KR100939361B1

KR100939361B1 - 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을통해 혈관 세포로 분화할 수 있는 혈관 줄기세포를제조하는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포 치료제로서의용도

Info

Publication number: KR100939361B1
Application number: KR1020080026420A
Authority: KR
Inventors: 유승권; 윤병선; 김보나; 문재희; 정혜연; 맹이삭; 전은경; 박규만
Original assignee: 주식회사 스템메디언스
Priority date: 2008-03-21
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2010-01-29
Also published as: KR20090100901A

Abstract

본 발명은 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍의 과정을 통해 혈관 내피 전구세포로 분화시키는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 여성의 소음순으로부터 분리한 성체세포를 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에 배양하였을 때 다분화능을 유지하면서 대량 증식이 가능하였다. 상기 세포를 MAPC배지에 VEGF를 처리하여 혈관 내피 전구세포로 분화가 가능하였다. 또한, 상기 성체세포를 EBM-2 기본 배지, 2% FBS, 0.04% 하이드로코티손, 0.4% bFGF, 0.1 %VEGF, 0.1% IGF-1, 0.1% 비타민C, 0.1% EGF, 0.1% GA-1000 및 0.1% 헤파린으로 이루어진 EGM-2 배지에서 배양하였을 때 혈관 내피 전구세포로 분화 유도시킬 수 있었다. EGM-2 배지의 과정을 거쳐서 분화 유도를 함으로써 소음순에서 분리한 성체세포가 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 혈관 내피 전구세포로 분화유도가 가능한 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같이 분화된 혈관 내피 전구세포는 허혈성 혈관질환 및 기타 심혈관계 치료에 이용할 수 있다.

성체세포, 리프로그래밍, reprogramming, 분화, 혈관 내피 전구세포, 로우 글루코즈 DMEM 배지, MAPC 배지, EGM-2 배지

Description

여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을 통해 혈관 세포로 분화할 수 있는 혈관 줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포 치료제로서의 용도{A method for preparing blood vessel stem cells from women labia minora skin cells by reprogramming method, and use of reprogrammed blood vessel endothelial cells as a cell therapy product}

본 발명은 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 다분화성의 성체세포를 분리한 후 로우 글루코스에서 배양하여 수득한 다분화성의 성체세포, 이를 이용하여 리프로그래밍(reprogramming)에 필요한 체외 배양 조건에서 혈관 내피 전구세포로의 전환을 획기적으로 증가시킬 수 있는 방법 및 상기 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 생성된 혈관 내피 전구세포의 허혈성 혈관질환 및 기타 심혈관계 치료 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 무한한 범위까지 분열하는 능력이 있고 다른 유형의 세포를 형성하기 위해 적합한 환경 하에서 적합한 자극을 통해 분화하는 능력을 가지는 세포이다. 줄기세포는 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지며, 다양한 질병에서 효율적인 치료수단으로 많은 연구가 행해지고 있다.

다른 유형의 세포로 분화하기 위한 줄기세포들의 다른 잠재력의 차이를 기준으로, 지금까지 배아줄기세포와 성체줄기세포 사이에 구분이 있어 왔다. 수정란 세포로부터 배아단계로, 성체 유기체로 발달하면서 줄기세포의 잠재력이 줄어든다는 것이 일반적으로 일치된 의견이다. 이러한 성질에 따라, 수정란세포는 만능(toticpotent)이라 일컬어지고, 배아줄기세포는 전분화능(pluripotent)이라 일컬어지고, 성체줄기세포는 다능성(multipotent)이라 일컬어진다.

만능 줄기세포는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 세포이다. 만능세포는 수정란세포와 함께 초기 배아단계의 세포들을 포함한다. 전분화능은 전형적으로 분열된 배반포의 내세포덩이(intermal cell mass)로부터 얻어지는 배아줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세 가지 배엽 세포 모두로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다.

그러나 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로,적은 범위까지 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려졌다. 따라서 조직특이 줄기세포는 오직 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있는 것이다. 성체줄기세포는 중추신경계 (central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc . Natl Acad . Sci . USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다. 그 예로 신경 줄기세포(neural stem cells)은 뉴런과 신경아교세포(glial cell)로, 골수중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 중배엽 세포(mesodermal cell)로 분화가 가능하며, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)는 혈액에 관련된 세포로 분화가 가능하다. 구체적 예는, 시각장애 치료에 있어서 각막 외부의 표피 줄기세포(epithelial stem cells) (Cell 57, 201-209, 1989)는 각막이식의 새로운 방법으로 부각되고 있다 (N. Engl . J. Med . 343, 86-93, 2000). 그리고 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells)의 경우 자가이식을 통한 치료에 이용할 수 있다(Blood Cells 20, 15-24, 1994).

그러나 최근에는 이들 성체 줄기세포가 같은 계통뿐만 아니라 다른 종류의 계통으로 분화됨으로써 이전에 알려졌던 것보다 성체줄기세포의 분화가 더 가능할 것으로 분석되며 이에 대한 연구가 진행 중이다. 골수조직(WO 02/064748) 또는 재생조직으로부터(WO 02/057430) 얻어진 성체줄기세포를 이용한 연구가 타겟 조직으로의 이식, 피더세포(feeder cell)층 위에서의 배양 및/또는 특정 성장인자의 존재 하에서의 배양과 같은 조건 하에서, 다른 배엽의 세포유형을 형성하기 위해 각각의 줄기세포의 분화도 일어날 수 있다는 것을 증명했다. 따라서 성체줄기세포가 동일 계통으로만 분화가능하다는 견해는 수정되어야만 했다. 예를 들면, 신경 줄기세포(neural stem cell)가 in vivo에서 혈액(Science 283, 534-537, 1999)과 골격근 세포(skeletal muscle cells) (Nature Neurosci. 3, 986-991, 2000)로 분화됨을 증명하였으며, 이식된 골수 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 골격근 세포(skeletal muscle cell) (Nature 401, 390-394, 1999; Science 279, 1528-1530, 1998)와 간세포(liver cell) (Science 284, 1168-1170, 1999)로 분화되었고, 뇌에 이식하였을 경우 신경 마커(neuronal marker)가 발현됨을 확인하였다 (Science 290, 1779-1782, 2000; Science 290, 1775-1779, 2000).

그렇지만, 이런 줄기세포를 분리하는데 많은 어려움이 따른다. 그 예로 중추신경계(central nervous system)나 골수(bone marrow), 망막(retina), 골격근 세포(skeletal muscle cells)와 같은 부위를 인간의 몸에서 분리하기란 많은 어려움과 고통이 따르기 때문이다. 특히 중추 신경계(central nervous system)과 같은 경우는 분리하는데 위험도가 크기 때문에 사실상 불가능하다.

또한, 성체 줄기세포를 얻는다고 하여도 성체줄기세포를 이용하여 세포치료를 하기에는 역부족이다. 첫 번째 이유로 세포치료를 하기 위해서는 많은 수의 세포들이 필요한데, 지금까지 제시된 방법에서는 그에 대한 세포수를 충족할 수 없기 때문이다. 두 번째 이유는 경제성인데, 현재 제시된 연구결과는 세포 치료를 하는데 있어서 많은 재료(배지 내 포함되어 있는 cytokine 등)를 필요로 한다. 세포배양에 첨가되는 재료들은 대부분 고가의 재료이기 때문에 경제적으로 효율성이 떨어진다.

따라서, 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복할 수 있도록 줄기 세포 성격을 갖는 세포를 대량으로 증식시켜서 세포치료에 이용할 수 있는 방법을 제시하고, 보다 적은 재료를 이용하여 세포의 수를 늘린 후, 세포치료에 이용하여 더욱 경제적으로 세포치료를 할 수 있는 방안을 제시하고자 하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 인간의 몸을 구성하는 기관 중 가장 접근하기 쉽 고 넓은 면적을 차지하는 피부 중 소음순에 초점을 맞추었다. 성체줄기 세포를 분리할 수 있는 곳은 다양하지만 최근에 피부에서도 성체줄기 세포를 분리할 수 있다고 보고되고 있다. 처음 피부에서 다분화능을 가진 성체줄기세포를 분리한 프레다 디, 밀러(Freda D, Miller)는 설치류의 등가죽을 사용하여 줄기세포를 분리하였다. 이 줄기세포는 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 지방세포(adipocyte)로 자발적인 분화가 일어났으며, 피부의 진피에서도 성체줄기세포의 존재를 확인(Nature cell biology 3, 778-784, 2001)하였으며, 설치류의 피부에 존재하는 성체줄기세포가 모낭에 있는 진피 유두에 존재한다는 것을 증명하였다(Nature cell biology 6, 1082-1093, 2004). 2004년 시드하르탄 찬드란(Siddharthan Chandran)은 사람의 피부에서 성체줄기세포를 분리하여, 뉴런, 지방세포(astrocyte), 평활근 세포(smooth muscle cell)로 분화를 시켰으며, 지방세포(astrocyte)의 경우 칼슘 이미징(calcium imaging) 분석을 통하여 분화된 지방세포(astrocyte)의 기능을 확인하였다(The Lancet 364, 172-178, 2004). 인간의 포경수술 후 나오는 표피 조직으로부터 성체줄기세포를 분리하여 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근 세포(smooth muscle cells)로 분화시켜 사람의 피부조직에서 성체줄기세포의 존재를 확인하였다(Stem Cells 23, 727-737, 2005).

그러나, 아직까지 여성의 소음순에서 성체줄기세포를 추출하고 이를 다분화능을 가진 성체줄기세포로 배양하는 방법에 관하여는 개시된 바 없다. 그리고 체외에서 손쉽게 대량 생산 가능한 소음순 유래 줄기세포를 이용해서 혈관 내피 전구세포로 분화를 유도해 대량생산이 가능한 세포치료제의 임상적용 가능성에 관한 연구 도 보고된바 없다.

그동안 혈관계 질환의 치료에 높은 치료가능성을 가질 것이라 생각되어지는 혈관 내피 전구세포는 골수(Br J Haematol 115, 186-194, 2001), 말초 혈액(Science 275, 965-967, 1997; Blood 95 ,952-958, 2000), 탯줄 혈액(Blood 95 , 952-958, 2000; J Clin Invest 105 , 1527-1536, 2000)에서 얻어졌다. 그리고 수많은 동물 실험을 통해서 상기 혈관 내피 전구세포가 말초혈관질환(Blood 105 , 1068-1077, 2004; Circ Res 85 , 221-228; 1999; Proc Natl Acad Sci USA 97 , 3422-3427, 2000; J Clin Invest 106 , 571-578, 2000), 관상동맥질환(Circ Res 85, 221-228, 1999; Circ Res 90 , e89-93; 2002; Circulation 107 , 461-468, 2003), 뇌혈관질환( Stroke 33 , 1362-1368, 2002; Circ Res 90 , 284-288, 2002)에 효과적이라는 것을 보여주었다. 그러나 세포 이식과 치료에 사용될 정도의 적절한 세포 수를 얻는 것이 힘들고 분리의 반복성이 떨어지며 분리된 혈관 내피 전구세포의 체외에서의 대량생산에는 한계가 있었다. 이로 인해 혈관계 질환의 치료에 효과적인 세포치료제의 재료가 될 수 있는 혈관 내피 전구세포의 대체 근원을 찾기 위해 지속적으로 탐구해왔다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 다분화능을 가지면서 손쉽게 체외 배양이 가능한 성체세포를 얻고, 상기 체외에서 대량 생산이 가능한 소음순 유래의 성체세포를 간단히 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지 배양조건에서 분화능을 유지하면서 대량으로 증식시킨 뒤에 혈관 내피 세포로의 분화를 유도하였다. 기존 의 알려진 조건으로 분화를 유도하였을 때, 혈관 내피 세포로의 분화세포가 생성되었으나, 성체세포를 로우 글루코스 조건에서 오랫동안 배양하는데 어려움이 있어서 이 방법은 한계점을 보이고 있다. 따라서, 본 발명에서는 소음순에서 분리한 성체세포를 리프로그래밍이라는 과정을 통해 좀 더 효율적으로 혈관 내피 세포로 분화시킬 수 있는 방법을 제공하고자 하였다. 로우 글루코스에서 배양하고 있던 세포를 혈관 내피 전구세포로의 분화를 EGM-2 배지 조건에서 유도를 한 후에, 인 비트로와 인 비보에서 혈관 내피 세포로의 분화를 유도할 수 있었다. 이와 같은 상기 혈관 내피 전구 세포의 허혈성 질환 치료 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 여성의 소음순 유래 성체줄기세포를 혈관 내피 전구 세포로 분화 유도하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 외배엽 전구세포로부터 혈관 내피 전구세포로의 분화를 유도하여 혈관 내피 세포의 획득이 현저히 향상되는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 분화된 혈관 내피 전구 세포를 포함하는 허혈성 혈관질환 및 기타 심혈관계 치료용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫 번째 양태에서는 여성의 소음순으로부터 다분화성 성체줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

여성의 소음순 조직은 남성의 포경수술 후 나오는 표피와 그 기원이 같기 때문에 여성의 조직인 소음순에서 줄기세포를 추출하여 성체 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 규명을 통하여 남성뿐만 아니라 여성 또한 세포치료가 가능할 수 있게 되었다. 또한 소음순의 경우 조직 내에 존재하는 섬유 등의 구성 비율이 적기 때문에 조직의 양에 비해 많은 수의 세포를 획득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 여성의 소음순 유래 성체줄기세포는, 여성의 소음순 조직을 분리하여 진피조직을 얻고, 상기 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 상기 분리 된 세포를 로우 글루코스(low glucose) DMEM 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다.

즉, 여성의 소음순 조직을 분리하여 진피를 얻고 진피에서 케라티노사이트를 블레이드로 긁어낸 다음, 상기와 같은 방법으로 얻어진 진피조직에서 세포를 분리하고 로우 글루코스(low glucose) DMEM 배지에서 배양하여도 1과 같은 소음순 유래 성체줄기세포를 획득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 상기 로우 글루코스(low glucose) DMEM 배지는 5~15%의 FBS, 바람직하기로는 10%의 FBS를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 로우 글루코스(low glucose) DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 용액을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 로우 글루코스(low glucose) DMEM 배지는 성체줄기세포를 배양시키는 동안 상기 성체줄기세포의 분화능을 유지할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 두 번째 양태에서는 상기 방법으로 수득되고, 하기의 특성을 나타내는 성체줄기세포를 제공한다:

(1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

(3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(4) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명의 세 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체줄기세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 여성의 소음순 유래 성체세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 두 가지 방법을 통해서 가능하다.

첫 번째로, 본 발명의 여성의 소음순 유래 성체세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM, 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양조건에서 배양하는 단계; 및

상기 단계에서 배양된 성체세포를 MAPC 배지에서 VEGF를 10 ng/ml 처리하면서 배양하는 단계.

두 번째로, 본 발명의 여성의 소음순 유래 성체세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

상기 로우 글루코스에서 배양된 성체세포를, EBM-2 기본 배지, 2 % FBS, 0.04 % 하이드로코티손, 0.4 % bFGF, 0.1 % VEGF, 0.1 % IGF-1, 0.1 % 비타민C, 0.1 % EGF, 0.1 % GA-1000 및 0.1 % 헤파린으로 이루어진 EGM-2 배지 배양 조건에서 추가로 배양하는 단계.

본 발명에서, 상기 MAPC 배지는 60 % DMEM, 40 % MCDB, 5 μg/ml 인슐린(Insulin), 5 μg/ml 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 5 ng/ml 셀레늄(selenium), 10^-8 M 덱사메타손(dexametasone), 10^-7M 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함할 수 있다.

상기 배양 조건에서 배양하던 세포를 마트리젤(matrigel)이 코팅(coating)된 플레이트(plate)에서 혈관 내피 세포로 분화시킬 수 있다.

종래 허혈성 혈관 질환 및 심혈관계 질환의 치료를 위한 혈관 내피 전구세포는 골수나 말초혈액, 탯줄 혈액에서 분리해서 사용했으나 각각의 근원 조직에서 분리할 수 있는 세포수가 적고 분리의 효율성이나 반복성이 떨어지며 체외 배양이 힘들었기 때문에 세포 치료에 사용할 만큼 수를 얻기 힘들었다.

그러나 본 발명에서는 소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 이루어진 배지 조건에서 배양함으로써 상당히 오랜 시간 동안 다분화능을 잃지 않으면서 계대배양을 통하여 세포치료에 필요한 충분히 많은 양의 세포를 얻을 수 있었다.

상기 소음순 유래로부터 얻어진 다분화능 성체세포는 중간엽줄기세포의 성격을 가지고 있어서, 단순히 동일한 계통이 아닌 다른 계통의 기관으로도 분화할 수 있다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 신경, 근육 등으로 분화할 수 있는 원시 세포로서, 구체적으로는, 빛에 반응하고 이러한 반응을 뇌에 전달할 수 있는 능력을 가진 망막 세포, 뼈를 만드는 조골세포, 뼈를 흡수하는 파골세포 또는 연골을 제조하는 연골세포, 근세포, 내피세로, 상피세포, 심장, 폐, 간, 신장 또는 췌장세포 등 다양한 기관으로 분화할 수 있다. 본 발명에 따르면 소음순의 진피조직의 제거와 같은 작은 수술로 세포를 분리하여 약간의 조직만으로도 많은 수의 중간엽 줄기세포의 성질을 가진 세포를 얻을 수 있어, 이를 줄기세포의 이식이 필요한 다양한 질병에 이용하는 것이 가능해진다.

도 4의 소음순 유래의 성체세포의 면역학적 표현형이 중간엽 줄기세포와 비슷하게 CD13, CD29, CD44, CD90에 양성이라는 것을 보여주고 있다. 그리고 도 3은 실제로 소음순 유래의 줄기세포가 중간엽 줄기세포처럼 뼈, 지방, 연골 세포로의 분화능을 가지고 있다는 것을 보여주었다.

상기와 같이 로우 글루코스 DMEM, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 이루어진 배지에서 중간엽 줄기세포와 유사한 성격을 가지고 다분화능을 유지하면서 대량 증식이 된 세포를 혈관 내피 세포로의 분화를 유도하는 배지로 바꾸어주었다. 즉, Fibronectin을 코팅을 하고 MAPC 배지에 VEGF를 첨가하여 성체세포를 배양한 결과 혈관 내피 세포로의 분화가 유도되었다(도 5D 및 도 5E). 또한 다른 방법인 reprogramming의 과정을 거치는 방법으로 로우 글루코스에서 배양하고 있던 세포를 EBM-2 기본 배지에 FBS, 하이드로코티손, bFGF, VEGF, IGF-1, 비타민C, EGF, GA-1000, 헤파린이 추가로 들어간 EGM-2 배지 배양 조건에서 혈관내피세포의 표현형과 기능을 가지는 세포로의 분화가 유도되었다(도 6 및 도 7).

본 발명의 네 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 줄기세포를 분화시켜 얻은 혈관 내피 전구세포의 혈관질환 치료를 위한 세포치료제로서의 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 혈관질환으로는 허혈성 혈관질환 및 심혈관계 질환이 포함된다.

본 발명에 있어서, 혈관 내피 전구세포로 치료 가능한 구체적인 허혈성 혈관질환으로는 허혈성 근육괴사, 부정맥, 협심증, 뇌졸중 등이 있다.

본 발명에 있어서, 혈관 내피 전구세포로 치료 가능한 구체적인 심혈관계 질환으로는 동맥경화증, 허혈성 재관류 손상, 재발협착증, 동맥 염증, 혈관벽 재형성, 심실 재형성, 속심실 조율, 관산 미세색전증, 빈맥, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 벤딩, 관상 동맥 결찰, 부정맥, 뇌졸중, 협심증, 심근경색, 심부전, 고혈압 등이 있다.

본 발명의 소음순 유래의 줄기세포에서 분화된 혈관 내피 전구세포는 신생혈관 형성을 통해 만성 혹은 급성 허혈성 하지 근육이 괴사가 일어나는 것을 막을 수 있는 것으로 확인되었다.

더 나아가, 본 발명에서 소음순 유래 줄기세포로부터 분화된 혈과 내피 전구세포는 급성 경색 후의 심근의 정상적인 기능회복에 도움을 줄 수 있으며 그 밖에 스텐트나 인공 장기나 기타 이식된 의료 장치의 이식 후 혈관생성을 도와 이식술의 효율을 향상시키는데 도움을 줄 수 있다. 또한, 이 외에도 혈관의 복원, 재생을 통해 다른 심혈관계 질환의 근본적인 치료에 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 분화된 혈과 내피 전구세포는 치료를 위해 상기 혈과 내피 전구세포를 포함하는 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료 시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.

줄기세포를 치료제로 사용하는 경우 적절한 투여량은 1회당 10⁴~10⁶cells/회이다.

본 발명은 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포로서 여성의 소음순으로부터 다분화능을 가지면서 손쉽게 체외 배양 가능한 성체줄기세포를 얻고 이를 혈관 내피 전구세포로 분화시킴으로써 종래 허혈성 혈관질환 및 기타 심혈관계 치료의 한계를 극복할 수 있는 세포 치료제로 적용 가능한 새로운 줄기세포를 제공할 수 있다. 동물 실험을 통해 유효성이 입증된 말초 혈액이나 골수, 탯줄 혈액 유래의 혈관 내피 전구세포는 세포치료에 사용되어질 만큼의 세포수를 얻는 것이 힘들고 분 리의 반복성도 떨어지며 체외에서 대량 생산이 어려웠으나, 본 발명을 통해 얻은 성체줄기세포는 체외에서 손쉽게 대량 생산을 할 수 있고 간단히 혈관 내피 전구세포로 분화를 시킬 수 있어서 대량생산이 가능한 세포치료제의 근원 세포가 될 수 있으며 이를 통해 세포 치료제의 대량 생산이 가능하다. 또한 자기 자신의 세포를 이용하기 때문에 면역거부 반응과 같은 부작용도 없어서 효과적인 세포치료제가 될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 소음순 유래 성체세포를 이용하여 혈관 내피 전구세포로 유도를 하기 위한 리프로그래밍의 조건 확립

소음순에서 분리한 성체세포를 이용하여 혈관 내피 세포로의 분화를 유도하기 위한 방법으로 도 1에서 제시하고 있는 바와 같이 경로(pathway) I과 경로(pathway) II의 두 가지 방법을 사용하였다. 우선, 소음순에서 분리한 세포는 로우 글루코스 조건에서 배양을 하였는데, 이와 같은 조건을 조건(condition) I로 명명하였다. 따라서 Condition I은 로우 글루코스 DMEM 에 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 배지조건을 의미한다. 첫 번째 pathway는 일반 적으로 중간엽 줄기세포를 분화시키는 대표적인 방법으로 condition I에서 배양하고 있던 세포를 각각의 분화 조건을 주어 분화를 유도한 결과를 나타낸다. 여기서는 기본적으로 지방 세포, 연골세포 등으로 분화가 유도되는 결과를 보았고, 또한 혈관 내피 세포로의 분화 조건을 주어 분화를 유도하였다. 이와 같은 방법으로 분화시킨 것이 pathway I이라고 할 수 있다. 본 발명자는 또 다른 방법으로 pathway II의 방법을 제시하였다. 소음순에서 분리한 성체세포를 EGM-2배지 조건에서 혈관 내피 전구세포로의 분화를 유도하고, 이를 인 비트로와 인 비보에서 혈관 형성의 능력이 있는지를 확인하였다. EGM-2배지 조건을 condition II로 하여 condition I에서 II를 거쳐 혈관 세포로 분화를 유도한 경우를 pathway II로 명명하였다. 이와 같은 방법은 분리한 성체세포를 reprogramming과정을 통해 혈관 세포로 분화를 유도시킨 것을 의미한다.

실시예 2: 소음순 유래 성체세포의 분리

여성 의원으로부터 40대 후반 여성의 음부 성형 및 질공 축소 시술을 받은 환자의 소음순 조직을 얻어서 이를 가지고 성체세포를 분리하였다.

먼저, 박테리아로부터의 오염을 방지하기 위해 70% EtOH에 약 30초간 담궈 두어 소독을 한 다음, 항생제가 들어있는 PBS로 5번 세척하였다. 응고된 혈액을 제거한 다음 1 ㎠ 크키로 소음순 조직을 절단하였다. 조직을 5 unit / ml의 디스파제(dispase) 용액에 4℃에서 밤새 배양(incubation)하였다. 표피는 포셉(forcep)를 이용하여 제거하였으며, 표피와 진피 사이에 존재하는 케라티노사이 트(keratinocyte)와 분비선을 제거하기 위하여 멸균된 블레이드(blade)로 긁어내었다. 진피 조직을 1mm²크기로 자른 다음 5%의 콜라게나제(collagenase IV)(Gibco, USA)에서 30분~1시간 배양(incubation)하였다. 배양(incubation) 후 시료를 원심분리하여 디스파아제(dispase)를 제거한 후, 배지에 부유시켰다. 피펫를 이용하여 조심스럽게 피펫팅하여 조직으로부터 세포들을 분리하였다. 조직과 단일 세포들을 분리하기 위하여 70μm 세포 스트레이너(cell strainer)(BD sciences, UK)를 이용하여 분리시켰다. 분리된 세포를 원심분리하여 모은 후, 로우 글루코스 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 기본 배지에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩(seeding)하였다. 24시간 후 배지을 바꾸었다. 24시간 후의 대부분의 세포는 세포 배양 접시에 부착되어 있으며, 외형은 소음순 진피의 형태를 가지고 있으며, 도 2과 같은 세포외형을 가지고 있었다. 배지는 2일마다 교환해주었으며 90% 세포 밀도 일 때 계대 배양하였다.

실시예 3: 소음순으로부터 분리한 세포의 핵형 분석

소음순 유래 줄기세포를 로우 글루코오스 DMEM를 통해 대량으로 배양을 한 후 핵형분석을 위해 중기(metaphase) 단계에서 0.1 g/ml 콜세미드 (colcemid)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 그런 다음 트립신 처리 후 저장성(hypotonic) KCl 용액을 통해 재부유하고 37℃에서 20분 동안 항온보관 하여 메탄올(methanol):아세트산(acetic acid)의 3:1 용액에 담근 뒤 염색체를 지-밴드 스 테이닝(G-band staining)을 통해 시각화 하였다(도 3).

실시예 4: 소음순 유래의 성체세포의 중간엽 줄기세포와의 유사성 확인

소음순 유래 성체세포는 중간엽 줄기세포의 성격을 가지고 있어서, 단순히 동일한 계통이 아닌 다른 계통의 기관으로도 분화할 수 있는 다분화능을 가지는 것으로 확인되었다.

먼저 유세포 분석기를 통해서 면역학적 표현형을 분석한 후 소음순 유래의 성체세포가 중간엽 줄기세포와 같이 CD13, CD29, CD44, CD90이 발현되는 것이 확인되었다(도 4). 대표적인 마커들의 발현을 중간엽 줄기세포와 비교를 하면서 RT-PCR로 확인을 하였다. 또한, 면역형광염색법을 사용하여 대표적인 마커들의 발현을 확인하였다. 그리고 이런 표면의 발현은 중간엽 줄기세포에 특이적이지 않기 때문에 중간엽 줄기세포의 성격을 나타내는 대표적인 특성인 뼈, 지방, 연골로의 분화능을 비교해 보았다. 소음순유래의 성체세포는 중간엽 줄기세포와 마찬가지로 뼈, 지방, 연골로의 분화능을 가진다는 것을 RT-PCR와 뼈, 지방, 연골에 특이적인 염색법을 이용해서 확인하였다(도 5A-C). 그리하여 본 발명에서 분리한 세포는 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 가지는 세포라는 것이 확인되었다.

실시예 5: 소음순 유래의 성체세포의 pathway II 방법을 이용한 혈관 내피 전구세포로의 분화유도

로우 글루코스 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 으로 구성된 배지인 condition I에서 배양하고 있던 세포를 재부유시켜 100 mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩(seeding)된 세포가 어는 정도 자라서 안정화되고 난후 세포가 90%이상 차면 다시 계대배양해서 원하는 만큼의 세포로 체외 배양하였다. 그런 후 70~80% 정도로 세포가 배양 용기에 차면 EBM-2 기본 배지에 FBS, 하이드로코티손, bFGF, VEGF, IGF-1, 비타민C, EGF, GA-1000, 헤파린이 추가로 들어간 EGM-2 배지로 배지를 교체하였다. 배지는 이틀에 한번 정도 교환해주었다. 때때로 세포의 성장 양상을 보고 세포의 계속적인 증식을 위해서 세포가 배양용기의 90% 이상 되면 계대배양을 해주었다.

일주일 이상 분화된 소음순 유래의 성체세포가 혈관 내피세포로 분화유도가 되었는지를 먼저 세포의 모양이 조약돌 비슷한 모양으로 바뀌는지를 확인하고(도 6A), 이때의 세포에서 RNA를 추출하고 RT-PCR의 방법을 사용하여 혈관 내피 전구세포에 특이적인 마커인 CD31 (PECAM), CD34, VE-Cadherin, vWF, eNOS의 발현을 mRNA 레벨에서 확인하였다(도 6C). 또한, 이때의 세포가 CD31과 CD34가 발현이 되고 있는지를 확인하기 위해서 FACS analysis방법을 사용하여 확인하였다. 마지막으로 면역학적 형광 염색을 통해서 CD31 (PECAM)과 vWF의 단백질이 각각 세포표면과 세포질에서 발현된 것을 단백질 레벨에서 확인하였다(도 6D).

그리고 소음순유래의 성체 줄기세포가 혈관 내피 전구세포를 유도하는 배지 배양조건에서 분화되어 실제로 혈관과 유사한 네트워크 구조를 형성할 수 있는 것을 확인하였다(도 7). 먼저 4-well 세포배양 접시를 마트리젤(matrigel ,8mg/ml)로 코팅한 후, 1×10⁵개/ml의 세포부유액 0.5 ml를 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 12 h, 24 h후 각각 혈관과 유사한 네트워크 구조를 가지는 지를 관찰하였다. 그 결과, condition II에서 분화시킨 세포(b)는 분화시키지 않은 세포(a)에 비해서 약 100배에 해당하는 수의 완전한 튜불(tubule) 구조를 가진다는 것을 알 수 있었다(도 7A 및 도 7B).

혈관 내피 세포의 대표적인 기능인 Dil-AC-LDL을 흡수할 수 있다는 점은 형광 현미경을 통한 관찰을 통해 확인하였다(도 7C). 도 7C는 10 μg/ml의 농도로 Dil-AC-LDL이라는 형광을 띠는 LDL유사체를 condition II에서 1주일 분화시킨 세포에 넣고 6시간 정도 배양했을 때 세포(b,c)가 이를 흡수한다는 것을 보여주고 있다.

실시예 6: 본 발명 혈관 내피 전구세포의 허혈성 질환 치료 효과 확인

상기 실시예 5에서 혈관 내피 전구세포를 유도하는 배지 배양조건에서 분화시켜 얻은 세포가 허혈성 사지를 가진 질환 동물 모델에게 주입되었을 때 혈관이 형성되었다는 것을 인간 세포 특이적인 항체를 이용한 면역학적 형광 염색을 통해서 확인하였다(도 8). 또한, 실제로 혈관의 형성을 통해서 근육괴사를 막을 수 있음을 확인함으로써 본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 분화된 혈관 내피 전구세포가 허혈성 질환에 효과적이고 직접적인 치료효과를 가짐을 알 수 있었다(도 8). 도 8A에서 제시하고 있는 바와 같이 condition I에서와 II에서 인젝션을 한 경 우에 발의 괴사(foot necrosis)가 발생하는 비율이나 사지의 손상(limb loss)이 일어나는 비율이 condition I보다 II에서 현저히 떨어지는 결과를 보여, pathway II 방법으로 분화를 유도시킨 세포가 인 비보에서 혈관 생성의 기능을 하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

동물 실험을 위해서 200-250 g의 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 래트(rat)에 케터민(ketamine)과 질라진(xylazine)을 피하에 주사해서 (80 mg/kg + 10 mg/kg, SC) 마취시킨 후 대퇴부 대동맥 절개수술을 통해서 허혈성 사지동물을 만들어냈다. 대퇴부 대동맥 절개수술을 위해서 피부를 절개한 후 장골 대동맥(external iliac artery)에서 대퇴부 대동맥(femoral artery)으로 분기하는 지점과 대퇴부 대동맥에서 복재동맥(saphenous artery)과 슬와동맥(popliteal artery)으로 분기하는 부위를 5-0 실크실을 이용해서 결찰한 후 결찰한 사이 부위를 절개해서 제거해내었다. 수술 후 면역 억제를 위해서 시클로스포린-A(cyclosporin-A)를 20mg/kg씩 복강에 매일 주사하였다. 수술 후 3시간 뒤 쥐를 무작위로 두 그룹으로 나누고 1×10⁶개의 분화된 세포를 50㎕의 혈청없는 EGM-2 배지(condition II)에 부유시킨 후 대퇴부 대동맥 절개술을 받은 넙적다리 안쪽근육으로 4군데에 나누어 주사하였다. 그리고 대조군으로 PBS나 분화시키지 않은 세포(condition I에서 배양한 세포)를 대퇴부 대동맥 절개술을 받은 다리 근육 안으로 주사하였다.

4주 후 뒷다리 근육의 조직을 냉동절편(cryosection)으로 만든 후 면역학적 형광 조직 염색과 H&E 염색을 통해서 혈관이 형성되었는지와 다리근육의 괴사정도 로 치료효과를 검증해보았다. 대조군으로서 분화시키지 않은 세포를 주사한 도 10의 A의 냉동 절편 사진에서는 주사한 세포가 이동하지 못하고 혈관 형성도 하지 못해서 다리 근육이 대규모로 괴사가 일어난 것을 보여주고 있다. 그러나 condition II에서 분화시킨 세포를 주사한 도 8의 B의 냉동 절편 사진은 혈관이 형성되고 그로 인해 주위의 근육이 괴사되는 것을 막아 치료효과가 있음을 보여주고 있다. 또한, 면역형광염색법을 통해 확인한 결과 대표적인 마커인 CD31과 vWF가 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 8C).

도 1은 소음순으로부터 분리한 성체세포를 혈관 내피 세포로 분화유도하는 방법을 간략히 도시한 것이다. pathway I은 성체세포를 MAPC 배지에 VEGF가 포함된 배양 조건에서 배양함으로써 분화유도를 하는 경로 즉, 방법을 나타낸 것이고, pathway II에서는 condition II 단계를 거치면서 리프로그래밍(reprogramming)을 유도하고, 혈관 내피 세포로 분화시키는 방법을 나타낸다. Condition II은 EGM-2배지 조건으로 EGM-2배지는 EBM-2 기본 배지에 hydrocortisone, GA-1000, 2% FBS, 0.4% bFGF, 0.1% VEGF, 0.1% IGF, 0.1% vitamine C, 0.1% EGF를 포함하고 있다. 이와 같은 과정을 통해 소음순에서 분리한 성체세포가 reprogramming 과정을 거쳐 혈관 내피 세포로 분화가 유도된다는 것을 보여주고 있다.

도 2는 소음순에서 분리한 세포의 모양을 현미경으로 관찰한 결과를 나타내고 있다. a는 40배, b는 100배, c는 200배의 배율로 관찰한 결과이고, 분리한 세포는 섬유아세포와 같은 모양을 하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 3은 소음순에서 분리한 세포가 정상적인 핵형을 유지하고 있는지를 확인한 결과를 나타낸다.

도 4A는 소음순에서 분리한 세포의 면역학적 표현형을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 보여주는 것이다. 도 4B는 bone marrow에서 분리한 중간엽 세포를 대조군으로 하고, 소음순에서 분리한 세포가 중간엽 줄기세포와 같은 성격을 가지는 지를 대표적인 마커로 확인한 결과를 나타낸다. 도 4B에서 hLMDCs가 소음순에서 분리한 성체세포를 의미하고, hMSCs가 대조군의 세포를 나타낸다. 도 4C는 면역형광염색법으로 단백질 레벨에서 마커의 발현이 되고 있는지를 확인한 결과이다.

도 5의 A-C는 소음순에서 분리한 본 발명의 성체줄기세포가 다분화능을 가진 중간엽줄기세포와 비슷한 분화능을 가지고 있음을, 뼈(A),지방(B),연골세포(C)로의 분화를 통해서 확인한 결과를 보여주는 것이다. 왼쪽은 뼈, 지방, 연골세포로 분화를 했을 때 발현이 되는 마커들을 RT-PCR로 확인한 결과이고, 이때 - 표시는 분화시키지 않은 세포를 나타낸다. 오른쪽은 적절한 스테인 방법을 사용하여 분화 여부를 확인한 결과를 나타내고 있다.

도 6은 도 1에서 언급했던 reprogramming의 방법을 사용하여 혈관 내피 전구세포로의 유도를 하는 실험 결과로, 소음순에서 분리한 성체세포가 condition II의 조건을 거치면서 혈관 내피 전구세포와 유사한 형태로 바뀐다는 것을 보여주는 것이다. 이때 A의 왼쪽 사진은 condition I에서 배양하고 있는 세포의 모습이고, 오른쪽 사진은 condition II에서 7일 동안 배양한 세포의 사진을 나타낸다. 도 6의 B는 condition II에서 7일 동안 배양한 세포가 CD31, CD34가 발현이 되는지를 FACS analysis방법을 이용하여 확인한 결과이다. 또한, 도 6C는 condition I와 condition II를 비교하여 condition II에서 혈관 내피 전구세포에서 발현되는 마커 들의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 6D는 이때의 세포에서 면역형광염색법으로 CD31과 vWF의 발현을 확인한 결과이고, 이 때 사용한 성체세포는 EGFP를 발현하게 만든 세포이므로 염색된 부분과 함께 관찰을 하여 확인을 하였다. 그림에서 DAPI는 핵을 염색한 결과를 의미한다.

도 7은 pathway II 과정을 통해 혈관 세포로 분화가 되었는지를 인 비트로 상에서 확인한 결과를 나타낸다. A는 condition I에 비해 conditio II 단계를 거친 세포에서 튜블 형성이 현저하게 높게 잘 되고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 (분화시킨 지 12시간째의 결과이다.), B는 이때의 튜블 구조의 수를 그래프화 하여 비교한 결과를 보여주고 있다. C는 혈관 내피 전구세포를 유도하는 배지 배양조건에서 분화된 세포가 혈관 내피 전구세포의 대표적 기능인 Dil-AC-LDL를 흡수할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 이때 a는 EGM-2 배지 (condition II)에서 분화시키지 않은 세포를 나타내고, b와 c는 EGM-2 배지(condition II)에서 일주일 분화시킨 세포에 LDL 유사체를 넣고 6시간 정도 배양한 후 흡수한 세포의 모습을 나타낸다.

도 8은 혈관 내피 전구세포를 유도하는 배지 배양조건에서 분화된 세포가 허혈성 사지를 가진 질환 동물 모델에게 주입되었을 때 혈관이 형성되었음을 면역학적 형광 염색을 통해서 확인한 결과를 보여주는 것이다. 이 때 A는 각각의 그룹에서 necrosis가 일어나는 비율을 비교한 결과를 보여주고 있고, condition II에서 배양한 세포를 인젝션한 경우에 necrosis비율이 적게 나타나는 것을 볼 수 있다. 또한, B는 혈관 내피 전구세포를 유도하는 배지 배양조건에서 분화된 세포가 허혈성 사지를 가진 질환 동물 모델에게 주입되었을 때 혈관의 형성을 통해서 근육괴사를 막는다는 것을 보여주는 것이다. 이때 control (-) 그룹은 분화 시키지 않은 세포를 주사한 후 절편한 사진을 나타내고, 아래의 condition II 그룹은 condition II에서 분화시킨 세포를 주사한 후 절편한 사진을 나타낸다. 이때의 조직을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과가 도 8C이다. 도 8C는 혈관 내피 전구세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 CD31 (a), vWF (b)가 세포에 염색된 결과를 나타내고 있고, EGFP는 소음순 유래 세포에 pBabe puro EGFP라는 벡터를 삽입한 결과 발현이 되고 있는 것을 나타내고 있다. 여기에서 DAPI는 핵을 염색한 결과를 보여주고 있고, merge라고 표기된 사진은 각각의 특이적으로 발현되는 마커와 EGFP를 함께 볼 수 있게 나타낸 결과이다.

Claims

소음순에서 분리한 성체줄기세포를 로우 글루코스 DMEM, FBS(fetal bovine serum), L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양조건에서 배양하여 하기 특성을 나타내는 다분화성 성체세포를 제조하는 단계:

(1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

(3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄;

(4) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

(5) 사이토카인 미포함 배지 배양 하에서도, 다분화능이 유지된 상태로 수득되고 대량증식 되는 능력을 가짐; 및

상기에서 제조된 성체줄기세포를 MAPC 배지에서 VEGF를 처리하면서 배양하는 단계를 포함하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 MAPC 배지는 DMEM, MCDB, 인슐린(Insulin), 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 셀레늄(selenium), 덱사메타손(dexametasone), 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법.
소음순에서 분리한 성체줄기세포를 로우 글루코스 DMEM, FBS, L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 이루어진 배양조건에서 배양하는 단계; 및

상기 로우 글루코스에서 배양된 성체줄기세포를, EBM-2 기본 배지, FBS, 하이드로코티손, bFGF, VEGF, IGF-1, 비타민C, EGF, GA-1000 및 헤파린으로 이루어진 EGM-2 배지 배양 조건에서 추가로 배양하는 단계를 포함하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 소음순에서 분리한 성체줄기세포는 분리된 여성의 소음순 조직으로부터 진피조직을 얻고, 얻어진 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 분리된 세포를 로우 글루코스 DMEM에서 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 혈관 내피 전구세포로 분화 유도하는 방법.
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