KR102111283B1

KR102111283B1 - 면역세포의 진탕 배양 방법

Info

Publication number: KR102111283B1
Application number: KR1020190166079A
Authority: KR
Inventors: 황성환; 강정화
Original assignee: 주식회사 이뮤니스바이오
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2020-05-15
Also published as: WO2021118015A1

Abstract

본 발명은 적절한 전단응력이 가해지도록 진탕배양을 함으로써 면역세포의 증식을 촉진하는 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 면역세포의 진탕 배양 방법은, 혈액으로부터 면역세포를 분리하는 단계 및 분리된 면역세포를 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 면역세포간 상호작용을 방해하지 않으면서 종래 동물세포의 배양시 발생하기 쉬운 발포의 문제 없이 세포의 성장과 증식을 촉진할 수 있으며, 세포 계수를 어렵게 하는 뭉침현상을 해소할 수 있는 효과가 있다.

Description

면역세포의 진탕 배양 방법 {Shaking culture method of immune cells}

본 발명은 면역세포의 배양방법에 관한 것으로, 특히 적절한 전단응력이 가해지도록 진탕배양을 함으로써 면역세포의 증식을 촉진하는 배양방법에 관한 것이다.

부유세포(suspension cell)는 어떤 표면에 부착하여 자라지 않고 부유하여 생장한다. 많은 부유세포는 생장하기 위한 여러 인자(factor)들을 주고받으며 서로 상호작용하기 쉽게 뭉침현상(aggregation)이 생긴다. 이러한 뭉침현상은 세포의 생장에 중요한 역할을 하지만 이런 뭉침현상이 과하게 일어나 크기가 커지게 되면 양분, 산소 등을 교환하기 어려워 생장에 제한이 되기도 한다. 따라서 부유세포의 뭉침현상을 조절하는 것은 부유세포의 배양에서 매우 중요하다.

종래의 미생물 배양계는 동물세포를 대량 생산하는 데에는 거의 적용할 수 없다. 동물세포는 세포벽이 없기 때문에 교반에 의해 야기되는 전단력에 대한 내성이 낮고, 동물세포 배양에 사용하는 배양액에는 혈청 등 단백질 성분이 많아 발포하기 쉬운 성질을 가지고 있다. 발포는 세포막의 분해를 일으키는 것으로 알려져 있으며 세포증식을 방해하는 원인이 된다. 이들에 대한 대책으로 소포제(계면활성제)를 첨가하는 방법을 고려할 수 있지만 미생물세포와 달리 동물세포는 계면활성제에 대한 저항성이 약하여 증식저해를 일으키기 때문에 소포제를 사용할 수 없다.

면역세포를 포함하여 동물세포는 기본적으로 교반, 진탕과정을 통해 생기는 전단응력(shear stress)에 민감하다. 따라서 외부 필터와 높은 유속에 의존하는 교반탱크 바이오리액터(stirred-tank bioreactor), 관류 배양시스템(perfusion culture system) 등을 사용하면 배양효율이 낮다.

특히, 면역세포의 경우 배양 초기에 모여 있어야 상호작용이 일어나고 성장이 잘 되는 것으로 알려져 있어 초기에는 적은 용량의 플라스크에서 정치배양한 후 큰 용량의 플라스크로 옮기면서 배양하는 것이 일반적이다.

림프구(Lymphocyte)는 면역세포의 일종으로 부유세포이며, 시험관 내(in vitro) 세포배양시 뭉치는 현상이 일어나고 시간이 지날수록 크기가 커지는 경향이 있다.

대한민국 특허공개 제10-2008-0072006호 대한민국 특허공개 제10-2011-0042210호 대한민국 특허공개 제10-2014-0123503호 대한민국 특허공개 제10-2018-0044427호

Godoy-Silva R et al., Physiological responses of CHO cells to repetitive hydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, No. 6, August 15, 2009. J.A. Frangos et al., Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 32, Pp. 1053-1060 (1988). Timm Tanzeglock et al., Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 104, No. 2, October 1, 2009. Zhang, Hu et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11,　Number 1, January 2010, pp. 103-112(10).

정치배양에서 부유세포는 계속해서 뭉침현상이 일어나게 되어 군집이 커지게 되지만, 적절한 교반속도로 진탕배양하는 환경에서는 뭉치는 세포의 크기를 제한할 수 있다. 진탕배양 환경에서는 배양액의 유동이 발생하고 이로 인해 전단응력이 세포에 물리적 영향을 미친다. 본 발명은 이러한 점에 착안한 것이다.

특히, 면역세포의 경우 배양 초기에 모여 있어야 상호작용이 잘 일어나고 성장이 잘 되는 것으로 알려져 있어 배양 초기에는 적은 용량의 플라스크에서 정치배양하고 있으나, 림프구를 비롯한 면역세포들이 부유세포인 점과 생체 내에서 혈관과 림프관을 순환하는 점을 고려할 때 적절한 전단응력을 가하여 세포 뭉침현상을 조절하면 세포의 생존과 증식에 더 긍정적인 영향을 미칠 것으로 생각할 수 있다.

본 발명은 위와 같은 점들에 기초하여, 면역세포의 배양에서 세포간 상호작용을 방해하지 않으면서 동물세포를 교반할 때 나타나는 발포 등의 문제점 없이 면역세포의 증식을 촉진하는 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 면역세포의 배양에서 세포간 뭉침현상을 해결함으로써 셀 계수를 용이하게 하는 것을 목적으로 한다. 이렇게 함으로써 무인배양기 내 이미징 장비를 통해 세포를 계수하고 배지를 추가하여 적정 세포 밀도를 유지할 수 있는 배양방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,

혈액으로부터 면역세포를 분리하는 단계; 및

분리된 면역세포를 하기 식으로 계산되는 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양하는 단계를 포함하는, 면역세포의 진탕 배양 방법을 제공한다.

(a: orbit 반경, η: 배지 점도 계수, ρ: 배양액 밀도, f: 초당 회전수)

상기 방법에서, 상기 진탕 배양은 면역세포를 배양하기 시작하는 배양 초기부터 이루어지는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 진탕 배양은 면역세포를 배양하기 시작하는 배양초기부터 배양 전기간에 걸쳐 이루어질 수 있다.

상기 방법에서, 상기 전단응력은 0.1~0.3dyn/cm²인 것이 바람직하다.

상기 면역세포는 특히 림프구를 포함한다.

상기 방법에서, 상기 배양은 2~20°의 기울기로 기울어진 상태로 배양하는 것이 바람직하다.

상기 방법에서, 상기 배양은 가운데 부분이 없는 도넛형태의 배양기를 사용하여 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 면역세포를 배양할 때 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양함으로써 세포간 상호작용을 방해하지 않으면서 종래 동물세포의 배양시 발생하기 쉬운 발포의 문제 없이 세포의 성장과 증식을 촉진할 수 있으며, 세포 계수를 어렵게 하는 뭉침현상을 해소할 수 있는 효과가 있다.

또한, 배양기의 가운데 부분이 없는 도넛형태의 배양기를 사용할 경우 교반시 전단응력이 가운데 부분에 미치지 않아 배양기 내부에서 전단응력이 국소적으로 차이가 나는 문제점도 해결하여 면역세포의 성장과 증식을 촉진하는 최적의 환경을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 진탕 배양 방법에서 계대배양 시점별 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 진탕 배양 방법에서 최종 총 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 진탕 배양 방법에서 총 세포증식배수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 진탕 배양 방법에서 각 계대배양 시점간 총 세포증식을 비교한 그래프이다.
도 5 내지 9는 본 발명의 일실시예에 따른 진탕 배양 방법에서 각 회전수(rpm)에서 세포뭉침형태를 보여주는 사진이다.
도 10은 교반배양한 실험구(shaking)와, 정치배양 후 교반배양한 비교구(standing & shaking)의 계대배양 시점별 총 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 11은 교반배양한 실험구(shaking)와, 정치배양 후 교반배양한 비교구(standing & shaking)의 최종 총 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 진탕 배양 방법에서 사용되는 도넛형태의 세포배양백의 일실시형태를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 진탕 배양 방법에서 사용되는 도넛형태의 세포배양백의 받침대의 일실시형태를 나타낸 것이다.

본 발명의 면역세포의 진탕 배양 방법은, 혈액으로부터 면역세포를 분리하는 단계; 및 분리된 면역세포를 하기 식으로 계산되는 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 면역세포는 면역에 관여하는 다양한 종류의 세포를 포함하는 개념으로, 림프구(lymphocyte), 자연살해세포(Natural Killer cell, NK 세포), 수지상세포(dendritic cell), 마크로파지(macrophage), T 세포, B 세포, 과립구(granulocyte), 단핵구(monocyte, 모노사이트), 거핵구(megakaryocyte) 등을 포함한다. 본 발명에서 면역세포는 특히 림프구와 자연살해세포를 포함한다.

본 발명의 면역세포 진탕 배양 방법을 구체적으로 설명한다.

먼저 혈액으로부터 면역세포를 분리한다. 면역세포의 분리에는 각 면역세포의 분리에 통상적으로 사용되는 방법이 사용될 수 있다.

분리된 면역세포를 배양기에 넣고 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양한다. 이때 분리된 면역세포는 배지에 현탁시킨 현탁액의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 전단응력은 0.1~0.3dyn/cm²을 가하는 것이 바람직하고, 0.15~0.25dyn/cm²을 가하는 것이 보다 바람직하며, 0.18~0.21dyn/cm²을 가하는 것이 특히 바람직하다.

상기 진탕 배양은 면역세포를 배양하기 시작하는 배양 초기부터 이루어지는 것이 바람직하다. 본 발명에서 '배양 초기'라 함은 세포를 배양기에 넣고 배양을 시작하는 시점으로 정의된다. 더욱 바람직하게는 상기 진탕 배양은 면역세포의 배양초기부터 배양 전기간에 걸쳐 이루어질 수 있다.

상기 배지로는 각 면역세포의 배양에 적합한 배지를 사용할 수 있다.

배양과정 중 배양액에 폴리 감마-글루타메이트(poly gamma-glutamate)를 첨가하면 IFN-γ, IL-1β, TNF-α의 분비가 증가하고 동물세포 부유배양에서 전단력을 감소시킬 수 있다(대한민국 특허등록 제10-1131867호 참고).

상기 배양기로는 교반배양에 통상적으로 사용되는 배양기를 사용할 수 있으며, 웨이빙 진탕기(Waving Shaker)를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

상기 배양기로 종래의 일반적인 원형 배양기를 사용할 경우 원형은 진탕배양 시 배양액의 유동에 의해 발생하는 전단응력을 가장 균등하게 하고 최소로 갖는 형태이기는 하나, 원의 중심 쪽으로 갈수록 유속이 감소하여 세포가 모이는 현상이 발생한다. 배양기로 가운데 부분이 없는 도넛형태의 배양기를 사용하면 이러한 문제점을 해결할 수 있다.

본 발명에서는 바람직하게는 배양기로 도넛형태의 배양기를 사용하며, 도넛형태의 배양기는 더욱 바람직하게는 도넛형태의 세포배양백이다. 도넛형태의 세포배양백은 원형에서 가운데 부분을 제거한 도넛형태의 관형 세포배양백이다. 이 모양은 전체적으로 혈관을 가장 간단하게 표현한 형태로서 도넛형태의 세포배양백에서 진탕배양을 진행하였을 때 세포배양환경을 최적으로 제어할 수 있다. 도넛형태를 지닌 가스치환식 세포배양백(gas-exchangeable cell culture bag)은 5㎖의 적은 부피에서부터 1ℓ 이상의 부피까지 스케일업(scale-up) 세포배양이 가능하다.

도 12는 본 발명에서 사용하는 도넛형태의 세포 배양백(10)의 바람직한 실시예이다. 도넛형태의 안쪽으로 배지, 양분, 자극제 등 세포배양에 필요한 여러 물질을 주입할 수 있는 주입 튜브(11)를 둘 수 있고, 도넛형태의 바깥쪽에 배양 종료 후 세포를 회수할 수 있는 배출 튜브(12)를 둘 수 있다.

상기 도넛형태의 세포 배양기는 바람직하게는 세포 배양기를 거치할 수 있는 거치대를 포함한다. 도 13은 세포배양백 거치대(20)의 일 실시예이다. 가운데가 오목하게 파인 원반형 거치대로, 가운데 부분에 돌출부(21)가 있어 이 부분에 도넛형태 세포배양백의 가운데 홀 부분을 끼움으로써 진탕 시에도 배양백의 이동을 막고 안정적인 거치상태를 유지할 수 있다. 이렇게 거치대는 세포배양백을 일정한 위치에 고정해주고, 웨이브 진탕(wave shaking) 배양시 최소한의 전단응력을 형성하고 기울기에 따른 세포 배양백 내의 배양액 환경을 바닥과 거의 수평으로 유지할 수 있도록 해주는 역할을 한다.

배양기는 적당하게 기울여서 진탕 배양하는 것이 세포증식을 위해 더 바람직하다. 기울기는 배양기의 종류, 형태에 따라 달라질 수 있는데, 일반적으로 바람직하게 배양기를 2~20°의 기울기(tilt angle)로 기울여 사용한다. 특히, 일반적인 T-플라스크를 사용할 때는 2~4°의 기울기(tilt angle)로 설정하여 사용하는 것이 바람직하며, 3°의 기울기가 보다 바람직하였다. 또, 세포배양백과 같은 형태의 배양기에서는 더 큰 기울기까지 바람직한데, 특히 도넛형태의 위와 같은 세포배양백을 사용하거나 또는 거치대와 함께 적용할 경우 3~20°의 기울기가 바람직하다.

이하 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 이들 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1>

본 실험의 혈액시료는 2명의 건강한 공여자로부터 공급받았다.

먼저, 사람의 말초혈액을 헤파린 처리된 10㎖의 진공채혈관(BD Vacutainer TM)을 이용하여 30~60㎖ 채혈하였다.

50㎖ 림프구 분리튜브(Leuco sep, Greiner Bio-One, Swiss)에 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus; endotoxin tested, 밀도 1.077g/㎖, GE Healthcare, USA) 15㎖를 넣고 200×g에서 원심분리하여 용액을 튜브 내의 유리막(glass membrane) 아래로 침강되게 하였다.

채혈한 혈액을 튜브에 옮기고 1,400×g에서 원심분리하여 적혈구와 과립구층은 아래로, 단핵구층과 혈소판 등은 위로 나뉘게 하여 혈액성분을 분리하였다.

원심분리를 한 후 분리된 상층의 혈장을 56℃ 수조에서 30분 동안 불활성화시켰다. 불활성화시킨 혈장은 1400×g에서 원심분리하여 림프구가 포함된 상층액을 실험에 사용하였다.

원심분리를 한 후 분리된 림프구층은 멸균된 피펫을 이용하여 50㎖ 튜브에 모았다.

채취한 림프구가 들어있는 50㎖ 튜브에 인산염 완충용액(PBS) 30㎖를 추가하여 200~400×g에서 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

상층액이 제거된 림프구에 KBM-502 배지 10㎖를 넣어 현탁시켜 세포를 세정(washing)하였다.

혈구계산판(hemocytometer)을 사용하여 세포현탁액 내의 세포수를 측정하고 다시 원심분리하여 림프구만을 모았다.

준비된 림프구 중 2.0×10⁷개를 취하여, T25 플라스크(SPL Life Sciences)에 넣고 항체, 사이토카인, 폴리감마글루탐산과 자가혈장, L-glutamine을 포함하는 KBM-502 배지를 첨가하였다. 이 때 세포현탁액은 총 5㎖가 되게 하였다.

준비된 플라스크는 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 배양은 OHAUS 웨이빙 진탕기(Waving Shaker)를 이용하여 진탕하는 과정을 포함하며, 배양액이 흘러 넘치는 것과 너무 강한 전단응력이 발생하는 것을 피하기 위해 기울기는 3°로 설정하였다.

진탕은 10rpm, 15rpm, 20rpm 및 30rpm에서 진행하였다. 10rpm, 15rpm, 20rpm 및 30rpm에서 플라스크 속 현탁액은 각각 0.1076dyn/cm², 0.1976dyn/cm², 0.3042dyn/cm² 및 0.5589dyn/cm²의 전단응력을 받는다. 웨이빙 진탕기(Waving Shaker)를 통한 전단응력은 상기 수학식 1로 계산하였다.

2일 동안 배양한 T25 플라스크에서 세포를 꺼내어 모은 후 T75 플라스크로 옮기고 항체, 사이토카인, 폴리감마글루탐산과 자가혈장, L-glutamine을 포함하는 KBM-502 배지를 추가로 첨가하였다. 이 때 세포현탁액은 총 20㎖가 되게 하였다.

2일 동안 배양한 T75 플라스크에서 세포를 꺼내어 모은 후 T175 플라스크로 옮기고 항체, 사이토카인, 폴리감마글루탐산과 자가혈장, L-glutamine을 포함하는 KBM-502 배지를 추가로 첨가하였다. 이때 세포현탁액은 총 60㎖가 되게 하였다.

총 6일 동안 배양한 세포현탁액 20㎕를 취하여 트리판블루 60㎕와 섞은 후, 혈구계산판에 올려놓고 세포수를 측정하였다. 세포계수는 트리판블루(trypan blue) 염색법으로 C-칩(C-chip)에서 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1, 도 1 내지 9에 나타내었다.

도 1은 계대배양 시점별 세포수를 나타낸 그래프이고, 도 2는 최종 총 세포수를 나타낸 그래프이며. 표 1은 최종 총 세포수를 나타낸 것이다. 도 3은 총 세포 증식배수를 나타낸 것이고, 도 4는 각 계대배양 시점간 총 세포증식(cell expansion)을 비교한 그래프이다.

	총 세포수
0rpm	8.63 × 10⁷
10rpm	10.35 × 10⁷
15rpm	17.95 × 10⁷
20rpm	14.1 × 10⁷
30rpm	7.05 × 10⁷

도 1 내지 4의 결과에서와 같이, 진탕과정을 포함한 배양법이 림프구의 증식에 도움이 되었다. 최적의 세포증식환경은 기울기 3°, 회전수 15rpm(전단응력 0.1976dyn/cm²)이었다.

다양한 회전수에서 세포뭉침현상의 패턴을 확인하여 도 5 내지 9에 나타내었다.

도 5 내지 도 9는 각 회전수(rpm)에서 세포뭉침형태를 보여주는 사진으로 0일 배양을 개시한 때에는 모든 세포의 형태가 균일하게 퍼져 있는 형태를 보인다. 그러나 각각의 회전수에서 배양한 후에는 세포의 뭉침형태가 다른 것을 확인할 수 있다. 정치배양 상태에서는 세포가 매우 크게 뭉친 형태가 관찰되었으며, 회전수(전단응력)이 증가함에 따라 상대적으로 균등한 크기의 뭉침형태가 관찰되었다.

도 9에서 확인되는 바와 같이, 회전수 30rpm(전단응력 0.5589dyn/cm²)으로 배양하였을 때 T175 플라스크(총 부피 60㎖)에서의 배양은 큰 전단응력으로 인하여 심각한 세포손상이 야기되어 시료마다 차이가 있었지만 빠른 경우 배양시작 5일째부터 사멸한 세포의 뭉침현상(dead cell aggregation)이 관찰되었다.

<실험예 2>

본 발명에서와 같이 처음부터 진탕배양한 배양방법과 초기에는 정치배양한 후 진탕배양한 배양방법을 비교하였다.

기본 실험방법은 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하였다.

다만, 실험구는 0일차부터 6일 동안 계속 진탕배양하였고, 비교구는 T25 플라스크와 T75 플라스크에서 정치배양한 후 T175 플라스크로 옮겨준 배양 4일 차부터 진탕배양을 실시하였다.

배양 6일차 두 배양 조건에 따른 총 세포수를 트리판 블루 염색법으로 혈구계산판에서 측정하여 비교하였다.

실험구(진탕배양)와 비교구(정치배양 후 진탕배양)의 계대배양 시점별 총 세포수를 도 10에 나타내고, 최종 총 세포수를 도 11에 나타내었다.

도 10과 11의 결과에서, 실험구가 비교구에 비해 총 세포수가 약 35% 향상된 것을 확인할 수 있다.

10: 도넛형태의 세포 배양백
11: 주입 튜브
12: 배출 튜브
20: 거치대
21: 돌출부

Claims

혈액으로부터 면역세포를 분리하는 단계; 및
분리된 면역세포를, 배양하기 시작하는 배양초기부터 배양 전(全)기간에 걸쳐 하기 식으로 계산되는 0.5dyn/cm² 이하의 전단응력이 가해지도록 진탕 배양하는 단계를 포함하는, 면역세포의 진탕 배양 방법.

(a: orbit 반경, η: 배지 점도 계수, ρ: 배양액 밀도, f: 초당 회전수)
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 전단응력은 0.1~0.3dyn/cm²인 것을 특징으로 하는, 면역세포의 진탕 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 면역세포는 림프구인 것을 특징으로 하는, 면역세포의 진탕 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 배양은 2~20°의 기울기로 기울어진 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는, 면역세포의 진탕 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 배양은 가운데 부분이 없는 도넛형태의 배양기를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 면역세포의 진탕 배양 방법.