CN105850977B - 血液保存液 - Google Patents
血液保存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105850977B CN105850977B CN201510033381.8A CN201510033381A CN105850977B CN 105850977 B CN105850977 B CN 105850977B CN 201510033381 A CN201510033381 A CN 201510033381A CN 105850977 B CN105850977 B CN 105850977B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- storage
- anticoagulant
- whole blood
- blood
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3.31‑3.32g柠檬酸三钠、0.01‑0.05g柠檬酸、2.45‑3.37g葡萄糖、0.2‑0.4g ATP、和50‑600U SOD，余量为水。本发明还提供了使用本发明的血液保存液对血液样品进行保存的方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域，具体涉及一种长效的保持外周血淋巴细胞扩增效力的血液保存液和其使用方法。
发明背景
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，其发病率逐年增高。20世纪80年代，Rosenberg等观察到患非免疫系统肿瘤的动物给予重组IL-2治疗后，动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移。此后，免疫细胞治疗在临床上的应用就迅速扩展开来，目前已成为手术、化疗和放疗之外的肿瘤综合治疗第四种模式。外周静脉血是所有免疫细胞治疗用细胞的培养原材料，一般采用肝素或复方柠檬酸钠保存液(ACD)作为抗凝剂加入静脉血中。这样的抗凝血必须在4-6小时内使用，才能保证淋巴细胞的活力及后续培养扩增效力，如果抗凝血保存超过10小时，其中的淋巴细胞就会部分或全部死亡，而无法进行后续正常的体外培养扩增，进而无法获得合格的免疫细胞治疗产品。目前市面常见的血液抗凝剂(如肝素和ACD)，均主要针对保护红细胞。专利申请CN 1411818A公开了一种针对外周血中淋巴细胞的抗凝剂，然而该申请没有对使用其公开的抗凝剂所保存的淋巴细胞后续增殖能力进行验证。本领域仍然需要新的细胞保存液，其能够增强对外周静脉血中淋巴细胞活力的保护，增加血液保存时间，避免如血样运送时间等对用于免疫治疗的淋巴细胞扩增的影响。
发明内容
本发明提供了一种新的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3.31-3.32g柠檬酸三钠、0.01-0.05g柠檬酸、2.45-3.37g葡萄糖、0.2-0.4g ATP、和50-600U SOD，余量为水。本发明还提供了使用本发明的血液保存液对血液样品进行保存的方法。通过本发明的血液保存液和保存方法可以在多达36h内使血液中淋巴细胞保持良好的扩增效力，足以满足目前免疫细胞治疗的要求。
附图简述
图1示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，分离所得PBMC数量变化情况。
图2示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后细胞数量情况。
图3示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，其中的淋巴细胞活化培养6天后的扩增倍数。
图4示出采血后立即分离与分别使用保存液N和S保存24h，培养6天后淋巴细胞表型情况。
图5示出三种SOD浓度的保存液保存血样48h内分离所得PBMC数量变化。
图6示出三种SOD浓度的保存液保存血样48h，活化培养6天后细胞数量情况。
图7示出三种SOD浓度的保存液保存血样48h，活化培养6天后细胞扩增倍数。
图8示出采血后立即分离与分别使用三种SOD浓度的保存液保存24h，培养6天后淋巴细胞表型情况。
图9示出采用三种保存液使用比例保存血样48h内分离所得PBMC数量变化。
图10示出采用三种保存液使用比例保存血样48h，活化培养6天后细胞数量情况。
图11示出采用三种保存液使用比例保存血样48h，活化培养6天后细胞扩增倍数。
图12示出采血后立即分离与分别采用三种使用比例的保存液保存24h，培养6天后淋巴细胞表型情况。
图13示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离所得PBMC数量变化情况。
图14示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的细胞数量情况。
图15示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的细胞扩增倍数。
图16示出采血后立即分离以及使用保存液在两种温度下保存血样24h，培养6天后淋巴细胞表型情况。
图17示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量变化情况。
图18示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的数量情况。
图19示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的细胞扩增倍数。
图20示出采血后立即处理与使用配制后保存不同时间的保存液保存血样24h，分离PBMC活化培养6天后的淋巴细胞表型比较。
具体实施方式
在一方面，本发明提供了一种适于保存用于体外淋巴细胞扩增的血液样品的血液保存液。
本发明的血液保存液的主要活性成分包括柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、ATP、SOD。不受任何理论限制，据认为柠檬酸三钠可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固；柠檬酸可以调节PH值，以适合细胞存活；葡萄糖为细胞提供营养；ATP为细胞提供能量；而SOD主要对抗及阻断因氧自由基对细胞的损害，并及时修复受损细胞。
在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含3.31-3.32g，例如3.31g、3.315g、3.32g柠檬酸三钠。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含0.01-0.05g，例如0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g柠檬酸。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含2.45-3.37g，例如2.45g、2.60g、2.75g、3.00g、3.15g、3.30g、3.37g葡萄糖。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含0.2-0.4g，例如0.25g、0.3g、0.35g、0.4g ATP。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含50-600U、优选200-600U，最优选200-400U例如350U的SOD。在一些实施方案中，本发明的血液保存液以水如注射用水作为溶剂。
本发明的细胞保存液易于保存并具有较长的货架期。例如，本发明的细胞保存液可以在配制后立即使用或在配制后保存多达8个星期再使用。
在另一方面，本发明提供了一种保存血液样品，特别是保存用于体外淋巴细胞扩增的血液样品的方法，所述方法包括使所述血液样品与本发明的血液保存液混合。使用本发明的方法进行保存的血液样品可以是各种血液样品，优选包含淋巴细胞的血液样品，例如外周静脉血。
在一些实施方案中，血液保存液与血液样品以1:5-1:20的比例混合。在一些优选实施方案中，血液保存液与血液样品以1:5-1:10的比例混合。在一些优选实施方案中，血液保存液与血液样品以1:10的比例混合。在一些实施方案中，血液保存液与血液样品的混合物保存于2℃-24℃。在一些实施方案中，血液保存液与血液样品的混合物保存于2℃-8℃。在一些优选实施方案中，血液保存液与血液样品的混合物保存于20℃-24℃。本发明的血液保存液使得可以在室温下对血液样品进行保存，这是特别有利的，因为可以避免血液样品的低温保存和低温运输，节约成本。
使用本发明的血液保存液和方法，血液样品可以长时间保存(至少24小时)而不影响使用所述血液样品进行淋巴细胞扩增的效果。通过本发明的方法，血液样品可以保存多达8小时、16小时、24小时、36小时或48小时。
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
实施例
实施例1、三种抗凝剂/保存液性能比较
1、保存液配制
肝素抗凝剂(本文简称H)为肝素锂真空抗凝管(Greiner，9ml)。
CN 1411818A中公开的抗凝剂(本文简称S)配方如下表1：
表1配方S：每100ml
具体配制方法如下(20ml)：先用12ml注射用溶解柠檬酸三钠664mg、柠檬酸5mg和葡萄糖550mg。再用注射用水定容于20ml。使用NaOH和HCl调整pH值至6.8-7.3。用0.22um针式滤器过滤，然后分装5ml/支，保存于4℃。
本发明的保存液(本文简称N)配方如下表2：
表2配方N：每100ml
具体配制方法如下(20ml)：先用12ml注射用水溶解柠檬酸三钠664mg、柠檬酸5mg和葡萄糖550mg。加入SOD一支(0.5ml，70U/支)和ATP两支(共4ml，40mg)。再用注射用水定容于20ml。使用NaOH和HCl调整pH值至6.8-7.3。用0.22um针式滤器过滤，然后分装5ml/支，保存于4℃。
2、实验设计
采集三个健康供者外周血(63ml/人)，分别使用三种保存液保存于2-8℃，其中肝素抗凝使用肝素锂真空抗凝管(Greiner，9ml)，N和S使用比例均为1:10(保存液：外周血)。分别于0h、8h、16h、24h、36h、48h六个时间点取出3ml外周血，采用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基(IMSF100，Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活化抗体(Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。实验分组见下表：
表3三种保存液性能比较实验分组
检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型(0h、24h、48h)；iv.扩增倍数。
3、实验结果
三种保存液保存血样48h，各检测点分离所得PBMC数量、活率、培养后细胞数量、活率及扩增倍数见下表4：
表4
“nd”表示无法检测。
由图1可以看出：0-16h保存液H保存血样分离所得PBMC数量急剧减少，16h后即无法获得PBMC；0-8h内保存液N和S保存血样分离所得PBMC数量基本无差别，8h开始保存液N组和S组分离PBMC数量均逐渐减少，但N组较S组减少缓慢，截止48hN组始终较S组多(p<0.05)。
由图2和图3可以看出：保存液H保存的淋巴细胞8h内扩增能力急剧减少，8h后无法增殖；保存液N和S组细胞在8h-36h内培养后细胞数量均逐渐减少，但N组较S组减少幅度小，48h开始两组细胞均无法增殖；保存液N组和S组在24h内扩增倍数变化不明显(p>0.05)，36h开始急剧减少，同时可见N组始终较S组高(p<0.05)。
三种保存液保存血样48h，分离所得PBMC培养6天后淋巴细胞表型情况见下表5：
表5
“nd”表示无法检测。
从表3和图4可以看出，使用保存液N和S保存血样24h，活化培养细胞较采血后立即分离培养细胞中CD3+T淋巴细胞百分比基本无差别(p>0.05)，CD3+CD8+T淋巴细胞百分比有所降低，但N组无统计学差异(p>0.05)，S组有统计学差异(p<0.05)。
4、结论
综上所述，可以得出以下结论：
i.分别使用三种保存液保存外周静脉血样0-48h，肝素组在8h后分离所得PBMC及淋巴细胞扩增能力均无法测得，提示了肝素仅能用于在8h内保存血样中淋巴细胞。
ii.48h内，N组和S组分离所得PBMC及活化培养后细胞数量均逐渐减少，但36h内，相同保存时间下N组分离所得PBMC数量及培养后细胞数量较S组更多，且具有统计学意义(p<0.05)。
iii.保存液N组在24h内活化培养后细胞扩增倍数基本无变化(p>0.05)。
iv.保存液N组在24h内活化培养后淋巴细胞表型基本无变化(p>0.05)。
由此可见，本发明的血液保存液对外周静脉血中淋巴细胞扩增效力的保护性能更佳。在使用比例为1:10(保存液：外周血)，血样保存温度为2-8℃条件下，可有效保持外周血中淋巴细胞增殖活性达24h。
实施例2、保存液配方优化
在实施例1的基础上，本发明人对配方N中SOD用量进行了研究，以使保存液对淋巴细胞保护性能达到最佳。
采集三个健康供者外周血(54ml/人)，分别使用含三种浓度SOD的保存液(70U/100ml、280U/100ml、560U/100ml)保存血样于2-8℃，使用比例均为1:10(保存液：外周血)。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点取出3ml外周血，采用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基(IMSF100，Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活化抗体(Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表6：
表6
检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型(0h、24h、48h)；iv.扩增倍数。
实验结果
三种SOD浓度保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数量及活率、扩增倍数情况示于下表7：
表7
“nd”表示无法检测。
由图5可见，12h内三种SOD浓度的保存液保存的血样分离所得PBMC数量基本无变化；12h开始三组均开始减少，低浓度组减少最快，中、高浓度组减少减慢，有统计学差异(p<0.05)，但中和高浓度组无显著差异(p>0.05)。
由图6和图7可以看出，SOD低浓度组培养后细胞数量和扩增倍数在0-48h内逐渐降低，至48h无扩增；中、高浓度组培养后细胞数量和扩增倍数在24h内降低不明显，24h后开始降低，两组间无显著差异(p>0.05)。
三种SOD浓度保存液保存血样48h，分离PBMC培养6天后细胞表型情况见于表8：
表8
| 标识 | CD3+％ | CD3+CD8+％ | CD3+CD4+％ |
| A-0 | 59.88 | 71.60 | 13.90 |
| B-0 | 59.88 | 71.60 | 13.90 |
| C-0 | 59.88 | 71.60 | 13.90 |
| A-24 | 39.88 | 27.50 | 0.33 |
| B-24 | 68.59 | 78.63 | 12.41 |
| C-24 | 75.81 | 79.55 | 10.47 |
| A-48 | nd | nd | nd |
| B-48 | nd | nd | nd |
| C-48 | nd | nd | nd |
“nd”表示无法检测。
从表6和图8可以看出，采血后立即分离与保存24h后分离PBMC进行活化培养，SOD低浓度组培养后CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比均有所降低，但中、高浓度组变化不明显(p>0.05)。
结论
综上所述，可以得出如下结论：
i.SOD低浓度组(70U/100ml)12h内分离所得PBMC数量无变化，之后逐渐减少，至48h无法分离有效细胞；培养后细胞数量和扩增倍数自0h开始即开始逐渐减少，至48h未见增殖；培养后淋巴细胞表型在24h即可见显著改变。
ii.SOD中浓度组(280/100ml)和高浓度组(560/100ml)12h内分离所得PBMC数量无变化，12-48h逐渐减少；培养后细胞数量、扩增倍数及淋巴细胞表型在24h内均无显著改变。
由此可见，SOD浓度过低不利于保护淋巴细胞活力，而血液保存液配方中SOD浓度在200-600U/100ml均无显著差别，考虑到成本因素，本发明保存液配方中优选的SOD浓度为200-400/100ml。
实施例3、保存液使用比例的优化
在前述实施例的基础上，本发明人对配方N的使用比例进行了研究，以使保存液对淋巴细胞保护性能达到最佳。
采集三个健康供者外周血(54ml/人)，分别采用三种比例与本发明保存液混合(保存液：血样＝1:20、1:10、1:5)，保存血样于2-8℃。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点取出3ml外周血，采用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基(IMSF100，Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活化抗体(Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表9：
表9
检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型(0h、24h、48h)；iv.扩增倍数。
实验结果
三种使用比例保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数量及活率、扩增倍数情况见下表10：
表10
“nd”表示无法检测。
由图9可见，采用三种使用比例(保存液：血样＝1:20、1:10、1:5)的保存液保存血样48h，从开始保存液低用量组(1:20)分离所得PBMC数量即开始逐渐减少，与其它两组有统计学差异(p<0.05)；0-12h内，保存液中和高用量组(1:10和1:5)分离所得PBMC数量变化不显著，12h后逐渐开始减少，而两组间差别不大(p>0.05)。
由图10和图11可以看出，采用三种使用比例(保存液：血样＝1:20、1:10、1:5)的保存液保存血样48h，从开始保存液低用量组(1:20)培养所得细胞数量和扩增倍数即开始逐渐减少，与其它两组有统计学差异(p<0.001和p<0.05)；0-24h内，保存液中和高用量组(1:10和1:5)培养后数量和扩增倍数变化不明显，24h后逐渐开始减少，而两组间差别无统计学意义(p>0.05)。
采用三种保存液使用比例保存血样48h，分离PBMC培养6天后的淋巴细胞表型见下表11：
表11
| 标识 | CD3+％ | CD3+CD8+％ | CD3+CD4+％ |
| A/B/C-0 | 71.32 | 83.05 | 10.15 |
| A-24 | 57.35 | 39.35 | 27.01 |
| B-24 | 72.85 | 84.18 | 8.87 |
| C-24 | 75.90 | 87.61 | 9.33 |
| A-48 | nd | nd | nd |
| B-48 | nd | nd | nd |
| C-48 | nd | nd | nd |
“nd”表示无法检测。
从表9和图12可以看出，采血后立即分离与采用三种使用比例(保存液：血样＝1:20、1:10、1:5)的保存液保存24h后分离PBMC进行活化培养，保存液低用量组(1:20)培养后CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比均有所降低((p<0.05)，但中、高用量组变化不明显(p>0.05)。
结论
综上所述，可以得出如下结论：
i.保存液低用量组(保存液：血样＝1:20)从血样保存开始，分离所得PBMC数量、培养后细胞数量和扩增倍数即随保存时间增加逐渐减少，至48h培养后细胞基本不可见；此外，24h内CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比亦有所降低。
ii.保存液中用量组(保存液：血样＝1:10)和保存液高用量组(保存液：血样＝1:5)分离所得PBMC在12h内变化不明显，12后逐渐减少；而培养后细胞数量及扩增倍数在24h内无显著变化，24h后逐渐减少，且两组间无差异；此外，两组样品在24h内培养后淋巴细胞表型维持不变。
由此可见，本发明保存液用量过低不利于保护淋巴细胞活力，至少应保证使用比例不低于1:10；而使用比例1:10与1:5之间无显著差别，考虑到应尽量降低保存液对血样成分的影响及成本因素，本发明的保存液的优选使用比例为1:10。
实施例4、保存液使用温度优化
前述实施例已优化了本发明保存液成分(SOD浓度为200-400U/100ml)及使用比例(1:10)，但所有试验均在2-8℃条件下进行，实施例对保存液保存血样的最佳温度条件进行研究。
采集三个健康供者外周血(36ml/人)，均与本发明的保存液以1:10混合(保存液：血样)，每个供者的血样均分为两份，分别保存于2-8℃(冰箱冷藏)和22±2℃(恒温箱设置22℃)。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点从保存于两种温度的血样中取出3ml，采用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基(IMSF100，Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活化抗体(Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表12：
表12
检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型(0h、24h、48h)；iv.扩增倍数。
实验结果
保存液在两种温度下保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数量及活率、扩增倍数情况见下表13：
表13
“nd”表示无法检测。
由图13可见，保存液分别在两种温度条件下(2-8℃和20-24℃)保存血样，分离所得PBMC数量12h内两组变化均不明显，12h后低温组开始逐渐减少，高温组在36h内基本保持不变，36h后开始减少，两组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
由图14和图15可以看出，本发明的保存液在两种温度条件下(2-8℃和20-24℃)保存血样，分离PBMC接种培养6天：低温组24h内培养后细胞数量和扩增倍数无明显变化，24h后逐渐减少，至48h无法增殖；高温组36h内培养后细胞数量和扩增倍数维持不变，36h后开始减少。由此可见，相同使用条件下，本发明保存液在20-24℃保存血样效果更佳(p<0.05)。
本发明的保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC培养6天后的淋巴细胞表型见于下表14：
表14
| 标识 | CD3+％ | CD3+CD8+％ | CD3+CD4+％ |
| A/B-0 | 62.75 | 74.3 | 21.7 |
| A-24 | 67.44 | 70.4 | 19.2 |
| B-24 | 65.24 | 75.7 | 23.1 |
| A-48 | nd | nd | nd |
| B-48 | nd | nd | nd |
“nd”表示无法检测。
从表12和图16可以看出，采血后立即分离与使用本发明保存液在两种温度下(2-8和20-24℃)保存血样24h，然后分离PBMC进行活化培养，低温组(2-8℃)和高温组(20-24℃)培养后CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比无明显差别(p>0.05)。
结论
综上所述，可以得出如下结论：
i.保存液低温组(2-8℃)，血样保存12h内分离所得PBMC数量变化不大，12-48h逐渐减少；血样保存24h内培养后细胞数量和扩增倍数基本保存不变，24-48h细胞逐渐减少至不可见；24h内淋巴细胞表型变化不明显。
ii.保存液高温组(20-24℃)，血样保存36h内分离所得PBMC数量、培养后细胞数量和扩增倍数基本没有变化，36h后开始减少；24h内淋巴细胞表型亦变化不显著。
由此可见，本发明的保存液在接近室温的温度条件下(20-24℃)使用，对淋巴细胞的保护性能更佳。
实施例5、保存液有效期的研究
分别在不同时间点配制本发明的血液保存液，保存于2-8℃，保存时间分别为0、2、4、8周。采集三个健康供者外周血(63ml/人)，分别与保存不同时间的保存液以1:10混合(保存液：血样)，保存于22±2℃。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点从每份血样中取出3ml，采用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基(IMSF100，Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活化抗体(Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表15：
表15
检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型(0h、24h、48h)；iv.扩增倍数。
实验结果
本发明保存液配制后保存不同时间，保存血样48h分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数量及活率、扩增倍数情况见下表16：
表16
由图17可见，本发明保存液配制后分别保存不同时间(0、2、4、8周)，用以在20-24℃保存血样48h，四组分离所得PBMC数量均表现为36h内变化不大，36h后逐渐减少，且四组间差别不显著(p>0.05)。
由图18和图19可以看出，本发明保存液配制后分别保存不同时间(0、2、4、8周)，用以在20-24℃保存血样48h，分离PBMC活化培养6天，四组所得培养后细胞数量和扩增倍数在血样保存36h内均变化不明显，36h后开始减少，四组表现一致，并无统计学差异(p>0.05)。
本发明保存液配制后保存不同时间，保存血样48h分离PBMC培养6天后的淋巴细胞表型见下表17：
表17
| 标识 | CD3+％ | CD3+CD8+％ | CD3+CD4+％ |
| A/B/C/D-0 | 80.99 | 70.85 | 25.08 |
| A-24 | 75.68 | 70.63 | 27.63 |
| B-24 | 71.32 | 69.98 | 30.20 |
| C-24 | 76.54 | 67.87 | 27.89 |
| D-24 | 81.73 | 75.69 | 20.63 |
| A-48 | nd | nd | nd |
| B-48 | nd | nd | nd |
| C-48 | nd | nd | nd |
| D-48 | nd | nd | nd |
“nd”表示无法检测。
由表17和图20可以看出，本发明保存液配制后分别保存不同时间(0、2、4、8周)，用以在20-24℃保存血样24h，分离PBMC活化培养6天，所得培养后细胞中的CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比，血样保存前后及使用配制后保存不同时间的保存液之间均无显著差异(p>0.05)。
结论
综上所述，可以看出，本发明保存液配制后立即使用与在2-8℃保存2、4、8周后使用，在20-24℃保存外周血36h内，分离所得PBMC数量、活化培养后细胞数量、扩增倍数、淋巴细胞表型均无变化。因此，可以得出结论，本发明血液保存液在2-8℃保存效期至少为8周，即在配制后8周内使用均能很好的保持血样中淋巴细胞的扩增效力。
Claims (21)
1.一种保存用于体外淋巴细胞扩增的血液样品的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3.31-3.32g柠檬酸三钠、0.01-0.05g柠檬酸、2.45-3.37g葡萄糖、0.2-0.4gATP、和50-600U SOD，余量为水。
2.权利要求1的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含200-600U SOD。
3.权利要求2的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含200-400U SOD。
4.权利要求1的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3.32g柠檬酸三钠、0.025g柠檬酸、2.75g葡萄糖、0.2gATP、和350U SOD，余量为水。
5.权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液的pH值为6.8-7.3。
6.权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液:血液样品的比例是1:5-1:20。
7.权利要求6的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液:血液样品的比例是1:5-1:10。
8.权利要求7的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液:血液样品的比例是1:10。
9.权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是2℃-24℃。
10.权利要求9的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是2℃-8℃。
11.权利要求9的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是20℃-24℃。
12.权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液具有多达56天的货架期。
13.一种保存用于体外淋巴细胞扩增的血液样品的方法，包括使血液样品与权利要求1-12中任一项的血液保存液混合。
14.权利要求13的方法，其中保存液和血液样品以1:5-1:20的比例混合。
15.权利要求13的方法，其中保存液和血液样品以1:5-1:10的比例混合。
16.权利要求13的方法，其中保存液和血液样品以1:10的比例混合。
17.权利要求13的方法，还包括将血液样品和血液保存液形成的混合物保存于2℃-24℃。
18.权利要求17的方法，其中将所述混合物保存于2℃-8℃。
19.权利要求17的方法，其中将所述混合物保存于20℃-24℃。
20.权利要求13的方法，还包括将血液样品和血液保存液形成的混合物保存多达8小时、16小时、24小时、36小时或48小时。
21.权利要求13-20任一项的方法，其中所述血液样品是外周静脉血。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510033381.8A CN105850977B (zh) | 2015-01-23 | 2015-01-23 | 血液保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510033381.8A CN105850977B (zh) | 2015-01-23 | 2015-01-23 | 血液保存液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105850977A CN105850977A (zh) | 2016-08-17 |
| CN105850977B true CN105850977B (zh) | 2018-10-26 |
Family
ID=56624017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510033381.8A Active CN105850977B (zh) | 2015-01-23 | 2015-01-23 | 血液保存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105850977B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108990962A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-12-14 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种细胞保护剂及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1186596A (zh) * | 1996-12-31 | 1998-07-08 | 陈怀勇 | 血液保存液 |
| US20100184855A1 (en) * | 2009-01-21 | 2010-07-22 | Bernhardt Randal J | Hard Surface Cleaner Compositions of Sulfonated Estolides and Other Derivatives of Fatty Acids and Uses Thereof |
| CN103336110A (zh) * | 2013-06-18 | 2013-10-02 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种全血质控物及其制备方法 |
| CN104107436A (zh) * | 2014-06-16 | 2014-10-22 | 华南农业大学 | 一种用于保存犬全血的保存液及其应用 |
-
2015
- 2015-01-23 CN CN201510033381.8A patent/CN105850977B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1186596A (zh) * | 1996-12-31 | 1998-07-08 | 陈怀勇 | 血液保存液 |
| US20100184855A1 (en) * | 2009-01-21 | 2010-07-22 | Bernhardt Randal J | Hard Surface Cleaner Compositions of Sulfonated Estolides and Other Derivatives of Fatty Acids and Uses Thereof |
| CN103336110A (zh) * | 2013-06-18 | 2013-10-02 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种全血质控物及其制备方法 |
| CN104107436A (zh) * | 2014-06-16 | 2014-10-22 | 华南农业大学 | 一种用于保存犬全血的保存液及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 红细胞保存技术研究进展;刘鹤 等;《医药论坛杂志》;20080515;第29卷(第09期);第124-127页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105850977A (zh) | 2016-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105994254A (zh) | 一种dc细胞的冻存液及冻存方法 | |
| Townsend et al. | Studies on the in vitro antitumor activity of fatty acids: I. 10-hydroxy-2-decenoic acid from royal jelly | |
| CN107708811A (zh) | 治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途 | |
| CN103210903B (zh) | 一种用于保存cik细胞的冻存液及其应用 | |
| CN106701681B (zh) | 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法 | |
| CN102517253A (zh) | 一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法 | |
| CN104082277A (zh) | 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法 | |
| CN102669087A (zh) | 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法 | |
| CN102994305B (zh) | 用蛹虫草、茧提取物制备保健食(疗)品之营养露酒的方法 | |
| CN105713878A (zh) | 一种体外扩增cd8+t细胞的方法 | |
| CN104938477A (zh) | 一种cik细胞冻存液及冻存方法 | |
| CN104430303B (zh) | 人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法 | |
| Syeklocha et al. | The proliferative state of antigen-sensitive precursors of hemolysin-producing cells, determined by the use of the inhibitor, vinblastine | |
| CN105143441A (zh) | 用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备及其应用方法 | |
| CN105462922A (zh) | 一种增加免疫细胞得率的方法 | |
| CN105211052B (zh) | 一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法 | |
| CN104039333B (zh) | 移植物抗宿主疾病的治疗或预防方法 | |
| CN108913660A (zh) | 冻存pbmc诱导cik细胞的培养试剂盒及方法 | |
| CN103981144A (zh) | 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法 | |
| CN105850977B (zh) | 血液保存液 | |
| CN103845420B (zh) | 一种塔黄提取物及其应用 | |
| CN105505872B (zh) | 一种致敏nk细胞的方法及组合物 | |
| WO2013191664A1 (en) | Method of producing cik cells and the cik cells produced by the method thereof and the use for treating cancer cells | |
| CN102987408B (zh) | 从蛹虫草废茧中提取游离氨基酸等营养成分的方法 | |
| CN101429495A (zh) | 一种人外周血来源造血干细胞的培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1226602 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |