JPH07504331A - 造血幹細胞の培養およびその遺伝子工学 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、請求の範囲１７記載のヒト造血幹細胞から遺伝されたヒト造血細胞。

明細書 造血幹細胞の培養およびその遺伝子工学緒言 技術分野 本発明の技術分野は、ヒト造血幹細胞の拡大およびその遺伝子修飾に関する。

背景 ヒト造血幹細胞組成物は、入手し易くなると、医薬として用いる機会が極めて多 くなる。造血幹細胞は、リンパ球および骨髄単球の細胞系統を含む白血球、赤血 球ならびに例えば破骨細胞のような他の種類の細胞を含むすべての血球の祖先で ある。さらに造血幹細胞は間質細胞にもなることができる。これらの細胞は極め て広範囲の機能を提供する。これらの細胞は、宿主の寿命期間中生存するように 自己再生することができないと考えられている。造血幹細胞は、宿主の寿命期間 中、自己再生しかつその多分化能潜在性を維持する唯一の細胞と考えられている 。それ故に、造血幹細胞の役割、その再生する方式および種々の細胞系統を産生 ずるようプログラムされている方式が分かると、広範囲の疾患の治療法に用いる 機会が与えられる。

実質的に均質なヒト幹細胞組成物を得ることができると、骨髄移植の新しい方法 が与えられる。造血幹細胞は悪性ではないということを示唆する証拠があるので 、摘出することによって、癌または他の悪性腫瘍を放射線または化学療法で治療 した後、宿主に悪性細胞が復活するのを回避することができる。造血幹細胞は、 その修飾物が宿主の寿命期間中生存する場合、遺伝子治療への切符が与えられる 。その上、誘導プロモーターを適正に使うことによって、各種タンパク質産物の 発現を、選択されたレベルの分化でもしくは選択された細胞系統で、または特定 の化学的標識、例えば化学誘引剤、特にリガンドなどに応答して達成することが できる。造血幹細胞が特定の細胞系統に誘導される方式が充分に分かると、特定 の細胞系統、例えば骨髄巨核細胞、Ｔ細胞のサブユニットおよび単球などの集団 を培養で産生させる機会がある。

造血幹細胞を使用する本発明の重要な態様は、培養で造血幹細胞を拡大する性能 である。造血幹細胞の増殖は他の細胞の増殖とは異なっている。というのは造血 幹細胞を拡大するためには、再生を行わねばならないだけでなく分化による造血 幹細胞の損失を抑制しなければならないからである。分化に対して再生が、骨髄 内で調節される方式は分かっていない。それ故に造血幹細胞の培養物を長期間維 持しかつ拡大させることができる方法が必要である。

また造血幹細胞を遺伝子工学的に処理することができるということは今まで示さ れていない。造血幹細胞はその独得の特性によって、従来遺伝子工学的に処理す ることに成功してきた他の細胞と異なっている。しかし子孫細胞を遺伝子工学的 に処理しようとすると、子孫細胞中に導入された構造の機能発現および間欠的発 現などの伝達が欠除していることが多い。それ故に上記構造の組込みが成功した ことを実証した場合でも、続いてその子孫細胞を増殖させ分化させると該構造が 機能しなくなる例がある。

関連する文献 米国特許第５．０６１．６２０号には、実質的に均一なヒト造血幹細胞組成物お よびこの組成物を得る方法が記載されている（この特許に引用されている文献も 参照のこと）。間質細胞関連の造血については、Ｐａｕｌら、Ｂｌｏｏｄ、　７ ７巻、１７２３〜１７３３頁、１９９１年に記載されている。

マウス白血病阻害因子が、造血前駆細胞のレトロウィルスベクター感染効率を増 大することは、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、　７６巻、１０９８〜１１０ ３頁、１９９０年に教示されている。Ｍｅｔｃａｌｆら、Ｂｌｏｏｄ、　７６巻 、５０〜５６頁、１９９０年には、マウスの造血組織および他の組織に白血病阻 害因子を注射した場合の作用が報告されている。多能性ヒト造血幹細胞に対する 白血病阻害因子の生体外での作用は、ＶｅｒｆａｉｌｌｉｅおよびＭｃＧｌａｒ ｅ、　Ｂｌｏｏｄ、　７７巻、２６３〜２７０頁、１９９１年に記載されている 。

Ｄｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ、　７８巻、６２４〜６３４頁、１９９１年には、生体 外と生体内の検定法を用いる、正常なヒト造血細胞への遺伝子転移について報告 されている。造血に対する白血病阻害因子の作用は、Ｍｅｔｃａｌｆ。

Ｐｈ１１．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、、　８３２７巻、９９〜１０９ 頁、１９９０年およびＬｅａｒｙら、　Ｂｌｏｏｄ、　７５巻、１９６０〜１９ ６４頁、１９９０年に記載されている。

白血病阻害因子（ＬＩＦ）の総説は、Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｉｎｔｌ、Ｊ、Ｃｅ１ ｌ　Ｃ１ｏｎ、。

９巻、９５〜１０８頁、１９９１年に見られる。胚子幹細胞に対するＬＩＦの作 用については、Ｎ１ｃｈｏｌｓら、Ｄｅｖ、、　１１０巻、１３４１〜１３４８ 頁、１９９０年ＨＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３６巻、６８４〜６ ８７頁、１９８８年：およびＳｍ１ｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３６巻、６８８ 〜６９０頁、１９８８年に記載されている。

発明の要約 ヒト造血幹細胞が培養によって生存しかつ拡大することができる条件下で、白血 病阻害因子（ＬＩＦ）を用いることによって、培養によってヒト造血幹細胞を維 持し増殖する方法と組成物を提供する。ＬＩＰは、適切な培養培地中で、ＬＩＦ 単独かまたは加えた他の造血細胞因子と組合わせて使用できる。実質的に均質な ヒト造血幹細胞組成物は、適切なりＮＡ構造体を、該幹細胞に導入し組込むのに 用いて遺伝子が修飾される。幹細胞の遺伝子の修飾は、組込まれた遺伝子の発現 が長期間維持されていることがリンパ球および骨髄単球の両者の多数の造血細胞 系統に示される検定法で実証される。

特定の実施態様の説明 実質的に均質なヒト造血幹細胞（以後“ｈＨＳＣ”と呼ぶ）は、白血病阻害因子 （“ＬＩＦ”　）を加えかつ任意に追加の造血因子を加えてなる適切な培地中で 、その他の点では通常の条件下で、長期間培養で維持されかつ数量が増大される 。ｈＨＳＣは、多系統細胞の子孫に絶えず分化する性能で実証されるように培養 で長期間維持することができる。

ｈＨＳＣは、実質的に均一な幹細胞組成物を用い、重要なりＮＡ配列を提供する ＤＮＡ構造体で遺伝子を修飾することができる。特に、ＤＮＡ構造体をｈＨＳＣ 宿主に導入するのにレトロウィルスのベクターが用いられる。得られた細胞は、 未修飾ｈ）Ｉｓｃ用に記載されている条件下で増殖させることができ、その結果 修飾されたｈＨＳＣは拡大し各種の用途に用いることができる。

使用されるｈ）ＩＳＣは、新鮮なものか、凍結されたものかまたは予め培養され たものである。ｈＨｓｃは胎児、新生児、成人の肝臓、骨髄、血液または他の通 常の起源から得ることができる。該幹細胞を他の細胞から分離する方法は、造血 細胞系統または他の細胞系統にかかわらず本発明にとって重要でない。これらの 細胞は米国特許第５、０６１．６２０号に記載されているのと同様にして分離す るのが便利である。この文献に記載されているように、ｈＨＳＣの実質的に均質 な組成物は、分化された細胞に関連するマーカーを含有しないが幹細胞に関連す るエピトープの特性を示す細胞を選択して単離することによって得ることができ る。この幹細胞は、抗体によって識別される特異的なエピトープ部位に関連する マーカーが存在し、かつある種の抗体が結合しないことによって識別されるある 種のマーカーがないことが特徴である。特異的なマーカーがｈＨＳＣに対して識 別されるときに、このようなマーカーに抗体が結合して所望の組成物が得られる 。

分化された細胞の多くの部分は、最初に比較的粗い分離法を用いることによって 取除くことができ、そのとき、リンパ球系統および骨髄単球系統のような造血系 の主要集団細胞系統は、巨核球のマスト細胞、好酸球および好塩基性細胞のよう な副集団とともに取出される。通常、造血細胞の少なくとも約７０〜９０％が取 り出される。所望により、ｆ　ｉｃｏ　ｌ　１−ｈｙｐａｑｕｅ分離法を利用す ることにより、前分離を採用して赤血球を除いてもよい。

粗い分離（ｇｒｏｓｓ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、磁気ビーズ、細胞傷害剤、 アフィニティークロマトグラフィーまたはパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）などを用 いて達成することができる。使用される抗体としては、ＣＤ３４の抗体、クラス Ｉｔ　）ＩＬＡ、またはたとえ全部ではな（でも大部分の成熟細胞がｈＨｓｃに は存在しないように除去できる他のマーカーがある。

粗い分離によって正の選択が行われるが、その分離と同時にまたは続いて負の選 択が行われ、この場合、デディケーテッド細胞（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ　ｃｅｌｌ ）に存在する特定マーカーに対する抗体が使用される。これらのマーカーは大部 分がＣＤ３−　、　ＣＤ７−　、　ＣＤ８−　、　ＣＤｌ０−。

ＣＤ１４−　、　ＣＤ１５−　、　ＣＤ１９−　、　ＣＤ２０−　、　ＣＤ３３ −を含有し、好ましくは少なくともＣＤ３−　、　ＣＤ８−　、　ＣＤｌ０−　 、　ＣＤ１９−　、　ＣＤ２０−　、　ＣＤ３３−を含有し、通常は少なくとも ＣＤｌ０−　、　ＣＤ１９−　、　ＣＤ３３−を含有している。次にデディケー テッド細胞が実質的に減損している造血細胞組成物をさらに’ｒｈｙ−ｔに対す るマーカーを使って分離し、その結果、実質的に均一な幹細胞集団が得られる。

この幹細胞集団の例は、ＣＤ３４”Ｔｈｙ−１”である集団であり、これは実質 的に均一な幹細胞組成物に近い。

本発明のｈＨＳＣ組成物は、長期間にわたる培養で維持することができ、選択し て二次培養およびさらに高次の培養にて移行させることができ、かつ各種のリン パ球と骨髄単球の細胞系統、特にＢリンパ球とＴリンパ球、単球、マクロファー ジ、好中球および赤血球などに分化できることが特徴である。

多分化能性ヒト幹細胞は次のように定義される。（１）子孫をすべて限定された 血液リンパ球細胞系統を生じ；および（２）限られた数の細胞が、すべての血液 細胞型および多分化能性造血幹細胞を含むそれらの祖先の非常に易感染性のヒト の宿主を、細胞再生で充分再構成できると定義される。

ｈＨＳＣは適切な栄養培地で培養して増殖させる。そしてその培地は、ならし培 地、適切な間質細胞系とのコカルチャー（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）、または造血 細胞の増殖を維持するのに充分な増殖因子を合成で組合わせたものを含有する培 地でもよい。

ならし培地またはコカルチャーの場合は、各種の間質細胞系を使用することがで きる。というのはヒト間質細胞系は要求されないことが分かっているからである 。したがってげっ歯動物の特にマウスのような他の間質細胞系を使用できる。い くつものマウス間質細胞系がＷｈｉｔｌｏｃｋら、Ｃｅ１１．４８巻、１００９ 〜１０２１頁、１９８７年に記載されており、そしてＡＣ６，２１がＡＴＣＣに 　として寄託されている。

所望によりその外の間質細胞系を増殖させることができる。

細胞を増殖させ維持することができる、コカルチャー用の各種の装置がある。し たがって、交差系剤（ｃｒｏｓｓｅｄ　ｔｈｒｅａｄｓ）　、膜、制御された培 地の流量などを利用する装置が、廃棄物を除去しかつ細胞増殖に関連する各種の 因子を再貯留して、細胞を増殖させるのに使用される。

組織培養のプレートまたはフラスコを利用するのが便利である。

この場合、間質細胞の集密層を、継代させずに、但し組織培養培地をは′１′５ 〜７日毎に取替えて、長期間維持することができる。

ｈＨＳＣは、それを間質細胞系上に、直接にもしくは多孔性膜によって分離して 置くことによってコカルチャーで増殖させることができ、る。例えば３Ｘ１０’ 〜３ＸＩＱ’細胞／１ｌｌｌを間質細胞集密層上に置く。

コカルチャーに用いられる培地はＲＰＭＩ−１６４０，１ＭＤＭなどのような便 利な増殖培地であり、個々にあるいは組合わせて用いられ、また細菌の増殖を防 止するために適切な抗生物質が用いられかつ他の添加剤例えばピルベート（０， １〜５　ｍＭ）　、グルタミン（０，５〜５　ｍＭ）　、２−メルカプトエタノ ール（１−１０Ｘ　１０−’Ｍ）および約５〜１５％好ましくは約ｌθ％の血清 例えばウシ胎児血清が用いられる。

これらの他の添加剤に加えて、ＬＩＦを、約１　ｎｇ／ａ１１〜１１００ｎ／ｍ ｌより一般的に５ｎｇ／ｍ１〜３０ｎｇ／ｍｌ添加する。またその外の因子、例 えばインターロイキン類、コロニー刺激因子類またはスチール因子などを含有さ せてもよい。ＬＩＦに加えて特に重要なのはＩＬ−３，ルー６およびＧＭ−Ｃ３ Ｆである。

これらの利用される因子は、天然産または合成の例えば組換え法で製造されるも のでもよ（、およびヒトもしくは他の種例えばマウスの因子でもよいがヒトの因 子が好ましい。

上記能の因子の量は一般に約１ｎｇ／ａ＋１〜１１００ｎ／ａ＋１の範囲内にあ る。一般に、【Ｌ−３の場合、濃度は、約５　ｎｇ／　ａｌｌ　〜５０ｎｇ／　 ａｌｌの範囲内にありより一般的に５　ｎｇ／ａｌｌ　〜ｌＯＱｎｇ／ｍｌであ り；ＩＬ−６の場合、濃度は約５　ｎｇ／ｍｌ　〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内にあ り、より一般的に５　ｎｇ／ｍｌ　〜２０μｇ／ｍｌであり；およびＧＭ−ＣＳ Ｆの場合、濃度は一般に５　ｎｇ／ｍｌ　〜５０ｎｇ／　ｍｌであり、より一般 的には５　ｎｇ／ｍｌ　〜２０ｎｇ／ｍｌである。

ＬＩＰなどの因子は、幹細胞の増殖と拡大の初期の過程の期間にのみ存在し、通 常少なくとも２４時間、より一般的には少なくとも約４８時間存在することがで き、または拡大の過程中維持され得る。したがって、ｈＨＳＣを最初増殖培地に 暴露することによって、拡大の全過程中、濃度を維持しなくても、有意な効果が 得られることが見出された。

遺伝子修飾の場合、細胞は所望の集団レベルに到達するのに充分な時間増殖させ る。通常少なくともｌＸｌ０’のｈＨｓｃ細胞が存在し、好ましくはｌＸｌ０’ の細胞である。ＬＩＦは少なくとも最初に培地中に、通常少なくとも１２時間よ り一般的に少なくとも２４時間存在し、そのときしＩＦと他の増殖因子への暴露 は実質的に終る。ＬＩＦと任意に他の成長因子は細胞の増殖の過程の期間中維持 される。細胞は上記因子を含有する培地中で少なくとも１２時間、通常は２４時 間増殖させた後に、ＤＮＡ構造体と接触させる。ｈｏｓｃの遺伝子修飾を行う場 合、通常レトロウィルスのベクターを使用する。

遺伝子修飾を行うのに各種のレトロウィルスベクターを用いることができる。通 常レトロウィルスと適切なパッケージング系（ｐａｃｋａｇｉｎｇｌｉｎｅ）の 組合わせが用いられ、このときそのキャプシドタンパク質がヒト細胞に感染する 機能を有している。各種の両種性ウィルス産生細胞系は公知であり、例えばＰＡ １２　（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　。

５巻、　４３１〜４３７頁、１９８５年）　、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　。

６巻、２８９５〜２９０２頁、１９８６年）　、ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら、ＰＮ ＡＳ、　８５巻、６４６０〜６４６４頁、１９８８年）がある。通常、幹細胞と ウィルスは培養培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされる。次いで幹 細胞はその培養培地で少なくとも２週間増殖させ、そして、５週間以上増殖させ てから分析する。

利用されるＤＮＡ構造体は通常マーカーを含有し、そのマーカーによって、該Ｄ ＮＡを組込まれた細胞を、該ＤＮＡ構造体を組込まれていない細胞に対して選択 することができる。各種のマーカーがあり、特に抗生物質耐性のマーカー例えば Ｇ４１８、ハイグロマイシンなどに対して耐性のマーカーがある。負の選択を用 いることができるが余り便利ではなく、この場合マーカーはＨＳＶ−ｔｋ遺伝子 であり、この遺伝子によって細胞はアシクロビルおよびガンシクロビルのような 試薬に対して敏感になる。

ＤＮＡ構造体は各種の従来法で製造することができる。所望の特徴、例えば長い 末端重複、マーカー遺伝子および制限部位を提供する多数のベクターが現在入手 できる。したがって、適切なプラスミド中にベクターを導入し、およびそのベク ターを、制限酵素処理、および適切な転写と翻訳の開始領域と終止領域を有する 所望の遺伝子の挿入によって操作し、次いでそのプラスミドを適切なパッケージ ング宿主に導入することができる。かくして、各操作において、上記プラスミド を適切な原核宿主内で増殖させてその構造体を分析して所望の構造体が得られた ことを確認し次いでその構造体をその後の操作に付すことができる。上記操作が 終ってから、プラスミドまたは切取られたウィルスをパフケージング宿主に導入 してパッケージし、次いで遺伝子修飾に用いるためウィルス粒子を単離する。

ＤＮＡの導入は次のような広範囲の目的に使用することができる。

例えば遺伝子療法、ｈＨＳＣへの新規な性能の導入、特定の細胞系統もしくはそ の系統のサブセットへの直接のデディケーション（ｄｅｄｉｃａｔｉｏｎ）また は特定の細胞系統またはサブセットへの成熟の促進などのために使用できる。造 血細胞はヒト宿主が機能するときに重要な役割を演じ、そしてそれらの細胞は広 範囲に存在しかつ多様な性能をもっているので、１Ｈｓｃには治療用途に対して 大きな可能性がある。

造血細胞に対して特異的な多くの遺伝病がある。例えば鎌状赤血球貧血、β−サ ラセミア、血小板減少症、血友病、複合型免疫不全症および大部分の白血病があ る。これらの疾病は、大部分が相同性組換え法によって治療することができ、こ の場合、欠陥遺伝子の少なくとも一つのコピーを修飾して野性型のすなわち機能 性の遺伝子にする。大ていの場合、両方のコピーを修正する必要はなく、通常、 治療処置を行うのに十分である一方のコピーを修正する。相同性組換え法につい ては文献に多数報告されている（例えばＬｌａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　 ３３６巻、３４８〜３５２頁、１９８８年およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら、 ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　５７巻、３２１０〜３２１４頁、１９９０年を参照のこと ）。

あるいはｈＨＳＣとその子孫を広範囲の産物を産生させるための担体として使用 することができ、このときは宿主に遺伝的に欠陥があるか、または続いて起こる 疾患（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅ）のために遺伝的に欠陥が生じて いる場合である。特定の天然産物が欠除していることが原因の遺伝病としては、 筋ジストロフィー（この場合シズトロフィンが欠除している）、のう脂性線維症 、アルツハイマー病、ゴーシュ病などがある。これらの例のなかで、Ｔ細胞受容 体、主要組織適合性遺伝子複合体、または免疫グロブリンサブユニットのような 多形タンパク質の特定の多形領域が特定の疾患例えば自己免疫疾患に対する感受 性に関与している場合、特定のエキソンを相同性組換え法で“ノックアウトして （ｋｎｏｃｋ　ｏｕｔ）”上記疾患に応答しない造血細胞が提供される。

糖尿病のように、細胞が自己免疫のために破壊された他の場合には、ｈＨＳＣは インシュリンの分泌に対する生理的要求に応答する細胞を提供するよう修飾され 、この場合、ランゲルハンス島での調節と類似の方法でインシュリン産生が調節 されるように適切なエンハンサ−とプロモーターを使用する。このようにして、 適切な造血細胞系統でインシュリン受容体の発現が行われる。

を約２５℃で４〜７日間培養して、その胎児胸腺のリンパ球集団を実また、多剤 耐性遺伝子例えばｐｇｐ−１は、細胞を細胞毒性薬剤に対して防護するために導 入してもよく、ウィルス感染に対して防護するためリボザイムを転写させてもよ く、またはウィルスの複製を阻害するため各種のタンパク質産物を細胞内で発現 させてもよい（例えばＨＩＶに対するｔａｔ遺伝子）。

また修飾された幹細胞は、老化、自己免疫疾患、造血障害またはウィルス感染症 の治療に用いることができる。

多くの場合、この治療では、幹細胞の骨髄または他の起源をヒトの宿主から取出 すことが行われ、その幹細胞をその起源から単離し、その取出された幹細胞を拡 大する。その間に宿主を処理して未変性の造血性能を実質的にまたは完全に除去 する。その幹細胞は、この期間中に、所望の遺伝子修飾物を含有する幹細胞が得 られるように修飾される。宿主の処理が完了した後、修飾された幹細胞は宿主に 戻されて新しい性能が提供される。必要に応じて、この工程は、先の幹細胞が実 質的になくなり、修飾された幹細胞が実質的な集団になっていることが保証され るまで繰返し行われる。

修飾された幹細胞が含有されていることを証明するのに各種の方法を用いること ができる。これらの細胞のゲノムを制限酵素処理し、増幅するかまた増幅せずに 用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応、ゲル電気泳動法、制限分析法、サ ザーン、ノーザンおよびウェスターンのプロット法が用いられ、配列決定法など すべて育利に用いられる。その上にこれらの細胞は、導入されたＤＮＡの性能を 適切に維持しながら、細胞が造血細胞系統まで確実に充分成熟できるよう各種の 条件下で増殖させることができる。幹細胞の多分化能性能が維持されていること を確認するため、生体外および生体内の各種の試験法が利用される。

Ｔ細胞への分化を実証するため、胎児の胸腺を摘出し、その胸腺４箇月間維持す ることができる。同様にヒト造血細胞の培養物はヒ質的に枯渇させる。次いで被 検細胞を上記胸腺組織中に顕微注射する。そのとき注射されるリンパ球集団のＨ ＬＡは、上記の胸腺細胞のＨＬＡと不適正に対合する。次に上記胸腺組織は、ヨ ーロッパ特許願第０３２２２４０号に記載されているのと同様にして、５ｃｉｄ ／５ｃｉｄマウスに移植する。このとき、胸腺は腎臓のうに移植するのが便利で ある。

赤血球の場合は、ＢＦＵ−Ｅユニットを同定する通常の方法を使用することがで き、例えばメチルセルロース培養法（Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅ５ｕｌｔｓ　１ｎＣａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１９７７年６１．　ドイツＳｐｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ 社発行１〜２２７頁のＭｅｔｃａｌｆの方法）があり、この方法によれば細胞が 赤血球細胞系統を発生できることが実証される。

骨髄細胞およびＢ細胞の性能を同定する場合には、被検集団をまずヒドロコルチ ゾンを含有する培地に導入し、次いでこの培地で６週間増殖させるのが便利であ る。使用される培地はＲＰＭＩ　１６４０とＩＭＤＭの５０　：　５０混合物か らなり、かつ１０％のＦＣＳ、　１０％のウマ血清、５０μｇ／ｍｌのストレプ トマイシン／ペニシリン、グルタミンおよび５　Ｘ　１０−’Ｍのヒドロコルチ ゾンを含有している。上記６週間の増殖期間中、前駆細胞がない場合は、成熟細 胞はすべて死ぬと予想される。６週間経過したときに骨髄細胞がまだみとめられ たならば、骨髄細胞に連続して分化する前駆細胞が存在していると結論すること ができる。

このとき、ヒドロコルチゾンを含有しないように培地を変えてＢ細胞の増殖を促 進することができる。３〜４週間待ってからＦＡＣ３分析法などの分析方法によ ってＢ細胞の存在を実証することによって、先に骨髄細胞を産生ずることができ た前駆細胞がＢ細胞も産生ずることができると結論できる。

ヒドロコルチゾンの存在下で増殖したヒト造血細胞は少なくとも１０コｌしＴツ ノが仔仕し１五−）臂せ’、：ｂ’！Ｖｌよ＼ζす９回月１町哨准ソ９ことがで き、この培養物はＢリンパ球と骨髄単球細胞を含有している。次いでその細胞培 養物を選別してｈＨＳＣを同定することができる。

本発明の幹細胞は、任意の生理学的に許容される媒体に入れて、通常、脈管内に 投与できるが、骨などの便利な部位にも導入することができ、その部位に本発明 の幹細胞は再生および分化を行うのに適切な部位を見つけることができる。通常 少なくともｌＸｌ０’個の細胞が投与されるが、ｌＸｌ０＠個以上投与するのが 好ましい。これらの細胞は注射またはカテーテルなどで注射することができる。

所望により、本発明の細胞を導入する目的によって、次のような因子類を含有し ていてもよい。例えば、ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−６およびＩＬ−１１ならび にその外のインターロイキン類のようなインターロイキン類、Ｇ−、Ｍ−および ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子；γ−インターフェロンのごときインタ ーフェロン類；エリトロポエチンなどがある。これら各種因子の量は、本発明の 細胞を投与する目的すなわち患者の特別な生理的要求によって決まり、通常、経 験によって決定される。

使用される幹細胞組成物は、一般に、５％より少ない細胞系統の免疫委任細胞を 有し、コカルチャー培地内で無細胞発生（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅｇｅｎｅｒａｔｉ ｏｎ）とリンパ球と骨髄単球の造血細胞系統のメンバーへの分化を行うことがで きる。これらの組成物は一般にヒトの造血性のＣＤ３４”　、　ＣＤｌ０−　、 　ＣＤ１９−　、　ＣＤ３３−および’ｒｈｙ−ｉ”であることを特徴とする細 胞を少なくとも８０％含有している。さらにこれら組成物は、ローダミンで染色 すると高ローダミンになるか、低ローダミンになるかまたはその組合わせになる 。上記細胞は高ローダミンの方が好ましい（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ、　Ｉｍａ＋ｕ ｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ、　３４４〜３５０頁、１９８９年参照）。

これらの細胞は液体窒素の温度で凍結して長期間貯蔵することができ、そして解 凍して再使用できる。これらの細胞は通常、１０％のＤＭＳＯ１５０％ＦＣ８お よび４０％ＲＰＭＩ　１６４０からなる培地中で貯蔵される。

これらの細胞は解凍されると、幹細胞の増殖と分化に関連する増殖因子および／ または間質細胞を使用することによって拡大させることができる。

下記の実施例は例示を目的として提供するものであり、本発明を限定するもので はない。

実験 Ｂｌｏｏｄ、　６８巻、１０３０頁、１９８６年）。モしてｉ’ｂｙ−ｔに対す る抗体はＦａｂｒｅから得た（ＤａｌｃｈａｎおよびＦａｂｒｅ、　Ｊ、Ｅｘｐ 、Ｍｅｄ、、　１４９巻、５７６頁、１９７９年）。ＣＤ３４に対する抗体は、 フルオレセイン、フィコエリトリンもしくはテキサス・レッド（Ｃａｌ　Ｔａｇ ）に接合された適切な抗１ｇを用いて検出するか、または磁気ビーズ（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＩＳ）　）に結合させ次いで磁気 によって分離した。’ｒｈｙ−１の抗体はフルオレセイン、フィコエリトリンま たはビオチンの接合体であり、そのビオチン接合体はテキサス・レッド−アビジ ン（Ｃａｌ　Ｔａｇ）で検Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ 、、　１０８巻、　１９７頁、１９８４年に記載されているように改変したＢｅ ｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳを使用した。上記のデュアルレーザー （ｄｕａｌ　１ａｓｅｔ）装置によれば４個の蛍光パラメーターと２個の光散乱 パラメーターを各被分析細胞について記録することができる。残留赤血球と死ん だ細胞および残渣は、光散乱ゲイティング（ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ 　ｇａｔｉｎｇ）およびプロビジウムヨージド（ｐｒｏｐｉｄｉｕａ＋　１ｏｄ ｉｄｅＸＰＩ）による染色か、または４色分析での散乱だけによって、分析から 除外した。フルオレセインとフィコエリトリン、およびフルオレセインとプロビ ジウムヨージドの空間オーバーラツプ（ｓｐａｔｉａｌ　ｏｖｅｒｌａｐ）に対 する補償は電子的に調節した。

細胞を分取する場合、染色された試料は、分取操作中を通じて４℃に維持した。

分取した液滴を１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中に集めた。

細胞集団をＦＡＣＳで単離し、続いてその試料をＨＢＳＳで１：ｌに希釈し、２ ００のｒｃｆで１０分間遠心分離し、次いで５０μｌもしくは１００μｍのＨＢ ＳＳ中に再懸濁させて、血球計数器で計数した。

培養検定は以下のようにして実施した。ＡＣ６，２１集密間質細胞層を、組織培 養培地を５〜７日毎に変えることによって継代なしで３〜４週間までの期間維持 した。継代を行うため、幹細胞の層を血清を含有しない培地で３回洗浄し、次に 血清なしの培地中の０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼージスパーゼ（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、米国インディアナ州、インディアナポリス所 在）２．５ｍＭ　（Ｔ−２５フラスコ）で該層を覆った。上記培養物を３７℃で １５〜３０分間インキュベートし、次いで上記の酵素含有培地中の細胞を、血清 を添加されたＲＰＭＩ　１６４０培地中に集めた。間質細胞を、パスツールピペ ットでピペッティングを行うことによって懸濁させ、もとの細胞濃度の１１５〜 １　／１５の濃度で直接培養した。一般に、１：１０で継代培養された集密間質 細胞層は５〜７日後に再び集密状態に到達した。サブクローンは希釈培養を３． ０〜０．３細胞／ウエルに制限することによって得た。

ヒト胎児骨髄の細胞懸濁液を、１６〜２０週間妊娠の胎児の長管から調製した。

これらの骨は縦方向に割り次に髄腔を小力の刃で掻爬する。これらの骨は次にコ ラゲナーゼージスパーゼをＲＰＭＩ　１６４０に溶解して調製した１ｍｇ／ｎ＋ Ｉ溶液中に入れた。この骨を３７°Ｃで３０分間インキュベートした後、髄腔を 培地（ｐｅｎ／５ｔｒｅｐ　、　２−ＭＥおよび５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ 　１６４０）でフラッシュして造血細胞を取出した。

あるいは骨髄はコラゲナーゼージスパーゼ処理なしで髄腔からフラッシュするこ とができる。

細胞懸濁液を、１６〜２０週間妊娠胎児の肝臓から調製する。肝臓を細断し次い でピペットで採取して細胞を放出する。その細胞懸濁液を、Ｆｉｃｏｌｌグラジ ェント上に置いて、肝細胞、赤血球および残渣を取り出す。次いで造血細胞を収 穫した。

成人骨髄は吸引液から得られ、この吸引液は、使用する前に処理して赤血球が除 去される。

バルク培養物（ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅ）は、マウスの間質細胞系の予め株化 させた集密層上にヒト細胞を置くことによって得ることができる。

１ｍＭ当り３　ＸＩＯ’　〜２　ＸＩＯ’個の細胞を、Ｔ−２５フラスコまたは ６ウエルプレート中の間質細胞上に置く。そのとき６ウエルプレートの各ウェル には３ｍＭを添加し、Ｔ−２５フラスコには５ｍｌ添加する。

５０Ｕ／ａ＋１のペニシリン１５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭの ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、５×１０−６Ｍの２−メルカプト エタノールおよび１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０とＩＭＤ Ｍの５０　：　５０混合物を使用した。デクスタータイブ（Ｄｅｘｔｅｒ−ｔｙ ｐｅ）の条件の場合は、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン７５０μｇ／ｍｌのストレプ トマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１０％のウ シ胎児血清、２０％のウシ血清および１０−’Ｍのコハク酸ヒドロコルチゾンナ トリウムを含有するＩＭＤＭを使用した。デクスタータイブの培地で増殖させた 骨髄細胞は骨髄性分化だけを起こす。培養は全細胞集団またはそれらの細胞表面 抗原（ＣＤ３４．　Ｔｈｙ−１）発現で分画した細胞で行った。

上記条件下で増殖する、出発集団中の細胞の頻度を測定することができる。その 頻度はウェルの３７％が全く増殖を示さない細胞数で決定される。

細胞増殖に対する成長因子の作用　長期培養培地１０Ｉｌ＋１中に、９６ウエル プレートの１ウェル当り１００μｌ　（約１００個の細胞）を添加した。そして その各ウェルにはＡＣ６，２１の集密間質細胞単層が入っていた。培地の１／２ づつを１週間毎に新鮮な長期培養培地と取替えた。

異なる因子を個々にまたは組合わせて添加したが、その添加量は３５日間に上記 条件下で得られる細胞の数が最大になる最適濃度であった。使用した因子はルー ３．　ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦ、スチール因子（ＳＬ）およびＬＩＦであった。

これらの因子は、Ｒ＆　Ｄ　５ｙｓｔｅａ＋ｓ社（米国。

ミネソタ州、ミネアポリス所在）から、凍結乾燥された組換えタンパク質（粉末 ）として入手した。各種の期間が終ってから、１０〜１５個のウェルをＦＡＣ３ 分析法でスクリーニングして、細胞の全数を計数した。以下の表（表■）は試験 結果を示す。

表Ｉ 細胞の増殖 時　間 処理　２週間　３週間　４週間　５週間　６週間　７週間なし　＞２．０００ ３＋６　＞２．０００ ＧＭ　＞　５．０００ ３　＋　６　＋ＧＭ　＞５．０００ ＳＬ　＞　２．００Ｏ ＬＩＰ　＋、００．００Ｏ ＬＩＰ　＋　３　＋　６　１００．０００ＬＩＦ　＋３　＋　６　＋ＧＭ　１０ ．０００２００．０００２００，０００Ｌ［Ｆ＋３＋６＋ＧＭ＋ＳＬ　１０．ｏ ００２００．０００２００，０００注：ウィルスの感染のあるなしにかかわらず 同じ処理したものの間に細胞増殖の差は全くない。

次の試験では、各種のマーカーを存する細胞の存在を測定した。

ＣＤ７はＴ細胞のマーカーであり、予想外のことではないがＴ細胞はみとめられ なかった。というのは胸腺の環境には暴露されていないからである。ＣＤ１５は 単球と顆粒球を示し、ＣＤ１９はＢ細胞を示し、およびＣＤ３３は骨髄細胞を示 す。１５個のウェルの中でマーカーを存する細胞が観察されたウェルの数は頻度 を意味する（表■）。

表■ ４週間培養物のＦＡＣＳ分析結果 処　理 ＣＤ　１９　１１／１５　１２／１５　１１／１５ＣＤ　１５　１５／１５　１ ５／１５　１５／１５ＣＤ　３３　１５／１５　１５／１５　１５／１５ＣＤ　 ７　０／１５　０／１５　０／１５次の試験では、上記培養を５週間行った後Ｆ ＡＣＳ分析をＣＤ３４　Ｔｈｙ−１集団について行った。次の表は、５週間後の ＣＤ３４　’ｒｈｙ−ｘ＋集団の百分率およびＦＡＣＳによって分析された１５ 個のウェルの中で陽性であったウェルの数を示す（表■）。

ＣＤ３４”ＴｈＹ−ビ集団 処　理　頻　度　百分率の範囲 ＬｒＦ＋　３　＋６　１３／１５　５．５６％−１６，２７％平均値　９．２％ ＬｒＦ＋　３　＋　６　＋ＧＭ　１１／１５　５．９％−２５，３％平均値　１ ０００％ ＬｒＦ＋　３　＋　６　＋ＧＭ＋ＳＬ　１３／１５　５．６５％−２１，５６％ 平均値　１１．３％ ＬＩＦ＋３　＋６＋ウイルス　１２／１５　５．５％−１８，１５％平均値　９ ．８％ 次の試験では、培養を７週間維持したことを除いて上記の試験を繰返した。次の 表は試験結果を示す（表■）。

表■ ７週間の生体外培養物のＦＡＣ３分析結果ＣＤ３４”Ｔｈｙ−１”　ＡＣ６ＧＭ 　ａ＋６　３＋６＋ＧＭ　ＬＩＰ頻度”　Ｏ／６　０／９　０／１５　０／１５ 　１２／１５百分率の範囲”　１．５％−１３％ 本　１％より大きい場合、陽性とした。

ネ＊　平均値は４．５％で中央値は５％である。

上記試験結果から次の結論が得られる。すなわち、生体外培養物中の本発明の幹 細胞集団は、適切な表面マーカーおよび適切な大きさと粒度（Ｐａｉｎｔａ−Ｇ ａｔｅ）をもっている。

生体外培養を行った後のＣＤ３４　Ｔｈｙ−ｉ集団の活性をさらに示すために生 体外の二次培養物を調製した。ＬｒＦ、　ＩＬ−３およびＩＬ−６で２４時間処 理し次いで５週間後の５０個のウェルからの細胞を、ＣＤ３４　’ｒｈｙ−ｘ集 団について選別した。全細胞は約５Ｘ１０＠個であった。選別後、約５Ｘ１０’ 個のＣＤ３４　’ｒｈｙ−＋細胞を得た。これらの細胞を直ちに、１ウェル当り 約１００個の細胞数で、長期培養培地とともにＡＣ６，２１の集密培養物を含有 するウェル中に導入した。以下の表は試験結果を示す。

ＣＤ３４”Ｔｈｙ−１”集団 処　理　頻　度　百分率の範囲 ＬＩＦ＋３　＋　６　１３／１５　５．５６％−１６，２７％平均値　９．２％ ＬＩＦ＋３　＋　６　＋ＧＭ　１１／１５　５．９％−２５，３％平均値　ｌ０ １５％ ＬｒＦ＋　３　＋　６　＋ＧＭ＋ＳＬ　、１３／１５　５．６５％−２１，５６ ％平均値　１１．３％ ＬＩＦ＋　３　＋　６＋ウイルス　１２／１５　５．５％−１８，１５％平均値 　９．８％ ｌＪＦ＋　３　＋６　６／１５　４．１％−１３％ＬｒＦ＋　３　＋６　＋ＧＭ 　、　６／１５　４．３％−１５％ＬＩＦ＋　３　＋　６　＋ＧＭ＋ＳＬ　８／ １５　４．９％−■６％△Ｍｏ＋ＰｙＦＩ０１−１１　’を利用した（ｖａｌｅ ｒｉｏら、Ｇｅｎｅ、　８４巻、４１９〜４２７頁、１９８９年、およびＢａｍ ｂｅｓｅｃｈｅｍら、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１７２巻、７２９〜７３６頁 、１９９０年）。感染は、約１０４個のＣＤ３４　Ｔｈｙ−１＋細胞とｌＸｌ０ ’ＣＦＵのウィルスを、ＬＩＦ、ｒＬ−３，ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦを各々 １０ｎｇ／ｍｌずつ含有する長期培養培地（“ＬＴＣＭ”）１ｍｌ中に導入する ことによって行った。この細胞混合物を２４時間維持し、次いでその培地をＬＴ ＣＭで１０ｍ１まで希釈し、得られた培地１００μ＋を、ＡＣ６，２１間質細胞 系の集密層が存在するウェル中に導入した。５〜１５個のウェルからの細胞（各 細胞にはウィルスを含有するものとしないものがある）をメチルセルロース培地 に導入し、２週間維持した。この期間の後、全細胞を各メチルセルロース培地か ら集めて」憇遺伝子についてＤＮＡ　ＰＣＲ法で分析した。

第２シリーズの実験では、上記メチルセルロース培養物に、１ａ＋ｇ、／＋ｌの ６４１８を添加し、次いでウィルスと予め接触させなかった５個のウェルの細胞 およびウィルスと予め接触させた２０個のウェルの細胞を調製した。これら培養 物を２週間維持し、その後、すべての細胞を各培地から単離してｎｅｏ遺伝子に ついて同じ分析に付した。またこれらの細胞はポリオーマのエンハンサ−配列の 存在について分析した。

使用したプライマーは次のとおりである。

ＣＡ　ＴＣＧＣＡＴＧＡＧ　ＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡ　（配列番号：　１　）　Ｎ ｅｏ−１ＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡ　ＴＣＡＴＧ　（配列番号 ：　２）　Ｎｅｏ−２ＣＴＡＧＡＣＴＧＧ　ＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡ　ＴＣＣＴＣ Ｔ　（配列番号：　３　）　ＰｙＦＩｏｌ−３ＣＡＡＴ　ＣＡＴＴＡＣＴＡＴＧ 　ＡＣＡＡＣＡＧＴＣＴ　ＡＧ　（配列番号：　４　）　ＰｙＦｌｏｌ−４ｎｅ ｏ遺伝子に対するプライマーで予想されたフラグメントは１８０ｂｐであった。

Ｇ４１８で選択されなかった細胞およびウィルスに暴露されなかった細胞由来の 試料はバンドを全く示さなかったが、ウィルスに暴露された細胞由来の３個の試 料は陽性であった。ＰＣＲに対する陽性と陰性の対照は予想どおりであった。電 気泳動による分離を行うために２％のアガロースゲルを使用した。

ウィルスに暴露した細胞の電気泳動を行ったとき、ウィルスに暴露しなかった細 胞の３個の対照試料はすべて陰性であったが、一方細胞がウィルスに暴露された １２個のウェルからの細胞はすべて陽性であった。

さらに、アーチファクトが存在しないようにするため、　１２０ｂｐと６０ｂｐ のフラグメントを提供する制限酵素Ｓｐｈ　Ｉまたは１５０ｂｐと３０ｂｐのフ ラグメントを提供する制限酵素Ｎｅｏ　ＩでＰＣＲ産物を消化した。

得られたゲルは予想されたバンドを提供した。すなわちウィルスに感染させなか った細胞は陰性であったが、一方ウイルスを感染させた細胞は元のバンドより小 さい二つのバンドを示した。

次の試験では、未感染細胞と感染細胞を試験して、５ＣＩＤ−ｈｕ／胸腺のモデ ル中で長期Ｔ細胞を再構成する性能を測定した。このとき胎児胸腺をＣ，Ｂ、　 １７ｓｃｉｄ／　５ｃｉｄマウスの腎臓のうに導入する。培養に使用される細胞 は、ＨＬＡが胸腺の細胞とは異なる（試験手順の説明については国際特許願事Ｐ ＣＴ／ＵＳ９１１０２３７３号参照）。５週間培養物由来の１０４個のＣＤ３４ 　ｒｈｙ−を細胞を使用したが、この細胞は、先に述べたように、最初、ＬＩＦ ＋　［Ｌ−３＋　ＩＬ−６またはこれらの因子子ウィルスに２４時間暴露し次い で５週間増殖させた細胞である。上記期間を終ってからこれらの細胞は、胸腺に 注射するのに用いるためＣＤ３４　’ｒｈｙ−ｔについて選別した。ＦＡＣＳ分 析を行った結果、２．３の試験で、ドナー細胞のＨＬＡに対するマーカーととも に表面膜タンパク質のＣＤ３．　ＣＤ４およびＣＤ８に対するマーカーによって 、Ｔ細胞の存在が観察されたことを示した。同様に、同じＴ細胞のマーカーを、 同じ２．３の試験で、すべてのヒト細胞の抗体と対比して用いたとき、Ｔ細胞の 大きな集団が観察された。

その胸腺の細胞を分離してＤＮＡ　ＰＣＲ分析に付した。使用したプライマーが ｎｅｏ遺伝子のプライマーの場合、胸腺由来の合計ｌＯ・個の細胞を用いたとき 、対照のマウスは陰性の結果を示したが、一方、以下の条件下：１０４細胞／胸 腺での二次培養物由来のＣＤ３４”　Ｔｈｙ−１陽性細胞を注射してから３箇月 後；２Ｘ１０”細胞／胸腺での一次培養物由来のＣＤ３４”　’ｒｈｙ−ｉ陽性 細胞を注射してから２．５箇月後；　１０’細胞／胸腺での一次培養物由来のＣ Ｄ３４”　ｒｈｙ−ｔゝ細胞を注射してから５箇月後；という条件下では陽性の 結果がみとめられた。類似の結果がポリオーマエンハンサ−について観察された 。

多分化能性造血幹細胞は、多分化能性を保持しながら、長期間増殖させ、培養中 に実質的に膨張させることができることは上記の試験結果から明らかである。し たがって、幹細胞は、広範囲の起源すなわち、胎児または成人の骨髄または血液 から得ることができ、かつ増殖させて細胞の膨張される起源を得ることができる 。さらに細胞には適切なレトロウィルスを感染させ、その結果、その細胞は、中 に含有されている遺伝子の機能発現性を有する該レトロウィルスの構造体を組込 み、そして分化および成熟を行った後、細胞内に該遺伝子は保持され発現される 。

本明細書で挙げた刊行物と特許願はすべて、個々の刊行物または特許願が具体的 にかつ個々に援用して示される場合と同程度に本願に援用するものである。

また本発明は充分に述べられているが、多くの変更と変形が、本願の特許請求の 範囲の思想または適用範囲を越えない場合、本発明に対して行えることは当該技 術分野の当業者にとって明らかであろ配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　Ｓｙｓｔｅｍｉｘ　Ｉｎｃ、社（ｉｉ）発明の名称：造血幹細 胞の培養およびその遺伝子工学（迅）配列の数　＝４ （ｉｖ）通信の宛先： （Ａ）受信人：　ｅｅｒｔｒａｍ　１．Ｒｏｗｌａｎｄ（Ｂ）ストリート：スィ ート３４００．エンパルカプロ・センター６（Ｃ）市　：サンフランシスコ （Ｄ）州　：カリフォルニア （Ｅ）国　：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ　：　９４１１１ （ｖ）コンピュータの読取り可能な形式（Ａ）媒体の種類　：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＮ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペ−レーティング システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ ｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．４．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）本願 のデータ （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９３／（Ｂ）出願臼　：　１９９３年３月３日 （Ｃ）分類　： （ｖｉ　）弁護士／弁理士の情報： （Ａ）姓名　：　Ｒｏｗｌａｎｄ、　Ｂｅｒｔｒａｍ　Ｉ（Ｂ）登録番号：２０ ．０１５ （Ｃ）参照／名簿番号：　ＦＰ−５５６９８／ＢＩＲ（ｉｘ）　！気通信の情報 ： （Ａ）　を話　：　（４１５）　７８１−１９８９（Ｂ）テレファックス：　（ ４１５）　３９８−３２４９（２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長　さ＝２１個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の表示：配列番号：ｌ： ＣＡＴＣＧＣＡＴＧＡ　ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴ　Ａ　２１（２）配列番号：２の 情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長　さ：２５個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列の表示：配列番号、２： ＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡ　ＴＣＡＴＧ　２５（２）配列番号 二３の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長　さ２２５個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 補正書の翻訳文提出書 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長　さ：２６個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の表示：配列番号＝４： ＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡ　ＧＴＣＴＡＧ　２６粗い分離によ って正の選択が行われるが、その分離と同時にまた（特許法第１８４条の８） 平成６年９月　デ日 は続いて負の選択が行われ、この場合、デディケーテッド細胞に存在する特定マ ーカーに対する抗体が使用される。これらのマーカーは、大部分がＣＤ３．　Ｃ Ｄ７．　ＣＤ８．　ＣＤｌ０．　ＣＤ１４．　ＣＤ１５．　ＣＤ１９．　ＣＤ２ ０゜ＣＤ３３を含有し、好ましくは少なくともＣＤ３．　ＣＤ８．　ＣＤｌ０． 　ＣＤ１９゜請求の範囲 １．ＣＤ３４”およびＴｈｙ−１”″であることを特徴とするヒト造血幹細胞を 培養培地内で増殖させる方法において、改良点が、前記幹細胞を、少なくとも約 １０ｎｇ／ａｉ１の白血病阻害因子を含有する培地と、少なくとも１２時間接触 させ二次いで前記幹細胞の増殖を支持することができる培地内で前記幹細胞を増 殖させる： ことを含んでなる改良された方法。

２、前記白血病阻害因子が約２〜２０ｎｇ／ａ＋１の濃度で存在している請求の 範囲１記載の方法。

３６前記接触が、少なくとも１　ｎｇ／ａｌｌの濃度の、ＩＬ−３，ＩＬ−６゜ ＧＭ−ＣＳＦまたはスチール因子のうちの少なくとも一つと行われる請求の範囲 ｌ記載の方法。

４、前記増殖が、間質細胞系由来の細胞によってならされた培地の存在下で行わ れる請求の範囲ｌ記載の方法。

５、前記間質細胞が前記培地中に存在している請求の範囲４記載の方法。

６、ＣＤ３４ゝおよび’ｒｈｙ−ｉ”であることを特徴とするヒト造血幹細胞を 培養培地内で増殖させる方法において、前記幹細胞を、約２〜２０ｎｇ／ｍｌの 白血病阻害因子および少なくともｌｎｇ／ｍｌの濃度の、ＩＬ−３，ルー６、　 ＧＭ−ＣＳＦまたはスチール因子のなかの少なくとも一つを含有する培地と、少 なくとも約１２時間接触させ；次いで 前記幹細胞の増殖を支持することができる培地内で前記幹細胞を増殖させる； ことを含んで改良された方法。

７、前記増殖が、間質細胞系由来の細胞によってならされた培地の存在下で行わ れる請求の範囲６記載の方法。

８、前記間質細胞が前記培地中に存在している請求の範囲７記載の方法。

９、前記白血病阻害因子が前記成長支持培地内に維持されている請求の範囲６記 載の方法。

１０、　ＣＤ３４°および’ｒｈｙ−ｉ４″であることを特徴とするヒト造血幹 細胞をトランスフェクトする方法であって；デディケーテッド（ｄｅｄｉｃａｔ ｅｄ）細胞を実質的に含有していないヒト造血幹細胞を、ヒト細胞に対して親和 性で、かつヒト造血細胞内で転写を仲介するＤＮＡ要素を有する重要なりＮＡ組 成物を含有するレトロウィルスのベクターと、少な（とも１０ｎｇ／ｍｌの白血 病阻害因子を含有する培地内で、前記ウィルスが前記幹細胞に入るのに充分な時 間接触させることを含んでなる方法。

１１、前記培地がさらに、ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦまたはスチール因 子のうちの少な（とも一つを、少なくとも１　ｎｇ／■ｌの濃度で含有している 請求の範囲ｌＯ記載の方法。

１２、前記の重要なりＮＡ組成物が、ヒト造血細胞内で転写を行う活性を存する 遺伝子である請求の範囲１３記載の方法。

１３、さらに、前記の注目のＤＮＡ組成物を含有する前記造血幹細胞を、幹細胞 の増殖を支持できる培地内で培養して増殖させることを含んでなる請求の範囲ｌ Ｏ記載の方法。

１４、前記成長支持培地が、間質細胞系由来の細胞によってならされた培地であ る請求の範囲１３記載の方法。

１５、前記間質細胞が前記増殖支持培地中に存在している請求の範囲１４記載の 方法。

１６、前記白血病阻害因子が前記増殖支持培地内に維持されている請求の範囲１ ５記載の方法。

１７、デディケーテッド（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）造血細胞を実質的に含有せず、 注目のＤＮＡ組成物の組込みによってもたらされる前記注目のＤＮＡ組成物を含 有する、ＣＤ３４°およびｒｈｙ−ｔ＋であることを特徴とするヒト造血幹細胞 組成物。

１８、前記の注目のＤＮＡ組成物が、造血細胞内で転写を行う活性を有する遺伝 子である請求の範囲１７記載のヒト造血幹細胞。

１９、前記遺伝子がＧ４１Ｂ耐性遺伝子である請求の範囲１８記載のヒト造血幹 細胞。

２０、請求の範囲１７記載のヒト造血幹細胞から遺伝されたヒト造血細胞。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ Ｉ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト造血幹細胞を培養培地内で増殖させる方法において、前記幹細胞を、少 なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの白血病阻害因子を含有する培地と、少なくとも１２ 時間接触させ；次いで前記幹細胞の増殖を支持することができる培地内で前記幹 細胞を増殖させる； ことを含んでなる改良された方法。
2. ２．前記白血病阻害因子が約２〜２０ｎｇ／ｍｌ存在している請求の範囲１記載 の方法。
3. ３．前記接触が、最少１ｎｇ／ｍｌの、ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦまた はスチール因子のうちの少なくとも一つと行われる請求の範囲１記載の方法。
4. ４．前記増殖が、間質細胞系によって得たならし培地の存在下で行われる請求の 範囲１記載の方法。
5. ５．前記間質細胞系が前記培地中に存在している請求の範囲４記載の方法。
6. ６．ヒト造血幹細胞を培養培地内で増殖させる方法において、前記幹細胞を、約 ２〜２０ｎｇ／ｍｌの白血病阻害因子および少なくとも１ｎｇ／ｍｌの、ＩＬ− ３，ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦまたはスチール因子のうちの少なくとも一つを含有 する培地と、少なくとも約１２時間接触させ；次いで 前記幹細胞の増殖を支持することができる培地内で前記幹細胞を増殖させる； ことを含んで改良された方法。
7. ７．前記増殖が、間質細胞系によって得たならし培地の存在下で行われる請求の 範囲６記載の方法。
8. ８．前記間質細胞系が前記培地中に存在している請求の範囲７記載の方法。
9. ９．前記白血病阻害因子が前記成長支持培地内に維持されている請求の範囲６記 載の方法。
10. １０．ヒト造血幹細胞をトランスフェクトする方法であって；デディケーテッド （ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）細胞を実質的に含有していないヒト造血幹細胞を、ヒト 細胞に対して親和性で、かつヒト造血細胞内で転写できる重要なＤＮＡ配列を含 有するレトロウイルスのベクターと、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌの白血病阻害因 子を含有する培地内で、前記ウイルスが前記幹細胞に入るのに充分な時間接触さ せることを含んでなる方法。
11. １１．前記培地がさらに、ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦまたはスチール因 子のうちの少なくとも一つを最少１ｎｇ／ｍｌ含有している請求の範囲１０記載 の方法。
12. １２．前記ＤＮＡ配列が、ヒト造血細胞内で転写できる遺伝子である請求の範囲 １０記載の方法。
13. １３．さらに、前記ＤＮＡ配列を含有する前記造血幹細胞を、幹細胞の増殖を支 持できる培地内で培養して増殖させることを含んでなる請求の範囲１０記載の方 法。
14. １４．前記成長支持培地が、間質細胞系によって得たならし培地である請求の範 囲１３記載の方法。
15. １５．前記間質細胞系が前記培地中に存在している請求の範囲１４記載の方法。
16. １６．前記白血病阻害因子が前記増殖支持培地内に維持されている請求の範囲１ ５記載の方法。
17. １７．デディケーテッド（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）造血細胞を実質的に含有せず、 ＤＮＡの組込みによってもたらされる注目のＤＮＡ配列を含有するヒト造血幹細 胞組成物。
18. １８．前記の重要ＤＮＡ配列が、造血細胞内で転写できる遺伝子である請求の範 囲１７記載のヒト造血幹細胞。
19. １９．前記遺伝子がＧ４１８耐性遺伝子である請求の範囲１８記載のヒト造血幹 細胞。
20. ２０．請求の範囲１７記載のヒト造血幹細胞から遺伝されたヒト造血細胞。