KR101525199B1

KR101525199B1 - 100㎖ 이하 말초혈액으로부터 ｎｋ세포의 대량 증식 방법

Info

Publication number: KR101525199B1
Application number: KR1020120101519A
Authority: KR
Inventors: 최병인; 임고은
Original assignee: (주)케이셀바이오
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2015-06-04
Also published as: KR20140035102A

Abstract

본 발명은, 1회 채혈 가능한 특정용량(30㎖ ~ 100㎖)의 말초혈액으로부터 말초혈액을 채취하여 림프구를 분리하는 단계; 분리된 림프구를 플라스크에 옮겨 면역세포 배양용 조성물 하에서 1차 배양하는 단계; 배양된 면역세포 중 NK세포만을 회수하여 플라스크에서 2차 배양하는 단계; 2차 배양 후 NK세포를 회수하여 이전의 배양에서보다 큰 용량의 플라스크에서 3차 배양하는 단계; 3차 배양 후 NK세포를 회수하여 대용량의 플라스크에서 4차 배양하는 단계를 포함하는 NK세포의 대량 증식 방법에 관한것으로, NK세포 분리 이후 4차의 배양으로 나누어 진행되며 NK세포를 초기 NK세포 수를 기준으로 1000배 이상 증식할 수 있고, 증식 배양된 NK세포를 유효활성성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물로서 제공할 수 있다.

Description

100㎖ 이하 말초혈액으로부터 ＮＫ세포의 대량 증식 방법{A METHOD FOR EXPANDING NK CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD BELOW 100㎖}

본 발명은 말초혈액에서 NK세포를 대량증식하고 장기 보관하는 기술에 관한 것이다.

면역계는 복잡한 기전에 의해 조절되며 면역계의 이상이 생길 경우 면역시스템에 불균형이 초래되어 암과 같은 난치성 질병이 발생한다. 종양(암)은 정상세포가 환경적, 유전적 요인에 의해 돌연변이를 일으켜 자가세포로 구성된 조직으로서 오랜 기간을 두고 진행되며, 암 환자의 면역세포는 정상인에 비하여 많은 부분에서 그 기능이 크게 저하되며 그 수도 급격이 줄어든다. 인체는 이러한 종양에 대항하여 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)나 자연 살해세포 (Natural Killer cell, NK cell)와 같은 면역세포를 생산하여 암 세포를 살상한다.

암의 치료를 위해서 암환자에게서 이러한 면역세포의 살상능과 활성증가는 암의 치료를 위해 매우 중요하다. 항암 치료는 암치료의 중요한 부분으로서 종양을 제거하거나 크기를 줄임으로서 증상을 완화하는데 목적이 있다. 여기에는 재발의 감소나 생존율을 높여야 하는 숙제를 가지고 있다. 무엇보다 항암제 치료는 환자의 삶의 질을 높일 수 있어야 한다. 하지만 현재의 치료법으로는 아직 만족스러운 암의 완치율에 접근하고 있지 못하며 무엇보다 항암제에 대한 저항성과 부작용, 그리고 사용된 약제가 모든 사람에게 효과가 있지 못하다는 약점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 아직 우리 나라의 암치료에 있어서 삶의 질 향상 문제는 두 번째의 문제로 생각할 수 밖에 없을 정도로 암치료에 대한 약제 사용과 연관된 regimen이나 규정, 행정적 절차의 개선이 필요한 상태이다. 따라서 각 환자에 맞는 효과적이고, 부작용이 적고 편안하게 받을 수 있는 새로운 치료법 개발의 요구성이 높다.

개선된 치료법의 조건은 무엇보다 전신치료제이면서도 좀더 효과적이어야 하고, 독성이 적어 정상세포에 주는 영향이 적어야 하며 정상세포와 구별되는 암의 특이적인 생물학적 특징에 초점을 맞춘 치료이어야 한다. 이에 최근에는 항암 화학치료 뿐 만 아니라 면역치료요법도 병용하는 임상이나 치료법 개발이 빠르게 추진되고 있다. 인체의 면역계에서 NK세포는 대표적인 선천면역세포 중 하나로, 비 특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있고 바이러스, 박테리아 등을 인식하여 살상하는 능력을 보유한 세포로 알려져 있다. NK세포의 살상은 NK세포가 분비하는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)등의 효소에 의한 살상과 Fas-FasL 상호작용으로 병원체를 살상하는 능력으로 암이나 감염된 세포를 제거한다. 특히, 암환자에서 이러한 NK세포의 살상능은 폐암 (Carrega P, et al., Cancer, 112, 863-875, 2008), 간암 (Jinushi M, et al., J Hepatol., 43, 1013-1020, 2005), 유방암 (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 33, 119-124, 2003), 자궁암 (Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 79, 224-250, 1999), 혈액암 (Tajima F., et al, Leukemia 10, 478-482, 1996) 등의 질환의 발생과 깊은 연관이 있는 것으로 보고되고 있다.

NK세포와 같이 면역세포를 이용한 항암치료의 효과는 암의 진행에 따라 차이가 날 수 있다. 면역세포치료는 암 진행 초기의 환자나 절제 수술 후 암의 재발을 억제하기 위해 사용할 때 그 효과가 극대화 될 수 있다. 따라서 이러한 암 질환의 치료를 위해서는 암환자에게서 NK세포의 암세포 살상능과 활성을 유지시키는 것이 필수적이며, 또한 NK세포 수를 유지시키는 것이 중요하다. 그러나 이러한 NK세포의 필요로 암환자의 혈액을 대량으로 확보하기도 어렵고 말초혈액에서 NK세포를 분리하는데 고비용이 들기 때문에 매우 한정된 환자만을 대상으로 항암면역치료가 진행되고 있는 실정이다.

따라서 전 세계적으로 여러 연구팀들에 의해 NK세포를 분리하여 확장 배양하는 기술이 개발되고 있다. 이러한 방법으로 단핵구에서 초기에 NK세포를 분리하거나 또는 T세포를 제거한 후 사이토카인을 사용하여 배양하는 방법 아니면 골수에 있는 줄기세포에서 NK세포를 유도하는 방법 등이 있다. 문제는 이들 방법이 고가의 장비를 요구하며 고농도 및 고가의 여러 종류의 사이토카인을 이용하고 있어 치료대상 환자가 경제적으로 부담하기에는 실로 어려운 실정이다.

본 발명의 목적은 말초혈액(100㎖이하)으로부터 림프구를 선택적으로 분리하고 분리한 림프구에서 NK세포를 대량 증식하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 증식 배양된 NK세포를 장기적 동결 보존하여 암 예방 및 치료용 조성물로서 제공하는 것이다.

상기의 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 말초혈액을 채취하여 림프구를 분리하는 단계;상기 분리된 림프구를 플라스크에 옮겨 면역세포 배양용 조성물 하에서 1차 배양하는 단계;상기 배양된 면역세포 중 NK세포만을 회수하여 플라스크에서 2차 배양하는 단계;상기 2차 배양 후 NK세포를 회수하여 이전의 배양에서보다 큰 용량의 플라스크에서 3차 배양하는 단계;상기 3차 배양 후 NK세포를 회수하여 대용량 플라스크에서 4차 배양하는 단계를 포함하는 NK세포의 대량 증식 방법을 제시한다. 즉, 본 발명의 증식방법은 기존의 배양증식방법과 달리 NK세포 분리 이후 4차의 배양으로 나누어 진행되며 NK세포를 최대한 증식시킬 수 있다.

또한 상기 배양 기간 동안, 플라스크 내에 2~3일 간격으로 배양조성물을 추가하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 이로써 NK배양이 효과적으로 일어나도록 도와주는 역할을 한다.

또한 상기 1차 및 2차 배양시 고순도 자연살해세포를 대량 배양하기 위하여 NK세포 배양용 배지에 첨가되는 배양 조성물은 인터루킨-2(IL-2), OKT-3, 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로-비드(micro-bead)를 포함하며, 배양 초기 증식을 일으키기 위하여 OKT-3를 사용한다. 마이크로 비드는 여러 종류의 면역세포 중 NK세포를 선택적 분리를 통하여 증식시키고, 활성화시키는 역할을 한다.

또한 상기 3차 및 4차 배양시 고순도 자연살해세포를 대량 배양하기 위하여 NK세포 배양용 배지에 첨가되는 배양 조성물은 인터루킨-2(IL-2), 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로-비드(micro-bead)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, NK세포를 최대한 증식시키기 위하여 배양은 각 단계별로, 1일간 1차 배양, 4일간 2차 배양, 5일간 3차 배양, 4일간 4차 배양을 진행하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 세포 배양을 4차에 걸쳐 별개의 플라스크에서 진행하고 각 단계별 최적의 배양기간을 찾아냄으로써 최종적으로 1000배의 NK 세포의 증식이 이루어지게 된다.

또한 NK세포 증식배양에 사용되는 상기 말초혈액은 건강한 정상인의 말초혈액을 대상으로 하며 특히, 1회 채혈용량인 30㎖ ~ 100㎖ 혈액에 존재하는 초기 NK세포, 더욱 바람직하게는 30㎖ ~ 60㎖ 혈액에 존재하는 초기 NK세포로부터 배양함으로써 NK 세포를 최대한 증식시킬 수 있다.

또한 본 발명의 제조방법에 따라 배양된 NK세포를 주요활성성분으로 포함하는 암예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다.

상기 암예방 및 치료용 조성물을 제조시에는 배양된 NK세포를 일정기간 냉동 보관하여 동결 보존 단계에서 얻은 세포를 융해, 복원하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 증식 배양된 NK 세포는 암 예방 및 치료용으로서 NK세포 조성물로서 당업계의 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과적 수술적으로 예상투여 부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 예상 투여부위로 이동 할 수 있다. NK세포의 치료용으로서의 조성물은 암의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 질병의 정도에 따라 적절히 선택될 수 있고 바람직하게는 성인의 경우 1X10⁶에서 1X10¹¹까지 세포를 투여할 수 있다. 투여를 위해서는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 텍스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 NK세포의 증식방법은 30㎖ ~ 60㎖ 용량의 말초혈액에서 NK세포를 초기 NK세포 수를 기준으로 1000배 이상 증식할 수 있다.

또한 말초혈액으로부터 얻은 NK세포를 더 많이 증식시켜 줌으로써, 암세포치료제에 이용할 수 있는 많은 수의 세포를 획득할 수 있고 활성이 뛰어난 세포를 이용할 수 있는 장점이 있으며, 말초혈액으로부터 분리한 NK세포를 이용한 세포 치료제의 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 증식방법은 기존의 배양 증식 방법과 달리 NK 세포를 선택적 분리 이후 4차 배양으로 나누어 진행됨으로써 NK 세포를 최대한 증식시킬 수 있다.

본 발명은 또한 증식 배양된 NK 세포를 장기적 동결 보존하여 암 예방 및 치료용 조성물로서 제공할 수 있다.

도 1은 인터루킨-2(IL-2)를 제외한 다른 사이토카인의 자극 없이 배양하는 기존의 배양방법과, 본 발명의 배양방법에 따른 세포배양 결과 세포수득률을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 배지 조성물에 의한 활성화 림프구의 배양 0일째, 5일째, 10일째, 14일째 활성화 림프구수를 계측한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 배지 조성물에 의해 배양된 활성화 림프구를 유세포 분석기(flowcytometry)를 이용하여 배양 조건별로 활성화 림프구의 CD3 및 CD56에 대한 표현항원을 검사한 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다.

실시예 1: 말초혈액의 채취와 혈액에서 림프구의 분리

건강한 정상인의 정맥으로부터 말초 혈액 30㎖ 또는 60㎖을 채혈하고 무균상태에서 혈액을 뽑아내었다. 이때, 채혈 용기로 헤파린 또는 EDTA와 같은 항응고제가 포함된 채혈 튜브를 사용할 수 있으며 바람직하게는 EDTA 튜브를 사용하였다. 그후 혈액을 50㎖ conical 튜브에 모은 후 피콜(ficoll)이 들어 있는 튜브에 벽면을 이용해 혈액을 조심스럽게 얹은 다음 2000rpm으로 30분간 원심분리 하였다.

5㎖ 피펫으로 피콜과 플라스마(Plasma)사이에 생긴 림프구층을 취하여 새로운 튜브에 옮겨 담은 후, PBS를 50㎖까지 채우고 세포를 고르게 섞고 1500rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액은 진공흡입(suction)하여 깨끗이 제거하는 방법으로 총 3번 세척하였다. 그후 트리판블루(Trypan blue)용액을 이용하여 림프구수를 측정하였다. 상기 림프구 현탁액 10㎕를 혈구 계산판에 공급하고 현미경에서 림프구수를 측정한 결과 총 1.0X10⁷~1.0X10⁸개였다.

실시예 2: 분리된 림프구에서 NK 세포의 증식배양

1. 1차 배양

말초혈액으로부터 분리된 림프구를 75㎠ 플라스크에 옮겨 CD335 항체가 있는 상태에서 배양하였다. 배양을 위해 2X10⁶U/㎖ 의 인터루킨-2(IL-2), 10ng/㎖의 OKT-3, 100ug/㎖의 항CD2 항체, 100ug/㎖의 CD335 항체를 넣은 플라스크를 조심스럽게 흔들어 세포와 사이토카인을 고르게 섞고, 이때 세포 배양액은 20㎖을 유지 하였다.

플라스크는 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37℃ 습윤 배양기에 넣어 1일간 배양하였다.

2. 2차 배양

상기 1차 배양 후 배양액을 회수하여 다른 플라스크에 분주 후 인터루킨-2 (IL-2), OKT-3, 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로 비드(micro-bead)가 포함된 배양액을 20㎖을 추가로 넣어주었으며, 2~3일 간격으로 배양액을 추가로 넣어주었다.

4일간 배양 후, 세포를 회수하여 원심분리 후, OKT-3를 제거하기 위해 PBS로 1번 세척하였으며, 진공흡입(suction)을 통하여 OKT-3를 깨끗이 제거하였다.

3. 3차 배양

상기 2차 배양한 세포에 2X10⁶U/㎖의 인터루킨-2(IL-2), 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로 비드(micro-bead)를 첨가하고, 고루 섞은 후, 1X10⁷ cells/flask에 세포를 접종하였다. 상기 플라스크는 5% 이상화탄소가 포함된 37℃ 습윤 배양기에 넣어 5일간 더 배양하였다. 2~3일 간격으로 인터루킨-2(IL-2), 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로 비드(micro-bead)가 첨가된 배양액을 첨가하였다.

4. 4차배양

상기 3차 배양된 세포를 수거하여 수를 측정하고, 수거된 세포는 175 ㎠ 플라스크에 4X10⁷ cells/flask에 세포를 접종한다. 그리고 2X10⁶U/㎖ 의 IL-2가 첨가된 배양액 30㎖을 넣어 주었으며, 2~3일 간격으로 인터루킨-2(IL-2), 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로 비드(micro-bead)가 첨가된 배양액을 첨가하고 4일간 배양하였다.

실시예 3 : 활성화 자연 살해 세포의 동결 보존

상기 실시예 2의 배양으로 얻은 활성화 NK세포를 초기 배양일로부터 14일째 되는 날 수거하여, 원심분리 한 후 상기 배양용 배지를 흡입기로 제거하고 활성화 침전물을 얻었다. 혈구 계산판을 이용하여 세포수를 측정한 후, NK 세포의 동결 보관을 시작하였다. 상기 활성화 림프구 침전물에 세포 보존액 (Freezing media 90%,Cryoserv 10%) 50㎖을 혼합하여 1.8㎖의 세포 보존용 튜브에 1㎖씩 튜브에 분리 주입하였다. 그리고 튜브를 상기 동결처리용기에 넣고 -80℃에서 보존한 후 3~5일 후에 질소탱크로 옮겨 보관하였다.

NK 세포 증식 결과 확인 실험

실시예 1에서와 같이, 정상인의 말초 혈액 30㎖~60㎖으로부터 림프구를 분리

한 후, 기존에 배양방법과 실시예 2에 따른 배양방법으로 각각 14일 동안 배양하여 NK 세포의 증식을 비교하였다. 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, OKT-3 + 항CD335 항체 + 항CD2 항체 + 마이크로-비드(micro-bead)의 자극이 없을 경우에는 약 300배의 증식에 그치는 반면, OKT-3 + 항CD335 항체 + 항CD2 항체 + 마이크로 비드(micro-bead)의 자극으로 10일 배양 후 약 400배, 최대 14일 배양으로 약 1000배의 증식한 것을 확인하였다.

또한 모든 혈액을 실시예 1에서처럼 림프구를 분리 한 후, 동일한 일정 세포를 플라스크에 분주하고 배양일로부터 5일째, 10일째, 14일째 되는 날 각 세포를 수거하여 세포수를 측정하였다. 그 결과 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, NK 세포를 배양하는 것은 인터루킨-2(IL-2)를 단독으로 처리하는 것보다 인터루킨-2(IL-2)+ 항CD335 항체 + 항CD2 항체 + OKT-3 를 동시에 처리한 경우 14일간의 배양으로 약 1000배 이상의 증식 능력을 보여주었다.

본 발명의 실시예 2의 결과로 나타나는 도 3의 그래프의 X축은 CD3(T-림프구 표지자)을 표지하는 것이고 Y-축은 CD56를 표지하는 것으로서, 각 그래프는 4개의 구획으로 나뉘어서 분석되는데, 네 구획 중 좌상 구획(01영역)은 CD3 음성, CD56 양성인 NK 세포를 표시하는 부분이며 우상 구획(02영역)은 CD3와 CD56이 모두 양성인 림프구를 표시하는 부분이다.

이 두 구획(01,02 영역)의 세포가 항암효과를 가지는 림프구를 나타낸다. 그러므로, 이러한 분석에 의할 때 본 발명의 실시예대로 인터루킨-2(IL-2), OKT-3,항CD2 항체, 마이크로-비드(micro-bead) 및 항CD335 항체를 조합하여 배양한 경우 배양전보다 배양후의 살해세포 표면항원인 CD56의 발현 비율이 60% 이상이었다. 또한, 배양후의 T-림프구 표지자인 CD3 음성인 세포의 비율은 50% 이상이고, CD3-CD56+ NK 세포의 비율은 30% 이상이었다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명에서 사용하는 배양 방법은 항암효과가 뛰어난 NK세포를 대량 증식 배양하는데 유용한 것임을 확인할 수 있었다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 이와 같은 특정 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능한 것이다.

Claims

말초혈액을 채취하여 림프구를 분리하는 단계;
상기 분리된 림프구를 플라스크에 옮겨 면역세포 배양용 조성물 하에서 1차 배양하는 단계;
상기 배양된 면역세포 중 NK세포만을 회수하여 플라스크에서 2차 배양하는 단계;
상기 2차 배양 후 NK세포를 회수하여 이전의 배양에서보다 큰 용량의 플라스크에서 3차 배양하는 단계;
상기 3차 배양 후 NK세포를 회수하여 대용량의 플라스크에서 4차 배양하는 단계를 포함하는 NK세포의 대량 증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 기간 동안, 플라스크 내에 2~3일 간격으로 배양조성물을 추가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 NK세포의 대량 증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 1차 및 2차 배양시 NK세포 배양조성물은 인터루킨-2(IL-2), OKT-3, 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로-비드(micro-bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 NK세포의 대량 증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차 및 4차 배양시 NK세포 배양조성물은 인터루킨-2(IL-2), 항CD2 항체, 항CD335 항체 및 마이크로-비드(micro-bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 NK세포의 대량 증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 1일간 1차 배양, 4일간 2차 배양, 5일간 3차 배양, 4일간 4차 배양을 진행하는 것을 특징으로 하는 NK세포의 대량 증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 말초혈액은 30㎖ ~ 60㎖ 인 것을 특징으로 하는 NK세포의 대량 증식 방법.
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