CN105462922A - 一种增加免疫细胞得率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种增加免疫细胞得率的方法，本发明的增加免疫细胞得率的方法，包括人外周血稀释、免疫细胞的分离、冻存、复苏及诱导扩增培养步骤，通过提取、保存健康时的细胞，并在后期诱导扩增培养，大大提高了免疫细胞的得率，在冻存的过程中采用特有的细胞冻存液可有效的保持免疫细胞的活性，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖，能够得到较高倍数的扩增和较高纯度的细胞，从而显著增加了免疫细胞的得率。

Description

一种增加免疫细胞得率的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种增加免疫细胞得率的方法。
背景技术
免疫细胞具有自然杀伤和自我保护的特征，其中淋巴细胞具有免疫调节和自我复制等特点，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，应用免疫细胞进行的免疫细胞疗法在癌症治疗中具有很大的临床应用价值。免疫细胞疗法目前主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、DC-CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法等。
在健康人体的血液中含有丰富的免疫细胞，随着老龄化、亚健康、患上各种疾病等原因，血液中免疫细胞的数量会明显呈下降趋势，增殖分化能力降低；而异体的免疫细胞移植则可能引起患者体内的免疫排斥反应；如何增加免疫细胞的得率直接影响了免疫细胞疗法的临床应用，现有技术中一般通过以下两个方面获得免疫细胞，一是直接从血液中提取免疫细胞，二是考虑通过后期诱导分化扩增免疫细胞。
目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定难度，在患者患病时采集血液也给患者造成二次伤害，并且减少身体的免疫细胞，降低抵抗力，所以在健康时采集的血液如何高效简单的分离更多的免疫细胞、保存和扩增成为免疫细胞治疗必须解决的问题，现有技术中已经存在从血液中分离免疫细胞的方法，但是该类免疫细胞分离过程中，对于细胞在冻存过程中的保护有限，细胞在冻存过程中容易受到损伤，在培养过程中的扩增数量也有十分有限。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种增加免疫细胞得率的方法，通过保存健康时的细胞，并在冻存过程中有效的保持细胞的活性，在扩增培养中能得到较高倍数的扩增和较高纯度的细胞，从而增加了免疫细胞的得率。
本发明通过以下技术方案实现该目的：
一种增加免疫细胞得率的方法，包括以下步骤：
1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为1：5～5：1；
2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1：5～5：1，离心机400～1000g离心10～30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞；
3)免疫细胞的冻存：将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，向制得的细胞悬液中加入细胞冻存液，摇匀分装至冻存管后移至程序降温仪，进行程序降温，降至-80℃后，转移至液氮罐；所述细胞冻存液由茶多酚、人血白蛋白和DMSO组成，人血白蛋白与DMSO的体积比为2～8：1；
4)免疫细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从液氮罐汇中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：4～10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
5)免疫细胞的诱导扩增培养：对步骤4)的培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖。
其中，步骤3)的细胞冻存液的配制方法：将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终浓度为1～10mg/mL，按体积比人血白蛋白：DMSO＝2～8：1，缓慢的加入DMSO，得到细胞冻存液。
其中，步骤3)的冻存过程具体为：将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMSO的体积比为5～17：1，茶多酚的终浓度为1～10mg/mL。
作为优选的，步骤3)的冻存管中免疫细胞的密度为2～6×106个/mL。
其中，步骤4)的冻存管从液氮罐汇中取出后，置于37℃恒温水浴，2min内完成溶解，转移至X-VIVO15培养基中，混匀后200～600g离心5～15min。
作为优选的，步骤4)的培养瓶中接种密度为1×106个/mL。
其中，NK细胞的诱导扩增培养方法：
6)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖，其终浓度分别为200～1000U/mL、200～1000U/mL、200～1000U/mL、15～120ug/mL，按总体积5～20％的量添加胎牛血清；
7)定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；
8)连续培养12～16天。
其中，CIK细胞的诱导扩增培养方法：
9)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为200～1000U/mL，按总体积5～20％的量添加胎牛血清；
10)第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为200～1000U/mL、15～120ug/mL；
11)定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；
12)连续培养12～16天。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的增加免疫细胞得率的方法，包括人外周血稀释、免疫细胞的分离、冻存、复苏及诱导扩增培养步骤，通过提取、保存健康时的细胞，并在后期诱导扩增培养，大大提高了免疫细胞的得率，在冻存的过程中采用特有的细胞冻存液可有效的保持免疫细胞的活性，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖，能够得到较高倍数的扩增和较高纯度的细胞，从而显著增加了免疫细胞的得率。
附图说明
图1为实施例9扩增培养后的NK细胞形态观察图。
图2为对照例1扩增培养后的NK细胞形态观察图。
图3为实施例12扩增培养后的CIK细胞形态观察图。
图4为对照例2扩增培养后的CIK细胞形态观察图。
图5为扩增培养后的NK细胞增殖曲线图。
图6为扩增培养后的CIK细胞增殖曲线图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1、免疫细胞的分离
1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为1：5；
2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1：5，离心机400g离心30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。
实施例2、免疫细胞的分离
1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为5：1；
2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为5：1，离心机700g离心20min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。
实施例3、免疫细胞的分离
1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为1：1；
2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1：1，离心机1000g离心10min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。
实施例4、免疫细胞的冻存
细胞冻存液：将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终浓度为1mg/mL，按体积比人血白蛋白：DMSO＝2：1，缓慢的加入DMSO，得到细胞冻存液。
将收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMSO的体积比为5：1，免疫细胞冻存密度为2×106个/mL。
实施例5、免疫细胞的冻存
细胞冻存液：将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终浓度为10mg/mL，按体积比人血白蛋白：DMSO＝8：1，缓慢的加入DMSO，得到细胞冻存液。
将收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMSO的体积比为17：1，免疫细胞冻存密度为6×106个/mL。
实施例6、免疫细胞的冻存
细胞冻存液：将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终浓度为5mg/mL，按体积比人血白蛋白：DMSO＝5：1，缓慢的加入DMSO，得到细胞冻存液。
将收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMSO的体积比为10：1，免疫细胞冻存密度为3×106个/mL。
实施例7、免疫细胞的复苏诱导扩增NK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：4，混匀后200g离心5min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖，其终浓度分别为200U/mL、200U/mL、200U/mL、15ug/mL，按总体积5％的量添加胎牛血清；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
实施例8、免疫细胞的复苏诱导扩增NK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：10，混匀后600g离心15min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖，其终浓度分别为1000U/mL、1000U/mL、1000U/mL、120ug/mL，按总体积20％的量添加胎牛血清；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
实施例9、免疫细胞的复苏诱导扩增NK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：7，混匀后400g离心10min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖，其终浓度分别为500U/mL、500U/mL、500U/mL、67.5ug/mL，按总体积10％的量添加胎牛血清；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
实施例10、免疫细胞的复苏诱导扩增CIK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：4，混匀后200g离心5min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为200U/mL，按总体积5％的量添加胎牛血清；第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为200U/mL、15ug/mL；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
实施例11、免疫细胞的复苏诱导扩增CIK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：10，混匀后600g离心15min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为1000U/mL，按总体积20％的量添加胎牛血清；第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为1000U/mL、120ug/mL；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
实施例12、免疫细胞的复苏诱导扩增CIK细胞
取实施例4、5或6的冻存管水浴溶解后，将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：7，混匀后600g离心10min，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
向上述免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为500U/mL，按总体积10％的量添加胎牛血清；第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为50U/mL、67.5ug/mL；定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；连续培养12～16天。
对照例1。
1)免疫细胞的分离提取：分离提取单个核细胞采用与本发明相同的方法；
2)免疫细胞的冻存：冻存与实施例不同的是，对照例1所使用的冻存液为：首先将DMSO和胎牛血清按1：5的体积比配制，并放入4℃冰箱冷却待用，用胎牛血清将分离提取到的单个核细胞重悬，再缓慢加入已经冷却的DMSO、胎牛血清混合液混匀，冻存液中DMSO与胎牛血清的体积比为1：11；
3)免疫细胞的复苏培养NK细胞：复苏方法与本发明相同，但免疫诱导扩增培养NK细胞过程中与本发明的区别在于没有添加海带多糖。
对照例2。
1)免疫细胞的分离提取：分离提取单个核细胞采用与本发明相同的方法；
2)免疫细胞的冻存：冻存与实施例不同的是，对照例1所使用的冻存液为：首先将DMSO和胎牛血清按1：5的体积比配制，并放入4℃冰箱冷却待用，用胎牛血清将分离提取到的单个核细胞重悬，再缓慢加入已经冷却的DMSO、胎牛血清混合液混匀，冻存液中DMSO与胎牛血清的体积比为1：11；
3)免疫细胞的复苏培养CIK细胞：复苏方法与本发明相同，但免疫诱导扩增培养CIK细胞过程中与本发明的区别在于没有添加海带多糖。
实施例13、扩增培养后免疫细胞形态观察
随机选取实施例9及对照例1扩增培养的NK细胞、实施例12及对照例2扩增培养的CIK细胞，在培养到14天时在200倍显微镜下进行拍照观察，免疫细胞形态分别如图1～4所示，由图1～4可知，应用本发明的方法扩增培养的NK细胞、CIK细胞的活性均较高，扩增密度也均明显优于对照例1、2的免疫细胞。
实施例14、扩增培养后免疫细胞表面标志物检测
分别将实施例7、8、9与对照例1、实施例10、11、12与对照例2扩增培养后的免疫细胞采用流式细胞仪进行表面标志物检测，检测结果如表1、表2所示：
表1实施例7～9与对照例1流式检测结果
组别 实施例7 实施例8 实施例9 对照例1
CD3-CD56+(％) 79.3 83.5 85.2 47.5
表2实施例10～12与对照例2流式检测结果
组别 实施例10 实施例11 实施例12 对照例1
CD3-CD56+(％) 47.1 47.9 49.3 17.8
从上述流式检测结果可以看出，本发明的方法扩增得到的NK细胞和CIK细胞都优于对照例，尤其是实施例9培养的NK细胞、实施例12培养的CIK细胞最佳。
实施例15、扩增培养后免疫细胞的增殖曲线
分别将实施例7～9与对照例1扩增培养的NK细胞、实施例10～12与对照例2扩增培养的CIK细胞从第5天进行每隔1天(第0、5、7、9、11、13天)计数，采用血球计数板计数，制得免疫细胞增殖曲线图，其中，图5为NK细胞增殖曲线，图6为CIK细胞增殖曲线。
从以上图5和图6分别可以看出，本发明的方法诱导扩增培养的NK细胞和CIK细胞的增殖数量优于对照例，尤其是实施例9和实施例12结果最佳。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种增加免疫细胞得率的方法，包括以下步骤：
1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为1：5～5：1；
2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1：5～5：1，离心机400～1000g离心10～30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞；
3)免疫细胞的冻存：将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，向制得的细胞悬液中加入细胞冻存液，摇匀分装至冻存管后移至程序降温仪，进行程序降温，降至-80℃后，转移至液氮罐；所述细胞冻存液由茶多酚、人血白蛋白和DMSO组成，人血白蛋白与DMSO的体积比为2～8：1；
4)免疫细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从液氮罐汇中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至X-VIVO15培养基中，细胞悬液与X-VIVO15培养基的体积比为1：4～10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用X-VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；
5)免疫细胞的诱导扩增培养：对步骤4)的培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖。
2.如权利要求1所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤3)的细胞冻存液的配制方法：将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终浓度为1～10mg/ml，按体积比人血白蛋白：DMSO＝2～8：1，缓慢的加入DMSO，得到细胞冻存液。
3.如权利要求2所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤3)的冻存过程具体为：将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMSO的体积比为5～17：1，茶多酚的终浓度为1～10mg/mL。
4.如权利要求3所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤3)的冻存管中免疫细胞的密度为2～6×106个/mL。
5.如权利要求1所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤4)的冻存管从液氮罐汇中取出后，置于37℃恒温水浴，2min内完成溶解，转移至X-VIVO15培养基中，混匀后200～600g离心5～15min。
6.如权利要求1所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤4)的培养瓶中接种密度为1×106个/mL。
7.如权利要求1所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤5)对NK细胞的诱导扩增培养方法：
6)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖，其终浓度分别为200～1000U/mL、200～1000U/mL、200～1000U/mL、15～120ug/mL，按总体积5～20％的量添加胎牛血清；
7)定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、IL-15、IL-21、海带多糖、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；
8)连续培养12～16天。
8.如权利要求1所述的增加免疫细胞得率的方法，步骤5)对CIK细胞的诱导扩增培养方法：
9)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为200～1000U/mL，按总体积5～20％的量添加胎牛血清；
10)第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为200～1000U/mL、15～120ug/mL；
11)定期补充新鲜的X-VIVO15培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大于3×106个/mL；
12)连续培养12～16天。
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