KR102542183B1

KR102542183B1 - 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존 방법

Info

Publication number: KR102542183B1
Application number: KR1020200189641A
Authority: KR
Inventors: 이재천; 이선행
Original assignee: (주)두다
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-06-14
Also published as: KR20210086569A

Abstract

본 발명은 항생제 및 항진균제가 첨가되어 있는 완충용액을 포함하는 치아 보존 용액, 상기 보존 용액에 치아를 담는 단계를 포함하는, 치아의 보존 방법 등에 관한 것으로, 본 발명의 치아 보존 방법은 치아 내에 포함되어 있는 줄기세포의 증식능, 생존률, 줄기세포능 등을 장시간 안정적으로 유지시킬 수 있는 방법이다.

Description

치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존 방법{Preservation method of tooth for isolating stem cell}

본 발명은 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용액, 이를 이용한 치아의 보존 방법 등에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 인체를 구성하는 다양한 세포로 분화가 가능하기 때문에 손상된 조직의 치료를 위한 치료제로서 활발히 연구되고 있다. 다양한 줄기세포 중에서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 임상적으로 가장 활발히 연구되어 왔으며, 중간엽줄기세포를 획득하기 위하여, 일반적으로 골수, 지방, 제대혈 등을 이용하여 왔다. 그러나 골수 또는 지방 유래의 중간엽줄기세포는 세포 증식 능력이 제한적이어서 동종 줄기세포 치료제로서 실질적으로 사용되기에는 어려움이 있다.

한편, 유치와 교정 치료 등의 목적으로 발치되는 영구치 등은 일반적으로 치과에서 의료 폐기물로 처리되고 있는데, 최근 치아의 치수, 치주인대, 치조골 등에 중간엽줄기세포가 존재한다는 것이 확인되면서, 이를 이용한 골재생, 연골재생, 신경재생, 혈관재생 등의 재생의료 연구가 활발히 진행되고 있다. 특별히, 치수줄기세포는 치아 속에 위치하고 있는 줄기세포로서 치아 내에 고농도로 포함되어 있을 뿐만 아니라, 치아의 주인인 당사자뿐만 아니라 그 부모나 조부모까지 조직의 재생의료 치료에 사용될 수 있어 그 활용가치가 상당히 높다고 할 수 있다. 그러나 이들 치아 유래 줄기세포의 경우, 치아를 발치하는 시점에 공기 중에 그대로 노출되어 오염이 시작될 뿐만 아니라 이미 치아에 존재하는 다수의 충치균, 치은염균, 구취유발균 등 다수의 유해 균들의 존재로 인하여 치아 유래 줄기세포의 생존율은 극히 저하된다. 이를 방지하기 위하여, 발치된 치아는 통상적으로 우유에 담아 보관하고 48 시간 이내에 이송할 것을 권장하고 있으나, 일반 가정 또는 지역 치과 병원에서 특정 보관장소까지 이동하는 시간은 일반적으로 오랜 시간이 소요되기 때문에, 이송된 치아로부터 줄기세포를 추출할 경우 세포의 변형 또는 생존율이 극도로 저하되어 줄기세포를 확보하기 어려운 경우가 대다수이다. 따라서 치아 유래 줄기세포를 실질적으로 치료에 적용하기 위해서는 장기간 보관 시에도 치아 유래 줄기세포의 생존율 및 줄기세포능이 유지될 수 있는 치아의 보존 방법이 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 치아 유래 줄기세포를 현실적으로 치료에 사용할 수 있도로록 하기 위하여 발치된 치아의 이송에 따른 장시간 보존 방법 등에 관하여 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.

국내공개특허 10-2015-0069469

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용액, 이를 이용한 치아의 보존 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 보다 자세하게는, 1 내지 3 볼륨%의 항생제 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제가 첨가된 용액을 포함하는, 치아 보존 용액, 상기 치아 보존 용액에 치아를 담는 단계 등을 포함하는 치아 보존 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 추가적으로 상기의 방법으로 보존된 치아로부터 줄기세포를 추출하고, 추출된 줄기세포를 동결 보존하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용액으로서, 1 내지 3 볼륨%의 항생제 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제가 첨가된 용액을 유효성분으로 포함하는 보존용 용액을 제공한다. 바람직하게는 항생제는 총 50 내지 900 μg/mL로, 항진균제는 0.1 내지 100 μg/mL의 농도로 포함할 수도 있고, 더욱 바람직하게는 항생제는 총 100 내지 600 μg/mL로, 항진균제는 0.2 내지 50 μg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 상기 보존용 용액은 치아로부터 치아 유래 줄기세포를 분리하기 위한 전 단계로서, 발치된 치아를 안전하게 장기간 보존하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항생제는 바람직하게는 페니실린, 스트렙토마이신, 아목시실린, 암피실린, 클라불란산, 세파클러, 세파드록실, 세파드린, 세팔렉신, 세픽심, 세포탁심, 폴리믹신, 트리메토프림, 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 리팜피신, 목시플록사신, 젠타마이신, 아미카신, 토브리마이신, 네오마이신, 에리트로바이신, 아지트로마이신, 클래리트로마이신, 테트라사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 또는 이의 조합 등이나, 세균의 증식 및 성장을 억제하는 약물로 사용되고 있는 항생제 또는 항균제라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 항진균제는 바람직하게는 암포테리신 B, 미코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸, 플루시토신, 클로트리마졸, 미카판긴, 또는 이의 조합 등이나, 진균의 증식 및 성장을 억제하는 약물로 사용되고 있는 항진균제라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 용액은 바람직하게는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 인산염완충용액(phosphate buffered saline), 생리식염수, 우유, 또는 이의 조합 등이나, 치아 내에 포함되어 있는 줄기세포의 pH, 삼투압 등을 유지하여 세포의 생존을 도와주는 역할을 하는 용액이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 보존용 용액은 줄기세포 내의 pH 및 삼투압을 유지하며, 세균의 오염을 방지하여 줄기세포의 생존능 및 줄기세포능을 장기간 유지하여, 치료를 위한 치아, 또는 치아 내의 줄기세포 등을 장시간 보관, 이송하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 50 내지 90 볼륨%의 에탄올 용액이 담겨있는 제1 용기; 및 b) 상기 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용액이 담겨있는 제2 용기를 포함하는, 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용기를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 치아의 보존용 용기는 발치된 치아를 제1 용기에 담아 바람직하게는 2 내지 20초간, 더욱 바람직하게는 5 내지 10초간 담아 치아를 1차 세척한 후, 세척된 치아가 제2 용기로 이동하여 보관되는 형태로 작동될 수도 있고, 또는 발치된 치아를 제2 용기에 담아 보관한 후에, 치아 유래 줄기세포를 분리하기 이전에 제1 용기에 치아를 옮겨 담아 2 내지 20초간, 더욱 바람직하게는 5 내지 10초간 담아 치아를 세척한 후 줄기세포를 분리하는 방식으로 작동될 수도 있다. 상기 보존용 용기는 냉장 상태, 즉, 3 내지 5℃에서 보관되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 a) 상기 보존용 용액에 치아를 담는 단계; 및 b) 상기 치아가 담긴 보존용 용액을 4℃에 보관하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존 방법을 제공한다. 상기 보존 방법은 치아로부터 줄기세포를 분리하기 위한 전처리 단계로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 보존 방법은 a) 단계 이전 또는 b) 단계 이후에 50 내지 90 볼륨% 에탄올을 이용하여 치아를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 보존된 치아로부터 분리된 치아 유래 줄기세포를 동결 보존하는 방법으로서, (a) 다이에틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 혈청(serum), 및 완충용액(buffer)을 포함하는 동결액을 제조하는 단계; (b) 상기 동결액에 치아 유래 줄기세포를 담는 단계; 및 (c) 상기 동결액에 담긴 치아 유래 줄기세포를 동결하는 단계를 포함하는 치아 유래 줄기세포의 동결 보존 방법을 추가로 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 다이에틸설폭사이드(DMSO)는 동결 보호제로서 비세포 침투성 초자화제 및/또는 세포 침투성 초자화제 중의 한 종류로 대체되어 사용될 수 있으며, 상기 비세포 침투성 초자화제로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(Ficoll), 덱스트란, 또는 이의 조합 등의 다당류 및 자당 등으로 대체될 수 있으며, 상기 세포 침투성 초자화제로는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, DMSO, 또는 이의 조합 등으로 대체될 수 있다. 또한, 바람직하게는 상기 동결 보호제는 바람직하게는 동결액의 5 내지 20 볼륨%로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 볼륨%로 포함될 수 있다. 5 볼륨% 미만이거나, 20 볼륨% 초과이면, 세포의 해동 후 생존율이 급격히 감소되게 된다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 혈청은 바람직하게는 우태아혈청, 우혈청, 인간혈청, 말혈청 등이나, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 혈청의 종류라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 혈청은 바람직하게는 동결액의 동결액의 10 내지 30 볼륨%로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 볼륨%로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 용액은 바람직하게는 α-MEM, Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 인산염완충용액(phosphate buffered saline), 생리식염수, 또는 이의 조합 등이나, 치아 내에 포함되어 있는 줄기세포의 pH, 삼투압 등을 유지하여 세포의 생존을 도와주는 역할을 하는 용액이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 치아 유래 줄기세포는 (a) 치아 내부의 치수 조직을 분리하는 단계; (b) 상기 치수 조직에 줄기세포를 추출하기 위한 효소를 처리하는 단계; 및 (c) 70 μm mesh를 이용하여 여과하여 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 추출되는 것을 특징으로 하나, 일반적으로 치아 유래 줄기세포를 분리하는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 효소는 collagenase, DNase I, papain, dispase, 또는 이의 조합을 이용할 수 있으나, 일반적으로 줄기세포를 분리하는데 사용되는 효소라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 동결하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(a) 0 내지 2 ℃에서 20 분 내지 40 분 동안 동결하는 단계; (b) -1.5 내지 -2.5℃/분의 속도로 -8 내지 -10℃까지 온도를 낮추는 단계; (c) -8 내지 -10℃에서 3 내지 7 분 동안 동결하는 단계; (d) - 0.2 내지 -0.4 ℃/분의 속도로 -35 내지 -45℃까지 온도를 낮추는 단계; 및 (e) - 9 내지 -11℃/분의 속도로 -130 내지 -150℃까지 온도를 낮추는 단계.

본 발명에 따른 치아 보존용 용액은 치아를 장시간 보관하여도, 치아 내의 줄기세포의 형태, 증식 속도 등에 영향 없이 정상 상태를 장시간 유지할 수 있으며, 줄기세포능 또한 안정적으로 유지되는 것을 확인하였으므로 치료를 위한 치아, 치아 내에 포함되어 있는 줄기세포, 치아 내에 포함되어 있는 물질들을 보관 및 이송하는데 사용되어, 발치된 치아를 이용한 다양한 치료 분야에 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 치아 보존용 용액은 줄기세포의 생존률에 영향을 미치지 않으며, 독성을 나타내지 않기 때문에, 치아 조직 외에 인체를 구성하는 조직 및 장기(주요장기, 탯줄, 골수, 지방, 제대혈, 혈액 등)에서도 줄기세포를 보관하기 위한 용도로도 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 상기 방법으로 보존된 치아로부터 분리된 치아 유래 줄기세포의 동결 보전 방법을 통하여 줄기세포의 추가 배양 단계 없이 간단한 방법으로 치아 유래 줄기세포를 동결 보존할 수 있어, 건강한 줄기세포를 고효율로 보관할 수 있을 뿐만 아니라, 장기간 보관 시에도 줄기세포의 생존률, 줄기세포능 등을 안정적으로 유지할 수 있기 때문에 치아 내에 포함되어 있는 줄기세포를 이용한 다양한 치료 분야에 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전반적인 실험방법을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항생제가 첨가된 치아 보존 용액을 이용한 치아 보관 시간에 따른 배양 성공률을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 항생제 및 항진균제가 첨가된 치아 보존 용액을 이용한 치아 보관 시간에 따른 배양 성공률을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 70% 에탄올을 사용하여 발거된 치아를 추가 세척한 경우에 배양 성공률을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 동결시킨 세포의 성장곡선을 확인한 결과를 나타낸 도면이며, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 동결시킨 세포의 계대 배양에 따른 세포 형태를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 동결시킨 세포의 중간엽줄기세포 특성을 FACS를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 동결시킨 세포를 이용하여 분화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 치아 유래 줄기세포를 상업화하기 위하여 필수적인, 발치된 치아의 장시간 보관 및 이송 방법에 대하여 연구한 결과, 항생제 및 항진균제가 포함되어 있는 치아 보존용 용액을 이용하면 치아의 장시간 보관 시에도 치아 내의 줄기세포를 안정적으로 보호하여, 줄기세포의 증식능, 형태, 줄기세포능 등을 효과적으로 장시간 유지할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 치아 보존용 용액을 이용함으로써 가정, 지역 치과 등에서 발치된 치아를 효과적으로 수집하여 치아 유래 줄기세포의 대량 추출이 가능하며, 이를 실질적으로 다양한 줄기세포 치료제로서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에 있어서, "줄기세포(stem cell)"란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포능(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 본 발명에서는 바람직하게는 치아 유래 줄기세포를 의미하며, 더욱 바람직하게는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)을 의미하나, 치아 유래 줄기세포의 종류라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “항생제(antibiotics)”란 세균의 증식 및 성장을 억제하는 약물로 사용되고 있는 항생제 또는 항균제를 총칭하며, 바람직하게는 페니실린, 스트렙토마이신, 아목시실린, 암피실린, 클라불란산, 세파클러, 세파드록실, 세파드린, 세팔렉신, 세픽심, 세포탁심, 폴리믹신, 트리메토프림, 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 리팜피신, 목시플록사신, 젠타마이신, 아미카신, 토브리마이신, 네오마이신, 에리트로바이신, 아지트로마이신, 클래리트로마이신, 테트라사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 또는 이의 조합 등이나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “항진균제(anticomytics)”란 진핵생물인 진균의 증식 및 성장을 억제하는 약물을 총칭하며, 바람직하게는 암포테리신 B, 미코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸,플루시토신, 클로트리마졸, 미카판긴, 또는 이의 조합 등이나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 발거된 치아의 보관

발거된 치아를 보관하기 위하여, Hank's balanced salt solution(HBSS)에 1 내지 3 볼륨%의 농도가 되도록 항생제(antibiotics, 페니실린 및 스트렙토마이신), 또는 1 내지 3 볼륨%의 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신) 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제(Fungizone(암포테리신 B)) (antibiotics and antimyotics; AA)를 첨가하여, 치아 보존 용액을 제조였다. 최종적으로, 항생제는 페니실린은 100 내지 300 units/mL, 스트렙토마이신은 100 내지 300 μg/mL의 농도가 되도록 첨가되었으며, 항진균제(amphotericin B)는 0.25 내지 0.75 μg/mL의 농도가 되도록 첨가되었다. 그리고 제조된 10 mL의 치아 보존 용액에 각각의 치아를 담고, 4℃의 조건에서 보관하였다. 보관 시간은 시료당 0 시간 이상에서 12 시간 미만, 12 시간 이상에서 24 시간 미만, 24 시간 이상에서 48 시간 미만, 48 시간 이상에서 72 시간 미만, 72 시간 이상에서 96 시간 미만, 96 시간 이상으로 분류하여 보관하였으며, 그 후 실험에 이용하였다.

실시예 2: 단일 세포의 획득

실시예 1과 동일한 방법으로 보관된 치아에서 각각 단일 세포를 획득하였다. 보다 자세하게는, 치아 보존 용액에 담겨있던 치아를 멸균된 핀셋을 이용하여 70% 에탄올에 10초간 세척하였다. 이후, 치아 보존 용액을 이용하여 다시 치아를 3 회 세척하고, 치아 내부의 치수 조직을 얇은 핀셋을 이용하여 분리하였다. 그리고 분리된 치수 조직에 1 mg/mL 농도의 collagenase 용액 500 μL를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30 분 동안 반응시킨 후에 파이펫을 이용하여 물리적으로 분해하였다. 그리고 용해작용을 위하여 500 μL의 collagenase 용액을 다시 첨가하고, 30 분 동안 배양기에서 반응시켰다. 용해반응이 완료된 후, 효소의 불활성화를 위하여 1 mL의 배양액(10 볼륨% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1 볼륨%의 AA가 첨가된 α-MEM)을 첨가하고, 70 μm-mesh를 이용하여 여과하였다. 그리고 남아있는 세포를 1 mL의 배양액을 이용하여 회수한 후, 다시 70 μm-mesh를 이용하여 여과하고, 1 mL의 배양액을 이용하여 세포를 획득하였다. 최종적으로 획득된 세포는 500 g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 배양액을 이용하여 현탁시킨 후, 헤모싸이토미터를 이용하여 세포의 수 및 상태를 확인하였다.

실시예 3: 세포의 배양 및 동결

실시예 2와 동일한 방법으로 획득된 세포의 1/10은 6-웰 플레이트를 이용하여 배양하고, 나머지 9/10는 동결하였다. 동결 방법은 획득된 세포를 동결액(10 볼륨% DMSO, 20 볼륨% FBS, 및 70 볼륨% α-MEM)을 이용하여 현탁시킨 후에 동결 바이얼로 옮겨 Controlled Rate Freezing(CRF)에서 동결 보관하였다. 보다 자세하게는, 1℃에서 30 분 동안 배양 후에, -2℃/분의 속도로 -9℃까지 온도를 낮춘 후, 이후 -9 또는 -10℃에서 5 분 동안 배양하였다. 그리고 다시 -0.3℃/분의 속도로 -40℃까지 낮춘 후, 이후로는 -10℃/분의 속도로 -140℃까지 동결시키고, 액체 질소 탱크에 보관하였다. 전반적인 실험 방법은 도 1에 나타내었다.

배양에 사용할 세포는 액체 질소 탱크에 보관되어 있던 동결 바이얼을 4℃에서 해동시킨 후에, 배양액을 이용하여 세척한 후에 배양하였다. 그리고 배양을 시작한지 3 일 후에 상층액을 제거하고, 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 이용하여 세포를 세척한 후에, 새로운 배양액으로 교체하였다. 그리고 다시 7 내지 10 일 동안 배양한 후에 콜로니가 겹치기 전에 계대 배양을 실시하였다. 계대 배양은 상층액을 제거하고, PBS를 이용하여 세척한 후에, 1 내지 2 mL의 0.25% 농도의 트립신 용액을 처리하고 배양기에서 3 분간 배양한 후에, 1 내지 2 mL의 배양액을 첨가하고, 용액을 모두 회수하여 500 g에서 5 분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 세포의 수를 측정하였다. 그리고 회수된 세포를 다시 1 X 10³ cells/cm²의 농도로 접종하고 컨플루언시가 70 내지 80 %에 도달하였을 때 다시 계대배양을 실시하였다. 상기 과정에서 오염이 확인된 웰에 대해서는 오염여부를 기록하고 폐기하였다. 3% 항생제만 첨가된 치아 보존 용액을 이용하여 치아를 보관하였을 때 보관 시간에 따른 세포 배양 성공률은 도 2에 나타내었고, 3% 항생제 및 항진균제가 첨가된 치아 보존 용액을 이용하여 치아를 보관하였을 때 보관 시간에 따른 세포 배양 성공률은 도 3에 나타내었다. 그리고 3% 항생제 및 항진균제가 첨가된 치아 보존 용액을 이용하여 치아를 보관하고, 70% 에탄올을 이용하여 추가 세척 단계를 거친 경우와 그렇지 않은 경우의 2 계대배양(P2) 후의 세포 배양 성공률은 도 4에 나타내었다.도 2에 나타난 바와 같이, 발치 후 12 시간 미만의 치아로부터 단일 세포를 분리하고 1차 배양하였을 경우에는 75% 이상의 세포 배양 성공률을 나타내었으나, 치아 보관 시간이 증가될수록 오염 확률이 높아져 세포 배양에 실패율이 높아지는 것을 확인하였다.

그러나 도 3에 나타난 바와 같이, 항생제 및 항진균제를 이용하여 보관한 경우에는 보관 시간과 관계없이 세포 배양 성공률이 모두 높은 것을 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 세포 획득 전 단계에 치아를 70% 에탄올을 이용하여 추가 세척한 경우에 2 계대배양 후에 10% 정도만 오염되었으나, 추가 세척하지 않은 경우에는 50% 정도가 오염된 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 치아 보존 용액에 항생제 및 항진균제를 함께 첨가하여,치아를 보존하고, 세포 획득 과정 전에 70% 에탄올을 이용하여 추가 세척 과정을 거치는 경우 오염으로 인한 세포 배양 실패율을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 동결된 세포의 세포 성장 곡선 확인

본 발명의 방법으로 분리 및 동결 보존된 세포가 정상적으로 성장하는지 확인하기 위하여, 서로 다른 환자로부터 획득된 치아에서 분리하여 동결하였던 세포를 일반적인 방법으로 해동시킨 후에, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1%의 AA가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하여 계대배양하였고, 각각의 계대 배양 시에 획득된 세포의 수를 측정하고, 세포의 형태는 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 모든 시료에서 9회(P9) 이상의 계대 배양에 성공하였으며 세포 성장 곡선 또한 정상인 것을 확인하였으며, 도 5b에 나타난 바와 같이, 세포의 형태 또한 정상인 것을 확인하였다.

실시예 5: 동결된 세포의 중간엽줄기세포 특성 확인

본 발명의 방법으로 분리 및 동결 보존된 세포가 중간엽줄기세포의 특징을 유지하고 있는지 확인하기 위하여, 동결된 세포를 일반적인 방법을 이용하여 해동시킨 후에 배양을 실시하였다. 그리고 계대배양 3 회, 6 회, 및 9 회의 세포를 유세포분석기(Fluorescence activated cell sorter; FACS)를 이용하여 분석하였다. 보다 자세하게는, 각각의 튜브에 1 X 10⁵ cells를 분주하고, 중간엽줄기세포에서 발현되는 것으로 알려진 마커인 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 및 HLA-I 또는 혈액세포에서 발현되는 것으로 알려진 마커인 CD14, CD31, CD34, CD45, CD117, 및 HLA-DR을 검출하는 항체를 각각 세포에 첨가하고, 4℃의 암실에서 30 분간 반응시킨 후에 2 mL의 FACS 버퍼(2 볼륨% FBS가 첨가된 PBS)를 첨가하였다. 그리고 500 g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거해 준 후에, 200 μL의 FACS 버퍼를 이용하여 재현탁시켜준 후에 FACSCalibur를 이용하여 분석을 실시하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 분리 및 동결 보존된 세포의 경우 9회의 계대 배양 후에도 중간엽줄기세포 마커는 지속적으로 높은 발현률을 유지하고 있는 반면, 혈관내피세포 마커의 경우에는 전혀 발현되지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 본 발명의 방법으로 보존된 치아로부터 분리되고, 동결 보관된 세포들은 중간엽줄기세포의 특성을 안정적으로 장기간 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 동결된 세포의 분화 가능 여부 확인

본 발명의 방법으로 분리 및 동결 보존된 세포가 중간엽줄기세포의 분화능을 정상적으로 가지고 있는지 확인하기 위하여, 동결된 세포를 일반적인 방법을 이용하여 해동시킨 후에 배양을 실시하였다. 그리고 계대배양 3 및 6 회의 세포를 각각 조골분화 배양액 키트 또는 지방분화 배양액 키트를 이용하여 분화를 유도하였다. 분화를 유도한지 21 일 후에 조골분화 여부는 Alizarin red 염색을 이용하여 확인하고, 지방분화 여부는 Oil red O 염색을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 계대배양 3회(P3) 및 6회(P6)에서 모두 정상적으로 조골세포 또는 지방세포로 분화된 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 항생제 및 항진균제가 포함되어 있는 치아 보존 용액을 이용함으로써 치아로부터 분리된 줄기세포를 높은 성공률로 보관할 수 있으며, 줄기세포의 특성을 안정적으로 유지함으로써 치아 유래 줄기세포를 이용한 다양한 분야에 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용액으로서,
상기 보존용 용액은 50 내지 90 볼륨%의 에탄올이 첨가된 제 1 용액; 및
1 내지 3 볼륨%의 항생제 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제가 첨가된 제 2 용액을 유효성분으로 포함하는, 보존용 용액.
제 1 항에 있어서,
상기 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 아목시실린, 암피실린, 클라불란산, 세파클러, 세파드록실, 세파드린, 세팔렉신, 세픽심, 세포탁심, 폴리믹신, 트리메토프림, 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 리팜피신, 목시플록사신, 젠타마이신, 아미카신, 토브리마이신, 네오마이신, 에리트로바이신, 아지트로마이신, 클래리트로마이신, 테트라사이클린, 독시사이클린, 및 미노사이클린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 보존용 용액.
제 1 항에 있어서,
상기 항진균제는 암포테리신 B, 미코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸,플루시토신, 클로트리마졸, 및 미카판긴으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 보존용 용액.
제 1 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 용액은 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 인산염완충용액(phosphate buffered saline), 생리식염수, 또는 우유인 것을 특징으로 하는, 보존용 용액.
제 1 항에 있어서,
상기 보존용 용액은 줄기세포 내의 pH 및 삼투압을 유지하며, 줄기세포의 생존능 및 줄기세포능을 유지하는 용도인 것을 특징으로 하는, 보존용 용액.
a) 치아를 50 내지 90 볼륨% 에탄올이 첨가된 제 1 용액을 이용하여 세척하는 단계;
b) 1 내지 3 볼륨%의 항생제 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제가 첨가된 제 2 용액에 세척된 치아를 담는 단계; 및
c) 상기 치아가 담긴 보존용 용액을 4℃에 보관하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존 방법.
삭제
a) 50 내지 90 볼륨%의 에탄올이 첨가된 제 1 용액이 담겨있는 제1 용기; 및
b) 1 내지 3 볼륨%의 항생제 및 1 내지 3 볼륨%의 항진균제가 첨가된 제 2 용액이 담겨있는 제2 용기를 포함하는, 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존용 용기.