. 이때, a는 40배, b는 100배, c는 200배로 관찰한 결과를 나타낸다. 분리한 세포는 condition I에서 배양을 하였고, 그림에서와 같이 섬유아세포 (fibroblast)의 모양을 나타내고 있었다.

도 3은 소음순으로부터 분리한 세포의 핵형분석을 한 결과를 나타낸다. 분리한 세포를 인 비트로에서 배양을 했을 때에도 정상 핵형을 나타내고 있는 것을 확인할 수 있다.

도 4는 pathway I의 과정을 통해 reprogramming이 가능한 것을 설명하고 있다. 도 4의 A에서는 condition I에서 II (ITS 배지)로의 변화할 때 세포의 모양을 크리스탈 바이올렛으로 염색을 하여 비교한 결과를 나타내고 있다. 도 4B는 condition II조건에서 배양하고 있는 세포에서 매일 RNA를 추출하여 내배엽성 전구세포에서 특이적으로 발현되는 마커들이 발현이 되는지를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내고 있다. 도 4C에서는 condition I과 II에서의 세포의 성장 속도를 비교한 결과를 나타내고 있다. Condition I에서보다 II에서의 세포의 성장 속도가 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있다. 도 4D에서는 condition I과 II에서의 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿 분석 방법을 통해서 내배엽성 전구세포의 마커들의 발현을 확인한 결과를 나타내고 있다. 도 4E에서는 4D에서 확인한 결과를 면역형광 염색법으로 다시 확인한 결과를 나타내고 있다.

도 5에서는 condition I에서 II, III로 가면서의 세포의 모양의 변화를 현미경으로 관찰한 모습을 나타낸다. 점차 아일렛 클러스터 (islet cluster) 모양의 세포가 형성되고 있는 것을 확인할 수가 있다.

도 6A에서는 췌장암세포 (Capan-2)를 positive control로 하고, condition I, II, II→III에서의 내배엽성 전구세포의 마커들과 췌장세포에서 발현되는 마커들을 확인한 결과를 나타내고 있다. Condition II에서 배양하고 있는 세포들에서 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 확인한 결과 내배엽성 전구세포에서 발현되는 마커들이 발현이 되고 있었고, 이 세포를 condition III인 CM 배지 조건으로 바꾸어주었을 때는 내배엽성 전구세포의 마커들의 발현이 줄면서, 췌장세포에서 발현되는 마커들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 6B에서는 동일한 세포에서 단백질을 분리하여 췌장세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 인슐린 (Insulin)과 피디엑스 원 (pdx-1)을 웨스턴 블럿 분석 방법으로 확인한 결과를 나타내고 있다.

도 7은 인 비트로에서 인슐린 분비하는 세포로 분화한 세포를 디티존 스테인을 하여 확인을 하고 (a,b), 그 때 특이적으로 발현되는 마커의 발현이 나타나고 있는지를 면역형광염색법을 사용하여 확인한 결과를 나타내고 있다 (c-h).

도 8에서는 pathway I 방법으로 분화 유도한 세포가 인 비트로 상에서 인슐린을 분비하고 있는지를 확인하기 위해서 글루코스 농도 차이에 의한 인슐린 분비량을 조사한 결과를 나타내고 있다. 이때 A는 글루코스 농도에 따른 인슐린 분비량을 인슐린 ELISA kit를 이용하여 측정한 결과를 나타내고 있고, B는 10 μM KCL을 포함하는 16.7 mM 글루코스 용액과 KCL을 포함하지 않는 용액을 사용하였을 때 배지에 분비된 인슐린의 양을 인슐린 ELISA kit을 사용하여 측정한 결과를 나타내고 있다. positive control로는 췌장암세포를 사용하였다.

도 9의 A와 B는 분화된 세포가 인 비보에서도 인슐린을 분비하는 작용을 효과적으로 하고 있는지를 확인한 결과를 나타내고 있다. 6주령 발브시 누드마우스를 사용하여 스트렙토조토신 (STZ: streptozotocin)을 주입을 하고, 혈당 수치가 250 mg/dL이상이 되었을 때, condition I, II, II→III에서 각각 배양한 세포를 펠렛 배양을 한 후에 kidney capsule의 방법으로 인젝션을 한 결과를 나타내고 있다. 도 9A의 그래프는 3일 간격으로 혈당을 측정하고 그 수치를 그래프 화하여 혈당량의 변화를 보여주고 있다. 또한, 도 9B에서는 condition III에서 배양한 세포를 인젝션한 마우스의 조직을 파라핀 블록을 만들어서 섹션을 한 후에 인슐린을 분비하는 세포에서 발현되는 마커인 C-peptide의 발현을 확인한 결과와 H&E 스테인을 하여 확인한 결과를 나타내고 있다.

도 10은 소음순 유래 성체세포를 GFP를 발현하게 만든 후에 pathway I의 방법으로 분화를 유도시킨 후에 마우스에 인젝션을 하여 인 비보에서도 인슐린을 분비하는 작용을 효과적으로 하고 있는지를 확인한 결과를 나타내고 있다. 도 10A는 pathway I의 방법으로 분화시킨 세포를 인젝션한 발브시 누드 마이스의 체중 변화를 그래프로 나타낸 결과이고 도 10B는 그 때의 혈당량을 측정하여 그래프로 나타낸 결과를 보여주고 있다. 도 10C는 세포를 인젝션한 마이스와 세포를 인젝션하지 않은 마우스를 비교하여 혈중 글루코스의 수치를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 11은 테스트를 끝낸 누드 쥐에서 신장을 적출하여 파라핀 블록을 만들어서 인슐린 분비세포에서 특이적으로 발현되는 마커가 발현이 되고 있는지를 확인한 결과를 나타내고 있다. 이 때 인젝션한 세포가 GFP를 발현하고 있어서 면역형광염색법으로 스테인된 부분과 GFP가 발현되는 부분을 비교하였다. 그 결과 분화된 세포를 인젝션한 부분에서 C-peptide가 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

1. 소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM, FBS, L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양 조건에서 배양하여 하기 특성을 나타내는 다분화성 성체줄기세포를 제조하는 단계:

   (1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

   (2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

   (3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄;

   (4) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

   (5) 사이토카인 미포함 배지 배양 하에서도, 다분화능이 유지된 상태로 수득되고 대량증식 되는 능력을 가짐;

   상기에서 제조된 성체줄기세포를 DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 및 글루타민으로 구성된 ITS 배지에서 배양하는 단계; 및

   상기 ITS 배지에서 배양된 세포를 glucose를 포함하고 있는 DMEM배지에 FBS(fetal bovine serum), L-글루타민(Cambrex), 페니실린-스트렙토마이신, 하이드로코르티손(hydrocortisone), 인슐린 및 니코티아마이드(nicotinamide)를 첨가한 CM배지에서 배양하여 인슐린 분비 세포로 분화 유도하는 단계를 통하여, 분화된 인슐린 분비 세포.
2. 제1항에 있어서, 상기 소음순에서 분리한 성체줄기세포는 분리된 여성의 소음순 조직으로부터 진피조직을 얻고, 얻어진 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 분리된 세포를 로우글루코즈 DMEM에서 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 분화된 인슐린 분비 세포.
3. 제1항에 있어서, 상기 분화된 인슐린 분비 세포는 하기 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분화된 인슐린 분비 세포:

   (1) 여성 소음순에서 유래된 성체세포로부터 분화됨;

   (2) 글루코스 농도에 비례하여 인슐린 분비의 양을 조절: 및

   (3) 시펩타이드(c-peptide), 피디엑스원(Pdx-1)을 발현.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분화된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 조성물.
6. 소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM, FBS, L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양 조건에서 배양하여 하기 특성을 나타내는 다분화성 성체줄기세포를 유효성분 으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물:

   (1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

   (2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

   (3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄;

   (4) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐;

   (5) 사이토카인 미포함 배지 배양 하에서도, 다분화능이 유지된 상태로 수득되고 대량증식 되는 능력을 가짐; 및

   (6) 인슐린 분비 세포로 분화되는 특성을 가짐.

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