CN104107436B - 一种用于保存犬全血的保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于血液保存技术领域，具体公开了一种用于保存犬全血的保存液及其应用。本发明通过添加SOD到CPDA保存液中对犬全血进行保存，探讨SOD对犬全血保存的作用。结果表明SOD添加量和保存效果不成规律性变化，总体来说，添加低活性单位SOD到CPDA保存液中，能增强犬全血保存时间和效果；高活性单位SOD对犬全血保存无明显效果。犬全血保存液的最佳配方为：26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。使用该配方的CPDA保存液对犬全血的保存时间最长可达35～42d。

Description

一种用于保存犬全血的保存液及其应用

技术领域

本发明涉及血液保存技术领域。更具体地，涉及一种用于保存犬全血的保存液及其应用。

背景技术

输血在兽医临床中是常用的急救和治疗措施，血液保存的质量好坏直接影响到输血治疗的效果。随着对血液和相关制品需求的增加，血液的保存越来越受到重视。但是库存血液超过一定储存期限就不再适用于临床，因此，如何提高血液体外保存的质量和期限，便成为一道医学难题。目前国内大多采用半开放式的储存方法，储存时间仅为24小时，而且质量难以保证。1890年瑞士生理学家Arthus和Pages在实验中首次发现血液中加入少许草酸盐或枸橼酸盐可以与钙离子结合而使血液不凝固。1914年比利时人Hustin也发现枸橼酸盐有抗凝作用，并首次提出将枸橼酸盐与葡萄糖混合，以便稀释血液。时隔不久，阿根廷人Agota和美国人Lewisohn也报告用枸橼酸盐抗凝后输血。此后进一步发现葡萄糖能改善红细胞活力，可以延迟输血。经过不断摸索和改进，终于在1943年由Loutit和Mollison配制出酸性枸橼酸盐-葡萄糖（acid-citrate-dextrose solution，ACD)抗凝保存液，不仅彻底解决了输血中的血液凝固问题，而且还能使血液得以保存，这就为血库的建立奠定了基础(Loutit et al, 1943)。

第一次世界大战期间，罗伯逊第一次证明血液存储的可行性，他将全血添加到抗凝剂（柠檬酸）和营养物质(葡萄糖)的混合液中进行保存(Robertson, 1918)。在第二次世界大战期间，血液保存有了进一步的发展。更多的血液和使用较少的抗凝和营养液，使血液中的营养比例接近1:1，红细胞体积分数，储存血细胞比容接近20%。之后第一代现代血液存储解决方案，ACD血液保存液（柠檬酸葡萄糖）出现。ACD血液保存液pH=5.5，通过高温灭菌而不破坏保存液中的葡萄糖。这种保存液相对之前的血液保存方案，可以用更少的ACD保存液保存更多的血液（14mL ACD保存液保存100mL血液）。ACD保存液应用后，各国学者继续探寻延长血液保存，提高血液保存质量的方法。ACD-B和它的后继者柠檬酸-磷酸葡萄糖（CPD），可以将血液储存三周。美国陆军医学研究实验室将腺嘌呤添加到血液保存液中，血液储存可以延长到5周。

各种配方的保存液从原理上分析都是类似的，首先保存液中加入了生物能量物质，保证红细胞能量代谢的顺利进行。此类物质主要代表为葡萄糖。红细胞内糖代谢的意义：ATP的功能，红细胞中的ATP主要用于维持一下几个方面的生理活动：（1）维持红细胞膜上钠泵(Na⁺-K⁺-ATPase)的正常运转，Na⁺和K⁺一般不易通过细胞膜，钠泵通过消耗ATP将Na⁺泵出、K⁺泵入红细胞以维持红细胞的离子平衡以及细胞容积和双凹盘状形态。（2）维持红细胞膜上钙泵(Ca²⁺-ATPase)的正常运转，将红细胞内的Ca²⁺泵入血浆以维持红细胞内的低钙状态。正常情况下，红细胞内的Ca价浓度很低，血浆内钙离子会被动扩散进入红细胞。缺乏ATP时，钙泵不能正常运行，钙将聚集并沉积于红细胞膜上，使膜失去柔韧性而趋于僵硬，红细胞易被破坏。（3）维持红细胞膜上脂质与血浆脂蛋白中的脂质进行交换。红细胞膜的脂质处于不断更新中，此过程需消耗ATP。缺乏ATP时，脂质更新受阻，红细胞可塑性降低，易于破坏。（4）少量ATP用于谷胱甘肽、NAD⁺的生物合成。（5）ATP用于葡萄糖的活化，启动糖酵解过程。其次则是维持适合红细胞生存的晶体和胶体物质，保持合适的渗透压，稳定红细胞的膜结构，如甘露醇，氯化钠等。还有肌苷与磷酸盐主要能维持或提高2，3- DPG水平，起到保护细胞膜和酶活性的目的。腺嘌呤对维持和恢复ATP、DPG水平及红细胞的活性起了重要作用。

然而，对于这种全血保存的现状，我们并不满足。随着研究的不断发展，近期有研究表明，红细胞自身可产生氧自由基：红细胞内含有大量血红蛋白，又富含氧，可形成氧合血红蛋白，氧合血红蛋白科发生自氧化，转变为高铁血红蛋白（MetHb），反映过程中氧被转变为超氧阴离子（O₂ ^-），再通过红细胞内SOD的作用，产生H₂O₂。红细胞内的铁是自由基反应的催化剂。O₂ ^-、H₂O₂通过铁的催化可产生轻自由基，经自由基对蛋白、脂质及核酸等损伤很大。红细胞能在自由基的侵袭中生存，主要由于它有一个有效的抗氧化防御体系，这体系主要有抗氧化酶类和抗氧化剂。如正常红细胞膜表面存在的SOD酶，SOD起第一道防线的作用，它将O₂ ^-歧化为H₂O₂，H₂O₂在过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用下分解成水和O₂。抗氧化剂有防止脂质过氧化及蛋白氧化变性的作用。可见在体内红细胞的氧化与抗氧化作用处于一个均衡的状态，如果自由基产生过多或抗氧化体系有缺陷，都会导致红细胞氧化损伤。一直老化红细胞的抗氧化酶类的活性都明显降低，表面自由基氧化作用还是老化红细胞损伤的重要因素。红细胞内的自由基若不立即清除，长期积累能诱导膜脂质及膜蛋白发生过氧化作用，造成损伤。SOD活性增强，促进吞噬细胞清除有害物质，提高机体清除CIC和脂质过氧化物的能力。

但是，血液在保存过程中，ATP和SOD酶活性逐渐下降，自由基大量堆积，诱导膜脂及膜蛋白发生过氧化作用，使膜结构和功能发生变化，骨架蛋白破坏，血红蛋白变性，导致膜变形性和稳定性下降，细胞逐渐衰亡。这一发现为全血保存技术的研究提供了一个新的方向，但是由于全血中的物质含量是很复杂的，且全血的在保存过程中，各种代谢和生理生化的变化是极其复杂的。延长血液保存时间，提高血液保存质量与多种因素有关。如何降低血液保存过程中的氧化损伤成为近年的一个重要方面。目前还未见有SOD酶和全血保存时间之间的关系的研究报道。阻碍了全血保存技术的进一步发展。

比格犬又名米格鲁猎兔犬，世界名犬之一，是犬类研究用的模式生物。目前犬全血的保存方法主要是采用ACD、CPD和CPDA保存液进行保存，但是这些保存液的效果都不是很理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服犬全血保存技术的缺陷和技术不足，提供一种添加超氧化物歧化酶（SOD）的犬全血保存液。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种保存犬全血的保存液，组成成分如下：

23.3～29.3g枸椽酸钠、2.27～4.27g枸椽酸、1.22～3.22g磷酸二氢钠、20～30g无水葡萄糖、0.175～0.375g腺嘌呤、1000～3000U超氧化物歧化酶冻干粉、800～1200mL蒸馏水。

优选地，所述保存犬全血的保存液的组成成分如下：

26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。

上述保存犬全血的保存液在犬全血保存中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，上述犬全血是指比格犬全血。

上述应用具体是指在犬全血保存过程中添加超氧化物歧化酶或利用上述保存犬全血的保存液保存犬全血，能够保持全血pH值稳定、降低游离血红蛋白浓度、乳酸含量和K⁺含量上升速度，延长比格犬全血的保存时间。对比格犬全血的保存时间可达35～42d。

本发明通过添加SOD到CPDA保存液中对比格犬全血进行保存，探讨SOD对比格犬全血保存的作用。

在探究SOD对比格犬全血保存作用时，在血液保存1d，3d，10d，21d，35d时，测定游离血红蛋白、全血乳酸含量、血浆pH值、K⁺浓度、Cl^-浓度、Na⁺浓度和血氨含量。用联苯胺法测定游离血红蛋白浓度，用酶学测定法测定全血乳酸含量，用硫氰酸汞与Cl^-形成有色络合物测定Cl^-浓度，用Berthlelot反应测定血氨含量，用K⁺与NA-TPB反应产生混浊并稳定的悬浮液测定K⁺浓度，用6-氢氧化锑钾比浊法测定Na⁺浓度，用Starter 3CpH测定仪测定pH值。

在CPDA保存液中添加1000U、2000U、4000U活性的SOD，观测低活性单位SOD对比格犬全血的保存作用。结果表明在保存期间Cl^-浓度、pH随保存时间延长而逐渐降低；K⁺浓度、游离血红蛋白浓度、全血乳酸含量随保存时间的延长逐渐升高。在35d时，1000U组的游离血红蛋白浓度为最低，差异极显著（P<0.01）；2000U组pH值最高，差异极显著（P<0.01），乳酸含量为最低，差异极显著（P<0.01），4000U组K⁺和Cl^-含量最低，差异极显著（P<0.01）。

另外，本发明还对高活性单位SOD对血液保存效果进行了研究，在CPDA保存液中添加5000U、10000U、20000U和40000U活性的SOD，观测高活性单位SOD对比格犬全血的保存作用。结果表明在在保存期间Cl^-浓度随保存时间延长而逐渐降低；K⁺浓度、游离血红蛋白浓度、全血乳酸含量、血氨含量随保存时间的延长逐渐升高。在35d时，5000U组游离血红蛋白浓度为最低，各组无显著差异（P>0.05）；CPDA组乳酸含量为最低，与5000U组差异显著（P<0.05），与10000U和20000U无显著差异（P>0.05），与40000U组差异极显著（P<0.01）；Na⁺浓度40000U为最低，各组无显著差异（P>0.05）；Cl^-浓度40000U为最低，与10000U组差异显著（P<0.05），CPDA组与各SOD组无显著差异（P>0.05）；K⁺含量CPDA组为最低，与5000U组和40000U组无显著差异（P>0.05），与 10000U组和20000U组差异显著（P<0.05）；血氨含量5000U组为最低，与20000U差异显著（P<0.05），与40000U差异极显著（P<0.01），CPDA组与各SOD组无显著差异（P>0.05）。

结果显示：低活性单位SOD能增强比格犬全血保存效果；高活性单位SOD对比格犬全血保存不是很理想，对此发明人分析如下：

超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶类，是生物体内超氧自由基的专一清除剂，是生物体内一种重要的防御酶。超氧化物歧化酶催化的歧化反应对于超氧化物初始浓度只是一级反应，并且在所有已知酶中具有最快的转换数（与底物反应速率）因此反应速率的限制只是在于酶和超氧化物分子间的碰撞频率，即反应速率是“扩散限制性”的。超氧化物的歧化反应与其初始浓度的平方相关，因此虽然高浓度的超氧化物半衰期很短（比如0.1mM浓度下为0.05秒），但低浓度的超氧化物的半衰期相当长（0.1nM浓度下可达14小时）。

SOD 能够清除自由基此解毒反应过程分为两步：第一步是，作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反应，生成另一种物质过氧化氢，即为：M^{（ n+1 ）}+-SOD + O₂ ^-→M-SOD + O₂和Mn⁺-SOD + O₂ ^- + 2H⁺ →M⁽ⁿ⁺¹⁾+-SOD + H₂O₂；第二步是，过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢离反应，最终生成了一种对人体无害的物质水。其第一步反应此过程中产生的H₂O₂对红细胞具有较大的毒性作用。因此，合适SOD活性单位，对血液保存具有重大影响。另一层面来说，目前作为治疗手段的药用SOD若与过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化氢酶合并使用，其治疗效果才更好。

长时间外源性增加过多的SOD，机体将不能维持一定量的自由基水平，免疫细胞使用自由基作为一个方法执行其免疫功能，过低的自由基会引起生理生化过程失常，破坏正常的生理功能，如：机体解毒、吞噬功能下降、凝血过程受阻及胶原蛋白、前列腺素、环核苷酸合成受损等，并引起严重的毒副作用。但随着高浓度自由基对SOD的大量消耗，以及机体的失代偿，SOD的生物合成能力会很快回落到低水平，并与较高浓度的自由基保持新的动态平衡。本实验中添加高活性单位SOD的保存液在游离血红蛋白浓度、乳酸含量、血氨含量等方面与CPDA组比较时，并无更好的保存效果。甚至其含量在保存35d时超过CPDA组。表明高活性单位SOD添加到血液保存液中对血液保存的质量没有帮助。

全血保存中同时保留了血液中的各种物质，包括白细胞、血小板、血浆中的各种蛋白、无机盐和有机物等多种物质。这些物质在血液保存过程中会发生一系列变化，包括水解反应、物质的聚集、变性等。其最终产物对保存中红细胞产生影响。Hyllner的研究表明全血保存时过敏毒素C3a和C5a水平明显升高，单独红细胞保存时C3a和C3a水平低。白细胞在全血在保存时会引起非溶血性发热反应和HLA同种免疫等副反应。白细胞在储存过程中会产生和释放各种生物活性物质和各种细胞因子，对红细胞具有一定损伤。因此，全血在保存过程中，其发生的生理生化变化时极其复杂的。并且，血液在保存过程中发生一系列的生理生化反应，其中最主要的为红细胞的生理生化反应。红细胞质量的高低，直接决定保存血液质量的高低。在保存过程中红细胞的老化和破坏产生一系列有害物质。游离血红蛋白浓度增高，将增加受血方代谢压力，严重者对肾小管有毒性作用，引起严重肾脏损害，危及生命。乳酸蓄积是一种可能导致致命性后果的机体内化学物质紊乱。乳酸浓度愈高，愈容易导致乳酸中毒。血氨浓度过高，增加受血方肝脏代谢压力，严重者可引起中枢神经系统功能障碍。从理论推导，添加SOD能减少自由基对红细胞的危害作用，提高红细胞在保存期间的存活率，减少有害物质的产生。但是，SOD对CPDA保存液中各物质之间的影响并未见报道。以及SOD本身添加的剂量对细胞保存的影响也未见报道。本研究结果表明，添加SOD对各物质的影响并不一样，以及SOD的剂量不同对红细胞保存效果影响也很大，即SOD添加量是非常关键的，且效果与添加量并不是成规律性的变化。

本发明实验表明，在保存35d时，添加SOD的血液保存液保存效果要好于CPDA组。但不同单位SOD组中各项指标的保存效果并没有呈现相应的规律性。本发明人通过大量的探索和研究实验，综合各因素的影响，得出如下结论：添加一定量的SOD到CPDA保存液中对比格犬全血保存有增强效果。其中添加2000U活性的SOD冻干粉对比格犬全血的综合保存作用最好。2000U活性SOD对比格犬全血保存过程中pH值最为稳定，乳酸含量增加最低，游离血红蛋白浓度低于CPDA组，K⁺含量显著低于CPDA组。配方为添加2000U活性SOD冻干粉到CPDA保存液中，即保存比格犬全血效果最佳的超氧化物歧化酶血液保存液的组成成分如下：

26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。

另外，比格犬为犬类标准试验动物，体型适中，性格温顺。国际上很多研究是以比格犬为实验模式动物。本发明可为犬临床血液保存及输血提供实验依据，所保存血液均为比格犬全血。哺乳动物血液主要组成成分及成分类型并没有差异，红细胞体内和体外代谢过程并无太大差异。从理论上推理，本发明得到血液保存液配方对其他哺乳动物血液应该由相同的保护效果。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种保存犬全血的保存液及其应用，尤其是在比格犬全血保存中的应用。通过添加低活性单位SOD到CPDA保存液中对比格犬全血进行保存，能增强比格犬全血保存时间和效果。

本发明还提供了一种比格犬全血保存液的最佳配方为：26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。使用该配方的CPDA保存液对比格犬全血的保存时间最长可达35～42d。

本发明克服了全血保存技术的限制，将全血保存时间提高到42d左右，且保存效果较好，具有很好的推广应用价值和前景。

附图说明

图1为低活性单位SOD各处理保存全血中血红蛋白浓度变化图。

图2为高活性单位SOD各处理保存全血中血红蛋白浓度变化图。

图3为低活性单位SOD各处理保存全血中乳酸含量变化图。

图4为高活性单位SOD各处理保存全血中乳酸含量变化图。

图5为低活性单位SOD各处理保存全血中K⁺含量变化图。

图6为高活性单位SOD各处理保存全血中K+含量变化图。

图7为低活性单位SOD各处理保存全血中Cl^-含量变化图。

图8为高活性单位SOD各处理保存全血中Cl^-含量变化图。

图9为高活性单位SOD各处理保存全血中血氨含量变化图。

图10为低活性单位SOD各处理保存全血中pH值变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用的实验材料如下：

（1）实验动物

12只比格犬（beagle），9～12月龄，体重13±1.2kg，血型为DEA1.1阴性，临床检查健康。定期注射疫苗，无输血经历。

（2）试剂

枸椽酸钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)、枸椽酸(C₆H₈O₇·H₂O)、无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)、腺嘌呤(C₅H₅N₅)均购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇购自广州市东红化工厂。SOD冻干粉购自广州麒宝生物科技有限公司。

游离血红蛋白测试盒、钾测试盒、钠测试盒、全血乳酸测试盒、血氨测试盒均购自南京建成生物有限公司。CPDA血液保存液按如下配方配制：26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、1000mL蒸馏水。按照配方用电子天平准确称取各试剂，用蒸馏水完全溶解。用氢氧化钠和盐酸溶液调CPDA保存液pH至5.7。配制过程中应做到无菌操作。因CPDA保存液含有腺嘌呤，需避光常温保存。保存血液时按每100mL全血14mLCPDA保存液添加。

实施例 1 超氧化物歧化酶（ SOD ）对比格犬全血保存的作用研究

1、血液采集和保存

采血前比格犬禁食12h，不禁水。采血时犬站立保定，颈静脉穿刺部位剃毛，75%（v/v）乙醇消毒。血袋采血200mL/只，按血液密度1.05g/cm³计算。将血袋置于水平电子天平上归零，待天平显示210g时停止采血。各血袋随机分组，并做好标记。将用生理盐水稀释的各单位SOD冻干粉注入相应组的血袋中，轻柔混匀。

每个血袋中血液无菌均分成两份，4℃冰箱无菌保存。注射器采血时，用50mL注射器采血48mL。再将新鲜血液注入高压灭菌的10mL试管中，每管8mL。4℃冰箱无菌保存。

分组情况是：CPDA保存液、添加1000U SOD酶的CPDA保存液、添加2000U SOD酶的CPDA保存液、添加4000U SOD酶的CPDA保存液、添加5000U SOD酶的CPDA保存液、添加10000 USOD酶的CPDA保存液、添加20000 U SOD酶的CPDA保存液、添加40000 USOD酶的CPDA保存液。

2、实验测定

各组保存液保存的全血在保存1d、3d、10d、21d、35d时取样测定。用注射器抽取全血，取血前轻柔混匀。血浆成分测定前，以3000r/min离心分离血浆。测定游离血红蛋白含量、全血乳酸含量、K⁺浓度、Cl^-浓度和血浆pH值。

数据结果用统计软件SPSS V13.0进行处理，采用一维方差分析，所得数据以“均数±标准差（ ±SD）”表示。

3、游离血红蛋白含量测定

血红蛋白具有过氧化物酶的作用，能催化过氧化氢氧化联苯胺产生一系列从绿、蓝、紫的各种颜色变化，在一定范围内其颜色的深浅与血红蛋白浓度成正比。

使用的游离血红蛋白测试盒购于南京建成生物有限公司。使用方法参考说明书进行，具体如下：

（1）显色剂配制：试剂一：试剂二：试剂三为20：20：1。

其中，试剂一：液体80mL×1瓶，2℃～8℃保存；

试剂二：液体80mL×1瓶，2℃～8℃保存；

试剂三：液体5mL×1瓶，2℃～8℃保存。

（2）游离血红蛋白含量测定步骤：

测定管：血浆0.15mL、显色剂2.5mL；

空白管：蒸馏水0.15mL、显色剂2.5mL。

测定管和空白管混匀后，37℃水浴20min，510nm，1cm光径，蒸馏水调零测定各管OD值。

计算公式：游离血红蛋白（mg/L）=126.3×(测定管OD-空白管OD)+3.5041。

（3）测定结果

由表1和附图1所示，随着保存时间的延长，各组保存血液中的游离血红蛋白逐渐升高。其中CPDA组上升最为显著，在35d时已达到分光光度计检测的最大值。1000U组游离血红蛋白浓度随时间上升最慢。CPDA组、1000U组、2000U组在保存10d后游离血红蛋白浓度显著升高（P<0.01），4000U组在保存3d后差异显著（P<0.05），10d后差异极显著（P<0.01）。在保存35d时，1000U组游离血红蛋白浓度为最低，与CPDA组差异极显著（P<0.01），2000U组、4000U组均低于CPDA组，但差异不显著（P>0.05）。

表1各组保存液保存比格犬全血游离血红蛋白变化mg/L

注：同列数据比较，标有不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05），标有不同大写字母表示组间差异极显著（P<0.01），标有相同小写字母表示组间差异不显著（P>0.05）。

血红蛋白正常情况下全部存在与红细胞中，当红细胞被破坏破裂时，红细胞内的血红蛋白释放入血，造成游离血红蛋白浓度上升。所以游离血红蛋白浓度的高低是衡量保存血液中红细胞质量的重要指标。在表1中随保存时间的延长，游离血红蛋白浓度升高，表明红细胞的破裂数量随保存时间而增加。红细胞内的血红蛋白形成氧合血红蛋白，再通过自氧化转变为高铁血红蛋白。这个过程中氧转变成超氧阴离子O₂ ^-，通过过氧化氢酶催化产生H₂O₂。O₂ ^-和H₂O₂通过铁的催化可产生羟自由基。羟自由基对红细胞具有毒性作用，可使蛋白质氧化、脂质氧化、细胞膜起泡等。虽然红细胞自身拥有一套抗氧化体系，但随着体外保存时间的延长抗氧化体系不断减弱，使得红细胞不断受到氧化损伤。在本实验中，添加SOD的保存液组的红细胞被破坏程度要低于CPDA组。因为SOD作为抗氧化剂可以将O₂ ^-歧化为H₂O₂，H₂O₂过氧化氢酶和过氧化物酶的作用水解成水和O₂。可降低自由基对红细胞的破坏作用。

添加高活性单位SOD对游离血红蛋白浓度的影响如表2和附图2所示。

表2 高活性单位SOD组游离血红蛋白浓度变化 mg/L

由表2可知，在10d时各血液保存组全血保存中游离血红蛋白浓度开始出现差异。在35d时，5000U组游离血红蛋白浓度为最低，CPDA组、20000U组和40000U组游离血红蛋白浓度在测定中达到分光光度计的最大值，10000U组在测定时部分值达到测定最大值。

全血在保存过程中，红细胞自身产生的氧自由基能诱导膜脂质及膜蛋白发生过氧化作用，造成损伤。活性氧自由基是细胞内一类重要的信号分子。正常情况下机体氧自由基的产生与自由基清除系统维持在相对平衡的状态。当长时间外源性增加过多的SOD，氧自由基过低会引起生理生化过程失常，影响细胞的正常生理功能。在35d时5000U组和10000U组的游离血红蛋白浓度低于CPDA保存组，而20000U组和40000U组的游离血红蛋白含量均达到测定的最大值。说明添加不同活性单位SOD对血液游离血红蛋白浓度存在影响，且这种影响与全血中活性氧自由基的含量、保存液中各组分相关的。

4、全血乳酸含量测定

以NAD⁺为氢受体，LDH催化乳酸脱氢产生丙酮酸，使NAD⁺转化成NADH。其中，PMS递氢使NBT还原为紫色显色物，显色物的吸光度在530nm时与乳酸含量成线性关系。

使用的全血乳酸测试盒购于南京建成生物有限公司。使用方法参考说明书进行，具体如下：

（1）试剂组成及配制：

蛋白沉淀剂：溶液50mL×1瓶，室温保存6个月，如有结晶，则取上清进行实验。

试剂一：酶稀释液60mL×1瓶，4℃～8℃冰箱保存6个月。

试剂二：酶储备液0.6mL×1瓶，4℃～8℃冰箱保存6个月；用时用一次性吸头取样。

试剂三：显色溶液6mL×2瓶，4℃～8℃冰箱保存6个月。

试剂四：粉剂×2支，0℃以下冷冻保存6个月。

试剂五：终止液60mL×2瓶，4℃～8℃冰箱保存6个月。

试剂六：3mmol/L标准液，2mL×1支，4℃～8℃冰箱保存6个月。

酶工作液配制：临用前将试剂二（酶储备液）和试剂一（酶稀释液）按照1：100的体积比进行混合，现用现配，4℃保存24小时内有效。

显色剂的配制：使用前取试剂四粉剂1支倒入1瓶试剂三中，待粉剂全部溶解后，用微量移液器取少许液体打入小离心管中，反复颠倒离心管，再用微量移液器将离心管中的液体转移到瓶中，如此反复2～3次，使二者充分混合，配成显色剂，4℃～8℃冰箱壁光保存。

（2）全血样本处理：

试管编号后，在各管中加入0.6mL蛋白沉淀剂。对号加入0.1mL保存全血后轻轻颠倒混匀。静置10min后，3500～4000r/min离心8min，取上清进行乳酸测定。

分组及操作如表3所示。

表3

混匀，530nm，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。

计算公式：

全血乳酸含量（mmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）÷（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准浓度（3mmol/L）×样本测试前稀释倍数

（3）测定结果

由表4和附图3所示，各血液保存组乳酸含量随血液保存时间延长而升高，CPDA组、1000U组、4000U组在保存3d时差异显著（P<0.01），2000U组在保存21d时差异显著（P<0.01）。血液保存3d时添加SOD冻干粉的实验组均与CPDA组差异显著（P<0.01）。保存35d时CPDA组乳酸含量最高，2000U组乳酸含量为最低。

表4各组保存液保存比格犬全血乳酸变化mmol/L

乳酸在体内的增加主要是血氧的缺乏，导致三羧酸循环中丙酮酸需氧氧化障碍，糖酵解速度增加，即丙酮酸还原成乳酸的速度增加，血中乳酸与丙酮酸比值增高及乳酸增加。乳酸蓄积是一种可能导致致命性后果的机体内化学物质紊乱。乳酸浓度愈高，导致乳酸中毒。红细胞没有线粒体，90%的能量依赖糖酵解供给，10%来自磷酸戊糖途径生成ATP。有研究表明在血液保存过程中每消耗1mol葡萄糖就生成2mol乳酸。糖酵解时丙酮酸还原成乳酸，致使保存全血的乳酸含量随保存时间增加而增高。在本实验中，血液保存35d时全血乳酸含量各SOD保存液组均要低于CPDA保存液组。SOD可以抵抗氧自由基红细胞对红细胞的损伤，有效维持红细胞ATP含量。这样使得糖酵解速度降低，从而丙酮酸还原成乳酸的速度降低。保存血液的乳酸含量降低有助于提高保存血液的质量，降低输血的风险。

添加高活性单位SOD对全血乳酸含量的影响如表5和附图4所示。

表5 高活性单位SOD全血乳酸含量变化 mmol/L

由表5可知，随保存时间延长，各血液保存组全血乳酸含量增长程度各不相同。CPDA保存液组在3d、10d、21d和35d时全血乳酸含量均为最低。添加SOD保存液各组中，在35d时40000U组全血乳酸含量为最高，与10000U组差异极显著（P<0.01）。10000U组的全血乳酸含量与CPDA组无显著差异（P>0.05）。

保存血液中乳酸增加是因为丙酮酸酵解作用增强，丙酮酸还原成乳酸。由上表可知在3d时各组全血乳酸含量无显著性差异（P>0.05），随保存时间延长添加SOD的保存液各组中乳酸含量均高于CPDA组。说明添加SOD的各保存液组丙酮酸还原成乳酸增加。添加SOD的保存液组中，其抗氧化能力的增强，氧自由基减少，使得H⁺增加。NADH和H⁺反应增强反而有利于丙酮酸还原成乳酸。

5、K⁺浓度测定

在碱性介质中，经蛋白沉淀剂处理后的血清样本中的钾离子与NA-TPB反应产生浑浊并有稳定的悬浮液。浑浊度与样本中钾离子浓度成正比。

使用的钾测试盒购于南京建成生物有限公司。使用方法参考说明书进行，具体如下：

（1）试剂组成及配制：

试剂一：甲液20mL×1瓶，4℃保存6个月；乙液2.5mL×1瓶，4℃保存6个月。

试剂二：NA-TPB工作液25mL×1瓶，4℃保存6个月。

试剂三：0.4mmol/L甲标准液1mL×1瓶，4℃保存6个月。

蛋白沉淀剂配制：按甲液：乙液=8：1的比例进行配制，现用现配。

（2）样本前处理：

取血清20μL加蛋白沉淀剂180μL，充分混匀，3500r/min离心5min，取上清50μL进行测定。

分组及操作如表6所示：

表6

混匀，放置5分钟，450nm，测各孔吸光度。

计算公式：

血清钾含量=（测定孔OD值-空白孔OD值）÷（标准孔OD值-空白孔OD值）×标准浓度（0.4mmol/L）×样本前处理稀释倍数（10倍）×样本测试前稀释倍数

（3）测定结果

由表7和附图5所示，各试验组K⁺含量均随保存时间延长升高，在保存3d时与保存1d时差异显著（P<0.01）。添加SOD冻干粉组在保存35d时K⁺含量均显著低于CPDA组（P<0.01），其中4000U组K⁺含量为最低。

表7 各组保存液保存比格犬全血血浆K⁺变化mmol/L

血液随着保存时间的延长，因红细胞膜ATP活性降低Na⁺-K⁺泵功能失调，红细胞膜脆性及通透性发生改变，红细胞破坏，细胞内钾离子向血浆释放，使血浆钾离子浓度升高。在本实验中CPDA保存液组的血浆钾离子含量在保存35d时为最高。添加SOD的保存液组血浆钾离子含量增加程度均低于CPDA保存液组。说明在添加SOD的保存液中储存红细胞内钾离子释放量减少。在SOD对红细胞的抗氧化损伤作用下，能更好的维持红细胞完整性。

添加高活性单位SOD对K⁺浓度的影响如表8和附图6所示。

表8 高活性单位SOD全血中K⁺浓度变化 mmol/L

由表可知，在血液保存的过程中随时间增加K⁺浓度上升，在35d时达到最高值。各组在保存1d、3d、10d和21d时，K⁺浓度无显著性差异（P>0.05）。在保存35d时，CPDA组与10000U组、20000U组、40000U组K⁺浓度差异显著（P<0.05），5000U组与其他四组K⁺浓度无显著性差异（P>0.05）。

红细胞内K⁺浓度高于红细胞外液，红细胞外液Na⁺浓度高于红细胞内液。这种离子浓度差的形成和维持是靠红细胞膜中Na⁺-K⁺泵来完成的，能量来自血液中ATP供给。其作用是逆着浓度梯度将Na⁺由红细胞内液移向红细胞外液，将K⁺向细胞内液运输。血液在保存时，贮存于4℃，ATP含量下降，Na⁺-K⁺泵活动减弱。红细胞外液的K⁺升高时向内液运输减弱。同时红细胞的破裂也使K⁺浓度上升。SOD与机体中产生的超氧阴离子自由基产生歧化反应，此过程产生H₂O₂。高活性单位SOD使得保存液抗氧化性增强，H₂O₂含量增加，其毒性作用破坏红细胞膜，Na⁺-K⁺泵活性失调。本实验中添加高活性单位SOD的保存液组，在血液保存35d时K⁺浓度均高于CPDA组。说明在添加高活性单位SOD的保存液组中，红细胞内外K⁺平衡没有CPDA组稳定。

6、Cl^-浓度测定

硫氰酸汞处理氯离子形成有色络合物，其颜色的深度与氯离子浓度成正比。

使用的测试试剂盒购于南京建成生物有限公司。使用方法参考说明书进行，具体如下：

（1）试剂组成及配制：

试剂一：100mmol/L氯标准液（355mg/dL）0.5mL×1支，2℃～8℃保存。

试剂二：硫氰酸汞工作液30mL×1瓶，2℃～8℃保存。

20mmol/L氯标准液的配制：用去离子水将100mmol/L氯标准液进行5倍稀释（即1：4稀释）。

分组及操作如表9所示：

表9

混匀后，放置5～10min，280nm，酶标仪测定各孔OD值。

计算公式：

血浆氯离子含量（mmol/L）=（测定孔吸光度-空白孔吸光度）÷（标准孔吸光度-空白孔吸光度）×标准品浓度（100mmol/L）×样品测试前稀释倍数。

（2）测定结果

由表10和附图7所示，Cl^-含量随保存时间延长而降低，在保存35d时均显著低于保存1d时（P<0.01）。在保存1d时，1000U组Cl^-含量显著低于CPDA组Cl^-含量（P<0.01），2000U组Cl^-含量显著高于CPDA组Cl^-含量（P<0.05），4000U组Cl^-含量与CPDA组无显著性差异（P>0.05）。在保存35d时，1000U组、2000U组Cl^-含量与CPDA组Cl^-含量无显著性差异（P>0.05），4000U Cl^-含量显著低于CPDA组Cl^-含量（P<0.01）。

表10 各组保存液保存比格犬全血血浆Cl^-变化mmol/L

Cl^-是血浆电解质中的主要阴离子，占阴离子总量的70%左右。Cl^-较易通过红细胞膜，在维持血浆渗透压和酸碱平衡等方面起重要作用。Cl^-和碳酸氢根离子在血浆和红细胞之间形成一种平衡，当碳酸氢根从红细胞中渗透出来的时候，红细胞中的阴离子数目减小Cl^-就进入红细胞中，以维持电性平衡。反之，也是一样。本实验中Cl^-浓度在全血保存35d时比1d时降低，但各组间变化不大。说明在血液保存的过程中Cl^-浓度保持相对稳定。

添加高活性单位SOD对Cl^-含量的影响如表11和附图8所示。

表11 高活性单位SOD全血中Cl^-含量变化 mmol/L

由表可知，Cl^-浓度随血液保存时间的延长而降低。各组间Cl^-浓度在1d、3d和10d时无显著性差异（P>0.05）。在21d时，CPDA组和5000U组Cl^-浓度差异显著（P<0.05）。在35d时，10000U组和40000U组Cl^-浓度差异显著（P<0.01）。

血浆Cl^-是决定血浆阴离子的主要离子之一，对维持血浆渗透压具有重要意义。血液在保存过程中随保存时间的延长pH值下降。红细胞内pH下降即H⁺浓度上升，Cl^-穿过细胞膜进入红细胞达到阴阳离子间平衡，血浆中Cl^-浓度降低。

7、血氨的测定

用蛋白沉淀剂沉淀血液蛋白并破坏酶活性，防止离体后产生游离氨，同时除去大部分干扰显色物质。用Berihelot反应使无蛋白滤液中氨显色，与标准液比较测定血液氨含量。

使用的血氨测试盒剂购于南京建成生物生物有限公司。使用方法参考说明书进行，具体如下：

（1）试剂组成与配制：

试剂一：蛋白沉淀剂（1）60mL×l瓶，2℃～8℃保存。

试剂二：蛋白沉淀剂（2）60mL×l瓶，2℃～8℃保存。

试剂三：显色剂（1）60mL×l瓶，2℃～8℃保存。

试剂四：显色剂（2）60mL×l瓶，2℃～8℃保存。

试剂五：7mmol/L标准储备液 1mL×l支，2℃～8℃保存。

350umol/L标准应用液配制：用标准品稀释液按1:19将7mmol/L标准储备液20倍稀释后备用。

试剂六：标准品稀释液 20mL×l瓶，2℃～8℃保存。

分组及操作如表12所示。

表12

充分混匀，37℃水浴20min，630nm，水调零，1cm光径，测定各管吸光度值。

计算公式：

血氨含量（μmol/L）=（测定管OD-空白管OD）÷（标准管OD-空白管OD）×标准浓度（350μmol/L）×样本测试前稀释倍数。

（2）测定结果

添加高活性单位SOD对血氨含量的影响如表13和附图9所示。

表13 高活性单位SOD全血中血氨含量变化μmol/L

由表可知，各组保存液中血氨浓度随全血保存时间的延长而升高，到35d时测得最高值。各组血氨浓度在1d、3d和21d时无显著性差异，10d时5000U与20000U和40000U组存在显著差异（P<0.05），与CPDA组和10000U组无显著差异（P>0.05）。35d时，40000U组血氨浓度为各组中最高，与5000U组和10000U组差异极显著（P<0.01）。CPDA组在35d时，血氨浓度与各添加SOD组保存液无显著性差异（P>0.05）。

血液在保存过程中CO₂转化成H₂CO₃ ^-，CO₂含量下降，通过酶促反应，全血中的蛋白质和氨基酸的化合物分解产生氨，导致血氨含量升高。全血随着保存时间的延长，红细胞破裂使蛋白质、谷氨酰胺和各种酶含量增加，导致保存血液中氨产生增加。SOD是蛋白酶，随着添加量的增加其中部分氨基酸可能分解产生氨，使血氨含量增加。由上表可知40000U组保存液血氨含量在35d时为最高，5000U组、10000U组和20000U组血氨含量低于CPDA组，可能与SOD对红细胞膜的抗氧化作用使膜蛋白分解减少有关。

8、pH值的测定

按照Starter 3C实验室pH计使用说明书步骤进行测定。

由表14和附图10所示，在血液保存过程中随保存时间延长CPDA组pH值显著下降（P<0.01），1 000U组、2 000U组、4 000U组pH值先升高后下降。对比保存35d与1d时，1 000U组pH值差异极显著（P<0.01），2 000U组差异显著（P<0.05），4 000U组差异不显著（P>0.05）。添加SOD冻干粉的血液保存组pH在3d后均显著高于CPDA组（P<0.01）。

表14 添加低活性单位SOD各组保存液保存比格犬全血pH值变化

血液中含有多对酸碱缓冲作用的物质，使得血液的酸碱度不会发生很大的变化，从而维持在相对稳定的状态。在本实验中添加SOD的血液保存组的pH一直维持在7.0以上，在保存过程中有轻微升高，之后随保存时间降低。CPDA保存液组在保存过程中3d以后pH呈下降的趋势。在血液保存的研究中认为保存液呈弱酸性时pH<6.0，ATP比较稳定、细菌生长较慢。新的研究表明，pH>7.0时可以加快糖酵解使ATP得产生速度高于利用速度，且血红蛋白在pH>7.0时有很好的缓冲性能，产生的酸性物质不会使pH降低。提高pH有助于血液的保存。

综上所述，游离血红蛋白含量高底可以代表红细胞的破坏程度。在保存1d时，各血液保存组游离血红蛋白<40mg/L。随保存时间延长各组游离血红蛋白含量均上升，35d时CPDA组的游离血红蛋白含量最高，1000U组的游离血红蛋白含量显著低于其他三组。这表明在CPDA保存液中添加SOD有助于减少游离血红蛋白的产生。在本实验中，CPDA组的pH随时间延长由1d时的7.23下降到35d时的6.51，添加SOD组的全血在保存过程中pH先升高后下降，在35d时仍高于7.0，2000U组pH值最高。表明血液保存液中添加SOD冻干粉能提高保存血液的pH值，延长保存时间。

在35d时，添加SOD的保存液中全血乳酸和K⁺含量都要低于CPDA组保存液。说明添加SOD后的CPDA保存液对比格犬全血的保存效果更好。本实验结果表明在保存35d时，2000U组的全血乳酸含量为最低，4000U组的K⁺和Cl^-含量为最低。

通过本实验表明，在保存35d时，添加SOD的血液保存液保存效果要好于CPDA组。但不同单位SOD组中各项指标的保存效果并没有呈现相应的规律性。

因此，本发明可以得出如下结论：添加SOD到CPDA保存液中对比格犬全血保存有增强效果。其中添加2000U活性的SOD冻干粉对比格犬全血保存作用最好。2000U活性SOD对比格犬全血保存过程中pH值最为稳定，乳酸含量增加最低，游离血红蛋白浓度低于CPDA组，K⁺含量显著低于CPDA组。配方为添加2000U活性SOD冻干粉到CPDA保存液中，即保存比格犬全血效果最佳的超氧化物歧化酶血液保存液的组成成分如下：

26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。

以上数据是对SOD酶添加到CPDA保存液后，保存液对犬全血保存作用的研究结果，另外，本发明还进行了添加SOD酶的CPDA保存液对犬全血的保存时间进行了研究，大量实验验证结果显示，添加2000U活性SOD冻干粉到CPDA保存液中，对比格犬全血的保存时间可以延长到42d左右。

Claims (7)

1.一种保存犬全血的保存液，其特征在于，组成成分如下：23.3～29.3g枸橼酸钠、2.27～4.27g枸橼酸、1.22～3.22g磷酸二氢钠、20～30g无水葡萄糖、0.175～0.375g腺嘌呤、1000～3000U超氧化物歧化酶冻干粉、800～1200mL蒸馏水。

2.根据权利要求1所述保存犬全血的保存液，其特征在于，组成成分如下：26.30g枸橼酸钠、3.27g枸橼酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。

3.根据权利要求1或2所述保存犬全血的保存液，其特征在于，犬是指比格犬。

4.权利要求1或2所述保存犬全血的保存液在犬全血保存中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述犬全血是指比格犬全血。

6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，是保持全血pH值稳定、降低游离血红蛋白浓度、乳酸含量和K⁺含量上升速度，延长比格犬全血的保存时间。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，对比格犬全血的保存时间可达35～42d。