JP5757942B2 - 表現型の可塑性を示す細胞を生成する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の分化、特に表現型の可塑性を示すハイブリッド細胞、およびこれらの細胞を生成する方法に関する。また、本発明は、所望の表現型の特定の細胞を生成する方法に関する。さらに、本発明は、より初期の前駆状態への脱分化能を有しているハイブリッド細胞を生成する方法に関する。さらに、本発明は、例えば組織生成ための、種々の用途におけるハイブリッド細胞の使用を意図している。
本明細書の全体を通じての従来技術のあらゆる議論は、当該従来技術が広く公知であるか、または当該分野においてよく知られている一般的な知識の一部を形成していることの自認として決して見做されるべきではない。
多重の融合細胞は不安定であり、融合に関連する細胞が多いほど、生じるハイブリッド細胞の不安定性が増すことが一般的に認められている。意外にも、本発明において、いくつかの細胞(例えば、3つの細胞)の融合から生じるハイブリッド細胞は、機能的な安定性を示す。特に、異なる系統に由来する細胞は体細胞性に融合されるか、またはハイブリダイズされて、実質的に安定なキメラ/ハイブリッド細胞を形成し得ることを見出している。より詳細には、本発明は、三重のハイブリッドを生じる少なくとも3つの親細胞のハイブリダイゼーションに基づいて生成される系統交雑のキメラ/ハイブリッド細胞に関する。ここで、少なくとも2つの親細胞は、異なる系統に由来しており、骨髄腫細胞はハイブリダイゼーションに関わっていない。
1つの骨髄単球性の共通前駆体K562(CD72+CD15+)、1つの初代B細胞(CD19)、および1つのT細胞(CD4)−KBT;
1つの骨髄単球性の共通前駆体K562、不死のB細胞WIL2NS、および不死のT細胞MOLT−KMW;または
初代培養された骨髄CD34+CD15+細胞に由来する1つの骨髄単球性の共通前駆体、1つの不死のB細胞WIL2NSおよび初代培養された1つのT細胞−WTM
のハイブリダイゼーションによって生成され得る。
未拘束(uncommitted)の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞である第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞をハイブリダイズして、ハイブリッド細胞を生成する工程、ならびに
当該ハイブリッド細胞が所定の表現型の上記細胞になる所定の環境に当該ハイブリッド細胞をさらす工程を包含している。
未拘束の前駆細胞に由来する第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
をハイブリダイズして、ハイブリッド細胞を生成すること、ならびに当該ハイブリッド細胞が所定の表現型の細胞になるような胸腺のストロマ細胞、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンドまたはこれらの組合せに当該ハイブリッド細胞をさらすことを提供することが明らかである。
未拘束の前駆細胞に由来する第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。ここで、上記第1の細胞は骨髄腫細胞ではない。
本発明に照らして、「含んでいる(comprise)」および「含んでいる(comprising)」などは、それらの排他的な意味ではなく、「包含しているが、これに限定されない」というそれらの包括的な意味において解釈されるべきである。
ハイブリッド細胞は、2以上のゲノムに由来する構成要素を含んでいる細胞(接合体およびそれらの派生物以外)である。それは、例えば2以上の生物学的な細胞(親細胞)の、体細胞ハイブリダイゼーション(または全細胞ハイブリダイゼーション)から構築される細胞である。親細胞は、同じ系統(または種)または異なる系統(または種)のいずれかから入手され得る。同じ系統および種から生成されたハイブリッド細胞は自己ハイブリッド(auto-hybrid)と呼ばれ、一方、異なる系統のハイブリッド細胞は異種ハイブリッドと呼ばれる。
キメラ細胞は、2以上の異なる種に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
系統交雑のハイブリッド細胞は、異なる細胞系統に由来する2以上の細胞に由来するゲノムを有している人工的に生成されたハイブリッド細胞である。造血細胞は2つの主な系統:リンパ球系(T細胞、B細胞およびNK細胞)ならびに骨髄系(単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)に分けられる。
トリハイブリッド細胞は、3つの細胞に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
細胞に言及するときに、「安定な」という用語は、所定の成長パラメータもしくは生産パラメーターの一貫性を証明する細胞の能力、または増加する世代数に対して細胞株の生産特性の一貫性を意味する。安定な形質転換体に言及して用いられるとき、それは、比較的に一定のレベルにおいて導入遺伝子を、実質的に無期限に発現する細胞株を意味する。
本明細書に照らして、「体細胞ハイブリダイゼーション」という用語は、細胞の原形質膜が良好に接触するよう誘導され、接触点において親細胞の原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導され、新たに形成された単一細胞の外膜の内部にそれぞれの親細胞の本体または細胞小器官が組み込まれるような方法において、単一の生細胞が2以上の二倍体(非生殖細胞)の細胞(親細胞)から生成される過程を指す。新たに形成された単一の細胞はハイブリダイズされた細胞またはハイブリッド細胞と呼ばれる。
「幹細胞」という用語は、有糸分裂による分裂能および種々の異なる細胞型への分化能を有している特殊化していない細胞(unspecialised cell)を指す。幹細胞は、胚性幹細胞、臍帯に由来する「成熟な」幹細胞または成体に由来する幹細胞を包含し得る。幹細胞は、すべての細胞型に分化する無制限の能力を有している細胞、すなわち全能細胞を包含している。また、幹細胞は、特殊化した細胞(例えば、全能性、多能性、低能性(oligopotent)または単能性幹細胞)への分化能に制限されている細胞を包含し得る。
「不死化された細胞」という用語は、無制限に成長する能力を有している細胞を指す。不死化された細胞はインビボの悪性腫瘍または胚に由来し得ることが明確であろう。代替的に、不死化された細胞は、無制限に成長する能力を誘導する処理を細胞に施すことによって入手し得る。これら処理は、例えば、インビトロの形質転換処理(例えばウイルス遺伝子の導入)を包含し得る。当該ウイルス遺伝子は、例えば、エプスタイン・バールウイルス(EBV)、シミアンウイルス40(SV40) T抗原、アデノウイルス E1AおよびE1B、ならびにヒトパピローマウイルス(HPV) E6およびE7である。代替的に、不死化された細胞はテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質(TERT)の発現または他の方法を経た細胞に由来し得る。また、不死化された細胞は、発癌遺伝子の発現が改変されている細胞に由来し得る。不死化された細胞は無制限に成長する能力を誘導する任意の処理(UV照射、または不死化の機構が不明である任意の形質転換を包含しているが、これらに限定されない)に由来し得る。
「骨髄腫細胞」という用語は、プラズマ細胞の悪性腫瘍を指す。
「ハイブリドーマ」という用語は、免疫化された動物の脾臓に由来するB細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーションによって生成される細胞を指す。ハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生能を有している不死化された細胞である。
(表現型)
「表現型」という用語は、細胞の物理的特性または形態を指す。例えば、表現型は、特定の細胞系統(例えば、リンパ球系統または骨髄球系統)に関し得る。代替的に、「表現型」という用語は、1つ以上の分子(例えば、細胞の表面上の分子(例えばCDマーカー)または細胞内の分子(例えば転写因子))の発現に関し得る。
「未拘束の前駆細胞」という用語は、任意の特定の系統に拘束されることなく、一部の種類の細胞にのみ分化し得るが、自己をもはや回復し得ない幹細胞の初期の子孫を指す。
骨髄性の共通前駆細胞は、骨髄系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、巨核球/赤血球または顆粒球/マクロファージ前駆細胞のいずれかになり得るが、リンパ球系細胞になり得ない。
リンパ系の共通前駆細胞は、リンパ球系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、B、T細胞およびナチュラルキラー細胞になり得るが、骨髄細胞になり得ない。
Bリンパ球系統に由来する細胞は、B細胞の任意の型になるB系統の分化の後の、リンパ系の共通前駆細胞に由来する任意の細胞である。
Tリンパ球系統由来の細胞は、T細胞の任意の型になるT系統の分化の後の、リンパ球共通前駆体に由来する任意の細胞である。
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、顆粒球および単球の系統に分化するが、巨核球および赤血球の系統には分化しない前駆細胞である。
巨核球−赤血球前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、巨核球および赤血球の系統に分化するが、顆粒球および単球の系統には分化しない前駆細胞である。
プレB細胞は、膜結合型IgMの重鎖が代替軽鎖と共に発現している段階において発達中のB細胞である。
未成熟なB細胞は、抗体の位置の組換え段階においてVJがL鎖上に再構成され、VDJがH鎖上(IgM受容体の発現がみられる)に再構成される骨髄において発達中のB細胞を指す。
ナイーブB細胞は、その表面の免疫グロブリンの無作為な遺伝子再構成を経て骨髄において分化し、成熟しているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟B細胞である。
T依存性の様式または非依存性の様式におけるクローン性増殖、およびプラズマ細胞への最終分化の組合せを生じるBCRを介した抗原認識を通じて、末梢において対応する抗原に接触した成熟B細胞型である。
エフェクターB細胞は、特定の抗原に特異的な抗体および免疫系の他の細胞を機能させるために過剰のサイトカインを分泌する短期生存型のB細胞の一種である、抗体分泌プラズマ細胞としばしば同義である。
記憶B細胞は、初期の免疫反応の間に接触した抗原に特異的である活性化B細胞から形成された長期生存型のB細胞であり、同じ抗原に対する2回目のばくろに続く迅速な応答が可能である。
プラズマ細胞は、最終的な有糸分裂後の短期生存型の免疫系の細胞であり、CD4+リンパ球(Th細胞)による刺激によってB細胞から分化し、大量の抗体を分泌する。
前T細胞は、TCRのβ鎖が二重陰性(CD4−CD8−)のT細胞(CD3+)において発現しており、VbDbJbが揃いっている段階において発達中のT細胞である。
未成熟T細胞は、骨髄から胸腺に移動しているが、そのTCRの再構成もしくは自己の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子上に提示された自己ペプチドに対するTCR結合能についての選択が完了していないか、またはそれぞれMHCクラスIもしくはII分子に対する細胞のTCR特異性と正確に相互関係を示すTキラー系統もしくはTヘルパー系統への分化を経ていない発達中のT細胞である。系統分化は補助受容体分子であるCD8またはCD4の一方の発現を喪失することによって表現型として特徴付けられる。
骨髄において分化し、そのTCRの再構成を伴う胸腺における中心的な選択のポジティブおよびネガティブな過程および補助受容体分子の1つの喪失を首尾よく経ているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟T細胞。
活性化T細胞は、抗原提示細胞上における主要組織適合遺伝子複合体ペプチド(ペプチド:MHCの複合体)およびB7ファミリーメンバーのそれぞれによる、細胞表面上のTCRおよびCD28の両方の結合を通して、抗原特異的なエフェクターT細胞になりつつあるT細胞である。
エフェクターT細胞は、細胞に適切なペプチド:MHCの複合体を有している当該細胞との接触によって即座に応答可能な短期生存型のTリンパ球の一種である。
図1.同定および分取−精製したCD71+K562細胞。
骨髄単球性の前駆体に由来するCD34およびCD15、ならびにエフェクターT細胞に由来するCD4を用いた3色染色。
本発明の好ましい実施形態は、添付の図面を参照した以下の非限定的な例によってさらに説明される。
1.細胞の選択、細胞の操作、および単一細胞のクローニング
以下の実施例は、HTSの生成および所望のタンパク質の発現に用いる哺乳類細胞株および初代培養された細胞の、選択および単離(または分取)を包含している細胞の調製について記載している。特定の特性を有している細胞の単一集団を得るための特定の選択法の選択、または特定の表現型の細胞を単離するための特定の(複数の)マーカーの使用は、まったく限定的ではなく、むしろ暗示的である。他の細胞マーカーまたは分取の手順は、同様の結果を出すために用いられ得る。
NaHCO3(JRH Biosciences)、20mMのHepes(Sigma)、4mMのL−グルタミン(Sigma)によって改変し、10%のウシ胎児血清FCS(JRH Biosciences)を補ったRPMI1640(Roswell Park Memorial Institute培地)を用いて、加湿した5%のCO2雰囲気の37℃のCO2インキュベーターにおいて、標準的な(通常の)条件下において、すべての不死の細胞株(下記を参照)を懸濁培養において成長させた。特に記載がない限り、本明細書に記載の組織培養培地(TC培地)は、本発明に関するすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞、初代培養された細胞培養および樹立したトリハイブリッド細胞株を培養するための標準培地である。一般的に、用いたすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞および初代培養された細胞を抗生物質のない環境において培養した。しかし、危険性の高いバクテリアおよび/または真菌による汚染の疑いがある場合、2%のアンピシリン(5000ユニット)/ストレプトマイシン(5mg)溶液(Sigma)を標準培地に加えた。
骨髄性の共通前駆体系統、K562(ヒトの慢性骨髄性白血病に由来する細胞株)、
Tリンパ球系統、MOLT4(ヒトのTリンパ芽球)および
Bリンパ球系統、WIL2NS(ヒトBTリンパ芽球)。
細胞の単離または分取、細胞の操作および単一細胞のクローニングは、本発明を通して重要な工程である。ここには、我々は目的の単一細胞の操作および/またはクローニングのために確立した単一細胞の供給系について説明する。単一細胞の供給系(図27)は、ガラスのマイクロピペット、1mlのシリンジおよび1次元簡易操作装置(one-dimensional coarse manipulator)から主に構成される。図28は、目的の単一細胞を拾い上げるために用いられるガラスのL字型マイクロピペットを示す。このピペットを、ヘマトクリットキャピラリーチューブ(75ミリメートル(mm)の長さ、それぞれ1.5mmおよび1.10mmの外径および内径)から作製した。熱を用いることによって、チューブの一端を、約250〜300マイクロメートル(μm)の内径および約30μmの先端の壁厚を有している先端(1)が得られるように引っ張った。マイクロピペットの他端には手を加えなかった(2)。細胞供給系(図27)において、シリンジ(4)を簡易操作装置上に載せ、同様に簡易操作装置を磁気スタンド(16)に載せている。この系は、シリンジのピストン(6)がシリンジに対して前方または後方に非常にゆっくりと動かされ得るように機能する。目的の単一細胞を操作するために、柔軟性のある医療用品質のチューブ(3)を用いて、図に示されるようにシリンジをマイクロピペット(2)の手を加えていない端に接続しなければならない。この単一細胞の供給系は、任意の細胞操作の前に、70%のアルコールを用いて数回にわたって洗浄することによって殺菌し、最終的に、必要なあらゆる適切な組織培養培地または溶液によって気泡を含ずに満たされる必要がある。
各細胞株由来の細胞のクローンを単一細胞のクローニングによって樹立した。本発明において用いられる任意の生物学的な細胞(例えば、K562細胞株の細胞)の単一細胞のクローニングまたは操作の方法を以下に記載する。
一例として、以下の方法は、蛍光標示式細胞分取器(FACS)を用いた、K562細胞株からの、骨髄単球性の系統のCD71陽性細胞の細胞選択および分取について説明する。
骨髄単球性の前駆細胞は、不死化した骨髄単球性の任意の細胞株または初代培養された造血組織(例えば骨髄)に由来し得る。以下は、ヒトの骨髄細胞株K562および骨髄サンプルからの骨髄単球性の前駆細胞を単離する例である。
細胞のハイブリダイゼーション実験にとっての細胞の骨髄単球性の表現型を確認するために、CD71+K562細胞はFACS分析および続く分取を用いてCD15+細胞に関してさらに濃縮された。
一例として、以下の方法は、急性骨髄性白血病(AML)の患者から得られた骨髄サンプルに由来する未拘束の細胞または骨髄性の細胞の選択について説明する。
分化転換系の確立のために、リンパ球を不死化した特定の細胞の任意の種類、または初代培養されたリンパ球のいずれかから誘導し得る。不死化されたWIL2NS細胞株およびMOLT4細胞株にそれぞれ由来するBリンパ球およびTリンパ球の調製は、項目1.1.3に記載されている。初代培養されたリンパ球は任意のリンパ組織(例えば、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および領域リンパ節)から単離され得る。第1の段階において、単核細胞を分離するためにすべてのリンパ組織を処理した。
説明および同意の後に、末梢血のサンプルを健康な個人から収集した。各血液サンプルはヘパリン処理されたチューブ(Vacutainer, BD)に回収し、プールし、RPMI1640を用いて希釈した。
以下の方法は、脾臓から単核細胞を単離するために本発明において使用された手法を説明する。同じ方法は、胸腺、扁桃腺または領域リンパ節から単核細胞を単離するために使用され得る。また、細胞の染色方法および分取方法が示されている。
組織サンプルをまず、項目1.3.1および項目1.3.2に記載のように単核細胞集団を抽出するために処理した。次いで、蛍光細胞染色、続いて細胞分取を、単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この細胞を、染色するまで標準的な培養条件(項目1.1参照)下に完全培地に懸濁させた。
項目1.3.1に記載のように、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この特定の例において、上述の方法(項目1.3.3)にしたがって、ヒトの臍帯血からのCD5陰性(ナイーブ)B細胞およびCD5陽性(抗原を経験した)B細胞の分取を、マウス抗ヒトCD5−FITC抗体(BD Pharmingen)、マウス抗ヒトCD19−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照を用いて行った。
項目1.3.1の記載と同様の方法を用いて、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続いて細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この特定の実施例において、上述した細胞の方法(項目1.3.3)にしたがって、ヒトの臍帯血からのCD5陽性(抗原を経験した)T細胞およびCD5陰性(ナイーブ)T細胞の分取を、マウス抗ヒトCD5−FITC抗体(BD Pharmingen)、マウス抗ヒトCD3−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照を用いて行った。FACSを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも20000の絞り込んだ結果を分析した。CD5陰性T細胞(CD3+CD5−)またはCD5陽性T細胞(CD3+CD5+)のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図5はマウス抗ヒトCD3抗体およびマウス抗ヒトCD5抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
上述の方法(項目1.3.1)を用いて、単核細胞を骨髄から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。活性化B細胞の染色および分取は、上記の項目1.3.3に記載されている。すなわち、10μlのマウス抗ヒトCD72−FITC抗体(BD Pharmingen)および20μlのマウス抗ヒトCD20−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照(PEマウスIgG2b,κ抗体)を用いた。FACSを用いて染色した細胞を分析した。プレB細胞、休止B細胞、活性化B細胞、濾胞樹状細胞からなるCD20陽性集団(CD20+CD72−)、または初期B細胞(CD20−CD72+)もしくは活性化B細胞(CD20+CD72+)からなるCD72陽性細胞のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図6はマウス抗ヒトCD20およびマウス抗ヒトCD72抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
MACS CD4 Multisortキット(Miltenyi Biotec GmbH)を用いて、CD4−CD8−二重陰性の胸腺細胞、CD4+CD8+二重陽性の胸腺細胞、ならびにCD4+およびCD8+単独陽性の胸腺細胞の集団を、製造者の手順にしたがって分取した。要約すると、項目1.3.2の記載と同様の方法を用いて回収した胸腺細胞をCD4 Multisort CD4マイクロビーズと共に30分間にわたってインキュベートした。5mMのEDTAおよび0.5%のBSAを含んでいるPBSを用いて洗浄した後、標識した細胞を磁気カラムによって分離した。陽性として選択された胸腺細胞(磁気カラム上に保持された)はCD4+単独陽性およびCD4+CD8+二重陽性の細胞集団を含んでいた。一方、CD4が減少した細胞集団(カラムから逃れた)はCD8+単独陽性およびCD4−CD8−二重陰性の細胞を含んでいた。CD4陽性として選択された細胞集団からマイクロビーズを除去するために、MACS Multisort分離試薬と共に細胞をインキュベートした。20分後に消化を止め、細胞をCD8マイクロビーズによって30分間にわたって標識した。CD4+CD8+二重陽性の胸腺細胞を正の選択によって得た。一方、CD4+単独陽性細胞は細胞集団が枯渇したことがわかった。CD4の枯渇した細胞集団をCD8マイクロビーズと共に30分間にわたってインキュベートした。標識した細胞を磁気カラムにかけた後、CD8+単独陽性の細胞を、CD4−CD8−二重陰性の胸腺細胞から分離できた。4つの異なる胸腺細胞亜集団の純度をフローサイトメトリー解析によって評価した。許容される純度は95%より高いものである。
項目1.3.2に記載の方法を用いて、単核細胞をヒト扁桃腺から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。CD54+T細胞(細胞間接着分子−1またはICAM−1)を単核扁桃細胞集団から抽出し、マウス抗ヒトCD3−PE抗体(BD Pharmingen)およびマウス抗ヒトCD54−FITC抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照の使用は項目1.3.5に記載のような細胞染色/分取方法を用いて選択した。FACSを用いて染色した細胞を分析した。CD3+T細胞(すなわちCD3+CD54−細胞)または活性化CD54+T細胞(すなわちCD3+CD54+細胞)のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図7はマウス抗ヒトCD3案乳亜およびマウス抗ヒトCD54抗体を用いて染色したサンプルのFACSプロファイルを示す。CD3+細胞をHTSの生成のために用い、一方でCD54+活性化T細胞を発現実験のために用いた。
マウス抗ヒトCD154抗体(BD Pharmingen)によって被覆した丸底96ウェルプレート(Corning)のウェルに、精製したB細胞(項目1.3.3参照)を3.75×105/mlにおいて播いた。10%の熱不活性化尿素−低IgG 胎児ウシ血清、FBS(Gibco/BRL)ならびに100U/mlのヒトインターロイキン4(IL−4)(R&D systems)および50ng/mlのヒトインターロイキン10(IL10)を補った(培養3日目の後に加えた)完全RPMI2640培地において、この細胞を培養した。培養物を2から3日毎に培養培地の半分を交換することによって新しく補給した。細胞生存率および細胞数を、血球計算板を用いて、トリパンブルー排除によって3回にわたって評価した。5日目および10日目において、培養したリンパ球を、回収し、PBSにおいて2回にわたって洗浄して、マウス抗ヒトCD19−PE抗体、マウス抗ヒトIgM−FITC抗体またはマウス抗ヒトIgG−FITC抗体(全てBD Pharmingen製)を用いたFACSによって分析した。すべての染色を、1×106の細胞あたり1μgの各抗体を用いて4℃において行った。すべての分析において、95%を超える細胞が同位体適合の陰性対照の染色にしたがったマーカーの組について二重陰性であった。死細胞および残骸を含んでいる領域を分析から排除した。すべての分析を5000から10000の生細胞を絞り込むことによって行った。
2.体細胞ハイブリダイゼーション
体細胞ハイブリダイゼーションの種々の方法が当該技術において周知である。これらとしては、例えば、センダイウイルスのような融合性(fusagenic)ウイルスを用いる生物学的方法(Kohler and Milstein, 1975)、ポリエチレングリコール(PEG)を用いる化学的方法(Wojciezsyn, et al, 1983)、および電界を用いる電気的方法(Neil, and Zimmermann, 1993)が挙げられるが、これらに限られない。各方法は目的の細胞の原形質膜が可逆的に透過可能となり、ハイブリダイズすることを誘導し得るか、または引き起こし得る。
本発明のいくつかの実施形態において、電気的な細胞技術をトリハイブリッドのようなハイブリダイズされた細胞の生成に用い得る。
細胞ハイブリダイゼーションの前に目的の個々の細胞を増殖させるため、上述した単一細胞の増殖/供給系(項目1.1.1)を本発明を通じて用いた。
本発明において、2つのL字型の微小電極を用いた。図29は被覆されていない直径128μmのニッケル合金から作製した微小電極(7)を示す。微小電極の柄を、外径1.5mmのヘマトクリットキャピラリーチューブ(8)によって覆った。微小電極のL字型部(9および10)を、電極の水平な部分および垂直な部分の両方の表面の一致する領域が、培地または適切な溶液にさらされるように配置した(Mahaworasilpa, 1992)。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、2つの微小電極を2つの微細マイクロマニピュレーター(fine micromanipulators)(各微小電極について1つずつ)の上に載せた。これらの微小電極を各電極の平行な電極配置が得られるような方法において設計した(図30)。各微細マイクロマニピュレーターを水圧によって駆動させし、0.5μmの精度の動きがX、YまたはZ方向において行えるようにした。
図31は標準的な96ウェル平底TCプレートのウェルにおける2つの平行な電極を示す。このウェルは本発明のいくつかの実施形態において、細胞ハイブリダイゼーションのチャンバーの役割を果たす。細胞ハイブリダイゼーションを行うため、微小電極を標準的な96ウェル組織培養プレートのウェル(12)に入っている適切な培地(11)に沈めた。図32および図33はそれぞれ、平行な電極配置の上面図および側面図を示す。ここでは、例えば、ハイブリダイズされるべくあらかじめ選択された3つの細胞をそれらが適切なAC電界の存在において一続きの細胞に整列するまたは形成することを誘導し得るようにおいて、平行な電極の間に置く。
3.電気的な細胞ハイブリダイゼーション法による造血性の分化転換系を確立する例
以下の項目は、異なる系統もしくは細胞型であるか、または同じ系統/もしくは細胞型であるが異なる表現型である、いずれかに由来する細胞のハイブリダイゼーションによって得た造血性の分化転換系(HTS)の生成の例を提供する。安定な各トリハイブリッドが親細胞の表現型の特性を同時に有していることを確認するために分析を行った。この確認は系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのRNA転写産物の存在、核型分類、および/または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。以下の例は分化転換系の最も典型的な表現型の特性について説明する。しかし、これらの例は、選択した特定のマーカーに限定されない。
一例として、この種のHTSを、1つの不死化した骨髄単球性の前駆体K562細胞、不死化した1つのTリンパ球MOLT4細胞、および不死化した1つのBリンパ球WIL2NS細胞をハイブリダイズすることによって生成した。このようにして得られたHTSをHTS−KMW系と名付けた(続いてその識別番号を付与した)。HTS−KMWを確立する工程に関する以下の段階、溶液(ハイブリダイゼーション、培養および回復培地)および本発明に用いるパラメーターを以下に記載する。
K562、WIL2NS、およびMOLT4細胞株を我々の標準培地(項目1.1参照)において培養し、5%のCO2の37℃の加湿インキュベータにおいてインキュベートした。定法にしたがって、各細胞株を3日毎に継代した。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を有している細胞型の安定な各クローンを、項目1.1.2に記載の手順を用いて樹立した。いくつかの実験において、項目1.1.3に記載のように樹立したCD71+に関して濃縮されている細胞集団を用いた。また、いくつかの事例において、CD71+に関して濃縮されているK562集団のCD15+細胞(項目1.1.3)を用いた。
TC96ウェルプレートの少数のウェルを細胞ハイブリダイゼーションウェルとして用いた。各ウェルを約150μlのハイブリダイゼーション培地によって満たした。この培地は、240mMのソルビトール(Sigma)、2.0mMのKH2PO4(Sigma)、0.4mMのCaCl2(Sigma)、0.2mMのMg(C2H3O2)2(Sigma)および0.2mMのCa(C2H3O2)2(Sigma)を含んでおり、0.2%のウシ血清アルブミン、BSA(Sigma)によって補われていた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの前に、あらかじめ選択した細胞型の各クローンの細胞を一度ハイブリダイゼーション培地において数分間にわたって洗浄し、新鮮なハイブリダイゼーション培地を含んでいるウェルに移した。このウェルはプレハイブリダイゼーションウェルとして設計した。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、選択した各クローンの単一の洗浄した細胞を項目1.1.1にしたがって、3つの細胞(選択した各クローンから1つずつ)のみを1対の同一の平行な電極(ウェルの底に沈めた(図33において示されるように))の間に置くように操作した。電極の距離は400マイクロメートル(すなわち400μm)において設定した。
確立されたHTS−KMW細胞株上の系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
HTS−KMW細胞は、異なる6つの表現型の集団、詳細には:(1)CD15+CD19+CD4+;(2)CD15+CD19+CD4−;(3)CD15+CD19−CD4+;(4)CD15−CD19+CD4+;(5)CD15−CD19+CD4−;(6)CD15−CD19−CD4+にさらに分取された。
一例として、この種のHTSを、K562細胞に由来する不死化した1つの骨髄細胞、初代培養された1つのヒトB細胞および初代培養された1つのヒトT細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって生成した。この種のHTSをHTS−KBTと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
HTS−KBTのトリハイブリッドの生成前のK562細胞の調製については、上述の通りである(項目1.1.3)。(i)脾臓、末梢血または臍帯血に由来する成熟B細胞(CD19+);骨髄に由来する初期B細胞(CD20−CD72+);骨髄に由来する活性化B細胞(CD20+CD72+);臍帯血に由来する、抗原を経験したB細胞(CD19+CD5+)、および(ii)脾臓および末梢血に由来するヘルパーT細胞(CD4+)、脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性T細胞(CD8+);臍帯血に由来する、抗原を経験したT細胞(CD3+CD5+);臍帯血に由来するCD3+T細胞;胸腺に由来する二重陽性のT細胞(CD4+CD8+)を含んでいるKBT系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた初代培養された細胞を実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離は、項目1.3に上述されている。
HTS−KBTの確立のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにAC電界およびパルスを変更したことを除いて、HTS−KBTの確立のために用いたもの(項目3.1.2)と同様である。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、230mMのソルビトール、1.8mMのKH2PO4、0.5mMのCaCl2、0.2mMのMg(C2H3O2)2および0.3mMのCa(C2H3O2)2を含んでおり、0.3%のBSAによって補われていた。0.5MHzおよび65〜75kV/mのAC電界を、それぞれ100μ秒のパルス幅および175〜185kV/mの強度を伴う3秒間隔における3回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。3回目の方形波パルスの終了後、AC電界をさらに5秒間にわたって連続的に出力し、細胞のハイブリダイゼーションが系統交雑のトリハイブリッドを生成するという結果になった。
この新しく作り出した分化転換ハイブリッド細胞のインキュベーションおよびHTSトリハイブリッドの回復手順は、上述されている(項目3.1.2)。
確立されたHTS−KBT細胞上における系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
HTS−KBT細胞株を、例えば、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって樹立した後、この細胞株を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。ハイブリダイゼーション前の細胞の調製(項目1.3.3)についての記載と同様の手順を用いて、HTS−KBT細胞株の細胞をマウス抗ヒトCD19およびCD4抗体を用いて標識した。図10(d)は、1つの不死の骨髄単球細胞および初代培養された2つの細胞から樹立したHTS−KBT細胞株のFACSプロファイル(CD19およびCD4標識)を示す。代表的に、このような安定な系統交雑のトリハイブリッドにおける99%を超える細胞が、親である初代培養された細胞と同様の密度を伴って、BおよびT細胞の両方に関するCDマーカーを発現していた。
他の実施形態において、1つのK562細胞、抗原を経験した1つのB細胞および抗原を経験した1つのT細胞に由来するHTS−KBT細胞株を樹立した。HTS−KBTのこのバリアントをHTS−KBTAEと命名した。この細胞をFACSを用いてCD19、CD3およびCD5の共発現について分析した。
HTS−KBTAE細胞は、異なる6つの表現型の集団、詳細には:(1)CD3+CD19+CD5+;(2)CD3+CD19+CD5−;(3)CD3+CD19−CD5+;(4)CD3+CD19−CD5−;(5)CD3−CD19+CD5+;(6)CD3−CD19+CD5−にさらに分取された。
他の実施形態において、1つのK562、胸腺から単離した1つのT細胞(CD4+CD8+について二重陽性)および骨髄から単離した1つの活性化B細胞(CD20+およびCD72+)の細胞ハイブリダイゼーションに由来するHTS−KBT細胞株を樹立した。HTS−KBTのこのバリアントを、HTS−KBTDPと命名した。この細胞を細胞表面上におけるCD4、CD8、CD20およびCD72の共発現について分析した。
HTS−KBTDP細胞は、異なる15の表現型の集団、詳細には:(1)CD4+CD8+CD20+CD72+;(2)CD4+CD8+CD20+CD72−;(3)CD4+CD8+CD20−CD72+;(4)CD4+CD8+CD20−CD72−;(5)CD4+CD8−CD20+CD72+;(6)CD4+CD8−CD20+CD72−;(7)CD4+CD8−CD20−CD72+;(8)CD4+CD8−CD20−CD72−;(9)CD4−CD8+CD20+CD72+;(10)CD4−CD8+CD20+CD72−;(11)CD4−CD8+CD20−CD72+;(12)CD4+CD8+CD20−CD72−;(13)CD4−CD8−CD20+CD72+;(14)CD4−CD8−CD20+CD72−;(15)CD4−CD8−CD20−CD72+にさらに分取された。
一例として、骨髄に由来する初代培養された1つの骨髄性の前駆体、WIL2NS細胞株に由来する不死化された1つのヒトB細胞、および初代培養されたヒトT細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって、この種のHTSを作製した。
HTS−WTMの作製に使用したWIL2NSの調製については、項目1.1.3にすでに記載されている。脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーT細胞(CD4+)の初代培養された細胞をこれらの実験に使用した。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離についてはすでに記載されている(項目1.3)。初代培養された骨髄性の前駆細胞は項目1.2.2に記載されているCD34+CD15+骨髄単核球に由来する。
HTS−WTMの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地を変更したことを除いて、HTS−WTMの生成のために用いたもの(項目3.1.2参照)と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーションの培地は、235mMのソルビトール、1.8mMのKH2PO4、0.5mMのCaCl2、0.3mMのMg(C2H3O2)2および0.25mMのCa(C2H3O2)2(Sigma)を含んでおり、0.3%のBSAによって補われていた。項目3.2.2の記載とまったく同じ電気的な手順をWTMの生成のために用いた。この新しく作り出した各分化転換ハイブリッド細胞のインキュベーションおよびHTSトリハイブリッド回復の手順については、項目3.1.2に記載されている。
確立されたHTS−WTM細胞上における系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
WIL2NS細胞株に由来する不死化された1つのBリンパ球、初代培養された1つのT細胞、および1つの骨髄単球性の前駆体の細胞ハイブリダイゼーションに由来するHTS−WTM細胞株を通常の条件の下(項目1.1を参照)に6ヶ月間にわたって培養した後に、HTS−WTM細胞の集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。CD19(B系統)、CD4(T系統)、CD15(骨髄系統)およびCD34(前駆細胞)に関する表面マーカーの発現を分析した。要約すると、マウス抗ヒトCD19−PE抗体、マウス抗ヒトCD4−FITC抗体(BD Pharmingen)およびマウス抗ヒトCD15PerCP抗体の組合せ、またはマウス抗ヒトCD34−PE抗体、マウス抗ヒトCD4−FITC抗体およびマウス抗ヒトCD15−PerCP抗体の組合せを用いて、このHTS−WTM細胞株の細胞を標識した。上述の手法(項目1.3.3)にしたがって細胞の染色を実施した。CD34+CD15+骨髄単球性の前駆細胞に由来するHTS−WTM細胞の典型的な発現プロファイルが図13に示されている。HTS−WTMの約81%はB系統および骨髄単球性の表現型を共有しており(CD34+CD15+)、またCD4+細胞の34%はそれらの表面にCD34を維持しており、CD34+細胞の68%はCD15を発現していることが分析によって示された。興味深いことに、CD34およびCD15が同じ起源(骨髄単球性の前駆細胞)に由来するにもかかわらず、CD34+細胞の28%はCD15の発現を維持していない。
HTS−WTM細胞は、異なる6つの表現型の集団、詳細には:CD15、CD19およびCD4の発現に基づいて、(1)CD15+CD19+CD4+;(2)CD15−CD19−CD4−;(3)CD15+CD19−CD4+;(4)CD15−CD19+CD4+;(5)CD15−CD19+CD4−;(6)CD15−CD19−CD4+;またはCD15、CD34およびCD4の発現に基づいて、(7)CD15+CD34+CD4+;(8)CD15+CD34+CD4−;(9)CD15+CD34−CD4+;(10)CD15−CD34+CD4+;(11)CD15−CD34+CD4−;(12)CD15−CD34−CD4+にさらに分取された。
4.環境条件の変化による異なる細胞表現型へのHTS細胞の分化転換
この実施例は、細胞系統に許容性の環境または細胞系統を促進する環境への所定のHTS細胞のばくろを通じた、異なる表現型への細胞の分化転換の実現可能なモデルのいくつかを示している。
以下の亜集団:HTS−KMW.1、HTS−KMW.6、HTS−KBT、HTS−KBTAE.1、HTS−KBTAE.4、HTS−WTM.1、HTS−WTM.6、HTS−WTM.7およびHTS−WTM.12に由来しており、項目3.1.4、項目3.2.3.1、項目3.2.3.3および項目3.3.3.2に記載されているように作製されたHTS細胞、ならびにK562細胞、WIL2NS細胞およびMOLT4細胞の対照培養物を新たな培養培地に移し、細胞の濃度を1mlにつき250000細胞または500000細胞に調整した。10U/mlのヒトIL−2(BD Biosciences)、1ng/mLのヒトIL−1β(BD Biosciences)、10ng/mlのヒトIL−23(R&D Systems)、1μg/mlの抗IL−4、1μg/mlの抗IFN−γおよび細胞につき1ビーズの割合の抗CD3/CD28活性化ビーズ(Invitrogen)を細胞培養物に補い、U底の96ウェルプレート(Corning)に、ウェルにつき200μlにおいて播いた。0.1、1および10ng/mlにおける増加する濃度のTGF−βを一連の4つのウェルに加えた。3日目および5日目に培養培地を、すべてのサイトカインおよび抗体を含んでいる新たな培地に置き換えた。8日目に、抗CD4、抗CD19およびCD15を用いて細胞を、染色し、項目1.3.3に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。染色の前に50ng/mlのPMA、500ng/mlのイオノマイシンおよび1倍のBD GoldgiStopを用いて5時間にわたって細胞を活性化した。
CD4+T細胞に誘導されたHTS培養物から生成された単独陽性のCD4+細胞を、マーカー発現および機能的な性質決定のさらなる分析のために分取した。許容される純度はCD4+T細胞の全体集団の98%であった。
Tリンパ球許容性のHTS培養物に由来する単独陽性のCD4細胞を、CD4+T細胞の表面に限定的に発現されているか、またはCD8+T細胞の機能にとって重要な、細胞表面上における以下の分子の発現について、さらに分析した。当該分子は、TCRαβ−T細胞受容体;CD25−活性化T細胞によって発現されるIL−2受容体αであり、CD4との組合せにおいてCD4+T細胞の制御性サブセットを意味する;CD27−T細胞の共刺激に関与する;CD28−ナイーブT細胞の活性化を意味する;CD62L−ナイーブT細胞およびメモリT細胞上に発現され、ホーミングに関与する;CD69−活性化T細胞上におけるシグナル伝達分子;CD95−活性化によって上方制御される;CD45RO−活性化T細胞またはメモリT細胞を意味する、である。各マーカーの発現をCD4と組み合わせて評価した。この目的のために、項目1.3.3に記載の同じ手法に本質的にしたがって、マウス抗ヒトCD4−PEと、マウス抗ヒトCD25−FITC、マウス抗ヒトCD27−FITC、マウス抗ヒトCD62L−FITC、マウス抗ヒトCD69−FITCまたはマウス抗ヒトCD95−FITCとの組合せを用いて、細胞を染色した。表2には、異なるHTS培養物に由来するCD4+Tリンパ球の表現型プロファイルが要約されている。
T細胞許容性のHTS培養物から生成された単独陽性のCD4+細胞を、10ng/mlのリポ多糖(LPS)を用いた4日間にわたるポリクロナル活性化に続いく、IL−2、IL−4、IL−8、IL−10、IFN−γおよびTNF−αの産生について、さらに分析した。平底の96ウェルプレートの1ウェルにつき、200μlの完全培地における200000細胞を播いた。上清を取り出し、それぞれのELISAキット(すべてInvitrogenから購入した)によって分析した。表3はHTS培養物に由来するポリクロナル性に刺激されたCD4+におけるサイトカイン産生の典型的なプロファイルを表している。
以下のTHS集団:項目3.2.3.3に記載のHTS−KBTAE.1およびHTS−KBTAE.4;項目3.2.3.5に記載のHTS−KBTDP.1、HTS−KBTDP.4およびHTS−KBTDP.12に由来する細胞、ならびにK562の対照培養物を細胞傷害性のCD8+Tリンパ球の分化に使用した。
細胞傷害性のT細胞へと誘導されたHTS培養物から生成された単独陽性のCD8+細胞を、マーカー発現および機能的な性質決定のさらなる分析のために分取した。
Tリンパ球許容性のHTS培養物に由来する単独陽性のCD8細胞を、細胞傷害性T細胞の表面に限定的に発現されているか、またはCD8+T細胞の機能にとって重要な、細胞表面上における以下の分子の発現について、さらに分析した。当該分子は、TCRαβ−T細胞受容体;CD8αおよびCD8β(ここで、β鎖の下方制御は抗原ばくろ前を意味する);CD27−T細胞の共刺激に関与する;CD28−ナイーブT細胞の活性化を意味する;CD62L−ナイーブT細胞およびメモリT細胞上に発現され、ホーミングに関与する;CD95−活性化によって上方制御される;CD45RO−活性化T細胞またはメモリT細胞を意味する、である。まず、項目1.3.3に記載の手法に本質的にしたがって、抗ヒトCD8α−PE(BD Pharmingen)および抗ヒトCD8β−FITC(BD Pharmingen)を用いて、細胞を標識した。続く染色において、抗ヒトTCRαβ−FITC、抗ヒトCD27−FITC、抗ヒトCD28−FITC、抗ヒトCD62L−FITCまたは抗ヒトCD45RO−FITC(すべてBD Pharmingenから購入した)と組み合わせて、抗ヒトCD8β−FITCを使用した。表4には、異なるHTS培養物に由来するCD8+Tリンパ球の表現型プロファイルが要約されている。
THS培養物から生成された単独陽性のCD8細胞を、細胞内のIFN−γおよびIL−2の産生について分析した。この目的のために、50ng/mlのホルボールエステルおよび500ng/mlのイオナマイシン(ionamycyne)を用いた通常の培養条件において、Tリンパ球の条件におけるHTS培養物に由来する単独陽性のCD8細胞を刺激した。1時間後に、200ng/mlのブレフェルディンAを加え、15分間にわたって20℃の4%のパラホルムアルデヒドにおいて細胞を固定した。3回にわたる洗浄サイクルの後に、細胞を、サポニンを用いて透過化処理し、抗IL−2−PE(Pharmingen)、抗IFN−γーFITCまたは同位体対照を用いて染色した。図16は、HTS−KBTAE.4およびHTS−KBTDP.12の培養物の単独陽性のCD8細胞における細胞内のIL−2およびIFN−γの典型的なプロファイルを示している。両方の培養物はIL−2、IFN−γまたはその両方を産生している細胞を含んでおり、HTS−KBTDP.12培養物は、HTS−KBTAE.4培養物が広範囲のIFN−γ濃度を有しているのに対して、IL−2について広範囲の産生レベルを有していた。
細胞内の細胞傷害性の顆粒の産生は、最終分化したT細胞を示す主なエフェクター機能である。細胞内の細胞傷害性の顆粒の検出のために、Tリンパ球許容性の条件におけるHTS培養物に由来する単独陽性のCD8細胞を、4%のパラホルムアルデヒドを用いて15分間にわたって20℃において固定した。洗浄後に、細胞を、サポニンを用いて透過化処理し、抗パーフォリン−PE抗体(BD Pharmingen)および抗グランザイムA−FITC抗体、同位体対照を用いて染色した。図17は、HTS−KBTAE.4およびHTS−KBTDP.12の培養物の単独陽性のCD8細胞における細胞内のパーフォリンおよびグランザイムAの典型的なプロファイルを示している。両方の内容物は、機能的に分化した細胞傷害性T細胞を示すパーフォリン、グランザイムAまたはその両方のいずれかについて陽性の細胞を含んでいた。両方の培養物における単独のCD8陽性細胞の約40%がそのような表現型を獲得していた。
以下のHTS集団:項目3.1.4に記載のHTS−KMW.1およびHTS−KMW.5;項目3.2.3.1に記載のHTS−KBT;項目3.2.3.3に記載のHTS−KBTAE.1およびHTS−KBTAE.6;項目3.2.3.5に記載のHTS−KBTDP.1およびHTS−KBTDP.13;項目3.34に記載のHTS−WTM.1およびHTS−WTM.7に由来する細胞、ならびにK562、WIL2NSおよびMOLT4の対照培養物を、ヒトの骨髄ストロマ細胞株HS−5の存在下におけるBリンパ球の分化に使用した。4mMのL−グルタミン、1.5g/Lのジカルボン酸ナトリウムおよび10%(v/v)のFCSを補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において、HS−5細胞を定法にしたがって維持した。分化実験の1日前または2日前に、HS−5細胞を、24ウェルのプレートの、1mlの培養培地の入ったウェルごとに60000細胞、または平底の96ウェルプレートの、100μlの培養培地の入ったウェルごとに6000細胞においてに播いた。HS−5成長培地の除去、ならびに24ウェルのプレートの、1mlのウェルごとに1000〜4000細胞、および96ウェルプレートの、100μlのウェルごとに100細胞において、選択したHTS細胞の集団を播くことによって、Bリンパ球分化の共培養を開始した。Bリンパ球系統を促進する添加剤、特に可溶性の4ng/mlのCD40L(Invitrogen)、10ngのヒトIL−4(Invitrogen)、5ng/mlのヒトIL−5(Invitrogen)、10ng/mlのヒトIL−6(Invitrogen)、10ng/mlのIL−10(Invitrogen)、5ng/mlのヒトIL−2(Invitrogen)、20ng/mlのIL−7(Invitrogen)、20ng/mlのFit3リガンド(Invitrogen)、20ng/mlの幹細胞由来因子(BD Bioscience)、10ng/mlのヒトIL−3(Invitrogen)および5μg/mlの抗CD40mAbのアゴニスト(クローンHM40−3、BD Bioscience)を、標準的な培養培地に補った。5日目および7日目に、培養培地をBリンパ球系統を促進する添加剤を補った新たな培地に交換した。HTS−KMW.1、HTS−KMW.5、HTS−KBT、HTS−WTM.1、HTS-WTM.7ならびにK562、MOLT4およびWIL2NSの対照培養物に由来する吸着しなった細胞を、回収し、マウス抗ヒトCD4−FITC、マウス抗ヒトCD19−PEおよびマウス抗ヒトCD15−PerCPを用いて染色し、項目1.3.3に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。図18は、Bリンパ球に分化を誘導された後の、100%のCD19+細胞を有しているHTS−KBTAE.6の典型的な染色プロファイルを示している。HTS−KBTAE.1およびHTS−KBTAE.6の場合に、抗ヒトCD4−FITCの代わりに抗ヒトCD3−FITCを用いて、吸着しなかった細胞を染色した。HTS−KBTDP.1およびHTS−KBTDP.13の培養物について、マウス抗ヒトCD20−PEを抗CD19−PEの代わりに用いた。
Bリンパ球のHTS培養物に由来する単独陽性のCD19細胞を分取し、B特異的な転写物および機能的な特性(例えば、免疫グロブリンの分泌およびプラズマ細胞への分化)の存在、B細胞マーカーについてさらに分析した。
Bリンパ球に関して促進されたHTS培養物に由来するCD19+細胞を、B細胞の表面上に限定的に発現されているか、またはB細胞の機能にとって重要な以下の分子の発現についてさらに分析した。当該分子は、CD1c−抗原提示における特殊な役割を有している、β2−ミクログロブリンと会合するMHCクラスI様分子;CD10−B細胞の発生に関与している亜鉛金属プロテアーゼ;CD20−B細胞活性化分子;CD22−単球およびT細胞とのB細胞の相互作用を担っている成熟B細胞上に発現されている接着分子;CD38−細胞活性化;CD40−アポトーシスからのB細胞の開放、およびアイソタイプ転換に関与するB細胞の分化および共刺激である;表面IgMおよびIgG、である。
14日目に、3.5mg/mlのリポ多糖(Sigma)に培養物をさらして、Bリンパ球を活性化させ、プラズマ細胞の形成を誘導した。96ウェルのELISAプレート、およびヒトμ鎖およびγ鎖に対する親和性精製された、プラスティックに吸着させたヤギ抗体を用いた標準的なELISAによって、すべてのHTS−Bリンパ球の培養物について、分泌されたIgMおよびIgGを定量化した。HRPを結合させたヒツジ抗ヒトIg抗体を用いて、結合した抗体を顕示化した。使用したすべての抗体はSigmaから入手した。ABTSを基質として使用し、405nmにおける吸光度を測定した。表6には、LPSばくろ後のCD19+細胞の表現型プロファイルが示されており、表7には、7日後および17日後におけるBリンパ球培養物において検出されたIgMおよびIgGのレベルが要約されている。
以下の亜集団HTS−WTM.4に由来しており、項目3.3に記載されているHTS細胞およびWIL2NSの対照培養物を新たな培養培地に移し、細胞濃度を1mlにつき100000〜200000細胞に調整した。50ng/mlのヒトIL−7(Invitrogen)、50ng/mlのヒトIL−6(Invitrogen)、10ng/mlのヒトIL−3(Invitrogen)、100ng/mlのヒトM−CSF(BD Bioscience)、30ng/mlのヒトGM−CSF(BD Bioscience)および50ng/mlのFit3L(Invitrogen)を細胞培養物に補い、当該細胞培養物を平底の24ウェルプレートの1ウェルにつき1mlにおいて播いた。3〜4日ごとに、新たな培養培地を培養培地の半分と置き換えることによって、新たな培養培地を継ぎ足した。図19は8日後におけるHTS培養物の形態を示しており、ここで、細胞を接着細胞の成長特性について評価した。
HTS細胞から生成されたマクロファージを、他のマクロファージ系統のマーカーおよび機能的な能力の発現についての分析に供した。
また、ヒトマクロファージを排他的に特徴付ける単一のマーカーがないので、マクロファージ系統の特徴であるCD11b、CD86、CD64、CD14およびCD115の発現について、HTS細胞から生成された接着性の細胞をさらに分析した。この目的のために、抗ヒトCD11b−PE抗体、抗ヒトCD86−FITC抗体、抗ヒトCD64−FITC抗体、抗ヒトCD14−PE抗体および抗ヒトCD115−PE抗体(BD Pharmingen)を用いて、マクロファージに関して促進されたHTS培養物を標識した。CD115−PE抗体を除くすべてのマーカーについての実質的に同じ染色手法は、項目1.3.3の記載にしたがった。M−CSFの、その受容体CD115に対する結合は、受容体の内部移行を生じ、したがって表面染色の強度を低減させ得る。したがって、表面および細胞内のCD115が評価され得るように、抗CD115−PEを用いた染色の前に、細胞を、固定し、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)を用いて透過化処理した。マクロファージ許容性の培地においてから8日後に細胞表面上におけるマクロファージ様因子の発現について、5つの別の培養物を分析した。図21には、HTS細胞上におけるマクロファージ様CDマーカーの分布(平均±標準偏差)が要約されており、ここで、約96%の細胞がCD11bについて陽性であり、95%の細胞がCD64について陽性であり、61%の細胞がCD86について陽性であり、56%の細胞がCD14について陽性であり、42%の細胞がCD115について陽性であった。これらのマーカーのいくつかが顆粒球および樹状細胞(DC)上において種々のレベルとして発現され得ることを考えて、ヒトのCD1a、CD83、CD15およびCD3についてのついての付加的な染色を、項目1.3.3に記載の手法を用いて実施した。染色は、わずかに認められた(CD15)か、認められなかった。これらの結果は、マクロファージ許容性の培地に移されると、HTS細胞がマクロファージの機能(例えば、吸着(CD11b)、増殖(M−CSFにとっての受容体であるCD115)、食作用(CD86)および免疫食作用(IgGにとっての受容体であるCD64))にとって決定的な表面分子を獲得することを示している。
機能的な特性を評価するために、HTSにおいて生成されたマクロファージを、食作用能および一酸化窒素(NO)の生成についてさらに分析した。
5.成熟した表現型の細胞とのハイブリダイゼーションによる異なる細胞表現型へのHTS細胞の分化転換
HTSの汎用性および利用される機序に対する非感受性をさらに証明するために、HTS細胞を、成熟エフェクターT細胞または成熟エフェクターB細胞とハイブリダイズした。また、異なる表現型の細胞を分化転換させるために、同じ方法が使用され得る。
HTS亜集団に由来するB細胞を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したCD54+T細胞への分化転換に使用した。詳細には、項目3.1.4に記載のHTS−KMW.5(単独のCD19+細胞)、項目3.2.3.3に記載のHTS−KBTAE.6(単独のCD19+細胞)、および項目3.2.3.5に記載のHTS−KBTDP.13(CD20+CD72+細胞)に由来する細胞を、この特定の実施例における分化転換に使用した。項目1.3.8に記載の通りに単離した、初代培養されたヒトCD54陽性T細胞を、CD54+T細胞の供給源として使用した。ハイブリダイゼーション手法は対応するHTSの作製のために使用された手法(項目3.1.2を参照)と本質的に同じであった。生じた混成体が安定した後に、それらを、標準的な培養条件の下に細胞株として維持し(項目1.1を参照)、項目1.3.3に記載の手法にしたがって表面マーカー発現について分析した。すべてのB細胞の亜集団は、それらのCD19+を消失して分化転換し、図24Aにおける代表的な例による証拠としてCD3+になった。それらをCD54発現についてさらに分析した。簡単に説明すると、項目1.3.8(CD54+T細胞の単離)に記載と同じ手法にしたがって、マウス抗ヒトCD54−FITC抗体およびマウス抗ヒトCD3−PE抗体を用いて、100μlの分取物につき1×105細胞を標識した。CD54について陽性の細胞の数は図24(B)に示されているように42〜85%の範囲であった。
以下のHTS亜集団に由来するT細胞を免疫グロブリン(Ig)分泌細胞への分化転換に使用した。この目的のために、項目3.1.4に記載のHTS−KMW.6(単独のCD4+集団)、項目3.2.3.3に記載のHTS−KBTAE.4(単独のCD3+集団)、項目3.2.3.5に記載のHTS−KBTDP.4(CD4+CD8+集団)を使用した。項目1.4に記載の通りに単離した、CD40活性化の初代培養されたIgM陽性B細胞またはIgG陽性B細胞を、初代培養された分泌B細胞の供給源として使用した。電気的な細胞ハイブリダイゼーション手法は、項目3.1.2に記載されているような対応するHTSの作製に使用した手法と本質的に同じであった。生じた混成体が安定した後に、それらを、維持し、CD19、CD40および表面Igについて分析した。すべてのHTS亜集団はそれらのT細胞マーカー(CD3、CD4およびCD8)を消失して分化転換し、CD19、CD40およびsIgの陽性細胞になった。図25は、CD3発現の消失および表面IgMの獲得を示しているCD40活性化のIgM陽性B細胞とのハイブリダイゼーションの後における分化転換したCD3+HTS−KBTAE.4細胞の代表的な例を示している。
6.環境条件の変化へのばくろを介した、HTS細胞に由来する成熟Bリンパ球の脱分化
項目4.3.1.1に記載されている通りにBリンパ球を促進する環境において培養され、HTS−WTM.1およびHTS−WTM.7に由来するCD19+細胞は、他のBリンパ球マーカーの発現について調べたとき、低い程度に成熟したB細胞種への脱分化の徴候(特にCD10発現の上方制御および表面IgG発現の下方制御)を示した(項目4.3.1.1)。これらの培養物において惹起された脱分化過程を確認するために、項目7.1に記載の造血性の幹細胞を促進する環境に細胞を置き、そのような培養の5日後に、初期の他のB細胞マーカー(例えば、Pax−5、λ様およびCD34)の転写物の存在について確認した。
ヒトβ2ミクログロブリン:センス、
54℃における5’ACCCCCACTGAAAAAGATGA3’(配列番号1)、およびアンチセンス、5’ATCTTCAAACCTCCATGATG3’(配列番号2);CD34:64℃におけるセンス、5’CTCTTCTGTCCAGTCACAGACC3’(配列番号3)、およびアンチセンス、5’GAATAGCTCTGGTGGCTTGCAA3’(配列番号4);CD10:65℃におけるセンス、5’CTGTGACAATGATCGCACTCTATG3’(配列番号5)、およびアンチセンス、5’GATTCCAGTGCATTCATAGTAATCTC3’(配列番号6);λ様:67℃におけるセンス、5’ATGCATGCGGCCGCGGCATGTGTTTGGCAGC3’(配列番号7)、およびアンチセンス、5’ATCCGCGGCCGCATCGATAGGTCACCGTCAAGATT3’(配列番号8);Pax−5:64℃におけるセンス、5’AGCAGGACAGGACATGGAGGA3’(配列番号9)、およびアンチセンス5’ATCCTGTTGATGGAACTGACGC3’(配列番号10);CD19:67℃におけるセンス、5’TCACCGTGGCAACCTGACCATG3’(配列番号11)、およびアンチセンス5’GAGACAGCACGTTCCCGTTACTG3’(配列番号12);VHコンセンサス−Cμ:60℃におけるセンス、5’GACACGGCCGTGTATTACTG3’(配列番号13)、およびアンチセンス、5’ATCCGCGGCCGCGGAATTCTCACACAGGAGAC-GA3’(配列番号14);Vkコンセンサス、:67℃におけるセンス、5*ATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG3*(配列番号15)、およびアンチセンス5’ATGCGGCCGCGGGAAGATGAAGACAGATG3’(配列番号16)。
7.体細胞ハイブリダイゼーションを介した、HTS細胞に由来する異なる表現型の成熟細胞の脱分化
HTSのさらなる可塑性を証明するために、種々のHTS培養物に由来する、表現型について区別される亜集団を、初期の造血性幹細胞との体細胞ハイブリダイゼーションを介した脱分化に供した。CD34+の骨髄幹細胞を項目1.2.2に記載のように選択した。体細胞ハイブリダイゼーションのための実質的に同じ手順を、項目3.1.2に記載のように利用した。
Bリンパ球を促進する環境において成長させたKBTAE.6およびKMW.5の培養物に由来するB細胞を、この特定の例に使用した。両方の培養物におけるすべての細胞の100%がCD19+陽性であるような純度について、培養物を選択した。Bリンパ球促進環境にさらした後のこれらの培養物のマーカー発現プロファイルは、表5にまとめられている(項目4.3.1.1を参照)。KMW.5はHTSの生成に使用された3つの細胞のすべてが不死化の表現型を有していた場合を代表しており、KBTAE.6は、不死化の骨髄性の前駆細胞、初代培養されたBリンパ球および初代培養されたTリンパ球に由来していた。骨髄に由来するCD34+幹細胞とのハイブリダイゼーションの後に、20ng/mlのヒトIL−6、300ng/mlのヒトSCF、100ng/mlのヒトfms様チロシンキナーゼ3リガンド(hFT3L)、20ng/mlのヒトトロンボポエチン(hTPO)、および60ng/mlのヒトIL−3を補った標準的な培養培地において、HTS培養物を成長させた。培養の1ヶ月間後に、CD34およびCD130、ならびに項目4.3.1.1に記載のBリンパ球関連マーカーの発現について、細胞の集団を分析した。骨髄からのCD34+細胞の単離について記載されている通りの同じ方法を利用して(項目1.2参照)、項目1.2.2に記載の同じマウス抗体ならびにマウス抗ヒトCD34−PEおよびマウス抗ヒトCD130−FITCを用いて、細胞を標識した。表9には、脱分化開始後における細胞のCDプロファイルがまとめられている。
Tリンパ球を促進する環境において成長させたKMW.6の培養物に由来するCD4+細胞を、この特定の例に使用した。培養物におけるすべての細胞の100%がCD4+陽性であるような純度について、培養物を選択した。Tリンパ球を促進する環境にさらした後のこれらのHTS培養物のマーカー発現プロファイルは表2にまとめられている(項目4.1.1.1参照)。骨髄に由来するCD34+幹細胞とのハイブリダイゼーションの後に、造血幹細胞(HSC)の成長を促進する種々のサイトカインを補った標準的な培養培地において、HTS培養物を成長させた(項目7.1参照)。HSC環境における1ヶ月間の後に、CD34およびCD130、ならびに項目4.1.1.1に記載のCD4+T細胞関連マーカーの発現について、細胞を分析した。以下の表10には、脱分化したCD4+細胞の表面上におけるCD発現のプロファイルが示されている。
細胞の大部分は、それらのCD4およびTCRの発現を消失し、CD25の発現について上方制御を受け、CD34の発現を獲得していた。
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Claims (35)
- 所定の表現型の細胞を生成する方法であって、
骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞をハイブリダイズして、表現型の可塑性を示すハイブリッド細胞を製造する工程、ならびに
当該ハイブリッド細胞を所定の環境にさらし、上記所定の表現型の細胞にする工程を包含しており、
上記所定の環境は、胸腺のストロマ細胞、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンド、またはこれらの組合せを含んでおり、
上記所定の表現型は、B細胞、T細胞および骨髄性細胞からなる群から選択されるか、または上記ハイブリッド細胞に関連する脱分化した表現型であり、
上記脱分化した表現型は、CD34、CD10、Pax−5またはλ様の少なくとも1つの発現を包含している、方法。 - 上記第2の細胞がBリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第3の細胞がTリンパ球系統に由来する細胞である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、骨髄性単球の前駆体、単核球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、または好塩基球である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のCD抗原:CD16、CD15またはCD14の少なくとも1つを提示している、請求項1に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単核球である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は骨髄性単球の前駆体である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血、または骨髄に由来するものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレB細胞、未成熟なB細胞、ナイーブB細胞、活性化B細胞、またはエフェクターB細胞である、請求項2に記載の方法。
- 上記エフェクターB細胞はプラズマ細胞または抗原を経験したB細胞である、請求項9に記載の方法。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のCD抗原:CD19、CD20、CD72またはCD5の少なくとも1つを提示している、請求項2または9に記載の方法。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレT細胞、未成熟なT細胞、ナイーブT細胞、活性化T細胞またはエフェクターT細胞である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のCD抗原:CD3、CD4、CD5またはCD8の少なくとも1つを提示している、請求項2または12に記載の方法。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項2〜13のいずれか1項に記載の方法。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項2〜14のいずれか1項に記載の方法。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである、請求項2〜13のいずれか1項に記載の方法。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである、請求項2〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 上記リンパ組織は、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺、および領域リンパ節から選択される、請求項16または17に記載の方法。
- 上記細胞の少なくとも1つはヒト細胞である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 上記細胞の少なくとも1つはマウス細胞である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞はK562細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記第2の細胞または第3の細胞はWIL2NS細胞またはMOLT4細胞である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞はWIL2NS細胞である、請求項2に記載の方法。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞はMOLT4細胞である、請求項2に記載の方法。
- 上記第1の細胞はK562細胞であり、上記第2の細胞はWIL2NS細胞であり、上記第3の細胞はMOLT4細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記第1の細胞はK562細胞であり、上記第2の細胞は初代培養されたB細胞であり、上記第3の細胞は初代培養されたT細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記B細胞およびT細胞はCD5を発現している、請求項26に記載の方法。
- 上記B細胞はCD20およびCD72を発現しており、上記T細胞はCD4およびCD8を発現している、請求項26に記載の方法。
- 上記第1の細胞は初代培養されたヒト単核球であり、上記第2の細胞はWIL2NS細胞であり、上記第3の細胞は初代培養されたT細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記第1の細胞は初代培養されたヒト骨髄単核球性の前駆体であり、上記第2の細胞はWIL2NS細胞であり、上記第3の細胞は初代培養されたヒトT細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記第1の細胞はK562細胞であり、上記第2の細胞はWIL2NS細胞であり、上記第3の細胞は初代培養されたT細胞である、請求項1に記載の方法。
- 上記ハイブリッド細胞が、幹細胞とさらにハイブリダイズされている、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 上記サイトカインまたは成長因子は、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−1β、IL−7、IL−23、TGF−β、M−CSF、GM−CSF、およびIFN−γからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 上記免疫グロブリンは、抗IL−4、抗IFN−γ、および抗CD3/CD28からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 上記受容体リガンドはFlt3リガンドまたはCD40リガンドである、請求項1に記載の方法。
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