JPH05503075A - 血球のａｔｐおよび２，３ｄｐｇ濃度を長時間維持する赤血球の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 血球のＡＴＰおよび２．３ＤＰＧ濃度を長時間維持する赤血球の保存方法 本出願は、米国特許出願第０７／４１７７６１の一部継続出願であり、上記特許 出願は１９８９年１０月６日に出願されたもので、その内容を本明細書に引用し て編入する。

発明の背景 ヒト赤血球の冷却貯蔵には２種の一般法がある：１）そのままの抗凝固剤溶液中 に冷却貯蔵する：２）抗凝固剤溶液および血漿から赤血球を分離し、赤血球貯蔵 用に特別に作られた溶液中に再懸濁した後冷却貯蔵する。

１）そのままの抗凝固剤中に保存する場合には、全血を通常のとおりクエン酸塩 、リン酸塩、デキストロース（ｄ−グルコース）およびアデニンを含有する溶液 （ＣＰＤＡ−１）、ｐＨ５．７中に取り出す。

血液を約１５００９（低回転）で遠心し、血漿を除却し、赤血球懸濁液はへマド クリット約７５％にする。赤小板は２回めの沈降により血漿から除去できる。

２）保存溶液中への赤血球の再懸濁および貯蔵の場合、血液を通常のとおりクエ ン酸塩、リン酸塩、グルコースのみを含有する溶液、ｐＨ５，７中に取り出す。

血液は上記（１）で記載されたのと同じ速度で遠心するが、赤血球は次にアトソ ールかまたはヌトリセル（表１参照）（ｐＨは各々５．７および５．８）のどち らかに再懸濁し、赤血球懸濁液のへマドクリットを約５５％にする。

貯蔵中のヒト赤血球は形態学的および生化学的変化をこうむり、この変化にはア デノシン三リン酸（ＡＴＰ）および２，３−ジホスホグリセリン酸塩（２，３Ｄ ＰＧ）の血球白濃度の低下、血球の形態学的変化並びに漸次的溶血が含まれる。

ＡＴＰ濃度は最初わずかに上昇した後、６週間の貯蔵後で最初の水準の３０−４ ０％まで漸次的に減少する。赤血球の細胞膜の流動性は、赤血球が膵臓および肝 臓の狭い流路を通過するのに不可欠であり、ＡＴＰの濃度におおよそ相関する。

２．３ＤＰＧの濃度は、約３または４日の貯蔵の後に急速に低下し、約１０日ま でにゼロに近づく。２．３ＤＰＧは赤血球中のヘモグロビンが組織に酸素を運搬 する能力に関係する。貯蔵中におこる形態学的変化は最終的には血球上の串剌を 発達させる（エキノサイトーシス）。これらの串剌は小胞として成長し始め、血 球の表面積の容積に対する比率および狭い流路を通過するときの変形能力は極端 に変化する。このような血球は輸血後膵臓および肝臓により循環から濾過して除 去される。輸血を許容可能にするために、輸血された赤血球の少なくとも７５％ は、輸血後２４時間循環されなければならない。赤血球の保存期間はこのことを 基礎として決定する。赤血球のＡＴＰ濃度および形態は、輸血用貯蔵血球の適性 の指標として役立つ。

輸血可能な赤血球の保存期間を延長させるために、ＡＴＰおよび可能な場合は２ ．３ＤＰＧの急速な減少を防ぐある種の方法で、血球を貯蔵するかまたは処理す る必要がある（例えばハルメニング、米国特許第４１１２０７０号およびゴール ドスティン、米国特許第４４２７７７７号参照）。赤血球の保存期間を延長させ る溶液は公知である（例えばハルメニング上記およびメリーマン、米国特許第４ ５８５７３５号、これらの開示は本明細書で引用して全てを編入する）。このよ うな溶液の典型的なものでは、クエン酸塩、リン酸塩、グルコースおよびアデニ ン並びに場合によって血球のＡＴＰ水準を維持することにより保存期間を延長さ れる機能があるその他の成分を含有する。ミナカミら（ブルーワー、Ｃ，Ｊ、編 入、エリスロサイト・ストラフチャー・アンド・ファンクション、ニューヨーク 、リス、１４９−１６６頁（１９７５年）中）は、４℃で測定した血球内ｐＨ（ 本明細書では以降ｐＨｉとして示す）が約７．４であり、ｐＨｉが血液保存に関 係すると考えられるパラメーターであると示唆される場合、赤血球中のグルコー ス分解活性が増強されると報告している。

しかしながら人工的に干渉する（例えばハルメニング、上記参照）ことな（、ま たは輸血用に認化されていないアンモニウムのような化合物を含有（例えばメリ ーマン上記、参照）しないで、長時間貯蔵中にＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの両方 を高水準に維持する溶液は、公知ではない。

長期間の貯蔵に関連するＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの減少並びに形態学的変化を 幾分逆行させることができ、それにより赤血球を回復させることができる方法お よび溶液は考案されている。しかしながら回復化溶液は、輸血には適していない ；これらは血球を輸血する前に除去しなければならない。従って、この方法に関 連する汚染の危険性がある。米国の法律では、このように処理した血球は細菌繁 殖の危険性を最低限に抑えるために２４時間以内に輸血しなければいけないとい うことを要求している。血球を汚染の危険にさらさないで、類似の系統の回復化 溶液を除去できる装置が今では開発されている。しかしながら、血球を回復させ た後、血球は輸血に適した溶液で洗浄しなければならない。しかしながら通常の 洗浄溶液、例えばグルコース−生理食塩水溶液は、２４時間を越す貯蔵には適し ていない。

赤血球を洗浄しなければならない実例は他にもある。例えば、グリセリン中冷凍 して貯蔵する赤血球は、使用する前に洗浄して脱グリセリン化しなければならな い。モー１ら（ボックス・サンプ、５３巻１９−２２頁（１９８７年）はリン酸 塩緩衝塩化ナトリウム洗浄溶液を用いて凍結赤血球を脱グリセロール化し、アデ ニン、アスコルベート−２−リン酸塩、リン酸三ナトリウム、デキストロールお よびマンニトールを含有する溶液、ｐＨ１１，０および容量オスモル濃度４４６ ミリオスモルに再懸濁することについて報告している。

ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧは共に２１日間十分に維持した。しかしながらアスコ ルベート−２−リン酸塩は輸血用の溶液としての使用は認められていない。それ に続く発表では、カルメンら（トランスフュージョン２８巻１５７−１６１頁（ １９８８年））は、アスコルベート−２−リン酸塩含有溶液中５週間しか貯蔵し ていない赤血球は初期値の２２．２％の水準までＡＴＰを喪失し、２４時間の生 存は７５％以下になると報告している。

その他の処置に供した赤血球もまた輸血する前に洗浄しなければならない。例え ばゴールドスティン、上記は、血球がその細胞機能を喪失しない条件下で、Ａ型 光血球からストロマのＢ型抗原決定基の末端ガラクトース部分を除去することに よりＢ型赤血球を０型赤血球に転換し、それにより輸血に適したものにする方法 を開示する。

末端ガラクトースの酵素開裂は低いｐＨて行わなければならない。

酵素処理の後、赤血球を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で緩衝した等張塩化ナ トリウム、ｐＨ７，４で、一部は残留酵素を洗い流すため、および一部はｐＨを 上げるために洗浄する。細胞の代謝実験により、この処理直後のＡＴＰ水準は９ ０％以上を保ち、２．３ＤＰＧ水準は８０−９０％であることが示されるが、こ れらの水準はこの洗浄液中に引き続いて貯蔵する間は維持できない。

赤血球の輸血には、ウィルス例えば非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスおよびヒト免疫不全 ウィルスに感染している供与者から得られた血液により受容者がウィルス感染す る危険性がある。この危険性を軽減するために、血球をウィルスを不活化する薬 物で処理する方法が報告されている。赤血球の毒性を取り除くが、次に赤血球を 輸血に適したものにするために不活化剤を除去する目的で洗浄しなければならな い。このような血球を続いて貯蔵できる再懸濁溶液は入手できない。

特定の情況下では、冷蔵赤血球の保存期間がこの４２日を越すのが望ましい。選 択的な手術に使用するために取られたオートロガス単位は、手術と実施できる前 に期限が切れるかもしれない。エイズまたは肝炎に感染しているかどうかを明白 にするために供与者の再検査を可能にするために血液を数か月貯蔵すべきである ということも提案されている。手間がかかり経費が高くつく凍結以外に、このよ うな能力のあるものが存在することは知られていない。

輸血可能な赤血球が危急に必要とされているために、ＡＴＰと２゜３ＤＰＧの両 方の血球内水率が高く、形態学的に良好で、洗浄後の溶血が少ないということを 維持する方法および溶液を開発するだけでなく、現在用いられている方法により 成就されるものよりも良好な保存特性を有する、未洗浄赤血球の日常的回収およ び再懸濁の方法をも開発するのが非常に重要である。さらに、輸血可能な赤血球 の洗浄と貯蔵の両方に適した溶液を開発する必要がある。

当業界では、赤血球を回収後貯蔵するが、洗浄はしない方法を開発することが非 常に必要である；このような方法は実質的に臨床において重要である。

また輸血可能な赤血球中のアデニン量は、腎毒性が懸念されるため、減少させる か排除するのが望ましい。

本発明の要旨 本発明は、予め洗浄するか、または洗浄していない輸血可能な赤血球の貯蔵保存 期間を延長させるだめの改善方法であって、以下の事を含む方法を提供する・上 記血球の血球内ｐＨを正常な生理学的水準（ｐＨ７，４，２２℃）に匹敵するか またはそれ以上の水準まで上昇させる；溶質に関して低張で血球を透過せず、輸 血用として臨床的に可能な、生物学的に適合した緩衝化溶液中に上記血球を貯蔵 する。

本発明はまた、貯蔵する前に赤血球の血球中ｐＨを上昇させる方法をも提供する 。

本発明はさらに、輸血可能な赤血球の保存期間を延長する方法であって、実質的 に塩化物を含有せず、少なくとも１種の実質的に非透過性溶質を含有する、機能 的に低張で、生物学的に適合する緩衝溶液中上記血球を洗浄および貯蔵すること を含む方法を提供する。

本発明は、赤血球内の塩化物濃度を低下させることを含む、輸血可能な赤血球の 保存期間を延長させる改善方法を提供する。

本発明は、輸血可能な赤血球の保存期間を延長させる方法であって、上記血球の 血球内ｐＨを正常の生理学的水準、ｐＨ７，４よりも高い水準まで上昇させる生 物学的に適合した緩衝溶液で上記血球を洗浄することを含む方法を提供する。

また、赤血球の保存期間を延長する方法であって、血球を生物学的に適合した緩 衝溶液で低ヘマトクリットに希釈し、それにより赤血球の保存期間が、同一緩衝 液中ヘマドクリット約５５％で貯蔵した赤血球の保存期間に比較して延長される ことを含む方法も提供する。

本発明はまた、赤血球保存溶液の成分としてアデニンの要求を減じるかまたは排 除する。

本発明は、貯蔵溶液のアデニンを減少させまたは排除し、赤血球を形態学的に改 善し、溶血を減じ、ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの血球内水率を上昇させ、延長し た期間中生理学的濃度でまたはそれ以上で上記水準を維持する方法を提供するこ とにより、−子め洗浄したまたは洗浄しない一赤血球の貯蔵方法を有意に改善す る。

本発明の実施において、赤血球の保存期間は、従来の技法を用いて貯蔵する赤血 球の保存期間に比較して有意に改善される。

図面の簡単な説明 図１は赤血球をリン酸塩洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−０−一〇−−０−）ま たは生理食塩水洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−・−一・−−・−）、ＡＲＣ３ ２中４℃±２℃で延長して貯蔵している間の赤血球内の２．３ＤＰＧのパーセン テージを表す。図中１００％は新鮮赤血球内の２．３ＤＰＧ量である。

図２は赤血球をリン酸塩洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−〇−−０−−〇−）ま たは生理食塩水洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−・−−・−一・−）、ＡＲＣ３ ２中４°Ｃ±２℃で延長して貯蔵している間の赤血球内のＡＴＰのパーセンテー ジを表す。図中１００％は新鮮赤血球内のＡＴＰ量である。

図３は赤血球をリン酸塩洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−〇−−〇−−〇−）ま たは生理食塩水洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−・−−・−−・−）、ＡＲＣ３ ２中４℃±２℃で延長して貯蔵している間の、または赤血球を生理食塩水洗浄液 で洗浄後、ｐＨ５，７でＣＰＤＡ−１中４℃±２℃で延長して貯蔵している間（ −Ｘ　−−Ｘ　−−Ｘ　−）の赤血球のモルフォロジカル・インデックス（形態 学的指標）を表す。

図４は赤血球をリン酸塩洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−〇−−〇−−０−）ま たは生理食塩水洗浄液、ｐＨ７，４で洗浄後（−・−−・−一・−）、ＡＲＣ３ ２中４℃±２℃で延長して貯蔵している間の、または赤血球を生理食塩水で洗浄 後、ｐＨ５，７のＣＰＤＡ−１中４℃±２℃で延長して貯蔵している間（−Ｘ　 −−Ｘ　−−Ｘ　−）の赤血球の溶血のパーセンテージを表す。図３および図４ は、高ｐＨ溶液中の赤血球貯蔵の優越性を示すが、図１−図４は塩化物濃度を低 下させることが決定的に重要であることをも示している。

図５はＡＲＣ８、ｐＨ７，５（ＯＯＯ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水洗浄液（ １５４ｍＭ　ＮａＣ１，２ａ＋Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，７、７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ　 Ｏ４）、ｐＨ７，３１（−・−−・−−・−）で洗浄後、ＡＲＣ８、ｐＨ７，５ ，４℃±２℃で６週間貯蔵した赤血球のインデックス並びにＡＴＰ（−）および ２．３ＤＰＧ（−−−−）のパーセンテージの比較を表す。この図はリン酸塩緩 衝液を生理食塩水洗浄液に添加しても、塩化物濃度を低下させ、かつｐＨ７，４ で強く緩衝する洗浄液と比較して、ＡＴＰおよび２，３ＧＴＰの維持に関して、 有益性を供し得ないことを示す。

図６は生理食塩水洗浄液、重量オスモル濃度２８６、ｐＨ７，４またはクエン酸 ナトリウム（１２２ｍＭ）、重量オスモル濃度２９７、ｐＨ７，３９のどちらか で洗浄後、続いてＡＲＣ９Ｃ，ｐＨ７，５中４℃±２℃で貯蔵した赤血球内のＡ ＴＰ（−’）および２，３ＤＰＧ（−−−−）の水準の比較を表す。この図はｐ Ｈ７，４で極わずかしか緩衝能力のないクエン酸塩で洗浄しても、２．３０ＰＧ の維持に関して生理食塩水洗浄液よりも優れており、これはこの非透過性陰イオ ンにより誘起される塩化物シフトのためである。

図７は血球をｐＨ７，４に調整した等張クエン酸ナトリウムを含有する洗浄液で 連続的に洗浄したときの、血球外ｐＨ（−〇−−０−−０−）および血球内ｐＨ （−１−−Ｉ−Ｉ　）の変化を示す。血球洗浄時に、拡散性のあるイオン、例え ば塩化物は希釈され、それにより濃度が低下する。血球内ｐＨおよび血球外ｐＨ の間の最大の差は、塩化物濃度が、本来の値の約１０％まで希釈された時に観察 された。

図８は血球をｐＨ７，４に調整した等張リン酸ナトリウムで漸次的に洗浄したと きの、血球外ｐＨ（−０−−０−−０−）および血球内ｐＨ（−Ｉ−−Ｉ−−Ｉ −）の変化を示す。リン酸塩は赤血球膜により十分に排除されないので、この洗 浄溶液は血球内ｐＨと血球外ｐＨの間の差を生じない。しかしながら、リン酸ナ トリウムはｐＨ範囲７゜０−８．０で良好な緩衝能力を有するので、血球内ｐＨ の水準は洗浄溶液のｐＨの水準まで上昇する。

図９は塩化物シフトを誘起するクエン酸塩の利点（図７参照）並びに血球内およ び血球外の両方のｐＨを支持するリン酸塩の利点（図８参照）を組み合わせに溶 液（ＡＲＣ８）で洗浄した細胞のｐＨ効果を説明する。血球内ｐＨ（−１−−１ −−Ｉ−）、血球外ｐＨ（−０−−０−一〇−）。

図１０は最初に、ｐＨ７，４に調整したリン酸塩緩衝等張クエン酸ナトリウムで 洗浄し、次に塩化ナトリウムで洗浄したときの、血球外ｐＨ（−０−−０−−０ −）および血球内ｐＨ（−Ｉ　−−１−−Ｉ　−）に及ぼす影響を示す。最初の クエン酸塩洗浄は血球内の高いｐＨを確立する決定的な段階である。これはｐＨ ７，０−８，０の範囲で強い緩衝液であるヘモグロビンのｐＨを上昇するので、 塩化物の再導入により塩化物シフトを逆転した後でさえもｐＨｉはそれにより維 持される。

図１１は最初に等張グリセロリン酸ナトリウム、ｐＨ９，５で洗浄し、次にＡＲ Ｃ８で洗浄したときの、血球外ｐＩ（（−〇−−〇−−〇−）および血球内ｐＨ （−Ｉ　−−Ｉ　−−Ｉ−）に及ぼす影響を示す。グリセロリン酸塩は塩化物シ フトを最大にし、同時に血球外ｐＨ，さらには血球内ｐＨを上昇させるので、７ ．０−８．０の範囲で良好な緩衝液であり、非透過性で、赤血球洗浄に理想的な 溶質になる。グリセロリン酸塩は現在、輸血可能な溶液中での使用が認められて いないので、ｐＨ１が高いという利点を失なわないで、ＡＲＣ８により洗い流さ れる。

図１２は有効な低張が貯蔵中の赤血球のモルフォロジカル・インデックス（形態 学的指標）および溶血に及ぼす有益な効果を説明する。

赤血球単位の半分を有効な重量オスモル濃度１２６ミリオスモルのＡＲＣ８（血 球を透過するグルコースの重量オスモル濃度を除外するので、従って血球容積に は影響しない）で洗浄し貯蔵した。赤血球単位のもう一方の半分は、マンニトー ルを添加して有効な重量オスモル濃度を３０８ミリオスモルで等張にしたＡＲＣ ８中で貯蔵した。マンニトールが貯蔵中の赤血球の溶血を防ぐという評判にもか かわらず、溶血と形態学は共に等張溶液中劣っていた。

図１３は４℃で測定した平均モルフォロジカル・インデックス（形態学的指標） 、血球内ｐＨ（ｐＨｉ）および血球外ｐＨ（ｐＨｘ）、並びに洗浄および７週間 のへマドクリット５５％での貯蔵を両方共行った赤血球６単位の２．３ＤＰＧお よびＡＴＰの初期濃度のパーセンテージを示す。これは本発明の原理を利用でき る優れた貯蔵であることを説明する。７週間ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの両方を 延長して上昇させ、並びにモルフォロジカル・インデックス（形態学的指標）を ９０％以上にできる赤血球の貯蔵方法は報告されていない。

図１４はクエン酸ナトリウム抗凝固剤、ｐＨ７，４，６３ｍ１に取り、約７３０ ０ｇ（高回転）で１０分間回転し、ヘマトクリット９８％にし、ＡＲＣ２７、ｐ Ｈ７，４，１７０菖ｌに再懸濁した赤血球単位を、ＡＲＣ２７中４℃での貯蔵週 間の関数として、モルフォロジカル・インデックス（形態学的指標）、溶血のパ ーセンテージ、並びに２゜３ＤＰＧおよびＡＴＰの初期血球白濃度のパーセンテ ージを表す。

赤血球単位の４℃での初期ｐＨｉは７．８７であった。塩化物濃度は３４＋Ｍで あった。この図は、非透過性溶質および／またはｐＨが７゜０−８．０の範囲で 良好な緩衝液で塩化物を洗い流すことにより達成される利点は、再懸濁する前に 高回転で赤血球へマドクリットを最高にし、血漿の持ち越しを最低にすることに より、洗浄しないでかなりの程度塩化物濃度の減少が達成できることを示す。４ ℃で貯蔵中のＡＴＰ、２．３ＤＰＧおよび形態学に関してこの品質を獲得できる 赤血球の保存計画は、広く用いられたり報告されたりしていない。比較するため に、従来の方法でアドソル中６週間保存した赤血球に通常見られるモルフォロジ カル・インデックス（形態学的指標）およびＡＴＰ水準を示す。アドソル中では ２．３ＤＰＧは１ｏ−１４日でゼロに近づく。

図１５はＡＲＣ３０，２１で希釈し、これの存在下貯蔵した赤血球をヘマトクリ ット１０％、４℃での数週間の貯蔵したときの機能として、モルフォロジカル・ インデックス（形態学的指標）、溶血のパーセンテージ、並びに２．３ＤＰＧお よびＡＴＰの初期血球白濃度のパーセンテージを表す。多量の緩衝液はＡＴＰお よび２，３ＤＰＧの維持を少なくとも１４週間まで延長する。

図１６は非臨床使用のため、例えば貯蔵状態を貯蔵溶液が輸血用として可能かど うかに関係なく最適にできるタイピング・パネル（ｔｙｐｉｎｇ　ｐａｎｅｌｓ ）のため赤血球貯蔵を説明する。この実施例では、赤血球は、糖分解の基質とし て供せられるグルコースおよびアデニンに加えて、非透過性溶質であるグルコン 酸ナトリウム１．６重量％、および血球を透過する優れた緩衝液である二塩基性 リン酸アンモニウム０．６６重量％を含有する溶液中ヘマトクリット８％で貯蔵 した。ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧを３０週間維持することは、赤血球貯蔵の分野 で前例がなく、本発明の詳細な説明する。

図１７は図１５でのように調製するが、ＡＲＣ３０中に存在する１０分の１量の アデニンを含有する希釈溶液を用いて調製した貯蔵赤血球の結果を説明する。Ａ ＴＰおよびモルフォロジカル・インデックス（形態学的指標）の維持は図１５で 示されるものに匹敵するが、２．３ＤＰＧの維持は著明に良好であり、本発明に より貯蔵される赤血球が通常用いられる濃度のアデニンを必要とせず、それどこ ろかアデニンが存在しない方が有益であることを示している。

好ましい態様の説明 他に定義しない場合、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、 通常の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記 載した全ての刊行物は引用して編入する。

本明細書で用いられる、赤血球の改善した延長保存期間または改善した貯蔵とは 、生存可能な赤血球を延長し期間低い溶血性で並びに血球のモルフォロジカル・ インデックス（形態学的指標）およびＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの水準は、当業 者に既知の通常の方法で貯蔵された血球中のモルフォロジカル・インデックス、 ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの水準よりも大きい水準での保存を示す。

この用語は、約３０−６０日もしくはそれ以上、たいていの場合は９０以上、ま たは１２０−１６０日以上さえもの期間、貯蔵に適用することを意味する。

本明細書で用いられる、低ヘマトクリットでの貯蔵とは、５５％より低いヘマト クリットでの貯蔵を意味する。典型的な低ヘマトクリット貯蔵はへマドクリット ５−１０％で行う。

本明細書で用いられる、血球内ｐＨ（ｐＨｉ）は、血球内部のｐＨであるニ一方 血球外ｐＨ（ＰＨｘ）は上記血球を保持する溶媒のｐＨである。

他に指示しない場合、ｐＨは室温、約２２℃で測定する。従ってｐＨ１が約７． ４であると述べる場合、これは約２２℃で測定したｐＨ１である。溶液のｐＨは 温度に依存するパラメーターであり、温度依存性の程度は、容易に測定でき、溶 液中の特定の溶質の機能である。

約２２℃での赤血球のｐＨ１７，４は約４℃でのｐＨ１約７．９に等価であり、 ２２℃でのｐＨｘ７．４は約４℃での約７．６５に等価である。

貯蔵中の血球は４℃±２℃であるので、貯蔵中の血球に関連するｐＨは４℃測定 し、本文中にそのように示す。

本明細書で用いられる、透過性溶質は赤血球の細胞膜を受動拡散により自由に通 過する能力がある溶質である。このような溶質はグルコースのような小さな非電 解質であってもよいし、また塩化物、酢酸塩もしくはリン酸塩のような小さな陰 イオンであってもよい。

非透過性溶質には、マンニトールおよびショ糖のような大きな非電解質、または クエン酸塩、グルコン酸塩、およびグリセロリン酸塩のような大きな陰イオンが 含まれる。陽イオンは、その電荷のために細胞膜を透過しない。例外はアンモニ ウムイオンであり、これは中性の分子、すなわちアンモニアとして血球に入り、 血球内で再びイオン化状態になる。（例えばメリーマン、ＨｏＴ、アメリカン・ ジャーナル・オブ・フィジオロジー２２５巻３６５−３７１頁（１９７３年）参 照） 本明細書で使用される生物学的に適合する溶液または生物学的に適合する緩衝溶 液は、それと接触する血球がその中で生存し続けることができる溶液である。接 触には、血球が何らかの方法で溶液にさらされる任意の方法、および限定するも のではないが緩衝溶液中の血球の懸濁が含まれる。生物学的に適合する緩衝溶液 は、細胞膜の完全性を維持するのに適し、その溶液と接触する血球の生物学的お よび生理学的反応を阻害または破壊しないｐＨおよび塩濃度を有する。典型的な ものでは生物学的に適合する緩衝溶液はｐＦ（５−９０であり、等張またはわず かに低張もしくは高張である。生物学的に適合する緩衝溶液には、それに限定す るものではないが、以下の表１に記載したものが含まれる。

本明細書で使用される、赤血球の血球内ｐＨを上昇させる生物学的に適合する溶 液は、本発明に従って調製され、その溶液と接触する血球の血球内ｐＨを上昇さ せる生物学的に適合する緩衝溶液である。赤血球の血球内ｐＨを上昇させる生物 学的に適合する緩衝溶液の実例には、本発明に従って用いられ、限定するもので はないが、実質的に塩化物イオンを含有せず、ｐＨは５−９．０、一般的には７ ゜４−７．５の溶液が含まれる。以下の表２に記載する溶液、例えばＡＲＣ８は 、溶液と接触する赤血球の血球内ｐＨを上昇させる生物学的に適合する緩衝溶液 の実例である。

表１ 血球の貯蔵に広（用いられ生物学的に適合する緩衝溶液溶液濃度 ＣＤＰＡ−１およびアドソルはバクスター・トラベノールより、ヌトリセルはカ ッターより市販されている。

重量オスモル濃度は非透過性成分により寄与される有効重量オスモル濃度である 。

表２ 赤血球の血球内ｐＨを上昇させることができる生物学的に適合した緩衝溶液の実 例 本明細書で用いられる有効重量オスモル濃度は、赤血球膜を透過−せず、従って 赤血球の容積の決定に役立つ複数の溶質の組み合わせ重量オスモル濃度を示す。

本発明により、塩化物濃度を低下でき、ｐＨｉを約２２℃で測定した時に約７． ４−約８．５に上昇できる場合、赤血球は何週間も、ＡＴＰおよび２．３ＤＰＧ は正常の水準かまたはそれを上回り、形態は非常に良好で、イン・ビボで２４時 間生存できるように貯蔵できるということが発見された。本発明により、赤血球 の保存期間は塩化物の初期希釈の程度、ｐＨｉの上昇および貯蔵溶液中に適当な 緩衝液を含有することにより貯蔵中のｐＨｉを維持できる程度に依存することも また発見された。

本発明により、ｐＨｉは任意の手段により上昇でき、それにより、約２２℃で測 定した場合、約７．４を上回る水準にまで上げられる。

ｐＨｉの初期上昇をこの水準にまで到達させるとりわけ有効な機構は、非透過性 陰イオンまたは非電解質を含有する溶液で血球を洗浄した場合に起こる塩化物シ フトである。これらの情況下で塩化物を血球から洗い出し、血球内環化物と入れ 替える対陰イオンが不在で、中性の電荷を維持するためにＯＨ−が血球内に入り 、それにより血球内Ｈが中和されｐＨｉが上がる。本明細書で示すように、種々 の洗浄溶液はｐＨｉおよびｐＨｘの両方を操作でき、ある情況下ではｐＨｉを８ ．０を越すまで上昇させる。

塩化物シフトにより生ずるｐＨｉ／ｐＨｘの差は、透過性陰イオンを再び導入し ない限り、貯蔵期間中ずっと維持される。このことは、血球外緩衝液によるｐＨ ｘの維持は、ｐＨｉを有効な糖分解が進行できる水準で維持することを助けるこ とを意味する。

一方、一度ｐＨｉが上昇すると、強力な緩衝液である血球内のヘモグロビンが、 たとえ塩化物またはその他の透過性陰イオンを再導入できても、ｐＨｉを維持す る傾向があり、ｐＨｉ／ｐＨｘ差を効果的に排除する。

低温（例えば４℃）貯蔵中のｐＨｉの維持には２個の因子が重要であるｐＨｉを 上昇させる塩化物ソフトの誘導および懸濁溶液の緩衝能力を最大化。貯蔵中、ｐ ＨｉおよびｐＨＸ間の差は、透過性陰イオンが導入されない限り、貯蔵期間中維 持される。血球外ｐＨすなわちｐＨＸは、ｐＨｉ／ｐＨｘに反映し、その結果ｐ Ｈｘの維持が間接的にｐＨｉを維持することの基礎を確立する。緩衝液の緩衝能 力が、例えば緩衝液の量を増やすことにより増強する場合、ｐＨｉは何週間も維 持できる。これは、今度はＡＴＰおよび２．３ＤＰＧの上昇した水準の維持をも たらす。

塩化物シフトを最大にすること、および緩衝能力を最大にすることという２個の 目的は、種々の手段により貯蔵赤血球により成就される。このように行うための １個の有効な手段は、血球を低いヘマトクリットで貯蔵し、緩衝液の血球に対す る比率を非常に大きくすることである。輸血可能な赤血球は１４週間以以上へマ トクリットで冷却貯蔵した後に回収できる。タイピング・パネルでの使用に適し た血球は、少なくとも３０週間冷却貯蔵した後に使用するために回収できる。

懸濁液の有効重量オスモル濃度は、赤血球貯蔵時間延長における重要なもう１個 の因子である。有効重量オスモル濃度とは、血球を透過せず、それにより血球容 積に影響を与える容質の重量オスモル濃度を示す。有効な低張は実質的に貯蔵溶 血を減少させることが示されている（メリーマン、上記）。機構は解明されてい ないが、恐らく浸透圧による隆起が血球表面の張力を増加させ、それにより、通 常貯蔵赤血球に関連する形状の変化に先んじる。その機構にががゎらず、貯蔵溶 血は、血球を透過しない血球外溶質の濃度をちょうど溶血には及ばない重量オス モル濃度に制限することにより、何分の−にも減少できる。

メリーマンにより報告されるように（上記）、巨大分子安定剤として知られる溶 質から成り、少なくとも１種の赤血球を透過できる溶質を含有する溶液に赤血球 を懸濁する場合、膜面積が増加し、通常１７０ミリオスモルで、約１２０μｓの 容積で溶血し始める赤血球が、溶血しないで８０ミリオスモルはどの低い重量オ スモル濃度の溶液に懸濁でき、容積は約１７０μｓに達することができる。本発 明で用いる溶質、主にリン酸塩、クエン酸塩およびグルコースは、全て巨大分子 安定剤であり、グルコースに関しては透過性溶質である。従って、膜の膨張現象 が赤血球貯蔵溶液の有効重量オスモル濃度を正常では溶血すると考えられるより も低い重量オスモル濃度まで低下させることに優越性を見出すことができる。

赤血球を本発明により貯蔵する場合、アデニンは糖分解の基質としてもはや必要 とされない。なぜならば、糖分解は多かれ少なかれ生理学的条件下で起こってい ると考えられ、ヌクレオチドは消費されるよりもむしろ再循環されるからである 。

本明細書で開示した洗浄赤血球の貯蔵のための本発明の任意の態様を実施する場 合、第一段階として、血液を供与者から当業者に公知である適切な溶液、例えば ＣＰＤＡ−１、ＣＤＰまたはクエン酸塩抗凝固剤に取り、血小板に富む血漿を８ 時間以内に除去する。残った赤血球は当業者に公知の標準洗浄液または希釈方法 を用いて洗浄するかまたは残留血漿量が有意に減少するまで希釈する。

本発明に従って洗浄赤血球を貯蔵する場合、血球の血球内ｐＨを上昇させる生物 学的に適合した緩衝液で血球を洗浄する。血球内ｐＨを上昇させるために、血球 は塩化物イオンを実質的に含まず、ｐＨが少なくとも約７．４で、少なくとも１ 種の非透過性陰イオンまたは非電解質を塩化物イオンの代わりに有する溶液で洗 浄できる。

別法として、血球を洗浄するよりむしろ実質的に塩化物陰イオンまたはその他の 透過性陰イオンを含まず、非透過性もしくは実質的に非透過性の陰イオンまたは 非電解性をそれの代わりに含有する緩衝液中に、またはその緩衝液で赤血球を希 釈してもよい。また、赤血球を貯蔵する前に血球の血球中ｐＨを上昇させる任意 の処理方法が本発明の範囲に含まれることをも意図する。

洗浄または処理赤血球を洗浄溶液とは異なる溶液中に貯蔵しようとする場合、標 準的な方法を用いて血球を沈降させ、ヘマトクリットを一般的に約９０より大き くし、上清を除去し、血球懸濁液の最終的な用途に依存して、望ましい貯蔵溶液 の適当な容量中に再懸濁する。

本発明による実施態様においては、赤血球は洗浄されず、血液はドナーから血液 凝固阻止剤、例えばＣＰＤＡ−１、ＣＤＰ又は、ｐＨを７．０又は、より高＜　 （７，０ないし８．５、好ましくは７．４−７．５）に調節したクエン酸溶液に とられる。血液凝固阻止剤中全血球の集収に続いて、赤血球を、例えば全血液を 比較的高い力（「ハードスピン」）、例えば、しかし限定されない、約７２６８ Ｇで１０分間遠心分離することにより血漿から分離され、これにより赤血球は約 ９０％又はそれ以上のへマドクリット値で詰められる。パックされた細胞は、約 ７．４よりも大のｐＨｉを維持するのに充分な適当な容量の実際上低張の生物学 的に適合しつる緩衝液、例えばＡＲＣ８に再び懸濁される。細胞懸濁液の最終容 量は、この分野の当業者に知られた輸血しつる赤血球を蓄えるのに普通に用いら れる量に類似する、典型的には３５０ないし４００ｍ１に選択される。この方法 はこれまで報告されたいかなる方法よりも優れた非洗細胞用貯蔵特性を生ずるこ とができる。

本発明の別の実施態様においては、適当な血液凝固阻止剤、例えばＣＤＰ、ＣＰ ＤＡ−１又はクエン酸塩血液凝固阻止剤中、いかなるｐＨにても、血漿を除去し て、血液を集めたのち、赤血球を、適当な量、例えば、しかしこれに限定されな い。約２１の有効な低張の生物学的に適合しうる緩衝液、例えば、しかしこれに 限定されない、少くとも約７．０のｐＨを有するＡＢＣ８を添加することにより 低ヘマトクリット値に希釈でき、血球を４℃で少くとも１４週間にわたって貯蔵 する。

このような貯蔵のための希釈は適当な手段により達成しうる。例えば赤血球を伸 長バッグに導入し、約２１の少くとも約７．０のｐＨを有する生物学的に適合し うる緩衝溶液で希釈できる。４℃で貯蔵する間、バッグは、垂直位置につるすこ とができる。血球はバッグの底におさまる。必要ならば、貯蔵の間、血球をゆる やかに混合することができる。血球を輸注する時に、おさまった血球は、バッグ の底から血球をバッグから移送パックに排出することにより又は、輸注のために 用いることができる非汚染赤血球を生ずる別の方法によりバッグから移動できる 。

輸注の前に、形態学的インデックス、溶血のパーセント、血球内ｐＨ，及び貯蔵 血球のＡＴＰ及び２．３ＤＰＧレベルを測定しうる。

形態学的インデックスは、この分野の当業者に知られた方法により測定しうる。

例えば、ホブマン等の方法（ホブマン、シー、エフ等（１９８０）ヘマトロシア １３：１３５−１４４）に従って光学顕微鏡内のパラホルムアルデヒド固定血球 の形態学の直接観察により測定でき、ここで、血球は、それらが正常の円盤形か ら離れた範囲に従って記録される。

溶血のパーセントは、この分野当業者に知られた方法により測定されうる。例え ば血球の試料を以下の式を用いてヘモグロビノメーター（コールタ−・エレクト ロエックス、インコーホレーテッド、ハイアリ−、フロリダ）でパーセント溶血 をアッセーできる。

上澄液ヘモグロビン濃度 ％溶血＝１００−ヘマトクリット値×□全ヘモグロビン濃度 ＡＴＰ及び２．３ＤＰＧのレベルはこの分野の当業者に知られた方法により測定 しうる。例えば、赤血球は、テクニカル・プレチンズ３３６−Ｗ及び３５−（シ グマ・ケミカル・カンバニイ・セントルイス・ミズウリ）に記載された方法に従 って、分光測光器、例えばモデルＤ〜、（ベックマン・インストルーメンツ・イ ンコーポレーテッド、フラートン　カリフォルニア）及びレコーダー、例えばモ デル２０００（ギルフォード・インストルーメント・ラボラトリーズ、インコー ホレーテッド　オバーリン、オハイオ）を用いてＡＴＰ及び２．３ＤＰＧについ てアッセーできる。

血球内ｐＨは、この分野の当業者に知られた方法により測定しうる。かかる方法 の一つで赤血球は十分な加速で遠心分離して固い血球ペレットを形成する。上澄 液を除去してパックした血球はこれらを溶血するために次いで凍結し、溶解され る。溶血血液のｐＨは血球の血球内ｐＨと同じように測定される。一般に、温度 にｐＨ依存するのでこのような測定は４℃で実施するか、又は温度に帰すること ができる違いを修正する。

低ヘマトクリット値貯蔵系は又、タイピングに対して赤血球の貯蔵用に用いるこ とができる。このような血球は現在約３０−４０日の貯蔵安定性で低ヘマトクリ ット値で供給される。タイピングに対して、溶血は５％を越えてはならない。赤 血球が輸注されるべきてない場合、貯蔵溶液の成分に課せられる制限はないので 、本発明の通りに実質的に貯蔵安定性を増加する全ての溶質を使用しつる。これ らの溶質は、リン酸アンモニウム、グルコン酸ナトリウム又はグリセロリン酸ナ トリウムを含む。リン酸アンモニウムは血球に入り、すぐれた緩衝液であるが、 浸透性効果はない。グリセロリン酸ナトリウム及びグルコン酸ナトリウムは血球 に侵入せず、従って塩化物シフトを最大にする。例えばこれらの溶質を用いるこ とができ、タイピングに用いられる血液の貯蔵安定性は少くとも３０週間延長で きる。

ＡＲＣ８もレジュベネイション（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）溶液として作用す る。ＡＤＳＯＬに４２日間貯蔵し、次いでＡＲＣ８で洗った血球はさらに５週間 の貯蔵時間を獲得し、これによりレジュベネイションを達成するために３７℃で のインキュベーションの必要を除き、次いで広〈実施されるものとして凍結する 。

本発明の方法を用いる好ましい実施態様では、血液は７．０又はそれより高いｐ Ｈに調整されたＣＤＰ又はクエン酸塩血液凝固阻止剤に入れる。約８時間以内に 、血液は少（とも１０分間で少くとも７０００ｇ沈降し、少（とも９０％、好ま しくは９５ないし９８％のへマドクリット値で固いパックされた赤血球を作る。

赤血球を他の血液成分から分離し、少くとも１００ｍ１、好ましくは１５０と２ ＱＱｍｌの間のＡＲＣ８に再び懸濁する。再懸濁が１００ｍ１以上のＡＲＣ８中 であるとき、溶液の成分の濃度は、１００ｍ１のＡＲＣ８中に存在する各々の同 じ量があるよう減少すべきである。集められ、分離され、この形式で貯蔵された 血球は、６週間の貯蔵後、通常の形式で集められ、貯蔵された血球よりもすぐれ たＡＴＰ、２．３ＤＰＣ１形態学的インデツクス、血球内ナトリウム濃度及び溶 血を有する。別法として血漿を除去後、血球を約２１のＡＲＣ８に直接希釈し、 低ヘマトクリット値で貯蔵する。より特異的には、成分分離後、パックされた赤 血球を２１のＡＲＣ８溶液に加え、これで大体１０倍希釈液に達する。この１０ 倍希釈液は塩化物シフトを最大にし、血球外溶液の有効な浸透圧重量モル濃度を 減する。血球外溶液の容量を１０倍より増したものも、貯蔵の間ｐＨのｉ及びｐ Ｈｘの両方を維持する緩衝液の実質的保有体を供給する。この方法は、少くとも １４週間の貯蔵を提供する。

以下の実施例は、説明の目的のみを含み、本発明の範囲を限定する意図はない。

実施例１ 洗浄血球の貯蔵 ４５０ｍ１の血液をドナーから６３ｍ１のＣＰＤＡ−１に取った。血小板リッチ な血漿を除去した。残った血球を２つの等しいアリコツトに４００ｍ１バツグに 分け、バッグを、ｐＨ７で、標準等張食塩溶液（０，９％ＮａＣ１）又は、リン 酸緩衝液である洗浄液で満した。次いで血球を、ツルポールＰＣ３Ｃ臨床遠心機 中、１４７１ｇで５分間遠心分離し、洗浄段階をもう１度繰り返した。残った血 漿の濃度は約１０２のファクターに減した。

洗浄後、血球を再び２つのアリコツトに分けて、ＣＰＤＡ−１、ｐＨ５，７また はＡＲＣ３２ｐＨ８中に約４５のへマドクリット値まで再び懸濁した。再懸濁し た血球は４℃＋２°Ｃで貯蔵した。貯蔵した血球を定期的にサンプリングして、 ２．３ＤＰＧ及びＡＴＰのレベル、並びに形態学的インデックス並びに百分率溶 血を測定した。

図１−４はこれらの測定の結果を描く、貯蔵前にリン酸塩溶液で洗浄した血球は 、食塩水で洗浄した血球に比べて貯蔵の期間、ＡＴＰ及び２．３ＤＰＧとも実質 的に高いレベルを有しく図１及び２）、より高い形態学的インデックス（図３） 及び有意に低い溶血の百分率（図４）を有したことが判かる。さらに、図２にお いて、リン酸塩中洗浄した血球における２、３ＤＰＧのレベルは、新鮮な血液血 球におけるレベルよりも実質的に高く、一方、食塩水洗浄血球での２．３ＤＰＧ のレベルは、貯蔵の期間、新鮮な血球中のレベルより下に速やかに減じたことが 判かる。食塩水中洗浄し、低ｐＨ溶液、本実施例においてＣＰＤＡ−１ｐＨ５， ７で貯蔵した血球は、形態学的インデックスにおいてより速やかな減少を示しく 図３）、溶血において上る（図４）。

実施例２ 洗浄血球の貯蔵 血液を実施例１のように取った。赤血球を２つのアリコントに分け、ツルホール ＲＣ３Ｃ臨床遠心機中、２つの１０分サイクル２９９５ｇを用いて２回洗浄した 。残った血漿の濃度はこれにより約１０３のファクターまで減じた。洗浄溶液は 、ＡＲＣ８又は緩衝化食塩水（１５４ｍＭ　ＮａＣ１，２，２ｍＭ　ＮａＨ２Ｐ Ｏ４，７，７５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７，３１）であった。全血球をＡＲＣ ８中約５５のへマドクリット値まで再び懸濁し、４℃±２℃で貯蔵した。貯蔵し た血球は、定期的にサンプリングして２．３ＤＰＧ及びＡ　Ｔ　Ｐのレベルを測 定した。これらの測定の結果は図５に示す。

実施例３ 洗浄血球の貯蔵 血液を実施例１のようにとった。赤血球を２つのアリコツトに分け、ツルポー小 ＲＣ３Ｃ臨床遠心機中、１度２９９５ｇで洗浄した。

残った血漿の濃度はこれにより約１０２のファクターまで減じた。

洗浄溶液は１５４ｍＭ　Ｎａに、１又は１１２ｍＭクエン酸ナトリウム、共にｐ Ｈ７，５で等張浸透圧モル濃度である。洗浄後、血球をＡＲＣ９Ｃ中約７０のへ マドクリット値まで再懸濁し、４℃±２℃で貯蔵した。貯蔵血球を定期的にサン プリングし、２．３ＤＰＧ及びＡＴＰのレベルを測定した。これらの測定の結果 は図６に示す。

実施例４ ｐＨ測定 標準等張食塩水、ｐＨ７，４でくり返し洗浄した新鮮な赤血球の血球内及び血球 外ｐＨを測定し、等張クエン酸ナトリウムｐＨ７，４でくり返し洗浄した同じ血 球のアリコツトの血球内及び血球外ｐＨと比較した。食塩水洗浄血球の血球内ｐ Ｈは７．３で血球外ｐＨは７．４７であった。対象的に塩化物フリーのクエン酸 ナトリウムで洗浄した血球の血球内ｐＨは８．１１で血球外ｐＨ７，０７であっ た。全てのｐＨ測定は２２℃で行なった。

実施例５ 血液の一単位は実施例１のようにとった。赤血球を等張クエン酸ナトリウム溶液 でｐＨ７，４で繰り返し洗浄した。

各洗浄は２．５のファクターにより塩化物を含む拡散イオンの濃度を希釈した。

各洗浄後、アリコツトの血球外及び血球内ｐＨを測定した。図７に示すように、 血球を引き続いて洗浄するにつれて、血球内ｐＨは増加し血球外ｐＨは減少した 。血球内と血球外ｐＨ間に最大の違いは、塩化物濃度が最初の値の約１０％に減 じた時点て観察された。

同じ実験は血球を洗浄するため等張リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４を用い て実施された。この実験の結果は図８に示す。

リン酸塩が血球に拡散するので等張リン酸ナトリウム緩衝液の能力は、血球外と 血球内ｐＨの間の差を増加するため、限定される。

しかしながらその緩衝能力ゆえに、血球内ｐＨがＡＴＰ及び２．３ＤＰＧレベル の維持のため適当なレベルに上るために、それは貯蔵のために適当な緩衝液であ る。

図９は、リン酸塩の緩衝能力で塩化物シフトに対するクエン酸塩の効果を結合し た結果を示す。塩化物ソフト及び緩衝とも、血球懸編液が徐々にＡＲＣ８で希釈 するとき明白である。

実施例６ 実施例５におけるように調製した血球をまず１１２ｍＭ（等張）クエン酸ナトリ ウム溶液の溶液中ｐＨ７，４で洗浄し、次いで１５４ｍＭ（等張）塩化ナトリウ ム溶液中、ｐＨ７，４で洗浄した。ヘモグロビンがｐＨ７，０−８，０の範囲に おいてすぐれた緩衝液であるのでｐＨｉ／ｐＨｘ差が非侵入陰イオンが含まれる 溶液中、洗浄により最大となったのち、得られる高い血球内ｐＨは、血球が侵入 イオンを含んだ溶液中再懸濁したのちでも、維持されることが判った（図１０参 照）。

即ち、血球内ヘモグロビンのｐＨの向上は、実施例２−４に示されるように、長 期間貯蔵の間、ＡＴＰ及び２．３−ＤＰＧの血球内レベルの維持に貢献している 、比較的高い血球内ｐＨを維持するのに重要である。

実施例７ 実施例５におけるように調製した血球を、７．０ないし８．０のｐＨ範囲で非侵 入で良好な緩衝液である等張（１７１ｍＭ）ホスホグリセリン酸ナトリウムを含 んだ溶液中、まず洗浄した。第３洗浄に続き血球を輸注に受け入れられうるＡＲ Ｃ８中洗浄した。図１１に示すように、このプロトコールの結果、最初の高い血 球内ｐＨ及び大きな血球内ｐＨ／血球外ｐＨ差となり、ＡＲＣ８で洗浄後高いｐ Ｈｉを維持する。

実施例８ 浸透圧モル濃度の効果 赤血球の貯蔵で有効な低張圧の重要性を示すため、１単位の血液をＣＰＤＡ−１ にとり、赤血球をおだやかなスピンで分離した。得られる赤血球を次いで２つの 等しいアリコツトに分けた。一つをＡＲＣ８中洗浄し、貯蔵した。有効浸透圧モ ル濃度１２６　ｍｏｓｚ０他をマンニトールで等張とした（３００ｍｏｓｍ）Ａ ＲＣ８中洗浄し貯蔵した。

これらは貯蔵の間ＡＴＰ及び２．３０ＰＧ維持に有意差はなかった。

しかしながら、図１２に示すように、形態学的インデックス及び溶血は、低張調 製において著しく良好であった。

実施例９ 洗浄血球の貯蔵 ８単位の血液をＣＰＤＡ−１にとり、赤血球を強いスピンにより分離した。次い で各単位の赤血球をハードスピンを用いてＡＲＣＳ中２回洗浄し、ＡＲＣ８中７ 週間貯蔵した。図１３から明らかなように、貯蔵期間を通じてｐＨｉ／ｐＨｘ差 が維持され、２．３ＤＰＧは正常以上のままであり、ＡＴＰはよく維持され、最 も有意には、形態学的インデックスは、９０％以上のままである。

アトソール中貯蔵した通常の血球又はＡＲＣ８中洗浄し貯蔵した血球を受けたホ ランティアでの６対の研究で、単一標識５１クロニウムタツグを用いる平均２４ 時間インビボ生存は、アトソール中６週間貯蔵で単位で７４．８±５．７％、Ａ ＲＣ８中洗浄及び６週間貯蔵で単位で８７．１±６，３であった。

実施例１０ 非洗浄血球の貯蔵 １単位の血液を６３ｍ１の３．５％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，４に、ハード スピンでとり、１７０ａ＋ＩＡＲＣ２７、ｐＨ７，４１：再懸濁した。ｐＨｉは ７．９であまた。塩化物濃度は３４ｍＭで希釈前の約１／１０であった。４℃で の貯蔵の週の作用として２．３ＤＰＧ及びＡＴＰの最初の血球内濃度の形態学的 インデックス及びバー・センテージの変化は図１４に示される。

実施例１１ 低ヘマトクリット値での貯蔵 血液を伸長したバッグ中、ＣＰＤＡ−１血液凝固阻止剤にとり、約２１のＡＲＣ ３０、ｐＨ７，５に希釈した。４°０１１０％のへマドクリット値での貯蔵の作 用として２．３ＤＰＧ及びＡＴＰの最初の血球内濃度の形態学的インデックス及 びパーセントテーシは図１５に示される。１４週でｐＨｉは７６０以上のままで あり、溶血は１％より小であった。

実施例１２ 赤血球をグルコン酸ナトリウムを含む溶液中、約８％のへマドクリット値で貯蔵 した。これは非侵入で塩化物シフト及びｐＨ範囲７゜０−８．０で良好な緩衝液 、リン酸アンモニウムを最大にし、又、血球に侵入する、即ち、その緩衝能力を 血球内及び血球性余白（ｓｐａｃｅ）に分配する。図１６に示すように、３０週 の冷却貯蔵後でも、２．３ＤＰＧは正常解糖を示す最初の値以上のままであった 。ＡＴＰは最初の６０％、形態学的インデックスは７０％で溶血は５％よりも小 であった。これらの血球はタイピングパネルでの使用に受け入れられるであろう 。

実施例１３ 赤血球を一度洗浄し、通常濃度の１／１０の、０．２ｍＭに減じたアデニン濃度 でＡＲＣ８中貯蔵した。表３に示すように、第２週で、この少量のアデニンは完 全に消費されるが、ＡＴＰ、２．３ＤＰＧ及び形態学的インデックスは７週にわ たり満足のい（ように維持された。これらのデータから、本発明に従って洗浄又 は希釈した赤血球は解糖のための外因性基質としてアデニンを必要としない。

表３ ４℃での週 ＊μＭ／ｇｍ　Ｈｇｂ 実施例１４ 赤血球を実施例１１のように分離し２１のＡＲＣ３０中に希釈したが、わずかに １μＭの濃度に減じたアデニンと共に行なった。表１７に示すように、アデニン 濃度での減少はＡＴＰ及び形態学的インデックスに有意な効果を示さず、２．３ ＤＰＧ維持は実質的に改良された。

修飾はこの分野の当業者に明らかであるから、本発明は、付加された請求の範囲 の範囲によってのみ限定されることを意味する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．輪注しうる赤血球の貯蔵安定性を延長する方法であって、（ａ）該血球の血 球内ｐＨを約７．０ないし約８．５の間のレベルに調節すること （ｂ）該血球を生物学的に適合しうる緩衝溶液中で貯蔵することを含む。 ２．工程（ａ）における該血球内ｐＨが約７．４と約８．５の間である請求項１ の方法。 ３．該血球内ｐＨを血球内塩化物濃度を減ずることにより工程（ａ）において調 節する請求項１の方法。 ４．該血球を、有効に低張な、生物学的に適合しうる緩衝溶液、約７．０ないし 約８．５のｐＨで、そしてその溶液は塩化物イオンを欠いている、で洗浄するこ とにより該血球内ｐＨを工程（ａ）において調節する請求項１の方法。 ５．該血球を、有効に低張な、生物学的に適合しうる緩衝液、約７．０ないし約 ８．５のｐＨで、そしてその溶液は塩化物イオンを欠いている、で希釈すること により該血球内ｐＨを工程（ａ）において調節する請求項１の方法。 ６．工程（ｂ）における該生物学的に適合しうる貯蔵緩衝液が塩化物イオンを欠 いている請求項１の方法。 ７．工程（ｂ）における該生物学的に適合しうる貯蔵緩衝溶液中の不浸透性溶質 の有効な浸透圧モル濃度がほぼ低張である請求項１の方法。 ８．工程（ｂ）における該生物学的に適合しうる貯蔵緩衝溶液が少量のアデニン を有するか又はアデニンを有しない請求項１の方法。 ９．工程（ｂ）における該血球を低ヘマトクリット値で貯蔵する請求項１の方法 。 １０．（１）全血液を血液凝固阻止剤溶液にとること（２）赤血球を血漿から分 離すること （３）該分離した血球を、該血球の血球内ｐＨを約７．０ないし約８．５の間の レベルに調節できる、有効に低張な、生物学的に適合しうる緩衝溶液、そしてそ の溶液は塩化物イオンを欠いている、で洗浄すること を含む請求項１の方法。 １１．工程（３）の後 （４）工程（３）の該洗浄溶液から該洗浄された血球を分離すること （５）該洗浄され、分離された血球を生物学的に適合しうる緩衝溶液中に貯蔵す ること を含む請求項１０の方法。 １２．該分離工程（４）を約９０より大きなヘマトクリット値まで実施する請求 項１１の方法。 １３．（１）全血液を血液凝固阻止剤溶液にとること（２）赤血球を血漿すら分 離すること （３）該血球を、該血球の血球内ｐＨを約７．０ないし約８．５の間のレベルに 調節できる、有効に低張な、生物学的に適合しうる緩衝溶液、そしてその溶液は 塩化物イオンを欠いている、で希釈すること を含む請求項１の方法。 １４．工程（３）の後、 （４）該希釈された血球を工程（３）の該希釈緩衝液中に貯蔵すること を含む請求項１３の方法。 １５．（１）全血液を血液凝固阻止剤溶液に、７．０から８．５のｐＨでとるこ と （２）該血球を血漿からハードスピンで分離し、これにより該血球を約９０より 大のヘマトクリット値でハックすること、及び（３）該パックされた血球を、該 血球のｐＨを約７．０ないし約８．５の間のレベルに調節できる、有効に低張な 、生物学的に適合しうる緩衝溶液、そしてその溶液は塩化物イオンを欠いている 、中に再び懸濁すること を含む請求項１の方法。 １６．該生物学的に適合しうる緩衝溶液がＡＲＣ８、ＡＲＣ９Ｃ、ＡＲＣ３２、 ＡＲＣ２７及びＡＲＣ３０からなる群から選択される請求項１の方法。