WO2016013710A1 - 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주의 제조방법 및 수득된 세포주 - Google Patents

중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주의 제조방법 및 수득된 세포주 Download PDF

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정원주
김호빈
오민선
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a pluripotent stem cell line derived from mesenchymal stem cells and a pluripotent stem cell line obtained.
  • the cell line refers to a continuous lineage cell line, that is, a establishing cell line, and means that the cultured cells acquire infinite proliferation and become a continuous lineage cell line.
  • stem cells collectively refer to undifferentiated cells in the pre-differentiated stage that can be obtained from each tissue. In the undifferentiated state, it is capable of continuously producing the same cells as itself for a certain period of time, and under proper conditions, it is capable of differentiating into various cells constituting biological tissues.
  • Stem cells can be largely divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to their differentiation capacity and production time. Another classification is according to the differentiation capacity of stem cells, and can be divided into pluripotency, multipotency and unipotency stem cells.
  • Adult stem cells can be divided into multipotent or unipotent stem cells.
  • Representative adult stem cells include mesenchymal stem cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs).
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • Mesenchymal stem cells are differentiated into chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, myocytes, and neurons.
  • Hematopoietic stem cells mainly contain blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets. It is known to differentiate into cells.
  • Pluripotent stem cells refer to stem cells that have the versatility to differentiate into all three germ layers that make up a living body and to differentiate into all cells or organ tissues of the human body, and generally embryonic stem cells. This is the case.
  • Human embryonic stem cells have many ethical problems because they are made from embryos that can occur as human beings, but are known to have superior cell proliferation and differentiation capacity as adult stem cells.
  • Adult stem cells can be obtained from bone marrow, blood, brain, skin, etc., so there are few ethical problems, but they have limited differentiation ability compared to embryonic stem cells.
  • differentiated pluripotent stem cells similar to embryonic stem cells by dedifferentiating adult-derived cells.
  • Representative methods include fusion with ES cells, somatic cell nuclear transfer, and reprogramming by gene factor.
  • the cell fusion method has a problem in that the induced cells have two more pairs of genes, and the somatic cell nuclear transfer method requires a large amount of eggs and a very low efficiency.
  • the specific factor injection method uses a virus containing a carcinogen to induce reverse differentiation by inserting a specific gene, which poses a high risk of cancer, and in view of the possibility of developing a cell therapy due to its low efficiency and difficulty in terms of methodology. It is a problem.
  • a culture composition at the stage of culturing isolated umbilical cord-derived mononuclear cells is very important. It is a state.
  • atopic dermatitis using Ecklonia cava was used in a composition for the treatment or prevention (Patent No. 2009-0043115) or an oxidative dyeing composition (Patent No. 2012-0126148), but the mesenchymal stem cells (adipose) There has been no use for dedifferentiating -derived mesenchymal stem cells into induced pluripotency stem cell lines.
  • the present inventors endeavored to find a method of inducing pluripotent stem cell lines with high efficiency for the practical use of cell therapy with high safety and production efficiency.
  • the Ecklonia cava extract which is a safe natural extract
  • the present invention was completed by confirming that the induced pluripotent stem cell line could be prepared using the mesenchymal stem cells in a safe and high efficiency.
  • an object of the present invention is to treat a mesenchymal stem cell with a differentiation medium containing Ecklonia cava (hereinafter referred to as STC-F002) to induce pluripotent stem cell lines. It is to provide a manufacturing method.
  • STC-F002 Ecklonia cava
  • Another object of the present invention is to provide a derivatized induced pluripotent stem cell line EPN-1 (Accession No .: KCLRF-BP-00318) by culturing mesenchymal stem cells in a medium for reverse differentiation containing Ecklonia cava . have.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell therapy composition comprising the induced pluripotent stem cell line.
  • a mesenchymal stem cell (mesenchymal stem cell) from the human umbilical cord; (B) forming a colony of the mesenchymal stem cells in a medium for reverse differentiation comprising Ecklonia cava ; It provides a method for producing an induced pluripotency stem cell line from mesenchymal stem cells comprising and (c) subcultured the colony to obtain an induced pluripotent stem cell line.
  • the present inventors have tried to find a method of inducing a high efficiency pluripotent stem cell line for the practical use of developing a cell therapy product having high safety and production efficiency without the ethical problem of destroying the embryo.
  • the Ecklonia cava extract which is a safe natural extract
  • a pluripotent stem cell line could be produced with surprisingly high efficiency.
  • Ecklonia cava an active ingredient included in the medium composition for retrodifferentiation of the present invention is a perennial seaweed of kelp seaweed kelp, which is a brown seaweed plant inhabiting the coastal area of Jeju Island and the Ulleungdo coast, mainly in the south coast. It is a food for conch, and is also used as a main raw material for making alginic acid, iodine and potassium, and for food.
  • Ecklonia cava extract comprises water, (a) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propanol, iso-propanol and normal-butanol, etc.), (b) the Mixed solvent of lower alcohol and water, organic solvents such as (c) acetone, (d) ethyl acetate, (e) chloroform, (f) 1,3-butylene glycol, (g) hexane, (h) diethyl ether
  • the solvent may be extracted using a solvent, and preferably, the solvent may be extracted using a mixed solvent of methanol or ethanol and water. When extracted using a mixed solvent, the content of methanol or ethanol is preferably 50-80v / v%.
  • the term “embryonic stem cell” refers to a cell having pluripotency as a cell cultured by separating from an inner cell mass of a blastocyst, which is an early stage of development after fertilization.
  • pluripotency refers to a stem having pluripotency capable of differentiating into three germ layers constituting a living body, that is, endoderm, mesoderm, and ectoderm. Refers to a cell.
  • differentiation refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and proliferate and grow, that is, a cell or tissue of an organism has a shape or function to perform a task given to each. It means to change.
  • cell therapeutic agent refers to a medicament used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared by isolation, culture, and special manipulation from humans, and is used to restore the function of cells or tissues. Or a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating, selecting, or otherwise modifying a cell's biological properties in vitro.
  • Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to stem cell therapy.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention are cells isolated from embryonic stem cells or adult stem cells derived from mammals, preferably umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and more preferably human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • the stem cells can be obtained from the umbilical cord connecting the placenta and fetus in the human body.
  • Mesenchymal stem cells can be harvested from a variety of methods, for example, by taking a umbilical cord from the human body and rinsing it until no blood comes out with DPBS.
  • the solution containing mononuclear cells can be obtained by incubation at °C.
  • the term “medium” refers to cells of cells such as stem cells in vitro , including elements essential for the growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. Refers to a mixture for incubation or differentiation.
  • Various media are commercially available in the art, and can also be manufactured artificially.
  • Commercially available media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, and ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal).
  • Essential Medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, and ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal).
  • Essential Medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12, DMEM F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal.
  • Essential Medium G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium)
  • IMPM Iscove's Modified D
  • Serum components for example, Fetal Bovine Serum (FBS)
  • antibiotics for example, penicillin, streptomycin
  • concentration of serum component or antibiotic component added to the basal medium may vary within a range capable of achieving the effect of the present invention, preferably 10% FBS, 100 unit / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, or the like. Can be added.
  • the medium of the present invention may further comprise a nutrient mixture (Nutrient Mixture).
  • the nutrition mixture is a mixture containing various amino acids, vitamins, inorganic salts, and the like generally used in cell culture, and may be prepared by mixing the amino acids, vitamins, inorganic salts, and the like, or use a commercially prepared nutrition mixture.
  • Commercially prepared nutrient mixtures include, but are not limited to, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302, and the like.
  • the medium of the present invention may further include energy water for induction and stabilization of pluripotent stem cells.
  • the energy water is preferably added at 0.01 to 10 v / v%, more preferably at 0.05 to 0.5 v / v%.
  • the medium composition of the present invention is a medium specific for pluripotent stem cell induction, and may be achieved by adding Ecklonia cava extract to the basal medium, and preferably at a concentration of 1 to 1,000 ⁇ g / ml based on the total medium composition, more preferably.
  • Ecklonia cava extract may be included at a concentration of 1 to 400 ⁇ g / ml.
  • “Induced pluripotent stem cell line” of the present invention is a stem cell induced pluripotency, such as embryonic stem cells in pluripotent mesenchymal stem cells, means a cell line capable of continuous passage culture.
  • the induced pluripotent stem cell line preferably means EPN-1 (Accession No .: KCLRF-BP-00318).
  • the induced pluripotent stem cell line EPN-1 (Accession No .: KCLRF-BP-00318), which is differentiated by culturing mesenchymal stem cells in a medium for reverse differentiation containing Ecklonia cava , Ecklonia cava To provide.
  • the induced pluripotent stem cell line EPN-1 of the present invention was deposited on May 30, 2014 at the Korea Cell Line Research Foundation of the College of Medicine, Seoul National University under the accession number KCLRF-BP-00318.
  • the induced pluripotent stem cell line EPN-1 characterized in that it shows a positive response in staining for Oct-4, SOX-2, or stage-specific embryonic antigen (SSEA-4) is provided.
  • SSEA-4 stage-specific embryonic antigen
  • the characteristics of the induced pluripotent stem cell line were tested, demonstrating that this is a pluripotent stem cell line (FIGS. 3 and 4).
  • the medium composition containing the Ecklonia cava extract of the present invention when using the medium composition containing the Ecklonia cava extract of the present invention, it was confirmed that pluripotent stem cell colonies were formed on day 8-10, unlike when using only DMEM F-12 medium (FIG. 2).
  • Induced pluripotent stem cell lines of the present invention have the same differentiation capacity as embryonic stem cells, and are almost identical to embryonic stem cells in the shape of cells. According to an embodiment of the present invention, as a result of examining the expression of genes (Nanog, Oct4, Sox-2, c-Myc) and protein (SSEA4) characteristic of embryonic stem cells in pluripotent stem cells induced by the present invention It was confirmed that the genes and proteins are expressed in the same manner as embryonic stem cells (FIGS. 4 and 5).
  • the induced pluripotent stem cell line of the present invention was differentiated into ectoderm cells, endoderm cells, hepatocytes, mesoderm cells, cartilage and osteoblasts, and the differentiation of each specific staining reaction (neural cells (Nestin), hepatocytes ( ⁇ -)). fetrotein), chondrocytes (Alcian blue), osteoblasts (Von kossa), and as a result, confirmed that the pluripotent, endoderm, mesoderm, like pluripotent stem cells have the same differentiation capacity as embryonic stem cells (Fig. 6 To FIG. 8)
  • the induced pluripotent stem cell line of the present invention can be used as an effective cell therapy.
  • composition of the present invention can be administered by any route of administration, specifically by intraperitoneal or chest cavity administration, subcutaneous administration, intravenous or arterial vascular administration, intramuscular administration, topical administration by injection, or the like.
  • the composition can be administered in the form of injections, suspensions, emulsifiers and the like based on conventional methods, and if necessary, suspended in an adjuvant such as Freund's complete adjuvant or adjuvant activity such as BCG. It is also possible to administer with the substance having.
  • an adjuvant such as Freund's complete adjuvant or adjuvant activity such as BCG. It is also possible to administer with the substance having.
  • the cell therapy composition of the present invention can be applied to arthritis, nervous system diseases, endocrine diseases, liver diseases, and the like, and according to the results of clinical trials for humans in the future, there is also the possibility of treating allogeneic cells for humans.
  • the present invention provides a method for preparing induced pluripotent stem cell lines from mesenchymal stem cells using a medium for reverse differentiation comprising Ecklonia cava .
  • the present invention provides an induced pluripotent stem cell line EPN-1 (Accession No .: KCLRF-BP-00318), which is cultured in a medium for reverse differentiation containing Ecklonia cava , which is the present inventors.
  • the present invention also provides a cell therapeutic composition comprising the induced pluripotent stem cell line EPN-1 (Accession No .: KCLRF-BP-00318).
  • the media composition according to the present invention can efficiently produce induced pluripotent stem cell lines using mesenchymal stem cells, and the prepared pluripotent stem cell lines are useful as cell therapeutic agents because they can differentiate into various cells. Can be used.
  • FIG. 1 is a diagram showing the induction of pluripotent stem cells almost identical to embryonic stem cells when cultured by injecting a differentiation medium (STC-F002) containing Ecklonia cava extract from mesenchymal stem cells.
  • STC-F002 a differentiation medium containing Ecklonia cava extract from mesenchymal stem cells.
  • Figure 2 shows the pluripotent stem cell colony formation induced by the concentration of Ecklonia cava extract according to the method of the present invention (Example 3).
  • Example 3 confirms that the cells induced by the method of the present invention (Experimental Example 1) are pluripotent stem cells using the expression of SSEA-4, a pluripotent stem cell specific protein.
  • Example 4 confirms that the cells induced by the method of the present invention (Experimental Example 2) are pluripotent stem cells using pluripotent stem cell-specific protein expression.
  • Figure 5 shows the gene expression (Experimental Example 3) of pluripotent stem cells induced by the method of the present invention.
  • pluripotent stem cells by inducing differentiation into ectoderm, mesoderm, and endoderm cells of pluripotent stem cells induced by the method of the present invention.
  • the herbal samples used in the experiment were purchased from Jeju Island and used in the experiment after accurate evaluation by experts. 100 g of the dried herbal sample was placed in 1 L of water, and water was extracted using an ultrasonic extractor for 16 hours, and filtered using a filter paper. The filtrate was concentrated in a rotary evaporator and immediately freeze dried.
  • the Ecklonia cava extract was added with a concentration of 1-1000 ⁇ g / ml and 0.1 v / v% of energy water to prepare STC-F002 medium, which is a medium for reverse differentiation.
  • Umbilical cord tissue is collected immediately after delivery. Rinse first with 500 ml of sterilized medium containing F-12 medium with transfer medium (50 IU / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin (purchased from Invitrogen)) prior to transfer to the laboratory. Transferred to a glass bottle. In the laboratory, stem cell extraction is performed in a flow hood of class 100 under sterile conditions. The sample is first transferred to a container of sterile stainless steel.
  • transfer medium 50 IU / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin (purchased from Invitrogen)
  • the PBS is washed several times and the umbilical cord tissue sample is then cut to 2 cm in length and transferred to a 10 cm diameter cell culture dish where further washing and anti-infection with 70% ethanol, antibiotic mixture (50 IU / ml penicillin, Wash several times with PBS with 50 ⁇ g / ml of streptomycin (purchased from Invitrogen) until the solution is clear.
  • antibiotic mixture 50 IU / ml penicillin
  • PBS 50 ⁇ g / ml of streptomycin (purchased from Invitrogen) until the solution is clear.
  • Example 2-2 Stem Cell Isolation and Culture in Human Umbilical Cord
  • An incision of the umbilical cord tissue is first made to separate the wharton jelly from the umbilical cord blood vessels and other internal elements. After removal of the blood vessels, the separated wharton jelly is cut into small pieces (0.5 cm x 0.5 cm) for extraction of the cells. Explants are performed by putting pieces of umbilical wharton jelly into different tissue culture dishes with cell culture conditions suitable for extraction of epithelial or mesenchymal stem cells.
  • the explanted tissue was treated with 5 ml Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) F-12 (Gibco), 10% FBS, 100 unit / with 10% fetal calf serum (FBS, Hyclone). It was immersed in ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin and maintained at 37 ° C. in a carbon dioxide cell incubator. Medium was changed every 3 or 4 days. Outgrowth of cells was monitored by light microscopy. Elongating cells were trypsinized (0.125% trypsin / 0.05% EDTA) for further expansion and cryopreservation (using DMEM / 10% FBS).
  • DMEM Dulbecco's modified eagle medium
  • FBS fetal calf serum
  • the medium was replaced every 3 or 4 days. Outgrowth of cells from explanted tissue was monitored by light microscopy.
  • pellets of cells were resuspended and counted in medium DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS, 100 unit / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, and 10 cm tissue culture dishes. Were inoculated at a density of 1 ⁇ 10 6 cells / dish. The medium was changed every 3 or 4 days. Cell growth and cloning were monitored by light microscopy. At about 90% confluence, the cells were sub-cultured as described above.
  • the control group was a medium of MSC.
  • DMEM F-12 (Gibco) 10% FBS, 100 unit / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin was used as the basal medium, and the experimental group used 1 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ⁇ l of Jeju Ecklonia cava extract in the medium using human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells subjected to subculture.
  • Colonies produced in Example 3 were treated with 1 mg / ml of collagenase to isolate colonies, and 1 ⁇ 10 6 in DMEM / F12 medium containing 10% FBS, 100 unit / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin. Cells were inoculated into T175 flasks and incubated in a CO 2 incubator. The medium was changed every 2 to 3 days, and passaged twice under conditions of passage at 80% confluency to build a stem cell line.
  • the stem cells passaged by the method of Example 4 was confirmed that the colonies continue to form, confocal microscopy by performing immunochemical staining using SSEA-4 antibody, a specific marker of pluripotent stem cells After analysis (confocal microscope), the cell colonies only because the marker staining was confirmed that the cells only pluripotent stem cells in the colonies (Fig. 3). In addition, it was confirmed that the cell line (cell line) as it continues to proliferate even after passage for 6 months.
  • the present inventors named the cell line “EPN-1 cell” and deposited on May 30, 2014, the Korean Cell Line Research Foundation (Korean Cell Line Research Foundation, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine, 28, Jongno-gu, Seoul). Deposited as -BP-00318.
  • OCT4, SOX2, and stage-specific embryonic antigen4 (SSEA4) proteins which are specific proteins of embryonic stem cells, with respect to pluripotent stem cells prepared in Example 3 was analyzed.
  • the staining process was first fixed with 4% paraformaldehyde (Paraformaldehyde), and then washed with PBS and blocked with 1% BSA solution (blocking).
  • Protein staining was performed using FITC at 488 nm and Hochest did not overlap with the FITC wavelength by taking at 350 nm UV.
  • the first figure shows the result of staining of each protein expression and gene expression in the nucleus
  • the cryest means the staining of the nucleus of the cell using harness dye
  • the third figure shows the two figures combined (Fig. 4).
  • Nanog, OCT4, Sox-2 are characteristic genes seen in embryonic stem cells, and c-Myc gene is a nonspecific gene that can appear positive in both embryonic stem cells and adult cells.
  • PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis, and the results of confirming the expression of these genes are shown in FIG. 5.
  • pluripotent stems from mesenchymal stem cells were cultured in an incubator at a humidity of 95%, 37 ° C., and 5% CO 2 using a medium for differentiation (STC-F002) according to the present invention.
  • Induced cells were then cultured in neuronal differentiation solution DMEM F-12, 2% B-27 supplement, 2 mM L-glutamin, 30 ng / ml EGF, 25 ng / ml bFGF for 5 days, followed by 2% FCS (Fatal Calf Serum), 25 ng / ml bFGF, 25 ng / ml BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) was incubated for 7 days in a medium.
  • DMEM F-12 2% B-27 supplement, 2 mM L-glutamin, 30 ng / ml EGF, 25 ng / ml bFGF for 5 days, followed by 2% FCS (Fatal Calf Serum), 25 ng / ml bFGF, 25 ng / ml BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) was incubated for 7 days in a medium.
  • FCS Total Calf Serum
  • pluripotent stem cells from mesenchymal stem cells were cultured in an incubator at a humidity of 95%, 37 ° C, and 5% CO 2 using a medium for differentiation (STC-F002) according to the present invention.
  • pluripotent stems from mesenchymal stem cells were cultured in an incubator at a humidity of 95%, 37 ° C. and 5% CO 2 using a medium for differentiation (STC-F002) according to the present invention.
  • Induced cells and chondrocyte differentiation solution DMEM F-12, 0.1 uM dexamethason, 50 ⁇ g / ml AsA (Acetylsalicylic Acid), 100 ⁇ g / ml sodium pyruvate, 40 ⁇ g / ml proline, 10 ng / ml TGF- ⁇ 1, 5 Incubated for 2 weeks in% ITS (Insulin-Transferrin-Selenium; 6.25 ⁇ g / ml insulin, 6.25 ⁇ g / ml transferring, 6.25 ng / ml selenius scid), 1.25 mg / ml bovine serum albumin, 5.35 mg / ml lioleic acid.
  • the Alcian blue positive reaction showed that the cells expected to be pluripotent stem cells could be differentiated into chondrocytes, which are mesodermal cells.
  • chondrocytes which are mesodermal cells.
  • a medium mixed with the reverse differentiation medium (STC-F002) according to the present invention incubated in a culture medium in a humidity of 95%, 37 °C, 5% CO 2 conditions medium
  • Pluripotent stem cells were derived from mesenchymal stem cells and then cultured for 2 weeks in osteoblast differentiation solution DMEM F-12, 2uM dexamethasone, 10mM ⁇ -glycerol phosphate, 0.3mM ascorbic acid, and 1uM BMP (bone morphogenic protein).

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 유도한 만능 줄기세포주(pluripotent stem cell line)를 제조하는 방법 및 이에 의해 수득된 유도만능 줄기세포주(기탁번호:KCLRF-BP-00318)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 유도만능 줄기세포주의 제조방법은 (a) 인간의 탯줄로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지로 콜로니를 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 콜로니를 계대배양하여 유도만능 줄기세포주를 수득하는 단계;를 포함한다. 본 발명에 따른 유도만능 줄기세포주는 본 발명자들에 의해 최초로 구축된 것이며, 본 발명의 만능 줄기세포주는 다양한 세포로 분화될 수 있으며, 세포이식 치료를 통하여 다양한 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주의 제조방법 및 수득된 세포주
본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 유도한 만능 줄기세포주를 제조하는 방법 및 수득된 만능 줄기세포주에 관한 것이다.
세포주는 연속계대성의 세포계, 즉 수립세포주를 의미하는 것으로, 배양세포가 무한증식성을 획득하여 연속계대성세포계가 되는 것을 의미한다.
아울러, 줄기세포는 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화될 수 있는 성질을 가지고 있다.
줄기세포는 분화능과 생성시기에 따라 크게 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분될 수 있다. 또 다른 분류는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로, 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다.
성체줄기세포는 다분화능 또는 단분화능 줄기세포로 구분할 수 있다. 대표적인 성체줄기세포에는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)와 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)가 있다. 중간엽 줄기세포는 연골세포 (chondroblast), 골세포(osteoblast), 지방세포(adipocyte), 근육세포(myocyte), 신경세포(neuron)로 분화하며 조혈모세포에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.
반면에 만능 줄기세포는 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화될 수 있어 인체의 모든 세포나 장기 조직으로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭하며, 일반적으로 배아줄기세포가 이에 해당된다. 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나, 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나, 배아 줄기세포에 비하여 한정된 분화능력을 가지고 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로, 성체에서 유래한 세포를 역분화시켜 배아줄기세포와 유사한 맞춤형 만능 줄기세포(주)를 제조하기 위한 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다. 대표적인 방법으로 세포 융합법(fusion with ES cell), 체세포 핵치환법(somatic cell nuclear transfer), 특정 인자 주입법(reprogramming by gene factor) 등이 있다. 세포융합법은 유도된 세포가 2쌍의 유전자를 더 가지고 있어 세포의 안정성 측면에서 문제점이 있고 체세포 핵치환법은 난자가 대량으로 필요하며 효율 또한 매우 낮다는 점에서 문제가 있다. 그리고 특정 인자 주입법은 특정 유전자를 삽입하여 역분화를 유도하기 위하여 발암유전자를 포함하는 바이러스를 이용하는 방법으로 암발생의 위험이 높으며, 낮은 효율과 방법적인 측면에서의 난이도로 인해 세포 치료제 개발 가능성 면에서 문제시 되고 있다.
만능 줄기세포주를 성공적으로, 그리고 다량으로 얻기 위해서는 분리된 제대 유래 단핵세포를 배양하는 단계에서의 배양 조성물이 매우 중요한 바, 보다 많은 양, 고효율의 유도방법으로 만능 줄기세포를 제조하기 위한 연구가 필요한 상태이다.
한편 감태를 이용하여 아토피 칠환이 치료 또는 예방을 위한 조성물(공개특허 제2009-0043115호)이나 산화염색용 염모제 조성물(공개특허 제2012-0126148호)에 사용한 경우는 있으나, 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell)를 유도만능 줄기세포주(induced pluripotency stem cell line)로 역분화하기 위한 용도로 사용된 것은 전무한 상태이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 안전성와 생산효율이 높은 세포 치료제 개발의 실용화를 위한 만능 줄기세포주를 고효율로 유도하는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 안전한 천연 추출물인 감태 추출물을 세포 배양 배지에 첨가할 경우 중간엽 줄기세포를 이용하여 안전하고도 높은 효율로 유도만능 줄기세포주를 제조할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포에 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지(이하, STC-F002로 명명함)를 처리하여 유도만능 줄기세포주(induced pluripotent stem cell line)의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지에 배양하여 역분화된 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318)를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유도만능 줄기세포주를 포함하는 세포 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, (a) 인간의 탯줄로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지로 콜로니를 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 콜로니를 계대배양하여 유도만능 줄기세포주를 수득하는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주(induced pluripotency stem cell line)를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 배아를 파괴하는 윤리적 문제를 없이 안전성와 생산효율이 높은 세포치료제 개발의 실용화를 위한 만능 줄기세포주를 고효율로 유도하는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 안전한 천연 추출물인 감태 추출물을 세포 배양 배지에 첨가할 경우 놀랍게도 높은 효율로 만능 줄기세포주를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 역분화용 배지 조성물에 포함되는 유효성분인 감태(甘苔, Ecklonia cava)는 주로 남해안, 제주도 해안 일대 및 울릉도 해안 일대에서 서식하는 갈조식물 다시마목 다시마과의 여러해살이 해조류로서, 주로 전복과 소라 등의 먹이가 되며, 알긴산이나 요오드 ·칼륨을 만드는 주요 원료나, 식용으로 이용하기도 한다.
본 발명이 포함하는 감태 추출물은 물, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르 등의 유기용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올과 물과의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있다. 혼합용매를 이용하여 추출할 경우 메탄올 또는 에탄올의 함량은 50-80v/v%가 바람직하다.
현재 상기 감태 추출물을 화장료 등의 피부 조성물에 적용하기 위한 사례가 증가되고 있으나(대한민국 공개특허 제2013-0017159호, 제2012-0040488호, 제2010-0097293호 등 참조), 만능 줄기세포 유도용 배지로 개발된 사례는 전무하다.
본 발명에서 사용된 용어 "배아줄기세포"는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyst)의 내부세포덩어리(inner cell mass)에서 분리하여 배양한 세포로 만능성(pluripotency)을 지니는 세포를 지칭한다. 본 발명에서 사용된 용어 "만능줄기세포"는 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 모두로 분화할 수 있는 만능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 포유동물 유래의 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포에서 분리한 세포로서, 바람직하게는 제대 유래 중간엽 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인체 제대유래 중간엽 줄기세포이다. 상기 줄기세포는 인체에서 태반과 태아를 연결하는 제대에서 채취하여 얻을 수 있다. 제대로부터 중간엽 줄기세포의 채취는 다양한 방법을 이용하여 이를 수행할 수 있으며, 예를 들어, 인체에서 제대를 채취하여 DPBS 로 혈액이 나오지 않을 때까지 씻어주고, 씻은 제대를 수술용 칼날로 다지고 37℃에서 인큐베이션(incubation) 시켜서 단핵세포가 함유된 용액을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외 (in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 배양 또는 분화를 위한 혼합물을 말한다.
당업계에는 다양한 배지가 시판되고 있으며, 인위적으로 제조하여 사용할 수도 있다. 시판 중인 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMPM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium(Gibco, Newyork, USA), Chang's Medium MesemCult-XF Medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) 등이 있으며, 인위적으로 제조할 수 있는 배지와 더불어 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 기본 배지로 사용할 수 있다.
상기 기본 배지에는 통상적으로 첨가되는 혈청 성분(예를 들어, FBS(Fetal Bovine Serum)) 및 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 등을 첨가할 수 있다. 상기 기본 배지에 첨가되는 혈청 성분 또는 항생제 성분의 농도는 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변할 수 있으며, 바람직하게는 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 등을 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 배지는 만능 줄기 세포의 유도와 안정화를 위해 에너지워터를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 에너지워터는 0.01 내지 10 v/v%로 추가하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5 v/v%로 추가한다.
본 발명의 배지 조성물은 만능 줄기세포 유도에 특이적인 배지로서, 상기 기본 배지에 감태 추출물을 첨가함으로써 달성될 수 있으며, 바람직하게는 전체 배지 조성물 기준 1 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로, 보다 바람직하게는 1 내지 400 ㎍/㎖ 농도로 감태 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명의 '유도만능 줄기세포주'란 다능성인 중간엽 줄기세포에서 배아줄기세포와 같은 만능성을 유도한 줄기세포로서, 지속적으로 계대 배양이 가능한 세포주를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 유도만능 줄기세포주는 바람직하게는 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318)를 의미한다.
따라서 본 발명의 다른 양태에 따르면, 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지에 배양하여 역분화된 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318)를 제공한다.
본 발명의 유도만능 줄기세포주 EPN-1은 서울대학교 의과대학의 한국세포주연구재단에 2014년 5월 30일에 기탁번호 KCLRF-BP-00318로 기탁되었다.
바람직하게는 Oct-4, SOX-2, 또는 SSEA-4(stage-specific embryonic antigen)에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주 EPN-1을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서는 유도만능 줄기세포주로서의 특성을 실험하여, 이것이 만능 줄기세포주임을 입증하였다(도 3 및 도 4).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 감태 추출물이 포함된 배지 조성물을 이용한 경우 DMEM F-12 배지만을 이용한 경우와 달리 8-10일째 되는 날 만능 줄기세포 콜로니들이 형성되었음을 확인할 수 있었다(도 2).
본 발명의 유도만능 줄기세포주는 배아 줄기세포와 동일한 분화능을 가지며, 세포의 모양에 있어서도 배아 줄기세포와 거의 동일하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 배아줄기세포에 특징적인 유전자(Nanog, Oct4, Sox-2, c-Myc) 및 단백질(SSEA4)의 발현여부를 조사한 결과 본 발명에 의해 유도된 만능 줄기세포에서 배아줄기세포와 동일하게 상기 유전자 및 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 4 및 도 5).
또한 본 발명의 유도만능 줄기세포주는 외배엽 세포인 신경세포, 내배엽세포인 간세포, 중배엽세포인 연골과 골아 세포로 분화가 되었고 분화 여부를 각각의 특이 염색반응(신경세포(Nestin), 간세포(α-fetrotein), 연골세포(Alcian blue), 골아세포(Von kossa))을 통하여 확인한 결과, 만능 줄기세포와 같이 외배엽, 내배엽, 중배엽으로 분화한 것을 확인하여 배아 줄기세포와 동일한 분화능을 가지고 있다(도 6 내지 도 8)
따라서, 본 발명의 유도만능 줄기세포주는 효과적인 세포 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 투여경로에 의해서, 구체적으로는 복강 또는 흉강 투여, 피하 투여, 정맥 또는 동맥 혈관내 투여, 근육내 투여, 주사에 의한 국소 투여 등의 방법에 의해서 투여 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 통상의 방법에 기초하여 주사제, 현탁제, 유화제 등의 형태로 투여할 수 있고, 필요에 따라서 프로인트 완전 보조제 등의 보조제에 현탁되거나, 또는 BCG와 같은 보조제 활성을 갖는 물질과 함께 투여하는 것도 가능하다.
본 발명의 세포 치료용 조성물은 관절염, 신경계질환, 내분비질환, 간질환 등에 적용이 가능하며, 추후 사람에 대한 임상시험 결과에 따라서는 사람에 대한 동종세포 치료제로의 가능성도 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주를 제조하는 방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지에 배양하여 역분화된 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318)을 제공하며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 구축된 것이다.
(iii) 또한, 본 발명은 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318)을 포함하는 세포 치료용 조성물을 제공한다.
(iv) 본 발명에 따른 배지 조성물을 이용하면 중간엽 줄기세포를 이용하여 유도만능 줄기세포주를 효율적으로 제조할 수 있으며, 제조된 만능 줄기세포주는 다양한 세포로의 분화가 가능하므로 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 중간엽 줄기세포에서 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지(STC-F002)를 주입하여, 배양 시 배아 줄기세포와 거의 동일한 만능 줄기세포가 유도되는 것을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 방법(실시예 3)으로 감태 추출물의 농도에 따라 유도된 만능 줄기세포 콜로니 형성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법으로 유도된 세포(실험예 1)를 만능 줄기세포 특이적 단백질인 SSEA-4의 발현을 이용하여 만능 줄기세포임을 확인한 것이다.
도 4은 본 발명의 방법으로 유도된 세포(실험예 2)를 만능 줄기세포 특이적 단백질 발현을 이용하여 만능 줄기세포임을 확인한 것이다.
도 5는 본 발명의 방법으로 유도된 만능 줄기세포의 유전자 발현(실험예 3)을 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 본 발명의 방법으로 유도된 만능 줄기세포의 외배엽, 중배엽, 내배엽 세포로 분화를 유도하여 만능 줄기세포임을 확인한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 역분화용 배지(이하'STC-F002'로 명명함)의 제조
실험에 사용된 생약 시료들은 제주도에서 구입하여 전문가의 정확한 감정을 거친 후 실험에 사용하였다. 건조된 생약 시료 100 g을 물 1 ℓ에 넣고 물은 16시간 동안 초음파추출기를 적용하여 추출하고 여과지를 사용하여 여과하였다. 여액을 회전감압증발기에서 농축시키고 즉시 동결 건조하였다. 제주 감태 추출물을 1-1000㎍/㎖의 농도와 에너지 워터 0.1 v/v%를 첨가하여 역분화용 배지인 STC-F002 배지를 제조하였다.
실시예 2: 인체 제대에서 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
실시예 2-1: 인체 제대 채취
제대 조직은 출산 직후 바로 수집된다. 시료가 실험실로 옮겨지기 전에 우선 깨끗이 헹군 다음 즉시 이송용 배지(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))이 첨가된 F-12 배지가 들어있는 500 ㎖의 멸균 유리병로 옮겨진다. 실험실에서는 멸균 상태 하에서 class 100의 플로우 후드에서 줄기세포의 추출이 수행된다. 시료는 우선 멸균 스테인레스 스틸의 용기로 옮겨진다. PBS는 수회 세정한 후 제대 조직 시료는 이후 2 ㎝ 길이로 잘라져 10 ㎝ 지름의 세포 배양 접시로 옮겨지며, 여기서 추가적인 세정 및 70% 에탄올로 항감염처리하고, 항생제 혼합물(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))이 첨가된 PBS로 상기 용액이 깨끗해 질 때까지 수차례 세정한다.
실시예 2-2: 인체 제대에서 줄기세포 분리 및 배양
제대의 혈관 및 기타 내부요소들로부터 와튼젤리(제대의 기질)을 분리하기 위해 제대조직의 절개가 우선 이루어진다. 혈관을 제거한 후 분리된 와튼젤리는 세포의 추출을 위해 작은 조각(0.5 ㎝ x 0.5 ㎝)의 크기로 잘라진다. 외식(explant)은 상피 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 추출에 적합한 세포배양 조건이 갖추어져 있는 각기 다른 조직배양 접시에 제대 와튼젤리의 조각을 넣어 수행된다.
중간엽 세포의 분리/배양을 위해 상기의 외식된 조직은 10% 우태혈청(FBS, Hyclone)이 첨가된 5ml의 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신에 담가져 이산화탄소 세포배양기에서 37℃로 유지되었다. 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 세포의 성장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링 되었다. 신장하는 세포들은 추가적인 확장 및 냉동보관(DMEM/10% FBS 이용)을 위해 트립신처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)하였다.
상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 외식된 조직으로부터의 세포의 신장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링 되었다.
중간엽 줄기세포의 추출을 위해, 세포의 펠렛은 배지 DMEM F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신에 재 현탁 및 카운트 되었으며, 10 ㎝ 조직배양 접시에 1 x 106 세포/접시의 밀도로 접종되었다. 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교환되었다. 세포의 성장(growth) 및 클론형성은 광학현미경으로 모니터링 되었다. 약 90%의 세포수(confluence)에서, 세포들은 상기에 설명된 바와 같이 서브-배양(sub-culture)되었다.
실시예 3: 역분화용 배지 속 감태추출물의 농도에 따른 인간 유래 중간엽 줄기세포로부터 만능 줄기세포 제조
STC-F002의 농도에 따라 인간 제대 유래 줄기세포로부터 만능 줄기세포를 유도하기 위한 실험으로 대조군은 MSC의 전용 배지로 DMEM F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 기본배지로 사용하였으며, 실험군은 계대배양을 두 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배지에 제주 감태 추출물을 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖의 농도와 에너지 워터 0.1 v/v%를 첨가하였다(도 2). 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 분리하여 세척된 단핵구 세포를 6-웰 플레이트(dish)에 1 x 104 개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하여 배양하였다. 배양 결과, 감태 추출물이 1 ~ 400 ㎍/㎖ 포함하는 배지에서 콜로니가 형성됨을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 콜로니를 계대배양하여 줄기세포주를 구축
실시예 3에서 생성된 콜로니를 콜라게나아제 1 mg/ml을 처리하여, 콜로니 세포들을 분리하였으며 10% FBS와 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신가 함유된 DMEM/F12 배지에서 1X106의 세포수로 T175 flask에 접종하여 CO2 incubator에서 배양하며, 2 ~ 3일마다 배지를 교체해주고 confluency 80% 정도 되었을 때 계대배양을 실시하는 조건으로 2회 계대 배양하여 줄기세포주를 구축하였다.
실험예 1: 유도만능 줄기세포주인지 여부
실시예 4의 방법으로 배양된 세포주가 만능 줄기세포주로서의 특징을 나타내는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4의 방법으로 계대 배양된 줄기세포는 콜로니를 지속적으로 형성하는 것을 확인하였으며, 만능줄기세포의 특이적인 마커인 SSEA-4 항체를 사용하여 면역화학적 염색법을 수행하여 공초점 현미경(confocal microscope)로 분석한 결과, 콜로니 세포만 마커가 염색되었으므로 콜로니안의 세포만이 만능 줄기세포임을 확인을 하였다(도 3). 또한 이를 6개월 동안 계대 배양하여도 줄기세포가 계속하여 증식하는 것으로 보아 세포주(cell line)임을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 상기 세포주를 “EPN-1 cell”로 명명하고, 2014년 5월 30일 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학교 암연구소)에 기탁번호 KCLRF-BP-00318로 기탁하였다.
실험예 2: 만능 줄기세포의 단백질 발현 여부 분석
상기 실시예 3에서 제조된 만능 줄기세포에 대하여 배아 줄기세포의 특이 단백질인 OCT4, SOX2, SSEA4(stage-specific embryonic antigen4)의 발현 여부를 이에 대한 항체를 사용하여 면역화학적 염색법을 사용하여 단백질 발현 여부를 분석하였다. 염색 과정은 우선 4% 파라포르말데하이드(Paraformaldehyde)를 이용하여 세포를 고정한 후 PBS로 세정하고 1% BSA용액으로 블로킹(blocking)을 하였다.
OCT4, SOX3, SSEA4에 대한 1차 항체를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응 시킨 후, PBS로 세정을 하고 1차 항체에 대한 형광(FITC)이 붙은 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그후 세포의 DNA를 염색하기 위하여 hochest dye를 이용하였고 결과적으로 세포의 핵을 염색하였다. PBS로 세정을 한 후 현광현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 발현 여부를 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
단백질 염색은 FITC 를 사용하여 488nm의 파장에서 사진을 촬영하였으며 Hochest는 UV 파장인 350nm파장에서 사진을 촬영하여 FITC 파장과 겹치지 않는다. 첫 번째 그림은 각 단백질 발현과 핵에 유전자 발현에 대한 염색 결과를 의미하고, hochest는 hochest dye를 이용하여 세포의 핵을 염색한 것을 의미하며, 세 번째 그림은 이 두 그림을 합쳐서 나타내고 있다(도 4).
그 결과, 실험군에서는 제주감태 추출물의 농도가 1 ~ 400 ㎍/㎖일 때만 10일 후 콜로니가 형성하는 것이 관찰 되었으며(도 2), 만능 줄기세포 특이적 마커인 OCT4, SOX2, SSEA4가 콜로니에서만 염색되어 만능줄기세포임을 확인 하였다(도 4).
실험예 3: 만능 줄기세포의 유전자 분석 비교
상기 실시예 3에서 제조된 만능 줄기세포를 현미경으로 보면서 200 ㎕ 파이펫을 사용하여 콜로니만 떼어낸 후, TRIzol 시약(Invitrogen사 제조)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 OCT4, Sox-2, Nanog, c-Myc 및 대조유전자인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다.
Nanog, OCT4, Sox-2는 배아줄기세포에서 보이는 특징적 유전자이며, c-Myc 유전자는 배아줄기세포 및 성체세포 모두에서 양성으로 보일 수 있는 비특이적인 유전자이다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 이들 유전자의 발현을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 따르면, 유도 과정을 거치치 않은 중간엽 줄기세포(MSC)에서는 만능 줄기세포의 특징적인 유전자인 OCT4의 발현도가 낮은 반면, 본 발명의 방법에 의해 유도된 만능 줄기세포(EPN)에서는 이들 특징적인 유전자들이 현저히 높게 발현되었다. 줄기세포 유전자인 SOX2와 Nanog는 역시 중간엽 줄기세포(MSC) 보다 유도된 만능줄기세포(EPN)에서 현저히 높게 발현 되었고, 비특이적인 유전자인 c-Myc은 유도과정을 거친 세포(EPN)가 유도과정을 거치지 않은 세포(MSC) 보다 낮게 발현됨을 알 수 있었다.
실험예 4: 외배엽 세포(신경 세포)로의 분화
신경세포로의 분화를 유도하기 위하여, 본 발명에 따른 역분화용 배지(STC-F002)를 사용하여 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에 배양하여 중간엽 줄기세포로부터 만능 줄기세포를 유도한 다음 신경세포 분화용액 DMEM F-12, 2% B-27 supplement, 2 mM L-glutamin, 30 ng/㎖ EGF, 25 ng/㎖ bFGF에서 5일 동안 배양한 다음 2% FCS(Fatal Calf Serum), 25 ng/㎖ bFGF, 25 ng/㎖ BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)로 구성된 배지에서 7일간 배양하였다. 신경세포로의 분화 검증을 위해 Nestin 단백질을 면역조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 녹색형광으로 염색되어 양성반응을 보여 만능 줄기세포로 예상되었던 세포들이 외배엽성인 신경세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 내배엽 세포(간 세포)로의 분화
간세포로의 분화를 유도하기 위하여, 본 발명에 따른 역분화용 배지(STC-F002)를 사용하여 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에 배양하여 중간엽 줄기세포로부터 만능 줄기세포를 유도한 다음 간세포 분화용액 DMEM F-12, 20 nM dexamethason, 5.5 ㎍/㎖ transferring, 7 ng/㎖ sodium selenite, 100 ng/㎖ HGF, 50 ng/㎖ FGF, 10 ㎍/㎖ insulin에서 3주 동안 배양하였다. 간세포로의 분화 검증을 위해 α-fetrotein 면역조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 녹색 형광으로 염색되어 양성반응을 보여 만능 줄기세포로 예상되었던 세포들이 내배엽 세포인 간세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 중배엽 세포(연골, 골아 세포)로의 분화
연골세포로의 분화를 유도하기 위하여, 본 발명에 따른 역분화용 배지(STC-F002)를 사용하여 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에 배양하여 중간엽 줄기세포로부터 만능 줄기세포를 유도한 다음 연골세포 분화용액 DMEM F-12, 0.1 uM dexamethason, 50 ㎍/㎖ AsA(Acetylsalicylic Acid), 100 ㎍/㎖ sodium pyruvate, 40 ㎍/㎖ proline, 10 ng/㎖ TGF-β1, 5% ITS(Insulin-Transferrin-Selenium ; 6.25 ㎍/㎖ insulin, 6.25 ㎍/㎖ transferring, 6.25 ng/㎖ selenius scid), 1.25 ㎎/㎖ bovine serum albumin, 5.35 ㎎/㎖ lioleic acid에서 2주 동안 배양하였다. 연골세포로의 분화 검증을 위해 Alcian blue 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 Alcian blue 양성반응을 보여 만능 줄기세포로 예상되었던 세포들이 중배엽 세포인 연골세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 골아세포로의 분화를 유도하기 위하여, 본 발명에 따른 역분화용 배지(STC-F002)를 혼합한 배지를 사용하여 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에 배양하여 중간엽 줄기세포로부터 만능 줄기세포를 유도한 다음 골아세포 분화용액 DMEM F-12, 2uM dexamethasone, 10mM β-glycerol phosphate, 0.3mM ascorbic acid, 1uM BMP (bone morphogenic protein)에서 2주 동안 배양하였다. 골아세포로의 분화 검증을 위해 Von kossa 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 Von kossa에 양성반응을 보여 만능 줄기세포로 예상되었던 세포들이 중배엽 세포인 골아 세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRF-BP-00318
수탁일자 : 20140530
Figure PCTKR2014007207-appb-I000001

Claims (10)

  1. 다음의 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주(induced pluripotency stem cell line)를 제조하는 방법:
    (a) 인간의 탯줄로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지로 콜로니를 형성시키는 단계; 및
    (c) 상기 콜로니를 계대배양하여 유도만능 줄기세포주를 수득하는 단계;
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 역분화용 배지는 감태(Ecklonia cava) 추출물과 에너지워터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주를 제조하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 감태 추출물은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxII complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 배지에 포함되는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주를 제조하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 감태 추출물은 배지 조성물 기준 1 내지 400 ㎍/㎖ 포함된 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주를 제조하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 역분화용 배지는 에너지워터 0.01 내지 10 v/v%를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주를 제조하는 방법.
  6. 중간엽 줄기세포를 감태 추출물(Ecklonia cava)을 포함하는 역분화용 배지에 배양하여 역분화된 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318).
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 역분화용 배지는 감태 추출물(Ecklonia cava)을 배지 조성물 기준 1 내지 400 ㎍/㎖로 포함하는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318).

  8. 제 6 항에 있어서, 상기 유도만능 줄기세포주는 Oct-4, SOX-2, 또는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen)에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318).
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 만능 줄기세포주는 배아유사체로 외배엽 세포, 내배엽 세포, 중배엽 세포로 자연분화할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 유도만능 줄기세포주 EPN-1(기탁번호:KCLRF-BP-00318).

  10. 제 6 항의 유도만능 줄기세포주(기탁번호:KCLRF-BP-00318)를 포함하는 세포 치료용 조성물.
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