KR101416845B1

KR101416845B1 - 치아 줄기세포의 이송간 보존 및 추출을 위한 조성물 및 그 조성물을 이용한 치아의 처리방법

Info

Publication number: KR101416845B1
Application number: KR1020110119012A
Authority: KR
Inventors: 국일
Original assignee: (주)치아줄기세포뱅크
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2014-07-08
Also published as: KR20120052180A

Abstract

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 치아 보존용 조성물을 제조하는 단계와; 발치된 치아에 최소한 1개 또는 2개 이상의 접촉통로를 형성하되, 상기의 접촉통로를 통하여 치아의 내부에 존재하는 치수에 상기의 치아 보존용 조성물이 접촉할 수 있도록 하는 치아의 접촉통로 형성단계와; 상기의 치아 보존용 조성물에 상기의 접촉통로를 가진 발치 치아를 침적시키거나 접촉시켜서 보존처리하는 발치 치아의 보존처리 단계; 를 포함하고 있다.
본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 발치된 치아로부터 그 내부의 치수를 안정되게 보존할 수 있고, 장시간이 경과될 경우에도 치아 내부의 치수가 물리화학적인 변화를 겪는 것을 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

치아 줄기세포의 이송간 보존 및 추출을 위한 조성물 및 그 조성물을 이용한 치아의 처리방법 {A Composition and Method for Conserving Tooth Stem Cell During Transferring the Same Tooth}

본 발명은 성체 줄기세포를 포함하는 치아(Tooth)의 이송간 안전하고 장시간 보존을 위한 조성물 및 그 조성물을 이용한 치아의 처리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 발치되어진 치아를 장시간 보관할 수 있고 치아의 성체 줄기세포를 장시간 보관후 추출할 경우에도 그 치아의 성체 줄기세포의 세포 조직의 변화와 물리적 충격을 최소화할 수 있는 조성물 및 그 조성물을 이용한 치아의 처리방법에 관한 것이다.

치아의 치수(Pulp) 및 치주인대 그리고 치조골에는 중간엽 줄기세포가 존재하고 있으며, 이를 이용한 골재생, 연골재생, 신경재생, 혈관재생 등의 재생의료 연구가 활발하게 진행되고 있다.

치수 및 치주인대, 치조골 줄기세포의 경우 기존의 제대혈 및 골수와 달리 혈액 내 액체 상태 속에 존재하지 않고, 치아의 내부에 존재하거나 또는 치아의 외부에 존재하고 있다. 더욱 구체적으로, 상기 치수(Pulp)는 치아 중심부로부터 치근에 이르기까지 존재하고, 치주인대는 치아 외부측 잇몸, 치조골과 연결되는 부위에 존재하며, 치조골은 치근 아래 뼈에 존재한다. 이들 치아 줄기세포는 치아를 발치하게 될 경우, 공기 중에 그대로 노출되고, 이러한 경우 치아줄기세포의 생존율은 극히 저하되어진다.

이를 방지하기 위하여, 통상적으로 우유에 담아 보관하고, 그로부터 48시간 이내에 이송할 것을 권장하고 있는데, 시간이 지체될 경우 세포의 변형 또는 생존율이 극도로 저하되어 줄기세포를 확보할 수 없게 된다.

또한, 치아 줄기세포를 나중에 사용하기 위하여 보관해야 할 경우, 일반 가정 또는 로컬 치과병원에서 특정 보관장소까지 이동하는 시간이 48시간 이상을 요구하게 되는 경우가 불가피하게 발생하게 된다. 그런데, 치아 줄기세포는 그 생존기간이 통상적으로 48시간을 초과하기 어렵고, 그 보존 및 이송시간이 최초의 발치된 시간으로부터 약 48시간을 경과하게 될 경우에도, 보존 및 이송으로 인한 영향을 받지 않고, 그 생존율을 극대화시키고, 보다 안전하게 배송하는 것이 치아 줄기세포의 확보에 아주 중요하다.

참고로, 종래의 제대혈 및 골수의 경우에는 채취시 액체 상태로 해당 업체의 이송용 키트에 일정한 온도를 유지하는 방법을 이용하고 있는데, 상기의 이송용 키트에 대한 특허를 취득하여 이송하고 있으며, 골수의 경우에는 대부분 해당 병원에서 골수를 채취하여 그 병원 내에서 임상에 이용하거나 이송시 액체 상태로 일정한 온도를 유지하는 방법을 활용하고 있다.

이에 반하여, 치아의 줄기세포의 경우에는 치조골이나 치주인대를 이용하는 것이 상대적으로 어려운 측면이 있으므로, 발치된 치아를 이용하는 방법을 강구하여야 하는 것인데, 현재까지 발치된 치아로부터 이송간 치아 줄기세포를 장시간 보존할 수 있는 방법은 거의 개발되어 있지 않은 실정이다.

이와 같이, 치아 줄기세포의 활용방법은 바람직한 것으로 평가되고 있지만, 아직까지 현실적이고 효과적인 치아 줄기세포의 이송간 장시간 보존 및 추출방법이 개발되어 있지 않다.

따라서, 본 발명의 목적은 치아의 내부에 존재하는 치수를 장시간 보존할 수 있고, 장시간 보존 및 이송의 경우에도 세포의 조직변화와 물리적 충격을 최소화하여 본래의 조직상태를 유지하거나 향상시킬 수 있는 치아보존용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 치아의 내부에 존재하는 치수를 이송간에 장시간 보존함과 동시에 상기의 치수를 치아로부터 손쉽게 추출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 기본 세포배양 배지와; 그의 최종 농도 10% 내지 20% 인 FBS(Fetal Bovine Serum)와; 그의 최종 농도 1 ~ 10 mM 인 글루타민과; 그의 최종 농도 50 ~ 500 μM 인 아스코르빈산과; 그의 최종 농도 50 ~ 500 U/mL 인 페니실린 및 50 ~ 500 μg/mL 인 스트렙토마이신; 을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 상기와 같은 치아줄기세포 배양액에 항산화물질과, pH 조정제와, 인산염 완충제로 희석한 피브리노겐과 트롬빈 등을 적당량 첨가하여, 저점성의 겔 상태의 조성물을 제조한다.

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 위와 같은 치아 보존용 조성물을 제조하는 단계와; 발치된 치아에 최소한 1개 또는 2개 이상의 접촉통로를 형성하되, 상기의 접촉통로를 통하여 치아의 내부에 존재하는 치수에 상기의 치아 보존용 조성물이 접촉할 수 있도록 하는 치아의 접촉통로 형성단계와; 상기의 치아 보존용 조성물에 상기의 접촉통로를 가진 발치 치아를 침적시키거나 접촉시켜서 보존처리하는 발치 치아의 보존처리 단계; 를 포함하고 있다.

본 발명에 있어서, 상기의 치아의 접촉통로 형성단계는 발치된 치아의 뿌리 일부, 또는 치아의 상하 좌우 어느 한쪽을 대상으로 하여, 커팅하거나 구멍을 내는 것으로 구체화될 수 있다. 치아에 대한 커팅이나 구멍의 형성은 통상적인 기구를 이용하여 실행될 수 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 발치된 치아로부터 그 내부의 치수를 안정되게 보존할 수 있고, 장시간이 경과될 경우에도 치아 내부의 치수가 물리화학적인 변화를 겪는 것을 효과적으로 예방할 수 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물을 이용할 경우, 발치된 치아를 48시간 이상 경과시킬 경우에도, 그 내부의 치수를 안정된 상태로 보존할 수 있으므로, 특정 장소에서 다른 특정의 장소로 안정되게 이송할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물을 이용할 경우, 세포의 생존에 필요한 통상적인 온도 범위에서 수행될 수 있으므로, 인공적으로 극저온 상태 또는 저온 상태를 유지할 필요가 없는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물을 이용할 경우, 인공적으로 극저온 상태 또는 저온 상태를 유지할 필요가 없으므로, 온도조절을 위한 부대적인 기구들을 동원할 필요가 없고, 누구나 쉽고 간단하게 활용할 수 있는 장점도 있다.

도 1은 일반적인 치아의 구성을 나타낸 단면도이고,
도 2는 본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법에 적합한 치아의 단면을 예시한 개념도이며,
도 3은 본 발명의 치아 보존용 조성물에 침적된 상태의 치아의 모습을 나타낸 예시도이며,
도 4 내지 도 8은 본 발명에 의한 실험예 5 내지 실험예 9에 관한 콜로니 형성능력을 확인하기 위한 사진자료들이다.

본 발명은 발치된 치아를 장시간 보관할 수 있는 치아 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기의 기본 세포배양 배지는 α-MEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 α-MEM 배지를 사용하는 것이 치아의 줄기세포의 배양에 적합하고, 이를 바탕으로 하여 발치된 후 접촉통로(10)를 형성한 치아의 내부에 존재하는 세포들에 대해 계속적인 영양공급원으로서 기능하기 때문이다. 일반적으로, 인체에서 치아가 발치되어지면, 혈관을 통하여 공급되던 영양원이 완전히 차단된 상태에 있으므로, 통상 48 시간 정도 경과되어지면, 그 치아의 내부 세포들은 서서히 사멸하게 되고, 부패되어지기 시작한다. 이러한 상황을 방지하기 위해서는, 발치된 치아의 내부에 세포들이 생존해나갈 수 있는 영양원이 필요하게 되는데, 그러한 영양원으로서 가장 바람직한 것이 상기의 α-MEM 배지라고 할 수 있다.

본 발명에 의한 치아 보존용 조성물은 상기의 기본 세포배양 배지에 10 ~ 20% FBS (우태 혈청)을 첨가하여 제조된다. 상기의 FBS (우태 혈청)는 동물성 영양 성분으로서 가장 바람직한 것이다. 10 % 미만의 경우에도 사용 불가능한 것은 아니지만, 동물성 영양 성분으로서 미약한 반면에, 20 % 이상의 경우에는 너무 고가로 구입하여야 하므로, 적합하지 않는 측면이 있다.

본 발명에 의한 치아 보존용 조성물은 상기의 기본 세포배양 배지에 세포의 단백질 공급원으로서 L-글루타민을 첨가하여 제조되어지고, 그의 최종적인 농도는 완성된 조성물에 대하여 1 ~ 10 mM 농도를 형성하도록 하는 것이 바람직하다. 1 mM 이하의 농도에서는 치아 세포에 충분한 양의 단백질 영양공급원으로서 적합하지 못한 반면에, 10 mM 이상의 농도로 수행할 필요성은 없다고 여겨진다. 보다 바람직하기는 2 ~ 5 mM 의 농도가 좋다.

본 발명에 의한 치아 보존용 조성물은 상기의 기본 세포배양 배지에 동물세포의 필수영양원으로서 아스코르빈산을 첨가하여 제조되어진다. 이는 일종의 비타민 C로 알려져 있고, 치아의 줄기세포는 일종의 동물세포에 해당하기 때문이다. 상기의 아스코르빈산은 그의 최종 농도가 완성된 조성물에 대하여 50 ~ 500 μM 인 것이 바람직하다. 50 μM 이하의 농도에서는 아스코르빈산에 의한 영양공급량이 불충분한 반면에, 500 μM 이상의 농도에서는 아스코르빈산의 농도가 너무 과량이므로 적합하지 않다. 보다 바람직하기는 100 ~ 200 mM 의 농도가 좋다.

본 발명에 의한 치아 보존용 조성물은 상기의 기본 세포배양 배지에 항생제로서 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 제조되어진다. 이는 일종의 동물세포의 항생제로서 사용되는 것이며, 상기의 항생제는 그의 최종 농도가 완성된 조성물에 대하여 50 ~ 500 U/mL 인 페니실린 및 50 ~ 500 μg/mL 인 스트렙토마이신인 것이 바람직하다. 50 U/mL 및 50 μg/mL 이하의 농도에서는 항생제로서의 활성이 약한 반면에, 500 U/mL 및 500 μg/mL 500 μM 이상의 농도에서는 과량의 항생제로 기능하므로, 오히려 세포에 적합하지 않다. 보다 바람직하기는 각각 100 ~ 200 U/mL 및 100 ~ 200 μg/mL 의 농도가 좋다.

위와 같은 비율로 형성된 치아 보존용 조성물을 좀더 구체적으로 살펴보면, 아래와 같다.

보다 구체적이고 실질적인 설명을 위하여, 본 발명의 치아 보존용 조성물의 기본배지를α-MEM 배지로 하고, 그에 첨가되는 영양원들을 15% FBS, 2 mM L-glutamine, 100μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin 으로 구성된 것을 기준으로 할 경우에 관하여 예시적으로 살펴보기로 한다.

특히, 본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물을 500 mL 기준으로 하여 제조하고자 할 경우를 살펴본다. 이 경우, α-MEM 배지를 410 mL 와, FBS 75 mL와, 200 mM L-glutamine (BIOSOURCE; Biofluids Inc) 5 mL 와, 10^-2 M ascorbic acid 2-phosphate (WACO) 5 mL 와, 10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin (P/S) (Biofluids Inc) 5 mL 를 칭량하여 혼합한다. 혼합 방식은 통상적인 방법으로 수행할 수 있으므로 별도로 설명하지 않기로 한다.

이때, 상기의 L-glutamine 의 경우, 200 mM 의 100 배 고농도의 글루타민을 첨가하였지만, 전체 조성물의 양이 500 mL 인 반면에 상기 글루타민의 첨가량이 5 mL 이므로, 최종적인 글루타민의 농도는 실제로 2 mM로 됨을 유의하여야 할 것이다. 이러한 사항은 상기의 아스코르빈산 및 상기의 항생제 등에 대해서도 동일한 원리로 적용됨을 언급해둔다. 또한, 상기의 영양원 명칭 뒤 괄호에는 그 상품명 내지 그 상품의 제조원 회사명칭임을 밝혀둔다.

상기 치아의 보존용 조성물은 세포액 보존조성물 내지 세포 배양액을 기반으로 한 것으로서, 치아 내부의 치수 줄기세포에 접촉됨으로써, 치아 줄기세포를 보존처리하기 위하여 사용되어진다. 상기의 치아의 보존용 조성물은 통상의 방식으로 여과처리한다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 상기와 같은 치아 줄기세포 배양액에 항산화 물질을 포함할 수 있다. 상기의 항산화 물질은 줄기세포 배양액에 산화방지를 위한 물질로서 EGCG(epigallocatechin gallate)를 0.002%의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 중성을 유지하기 위하여, pH 조정제를 포함하는 것이 바람직하고, 이를 위하여 pH조정제로서 HEPES를 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 치아의 보존용 조성물은 저점성의 겔 상태의 조성물을 얻기 위하여 인산염 완충제로 희석한 피브리노겐과 트롬빈을 적당량 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 아래와 같이 3단계로 진행될 수 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 먼저 상기의 치아 보존용 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명은 위에서 설명한 바와 같은 성분 및 그 함량을 기준으로 하여 상기의 치아 보존용 조성물을 제조한다. 구체적인 설명은 위에서 이미 행하였으므로, 반복하여 실시하지 않기로 한다.

상기의 치아 보존용 조성물에 항산화물질 EGCG(epigallocatechin gallate)를 0.002%의 농도로 첨가하고, pH조정제(HEPES)를 첨가하여 PH 7.0-7.5 정도를 맞춘다. 상기의 조성물을 교반 혼합한 다음, 이것을 0.22㎛의 필터(밀리포아사제)로 무균으로 여과하여 조제한다. 이후, 10 x 인산완충액(10배 고농도 인산완충액)으로 피브리노겐 및 트롬빈을 희석하여 본 조성물에 첨가한다. 조성물은 10ps 이하의 저점성으로 제조한다. 점성이 10ps 를 초과하게 되면, 치아내부의 치수에 조성물이 잘 흡수되지 않기 때문이다. 보다 바람직하기로는 5 ps 이하, 더욱 바람직하기로는 1 ps 이하의 점성을 유지하는 경우이다.

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 발치된 치아에 최소한 1개 또는 2개 이상의 접촉통로(10)를 형성하는 치아의 접촉통로 형성단계를 포함하고 있다.

본 발명은 발치된 치아의 내부에 존재하는 치수에 본 발명에 의한 상기의 조성물을 접촉시키기 위하여, 접촉통로(10)를 형성한다. 상기의 접촉통로(10)는 치아의 내부에 존재하는 치수에 본 발명의 조성물을 접촉할 수 있는 방식으로 형성되면 족하고, 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 상기의 접촉통로(10)는 발치된 치아의 뿌리를 일부 커팅하거나, 전부 커팅하거나, 또는 작은 틈새 또는 작은 구멍을 형성함으로써 완성될 수 있다. 본 발명에 의한 상기의 접촉통로(10)는 치아의 뿌리부 또는 몸체부에 형성될 수도 있다. 치아의 몸체부에 형성될 경우, 상기의 접촉통로는 치아의 몸체부에 일부 커팅되어 형성된 틈새의 형상을 이루거나, 치아의 몸체부에 형성된 작은 구멍의 형상을 이루게 된다.

상기의 접촉통로(10)는 작은 틈새 또는 작은 구멍 또는 다른 어떠한 형상을 이루고 있더라도, 반드시 치아의 외부에서 치아의 내부에 존재하는 치수에 접촉할 수 있는 통로를 가지고 있는 것이 중요하다. 치아의 뿌리 또는 치아의 몸체에 형성된 틈새의 커팅작업 또는 구멍의 형성작업은 치과의원이나 치과병원에서 사용되고 있는 통상적인 기구를 이용하여 실행될 수 있다.

도 2는 본 발명에 의한 치아의 접촉통로 형성단계를 이행한 이후의 치아의 모습을 개략적으로 도시하고 있다. 도 2에서는 치아의 뿌리 부분과 치아의 몸체부에 여러가지 형태로 접촉통로(10)를 형성하고 있음을 보여주고 있다.

본 발명에 의한 치아의 보존 처리방법은 상기의 치아 보존용 조성물에 상기의 접촉통로(10)를 가진 발치 치아를 침적시키거나 접촉시켜서 보존처리하는 발치 치아의 보존처리 단계를 포함하고 있다.

본 발명은 상기의 치아 보존용 조성물을 소정의 용기에 부어 넣고, 치아 보존용 조성물이 채워져있는 용기의 내부에, 상기의 접촉통로(10)가 형성된 치아를 집어넣는다.

도 3은 본 발명의 치아 보존용 조성물이 채워져 있는 용기(튜브)에 접촉통로(10)를 형성한 치아를 집어 넣은 모습을 사진으로 촬영한 것이다. 접촉통로(10)가 형성된 치아는 바닥에 놓여 있고, 치아 보존용 조성물에 완전히 침적되어 있는 모습을 확인할 수 있다.

이때, 상기의 치아 보존용 조성물은 치아의 외부에 접촉하게 되고, 이어서 상기의 접촉통로(10)를 통하여 그 내부로 이동하게 된다. 이동하는 방식은 삼투압 현상에 의하여 진행되는 것으로 추정된다. 상기의 접촉통로(10)를 통하여 치아의 내부로 이동한 치아 보존용 조성물은 상기의 치수(pulp)에 접촉하게 된다. 치아의 내부에 존재하는 치수(pulp)는 발치된 순간부터 한동안 외부로부터 혈액의 공급이 중단된 상태이었으나, 상기의 접촉통로(10)를 통하여, 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물을 공급받게 된다. 상기의 치아 보존용 조성물은 치아 내부의 치수에 영양성분을 공급하게 되므로, 치아 내부의 치수는 치아의 발치 여부와 상관없이 장시간 동안 생물학적인 충격을 받지 않고, 안전하게 생물학적인 조직 및 기능을 정상적으로 유지하고 보존하게 된다.

이하, 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물을 이용하여 발치된 치아를 보존처리하는 방법을 구체적으로 살펴보기로 한다. 여기에서는, 먼저 발치된 치아에 접촉통로(10)로서 소정을 틈새 또는 소정의 구멍을 형성한 경우와, 그렇지 않은 경우를 살펴보기로 한다.

《실험 예 1》

33세 여성의 제3대구치(38번)를 발치하고, 발치된 치아를 커터로 약 1밀리미터 정도의 틈새를 형성한 후, 치아의 치수를 상기의 틈새를 매개로 하여 외부에 노출될 수 있도록 하였다. 상기의 틈새를 형성한 후, 곧바로 본 발명에 의한 상기 치아 보존용 조성물에 넣었다. 그 상태에서 48 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 그 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 확인하였다. 상기의 치수(pulp)는 염색된 것으로 확인되었고, 이를 통하여 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물이 상기의 치수(pulp)에 접촉 및 흡수됨을 간접적으로 확인할 수 있었다.

《실험 예 2》

45세 남성의 제2소구치(44번)를 발치하고, 발치된 치아의 몸체를 드릴로 약 2밀리미터의 구멍을 형성한 후, 곧바로 본 발명에 의한 상기 치아 보존용 조성물에 넣었다. 그 상태에서 72 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 확인하였다. 상기의 치수(pulp)는 염색된 것으로 확인되었고, 이를 통하여 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물이 치아의 발치 이후 72시간이 경과된 경우에도 치수(pulp)에 접촉 및 흡수됨을 간접적으로 확인할 수 있었다. 이때, 상기의 치수(pulp)는 외관상 조직의 변형이 전혀 관찰되지 않았다.

《실험 예 3》

29세 여성의 제3대구치(28번)를 발치하고, 발치된 치아의 상부에서 아래쪽으로 커터로 약 1밀리미터 정도의 틈새를 형성한 후, 곧바로 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물에 넣었다. 그 상태에서 96 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 확인하였다. 상기의 치수는 염색된 것으로 확인되었고, 이를 통하여 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물이 치아의 발치 이후 96시간이 경과된 경우에도 상기의 치수(pulp)에 접촉 및 흡수됨을 간접적으로 확인할 수 있었다. 상기의 치수(pulp)는 외관상 조직의 변형이 전혀 관찰되지 않았다.

《실험 예 4》

30세 남성의 제1소구치(33번)를 발치하고, 발치된 치아의 몸체를 측면에서 드릴로 약 2밀리미터의 구멍을 형성한 후, 곧바로 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물에 넣었다. 그 상태에서 120 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 확인하였다. 상기의 치수는 염색된 것으로 확인되었고, 이를 통하여 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물이 치아의 발치 이후 120시간이 경과된 경우에도 상기의 치수(pulp)에 접촉 및 흡수됨을 간접적으로 확인할 수 있었다. 이때, 상기의 치수(pulp)는 외관상 조직의 변형이 전혀 관찰되지 않았다.

《 실험 예에 관한 평가 》

이와 같이, 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물은 치아의 발치 이후 120시간 (5일)이 경과된 경우에도, 그의 외관상의 조직이 전혀 변형되지 않음을 확인할 수있었다.

《비교실험 예 1》

25세 여성의 제3대구치(38번)를 발치하고, 치아의 치수가 노출되지 않는 원상태의 치아를 그대로 본 발명의 상기 치아 보존용 조성물에 넣고, 48 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 살폈더니, 상기의 치수(pulp)는 전혀 염색이 되지 않은 것으로 확인되었다.

《비교실험 예 2》

32세 남성의 제2소구치(44번)를 발치하고, 치아의 치수가 노출되지 않는 원상태의 치아를 그대로 본 발명의 상기 치아 보존용 조성물에 넣고, 72 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 살폈더니, 상기의 치수(pulp)는 역시 전혀 염색이 되지 않은 것으로 확인되었다. 또한, 상기의 치(pulp)수는 약간의 조직이 변형된 것으로 관찰되었다.

《비교실험 예 3》

28세 여성의 제3대구치(28번)를 발치하고, 치아의 치수가 노출되지 않는 원상태의 치아를 그대로 본 발명의 상기 치아 보존용 조성물에 넣고, 96 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 살폈더니, 상기의 치수(pulp)는 역시 전혀 염색이 되지 않은 것으로 확인되었다. 또한, 상기의 치수(pulp)는 상당한 정도로 조직이 변형된 것으로 관찰되었다.

《비교실험 예 4》

25세 남성의 제1소구치(44번)를 발치하고, 치아의 치수가 노출되지 않는 원상태의 치아를 그대로 본 발명의 상기 치아 보존용 조성물에 넣고, 120 시간을 경과시킨 후, 그 침투 정도를 2% crystal violet 을 통하여 염색을 진행하였다. 치아를 절단하여 치수(pulp)의 염색 정도를 살폈더니, 상기의 치수(pulp)는 역시 전혀 염색이 되지 않은 것으로 확인되었다. 또한, 상기의 치수(pulp)는 조직이 완전히 변형된 것으로 관찰되었고, 심한 악취를 느낄 수 있었다.

《 비교실험 예에 관한 평가 》

상기의 비교실험 예들을 통하여 확인되는 바와 같이, 발치된 치아에 틈새를 형성하지 않고, 발치된 그대로 본 발명의 치아 보존용 조성물에 넣어 보관한 경우에는 설혹 120시간 (5일) 동안 침적시켰을 때에도, 치수(pulp) 조직에도 침투되지 않았음을 확인할 수 있었고, 또한 3일 경과시에는 치수조직에 변형을 일으키게 되므로, 이를 생물학적으로 활용할 수 없게 됨을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자는 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물 및 이를 이용한 처리방법이 어느 정도까지 발치된 치아를 이용하여 생물학적으로 활용가능한 것인지의 여부를 확인하기 위하여, 아래와 같은 추가적인 실험을 수행하였다.

《실험 예 5A - 2일 경과시의 경우》

2011년 4월 10일 29세 여성(성명은 생략함. 이하, 동일함)의 치아38번을 서울 강서구 화곡역 근처에 소재하는 임플러스 치과(이하, 로컬 치과로 약칭함.)에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 2일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 5월 4일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 5월 16일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 73 정도이었다. 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하기 위하여 2% crystal violet 을 사용하였으며, 이는 아래의 모든 실험 예에서도 동일하였다.

《실험 예 5B - 2일 경과시의 경우》

2011년 7월 25일 24세 남성의 치아14,34을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 2일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 8월 23일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 5월 16일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 72.7 정도이었다.

도 4에 나타난 사진자료는 상기 실험 예 5에 관한 것으로서, 그 좌측면 사진자료는 상기 실험 예 5A에 관한 것인 반면에, 그 우측면의 사진자료는 상기 실험 예 5B에 관한 것이다. 또한, 사진자료 중에서 상부에 존재하는 부분은 각 실험에 사용된 치아에 관한 정보를 샬레의 표면에 기록한 것이고, 그 하부에 존재하는 사진자료가 콜로니 형성능력을 확인하기 위한 것임을 밝힌다. 이하, 동일하다.

《실험 예 6A - 3일 경과시의 경우》

2011년 7월 5일 27세 여성의 치아24,34번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 3일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 8월 1일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 8월 12일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 87.3 정도이었다.

《실험 예 6B - 3일 경과시의 경우》

2011년 8월 2일 17세 남성의 치아14을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 치관 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 3일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 8월 29일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 9월 9일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 60.3 정도이었다.

도 5에 나타난 사진자료는 상기 실험 예 6에 관한 것으로서, 그 좌측면 사진자료는 상기 실험 예 6A에 관한 것인 반면에, 그 우측면의 사진자료는 상기 실험 예 6B에 관한 것이다.

《실험 예 7A - 4일 경과시의 경우》

2011년 6월 20일 22세 남성의 치아48번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 4일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 7월 16일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 7월 27일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 99 정도이었다.

《실험 예 7B - 4일 경과시의 경우》

2011년 8월 1일 23세 여성의 치아24,34번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 4일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 8월 27일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 9월 8일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 70.3 정도이었다.

도 6에 나타난 사진자료는 상기 실험 예 7에 관한 것으로서, 그 좌측면 사진자료는 상기 실험 예 7A에 관한 것인 반면에, 그 우측면의 사진자료는 상기 실험 예 7B에 관한 것이다.

《실험 예 8A - 6일 경과시의 경우》

2011년 3월 13일 16세 여성의 치아14번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 6일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 4월 28일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 5월 11일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 83 정도이었다.

《실험 예 8B - 6일 경과시의 경우》

2011년 5월 28일 26세 여성의 치아37,38번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 치관 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 6일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 6월 27일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 7월 6일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 105.3 정도이었다.

도 7에 나타난 사진자료는 상기 실험 예 8에 관한 것으로서, 그 좌측면 사진자료는 상기 실험 예 8A에 관한 것인 반면에, 그 우측면의 사진자료는 상기 실험 예 8B에 관한 것이다.

《실험 예 9A - 9일 경과시의 경우》

2011년 3월 29일 21세 남성의 치아15번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 뿌리 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 9일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 5월 2일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 5월 14일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 45 정도이었다.

《실험 예 9B - 9일 경과시의 경우》

2011년 7월 27일 17세 여성의 치아14,45번을 상기의 로컬 치과에서 채취하여, 그 치아의 치관 부분을 절단한 후, 본 발명의 조성물이 들어 있는 튜브에 넣었다. 상기의 튜브를 이송하여 본 발명자의 연구실에 옮겨 온 다음, 9일 경과된 이후, 치수 부분의 세포를 추출하여, 세포배양액에서 배양하였다. 이후, 2011년 8월 29일 Passage 2까지 성공적으로 배양하였고, 2011년 9월 9일 Passage 3에서 콜로니 형성능력(CFE)을 확인하였더니, 평균 63.7 정도이었다.

도 8에 나타난 사진자료는 상기 실험 예 9에 관한 것으로서, 그 좌측면 사진자료는 상기 실험 예 9A에 관한 것인 반면에, 그 우측면의 사진자료는 상기 실험 예 9B에 관한 것이다.

《 보존처리후 콜로니 형성 실험에 관한 평가 》

상기의 보존 처리 이후 콜로니 형성 실험결과에 의하면, 보존처리 이후 6일 경과된 경우에도 여전히 콜로니 형성능력이 왕성하게 관찰되었지만, 보존처리 이후 9일을 경과한 경우에는 콜로니 형성능력이 상당히 저하됨을 확인할 수 있었다.

이는 본 발명에 의한 치수 보존용 조성물을 이용할 경우, 9일 경과될 때까지 치수의 줄기세포를 생물학적으로 활용할 수 있는 것으로 여겨지고, 이는 여태까지 불가능하였던 사항을 개선함으로써, 이와 같이 장시간에 걸쳐 발치된 치아의 줄기세포를 생물학적으로 충분히 보존할 수 있는 기술로 여겨진다.

이상에서 본 발명에 의한 치아 보존용 조성물 및 그 처리 방법을 구체적으로 설명하였으나, 이는 본 발명의 가장 바람직한 실시양태를 기재한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의해서 그 범위가 결정되어지고 한정되어진다.

또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 본 발명의 명세서의 기재내용에 의하여 다양한 변형 및 모방을 행할 수 있을 것이나, 이 역시 본 발명의 범위를 벗어난 것이 아님은 명백하다고 할 것이다.

10 : 접촉통로

Claims

α-MEM(a-Minimal Essential Medium: α-최소 필수영양 배지)과;
전체 조성물에 대한 최종 농도 기준으로, 10~20%의 우태 혈청(FBS: Fetal Bovine Serum)과, 1~10 mM의 글루타민과, 50~500 μM의 아스코르빈산과, 50~500 U/mL의 페니실린 및 50 ~ 500 μg/mL의 스트렙토마이신과, 항산화 물질로서의 EGCG(epigallocatechin gallate)를 포함하며:
pH가 7.0~7.5이고, 점도가 최대 10cp(centipoise)인
발치 치아 보존용 조성물.
제1항에 있어서,
상기한 발치 치아 보존용 조성물 500 mL 기준으로, α-MEM 410 mL과, FBS 75 mL과, 200 mM L-glutamine 5 mL과, 10^-2 M 아스코르빈산 2-포스페이트 5 mL과, 10,000 U/mL 페니실린(penicillin) 및 10,000 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin) 5 mL을 포함하는 발치 치아 보존용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 발치 치아 보존용 조성물이 pH 조정제로서 HEPES를 포함하고, 상기한 EGCG를 0.002%의 농도로 포함하며, 인산완충액 희석 피브리노겐 및 트롬빈의 첨가에 의해 상기한 점도 조절이 이루어진 발치 치아 보존용 조성물.
하기의 단계로 구성되는 발치 치아의 보존처리 방법:
(A) 제1항 또는 제2항에 따른 발치 치아 보존용 조성물을 제조하는 단계;
(B) 발치 치아의 뿌리 부분 또는 발치된 치아의 몸체 부분에 적어도 1개소의 접촉통로(10)를 형성하여, 치아의 내부 치수에 연통된 치수 접촉통로 형성단계; 및
(C) 상기의 발치 치아 보존용 조성물에 상기의 접촉통로(10)를 형성한 발치 치아를 침적시키거나 접촉시켜서 보존처리하는 발치 치아의 보존처리 단계.
제4항에 있어서,
상기의 접촉통로(10)는 치아의 뿌리 부분 또는 치아의 몸체 부분에 일부를 커팅하거나 전부를 커팅하여 틈새 형상으로 형성하거나 절단시켜 형성되는 발치 치아의 보존처리 방법.
제4항에 있어서,
상기의 접촉통로(10)는 치아의 뿌리 부분 또는 치아의 몸체 부분에 구멍 형상으로 형성되는 발치 치아의 보존처리 방법.