CN111826341A - 一种体外培养hek293细胞用于瞬时表达蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外培养HEK293用于瞬时表达蛋白的方法,包括如下步骤:S1:将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏,培养箱中孵育;S2:将细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养;S3:传代操作;S4:再次传代操作;S5:准备转染质粒;S6:获取包括细胞密度和存活率的数据并稀释细胞;S7:稀释质粒DNA;S8:稀释转染试剂;S9:将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中,将混合物在室温下孵育;S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞中摇动;S11:放入培养箱培养,收获HEK293细胞和表达产物。本发明可明显提高表达量,表达效率高,在更短的时间获得更多的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,更具体地说,尤其涉及一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法。
背景技术
HEK293细胞是抗体和重组蛋白表达的重要平台。根据表达的时间不同,可将基因产物表达分为瞬时表达与稳定表达。稳定表达是抗体药物生产系统的金标准,不过其过程耗费时间长,费用高,不利于大通量、高效率地筛选新的抗体药物。瞬时基因表达技术是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的载体上,不整合至染色体,较短时间内就可获得目的基因的表达产物,但随着细胞的分裂增殖,这种外源基因最终会消失,表达持续时间为几天到两周。此技术大大缩短了微量至中等量重组抗体的生产过程,从而为抗体药物的快速生产、早期筛选和功能、毒理分析提供有效的手段。
瞬时基因表达技术常用的宿主细胞有HEK293细胞、CHO细胞等,HEK293细胞具有生长速度快,易于转染等优点,在抗体药物的快速高效表达和功能分析时,具有很好的优势。因而HEK293的瞬时表达已成为生物制药企业常用技术平台之一。不过瞬时表达虽然具有快速、简便、易操作的特点,但是蛋白产量往往不太理想。目前,市场上缺乏一种利用无血清HEK293培养基用于体外培养高效瞬时表达蛋白的方法。另外,目前HEK293培养基市场为SIGMA、Invitrogen、Hyclone和Lonza等国际知名培养基占领,价格昂贵,每升高达上千元,不利于企业降低成本。故开发一种使用自主品牌且低成本的无血清无动物来源培养基进行HEK293高效瞬时表达的方法,对于抗体药物的产业化的意义是非常重大的。
发明内容
本发明提供了一种使用无血清HEK293培养基用于体外培养高效瞬时表达蛋白的方法。
为了解决现有技术的问题,本发明提供了如下技术方案:本发明的一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法,包括如下步骤:
S1:将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏,将HEK293细胞在37℃培养箱中孵育;
S2:当细胞活率≥95%且生长处于对数中期时,开始进行驯化程序;
S3:每2-3天进行一次传代操作,以保持HEK293细胞处于早期对数生长期,细胞接种密度为0.3~0.6×106细胞/mL;
S4:当细胞密度达到3~4×106细胞/mL且细胞活率≥95%,2~4天时,再次传代培养HEK293细胞;
S5:细胞密度达到约3~4×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒,转染前一天,将HEK293细胞按2~4×106细胞/mL细胞密度接种,并使HEK293细胞生长过夜;
S6:在第二天(转染当天),获取包括细胞密度和存活率的数据,进行转染的细胞活率应≥95%,使用新鲜的培养基将细胞稀释至2~4×106细胞/mL;
S7:稀释质粒DNA,通过旋转和/或翻转混匀;
S8:将转染试剂充分混匀,并用培养基稀释转染试剂,通过旋转和/或翻转来混合;
S9:将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中,旋转和/或颠倒或轻轻吹打2-3次进行混合,将混合物在室温下孵育约20分钟;
S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的HEK293细胞中,在添加过程中轻轻摇动;
S11:放回37℃培养箱中培养,在转染第二天(第1天),在瞬时表达过程中,维持葡萄糖浓度在4g/L以上,当细胞活率低于60%时收获HEK293细胞和表达产物。
可选择地,在步骤(S1)中,在日常传代中,直接将细胞接种到该无血清HEK293培养基中进行培养。
优选地,所述转染试剂是PEI。应该理解,本发明可以使用任何合适的转染试剂,而不限于PEI。
进一步地,在步骤(S1)中,所述的HEK293细胞的细胞数量为细胞数量>1×107。
进一步地,在步骤(S1)中,所述的培养箱中的转速为125±5rpm,培养箱中CO2浓度设置为8%。
更进一步地,在步骤(S7)和步骤(S8)中,按照DNA:1~2mg/L;PEI:2~4mg/L的转染体系转染质粒和PEI。
进一步地,在步骤(S11)中,在转染后16-22小时向摇瓶中添加5%(v/v)293-ProFeed,在添加过程中轻轻晃动摇瓶,将摇瓶放回37℃培养箱。进一步地,前述方法中的蛋白为抗体。
优选地,所述抗体为CD20单抗,PD-1单抗;所述重组蛋白重组人凝血因子VIII,以及任何其他适用于本发明方法的抗体。
可选地,根据实际应用,步骤S1-S11的顺序可以变化,这在本领域技术人员的能力范围之内,没有超出本发明的范围。
优选地,前述方法所用的培养基为HEK293无血清培养基,所述的HEK293无血清培养基组分组成如实施例1-3中的任一项所述。
有益效果:本发明可明显提高表达量,表达效率高,可以在更短的时间内获得更多的蛋白,进而显著提高抗体药物样品生产、早期筛选和功能、毒理分析的效率,加速药物研发进程。另外,本发明操作简便,相关试剂容易采购,可行性好。
与现有技术相比,具有如下优点:本发明提供的一种体外培养HEK293用于瞬时表达蛋白的方法,与使用国际知名品牌F的培养方法相比,本发明可明显提高蛋白表达量,可以在更短的时间获得更多的蛋白,更有利于抗体快速生产的产业化应用。
附图说明
图1为本发明的实施例1与比较例1的目的蛋白滴度的示意图。
图2为本发明的实施例2与比较例2的目的蛋白滴度的示意图。
图3为本发明的实施例3与比较例3的目的蛋白滴度的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除了指出来源之外,本发明其他所用的试剂、耗材、仪器或设备均为本领域常规使用的试剂、耗材、仪器或设备,能够通过商业途径购买到或实验室制备得到。
本发明方法的主要步骤如下:
S1:将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏,孵育;
S2:将细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养;
S3:传代操作;
S4:再次传代操作;
S5:准备转染质粒;
S6:获取包括细胞密度和存活率的数据,稀释HEK293细胞;
S7:稀释质粒DNA;
S8:混合并稀释转染试剂;
S9:将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中,孵育;
S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞中摇动;
S11:放入培养箱培养,收获HEK293细胞和表达产物。
实施例1
本发明的一种体外培养HEK293用于瞬时表达蛋白CD20单抗的方法,包括如下步骤:
S1:取同一批次冻存的Expi293细胞(原始Expi293细胞从Gibco购得,细胞数量2.0×107)在原始培养基CD 293里复苏。将细胞在37℃培养箱中(120rpm,8%CO2)孵育准备转染并表达目的蛋白CD20单抗。
S2:当细胞活率≥95%且生长处于对数中期时,才开始进行驯化程序。在日常传代中,直接将细胞接种到HEK293培养基中进行培养。
S3:每2-3天进行一次传代操作,以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.3~0.6×106细胞/mL。
S4:当细胞密度达到3~4×106细胞/mL且细胞活率≥95%(2~4天)时,再次传代培养细胞。
S5:细胞密度达到约3~4×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒。转染前一天,将细胞按3×106细胞/mL细胞密度接种,并使细胞生长过夜。
S6:在第二天(转染当天),获取包括细胞密度和存活率的数据。进行转染的细胞活率应≥95%。使用新鲜的培养基将细胞稀释至3×106细胞/mL。在接下来的步骤S7到S8,按照DNA:1.5mg/L。PEI(转染试剂):3mg/L的转染体系准备转染质粒和PEI。
S7:用培养基稀释质粒DNA。通过旋转和/或翻转试管混匀。
S8:将含有PEI的试管轻轻翻转4-5次以充分混匀。并用培养基稀释PEI。通过旋转和/或翻转试管来混合。
S9:将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2-3次进行混合。将混合物在室温下孵育约20分钟。
S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞摇瓶中,在添加过程中轻轻摇动摇瓶。
S11:将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天),在转染后16-22小时向摇瓶中添加5%(v/v)293-ProFeed(来自奥浦迈,下同),在添加过程中轻轻晃动摇瓶。将摇瓶放回37℃培养箱。在瞬时表达过程中,维持葡萄糖浓度在4g/L以上。当细胞活率低于60%时收获细胞和表达产物,检测细胞培养液中蛋白浓度。
实施例1中的HEK293细胞无血清培养基配方如表1所示:
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于:实施例2与实施例1的操作步骤相同,区别在于实施例2转染并表达的蛋白为VEGF单抗,HEK293细胞无血清培养基配方如表2所示:
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于:实施例3与实施例1的操作步骤相同,实施例3转染并表达的蛋白为TNF-α单抗。
HEK293细胞无血清培养基配方如表3所示:
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于:培养表达过程中一些参数的变化,例如接种密度、传代间隔、孵育时间等。
本发明的一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法,包括如下步骤:
S3:每3天进行一次传代操作,以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.3×106细胞/mL。
S4:当细胞密度达到4×106细胞/mL且细胞活率≥95%(2~4天)时,再次传代培养细胞。
S5:细胞密度达到约3.5×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒。转染前一天,将细胞按3×106细胞/mL细胞密度接种,并使细胞生长过夜。
S8:将PEI管轻轻翻转4次以充分混匀。并用培养基稀释PEI。通过旋转和/或翻转试管来混合。
S9:将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2.5次进行混合。将混合物在室温下孵育约20分钟。
S11:将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天),在转染后22小时向摇瓶中添加5%(v/v)293-ProFeed,在添加过程中轻轻晃动摇瓶。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于:培养表达过程中一些参数的变化,例如接种密度、传代间隔、孵育时间等。
本发明的一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法,包括如下步骤:
S3:每2天进行一次传代操作,以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.6×106细胞/mL。
S4:当细胞密度达到3×106细胞/mL且细胞活率≥95%(2~4天)时,再次传代培养细胞。
S5:细胞密度达到约3×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒。转染前一天,将细胞按3×106细胞/mL细胞密度接种,并使细胞生长过夜。
S8:将PEI管轻轻翻转5次以充分混匀。并用培养基稀释PEI。通过旋转和/或翻转试管来混合。
S9:将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打3次进行混合。将混合物在室温下孵育约20分钟。
S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞摇瓶中,在添加过程中轻轻摇动摇瓶。
S11:将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天),在转染后16小时向摇瓶中添加5%(v/v)293-ProFeed,在添加过程中轻轻晃动摇瓶。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于:培养及表达过程中一些参数的变化,例如接种密度、传代间隔、孵育时间等。
本发明的一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法,包括如下步骤:
S2:当细胞活率≥95%且生长处于对数中期时,才开始进行驯化程序。在日常传代中,直接将细胞接种到HEK293培养基中进行培养。
S3:每2.5天进行一次传代操作,以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.5×106细胞/mL。
S4:当细胞密度达到3.5×106细胞/mL且细胞活率≥95%(2~4天)时,再次传代培养细胞。
S5:细胞密度达到约4×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒。转染前一天,将细胞按3×106细胞/mL细胞密度接种,并使细胞生长过夜。
S7:用培养基稀释质粒DNA。通过旋转和/或翻转试管混匀。
S8:将PEI管轻轻翻转4.5次以充分混匀。并用培养基稀释PEI。通过旋转和/或翻转试管来混合。
S9:将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2次进行混合。将混合物在室温下孵育约20分钟。
S11:将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天),在转染后20小时向摇瓶中添加5%(v/v)293-ProFeed,在添加过程中轻轻晃动摇瓶。
比较例1
S1:取一管Expi293细胞(与实施例1所用Expi293细胞同一批次冻存,细胞数量2.0×107)在原始培养基(CD 293)里复苏。将细胞在37℃培养箱中(120rpm,8%CO2)孵育,准备分别转染并表达目的蛋白CD20单抗(目的蛋白同实施例1)。
S2:在日常传代中,直接将细胞接种到293基础培养基CD 293中进行培养。
S3:每2-3天进行一次传代操作,以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.3~0.6×106细胞/mL。
S4:当细胞密度达到3~4×106细胞/mL且细胞活率≥95%(2~4天)时,再次传代培养细胞。
S5:细胞密度达到约3~4×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒。转染前一天,将细胞按2~4×106细胞/mL细胞密度接种,并使细胞生长过夜。
S6:在第二天(转染当天),获取包括细胞密度和存活率的数据。进行转染的细胞活率应≥95%。使用新鲜的CD 293将细胞稀释至3×106细胞/mL。在接下来的步骤S7到S8,按照DNA:1.5mg/L。PEI:3mg/L的转染体系准备转染质粒和PEI。
S7:用CD 293培养基稀释质粒DNA。通过旋转和/或翻转试管混匀。
S8:将PEI管轻轻翻转4-5次以充分混匀。并用CD 293培养基稀释PEI。通过旋转和/或翻转试管来混合。
将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2-3次进行混合。将混合物在室温下孵育约20分钟。
将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞摇瓶中,在添加过程中轻轻摇动摇瓶。
将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天),在转染后16-22小时向摇瓶中添加5%(v/v)CD 293Feed(国际知名品牌F的补料),在添加过程中轻轻晃动摇瓶。将摇瓶放回37℃培养箱。在瞬时表达过程中,维持葡萄糖浓度在4g/L以上。当细胞活率低于60%时收获细胞和表达产物,检测细胞培养液中目的蛋白浓度。
比较例2
比较例2与比较例1的区别在于:比较例2与比较例1的操作步骤相同,比较例2转染并表达的蛋白为VEGF单抗(目的蛋白同实施例2)。
比较例3
比较例3与比较例1的区别在于:比较例3与比较例1的操作步骤相同,比较例3转染并表达的蛋白为TNF-α单抗(目的蛋白同实施例3)。
实验结果:实施例与比较例收获蛋白滴度对比。
如图1至图3所示,实施例1中收获的CD20单抗滴度为1167mg/L,实施例2中VEGF单抗滴度为1059mg/L,实施例3中TNF-α单抗滴度为402mg/L。比较例1中收获的CD20单抗滴度为829mg/L,VEGF单抗滴度为549mg/L,TNF-α单抗滴度为130mg/L。实施例可使CD20单抗、VEGF单抗和TNF-α单抗的表达相比较对应的比较例分别增加40.77%、92.90%和209.23%。实施例1~3中OPM 293培养系统可用于实现三种重组单抗的高水平表达。同样的,实施例4-6也实现了蛋白的高水平表达。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述试验例的限制,上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于包括如下步骤:
S1:将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏,将HEK293细胞在37℃培养箱中孵育;
S2:当HEK293细胞活率≥95%且生长处于对数中期时,开始进行驯化;
S3:每2-3天进行一次传代操作,以保持HEK293细胞处于早期对数生长期,细胞接种密度为0.3~0.6×106细胞/mL;
S4:当细胞密度达到3~4×106细胞/mL且细胞活率≥95%,2~4天时,再次传代培养HEK293细胞;
S5:细胞密度达到约3~4×106个活细胞/mL,活率≥95%时,准备转染质粒,转染前一天,将HEK293细胞按2~4×106细胞/mL的细胞密度接种,并使HEK293细胞生长过夜;
S6:在第二天,即转染当天,获取包括细胞密度和存活率的数据,进行转染的HEK293细胞活率应≥95%,使用新鲜的培养基将HEK293细胞稀释至2~4×106细胞/mL;
S7:稀释质粒DNA,通过旋转和/或翻转混匀;
S8:将转染试剂充分混匀,并用培养基稀释转染试剂;
S9:将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中,旋转和/或颠倒或轻轻吹打2-3次进行混合,将混合物在室温下孵育约20分钟;
S10:将混合物缓慢添加至步骤S6的HEK293细胞中,在添加过程中轻轻摇动;
S11:放回37℃培养箱中培养,在转染第二天,在瞬时表达过程中,维持葡萄糖浓度在4g/L以上,当细胞活率低于60%时收获HEK293细胞和表达产物。
2.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:在步骤S1中,所述的HEK293细胞的细胞数量为细胞数量>1×107。
3.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:在步骤S1中,所述的培养箱中的转速为125±5rpm,培养箱中CO2浓度设置为8%。
4.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:在步骤S7和步骤S8中,按照DNA:1~2mg/L;转染试剂:2~4mg/L的转染体系转染质粒和转染试剂。
5.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:在步骤S11中,在转染后16-22小时向HEK293细胞添加补料,在添加过程中轻轻晃动HEK293细胞,放回37℃培养箱。
7.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:在日常传代中,直接将HEK293细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养。
8.根据权利要求1-6任一项所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:所述蛋白为抗体。
9.根据权利要求6所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:所述抗体为CD20单抗、PD-1单抗;所述重组蛋白重组人凝血因子VIII。
10.根据权利要求6所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法,其特征在于:步骤S1-S11的顺序可以变化。
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