KR20120046157A - 표현형적 유연성을 나타내는 세포 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본원 발명은 세포 분화 그리고, 특히 표현형적 유연성을 나타내는 하이브리드 세포들 및 이들 세포들의 제조 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 원하는 표현형을 갖는 특정 세포들의 제조 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 보다 초기의 기원세포 단계로 탈-분화 할 수 있는 능력을 갖는 하이브리드 세포들의 제조 방법에 관련된다. 본 발명은 또한 예컨대 조직 생성(tissue generation) 같은 범주 내에서의 상기 하이브리드 세포들의 용도에 대한 것이다.
Description
본원 발명은 세포 분화 및, 특히 표현형적 유연성을 나타내는 하이브리드 세포들 그리고 이들 세포들을 제조하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 원하는 표현형의 특이적 세포들을 발생시키는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 보다 초기의(earlier) 기원세포(progenitor) 상태로 탈-분화하는 능력을 갖는 하이브리드 세포를 제조하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 일정 범주의 용도, 예컨대 조직 발생에 하이브리드 세포들을 사용하는 것과 관련된다.
명세서 전체에서 선행기술에 대한 여하한 논의는 이에 대한 자인을 의미하는 의도는 해석되어서는 안 되며, 그러한 선행기술은 널리 알려져 있거나 이 분야의 공통의 일반적 지식의 일부를 형성한다.
줄기 세포의 신체 조직 재생 능력 및 세포성 줄기 세포 분획의 독특한 유연성에 대한 연구 결과들은 표적 조직의 복구 가능성에 대한 문을 열었다. 조혈 줄기 세포들 (HSCs)은 자기-재생 능력 및 특수한 마이크로환경에 노출됨에 따라 다양한 특화된 혈액 세포 타입들 [계통들(lineages)]로 발생하는 잠재력 양쪽 모두를 나타낸다. 상이한 혈액 세포들의 분화 과정, 즉 조혈(hematopoiesis)은 척추동물에서 어떻게 유전적 프로그램이 수립되고 실행되는지, 그리고 또한 백혈병들에서 어떻게 혈액 생성의 조혈 과정이 변경되는지에 대한 소중한 모델을 제공한다. 최근의 연구 결과는 어떻게 이것이 달성되는지를 나타낼 뿐만 아니라 생체 내에서의 조직 줄기 세포들의 비상한 유연성을 나타내는지를 보여준다.
조혈(Hematopoiesis)은 통상적으로 계급적(hierarchical) 방식으로 묘사되는데, HSCs가 먼저 기원세포들(progenitors)를 만든 다음 다중 또는 단일 계통의 경로로 분화되어가는 다양한 능력을 갖는 전구세포들(precursors)을 만든다. 특정 계통으로 구속되는 세포들의 유연성을 조사한 연구 결과, 계통 변환(lineage switching) 과정은 형질전환(transformation) 및/또는 종양유전자들의 발현을 요구한다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 계통 변환의 증거가 관찰되는 경우, 단지 세포의 적은 퍼센트에서만 일어난다는 것이 밝혀졌다. (Klinken et al, Cell 53: 857-867, 1988; Graf et at, Blood 99: 3089-3101, 2002).
특히, 5-아자사이티딘으로 처리된 어벨슨(Abelson) 바이러스 형질전환된(transformed) 프리-B 림포마 세포 라인으로의 실험에서는 식작용(phagocytic) 및 에스테라제 활성은 물론 플라스틱에 부착하는 능력을 포함하는, 대식세포-유사 성질을 나타내는 세포들의 아군(subset)이 도출되었다. (Boyd et al, Nature 297:691-693, 1982). 보다 최근의 실험에서는 B 림포마 세포 라인들 또는 프리-백혈병 골수 B 계통 세포들에서 E-myc 및 v-raf 종양유전자들의 공동 발현(concomitant expression)이 그들의 대식세포들로의 발현을 초래할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 형질도입된(transfected) 대식세포-유사 세포들은 다중의 골수세포 마커들, 이를테면 콜로니 자극 수용체-1,를 가공하며 리소자임을 발현하고 뿐만 아니라 또한 원래 세포들의 특성들, 이를테면 이뮤노글로불린 재배열,을 유지한다. 대식 세포들로의 전이(transition) 이외에, B-계통 세포들은 또한 max 유전자로 형질 도입(transfection)에 의하여 과립구들로 전이되는 것으로 보고되었다. (Lindeman et al, Immunity 1: 517-527, 1994). 중요한 것은, 트랜스-유전자들을 발현하는 세포들의 오직 소 분획만이 실제로 계통 변환되며, 이것은 한 계통으로부터 다른 계통으로의 전이가 완전히 이해되지 않은 복잡한 과정이라는 것을 지시한다. (Klinken et al, Cell 53: 857-867, 1988; Borzello et al, Mol. 세포 Biol. 10:2703-2714, 1990).
조혈의 계통 유연성을 조사하는 대안적인 실험적 접근방법은 유전자-녹아웃 마우스의 발생과 관련된다. 특히, Pax-5 녹아웃 마우스에서 유래된 B 계통 세포들은 프리-B 세포들 특성들, 이를테면 B220, AA4.1, SL 사슬 및 c-Kit (낮음)의 발현, 그러나 CD19는 아님, 을 나타내었다. 이들 세포들은 또한 만능(pluripotent) 줄기 세포들의 특성들, 이를테면 인터류킨 7 (IL-7)의 존재 하에 기질세포들 상에서 연속적 자기-재생, 이식 후 골수로의 홈잉(homing), 그리고 생체 내 및 시험관 내 모두에서 대부분의 조혈 세포 타입들로의 분화 능력, 을 나타내었다. 예컨대, RAG2 녹아웃 마우스로 이식되는 경우 이들 세포들은 T 세포들로 분화된다. (Rolink et al, Nature 401:556-562, 1999). 상이한 사이토카인들 또는 성장 인자들의 존재 하에서 성장되는 경우, 이들은 상이한 세포 타입의 범주로 분화되었다. 예컨대, IL-2로의 처리는 자연 킬러 세포(NK 세포)들로의 전환을 초래하였고, CSF-1 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)로의 처리는 수지상 세포들로의 전환을 초래하였으며, CSF-1로의 처리는 대식세포들로의 전환을, IL-3, IL-6, 줄기 세포 인자 (SCF) 및 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)로의 처리는 호중구들로의 전환을 초래하였다 (Nutt et al, Nature 401: 556-562, 1999).
비록 Pax-5 녹아웃 마우스로부터 유래된 세포들로부터 유연성이 입증된 것으로 보이지만, Pax-5 녹아웃 프리-B 세포들에 상당하는 표현형을 나타내는 세포들이 대부분 야생형 타입 동물들에는 존재하지 않기 쉬운데, 이는 야생 타입 마우스로부터의 프리-B 세포의 배양이 어렵기 때문이다. (Kee et al, Curr. Opin. Immunol. 13: 180-185, 2001).
유전형질전환 마우스를 사용하여 공통 림프계 기원세포 (CLPs)의 유연성을 조사하는 다른 연구에서는, 인간 IL-2 수용체 β사슬을 이소적으로(ectopically) 발현하는 유전형질전환 마우스 라인으로부터의 CPLs가, IL-7의 존재 하에서 기질 세포들 상에 배양하는 경우, B 세포들 및 NK 세포들로 분화된다는 것을 보여주었다. IL-2가 배지에 첨가되는 경우, 그들은 과립구들 및 대식세포들을 형성하였다. 그러나 이들 결과들은 동일 조건 하에서 성장한 대조군 CLPs로부터는 재현될 수 없었다. (Kondo et al, Nature 407: 383-386, 2000). 따라서, 이들 연구들의 결과들은 세포 유연성을 유도하는 것은 구속된 세포들에 의하여 정상적으로 발현되지 않는 유전자들을 발현시키는 것이 필요하다는 것을 제안하는 것으로 보인다.
전술한 연구들에서 설명한 표현형적 유연성을 나타내는 세포들은 마우스 림포마들로부터 유래되었거나, 종양유전자에 의하여 형질전환되었거나, 또는 돌연변이에 의하여 변경된 것들 중 하나이다. 정상 B-세포들의 유연성에 대하여는 제한된 데이터가 존재한다. 한 세트의 실험들이, IL-3, IL-6 및 GM-CF로 배양되는 경우, 성체 마우스의 골수로부터의 CD19, DJ-재배열 양성 그리고 B220 음성 B 세포들의 부착성 대식세포 유사 세포들로의 전환을 개시하였다. 그러나, NK 또는 T 세포들로의 전환은 달성이 불가능하였다. (Montecino-Rodriguez et al, Nat. Immunol. 2: 83-88, 2001).
골수계 계통으로부터 B 림프계계통으로의 역 형질전환에 대하여는 매우 제한적인 데이터만이 입수 가능하다. 수행된 실험들은 E2A, EBF 및 RAG 유전자에 의하여 인코드된 초기 B 계통 특이적 전사(transcription) 인자들의 강제 발현과 주로 관련된다. 예컨대, E2A의 강제 발현은 이 세포들이 그들의 고유의 특성들을 잃게 하며, Mac-1 및 c- frm 의 발현을 하향 조절하고(down-regulate), 다수의 B 계통 특이성 유전자들을 유도하게 하는데, 마이토겐들에 반응하여 κ사슬을 형성하는 능력을 포함한다. (Kee et al, J. Exp. Med. 188: 699-713, 1998). 이들 세포들이 완전한 B-계통 표현형을 획득하지 못하였다는 사실은 E2A, EBF, 및 RAG 유전자 발현들의 조합이 계통 특성화(specification)에 충분치 못하며 추가적 유전자들이 관련되어야 함을 제안한다. (Romanow et al, Mol. 세포 5: 343-353, 2000).
T-계통 및 대식세포들 사이의 가능한 전환에 대한 예시들 또한 존재한다. 가슴샘버팀질세포 라인으로부터의, 컨디션된 배지에서 배양되는 경우, 정제된 프로-T 세포들의 아군은 기능성(functional) 대식세포들로 발생되었다. 동일한 전환이 IL-6, IL-7 및 대식세포 콜로니-자극 인자의 조합의 존재 하에서 관찰되었으나 (M-CSF; CSF-1), 빈도는 상당히 낮았다. (Lee et al, J. Immunol. 166: 5964-5989, 2001).
대부분의 개시된 교차분화는 논란의 여지는 있으나 골수계-적혈구의 분획 내에서의 유연성이다. 이 분야에서 대부분의 실험은 강제적인 전사 인자 발현에 기초한다. 한 계통에서 다른 계통으로의 배양된 세포 라인들의 직접 분화를 허용하는 가장 재현성 있고 예측 가능한 실험 시스템은 Myb-Ets-엔코딩 백혈병 바이러스에 의한 조류 적혈구의-거대핵세포 기원세포들의 형질전환에 기초한다. 이들 E26-MEP 세포들은 다수의 거대핵세포성 및 줄기 세포 표면 마커들, 이를테면 MEP21/트롬보뮤신(thrombomucin) /PCLP1 및 GPIIaIIb/CD41, 을 발현함은 물론(Graf et al, Cell 70:201-213, 1992; McNagny et al, J. Cell. Biol. 138:1395-14-7, 1997) GATA-1 및 FOG-1을 발현하나, 골수 단구 세포의 세포 표면 마커들은 발현하지 않으며, 그리고 PU.1, C/EBPα및 C/EBPβ는 발현하지 않거나 농도가 낮았다. 만약 v-Ets가 이들 세포들에서 불활성화되면, 이들은 적혈구의 세포들로 분화된다. (Golay et al, Cell 55: 1147-1158, 1987; Rossi et al, Curr. Biol. 6: 866-872, 1988). 대안적으로, Myb의 불활성화는 이들 세포들이 트롬보사이트들로 전환되는 것을 리드한다. (Frampton et al, EMBO J. 14: 2866-2875, 1995). 레트로바이러스(retroviral) 형질전환을 통한 ras 경로의 종양 유전자들의 도입을 통하여 또는 단백질 키나아제 C (PKC)의 활성화에 의하여 세포들은 신호의 강도에 따라 호산구들 또는 골수아세포(myeloblasts)들 중 어느 쪽이 되도록 구속될 수 있다. (Graf et al, Cell 70:201-213, 1992; Rossi et al, EMBO J. 15: 1894-1901, 1996).
멀티-분화능(multi-potent) 또는 분화된 상태의 유지는 진행중인(on-going) 과정의 결과이며 단일 (또는 소수의) 핵 조절제들의 활성화 또는 억제가 분화, 계통 변환 또는 탈-분화를 일으킬 수 있다는 것은 널리 알려져 있다. (Orkin, Nature Rev. Genet. 1: 57-64, 2000). 본원에서, 특정 계통에 대한 그들의 발현이 한정된 핵 전사 인자들의 연구가 특히 관심 대상인데, 이는 그들이 세포 다양화(diversification)에 고유한 유전자 발현 프로그램을 수립하기 때문이다. 지속되는 조혈, 세포 생존 및 증식을 위하여 성장 인자들이 중요한 반면, 이들은 경로 분화에 대하여 반드시 도움이 되지는 않는다. (Sokolovsky et al, Pr℃. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6573-6575, 1998; Stoffel et al, Pr℃ Natl. Acad. Sci. USA 96: 698-702, 1999).
계통 분화의 복잡성이 주어진 인자가 발현되는 농도 또는 수준이 계통 분화의 방향에 영향을 줄 것이라는 것을 지시하는 연구에 의하여 추가로 설명되었다. 특히, 형질전환된 닭의 기원세포 시스템에서 (Kulessa et al, Genes Dev. 9: 1250-1262, 1995), 계통 결과(outcome)는 GATA-1 발현 수준과 상관되었다. 낮은 수준에서, 호산구들로 발생되었으며 높은 수준에서는 적혈구 및 거대핵 세포들로 생산되었다. 최근에는, 높은 수준의 PU.1가 대식세포들의 발달에 유리하며, 반면 낮은 수준에서는 B 세포들이 발생된다는 것이 밝혀졌다. (DeKoter et al, Science 288: 146-149, 2000).
또한 HSCs가 조직의 상이한 타입들에 기여하는 뛰어난 능력을 소유한다는 것이 최근에 부상하고 있다. 그러므로, 세포들의 유연성을 조절하거나 도입하는 능력은 잠재적으로 많은 다양한 용도를 가질 것이다. 예컨대, FAH 티로시나아제 결핍의 기능적 간 재건은 고도로 정제된 HSCs의 사용에 의하여 달성되었다. 헤파토사이트들은 내배엽(endoderm)으로부터 유래되며, 따라서 중배엽(mesodermally) 유래된 HSCs가 내배엽(endodermal) 유도체로 전환되는 능력을 갖는 것으로 보인다. (Lagasse et al, Nature Med. 6: 1229-1234, 2000). 다른 세트의 연구들은 HSCs의 더욱 더 큰 유연성을 가리키는데, 여기서는 골수에서 유래된 하나의 단일 줄기 세포가 많은 기관에서 다양한 상피(epithelial) 조직에 저도 기여함(contribution)을 증명하였으며, 다만, 이들 세포들의 기능적 능력에 대한 어떠한 데이터도 제출되지 않았다. (Krause et al, Cell 105: 369-377, 2001). 강화된(enriched) 골수 집단으로부터 유래된 성체 줄기 세포에 대한 최근의 연구들은 또한 심근 경색(myocardial infarction) 후 근 세포들의 복구에 대한 능력을 지시한다. (Orlic et al, Ann. NY Acad. Sci. 938: 221-230, 2001; Orlic et al, Nature 410: 701-705, 2001; Jackson et al, J. Clin. Invest. 107: 1395-1402, 2001).
위에서 설명한 연구들은, 세포들에 유연성을 도입하는 것에 대한 이해 및 그 가능성이 예컨대 조직 재생에서와 같은 잠재적으로 중요한 용도를 갖는다는 것을 명백히 지시한다.
또한 조혈 세포들이 보다 초기의 기원세포 단계로 역(retro)- 또는 탈(de)-분화할 수 있다는 것에 대한 증거가 늘어나고 있다. 예컨대, v-myb의 온도 민감성(ts) 돌연변이주에 의하여 형질전환된 닭 골수 단핵구 세포(myelomonocytic cell)들은 허용(permissive) 온도에서 골수아세포(myeloblasts)와 닮은 미성숙 표현형을 나타낸다. 그러나, 비-허용 온도에서 그들은 부착성, 식균성, 대식세포-유사 세포들로 시프트 되며 분열을 중단한다. 시간 경과적(Time-lapse) 연구들은 이 과정이 허용 온도로 시프트 후 2 내지 3일 내에 대부분의 부착성 세포들이 다시 모세포 형태(blast morphology)를 되찾으며 세포 주기에 다시 들어가는 가역적인 것임을 보여주었다. (Beug et al, Genes Dev. 1: 277-286, 1987).
그러나 아직까지는, 환경의 조작에 의하여 단일 세포 집단으로부터 기능적으로 분화된 골수계 또는 림프계 세포들의 발생을 허용하는 재현 가능하고 안정한 모델이 존재하지 않으므로, 대부분의 교차-분화를 조사하는 연구들은 비-인간 세포들에 대하여 수행되었다.
현재, 모든 조혈 계통 내의 교차-분화 연구들은 살아있는 숙주에로의 이식이 필요한 비-인간 모델에서 수행되고 있다. 더욱이, 이들 모델 시스템 중 어느 것도 높은 비율로 상이한 계통들로의 세포들의 변환을 증명하지 못하였고, 따라서 시험관 내 및 생체 내에서의 효능은 한정된다. 가장 중요한 점은, 이들 모델들이 종종 자연적으로 존재하지 않는 세포 표현형들, 이를테면 유전형질전환 동물들 또는 인공적으로 형질전환된 세포들,의 사용을 수반한다는 것이다.
성숙한 작용 세포들의 교차분화와 관련된 데이터는 제한적이거나 없다. 이것은 B 세포들, T 세포들 및 골수계 세포들의 성숙한 표현형들의 마커들, 특히 이를테면 CD19, CD4 또는 CD3, 및 CD15 마커들,을 포함하는 세포 시스템 또는 동물 모델의 결여 때문이다. B 계통 교차분화에 대한 다수의 연구들은 성숙한 CD19 양성 세포들로의 낮은 전환 빈도를 갖는 프리-B 세포들과 관련된다. B 계통과 골수계 사이 그리고 T 림프계에서 골수계로의 변환이 제한된 성공으로 달성된 반면, B 및 T-림프계 계통 사이의 상호-전환(inter-conversion)은 관찰된바 없다.
참조문헌들
본원 발명의 목적은 선행기술의 하나 이상의 단점을 극복하거나 개량하고, 또는 유용한 대체물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
일반적으로, 멀티-융합 세포들은 불안정하며, 더 많은 세포들이 융합에 관련될수록 도출되는 하이브리드 세포의 불안정성도 증가한다고 인식되고 있다. 놀랍게도, 본원 발명에서는 다수의 세포들, 예컨대 3 세포들,의 융합으로부터 도출된 하이브리드 세포들은 기능적(functional) 안정성을 나타낸다. 특히, 상이한 계통들 유래의 세포들이 체세포(somatically) 융합되거나 또는 하이브리드되어 실질적으로 안정한 키메릭/하이브리드 세포들을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 본원 발명은 트리-하이브리드를 일으키는 적어도 세 개의 부모 세포들의 하이브리드화로부터 발생된 교차-계통 키메릭/하이브리드 세포들에 대한 것으로서, 여기서 적어도 두 개의 부모 세포들은 상이한 계통들로부터 유래되며 여기서 미엘로마 세포는 하이브리드화에 포함되지 않는다.
또한 놀랍게도 본 발명의 안정한 키메릭/하이브리드 세포들은 소정의 외생(exogenous) 인자 또는 인자들로의 처리에 의하여 원하는 표현형 이를테면 원하는 계통의 세포로의 그들의 전환을 허용하는 표현형 유연성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
이들 인자들은 사이토카인, 성장 인자, 이뮤노글로불린, 수용체 리간드, 기질 세포와 같은 세포 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
세포 표현형을 변경하는 공지된 방법들은 세포 형질전환을 수반하는데, 예컨대, 종양유전자 발현의 변경 또는 유전형질전환 동물들로부터 세포들의 분리에 의한다. 이들 방법들은 기술적으로 복잡하며 비효율적 결과를 생성하는데, 이는 관례적으로 낮은 수준의 세포 표현형 유연성을 포함한다. 더욱이, 이들 공지된 방법들은 인간 세포들에 쉽게 적용될 수 없다.
본원 발명은 효율적인 교차(trans)-분화 또는 탈(de)-분화를 허용하는 안정한 세포 시스템을 제공함으로써 이미 공지된 방법에 비하여 현저한 장점을 제공한다. 더욱이, 본원 발명은 인간 세포들의 교차-분화 또는 탈-분화를 허용한다.
일 실시예에서, 본원 발명은 세포 분화 과정, 예컨대 혈액 세포들의 분화, 즉 조혈(hematopoiesis) 과정 연구를 위한 간단하고 다목적인 모델 시스템을 제공하는 것에 관련된다. 본원 발명은 또한 척추동물에서 어떻게 유전적 프로그램들이 수립되고 수행되는지 조사하기 위한 중요한 모델을 제공하는 것에 관한 것이다. 본원 발명은 또한 세포성 악성 종양의 형성, 예컨대 백혈병에서 어떻게 혈액 형성의 항상성이 변경되는지, 에 대한 이해를 제공하는 것에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본원 발명은 또한 이를테면 질병의 치료를 위한 특이적 세포들 또는 조직들의 발생과 같은 용도들에 사용될 수 있는 표현형적 유연성을 발현하는 세포들의 발생에 관련된다.
본원 발명은 분화 과정의 모델 시스템 연구를 나타낼 수 있다. 또한, 성숙한 세포들로부터 특정 세포들의 분화 또는 탈-탈분화 능력이 유리할 수 있는 상황이 존재할 수 있다. 예컨대, 어떤 환자들은 분화 경로의 일정 시점에서의 돌연변이로 인하여 특정 표현형을 갖는 충분한 세포를 생산하는 능력이 결여되어 있다. 예컨대, 그들은 프리-B 세포들을 가지나 성숙한 B 세포들은 가지지 않을 수 있다. 그러한 환자들로부터 프리-B 세포들을 분리하여 B 세포들이 되게 하는 것은 도움이 되지 않을 것이다. 그러나, 그들의 돌연변이가 없는 다른 성숙한 세포 타입들은 본 발명을 사용하여 B 세포들로 교차-분화될 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 요구되는 B 세포들, T 세포들 또는 골수 단구 세포들의 발생을 허용하는 조혈 교차분화 시스템 (HTS)의 창조에 관련된다.
일 실시예에서, 세포 유연성을 나타내는 트리-하이브리드 세포가 하나의 골수 단구 세포 기원세포 (불멸(immortal) 또는 일차(primary) 중 하나), 하나의 B 세포 (불멸 또는 일차 중 하나) 그리고 ?하나의 T 세포 (불멸 또는 일차)의 하이브리드화에 의하여 발생될 수 있으며, 여기서 상기 하이브리드 세포는 하이브리드화에 사용되는 모든 세포 타입들로부터의 특이적 CD 마커들, 예컨대 CD15, CD19, CD4, 을 발현한다. 그러나, 통상의 기술자들은 본원 발명이 이들 특정 마커들을 발현하는 하이브리드 세포들에 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
일부 특정 실시예들에서, 본 발명의 하이브리드 세포들은 예컨대 이하의 하이브라드화에 의하여 발생될 수 있다.:
하나의 공통 골수 단구 세포 기원세포 K562 (CD72+CD15+) 및 하나의 일차 B 세포 (CD19) 및 하나의 T 세포 (CD4)-KBT;
하나의 공통 골수 단구 세포 기원세포 K562 및 불멸 B 세포 WIL2NS 및 불멸 T 세포 MOLT4-KMW; 또는
일차 골수 CD34+CD15+ 세포 유래의 하나의 공통 골수 단구 세포 기원세포, 하나의 불멸 B 세포 WIL2NS 및 하나의 일차 T 세포-WTM.
특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포들은, 필요에 따라 다양한 인자들 이를테면 사이토카인, 성장 인자, 이뮤노글로불린, 수용체 리간드, 이를테면 기질 세포와 같은 세포 또는 이들의 조합에 노출시키거나 또는 원하는 세포 타입과 이들을 추가로 하이브리드시키거나 중 하나에 의하여 B, T 또는 골수 단구 세포로 분화돨 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 그들을 다른 세포, 이를테면 기원세포 이를테면 또는 예컨대 CD34를 발현하는 세포와 추가로 하이브리드시킴으로써 탈-분화될 수 있다.
제 1 측면에 따르면, 본원 발명은 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
제 1 세포, 여기서 상기 제 1 세포는 줄기 세포 또는 미구속(uncommitted) 기원세포(progenitor) 유래의 세포임;
공통 림프계 기원세포 유래의 제 2 세포; 그리고
공통 림프계 기원세포 유래의 제 3 세포를 하이브리드하여
하이브리드 세포를 생성하는 단계 및 상기 하이브리드 세포를 소정의 환경에 노출시켜 상기 하이브리드 세포가 상기 소정의 표현형의 세포로 되는 단계.
일 실시예에서 상기 소정의 표현형은 B 세포, T 세포 또는 골수계 세포이다. 다른 대안적 실시예에서, 상기 소정의 표현형은 하이브리드 세포에 비하여 탈-분화된 표현형이다. 상기 탈-분화된 표현형은 예컨대 CD34 또는 CD10 또는 Pax-5 또는 λ-유사(like) 중 하나 또는 그 이상의 발현을 포함한다.
일부 실시예들에서 상기 제 1 세포는 공통 골수계 기원세포 유래의 세포이고, 상기 제 2 세포는 B 림프계 계통 유래의 세포이며 그리고 상기 제 3 세포는 T 림프계 계통 유래의 세포이다.
바람직하게는, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구이다. 이와 같이, 본 발명이 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명백하다.
바람직하게는 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 하나 이상의 이하의 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14, 을 디스플레이한다. 이와 같이, 본 발명이 하나 이상의 이하의 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14,을 디스플레이하는 공통 골수계 기원세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포의 발생 방법을 제공하는 것이 명백하다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 단핵구이다. 이와 같이, 본 발명은 단핵구, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포의 발생 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 일차(primary) 골수 단구 세포 기원세포(progenitor)이다. 이와 같이, 본 발명은 일차 골수 단구 세포 기원세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구에서 선택된 불멸화된 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명백하다.
다른 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 유래된다. 이와 같이, 본 발명이 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수 유래의 공통 골수계 기원 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명확하다.
다른 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용(effector) B 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용 B 세포로부터 선택된 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명확하다.
일 실시예에서, 상기 작용 B 세포는 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 하나 이상의 이하의 CD 항원들 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 디스플레이한다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 하나 이상의 다음의 CD 항원들 CD19, CD20, CD72 또는 CD5을 디스플레이하는 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작용 T 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작용 T 세포로부터 선택된 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD3, CD4, CD5 또는 CD8를 디스플레이한다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD3, CD4, CD5 또는 CD8를 디스플레이하는 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 불멸 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 불멸 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 림프계 조직 유래의 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 림프계 조직 유래의 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 포함되는 B 또는 T 림프계 세포들이 림프계 조직으로부터 유래되는 경우, 상기 림프계 조직은 바람직하게는 말초혈, 탯줄 혈액, 비장, 골수, 가슴샘, 편도, 아데노이드들, 그리고 국소 림프절들로부터 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명의 방법에 포함되는 하나 이상의 세포들의 하나 이상은 인간 세포이다. 또한 본 발명의 방법이 인간 세포 이외의 세포들 예컨대 마우스 세포를 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 K562 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 K562 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명백할 것이다.
일 실시예에서, 상기 제 2 세포 또는 상기 제 3 세포는 각각 WIL2NS 세포 또는 MOLT4 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, WIL2NS 세포 그리고 T 림프계 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공하는 것은 명백할 것이다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 MOLT4 세포를 하이브리드시키는 단계를 포함하는 소정의 표현형의 세포를 발생시키는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 MOLT4 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 일차 B 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 인간 단핵구, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 인간 골수 단구 세포 기원세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 인간 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
또 다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 마우스 단핵구, 상기 제 2 세포는 SP2 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 마우스 T 세포이다.
일부 실시예들에서, 상기 B 세포 그리고 상기 T 세포는 CD5를 발현한다. 대안적 실시예들에서 상기 B 세포는 CD20 및 CD72를 발현하고 상기 T 세포는 CD4 및 CD8를 발현한다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의하여 발생된 하이브리드 세포는 다른 세포와 추가로 하이브리드 된다. 여기서 상기 다른 세포는 예컨대 줄기 세포 또는 기원세포일 수 있다.
일부 실시예들에서, 상기 소정의 환경은 가슴샘버팀질세포(thymic stomal cell), 사이토카인, 성장 인자, 이뮤노글로불린, 수용체 리간드 또는 이들의 조합을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 방법이 다음을 제공하는 것은 명백할 것이다:
전술한 바와 같은 세 개의 세포들, 예컨대
제 1 세포, 여기서 상기 제 1 세포는 미구속 기원세포 유래의 세포임;
공통 림프계 기원세포 유래의 제 2 세포; 그리고
공통 림프계 기원세포 유래의 제 3 세포를 하이브리드시켜 하이브리드 세포를 생성하고 상기 하이브리드 세포를 가슴샘버팀질세포들, 사이토카인, 성장 인자, 이뮤노글로불린, 수용체 리간드 또는 이들의 조합에 노출시켜 상기 하이브리드 세포가 소정의 표현형의 상기 세포로 됨.
일부 실시예들에서, 소정에 환경에 포함된 상기 사이토카인 또는 성장 인자는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-1베타, IL-7, IL-23, TGF-베타, M-CSF, GM-CSF 그리고 IFN-감마로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 실시예들에서, 상기 이뮤노글로불린은 항-IL-4, 항-IFN-감마 그리고 항-CD3/CD28으로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 실시예들에서, 상기 수용체 리간드는 Flt 3 리간드 또는 CD40 리간드이다.
또 다른 측면에서, 본원 발명은 이하의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다:
제 1 세포, 여기서 상기 제 1 세포는 줄기 세포 또는 미구속 기원세포 유래의 세포임;
공통 림프계 기원세포 유래의 제 2 세포; 그리고
공통 림프계 기원세포 유래의 제 3 세포,
그리고 여기서 상기 제 1 세포는 미엘로마 세포가 아님
일 실시예에서, 상기 제 2 세포는 B 림프계 계통 유래의 세포 그리고 상기 제 3 세포는 B 림프계 계통 유래의 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 2 세포는 B 림프계 계통 유래의 세포이고 상기 제 3 세포는 T 림프계 계통 유래의 세포이다.
바람직하게는, 상기 제 1 세포는 공통 골수계 기원세포 유래의 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포, 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
바람직하게는 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구이다. 이와 같이 본 발명이 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
바람직하게는 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14를 디스플레이한다. 이와 같이 본 발명이 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14을 디스플레이하는 공통 골수계 기원세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14를 디스플레이하는 공통 골수계 기원세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 단핵구이다. 이와 같이, 본 발명은 단핵구 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 단핵구, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 일차(primary) 골수 단구 세포 기원세포이다. 이와 같이, 본 발명은 일차 골수 단구 세포 기원세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 일차 골수 단구 세포 기원세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구에서 선택된 불멸화된 세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구에서 선택된 불멸화된 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 유래된다. 이와 같이, 본 발명이 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수에서 유래된 공통 골수계 기원세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수 유래의 공통 골수계 기원 세포, B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용 B 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포 그리고 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용 B 세포에서 선택된 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백하다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용 B 세포에서 선택된 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 작용 B 세포는 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포 그리고 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포에서 선택된 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD19, CD20, CD72 또는 CD5, 를 디스플레이한다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포 그리고 두 개의 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD19, CD20, CD72 또는 CD5,를 디스플레이하는 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD19, CD20, CD72 또는 CD5,을 디스플레이하는 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작용 T 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작용 T 세포에서 선택된 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD3, CD4, CD5 또는 CD8,를 디스플레이한다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 하나 이상의 다음의 CD 항원들, CD3, CD4, CD5 또는 CD8,를 디스플레이하는 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들, 이들 중 하나 이상은 불멸 세포일 수 있음,의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 불멸 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 불멸 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직에서 유래된다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포 그리고 두 개의 림프계 조직 유래의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, 림프계 조직 유래의 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이와 같이, 본 발명은 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 림프계 조직 유래의 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
본 발명의 하이브리드 세포들에 포함되는 B 또는 T 림프계 세포들이 림프계 조직으로부터 유래되는 경우, 상기 림프계 조직은 바람직하게는 말초혈, 탯줄 혈액, 비장, 골수, 가슴샘, 편도, 아데노이드들, 그리고 국소 림프절로부터 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 발생에 포함되는 세포들의 하나 이상은 인간 세포이다. 또한 본 발명의 하이브리드 세포가 인간 세포 이외의 세포 예컨대 마우스 세포를 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다.
일 실시예에서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는K562 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 K562 세포 그리고 두 개의 B 림프계 세포들의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백할 것이다. 본 발명은 또한 K562 세포, 불멸 B 림프계 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 제 2 세포 또는 상기 제 3 세포는 각각 WIL2NS 세포 또는 MOLT4 세포이다. 이와 같이, 본 발명이 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, WIL2NS 세포 그리고 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공하는 것은 명백할 것이다. 본 발명은 또한 공통 골수계 기원세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 그리고 MOLT4 세포의 하이브리드화에 의하여 발생된 하이브리드 세포를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 MOLT4 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 일차(primary) B 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 인간 단핵구, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 인간 골수 단구 세포 기원세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 인간 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 K562 세포, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 단핵구, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 WIL2NS 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 마우스 단핵구, 상기 제 2 세포는a SP2 세포 그리고 상기 제 3 세포는 일차 마우스 T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 마우스 단핵구, 상기 제 2 세포는a SP2 세포 그리고 상기 제 3 세포는 SP2 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 제 1 세포는 일차 인간 또는 마우스 단핵구, 상기 제 2 세포는 WIL2-NS 세포 그리고 상기 제 3 세포는 SP2 세포이다.
일 실시예에서, 본 발명은 하이브리드 세포는 원하는 단백질을 발현한다. 일 실시예에서 상기 단백질은 내생성(endogenous) 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 단백질은 재조합(recombinant) 단백질이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 사이토카인 예를 들면 콜로니 자극 인자 또는 인터류킨이다. 일 실시예에서 상기 단백질은 GM-CSF이다. 다른 실시예에서, 상기 단백질은 인터류킨 2이다. 또 다른 실시예에서, 상기 단백질은 수용체 또는 이의 단편(fragment)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 단백질은 가용성 수용체이다.
일 실시예에서, 상기 단백질은 인간 IL-4 수용체 알파 사슬이다. 다른 실시예에서 상기 단백질은 IgM이다. 또 다른 실시예에서, 상기 단백질은 IgG이다. 또 다른 실시예에서 상기 단백질은 CD54이다.
일 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포를 발생시키기 위한 상기 하이브리드화는 전기적 수단에 의하여 달성된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포를 발생시키기 위한 상기 하이브리드화는 화학적 수단에 의하여 달성된다.
일 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 관심 대상의 단백질을 발현하는 세포와 추가로 하이브리드된다.
일 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포를 발생시키기 위하여 사용되는 상기 하이브리드화는 세 개의 개별적 세포들을 하이브리드시킴으로써 수행된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 세포를 발생시키기 위하여 사용되는 상기 하이브리드화는 세 집단(populations)의 세포들을 사용하여 수행되며, 여기서 각각의 집단은 복수의 동일 세포 타입들 또는 표현형들을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 상기 하이브리드 세포는 원하는 해독 후(post-translational) 변형 또는 원하는 기능성을 나타내는 단백질의 발현을 허용하도록 특정 세포 타입-정의(defining) 마커로 강화(enriched)된다.
용어의 정의
본원 발명의 문맥에서, “포함한다”, “포함하는” 그리고 이와 유사한 표현은, 배타적으로 느껴지는 것과는 달리, "포함하나, 이에 제한되지 않는"의 느낌으로 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
하이브리드
세포
하이브리드 세포는 하나 이상의 게놈으로부터의 성분들을 포함하는 세포이다 {접합체들(zygotes) 및 이들의 유도체들 이외}. 이것은 예컨대, 두 개의 또는 그 이상의 생물학적 세포들 (부모 세포들)의 체세포(somatic cell) 하이브리드화(또는 전 세포 하이브리드화)로부터 구성되는 세포이다. 부모 세포들은 동일 계통(lineage) (또는 종(species)) 또는 상이한 계통 (또는 종) 중 하나로부터 얻어질 수 있다. 동일 계통 및 종으로부터 생성된 하이브리드 세포는 오토-하이브리드로 칭하는 반면, 상이한 계통의 것은 헤테로-하이브리드라 칭한다.
키메릭
세포
키메릭 세포는 두 개의 또는 그 이상의 상이한 종들로부터 기원하는 게놈을 갖는 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다.
교차(
Cross
)-계통
하이브리드
세포
교차-계통 하이브리드 세포는 상이한 세포 계통들 유래의 두 개의 또는 그 이상의 세포들에서 기원하는 게놈을 갖는 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다. 조혈 세포들은, 예컨대, 두 종의 주 계통들로 분리된다: 림프계 (T 세포들, B 세포들 그리고 NK 세포들) 그리고 골수계 [단핵구들 그리고 대식세포들, 호중구들, 호염기구들 그리고 호산구들, 적혈구들(erythrocytes), 거대핵세포들(megakaryocytes)/혈소판들, 수지상 세포들].
트리-
하이브리드
세포
트리-하이브리드 세포는 3 세포들로부터 기원하는 게놈을 가진 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다.
안정한
세포를 언급하는 경우, “안정한”이라는 용어는 주어진 성장 또는 생산성 파라미터, 또는 증가하는 발생 수에 따른 세포 라인의 생산 특징들의 지속성을 입증하는 세포의 능력을 지칭한다. 안정한 형질도입체(transfectant)에 대하여 참조되는 경우, 이는 실질적으로 무한정하게 상대적으로 일정한 수준으로 트랜스-유전자를 발현하는 세포라인을 지시한다.
체세포
하이브리드화
본원 명세서의 문맥에서, “체세포 하이브리드화”라는 용어는 하나의 과정을 지시하는데, 여기서 하나의 단일의 생명력 있는 세포가 두 개의 또는 그 이상의 디플로이드 (비-배우자) 세포들 (부모 세포들)로부터 세포들의 원형질막이 충분히 잘 접촉되도록 유도되어, 접촉의 일 시점에서 부모 세포들의 원형질막들의 가역적인 붕괴가 동시에 유도되고, 각 부모 세포의 존재 또는 소기관(organelles)들이 새로 형성된 단일 세포의 외막(envelope) 내로 조합되는 방식으로 형성된다. 새로이 형성된 단일 세포는 하이브리드화된 세포 또는 하이브리드 세포로 지칭된다.
줄기 세포
“줄기 세포”라는 용어는 유사분열(mitosis)에 의하여 분열될 수 있는, 그리고 상이한 세포 타입들의 범주로 발달할 수 있는 능력을 갖는 특정화되지 않은 (unspecialised) 세포를 지칭한다. 줄기 세포들은 배아(embryonic) 줄기 세포들, 탯줄(umbilical cord) 유래의 “성체(adult)” 줄기 세포들 또는 성체들 유래의 줄기 세포들을 포함할 수 있다. 줄기 세포들은 모든 세포 타입들로 분화될 수 있는 제한 없는 능력을 갖는 세포들, 즉 전능(totipotent) 세포들을 포함할 수 있다. 줄기 세포들은 또한 특화된(specialised) 세포들로 분화 능력이 제한된 세포들, 예컨대 만능(pluripotent), 다능(multipotent), 소기능(oligopotent) 또는 단일능(unipotent) 줄기 세포들을 포함할 수 있다.
불멸화된
세포
“불멸화된(immortalised)” 세포라는 용어는 무한한 성장 능력을 갖는 세포를 지시한다. 불멸화된 세포가 생체 내에서 악성 종양(malignancy) 또는 배아에서 유래될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 대안적으로, 불멸화된 세포는 무한한 성장 능력을 유도하는 세포에 대한 작용을 수행함으로써 유래될 수 있다. 이러한 작용들은 예컨대, 시험관 내에서의 형질전환 과정, 예를 들면 바이러스 유전자들, 이를테면 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 시미안 바이러스 40 (SV40) T 항원, 아데노바이러스 E1A 그리고 E1B, 그리고 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6 그리고 E7, 의 도입을 포함할 수 있다. 대안적으로, 불멸화된 세포는 텔로머라아제 역전사 효소 단백질 (TERT)의 발현 또는 다른 수단들을 통하여 세포로부터 유래될 수 있다. 불멸화된 세포들은 또한 종양유전자 발현이 변화된 세포들로부터 유래될 수 있다. 불멸화된 세포들은 UV 노출 또는 불멸화 메카니즘이 알려지지 않은 자연 발생적(spontaneous) 형질전환을 포함하나 이에 제한되지 않는 무한한 성장 능력을 유도하는 여하한 작용으로부터 유래될 수 있다.
미엘로마
세포
“미엘로마 세포(골수종 세포)”라는 용어는 플라즈마 세포의 악성 종양(malignancy)을 지시한다.
하이브리도마
“하이브리도마”라는 용어는 미엘로마 세포 그리고 면역화된 동물의 비장 유래의 B-세포의 하이브리드화에 의하여 생성된 세포를 지시한다. 하이브리도마들은 모노클로날 항체들을 생산하는 능력을 갖는 불멸화된 세포들이다.
표현형
“표현형”이라는 용어는 세포의 물리적 특징들 또는 형태학을 지시한다. 예컨대 이것은 특정 세포 계통, 예컨대 림프계 또는 골수계 계통에 관한 것일 수 있다. 대안적으로, “표현형”이라는 용어는 예컨대 세포의 표면상에, 이를테면, CD 마커들 또는 세포 내 분자들, 이를테면 전사 인자들과 같은, 하나 또는 그 이상의 분자들을 발현하는 것과 관련될 수 있다.
미구속(
uncommitted
) 기원세포
미구속(uncommitted) 기원세포는 여하한 특정 계통에 구속됨이 없으나 더 이상 자가재생(renew)할 수 없는 오직 제한된 종류의 세포들로만 분화될 수 있는 줄기세포의 초기 후손(descendant)이다.
공통(
Common
) 골수계 기원세포
공통 골수계 기원세포는 골수계 계통으로 제한되고 그리고 거대핵세포/적혈구 또는 과립구/대식세포 기원세포들 중 하나를 낳을 수 있는, 그러나 림프계 세포들은 아님, 조혈 줄기 세포의 자손(progeny)이다.
B 림프계 계통-
유래된
세포
B 림프계 계통-유래된 세포는 여하한 타입의 B 세포들이 되는 B 계통 구속을 따르는 공통 림프계 기원세포로부터 기원한 여하의 세포이다.
T 림프계 계통-
유래된
세포
T 림프계 계통-유래된 세포는 여하한 타입의 T 세포들이 되는 T 계통 구속을 따르는 공통 림프계 기원세포로부터 기원한 여하의 세포이다.
과립구-대식세포 기원세포
과립구-대식세포 기원세포는 공통 골수계 기원세포로부터 기원하고 과립구 그리고 단핵구 계통들, 그러나 거대핵세포 및 적혈구의 계통들은 아님, 로 구속된 기원세포이다.
거대핵세포
-적혈구의 기원세포
거대핵세포-적혈구의 기원세포는 공통 골수계 기원세포로부터 기원하고 그리고 거대핵세포 그리고 적혈구의 계통들, 그러나 과립구 및 단핵구 계통들은 아님,에 구속된 기원세포이다.
프리
-B 세포
프리-B-세포는 막 결합 IgM의 중쇄 사슬이 대리(surrogate) 경쇄 사슬과 발현되는 단계의 발달 B 세포이다.
미성숙 B 세포
미성숙 B 세포는 항체의 재조합 단계에서 유전좌위 VJ가 L 사슬들에서 재배열되고 VDJ가 H 사슬들에서 재배열되며 IgM 수용체 발현이 나타나는 골수에서의 발달 B 세포를 지시한다.
나이브
B 세포
나이브 B 세포는, 그것의 이뮤노글로불린 표면의 무작위 유전자 재배열을 통하여 골수에서 분화되고 성숙된, 그러나 아직 말초에서 동족(cognate) 항원과 만나지 않은, 성숙한 B 세포이다.
활성화된 B 세포
활성화된 B 세포는, T-종속적 또는 독립적 방식으로 플라즈마 세포들로 최종 분화 및 클로날 증식의 조합을 일으키는 BCR을 통한 항원 인식을 통하여 말초에서 동족 항원과 만난 성숙한 B 세포의 타입이다.
작용 B 세포
작용 B 세포는 종종 항체 분비 플라즈마 세포와 동의어로 사용되며, 특정 항원에 특이적인 항체들뿐 아니라, 면역 시스템의 다른 세포들을 관련시키는 사이토카인들의 과잉을 분비하는 짧은-수명의 B 세포 타입이다.
기억 B-세포
기억 B 세포들은 일차 면역 반응 동안에 만난 항원에 특이성이며 동일 항원에 두 번째 노출에 따라 빨리 반응할 수 있는 활성화된 B 세포로부터 형성된 긴 수명의 B 세포이다.
플라즈마
세포
플라즈마 세포는 면역 시스템의 최종 유사분열 후(terminal post-mitotic), 단기 수명 세포로서, B 세포로부터 CD4+ 림프구 (Th 세포들)의 자극에 따라 분화되며 다량의 항체들을 분비한다.
유연성
“유연성”이라는 용어는 주어진 유전자형에서 그것의 표현형을 변화시킬 수 있는 세포의 능력을 지시하는데, 이 변경은 환경의 변화에 대한 반응일 수 있다.
프리
-T 세포
프리-T 세포는 VbDbJb가 완전하고(complete) 그리고 TCR 베타 사슬이 더블 음성 (CD4-CD8-) T 세포 (CD3+)에서 발현되는 단계의 발달 T 세포이다.
미성숙 T 세포
미성숙 T 세포는 골수에서 가슴샘으로 이동하였으나 이의 TCR의 재-배열, 또는 주조직적합복합체 (self-major histocompatibility complex) (MHC) 분자들과 관련하여 제공된 자기 펩타이드들에 대한 이의 TCR 결합 능력을 위한 선택이 완료되지 않은 또는 각각, MHC 클래스 I 또는 II 분자들에 대한 세포의 TCR 특이성에 정확히 연관되는, T 킬러 또는 T 헬퍼 계통들로의 구속을 거친 발달 T 세포이다. 계통 구속은 공동-수용체 분자들, CD8 또는 CD4, 중 하나의 발현의 손실에 의하여 표현형적으로 마크된다.
나이브
T 세포
나이브 T 세포는 골수에서 분화되고, 이의 TCR의 재-배열로 가슴샘에서 중심 선택의 양성 및 음성 과정 및 공동-수용체 분자들의 하나의 손실을 성공적으로 거쳤으나, 아직 말초에서 동족 항원을 만나지 않은 성숙한 T 세포이다.
활성화된 T 세포
활성화된 T 세포는, 각각 주조직적합복합체 펩타이드 (펩타이드:MHC 복합체)에 의한 세포 표면상의 CD28 및 TCR 모두와 항원 제공 세포들상의 B7 패밀리 멤버의 교합(engagement)을 통하여, 항원 특이성 작용 T 세포로 되도록 설정된 T 세포이다.
작용 T 세포
작용 T 세포는 그 세포에 대하여 적당한 펩타이드:MHC 복합체를 갖는 세포들과의 접촉에 즉각적으로 반응할 수 있는 단기-수명 T 림포사이트의 타입이다.
교차분화
“교차분화”라는 용어는 특정 타입의 비-줄기 세포가 상이한 타입의 세포로 형질 전환하는 경우 또는 이미 분화된 줄기 세포가 그것의 이미 구속된 분화 경로 이외의 세포들을 창조하는 경우에 일어나는 과정을 지시한다.
도 1. 확인 및 분류-정제된 CD71+ K562 세포들
도 2. CD15 및 CD71 양성 K562 세포들의 FACS 프로파일들; (a) 대략적으로 18%의 오리지날 CD71-강화된 K562 세포 집단이 CD15 (R1 영역)에 대하여 양성이었으며 (b) 2개월 배양 후 CD15 양성 K562 세포들의 재분석 결과.
도 3. 48시간 배양 후 CD34+ 강화된 AML 단핵 세포들로부터 CD34+ 및 CD34+CD15+ 세포들의 분류
도 4. 마우스 항-인간 CD19 그리고 마우스 항-인간 CD5 항체들로 염색된 제대혈 단핵 세포들의 FACS 프로파일
도 5. 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD5 항체들로 염색된 단핵 제대혈 세포들의 FACS 프로파일.
도 6. 마우스 항-인간 CD20 및 마우스 항-인간 CD72 항체들로 염색된 골수 단핵 세포들의 FACS 프로파일.
도 7. CD3 및 CD54 염색에 대하여 염색된 편도의(tonsilar) 단핵 세포들의 전형적인 FACS 프로파일.
도 8. IgM 및 IgG 양성 배양된 림포사이트들의 존재; (A) 5일간 배양 후 18%의 CD19+ 세포들이 IgM 양성이었으며 단지 1%가 표면에서 IgG를 검출할 수 있었고 (B) 10일 후, IgM 양성 림포사이트들의 퍼센트는 단 2%로 감소한 반면, IgG 양성 세포들의 퍼센트는 15%로 증가하였다.
도 9. HTS-KMW 세포들 상의 CD 발현들의 FACS 프로파일들 및 상이한 표현형의 세포 집단들에 대한 분류 영역들.
도 10. 일차 혼합된 비장 림포사이트들 상의 CD4 및 CD19의 발현, 분류된 CD4 및 CD19의 집단들 그리고 HTS-KBT 세포 라인 도출; (a) 일차 비장 림포사이트들 상의 CD4 및 CD19의 발현 (b) 분류된 CD19+ 세포들의 순도 프로파일 (98.1%); (c) 분류된 CD4+ 세포들의 순도 프로파일 (96.8%); (d) HTS-KBT 세포들 상의 CD19 및 CD4의 공동-발현. HTS-KBT 세포 집단의 99% 이상이 B 및 T 세포들 모두에 대한 마커들을 공동-발현한다.
도 11. 하나의 불멸 골수계 그리고 두 개의 일차 항원-경험 림프계 세포들 유래의 HTS-KBTAE 라인상의 CD19, CD3 및 CD5의 발현: (a) HTS-KBTAE 세포 표면상의 CD19 및 CD5의 발현; (b) HTS-KBTAE 세포들상의 CD3 및 CD5의 발현.
도 12. 하나의 불멸 골수계 그리고 골수 및 가슴샘 유래의 두 개의 일차 림프계 세포들 유래의 HTS-KBTDP 세포들상의 CD4, CD8, CD72 및 CD20의 표면 발현: (a) HTS-KBTDP의 표면상의 CD4 및 CD8의 발현, (b) HTS-KBTDP의 표면상의 CD4 및 CD72의 발현, (c) HTS-KBTDP의 표면상의 CD20 및 CD8의 발현.
도 13. 골수 단구 세포 기원세포들로부터 기원한 HTS-WTM 세포들의 표면상의 CD 발현들; (A) CD19, CD4 및 CD15으로 삼색 염색 그리고 (B) 골수 단구 세포 기원세포에서 유래된 CD34 및 CD15 그리고 작용 T 세포에서 유래된 CD4로 삼색 염색.
도 14. CD4 표현형 촉진(promoting) 환경에서 8일 후 HTS-KMW.6, HTS-WTM.6 및 HTS-WTM.12 배양에서 CD4, CD19 및 CD15에 대한 대표적 염색 프로파일로서, 여기서 100%의 세포들이 그들의 세포 표면상에 단일 마커로서 CD4를 보유하였다. (단일 양성 CD4 세포들). 도면으로 도시되지 않았으나, HTS-KMW.1 배양에서, 단일 CD4+ 세포들은 100%의 삼중 양성 CD15+CD19+CD4+ 세포들로 구성된 출발 집단 중 49%를 나타냈으며; HTS-KBT에서는, 이것은 초기 100% 이중 양성 CD19+CD4+ 집단의 50%에 달하였으며; HTS-KBTAE.1에서는, 이것은 100% 삼중 양성 CD3+CD19+CD5+ 집단의 61%에 달하였으며; HTS-KBTAE.4에서는, 이것은 초기의 100%의 CD3+ 세포들 중의 74%에 달하였으며; HTS-WTM.1에서는, 100% 삼중 양성 CD15+CD19+CD4+ 집단으로부터 82%에 달하였으며; 그리고 HTS-WTM.7에서는, 100% 삼중 양성 집단의 CD15+CD34+CD4+ 표현형으로부터 71%의 세포들이 단일 CD4 양성 세포들이 되었다.
도 15. CD8, CD19 및 CD15에 대한 HTS KBTDP.12 배양에서의 대표적 염색 프로파일로서, 여기서 100%의 세포들이 CD8+ 촉진 환경에 14일간 노출 후 단지 CD8에 대하여 양성으로 염색되었다. 도면으로 도시되지 않았으나, KBTAE.1에서, 단일 양성 CD8 세포들의 수는 100% 삼중 양성 CD3+CD19+CD5+ 집단으로부터 53%에 달하였으며; KBTAE.4에서는, 100% 단일 CD3+ 집단으로부터 유래되어 61%에 달하였고; HTS KBTDP.1 및 HTS KBTDP.4에서는, 이들 수치는 각각 100% CD4+CD8+CD20+CD7+ 및 CD4+CD8+CD20-CD71- 집단들에서 72% 및 86%이었다.
도 16. HTS-KBTAE.4 (A) 및 HTS-KBTDP.12 (B) 배양들의 단일 양성 CD8 세포들에서 인간 IL-2 및 인간 IFN-γ의 세포내 생산. 두 배양들 모두 IL-2, IFN-γ 또는 양쪽 모두를 제조하는 세포들이 함유되어 있었으나, HTS-KBTDP.12 배양은 IL-2에 대하여 광범위한 생산 농도를 가지는 반면, HTS-KBTAE.4 배양은 IFN-γ 농도에 대하여 더욱 넓은 범주를 나타내었다.
도 17. HTS-KBTAE.4 (A) 및 HTS-KBTDP.12 (B) 배양들의 단일 CD8 양성 세포들에서 세포 내 페르포린 및 그랜자임 A의 전형적인 프로파일
도 18. B 림프계 촉진 환경에서 7일 후 항-CD19, 항-CD4 및 항-CD15 항체들로 HTS-KBTAE.6 배양의 전형적 염색.
도 19. 대식세포 허용(permissive) 성장 배지에서 8일 후 HTS 배양으로부터 발생된 세포들의 부착 형상(Adherent morphology)
도 20. 대식세포 허용 성장 배지에서 8일 후 HTS-WTM.4 세포들상의 CD19, CD15 및 CD4 발현 프로파일로서, 적은 퍼센트의 세포들은 여전히 CD4에 대하여 양성이며 그리고 7%의 세포들은 표면에 골수 단구 세포 CD15 마커를 보유하는 반면 CD19의 발현은 완전히 상실됨을 보여줌.
도 21. 대식세포 허용 성장 배지들에서 8시간 후 HTS-WTM.4 세포들의 표면상의 대식세포-유사 마커들의 발현들.
도 22. 대식세포 허용 환경에서 8일 후 HTS-WTM.4 배양에서 유래된 CD64 양성 대식세포들에 의한 1000 nm 마이크로스피어들의 식작용(Phagocytosis)
도 23. 대식세포 허용 성장 배지에서 8일 후 LPS 자극된 HTS-WTM.4 세포들에 의한 나이트릭 옥사이드의 생산.
도 24. 일차 CD54+ 인간 T 세포들과 체세포 하이브리드화에 의하여 T 세포들로 교차-분화된 HTS-KBTAE.6에서 유래된 CD19+ B 림포사이트들에 의한 CD3 및 CD54 발현의 전형적인 프로파일. 도 24A는 CD3 발현의 획득과 동시에 그러한 세포들에 의한 CD19 발현의 손실을 나타내는 반면, 도 24B는 CD3 양성 T 세포들에 의한 CD54 발현을 확인한다.
도 25. CD40 활성화된 IgM 양성 B 세포들과 체세포 하이브리드화 후 CD3+ HTS-KBTAE.4 세포들의 교차-분화의 대표적 프로파일로서, CD3 발현의 상실 및 그리고 표면 IgM의 획득을 나타낸다.
도 26. CD19+ 세포들의 100% 균질 배양에서 개시된 HTS-WTM 배양들 1 및 7에서 초기 B 세포 발달 마커들에 대한 RT-PCR 전사체들(transcripts)이며 HTS-KMW.1와 비교하여 탈-분화 신호를 나타냄. 양쪽 모두의 HTS-WTM에서 CD10의 상향 조정(상향-조정)과 Pax-5 그리고 λ-유사 전사체들의 존재 그리고 HTS-WTM.7 에서 CD34의 출현은 환경적 조건들 변화에 대한 반응으로 성숙한 B 세포들의 초기 단계의 B 세포들로의 탈분화를 지시한다.
도 27. 단일-세포 조작/전달 시스템.
도 28. 유리 마이크로-피펫.
도 29. 마이크로-전극.
도 30. 두 개의 평행한 마이크로-전극들.
도 31. 조직 배양 플레이트의 웰(well) 내의 두 개의 마이크로-전극.
도 32. 중간에 3 세포들, 2 마이크로 전극들을 포함하는 웰의 평면도.
도 33. 도 32의 웰의 측면도.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 바람직한 이하의 실시예가 첨부된 도면을 참조하는 비-제한적인 실시예들에 의하여 추가로 설명된다.
도 2. CD15 및 CD71 양성 K562 세포들의 FACS 프로파일들; (a) 대략적으로 18%의 오리지날 CD71-강화된 K562 세포 집단이 CD15 (R1 영역)에 대하여 양성이었으며 (b) 2개월 배양 후 CD15 양성 K562 세포들의 재분석 결과.
도 3. 48시간 배양 후 CD34+ 강화된 AML 단핵 세포들로부터 CD34+ 및 CD34+CD15+ 세포들의 분류
도 4. 마우스 항-인간 CD19 그리고 마우스 항-인간 CD5 항체들로 염색된 제대혈 단핵 세포들의 FACS 프로파일
도 5. 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD5 항체들로 염색된 단핵 제대혈 세포들의 FACS 프로파일.
도 6. 마우스 항-인간 CD20 및 마우스 항-인간 CD72 항체들로 염색된 골수 단핵 세포들의 FACS 프로파일.
도 7. CD3 및 CD54 염색에 대하여 염색된 편도의(tonsilar) 단핵 세포들의 전형적인 FACS 프로파일.
도 8. IgM 및 IgG 양성 배양된 림포사이트들의 존재; (A) 5일간 배양 후 18%의 CD19+ 세포들이 IgM 양성이었으며 단지 1%가 표면에서 IgG를 검출할 수 있었고 (B) 10일 후, IgM 양성 림포사이트들의 퍼센트는 단 2%로 감소한 반면, IgG 양성 세포들의 퍼센트는 15%로 증가하였다.
도 9. HTS-KMW 세포들 상의 CD 발현들의 FACS 프로파일들 및 상이한 표현형의 세포 집단들에 대한 분류 영역들.
도 10. 일차 혼합된 비장 림포사이트들 상의 CD4 및 CD19의 발현, 분류된 CD4 및 CD19의 집단들 그리고 HTS-KBT 세포 라인 도출; (a) 일차 비장 림포사이트들 상의 CD4 및 CD19의 발현 (b) 분류된 CD19+ 세포들의 순도 프로파일 (98.1%); (c) 분류된 CD4+ 세포들의 순도 프로파일 (96.8%); (d) HTS-KBT 세포들 상의 CD19 및 CD4의 공동-발현. HTS-KBT 세포 집단의 99% 이상이 B 및 T 세포들 모두에 대한 마커들을 공동-발현한다.
도 11. 하나의 불멸 골수계 그리고 두 개의 일차 항원-경험 림프계 세포들 유래의 HTS-KBTAE 라인상의 CD19, CD3 및 CD5의 발현: (a) HTS-KBTAE 세포 표면상의 CD19 및 CD5의 발현; (b) HTS-KBTAE 세포들상의 CD3 및 CD5의 발현.
도 12. 하나의 불멸 골수계 그리고 골수 및 가슴샘 유래의 두 개의 일차 림프계 세포들 유래의 HTS-KBTDP 세포들상의 CD4, CD8, CD72 및 CD20의 표면 발현: (a) HTS-KBTDP의 표면상의 CD4 및 CD8의 발현, (b) HTS-KBTDP의 표면상의 CD4 및 CD72의 발현, (c) HTS-KBTDP의 표면상의 CD20 및 CD8의 발현.
도 13. 골수 단구 세포 기원세포들로부터 기원한 HTS-WTM 세포들의 표면상의 CD 발현들; (A) CD19, CD4 및 CD15으로 삼색 염색 그리고 (B) 골수 단구 세포 기원세포에서 유래된 CD34 및 CD15 그리고 작용 T 세포에서 유래된 CD4로 삼색 염색.
도 14. CD4 표현형 촉진(promoting) 환경에서 8일 후 HTS-KMW.6, HTS-WTM.6 및 HTS-WTM.12 배양에서 CD4, CD19 및 CD15에 대한 대표적 염색 프로파일로서, 여기서 100%의 세포들이 그들의 세포 표면상에 단일 마커로서 CD4를 보유하였다. (단일 양성 CD4 세포들). 도면으로 도시되지 않았으나, HTS-KMW.1 배양에서, 단일 CD4+ 세포들은 100%의 삼중 양성 CD15+CD19+CD4+ 세포들로 구성된 출발 집단 중 49%를 나타냈으며; HTS-KBT에서는, 이것은 초기 100% 이중 양성 CD19+CD4+ 집단의 50%에 달하였으며; HTS-KBTAE.1에서는, 이것은 100% 삼중 양성 CD3+CD19+CD5+ 집단의 61%에 달하였으며; HTS-KBTAE.4에서는, 이것은 초기의 100%의 CD3+ 세포들 중의 74%에 달하였으며; HTS-WTM.1에서는, 100% 삼중 양성 CD15+CD19+CD4+ 집단으로부터 82%에 달하였으며; 그리고 HTS-WTM.7에서는, 100% 삼중 양성 집단의 CD15+CD34+CD4+ 표현형으로부터 71%의 세포들이 단일 CD4 양성 세포들이 되었다.
도 15. CD8, CD19 및 CD15에 대한 HTS KBTDP.12 배양에서의 대표적 염색 프로파일로서, 여기서 100%의 세포들이 CD8+ 촉진 환경에 14일간 노출 후 단지 CD8에 대하여 양성으로 염색되었다. 도면으로 도시되지 않았으나, KBTAE.1에서, 단일 양성 CD8 세포들의 수는 100% 삼중 양성 CD3+CD19+CD5+ 집단으로부터 53%에 달하였으며; KBTAE.4에서는, 100% 단일 CD3+ 집단으로부터 유래되어 61%에 달하였고; HTS KBTDP.1 및 HTS KBTDP.4에서는, 이들 수치는 각각 100% CD4+CD8+CD20+CD7+ 및 CD4+CD8+CD20-CD71- 집단들에서 72% 및 86%이었다.
도 16. HTS-KBTAE.4 (A) 및 HTS-KBTDP.12 (B) 배양들의 단일 양성 CD8 세포들에서 인간 IL-2 및 인간 IFN-γ의 세포내 생산. 두 배양들 모두 IL-2, IFN-γ 또는 양쪽 모두를 제조하는 세포들이 함유되어 있었으나, HTS-KBTDP.12 배양은 IL-2에 대하여 광범위한 생산 농도를 가지는 반면, HTS-KBTAE.4 배양은 IFN-γ 농도에 대하여 더욱 넓은 범주를 나타내었다.
도 17. HTS-KBTAE.4 (A) 및 HTS-KBTDP.12 (B) 배양들의 단일 CD8 양성 세포들에서 세포 내 페르포린 및 그랜자임 A의 전형적인 프로파일
도 18. B 림프계 촉진 환경에서 7일 후 항-CD19, 항-CD4 및 항-CD15 항체들로 HTS-KBTAE.6 배양의 전형적 염색.
도 19. 대식세포 허용(permissive) 성장 배지에서 8일 후 HTS 배양으로부터 발생된 세포들의 부착 형상(Adherent morphology)
도 20. 대식세포 허용 성장 배지에서 8일 후 HTS-WTM.4 세포들상의 CD19, CD15 및 CD4 발현 프로파일로서, 적은 퍼센트의 세포들은 여전히 CD4에 대하여 양성이며 그리고 7%의 세포들은 표면에 골수 단구 세포 CD15 마커를 보유하는 반면 CD19의 발현은 완전히 상실됨을 보여줌.
도 21. 대식세포 허용 성장 배지들에서 8시간 후 HTS-WTM.4 세포들의 표면상의 대식세포-유사 마커들의 발현들.
도 22. 대식세포 허용 환경에서 8일 후 HTS-WTM.4 배양에서 유래된 CD64 양성 대식세포들에 의한 1000 nm 마이크로스피어들의 식작용(Phagocytosis)
도 23. 대식세포 허용 성장 배지에서 8일 후 LPS 자극된 HTS-WTM.4 세포들에 의한 나이트릭 옥사이드의 생산.
도 24. 일차 CD54+ 인간 T 세포들과 체세포 하이브리드화에 의하여 T 세포들로 교차-분화된 HTS-KBTAE.6에서 유래된 CD19+ B 림포사이트들에 의한 CD3 및 CD54 발현의 전형적인 프로파일. 도 24A는 CD3 발현의 획득과 동시에 그러한 세포들에 의한 CD19 발현의 손실을 나타내는 반면, 도 24B는 CD3 양성 T 세포들에 의한 CD54 발현을 확인한다.
도 25. CD40 활성화된 IgM 양성 B 세포들과 체세포 하이브리드화 후 CD3+ HTS-KBTAE.4 세포들의 교차-분화의 대표적 프로파일로서, CD3 발현의 상실 및 그리고 표면 IgM의 획득을 나타낸다.
도 26. CD19+ 세포들의 100% 균질 배양에서 개시된 HTS-WTM 배양들 1 및 7에서 초기 B 세포 발달 마커들에 대한 RT-PCR 전사체들(transcripts)이며 HTS-KMW.1와 비교하여 탈-분화 신호를 나타냄. 양쪽 모두의 HTS-WTM에서 CD10의 상향 조정(상향-조정)과 Pax-5 그리고 λ-유사 전사체들의 존재 그리고 HTS-WTM.7 에서 CD34의 출현은 환경적 조건들 변화에 대한 반응으로 성숙한 B 세포들의 초기 단계의 B 세포들로의 탈분화를 지시한다.
도 27. 단일-세포 조작/전달 시스템.
도 28. 유리 마이크로-피펫.
도 29. 마이크로-전극.
도 30. 두 개의 평행한 마이크로-전극들.
도 31. 조직 배양 플레이트의 웰(well) 내의 두 개의 마이크로-전극.
도 32. 중간에 3 세포들, 2 마이크로 전극들을 포함하는 웰의 평면도.
도 33. 도 32의 웰의 측면도.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 바람직한 이하의 실시예가 첨부된 도면을 참조하는 비-제한적인 실시예들에 의하여 추가로 설명된다.
실시예 1
1. 세포 선택, 세포 조작 및 그리고 단일-세포
클로닝
이하의 실시예들은 HTS의 창조를 위해 사용되는 포유류 세포 라인들 및 일차 세포들의 선택 및 분리(또는 분류)를 포함하는 세포의 준비를 설명한다. 특정의 특성들을 갖는 세포들의 순수한 집단을 얻기 위한 특정 선택 기술의 선택 또는 특정 표현형의 세포들의 분리를 위한 특정 마커(또는 마커들)의 사용은 여하한 경우에도 제한적이 아니며 단지 지시를 위한 것이다. 다른 세포 마커들 또는 분류 절차들이 동일한 결과들을 얻기 위하여 사용될 수 있다.
1. 1. 불멸 인간 세포 라인들로부터 세포들의 선택
모든 불멸 세포 라인들(이하 참조)이 현탁 배양에서 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 보습된 5% CO2 대기에서 NaHCO3 (JRH Biosciences), 20 mM Hepes (시그마), 4 mM L-글루타민 (시그마)로 변형되고 10% 우혈청(Foetal calf serum, FCS), (JRH Biosciences)가 보충된 변형된 RPMI1640 (Rosewell Park Memorial Institute 배지)를 사용하여 표준 (정상) 조건들 하에서 성장되었다. 달리 설명되지 않는 한, 여기서 설명된 조직 배양 배지 (TC 배지)는 모든 불멸 세포 라인들, 일차 암세포들, 일차 세포 배양들 및 본원 발명을 위하여 수립된 트리-하이브리드 세포 라인들의 배양을 위한 표준 배지이다. 일반적으로, 사용된 모든 세포 라인들, 일차 암세포들 그리고 일차) 세포들은 항생물질-없는(free) 환경에서 배양되었다. 그러나, 박테리아 및/또는 진균 오염의 높은 위험이 의심되는 경우, 2% 페니실린 (5000단위)/스트렙토마이신 (5 mg) 용액 (시그마)이 표준 배지에 포함되었다.
본 발명에 사용된 인간 세포 라인들은 다음과 같다:-
공통 골수계 기원세포 계통, K562 (인간 만성 골수성 백혈병에서 유래된 세포 라인),
T 림프계 계통, MOLT4 (인간 T 림포블라스트) 그리고
B 림프계 계통, WIL2NS (인간 B 림포블라스트).
1.1.1. 단일-세포 전달 시스템
세포 분리 또는 분류, 세포 조작 및 단일-세포 클로닝은 본 발명 전체에서 필수적 과정들이다. 여기서 우리는 관심 대상 단일 세포의 조작 및/또는 클로닝을 위하여 수립된 단일-세포 전달 시스템을 설명한다. 상기 세포 전달 시스템 (도 27)은 주로 유리 마이크로-피펫, 1ml 주사기 그리고 1차 조식(coarse) 조작기로 구성된다. 도 28은 관심 대상의 단일 세포을 집어올리는데 사용되는 유리의, L-자형 마이크로-피펫을 도시한다. 이 피펫은 헤마토크리트(haematocrit) 모세관 튜브로 제조된 것이며, 75밀리미터 (mm) 길이, 외경 및 내경은 각각 1.5mm 및 1.10mm이다. 열을 사용하여, 튜브의 일 말단이 당겨져 팁 (1)의 내경이 대략적으로 250-300마이크로미터 (μm) 그리고 팁의 벽이 대략적으로 30 μm 두께로 얻어졌다. 마이크로-피펫의 다른 쪽 말단은 변형되지 않고 유지되었다. (2). 상기 세포 전달 시스템 (도 27)에서, 주사기 (4)가 조식 조작기 상에 장착되는데, 이는 다시 자기 스탠드 상에 장착된다 (16). 상기 시스템은 주사기의 플런저 (6)가 주사기에 대하여 앞 또는 뒤 중 어느 한쪽으로 매우 천천히 움직일 수 있게 힘이 가해질 수 있도록 작동한다. 관심 대상의 단일 세포를 조작하기 위하여, 주사기는 도면에 나타난 바와 같이 가요성, 의료 등급 튜브 (3)를 사용하여 마이크로-피펫의 변형되지 않은 말단 (2)에 연결되어야 한다. 상기 단일-세포 전달 시스템은 70% 알코올로 수회 씻어내려 멸균하여야 하며 그리고 최종적으로 여하한 세포 조작 전에, 요구되는 여하한, 적당한 조직 배양 배지 또는 용액으로 공기 기포 없이 채워져야 한다.
1.1.2. 단일-세포
클로닝
각각의 세포 라인에서 세포들의 클론들은 단일 세포 클로닝에 의하여 수립되었다. 본 발명에서 사용된 여하한 생물학적 세포들, 예컨대, K562 세포 라인의 세포들의 단일 세포 클로닝 또는 조작 기술이 이하에 설명된다.
K562 세포들의 5 μl의 세포 현탁액을 배양으로부터 로그-단계(log-phase)에 취하여 조직 배양 96-웰 플레이트 (TC 플레이트, Becton 및 Dickinson 또는 BD)의 웰에 넣었는데, 여기에는 150 μl의 TC 배지가 담겨있다. 상기 웰은 “세포-저장 웰”로 지정되었다. 상기 플레이트를 전도(inverted) 현미경 (Axiovert 40C, Carl Zeiss)의 XY 현미경 스테이지에 배치하였다. 단일 세포 조작/클로닝 과정 전에, 마이크로-피펫 (도 28)은 공기 기포 없이 완전히 TC 배지로 충전되었다. 단일-세포 전달 시스템 (도 27)의 마이크로-피펫, 튜빙(tubing) 및 주사기는 일차 조식 조작기 (5) (Narishege)에 장착되었다. 마이크로-피펫 팁 (1)은 팁이 현미경의 광학 시계의 중앙에 위치하도록 정렬되었다. K562의 단일세포를 조작 및 클론하기 위하여, 마이크로-피펫을 세포-저장 웰에 넣었다. 주사기의 플런저를 흡입 방향으로 매우 서서히 움직여, K562의 단일 세포를 마이크로-피펫에 넣었다. 마이크로-피펫을 세포-저장 웰에서 꺼냈다. 현미경 스테이지를 세포-저장 웰로부터 “클로닝 웰”로 지정된 인접 웰로 측면으로 움직이고, 이후 마이크로-피펫을 이 클로닝 웰에 넣어, 마이크로-피펫 내의 단일 세포가 부드럽게 마이크로-피펫으로부터 방출되었다. 이것은 주사기의 플런저를 방출 방향으로 매우 서서히 움직임으로써 달성되었다. 세포-저장 웰에서 단일 세포를 끌어내고 단일 세포를 클로닝 웰에 넣는 과정은 TC 플레이트당 60 단일-세포 클론들이 얻어질 때까지 여러 차례 반복되었다. 클로닝 플레이트는 37℃에서 5% CO2로 작동되는 보습된 인큐베이터 (Thermoline Scientific)에서 10일간 배양되었다. 각각의 클로닝 웰 내의 배지는 배양기간 동안 신선한 TC 배지로 정기적으로 보급되었다. 각각의 클로닝 웰로부터의 각각의 클론의 세포 증식이 24시간 마다 기록되었다. 배양기간 종료시, K562 세포들의 다수의 클론이 수립되었다. 증식 속도가 가장 높은 또는 세포 표면에 발현된 관심 대상 마커, 예컨대, K562 세포들상의 CD71 트랜스페린 수용체,의 농도가 가장 높은 클론이 HTS의 수립 또는 추가의 실험들을 위하여 선택되었다.
1.1.3
CD71
+
세포들의 분류
일 실시예로서, 이하의 방법은 형광-활성 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 K562 세포 라인으로부터 골수 단구 세포 계통의 CD71 양성 세포들의 세포 선택 및 분류를 설명한다.
이 목적을 위하여, 2% 소 혈청 알부민, BSA, (시그마)를 함유하는 100 μl의 포스페이트 버퍼 용액 (Dulbeco PBS)에 현탁된 1 x 105 K562 세포들이 암소에서, 20μl의 피코에리트린 (PE) 컨쥬게이트된 항-CD71 (BD Pharmingen) 또는 PE 컨쥬게이트된 이소타입(isotype) 대조 항체들 IgG2a,κ (BD Pharmingen) 중 하나와 30분 동안 실온에서 배양되었다. 배양 혼합물은 1ml의 PBS로 희석되었고 염색된 세포들 300g에서 10 분간의 원심분리로 수집되었다. 1ml의 PBS로 추가 세척 후, 염색된 세포들은 1ml의 PBS에 현탁되었고 FACS (BD FACS칼리버)를 사용하여 즉시 분석되었다. 도 1은 K562 세포 라인의 CD71+ 세포들의 프로파일들을 도시한다. CD71+ 양성 세포들이 게이트되고(gated) 구분되었다(sorted out) (도 1a). 대략적으로, 65%의 최초 K562 집단이 CD71에 대하여 양성이었다. 분류된 세포들은 300g에서 10 분간 원심분리되고 이후의 실험을 위하여 1ml의 PBS에 현탁되었다. 100ml의 현탁된 CD71+-분류된 세포들이 도 1b에 도시된 바와 같이 순도 분석을 위하여 수집되었다. 순도 99%의 CD71+ 분류 세포가 수득 되었다. 세포 분류 후, K562 세포 라인의 CD71+ 세포들은 추가의 실험을 위하여 사용되거나 또는 표준 배양 조건하의 배양에 배치되고 CD71 강화된 K562 세포들로 마크되었다. 동일한 방법론이 CD71-강화된 WIL2NS 그리고 CD71-강화된 MOLT4 배양들을 수립하기 위하여 사용되었다.
1.2 골수 단구 세포 세포들의 분리
골수 단구 세포 기원세포들은 여하한 불멸 골수 단구 세포 세포 라인들에서 또는 일차 조혈 조직들, 이를테면 골수,에서 유래될 수 있다. 이하는 인간 골수계 세포 라인 K562로부터 그리고 골수 샘플들로부터 골수 단구 세포 기원세포들을 분리하는 실시예들이다.
1.2.1
CD71
+
K562
배양으로부터 골수 단구 세포 세포들의 선택
세포 하이브리드화 실험들을 위한 세포들의 골수 단구 세포 표현형을 확보하기 위하여, CD71+ K562 세포들이 FACS 분석을 사용하여 CD15+ 세포들에 대하여 더욱 강화되었으며(enriched) 이후 분류되었다(sorting).
항목 1.1.3에 설명된 CD71-강화된 K562 세포들이 PE 항-인간 CD71 및 FITC 항-인간 CD15로 표지되었다. (BD Pharmingen). 2% BSA를 함유하는 100 μl의 PBS에 현탁된 1 x 105 세척된 CD71-강화된 K562 세포들이 암소에서 20 μl의 항-인간 CD71-PE 그리고 항-인간 CD15-FITC 항체들 또는 음성 이소타입 대조 항체들 또는 FITC 및 PE 표지된 음성 이소타입 대조 항체들 중 하나와 30분 동안 실온에서 배양되었다. 배양 혼합물은 1ml의 PBS로 희석되고 염색된 세포들은 300g에서 10 분간의 원심분리로 수집되었다. 1ml의 PBS로 추가 세척 후, 염색된 세포들은 1ml의 PBS로 현탁되고 FACS 칼리버 (BD)를 사용하여 즉시 분석되었다.
전형적인 FACS 프로파일은 도 2a에 도시된다. 배양에서 5개월 후, 99%의 CD71-강화된 K562 세포들이 CD71에 대하여 양성으로 유지되었는데, 이는 대략적으로 18%가 표면 CD15를 발현하였다. CD71 및 CD15 모두에 대하여 양성인 세포들은 게이트되었고 (도 2a) 구분되었다(sorted out). 분류된 세포들은 300g에서 10 분간 원심분리하여 수집되고 1ml의 PBS에 추가 실험들을 위하여 현탁되었다. 100 μl의 현탁된 CD71+CD15+ 분류된 세포들이 순도 분석을 위하여 수집되었다. 2개월 배양 후, 분류된 세포들은 CD71 및 CD15의 공동 발현에 대하여 재-분석되었다. (도 2b). 이 결과는 대략적으로 98%의 정제된 세포들이 CD 71 및 CD15 양쪽 모두를 보유한다는 것을 지시한다. 초기에는 CD71 및 CD15 양쪽 모두를 표면에 발현한 일부 세포들이 CD15 발현을 상실하였다는 것이 밝혀졌으며 (도 2b), 이는 K562 세포들에서 골수 단구 세포 계통에의 구속이 안정하지 않으며 가역적임을 제안한다.
1.2.2 일차 세포들로부터 미구속 및 골수 단구 세포 기원세포들의 선택
일 실시예로서, 이하의 방법은 미구속 세포들 또는 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자에서 얻은 골수 샘플들로부터의 골수성 계통의 세포들의 선택을 설명한다. 동일한 방법이 또한 대응되는 혈액 악성 종양들의 골수 샘플들로부터의 다른 계통들의 세포들의 선택에 적용될 수 있다.
AML환자로부터의 골수 조직검사체(aspirates)가 정보제공 및 동의 후 수득되었다. 이 샘플들은 실험들의 실행 전에 AML의 진단이 수립된 환자들로부터 추출되었다. AML 단핵 세포들이 항목 1.3.1에 개시된 동일한 밀도 구배 원심분리 절차를 사용하여 분리되었고, 샘플들로부터 CD34+ 세포들이 분류되거나 또는 FACS를 사용하여 분리되었다.
위에서 얻은 단핵 세포들을 염색하거나 또는 표지하기 위하여, 10 μl의 마우스 항-인간 CD34-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 PE 이소타입 대조 항체 (BD Pharmingen)가 염색 배지 (PBS+5%BSA)내 1 x 106 단핵 세포들의 주어진 분액 100 μl에 추가되었다. 주어진 분액에 대하여, 염색 혼합물이 얼음 상에서 30 분간 배양되었다. 10ml의 아이스-냉각 염색 배지가 세포 펠렛에 첨가되고 7 분간 350g 및 4℃에서 원심분리되었다. 상청액들은 아스피레이션되고(aspirated) 이후 세포 펠렛은 튜브를 살짝 튕겨 재현탁되었는데, 여기에는 동일 상당 부피의 얼음-냉각 염색 배지가 첨가되었다. 염색된 세포들은 원심분리되고 얼음-냉각 염색 배지에 한번 더 세척되었다. 표지된 세포들은 염색 배지에 현탁되었고 FACS에 공급되었다. CD34+ 세포 집단에 대하여 적당한 분류 게이트 들이 설정된 후, 세포 분획들이 수집되었다. CD34+ 세포들이 곧바로 사용되거나 또는 골수 단구 세포 세포들의 강화(enrichment)를 위하여 배양에 배치되었다.
강화 배양들을 위하여, 40 x 103 세포들의 CD34+-강화된 세포들을 합성 세포외 기질로 프리-코팅된 12 웰 플레이트들 내의 플레이트들에 넣었다. 이 세포들은 57 mM의 β-멀캅토에탄올 (시그마), 1 mM 하이드로코르티손 그리고 20 ng/ml의 인간 인터류킨-3 (IL-3) 그리고 인간 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)이 보충된 완전 TC 배지 내에서 팽창되었다. 배양에서 48시간 후, 세포들은 FACS를 사용하여 CD15 발현에 대하여 더욱 선택되었다.
형광-세포 염색을 위하여, 마우스 항-인간 CD15-FITC (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD34-PE (BD Pharmingen)가 사용되었고 이 항목에서 앞서 설명한 것과 유사한 세포 염색 방법이 또한 적용되었다. 염색된 샘플은 FACS를 사용하여 분석되었다. CD34 및 CD15 양성 세포 집단 (CD34+CD15+)에 대한 또는 CD34 양성 및 CD15 음성 세포 집단 (CD34+CD15-)에 대한 적당한 분류 게이트들이 설정된 후, 분획들이 수집되었다.
48시간 배양 후의 CD34+ AML 세포들상의 CD34+ 세포들에 대한 그리고 CD15 발현에 대한 전형적인 발현 프로파일 및 분류 게이트들이 도 3에 도시된다. 대략적으로, 54%의 AML 단핵 세포들이 CD15에 대하여 양성으로 테스트 되면서 CD34 발현을 유지한 반면, 세포 집단의 나머지는 골수 단구 세포 계통에 구속됨이 없이 CD34 발현을 보유하였다. CD34+CD15+ 세포들은 교차분화 시스템의 창조를 위한 실험에 사용되었고, 반면 미구속 CD34+ 세포들은 탈-분화 실험들에 사용되었다.
1.3
림포사이트들의
분리
교차분화 시스템의 수립을 위하여, 림포사이트들이 여하한 타입 특이적 불멸 세포들로부터 또는 일차 림포사이트들로부터 유래될 수 있다. 불멸 WIL2NS 및 MOLT4 세포 라인들로부터 B 그리고 T 림포사이트들의 제조는 각각 항목 1.1.3.에 기재되어 있다. 일차 림포사이트들은 여하한 림프계 조직들 이를테면 말초혈, 탯줄 혈액, 비장, 골수, 가슴샘, 편도, 그리고 국소 림프절들, 에서 분리될 수 있다. 제 1단계로서, 모든 림프계 조직들이 단핵 세포들의 분리를 위하여 가공되었다.
1.3.1. 골수,
말초혈
또는 제대혈로부터 인간
단핵
세포들의 분리
말초혈 샘플들이 정보 제공 및 동의 후 건강한 개인들로부터 수집되었다. 각각의 혈액 샘플은 헤파린 처리된(heparinised) 튜브들에 수입되었고 (Vacutainer, BD), 울혈되었고(pooled), 그리고 RPMI1640에 희석되었다.
인간 골수 조직검사체가 골수 생검을 거치고 여하한 혈액 이상이 없는 정상 골수를 가진 환자들로부터 수득되었다. 샘플들은 1:3 비율로 RPMI1640로 희석되었다.
인간 제대혈 샘플들이 정상의 산달을 채운 질 분만자들로부터 정보제공과 동의 후 수득되었다. 각각의 탯줄 혈액이 헤파린처리된(heparinised) 60ml 주사기로 태아의 분만 및 탯줄 결찰 후, 자궁 적출 전 수집되었다. 각각의 샘플은 RPMI1640로 희석되었다.
말초혈 단핵 세포들 (PBMCs), 골수 단핵 세포들 (BMMCs) 그리고 제대혈 단핵 세포들 (UCBMCs)이 Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia)에 대하여 밀도 원심분리로 준비되었다. 간단히, 10ml의 Ficoll-Paque를 20ml의 세포 현탁액 하에 20ml 주사기에 부착된 케뉼러 튜브를 사용하여 층상화 하였다. 샘플 세포들은 1,700 rpm (700g)로 40 분간 4℃에서 원심분리되었다. 계면의 세포들이 수집되었고 50ml의 RPMI1640로 2,000 rpm (1,000g)으로 10 분간 원심분리에 의하여 세척되었다. 상청액은 폐기하였고 펠렛화된 세포들은 40ml의 RPMI1640에 재현탁되고 1,300 rpm (400g)로 10 분간 원심분리되었다. 적혈구들 그리고 혈소판들은 0.83% (wt/vol) NH4Cl 로 세포용해하여 제거되었고 각각, PBS로 1:2의 비율로 희석된 Ficoll-Paque로 제2 원심분리되었다.
분리된 단핵 세포들은 배양에 사용되거나 또는 FACS을 통하여 세포 특이적 분획들로 분석 및 분류에 사용되었다.
1.3.2. 고형 림프계 조직들로부터 인간
단핵
세포들의 분리
이하의 방법은 비장으로부터 단핵 세포들의 분리를 위한 본 발명에서 사용된 절차를 설명한다. 동일한 방법이 가슴샘, 편도 또는 국소 림프절들로부터 단핵 세포들의 분리에 사용될 수 있다. 세포 염색 및 분류 방법 또한 설명된다.
비장 샘플들이 국제 생명 윤리 가이드라인에 따라 기관 이식 제공자로부터 수득되었다. 비장의 블록들, 대략적으로 각각 2 x 2 x 3cm,가 스플리노사이트들을 분리할 때까지 RPMI 1640에서 4℃로 유지되었다. 각각의 블록들은 주사기의 플런저를 사용하여 멸균 체의 망을 통과시켜 작은 조각으로 절단되었다. 세포들은 이후 20 U/ml 타입 VII 콜라게나아제 (시그마) 그리고 20 U/ml DNase (시그마)로 완전 배지에서 30분 동안 실온에의 소화에 의하여 효소적으로 분열되었다(dissociated). 세포 응집체들은 10mM로 만드는 EDTA의 추가 및 실온에서 5분간의 교반에 의하여 추가로 분열되었다. 스플리노사이트들은 이후 효소 소화를 정지시키기 위하여 완전 배지로 두 번 세척되었고 RPMI 1640에 재-현탁 되었다. 이들 조건들은 비-효소 분열 절차에 비하여 표면 분자 발현에 영향을 주지 않았다 (McIlroy et al 1995) 비장 단핵 세포들은 항목 1.3.1에 설명된 바와 같은 밀도 구배 원심분리, 단 적혈구들의 분리는 제외, 에 의하여 이들 스플리노사이트 현탁액들로부터 분리되었다. 비장 단핵 세포들은 RPMI1640에 재-현탁되고 세포 농도는 ml당 1 x 106 세포들로 조정되었다. 세포 생존율(viability)은 트리판 블루 익스클루션(트리판 블루 염색법)으로 측정하여 98% 이상이었다.
1.3.3. 인간 비장들 및
말초혈로부터
성숙한 B 세포들 그리고
헬퍼
T 세포들의 분리
조직 샘플들은 처음에 항목 1.3.1 및 항목 1.3.2에 설명된 바와 같이 단핵 세포 집단으로 추출하기 위하여 가공되었다. 단핵 세포 집단의 분리 4시간 이내에 형광-세포 염색 후 세포 분류가 수행되었다. 세포들은 염색될 때까지 표준 배양 조건 (항목 1.1 참조) 하에서 완전 배지에 현탁되었다.
이하는 일차 세포들로부터 B 및 T 세포들의 염색 및 분류의 실시예들이다. 통상적으로, B 세포들 및 헬퍼 T 세포들의 선택은 각각 CD19 및 CD4의 표면 발현들에 기초하였다.
간단히, 10 μl의 각각의 마우스 항-인간 CD19-FITC 컨쥬게이트된 항체 (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD4-PE 컨쥬게이트된 항체 (BD Pharmingen) 또는 적당한 이소타입 대조군이 100 μl 분액의, 분액 당 1 x 105 세포들을 함유하는 염색 배지 (PBS+5%BSA)내 단핵 세포들에 추가되었다. 주어진 단핵 세포 집단의 분액에 대하여, 염색 혼합물은 얼음 상에서 30 분간 배양되었다. 10ml의 얼음-냉각 염색 배지가 염색 혼합물에 추가되고 7 분간 350g 및 4℃에서 원심분리되었다. 상청액은 아스피레이션되었고(aspirated) 이후 세포 펠렛은 상당 부피의 얼음-냉각 염색 배지가 추가된 튜브를 살짝 튕겨 재-현탁되었다. 염색된 세포들은 원심분리되고 얼음-냉각 염색 배지로 한번 더 세척되었다. 이 과정은 다른 분액들에 대하여 반복되었다. 염색된 세포들은 FACS를 사용하여 분석되었다. 적어도 20,000 게이트된 이벤트들이 각각의 샘플에 대하여 분석되었다. CD19 양성 B 세포 집단 (CD19+CD4-) 또는 CD4 양성 T 세포 집단 (CD4+CD19-)에 대한 적당한 분류 게이트들이 설정된 후, 분획들이 수집되었다. 1ml의 각각의 분획이 순도 분석을 위하여 수집되었으며 각각의 분획의 나머지는 추가 실험들을 위하여 완전 배지에 재-현탁되었다.
소수의 세포들 (≤ 5×105 세포들)이 적당한 어댑터들(adapters)로 원심 분리 튜브로 직접 분류되었다. 분류 전, 작은 부피 (0.1 내지 0.2ml)의 보충된 RPMI1640가 분류된 샘플과 혼합하여 분류된 세포들의 생존율을 개선하기 위하여 회수 튜브들에 첨가되었다. 분류 후, 다수의 회수된 세포들이 허용되는 경우, 20 μl의 각각의 분류된 세포 샘플이 그것의 순도를 검증하기 위한 재-분석을 위하여 1:10로 희석되었다. 수용 가능한 순도는 ≥95%였다. 추가로 20 내지 40 μl의 FCS가 분류된 샘플 ml당 추가되었고 7 분간 350g로, 4℃에서 원심분리되었다. 세포들은 이후 표준 조직 배양 배지에 재-현탁되었다. 만약 충분한 세포들이 입수된다면, 이들은 수율 측정을 위하여 카운트 되었다.
항-인간 CD19-FITC 및 항-인간 CD4-PE으로 표지된 비장 샘플들의 FACS 프로파일이 도 10a에 도시되며, 분류된 CD19+ B 세포들 및 CD4+ T 세포들의 순도 분석 프로파일들은 도 10b 및 10c에 도시된다. 분획들에서 세포 순도는 CD19+ 세포들에 대하여 98%를 초과하였고 CD4+ 세포들에 대하여 96%를 초과하였다.
말초혈로부터의 CD19+ 및 CD4+ 세포들에 대한 분류 및 순도 프로파일들은 필수적으로 비장 샘플들에서의 그것과 유사하였으며, 단지 좀더 적은 수의 각각의 세포 집단이 수득되었다.
1.3.4. 인간 제대혈로부터
CD5
양성 (항원-경험) B 세포들 및
CD5
음성 (
나이브
) B 세포들의 분리
항목 1.3.1에 기재된 바와 같이 제대혈 샘플들로부터 단핵 세포들이 준비되었다. 단핵 세포 집단의 분리 4시간 이내에 형광-세포 염색 후 세포 분류가 수행되었다. 이 특정 실시예에서, 인간 제대혈로부터의 CD5 음성 (나이브) B 세포들 및 CD5 양성 (항원-경험) B 세포들의 분류는 전술한 방법에 따라 (항목 1.3.3) 마우스 항-인간 CD5-FITC 항체 (BD Pharmingen), 마우스 항-인간 CD19-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적당한 이소타입 대조구를 사용하여 수행되었다.
염색된 샘플들은 FACS를 사용하여 분석되었다. 적어도 20,000개의 게이트된 이벤트들이 각각의 샘플에 대하여 분석되었다. CD5 음성 B 세포 집단 (CD19+CD5-)에 대한 또는 CD5 양성 B 세포 집단 (CD19+CD5+) 집단에 대한 적당한 분류 게이트들이 수립된 후, 다수의 분획들이 수집되었다. 도 4는 마우스 항-인간 CD19 및 마우스 항-인간 CD5로 염색된 샘플들의 전형적인 프로파일을 도시한다.
총 순환 림포사이트들에 대하여 샘플 내의 B 세포들의 퍼센트는 4 내지 19.2%이고 CD5+ B 세포들은 0.8 내지 7.2%의 범주였다.
1.3.5. 인간 제대혈로부터
CD5
양성 (항원-경험) T 세포들 및
CD5
음성 (
나이브
) T 세포들의 분리
단핵 세포들이 제대혈 샘플들로부터 항목 1.3.1에서 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여 추출되었다. 단핵 세포 집단의 분리 4시간 이내에 형광-세포 염색 후 세포 분류가 수행되었다. 이 특정 실시예에서, 인간 제대혈로부터 CD5 양성 (항원-경험) T 세포들 및 CD5 음성 (나이브) T 세포들의 분류는 마우스 항-인간 CD5-FITC 항체 (BD Pharmingen), 마우스 항-인간 CD3-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적당한 이소타입 대조구를 사용하여 전술한 세포의 방법에 따라 (항목 1.3.3) 수행되었다. 염색된 세포들은 FACS를 사용하여 분석되었다. 적어도 20,000의 게이트된 이벤트들이 분석되었다. 분류 게이트들은 CD5 음성 T 세포들 (CD3+CD5-) 또는 CD5 양성 T 세포들 (CD3+CD5+)중 하나를 함유하는 분획들을 수집하도록 설정되었다. 도 5는 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD5 항체로 염색된 샘플들의 전형적인 프로파일을 도시한다.
효율적으로, 분류된 집단들의 회수 및 분석에 사용된 동일한 방법이 항목 1.3.3에 기재되어 있다.
샘플들 내의 T 세포들의 퍼센트는 총 순환된 림포사이트들의 1.7 내지 13.5% 범주였고, CD5+ T 세포들은 0.4 내지 1.3%의 범주였다.
1.3.6. 인간 골수
단핵
집단으로부터
CD
20 및
CD
72 발현들에 기초한 초기 B 세포들, 활성화된 및 휴면(
resting
) B 세포들의 분리
단핵 세포들이 골수로부터 전술한 방법을 사용하여 (항목 1.3.1) 추출되었다. 단핵 세포 집단의 분리 4시간 이내에 형광-세포 염색 후 세포 분류가 수행되었다. 활성화된 B 세포들의 염색 및 분류는 전술한 항목 1.3.3에 기재되어 있다. 특히, 10 μl의 마우스 항-인간 CD72-FITC 항체 (BD Pharmingen) 그리고 20 μl의 마우스 항-인간 CD20-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적당한 이소타입 대조 (PE 마우스 IgG2b,κ 항체들)이 사용되었다. 염색된 세포들은 FACS를 사용하여 분석되었다. 분류 게이트들은 프리-B 세포들, 휴면 그리고 활성화된 B 세포들, 소포성 수지상 세포들 (CD20+CD72-)을 포함하는 CD20 양성 집단 또는 초기 B 세포들 (CD20-CD72+) 또는 활성화된 B 세포들 (CD20+CD72+)를 포함하는 CD72 양성 세포 집단 중 하나를 함유하는 분획들을 수집하기 위하여 수립되었다. 도 6은 마우스 항-인간 CD20 및 마우스 항-인간 CD72 항체들로 염색된 샘플들의 전형적인 프로파일을 나타낸다.
효율적으로, 항목 1.3.3에 기재된 동일한 방법이 분류된 세포들의 회수 및 분석에 적용되었다.
전형적으로, 대략 10-15%의 골수 단핵 세포 집단이 CD20 및 CD72 모두에 대해 양성이었으며; 9-12%의 세포들이 CD20에 대해 양성이나 CD72에 대해 음성이었고; 그리고 대략 8%가 CD72에만 양성이었다.
1.3.7. 자기 구슬(
magnetic
bead
) 분류에 의한
티모사이트
(
thymocyte
) 서브집단들의 분리
MACS CD4 Multisort 키트 (Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여, CD4-CD8- 이중 음성 티모사이트들, CD4+CD8+ 이중 양성 티모사이트들, 그리고 CD4+ 및 CD8+ 단일 양성 티모사이트 세포 집단들이 사용설명서에 따라 구분되었다. 간단히 말해, 항목 1.3.2에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 수집된 티모사이트들이 CD4 Multisort CD4 마이크로구슬들과 30 분간 배양되었다. 5 mM EDTA 및 PBS 내 0.5% BSA로 세척 후, 표지된 세포들은 자기 칼럼들 상에서 구획되었다. 자기 칼럼 상에 보유된 양성 선택된 티모사이트들은 CD4+ 단일 양성 및 CD4+CD8+ 이중 양성 세포 집단들을 함유한 한편, 칼럼을 통화하여 용리된 CD4 고갈된 세포 집단은 CD8+ 단일 양성 및 CD4-CD8- 이중 음성 세포들을 함유하였다. CD4 양성 선택된 세포 집단들로부터 마이크로구슬들을 제거하기 위하여, 세포들은 MACS Multisort 방출 시약과 배양되었다. 20 분 후, 소화가 정지되었고, 세포들은 30 분간 CD8 마이크로구슬들로 표지되었다. CD4+CD8+ 이중 양성 티모사이트들은 양성 선택으로 수득된 한편, CD4+ 단일 양성 세포들은 고갈된 세포 집단에서 발견되었다. CD4 고갈된 세포 집단은 30 분간 CD8 마이크로구슬들로 배양되었다. 자기 칼럼 상에 표지된 세포들을 적용한 후, CD8+ 단일 양성 세포들이 CD4-CD8- 이중 음성 티모사이트들로부터 구획될 수 있었다. 4개의 상이한 티모사이트 서브집단들의 순도는 유세포 분석으로 평가되었다. 수용되는 순도는 95% 이상이었다.
1.3.8 인간 편도로부터
CD54
+
T 세포들의 분리
단핵 세포들이 인간 편도로부터 항목 1.3.2에 기재된 방법을 이용하여 추출되었다. 단핵 세포 집단의 분리 4시간 이내에 형광-세포 염색 후 세포 분류가 수행되었다. CD54+ T 세포들 (세포간 접착 분자-1 또는 ICAM-1) 단핵 편도 세포 집단에서 추출되었고, 마우스 항-인간 CD3-PE 항체 (BD Pharmingen) 그리고 마우스 항-인간 CD54-FITC 항체 (BD Pharmingen) 또는 적당한 이소타입 대조구를 사용하며, 항목 1.3.5에 기재된 세포 염색/분류 방법을 사용하여 선택되었다. 염색된 세포들 ㅇ은 FACS를 사용하여 분석되었다. 분류 게이트들은 CD3+ T 세포들 (즉, CD3+CD54- 세포들) 또는 활성화된 CD54+ T 세포들 (즉, CD3+CD54+ 세포들) 중 하나를 함유하는 분획들을 수집하기 위하여 설정되었다. 도 7은 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD54 항체들로 염색된 샘플들의 FACS 프로파일을 도시한다. CD3+ 세포들이 HTS의 창조를 위하여 사용된 한편, CD54+ 활성화된 T 세포들은 교차분화 실험들에 사용되었다.
실험 결과들은 T 세포들 편도에서 분리된 다수 (82%)의 단핵 세포들을 구성하는 반면, 오직 9%만이 CD54+ T 세포들이었음을 보여준다.
1.4.
IgM
및
IgG
를 분비하는 인간
림포사이트들의
발생 및 선택
정제된 B 세포들 (항목 1.3.3 참조)이 마우스 항-인간 CD154 항체 (BD Pharmingen)로 코팅된 96개의 둥근 바닥 웰 플레이트들 (코닝)의 웰들에 3.75 x 105 세포들/ml로 접종되었다. 세포들은 배양에 3일 후 첨가되는 10% 열 불활성화된 울트라-로우 IgG 우혈청(Foetal Bovine Serum), FBS, (Gibco/BRL) 그리고 100 U/ml의 인간 인터류킨 4 (IL-4) (R&D 시스템들) 그리고 50 ng/ml의 인간 인터류킨 10 (IL-10)으로 보충된 완전 RPMI1640 배지에서 배양되었다. 이 배양들은 매 2 내지 3일 마나 배양 배지의 반을 교체함으로써 보급되었다. 세포 생존율 그리고 카운트는 혈구 계산기를 사용하여 트리판 블루 염색법(trypan blue exclusion)에 의하여 3중으로(in triplicate) 평가되었다. 5일 및 10일에, 배양된 림포사이트들이 수확되었고, PBS에서 두 번 세척되었고 마우스 항-인간 CD19-PE, 마우스 항-인간 IgM-FITC 또는 마우스 항-인간 IgG-FITC 항체들 (모두 BD Pharmingen사 제품)을 사용하여 FACS로 분석되었다. 모든 염색들은 4℃에서 1 x 106 세포들 당 1μg의 각각의 항체로 달성되었다. 모든 분석들에서, 95% 이상의 세포들이 이소타입-매치된 음성 대조 염색에 따라 마커들 세트와 이중-음성이었다. 죽은 세포들 및 파편들을 함유하는 영역들은 분석에서 배제되었다. 모든 분석들은 5,000 내지 10,000 생존 세포들의 게이팅에 의하여 수행되었다.
배양된 림포사이트들에서 IgM 및 IgG 양성 세포들의 전형적인 프로파일들이 도 8에 도시된다. 배양에서 5일 후 18%의 CD19+ 세포들이 IgM 양성이었고 단지 1%만이 표면상에 탐지 가능한 IgG를 나타낸 한편, 10일 후 IgM 양성 림포사이트들의 퍼센트는 단지 2%로 감소한 반면 IgG 양성 세포들의 퍼센트는 15%로 증가하였다. 적당한 게이트들의 설정 후 IgM 양성 및 IgG 양성 분획들이 구분되었다.
배양에서 IgM 및 IgG 농도들은 96 ELISA 웰 플레이트들 및 인간 μ 및 γ 사슬들에 대한 플라스틱-흡수 염소-친화도-정제 항체들(plastic-absorbed goat-affinity-purified antiboides)을 사용하여 표준 ELISA에 의하여 측정되었다. 결합된 항체들은 HRP-컨쥬게이트된 양(sheep) 항-인간 Ig 항체들로 드러났다. 모든 항체들은 시그마 사의 것이었다. ABTS가 기질로서 사용되었고 광학 밀도(optical densities)는 405 nm에서 측정되었다. 표 1은 5 및 10일 후 B 림포사이트 배양에서 탐지된 IgM 및 IgG의 농도를 요약한 것이다.
표 1. 일차 B
림포사이트
배양에서
IgM
및
IgG
의 생산
IgM의 생산은 5일 후 배양에서 감소되는 한편 IgG 생산은 증가하였다.
실시예 2
2. 체세포
하이브리드화
체세포 하이브리드화의 몇몇 방법이 이 분야에 공지되어 있다. 이들은, 예컨대, 융해성(fusagenic) 바이러스 이를테면 센다이 (Sendai) 바이러스를 이용하는 생물학적 방법 (Kohler 및 Milstein, 1975), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하는 화학적 수단들 (Wojciezsyn, et al, 1983), 그리고 전기장들을 사용하는 전기적 방법 (Neil, 및 Zimmermann, 1993)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 각각의 방법은 대상 세포들의 원형질막들을 가역적으로 투과성으로 하고 하이브리드 하는 것을 유도하거나 일으킬 수 있다.
전술한 세포 하이브리드화 방법들을 막론하고, 두 개의 필수적 단계들이, 원칙적으로, 세포 하이브리드화를 달성하기 위하여 요구된다. 먼저, 하이브리드 될 세포들의 원형질막들이 우수한 세포막 접촉에 도달하여야 한다. 둘째로, 접촉 시점에 원형질막들의 가역적인 파괴가 동시에 유도되어야 한다.
전기적 세포 하이브리드화 방법에서, 대상 세포들은 적당한 전기장 주파수를 갖는 교대-전류 전기장 (AC 전기장)을 사용하여 우수한 세포막 접촉에 이르게 할 수 있으며 AC 전기장과 동시에 짧은 전기적 펄스에 노출시키는 경우 하이브리드가 유도될 수 있다.
더욱 구체적으로, 전기적 세포 하이브리드화는 다음의 물리적 현상을 수반한다. ; 유전영동 (DEP) 및 플라즈마 세포 막들의 전기적 파괴.
유전영동 (Pohl,1978)은 유전 입자들, 이를테면 생물학적 세포들의, 적당한 용액에 현탁되고 적당한 주파수의 비-균일 AC 전기장에 도입되는 경우의, 이동을 설명하는 현상이다. 세포들의 이동은 (i) 유전 입자들, 예컨대 0.5 내지 2.0 메가헤르츠 (MHz) 사이의 전기장 주파수에서 100 mM 솔비톨에 현탁된 Sp2 세포들의 병진(translation) 및 이동 (Mahaworasilpa, 1992) 그리고 (ii) 유전 입자들, 예컨대 전기장 주파수 2 내지 10 킬로헤르츠 (kHz)에서 100 mM 솔비톨에 현탁된 Sp2 세포들의 회전 (Mahaworasilpa, 1992)으로 설명될 수 있다는 것은 널리 보고되어 있다. 비-균일 전기장은 한 쌍의 전극들, 예컨대, 다수의 배치로 배열될 수 있는 전기적, 실린더형 와이어들,을 가로질러 전기장을 적용함으로써 발생될 수 있다. 가장 널리 사용되는 배치는 평행 전극 배치이다. (도 30). 비-균일 전기장의 존재 하에, DEP는 유전 입자들 (즉, 생물학적 세포들)이 서로 끌어당기고 동시에 가장 강한 전기장 영역으로 이동하는 것을 일으킬 수 있다. 그 결과, 이것은 세포들의 사슬 또는 스트링들을 형성하고, 차례로, 우수한 세포막 접촉을 유도한다. 세포들의 상호 인력이 그 세포들이 적절히 낮은 전기 전도도의 용액에 현탁되는 경우 강력히 촉진된다는 것은 명백하다.
세포막들의 전기적 파괴는 적절한 하이브리드화 용액에 현탁된 세포들이 적당한 펄스 높이 및 폭을 갖는 전기적 펄스에 노출되는 경우 유도될 수 있다. (Zimmermann, 1982). 펄스 폭의 범위는, 예컨대, 1 내지 200 마이크로 초 (μsec)의 스퀘어 펄스가 널리 사용되며, 하이브리드되는 세포의 타입들에 따른다.
2.1. 전기적 세포
하이브리드화
시스템
본 발명의 일부 실시예들에서, 전기적 세포 기술이 하이브리드된 세포들, 이를테면 교차-분화 세포들의 창조에 사용될 수 있다.
2.1.1. 세포 조작 시스템
세포 하이브리드화 전에 관심 대상의 개별 세포들의 조작을 위하여, 전술한 단일-세포 조작/전달 시스템 (항목 1.1.1)이 본 발명 전체에서 사용되었다.
2.1.2. 마이크로전극들
본 발명에서는 두 개의 L-자형 마이크로전극들이 사용되었다. 도 29는 코팅되지 않은 니켈 합금으로 제조되고, 128 μm 직경의 (7) 마이크로전극을 도시한다. 마이크로전극의 샤프트는 헤마토크리트 모세관 튜브, 1.5mm 외경,으로 덮였다. 마이크로전극의 L-자형 부분은 전극의 수직 및 수평 부분 모두의 표면의 일정 영역이 배지 또는 적당한 용액에 노출되도록 배치되었다. (Mahaworasilpa, 1992). 세포 하이브리드화 과정 전에, 두 개의 마이크로전극들이 각각의 마이크로전극 당 하나씩 두 개의 미세 마이크로조작기들에 장착되었다. 이들 마이크로전극들은 각각의 전극의 평행 전극 배치가 수득 되도록 배열되었다. (도 30). 각각의 미세 마이크로조작기는 수력으로(hydraulically) 작동되고 X, Y 또는 Z 방향으로 0.5 μm 정도로 미세하게 움직일 수 있도록 되어 있다.
2.1.3. 세포
챔버
및 배치
도 31은 본 발명의 일부 실시예들에서 세포 하이브리드화 챔버로서 역할을 하는 표준 96-웰-평평한-바닥 TC 플레이트의 웰 내의 두 개의 평행 전극들을 도시한다. 세포 하이브리드화를 수행하기 위하여 마이크로전극들이 표준 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰 (12)에 함유된 적당한 배지 (11)에 잠겼다. 도 32 및 도 33은 각각 평행 전극 배치의 평면도 및 측면도를 도시하며, 여기서 예컨대 세 개의 하이브리드 되도록 미리-선택된 세포들이 적당한 AC 전기장의 존재 하에 세포들의 사슬을 형성하도록 또는 일렬로 정렬되도록 유도할 수 있게 평행 전극들 사이에 배치된다.
실시예 3
3. 전기적 세포
하이브리드화
방법에 의한 조혈 교차분화 시스템 수립 실시예들
이하의 항목들은 상이한 계통들 또는 세포 타입들 또는 동일한 계통들/또는 세포 타입들, 그러나 상이한 표현형들임, 중 어느 것으로부터 세포들을 하이브리드함으로써 얻어지는 조혈 교차분화 시스템들 (HTS)의 창조 실시예들을 제공한다. 각각의 안정한 시스템은 동시에 부모 세포들의 표현형 특징들을 소유하는 것을 확인하는 분석을 거쳤다. 이 확인은 계통 특이성 세포 표면 마커들, 계통 특이성 마커들의 세포내 발현, 계통 특이성 마커들의 RNA 전사체들의 존재, 및/또는 계통 특이성 단백질들의 분비의 분석에 기초하였다. 이하의 실시예들은 교차분화 시스템들의 가장 전형적 표현형 특성들을 설명한다. 그러나, 이들 실시예들은 선택된 특정 마커에 한정되는 것은 전혀 아니다.
3.1. 하나의 불멸 골수 단구 세포 기원세포, 하나의 불멸 B
림포사이트
및 하나의 불멸 T
림포사이트
-
HTS
-
KMW 유래의
HTS
일 실시예로서, 이 타입의 HTS가 하나의 불멸 골수 단구 세포 기원세포 K562 세포, 하나의 불멸 T 림프계 MOLT4 세포 및 하나의 불멸 B 림프계 WIL2NS 세포의 하이브리드화에 의하여 창조되었다. 이렇게 얻어진 HTS는 HTS-KMW 시스템 (뒤에 시리얼 번호를 수반)으로 표지되었다. 본 발명에서 사용된 HTS-KMW 수립 과정을 위한 이후의 단계들, 용액들 (하이브리드화, 배양 및 회수 배지들) 그리고 파라미터들이 이하에서 설명된다.
3.1.1.
HTS
-
KMW
을 위한 세포의 준비
K562, WIL2NS, 및 MOLT4 세포 라인들이 우리의 표준 TC 배지 (항목 1.1 참조)에서 배양되었으며 보습된 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 일과로서, 각각의 세포 라인은 매 3일마다 계대 배양 되었다(passaged). 세포 하이브리드화 전에, 최고 증식율을 갖는 각각의 세포 타입의 안정한 클론이 항목 1.1.2에 설명된 절차를 사용하여 수립되었다. 일부 실험에서, 항목 1.1.3 에 기재된 바와 같이 수립된 CD71+-강화된 세포 집단들이 사용되었다. 또한, 일부 경우, CD71+-강화된 K562 집단의 CD15+ 세포들 (항목 1.1.3)이 실험들에 사용되었다.
3.1.2.
HTS
-
KMW
수립을 위한 세포
하이브리드화
프로토콜
TC 96-웰 플레이트의 몇몇 웰들이 세포 하이브리드화 웰들로서 사용되었다. 각각의 웰은 대략 150 μl의 하이브리드화 배지로 충전되었는데, 이는 0.2% 소 혈청 알부민, BSA (시그마)으로 보충된 240 mM 솔비톨 (시그마), 2.0 mM KH2PO4 (시그마), 0.4 mM CaCl2 (시그마), 0.2 mM Mg(C2H3O2)2 (시그마) 그리고 0.2 mM Ca(C2H3O2)2 (시그마)로 구성되었다. 전기적 세포 하이브리드화 이전에, 각각의 세포 타입의 미리(pre)-선택된 클론의 세포들은 몇 분간 하이브리드화 배지에서 한번 세척되었고 신선한 하이브리드화 배지 함유 웰로 이동되었다. 이 웰은 프리-하이브리드화 웰로 지정되었다. 세포 하이브리드화 과정 전에, 선택된 각각의 클론의 단일 및 세척된 세포가 조작되었다. 항목 1.1.1에 따라 오직 세 개의 세포들, 각각의 선택된 클론으로부터 하나씩, 한 쌍의 동일한 평행 전극들의 사이에 위치되었는데, 이는 웰의 바닥까지 잠겼다. (도 33에 도시된 바와 같음). 전극들의 분리는 400 마이크로미터로 설정되었다. (예를 들어. 400 μm).
전기적 세포 하이브리드화를 달성하기 위하여, 먼저, 주파수 0.8 MHz 및 미터당 전기장 세기 대략 50-60 킬로볼트 (예를 들어 50-60 kV/m)의 교류 전류 (AC) 전기장이 전극들 사이에 몇 분간 세 세포들에서 유전영동, DEP, 에 의하여 서로 인력이 유도되고 세포들의 스트링을 형성하도록 적용되었다. 이 과정은 세포들이 우수한 세포막 접촉을 만들도록 유도하였다. 세포들은 K562 세포가 세포 일렬선 (14)의 중간에 있도록 배열되었다. (도 32 또는 33 참조). 이후, 두 전기 스퀘어 펄스가, 펄스 간 3초의 간격으로, AC 전기장과 동시에 적용되었다. 대략 170 kV/m의 강도 및 75 마이크로-초 (예를 들어 75 μsec)의 펄스 폭을 갖는 각각의 펄스가 사용되었다. 제 2 스퀘어 펄스의 완료 후, AC 전기장은 또다시 5초간 유지되어, 단일 트리-하이브리드된 세포로의 세포 하이브리드화를 초래하였다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 세 세포들의 하이브리드화가 동시에 일어나지 않을 수도 있음, 즉, 세 세포들 중 두 개의 하이브리드화가 종종 먼저 일어나고 이후 상기 제 3 세포의 하이브리드화가 수반됨, 이 관찰되었다. 일부 경우 추가의 스퀘어 펄스가 완전한 세-세포 하이브리드화를 얻기 위해 요구되었다. 새로 창조된 트리-하이브리드된 교차-분화 세포는 이후 하이브리드화 웰에서 회수 웰로 이동되는데, 이는 하이브리드화 웰들의 열(row)에서 상이한 열에 위치하고 있다. 각각의 회수 웰은 150 μl 표준 TC 배지 (항목 1.1 참조)를 함유하였다. 각각의 새로 수립된 교차-분화 세포는 회수 웰 당 하나의 교차-분화 세포로, 37℃ 및 5% CO2 조성으로 작동되는 보습된 인큐베이터에서 7일간 배양되었다. 대부분의 교차-분화 트리-하이브리드 세포들은 세포 하이브리드화 이벤트 36시간 이내에 분열되는 것으로 나타났다. 배양기간 말에, 각각의 회수 웰의 배지는 신선한 표준 배지로 적당히 보급되었다. 이것은 각각의 교차-분화 트리-하이브리드 클론의 세포증식을 자극하였다. 2 또는 3일 후 분열하는 또는 생존하는 세포들이 각각의 회수 웰로부터 확인되었으며 표준 24-웰 TC 플레이트의 웰들에 플레이트 되어 교차-분화 트리-하이브리드 클론들의 세트를 낳았다. 각각의 교차-분화 트리-하이브리드 클론은 우리의 표준 배양 배지 (항목 1.1 참조) 10밀리리터 (ml)를 함유하는 25cm2 TC 플라스크로 이동되기 전에 24-웰 플레이트에서 한 주 더 배양되었고 추가의 분석을 위하여 적당히 표지되었다. 전기적 세포 하이브리드화 및 교차-분화 트리-하이브리드 회수 과정의 전 과정이 안정한 교차-분화 트리-하이브리드 세포들의 배치를 창조하기 위하여 수차례 반복되었다.
3.1.3.
HTS
-
KMW
의 계통
마커
프로파일
수립된 HTS-KMW 세포 라인 상의 계통 특이성 마커들의 공동-발현의 입증 실시예가 이하에 제공된다.
HTS-KMW 세포 라인이 정상 배양 조건에서 6개월간 수립된 후, 이 HTS-KMW 세포 집단은 골수계, B 및 T 림프계 계통들의 특이성 CD 마커들의 발현에 대하여 분석되었다.
트리-컬러 FACS 분석이 다음의 CD 마커들의 공동-발현들을 검증하기 위하여 사용되었다. : WIL2NS에서 기원한 CD19, K562에서 기원한 CD15, 그리고 MOLT4에서 기원한 CD4.
요약하면, 5% BSA 함유 PBS 내의 1 x 106 세포들/ml의 농도의 100 μl의 HTS-KMW 세포들이 100 μl의 PBS에 현탁되고 30 분간 4℃에서 0.5 mg/100ml의 마우스 항-인간 CD15-PerCP, 0.25mg/100ml의 마우스 항-인간 CD4-PE 그리고 1.0mg/100ml의 마우스 항-인간 CD19-FITC 항체들 또는 적당한 이소타입 대조구와 배양되었다. 모든 마우스 항-인간 항체들은 BD Pharmingen으로부터 입수하였다. PBS로 광범위한 세척 후, 표지된 세포들은 FACS칼리버 유세포 분석기 및 세포 Quest Pro 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
도 9는 HTS-KMW 세포들의 전형적인 FACS 프로파일을 도시하는데, 이는 HTS-KMW 세포들, 여기서 계통 특이성 특성들은 불멸 표현형들로부터 옴, 이 골수계가 우세한, 혼합된 표현형들의 이종의 세포 집단들을 함유한다는 것을 지시한다. 그러나, 62%의 HTS-KMW 세포들은 골수계 및 T 림프계 표현형들을 공유하였고 28%의 HTS-KMW 세포들 T 및 B 림프계 표현형들을 발현한다.
3.1.4.
HTS
-
KMW
로부터의 상이한 표현형 집단들의 분리
HTS-KMW 세포들은 여섯 가지의 상이한 표현형 집단들, 특히 이하로 더욱 분류되었다:
분류 영역들은 도 9에 도시된 바와 같이 설정되었다. 상이한 세포 집단들에 대한 분류 게이트들은 다음과 같이 정의되었다: (1) CD15+CD19+CD4+ 세포 집단은 HTS-KMW.1로 지정되었고 R3 및 R6 영역들 모두가 카운트 되었고; (2) CD15+CD19+CD4- 세포 집단은 HTS-KMW.2로 지정되었고 R5 및 R2 영역들 모두가 카운트 되었고; (3) CD15+CD19-CD4+ 세포 집단은 HTS-KMW.3로 지정되었고 R6 및 R1 영역들 모두가 카운트 되었고; (4) CD15-CD19+CD4+ 세포 집단은 HTS-KMW.4로 지정되었고 R4 및 R3 영역들 모두가 카운트 되었고; (5) CD15-CD19+CD4- 세포 집단은 HTS-KMW.5로 지정되었고 R7 및 R2 영역들 모두가 카운트 되었고; (6) CD15-CD19-CD4+ 세포 집단은 HTS-KMW.6로 지정되었고 R4 및 R1 영역들 모두가 카운트 되었다. 분류된 세포 집단들은 신선한 배양 배지로 이동되었고 정상 배양 조건들 하에서 구획 배양들로서 성장되었다. 각각의 세포 집단의 순도는 분류 즉시 수용되는 순도 98%로 검증되었다.
3.2. 하나의
불멸
골수 단구 세포 기원세포, 하나의 일차 B
림포사이트
및 하나의 일차 T
림포사이트
-
HTS
-
KBT 유래의
HTS
일 실시예로서, 이 타입의 HTS가 K562 세포 라인으로부터의 하나의 불멸 골수계 유래된 세포, 하나의 일차 인간 B 세포 및 하나의 일차 인간 T 세포의 체세포 하이브리드화에 의하여 창조되었다. 이 타입의 HTS가 뒤에 시리얼 번호가 오는 HTS-KBT로 지칭되었다.
3.2.1.
HTS
-
KBT
수립을 위한 세포의 준비
HTS-KBT의 창조 전에 K562 세포들의 준비는 앞에 기재되어 있다. (항목 1.1.3). HTS-KBT의 창조에 사용되는 일차 세포들은 다음을 포함한다: (i) 비장, 말초혈 또는 제대혈 유래의 성숙한 B 세포들 (CD19+); 골수에서 유래된 초기 B 세포들 (CD20-CD72+) ; 골수 유래의 활성화된 B 세포들 (CD20+CD72+) ; 제대혈 유래의 항원 경험 B 세포들 (CD19+CD5+) 그리고 (ii) 비장 및 말초혈 유래의 헬퍼 T 세포들 (CD4+), 제대혈 유래의 항원-경험 T 세포들 (CD3+CD5+); 가슴샘에서 유래된 이중 양성 T 세포들 (CD4+CD8+)은 물론, 제대혈로부터의 CD3+ T 세포들이 실험들에 사용되었다. 다양한 림프계 조직들로부터 다양한 일차 림프계 세포들의 분리는 전술한 항목 1.3.에 기재되어 있다.
3.2.2.
HTS
-
KBT
수립을 위한 세포
하이브리드화
프로토콜
HTS-KBT 수립을 위한 세포 하이브리드화 프로토콜은 HTS-KMW의 수립에 사용된 것과 유사하나(항목 3.1.2), 다만 배지 및 AC 전기장들 그리고 펄스들이 변화되었다. 이들 실험들에 사용된 하이브리드화 배지는 0.3% BSA로 보충된, 230 mM 솔비톨, 1.8 mM KH2PO4, 0.5 mM CaCl2, 0.2 mM Mg(C2H3O2)2 그리고 0.3 mM Ca(C2H3O2)2 로 구성되었다. 0.5 MHz 및 65-75 kV/m의 AC 전기장이 3-초 간격의 세 스퀘어 펄스들의 행렬로 동시에 적용되었는데, 각각의 펄스는 펄스 폭이 100 μsec 그리고 강도가 175-185 kV/m이었다. AC 전기장은 제 3 스퀘어 펄스의 완료 후 추가로 5초 동안 계속 켜져서 교차-계통 트리-하이브리드 세포를 제조하는 세포들의 하이브리드화를 초래하였다. 각각의 새로 형성된 교차-분화 하이브리드 세포의 배양 및 HTS 트리-하이브리드 회수 프로토콜들은 앞서 설명되었다. (항목 3.1.2).
3.2.3.
HTS
-
KBT
의 계통
마커
프로파일
수립된 HTS-KBT 세포들상의 계통 특이성 마커들의 공동-발현의 검증 실시예들이 이하에서 제공된다.
3.2.3.1 하나의 불멸 골수계 세포, 하나의 일차 성숙한 B 세포 및 하나의 일차 작용 T
헬퍼
세포로부터 수립된
HTS
-
KBT
의
마커
프로파일
HTS-KBT 세포 라인이, 예컨대, 정상 배양 조건들에서 몇 달간 수립된 후, 이 세포 라인은 계통 특이성 CD 마커들의 발현에 대하여 분석되었다. HTS-KBT 세포 라인의 세포들은 마우스 항-인간 CD19 및 CD4 항체들로 하이브리드화 전에 세포 준비에서 설명한 바와 같은 동일한 프로토콜들을 사용하여 (항목 1.3.3) 표지되었다. 도 10(d)은 하나의 불멸 골수 단구 세포 세포 및 2 일차 세포들로부터 수립된 HTS-KBT 세포 라인의 FACS 프로파일들 (CD19 및 CD4 표지들)을 도시한다. 전형적으로, 이러한 안정한 교차-계통(lineage) 트리-하이브리드에서 99% 이상의 세포들 이 부모, 일차 세포들의 그것과 유사한 밀도로 B 및 T 세포들 양쪽 모두에 대한 CD 마커들을 발현하였다.
3.2.3.2 하나의 불멸 골수계 세포 및 두 개의 일차 항원-경험 림프계 세포들 (B 및 T 세포들)로부터 수립된
HTS
-
KBT
의
마커
프로파일
다른 실시예에서 하나의 K562 세포, 하나의 항원-경험 B 및 하나의 항원-경험 T 세포의 세포 하이브리드화 유래의 HTS-KBT 세포 라인이 수립되었다. 이 HTS-KBT의 변형체는 HTS-KBTAE로 지정되었다. 세포들이 FACS을 사용하여 CD19, CD3 및 CD5의 공동-발현에 대하여 분석되었다.
요약하면, 세포들은 마우스 항-인간 CD5-FITC 및 마우스 항-인간 CD19-PE 또는 마우스 항-인간 CD4-PE 항체들로 세포 하이브리드화 전에 세포 준비에서와 같은 동일한 프로토콜들을 사용하여 (항목 1.3.3) 표지되었다. 도 11은 그러한 HTS-KBTAE 세포 라인의 세포들의 FACS 프로파일들을 도시한다. 결과들은 5-10%의 HTS-KBTAE 세포 집단이 CD5 분자의 세포 표면 발현을 유지, 한편 CD3 또는/및 CD19에 대하여 양성임, 함으로써 항원 노출의 기억을 보유하는 것을 보여준다. 또한 적어도 83%의 CD5 음성 세포 집단이 B 계통 (CD19) 및 T 계통 (CD3) 마커들 양쪽 모두를 공동-발현하였다.
3.2.3.3
HTS
-
KBT
AE
로부터 상이한 표현형 집단들의 분리
HTS-KBTAE 세포들은 여섯 가지의 상이한 표현형 집단들, 특히 다음으로 더욱 분류되었다:
분류 영역들은 도 11에 도시된 바와 같이 설정되었다. 상이한 세포 집단들에 대한 분류 게이트들은 다음과 같이 정의되었다: (1) CD3+CD19+CD5+ 세포 집단이 HTS-KBTAE.1로 지정되었고 R2 및 R4 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었고; (2) CD3+CD19+CD5- 세포 집단이 HTS-KBTAE.2로 지정되었고 R1 및 R3 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었고; (3) CD3+CD19-CD5+ 세포 집단이 HTS-KBTAE.3로 지정되었고 R4 영역은 카운트되었으나 R2 영역은 카운트 되지 않았고; (4) CD3+CD19-CD5- 세포 집단이 HTS-KBTAE.4로 지정되었고 R3 영역은 카운트 되었으나 R1 영역은 아니었고; (5) CD3-CD19+CD5+ 세포 집단이 HTS-KBTAE.5로 지정되었고 R2은 카운트되었으나 R4 영역은 아니었고; (6) CD3-CD19+CD5- 세포 집단이 HTS-KBTAE.6로 지정되었고 R1은 카운트되었으나 R3 영역은 아니었다. 분류된 세포 집단들은 신선한 배양 배지로 이동되었고 정상 배양 조건들에서 구획 배양들로 성장되었다. 각각의 세포 집단의 순도는 분류 후 즉시 수용되는 순도 98%로 검증되었다.
3.2.3.4 하나의 불멸 골수계 세포, 활성화된 B 세포 및 하나의 일차 이중 양성 미구속 작용 T 세포로부터 수립된
HTS
-
KBT
의
마커
프로파일
다른 실시예에서 HTS-KBT 세포 라인이 하나의 K562, 가슴샘에서 분리된 하나의 T 세포 (CD4+ 및 CD8+에 대하여 이중 양성) 및 골수에서 분리된 하나의 활성화된 B 세포 (CD20+ 및 CD72+)의 세포 하이브리드화로부터 유래되었다. 이 HTS-KBT의 변이체는 HTS-KBTDP로 지정되었다. 세포들은 세포 표면상에 CD4, CD8, CD20 및 CD72의 공동-발현들에 대하여 분석되었다.
요약하면, 이 HTS-KBTDP 세포들은 마우스 항-인간 CD4-PE 및 마우스 항-인간 CD72-FITC 항체들 또는 마우스 항-인간 CD20-PE 및 마우스 항-인간 CD8-FITC 항체들 또는 마우스 항-인간 CD4-PE 및 마우스 항-인간 CD8-FITC 항체들의 항체 조합의 하나로 일차 림포사이트들의 분리에 대하여 기재된 것과 같은 동일한 프로토콜들을 사용하여(항목 1.3). 표지되었다. 도 12는 그러한 HTS-KBTDP 세포들의 FACS 프로파일들을 도시한다.
결과들은 (도 12 참조) 99%의 HTS-KBTDP 세포들이 그 표면에 이중 양성 T 유래된 세포 CD4 또는 CD8 중 하나를 발현, 여기서 66-71%의 세포들은 CD4에 대하여 양성이고 및 88-89%의 세포들은 CD8에 대하여 양성임, 한다는 것을 보여준다. 이들 세포들의 60%에서는, CD4 및 CD8의 발현은 동시에 일어났다. 양성 티모사이트들 유래의 CD4에 대하여 양성인 한편, 61%의 세포들은 또한 골수의 활성화된 B 세포들 유래의 CD72에 대하여 양성이었다. 그러나, 94%의 HTS-KBTDB 집단은 그들의 표면상에 CD72를 발현하였다. 다른 한편, 31%의 CD8 양성 세포들은 CD20을 공동 발현하였다. CD20 양성 세포들의 총 숫자는 39%였다.
3.2.3.5
HTS
-
KBT
DP
로부터 상이한 표현형 집단들의 분리
HTS-KBTDP 세포들은 추가로 15가지의 상이한 표현형 집단들, 특히 이하로 분류되었다: 
분류 영역들은 도 12에 도시된 바와 같이 설정되었다. 상이한 세포 집단들에 대한 분류 게이트들은 다음과 같이 정의되었다. : (1) CD4+CD8+CD20+CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.1로 지정되었고 R2, R5 및 R8 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (2) CD4+CD8+CD20+CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.2로 지정되었고 R2, R8 및 R4 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (3) CD4+CD8+CD20-CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.3로 지정되었고 R2, R5 및 R9 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (4) CD4+CD8+CD20-CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.4로 지정되었고 R2, R4 및 R9 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (5) CD4+CD8-CD20+CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.5로 지정되었고 R1, R5 및 R7 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (6) CD4+CD8-CD20+CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.6로 지정되었고 R1, R4 및 R7 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (7) CD4+CD8-CD20-CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.7로 지정되었으며 R1, R5 및 R12 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (8) CD4+CD8-CD20-CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.8로 지정되었고 R1, R4 및 R12 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (9) CD4-CD8+CD20+CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.9로 지정되었고 R3, R6 및 R8 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (10) CD4-CD8+CD20+CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.10로 지정되었으며 R3, R11 및 R8 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (11) CD4-CD8+CD20-CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.11로 지정되었으며 R3, R6 및 R9 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (12) CD4-CD8+CD20-CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.12로 지정되었으며 R3, R11 및 R9 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (13) CD4-CD8-CD20+CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.13로 지정되었으며 R10, R6 및 R7 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (14) CD4-CD8-CD20+CD72- 세포 집단은 HTS-KBTDP.14로 지정되었으며 R10, R11 및 R7 세 영역들 모두 카운트 되었으며; (15) CD4-CD8-CD20-CD72+ 세포 집단은 HTS-KBTDP.15로 지정되었으며 R10, R6 및 R12 세 영역들 모두 카운트 되었다. 분류된 세포 집단들은 신선한 배양 배지로 이동되었으며 정상 배양 조건들 하에서 구획 배양들로 성장되었다. 각각의 세포 집단의 순도는 분류 즉시 수용되는 순도 98%로 검증되었다.
3.3 일차 골수 단구 세포 기원세포, 불멸 B
림포사이트
및 일차 T
림포사이트
-
HTS
-
WTM 유래의
HTS
의 실시예
일 실시예로서, 이 타입의 HTS가 골수 유래의 하나의 일차 골수계 기원세포, WIL2NS 세포 라인 유래의 하나의 불멸 인간 B 세포 및 하나의 일차 인간 T 세포의 체세포 하이브리드화에 의하여 창조되었다. 이 타입의 HTS가 뒤에 시리얼 번호가 붙는 HTS-WTM라 지칭되었다.
3.3.1.
HTS
-
WTM
의 수립을 위한 세포의 준비
HTS-WTM의 창조에 사용된 WIL2NS 세포들의 준비는 전술한 항목 1.1.3에 기재되어 있다. 비장, 말초혈, 제대혈 및 가슴샘 유래의 헬퍼 T 세포들 (CD4+)의 일차 세포들이 이들 실험들에 사용되었다. 다양한 림프계 조직들로부터 다양한 일차 림프계 세포들의 분리는 앞서 기재되었다. (항목 1.3). 일차 골수계 기원세포들은 항목 1.2.2.에 기재된 CD34+CD15+ 골수 단핵 세포들로부터 유래되었다.
3.3.2.
HTS
-
WTM
의 수립을 위한 세포
하이브리드화
프로토콜
HTS-WTM 생산을 위한 세포 하이브리드화 프로토콜은 HTS-KMW 생산에 사용된 것과 유사하고 (항목 3.1.2 참조), 다만 배지는 변화되었다. 이들 실험들에 사용되는 하이브리드화 배지는 0.3% BSA로 보충된, 235 mM 솔비톨, 1.8 mM KH2PO4, 0.5 mM CaCl2, 0.3 mM Mg(C2H3O2)2, 및 0.25 mM Ca(C2H3O2)2 (시그마)로 구성되었다. 항목 3.2.2에 기재된 그 전기적 프로토콜이 WTM의 생산에 사용되었다. 각각의 새롭게 형성된 교차-분화 하이브리드 세포의 배양 및 HTS 트리-하이브리드 회수 프로토콜들은 전술한 것과 같다. (항목 3.1.2).
3.3.3.
HTS
-
WTM
의 계통
마커
프로파일
수립된 HTS-WTM 세포들 상의 계통 특이성 마커들의 공동-발현의 검증 실시예가 이하에 제공된다.
3.3.3.1 하나의 일차 골수계 기원세포, 하나의 불멸 림프계 세포 및 하나의 일차 T 세포로부터 수립된
HTS
-
WTM
의
마커
프로파일
WIL2NS 세포 라인에서 유래된 하나의 불멸 B 림포사이트, 하나의 일차 T 세포 및 하나의 골수 단구 세포 기원세포의 세포 하이브리드화에서 유래된 HTS-WTM 세포 라인이 정상 조건들에서 (항목 1.1 참조) 6개월간 배양된 후, 이 HTS-WTM 세포 집단은 계통 특이성 CD 마커들의 발현에 대하여 분석되었다. CD19 (B 계통), CD4 (T 계통), CD15 (골수계 계통) 및 CD34 (기원세포)에 대한 표면 마커들의 발현이 분석되었다. 요약하면, 이 HTS-WMT 세포 라인의 세포들이 마우스 항-인간 CD19-PE, 마우스 항-인간 CD4-FITC (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD15-PerCP 항체들의 조합으로 또는 마우스 항-인간 CD34-PE, 마우스 항-인간 CD4-FITC 및 마우스 항-인간 CD15-PerCP 항체들의 조합으로 표지되었다. 세포 염색이 전술한 프로토콜들에 따라 수행되었다. (항목 1.3.3). CD34+CD15+ 골수 단구 세포 기원세포에서 기원한 HTS-WTM 세포들의 전형적인 발현 프로파일들이 도 13에 도시되었다. 이 분석은, 대략적으로 81%의 HTS-WTM 세포들이 B 계통 및 골수 단구 세포 표현형들 (CD19+CD15+)을 공유한다는 것과 61%의 CD19+가 또한 CD4, T 계통 마커에 대하여 양성이라는 것을 보여준다. 34%의 CD4+ 세포들은 또한 그들의 표면상에 CD34를 보유하였고 68%의 CD34+ 세포들은 CD15를 발현하였다. 재미있게도, CD34 및 CD15 양쪽 모두 동일한 공급원 (골수 단구 세포 기원세포)으로부터 왔음에도 28%의 CD34+ 세포들은 CD15 발현을 보유하지 않았다.
3.3.3.2
HTS
-
WTM
로부터 상이한 표현형 집단들의 분리
HTS-WTM 세포들은 여섯 가지의 상이한 표현형 집단들, 특히 이하로 추가로 분류되었다: CD15, CD19 및 CD4에 기초하여 (1) CD15+CD19+CD4+; (2) CD15+CD19+CD4-; (3) CD15+CD19-CD4+; (4) CD15-CD19+CD4+; (5) CD15-CD19+CD4-; 및 (6) CD15-CD19-CD4+ ; 또는 CD15, CD34 및 CD4의 발현에 기초하여 (7) CD15+CD34+CD4+; (8) CD15+34+CD4-; (9) CD15+34-CD4+; (10) CD15-CD34+CD4+; (11) CD15-CD34+CD4-; 및 (12) CD15-CD34-CD4+.
분류 영역들은 도 13(A) 및 13(B)에 도시된 바와 같이 설정되었다. CD15, CD19 및 CD4 발현에 기초한 상이한 세포 집단들에 대한 분류 게이트들은 다음과 같이 정의되었다: (1) CD15+CD19+CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.1로 지정되었으며 R3 및 R6 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었고; (2) CD15+CD19+CD4- 세포 집단은 HTS-WTM.2로 지정되었으며 R6 및 R1 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었고; (3) CD15+CD19-CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.3로 지정되었으며 R5 및 R2 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었고; (4) CD15+CD19-CD4- 세포 집단은 HTS-WTM.4로 지정되었으며 및 R5 영역에서는 카운트 되었으나 R1, R2, 및 R3영역들에서는 아니었고; (5) CD15-CD19+CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.5로 지정되었으며 R3 및 R4 영역들 양쪽 모두가 카운트 되었으나 R5 및 R6는 아니었고; (6) CD15-CD19-CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.6로 지정되었으며 R2 영역은 카운트 되었으나 영역들 R4, R5, 및 R6에서는 아니었다. 분류된 세포 집단들은 신선한 배양 배지로 이동되었으며 및 정상 배양 조건들 하에서 구획 배양들로 성장되었다. 각각의 세포 집단의 순도는 분류 후 즉시 수용되는 순도 98%로 검증되었다.
도 13B는 CD15, CD34 및 CD4의 발현에 기초한 상이한 세포 집단들에 대한 분류 게이트들을 도시한다. 이 게이트들은 다음과 같이 정의되었다: (7) CD15+CD34+CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.7로 지정되었으며 영역들 R3 및 R6 양쪽 모두에서 카운트 되었고; (8) CD15+34+CD4- 세포 집단은 HTS-WRM.8로 지정되었으며 영역들 R1 및 R6 양쪽 모두에서 카운트 되었고; (9) CD15+34-CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.9로 지정되었으며 영역들 R2 및 R5 양쪽 모두에서 카운트 되었고; (10) CD15-CD34+CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.10로 지정되었으며 영역들 R3 및 R4 양쪽 모두에서 카운트 되었고; (11) CD15-CD34+CD4- 세포 집단은 HTS-WTM.11으로 지정되었으며 영역들 R1 및 R4 양쪽 모두에서 카운트 되었고; 및 (12) CD15-CD34-CD4+ 세포 집단은 HTS-WTM.12로 지정되었으며 영역 R2에서 카운트되었으나, 영역 R3에서는 아니며 영역들 R4, R5, 및 R6에서도 아니다. 분류된 세포 집단들 신선한 배양 배지로 이동되었으며 및 정상 배양 조건들 하에서 구획 배양들로 성장되었다. 각각의 세포 집단의 순도는 분류 후 즉시 수용되는 순도 98%로 검증되었다.
실시예 4
4.
HTS
세포들의 환경 조건 변화에 의한 상이한 세포 표현형들로의 교차분화
이 실시예는 세포 계통 허용 또는 세포 계통 촉진 환경에 주어진 HTS의 노출을 통하여 상이한 표현형들로의 세포 교차분화의 가능한 모델들의 일부를 보여준다. 각각의 실시예는 여기서 주어진 조건들에 전혀 한정되지 않는다.
4. 1.
HTS
세포들의
CD4
+
T 세포들로의 교차분화
다음의 서브집단들 HTS-KMW.1, HTS-KMW.6, HTS-KBT, HTS-KBTAE.1, HTS-KBTAE.4, HTS-WTM.1, HTS-WTM.6, HTS-WTM.7 및 HTS-WTM.12 유래의 그리고 항목 3.1.4, 항목 3.2.3.1, 항목 3.2.3.3 및 항목 3.3.3.2에 기재된 바와 같이 제조된 HTS 세포들은 물론 K562, MOLT4 및 WIL2NS 세포들의 대조 배양들이 신선한 배양 배지로 이동되었으며 세포 농도가 ml 당 250,000 내지 500,000 세포들로 조정되었다. 이 세포 배양은 10 U/ml의 인간 IL-2 (BD Biosciences), 10 ng/ml의 인간 IL-1베타 (BD Biosciences), 10 ng/ml의 인간 IL-23 (R&D 시스템들), 1 μg/ml의 항-IL-4, 1 μg/ml의 항-IFN-γ 및 세포당 1 구슬의 비율로 항-CD3/CD28 활성화 구슬들(Invitrogen)로 보충되었고 웰 당 200 μl로 U-자형 바닥 96 웰 플레이트들에 접종되었다. (Corning). 4개의 웰들의 시리즈에 0.1, 1 및 10 ng/ml로 TGF-베타의 증가된 농도가 첨가되었다. 이 배양 배지들은 3일 및 5일에 모든 사이토카인들 및 항체들을 함유하는 신선한 배지로 교체되었다. 8일에 세포들은 항-CD4, 항-CD19 및 항-CD15로 염색되었고 항목 1.3.3에 기재된 바와 같이 유세포 분석법으로 분석되었다. 염색 전에 세포들은 5 시간 동안 50 ng/ml의 PMA, 500 ng/ml의 이오노마이신 및 1 x의 BD GoldgiStop으로 활성화되었다.
이 세포들은 이후 항목 3.1.3에 도시된 바와 같이 마우스 항-인간 CD4-PE, 항-인간 CD19-FITC 및 항-인간 CD15-PerCp 항체들로 표지되었다. 도 14는 배양들에서 CD4, CD19 및 CD15에 대한 트리-염색의 대표적 프로파일을 도시하는데, 여기서 100%의 세포들이 CD4+ 세포들을 향한 유도된 분화 후 표면상에 오직 CD4를 발현하였다. HTS-KMW.1 배양에서, 단일 CD4+ 세포들은 삼중 양성 (CD15+CD19+CD4+) 세포들의 순수한 집단으로부터 개시된 총 세포집단의 49%에 달하였다. HTS-KBT에서는, 이것은 처음의 100% 이중 양성 (CD19+CD4+) 집단에서 유래되어 50%에 달하였으며; HTS-KBTAE.1에서는 100% 삼중 양성 (CD3+CD19+CD5+) 집단의 61%; HTS-KBTAE.4에서는 처음의 100%의 CD3+ 세포들에서 74%; HTS-WTM.1에서는 100% 삼중 양성 (CD15+CD19+CD4+) 집단의 82%; 그리고 HTS-WTM.7에서는 71%가 CD15+CD34+CD4+ 표현형의 100% 삼중 양성 집단으로부터 단일 CD4 양성 세포들이 되었다. 모든 대조 배양들 K562, MOLT4 및 WIL2NS 세포들은 그들의 마커 발현 프로파일이 변하지 않고 유지되었다.
4.1.1
HTS
로부터
발생된
CD4
+
T 세포들의 특성화
CD4+ T 세포들을 향하여 유도된 HTS 배양들로부터 발생된 단일 양성 CD4+ 세포들은 마커들 발현 및 기능적 특성 평가의 추가 분석을 위하여 구분되었다. 수용되는 순도는 CD4+ T 세포들의 총 집단의 98%였다.
4.1.1.1
HTS
배양들로부터
발생된
CD4
+
세포들의 표현형 프로파일
T 림포사이트 허용 HTS 배양들에서 유래된 단일 양성 CD4 세포들이, CD4+ T 세포들의 표면에 독점적으로 발현되거나 또는 CD8+ T 세포 기능들에 중요한, 세포 표면상의 다음의 분자들의 발현에 대하여 추가로 분석되었다: TCRαβ - T 세포 수용체; CD25 - IL-2 수용체 알파 발현된 활성화된 T 세포들 및 CD4+ T 세포들의 조절성 아군(regulatory subset)을 나타내는 CD4과 조합으로; CD27 - T 세포 공동-자극에 수반되는; CD28 - 나이브 T 세포들의 활성화를 지시; CD62L - 나이브 및 기억 T 세포들에서 발현되며 홈잉에 수반되는; CD69 - 활성화된 T 세포들상의 신호 전달 분자; CD95 - 활성화에 따라 상향 조절됨; 및 CD45RO - 활성화된 T 세포 또는 기억 T 세포들을 지시함. 각각의 마커 발현은 CD4과 조합하여 평가되었다. 이 목적을 위하여, 세포들은 마우스 항-인간 CD25-FITC, 마우스 항-인간 CD27-FITC, 마우스 항-인간 CD62L-FITC, 마우스 항-인간 CD69-FITC, 마우스 항-인간 CD95-FITC 또는 마우스 항-인간 CD45RO-FITC 중 어느 하나와 조합한 마우스 항-인간 CD4-PE로 항목 1.3.3에 기재된 것과 동일한 프로토콜에 필수적으로 따라 염색되었다. 표 2는 상이한 HTS 배양들 유래의 CD4+ T 림포사이트들의 표현형 프로파일을 요약한 것이다.
다양한 배양들로부터의 세포들 모두는 그들의 표면에 TCR의 성숙한 형태를 발현하는 한편, CD 발현 프로파일은 HTS 배양들에서 발생된 CD4+ 아군들의 다양성을 보여준다. 세포들은 CD62L 발현에 의하여 증명되는 바와 같이 홈잉에 대하여 상이한 능력을 나타내는데, 이는 다양한 활성화 분자들에 대한 발현 수준에 현저히 상관되어 있다. 특히 일차 골수 단구 세포 기원세포들에서 기원한 HTS-WTM 배양들에서 활성화된 T 헬퍼 세포들의 아군뿐만 아니라 T 세포들의 CD4+CD25+ 조절 아군 발생시키는 것이 가능하였다.
표 2. T 세포 허용
HTS
배양들로부터
발생된
CD4
+
세포들의 표현형
프로파
일
4.1.1.2
HTS
배양들로부터
발생된
CD4
+
세포들의 사이토카인들의 생산
T 세포 허용 HTS 배양에서 발생된 단일 양성 CD4+ 세포들이 4 일간의 10 ng/ml의 리포폴리사카라이드 (LPS)로의 폴리클로날 활성화 후 IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-γ 및 TNF-α의 생산에 대하여 추가로 분석되었다. 이 세포들은 96-평평한-바닥 웰 플레이트들의 웰 당 200 μl의 완전 배지에 200,000 세포들로 접종되었다. 상청액들은 제거되었고 개개의 ELISA 키트로 분석되었다. (모두 Invitrogen에서 구입). 표 3은 HTS 배양들 유래의 폴리클로날 자극된 CD4+에서의 사이토카인 생산의 전형적인 프로파일을 나타낸다.
표 3. T 림프계 촉진 환경에서의
HTS
배양들로부터
발생된
CD4
+
세포들의 상청액들에서 다양한 사이토카인들의 농도
이 사이토카인 프로파일들은 T 세포 허용 환경에서의 HTS 배양들로부터 발생된 CD4+ 세포들에서 염증 우세(inflammatory dominant) 내지 조절 우세(regulatory dominant) 프로파일들의 범주의 상이한 T 세포 아군들의 존재를 재확인시킨다.
4. 2.
HTS
세포들의 세포독성
CD8
+
T 세포들로의 교차분화
다음 HTS 집단들에서 유래된 세포들: 항목 3.2.3.3에 기재된 HTS-KBTAE.1 및 HTS-KBTAE.4; 항목들 3.2.3.5에 기재된 HTS-KBTDP.1, HTS-KBTDP.4, 및 HTS-KBTDP.12은 물론 K562의 대조 배양의 웰들이 세포독성 CD8+ T 림포사이트들의 분화에 사용되었다.
이 목적을 위하여, 대조 K562 세포들 및 각각의 HTS 집단들에서 유래된 세포들이 인간 가슴샘버팀질세포들 단일 층으로 덮인 24 웰 플레이트들에 웰 당 100,000 세포들로 접종되었다. 가슴샘버팀질세포들은, 37℃에서 60분간 자주 교반하면서 0.5 mg/ml의 콜라게나아제 및 2 U/ml DNase로 PBS에서 배양함으로써 단일 세포 현탁액으로 소화된 저며진(minced) 가슴샘의 작은 단편으로부터 제조되었다. 이 세포 현탁액은 배양 배지 (RPMI1640, 10% FCS, 10 IU/ml 페니실린, 10 pg/ml 스트렙토마이신, 및 1 mmol/L L-글루타민)로 한번 세척되었다. 이 가슴샘버팀질 배양들은 2ml의 배양 배지에서 웰 당 106 세포들로 24-웰 플레이트들에서 신선한 또는 동결보존된 세포들 중 하나를 사용하여 수립되었다. 2일 후, 비-부착성 세포들은 배양 배지로 3회 세척에 의하여 제거되었다. 단일 층은 이후 매주 적어도 2회 교환되는 배양 배지에 유지되었다. 이 HTS 배양들은 또한 1% 비-필수 아미노산들, 10 ng/ml의 인간 IL-7 및 100 U/ml의 인간 IL-2 (BD Bioscience)로 보충되었다. 배양 배지는 5일 및 10일에 사이토카인들을 함유하는 신선한 배지로 교체되었다.
14일에, 이 HTS 세포들은 CD8, CD19 및 CD15의 발현에 대하여 분석되었다. 이 목적을 위하여, 세포들 이후 항목 1.3.3에 기재된 바와 같이 마우스 항-인간 CD8-PE, 항-인간 CD19-FITC 및 항-인간 CD15-PerCp 항체들로 표지되었다. 도 15는 HTS KBTDP.12 배양에서 계통 마커의 전형적인 프로파일을 도시하는데, 여기서 100%의 세포들이 CD8+ 세포들을 향하여 유도된 분화 후 단일 양성 (CD8+) 표현형을 나타냈다. KBTAE.1에서, 100% 삼중 양성 CD3+CD19+CD5+ 집단으로부터 단일 양성 CD8 세포들의 수는 53%에 달하였고, KBTAE.4에서 100% 단일 CD3+ 집단에서 유래된 그러한 숫자는 61%였다. HTS KBTDP.1 및 HTS KBTDP.4에서, 단일 CD8+ 세포들의 퍼센트는 각각 100% CD4+CD8+CD20+CD72+ 및 CD4+CD8+CD20-CD71- 집단들의 72% 및 86%까지 상승하였다. 대조 K562 배양들에서는 아무런 변화도 관찰되지 않았다.
4.2.1
HTS
배양들로부터
발생된
CD8
+
세포들의 특징 설명
세포독성 T 세포들을 향하여 유도된 HTS 배양들로부터 발생된 단일 양성 CD8+ 세포들이 마커들 발현 및 기능적 특성화의 추가 분석을 위하여 구분되었다.
4.2.1.1
HTS
배양들로부터
발생된
CD8
+
세포들의 표현형 프로파일
T 림포사이트 허용 HTS 배양들 유래의 단일 양성 CD8 세포들이, 세포독성 T 세포들의 표면상에 독점적으로 발현되거나 또는 CD8+ T 세포 기능들에 대하여 중요한, 세포 표면상의 다음의 분자들의 발현에 대하여 추가로 분석되었다: TCRαβ - T 세포 수용체; CD8α 및 CD8β, 여기서 β 사슬의 하향 조정은 항원 노출 전임을 지시함; CD27 - T 세포 공동-자극에 수반됨; CD28 - 나이브 T 세포들의 활성화를 지시함; CD62L - 나이브 및 기억 T 세포들에서 발현되며 홈잉에 수반됨; CD95 - 활성화에 따라 상향 조정됨; 및 CD45RO - 활성화된 T 세포 또는 기억 T 세포들을 지시함. 먼저, 이 세포들은 항목 1.3.3.에 기재된 것과 필수적으로 동일한 프로토콜에 따라 항-인간 CD8α-PE (BD Pharmingen) 및 항-인간 CD8β-FITC (BD Pharmingen)로 표지되었다. 이후의 염색들에서, 항-인간 CD8β-FITC가 항-인간 TCRαβ-FITC, 항-인간 CD27-FITC, 항-인간 CD28-FITC, 항-인간 CD62L-FITC, 항-인간 CD95-FITC 또는 항-인간 CD45RO-FITC (모두 BD Pharmingen 사로부터 입수)과 조합하여 사용되었다. 표 4는 상이한 HTS 배양들 유래의 CD8+ T 림포사이트들의 표현형 프로파일을 요약한 것이다.
표 4. T 세포 허용
HTS
배양들로부터
발생된
CD8
+
세포들의 표현형 프로파일
마커 프로파일링은, 다양한 집단들의 세포들 모두는 CD8에 대한 α 및 β양쪽 모두의 사슬들과 TCRαβ 단독의 발현에 대하여 동질이었음을 나타냈다. 그러나, 이 세포 집단들은 다른 마커들의 이종의 발현뿐만 아니라 활성화, 홈잉 및 기억에 수반되는 마커 발현들의 상이한 정도 또한 나타냈다.
4.2.1.2
HTS
배양들로부터
발생된
CD8
+
세포들에 의한 사이토카인들의 생산
HTS 배양들로부터 발생된 단일 양성 CD8 세포들이 IFN-γ 및 IL-2의 세포내 생산에 대하여 분석되었다. 이 목적을 위하여, T 림프계 조건에서 HTS 배양들 유래의 단일 양성 CD8 세포들이 표준 배양 조건들 하에서 포오볼에스테르 (PMA) 50 ng/ml 및 이오노마이신(ionamycin) 500 ng/ml로 자극되었다. 1시간 후, 200ng/ml의 브레펠딘 A가 첨가되었으며 이 세포들은 추가로 3시간 동안 표준 배양 조건들 하에서 배양되었다. 세척 후, 세포들은 4% 파라포름알데하이드로 15 분간 20℃에서 고정되었다. 3회의 세척 사이클들 후, 이 세포들은 사포닌으로 투과 가능하게 되고(permeabilised) 항-IL-2-PE (Pharmingen), 항-IFN-γ-FITC 또는 이소타입 대조구로 염색되었다. 도 16은 HTS-KBTAE.4 및 HTS-KBTDP.12 배양들의 단일 양성 CD8 세포들에서 세포내 IL-2 및 IFN-γ의 전형적인 프로파일들을 도시한다. 양쪽 모두의 배양들이 IL-2, IFN-γ 또는 양쪽 모두를 제조하는 세포들을 함유한 한편, IFN-γ 농도의 보다 넓은 범주를 갖는 HTS-KBTAE.4 배양과는 대조적으로 HTS-KBTDP.12 배양은 IL-2에 대한 생산 수준의 넓은 범주를 가졌다.
4.2.1.3
HTS
배양들로부터
발생된
CD8
+
세포들의 세포독성 작용 기능들
세포내 세포독성 과립들의 생산은 최종적으로 분화된 T 세포들을 지시하는 주요 작용 기능이다. 세포내 세포독성 과립들의 탐지를 위하여, T 림포사이트 허용 조건들 내의 HTS 배양들로부터의 단일 양성 CD8 세포들이 4% 파라포름알데하이드로 15 분간 20℃에서 고정되었다. 세척 후, 세포들은 사포닌으로 투과 가능하게 되었으며 항-페르포린-PE (BD Pharmingen) 및 항-그랜자임 A-FITC 항체들 또는 이소타입 대조구로 염색되었다. 도 17은 HTS-KBTAE.4 및 HTS-KBTDP.12 배양들의 단일 CD8 양성 세포들 내의 세포내 페르포린 및 그랜자임 A의 전형적인 프로파일들을 도시한다. 양쪽 모두의 배양들은 기능적으로 분화된 세포독성 T 세포들을 지시하는 페르포린, 그랜자임 A 또는 양쪽 모두에 대하여 양성인 세포들을 함유하였다. 대략적으로, 양쪽 모두의 배양들에서 40%의 단일 CD8 양성 세포들이 그러한 표현형을 획득하였다.
4. 3.
HTS
로부터의
HTS
세포들의 B
림포사이트들로의
교차분화
다음의 HTS 집단들: 항목 3.1.4에 기재된 HTS-KMW.1 및 HTS-KMW.5; 항목 3.2.3.1에 기재된 HTS-KBT; 항목 3.2.3.3에 기재된 HTS-KBTAE.1 및 HTS-KBTAE.6; 항목 3.2.3.5에 기재된 HTS-KBTDP.1 및 HTS-KBTDP.13; 항목 3.3.4에 기재된 HTS-WTM.1 및 HTS-WTM.7,에서 유래된 세포들은 물론 K562, MOLT4 및 WIL2NS의 대조 배양들이 인간 골수 기질 세포 라인 HS-5의 존재 하의 B 림포사이트들의 분화에 사용되었다. HS-5 세포 라인은 4 mM의 L-글루타민, 1.5g/L 소듐 바이카보네이트 및 10% (v/v)의 FCS로 보충된 Dulbecco의 변형된 이글의 배지 (DMEM)에 관례대로 유지되었다. 분화 실험들 1 또는 2일 전에, HS-5 세포들은 24-웰 플레이트들에서 1ml 배양 배지에 웰 당 60,000 세포들로 또는 96-평평한-바닥 웰 플레이트들에서 100 μl의 배양 배지에 웰 당 6,000 세포들로 플레이트 되었다. B-림포사이트 분화 공동-배양들은 HS-5 성장 배지를 제거하고 선택된 HTS 세포 집단들을 24-웰 플레이트들에서 웰 당 1,000 내지 40,000 세포들로 1ml로 그리고 96-웰 플레이트들에서 웰 당 100 세포들로 100 μl로 접종함으로써 개시되었다. 표준 배양 배지는 B 림프계 계통을 촉진하기 위한 첨가제로, 특히 가용성 CD40L 4 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-4 10 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-5 5 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-6 10 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-10 10 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-2 5 ng/ml (Invitrogen)로, 인간 IL-7 20 ng/ml (Invitrogen)로, Flt 3 리간드 20 ng/ml (Invitrogen)로, 줄기 세포-유래된 인자 20 ng/ml (BD Bioscience)로, 인간 IL-3 10 ng/ml (Invitrogen)로 그리고 작용제 항-CD40 mAb 5 μg/ml (클론 HM40-3, BD Bioscience)로 보충되었다. 이 배양 배지는 5일 및 7일에 B 림프계 계통을 촉진하기 위한 첨가제들이 보충된 신선한 배지로 교체되었다. HTS-KMW.1, HTS-KMW.5, HTS-KBT, HTS-WTM.1, HTS-WTM.7로부터의 비-부착성 세포들 및 대조 배양들 K562, MOLT4 및 WIL2NS이 수집되었으며 마우스 항-CD4-FITC, 마우스 항-CD19-PE 및 마우스 항-CD15-PerCP로 염색되었고 항목 1.3.3에 기재된 바와 같이 유세포 분석법으로 분석되었다. 도 18은 B 림포사이트들을 향하여 유도된 분화 후 100% 단일 CD19+세포들의 HTS-KBTAE.6 배양의 전형적인 염색 프로파일을 도시한다. HTS-KBTAE.1 및 HTS-KBTAE.6 배양들의 경우, 비-부착성 세포들은 항-CD4-FITC 대신 항-인간 CD3-FITC로 염색되었다. HTS-KBTDP.1 및 HTS-KBTDP.13 배양들에 대해서는, 마우스 항-인간 CD20-PE가 항-CD19-PE대신 사용되었다.
4.3.1
HTS
배양들로부터
발생된
CD19
+
세포들의 특성화
B 림프계 HTS 배양들 유래의 단일 양성 CD19 세포들이 구분되었으며 B 세포 마커들, B-특이적 전사체들의 존재 및 기능적 특성들 이를테면 이뮤노글로불린 분비 및 플라즈마 세포들로의 분화에 대하여 추가로 분석되었다.
4.3.1.1 다른 B 세포
마커들의
표면 발현
B 림프계 구동(driven) HTS 배양들 유래의 CD19+ 세포들이, B 세포들의 표면상에 독점적으로 발현되거나 또는 B 세포 기능들에 대하여 중요한, 세포 표면상의 다음의 분자들의 발현에 대하여 추가로 분석되었다: CD1c - 항원 제공에서 특화된 역할을 갖는 β2-마이크로글로뷸린과 연관된 MHC 클래스 I-유사 분자들; CD10 - B 세포 발달에 수반되는 아연 메탈로프로테나아제; CD20 - B 세포 활성화 분자; CD22 - B 세포의 단핵구들 및 T 세포들과의 상호작용을 담당하는 성숙한 B 세포들 상에 발현되는 부착 분자; CD38 - 세포 활성화; CD40 - B 세포 분화 및 이소타입 변환 및 세포 사멸로부터 B 세포들 구조에 수반되는 공동-자극; 표면 IgM 및 IgG.
이 목적을 위하여, B 림프계-구동 HTS 배양들 유래의 CD19+ 세포들이 마우스 항-인간 CD1c-PE, 마우스 항-인간 CD10-FITC, 마우스 항-인간 CD20-PE, 마우스 항-인간 CD22-FITC, 마우스 항-인간 CD38-FITC, 마우스 항-인간 CD40-FITC, 마우스 항-인간 IgG-PE 및 마우스 항-인간 IgM-PE 항체들 (BD Pharmingen)로 표지되었다. 필수적으로 모든 마커들에 대하여 항목 1.3.3에 기재된 것과 같은 동일한 염색 프로토콜에 따랐다. 표 5는 상이한 HTS 배양들 유래의 B 림포사이트들의 표현형 프로파일을 요약한 것이다.
표 5. B 림프계 촉진 환경 내의
HTS
로부터
발생된
CD19
+
세포 표현형 분석
새로운 마커 발현, 상향-조정 또는 하향-조정은 대조 배양들 K562, WIL2NS 및 MOLT4에서 관찰되지 않았다.
원래 CD5+ B 세포들 유래의 HTS-KBTAE 집단들이 B 림프계 촉진 환경에서 배양되는 경우, 더욱 활성화된 CD20+, 더욱 성숙한 CD22+ 및 CD40+ 세포들이 탐지되었다. 이들 배양들 또한 LPS 자극 후 보다 많은 IgG 양성 세포들을 함유하였다는 것을 고려하면 (표 6), 이 결과들은 이들 특정 집단들의 기능적 B 세포들 및 플라즈마 세포들로의 분화 능력을 지시한다.
세포 표면상의 CD10, 세포 표면상의 IgM 발현의 소멸과 결부된 프리-B 세포들에 대한 마커, 특히 HTS-WTM 배양들에서,의 출현은 CD19+ 세포들의 원시 프리-B 세포들로의 탈-분화를 강력하게 제안한다.
4.3.1.2
플라즈마
세포들로의 분화 능력
14일에, 배양들은 3.5 mg/ml의 리포폴리사카라이드 (시그마)에 B 림포사이트들을 활성화하고 플라즈마 세포 형성을 유도하기 위하여 노출되었다. 분비된 IgM 및 IgG가 모든 HTS-B 림프계 배양들에 대하여 표준 ELISA 방법으로 96-ELISA-웰 플레이트들 및 인간 μ 및 γ 사슬들에 대한 plastic-absorbed goat-affinity-정제 항체들을 사용하여 정량되었다. 결합된 항체들은 HRP-컨쥬게이트된 양(sheep) 항-인간 Ig 항체들로 노출되었다. 사용된 모든 항체들은 시그마 사로부터 입수하였다. ABTS가 기질로서 사용되었으며 광학 밀도들이 405nm에서 측정되었다. 표 6은 LPS에 노출 후 CD19+ 세포들의 표현형 프로파일을 도시하며 표 7은 7일 및 17일 후 B 림포사이트 배양에서 탐지된 IgM 및 IgG의 농도를 요약한 것이다.
표 6.
LPS
로 자극 후
CD19
+
B 세포의 표현형 분석
IgG 산출 세포들은 물론 CD40+ 양성 세포들의 증가와 동반하여 CD22+ 세포들의 수가 증가되었으므로, HTS-KBT 배양들에서 단일 CD19+ 세포들 수의 감소는 플라즈마 세포들로의 추가 분화의 탓일 수 있다. WTM 배양들에서 덜 성숙한 CD10+ 프리-B 세포들의 수 또한 CD40+ 및 CD22+ 양성 세포들의 발원으로 감소되었다.
ELISA 결과들은, 성숙한 B 세포들에서 플라즈마 세포들로의 일정 정도의 진보가 LPS 자극된 배양들, 특히 HTS-KBT 배양들에서 존재함을 확인시켜 주는데, 여기서 IgG가 최초로 탐지되었다.
표 7. B 림프계 촉진 환경에서
HTS
배양들의
상청액에서
IgM
및
IgG
의 농도
4. 4.
HTS
세포들의 대식세포들로의 교차분화
다음의 서브집단 HTS-WTM.4 및 항목 3.3에 기재된 것에서 유래된 HTS 세포들은 물론 WIL2NS의 대조 배양이 신선한 배양 배지로 이동되었으며 세포 농도는 ml 당 100,000 내지 200,000 세포들로 조정되었다. 세포 배양은 50 ng/ml의 인간 IL-7 (Invitorgen), 50 ng/ml의 인간 IL-6 (Invitrogen), 10 ng/ml의 인간 IL3 (Invitrogen), 100 ng/ml의 인간 M-CSF (BD Biosciences), 30 ng/ml의 인간 GM-CSF (BD Biosciences) 및 50 ng/ml의 Flt3L (Invitrogen)로 보충되었고 24-웰-평평한-바닥 플레이트들에서 웰 당 1ml로 접종되었다. 신선한 배양 배지가 매 3 내지 4일마다 배양에 배양 배지의 반을 신선한 것으로 교체함으로써 보급되었다. 도 19는 8일 후 HTS 배양의 형태를 도시하는데, 여기서 세포들은 부착 세포들의 성장 특성들을 띠었다.
세포들은 이후 마우스 항-인간 CD4, 항-인간 CD19 및 항-인간 CD15 항체들로 항목 1.3.3에 기재된 바와 같이 표지되었다. 도 20은 다수의 세포들이 8 일간 대식세포 허용 배양에 둔 후 모든 마커들의 발현을 상실, CD15는 예외, 하는 것을 도시하는데, 여기서 대략적으로 7%의 세포들이 골수 단구 세포 계통 마커에 대하여 양성을 유지한다. 오직 2%의 세포들이 CD4에 대하여 양성이었으며 CD19에 대하여는 전혀 없었다. 반면 대조 WIL2NS 배양에서는 아무 변화도 관찰되지 않았다.
4.4.1
HTS
에서
발생된
대식세포들의 특성화
HTS-발생된 대식세포들이 다른 대식세포 계통 마커들의 발현에 대하여는 물론 기능성 성능에 대한 분석에 도입되었다.
4.4.1. 1 다른 대식세포
마커들의
발현
인간 대식세포를 독점적으로 특성화하는 단일 마커가 존재하지 않으므로, HTS 발생된 부착 세포들이 또한 CD11b, CD86, CD64, CD14 및 CD115의 발현에 대하여 추가로 분석되었는데, 이들은 대식세포 계통의 특성들이다. 이 목적을 위하여, 대식세포-구동 HTS 배양들 유래의 부착 세포들이 항-인간 CD11b-PE, CD86-FITC, CD64-FITC, CD14-PE 및 항-CD115-PE 항체들 (BD Pharmingen)로 표지되었다. 필수적으로 항목 1.3.3에 기재된 것과 동일한 염색 프로토콜을 모든 마커들에 대하여, 단 CD115-PE를 제외, 따랐다. M-CSF의 이의 수용체 CD115에 대한 결합은 수용체 내재화(internalisation)를 초래할 수 있으며 따라서 표면 염색의 강도를 감소시킬 수 있다. 그러므로, 항-CD115-PE로의 염색 전에, 세포들은 Cytofix/Cytoperm 키트로 (BD Biosciences) 고정되고 투과 가능하게 되어 표면 및 세포내 CD115가 평가될 수 있다. 5 개의 구획 배양들이 대식세포 허용 배지에서 8일 후 세포 표면상의 대식세포 유사 인자들이 발현에 대하여 분석되었다. 도 21은 HTS 세포들 상에서 대식세포-유사 CD 마커들 (평균 + SD)의 분포를 요약한 것인데, 여기서 대략적으로 96%의 세포들이 CD11b에 양성이었고, 95%의 세포들이 CD64에 대하여, 61%가 CD86에 대하여, 56%가 CD14에 그리고 42%가 CD115에 양성이었다. 이들 마커들의 일부가 과립구들 및 수지상 세포들 (DCs)에서 다양한 농도로 발현될 수 있다는 전제 하에, 인간 CD1a, CD83, CD15 및 CD3에 대한 추가 염색이 항목 1.3.3에 기재된 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 소량 (CD15) 내지 염색되지 않음이 관찰되었다. 이들 결과들은 HTS 세포들이 대식세포 허용 배지로 이동되는 경우 대식세포 기능들에 아주 주요한 표면 분자들을 획득한다는 것을 보여주는데, 그러한 것에는 부착 (CD11b), 성장 (CD115 이는 M-CSF에 대한 수용체임), 식작용 (CD86) 및 면역 식작용 (CD64 이는 IgG에 대한 수용체임)이 있다.
4.4.1.2
HTS
로부터
발생된
대식세포들의 기능적 특성화
기능적 특성들을 평가하기 위하여, HTS에서 발생된 대식세포들이 식작용 능력 및 나이트릭 옥사이드 (NO)의 생산에 대하여 추가로 분석되었다.
식작용 능력은 형광 마이크로스피어들 [분자 프로브(Molecular Probes)] 식작용 능력으로 유세포 분석법으로 평가되었다. 대식세포 허용 배지에서 8일 후 HTS 세포들은 ml 당 1,000,000 세포들로 24-웰 플레이트들에서 18 시간 동안 5 μg/ml의 LPS (시그마) 및 카르복실화된 40 nm 및 1000 nm 폴리스티렌 마이크로스피어들과 형광 피코에리트린 (PE) 표지들로 배양되었다. 이 세포들은 수집되었고 얼음 상에서 45분간 CD64에 대한 항-인간 FITC-컨쥬게이트된 항체들과 냉 2% (w/v) BSA/PBS에서 배양되었고, 두 번 세척되고 유세포 분석법으로 분석되었다. 이중 양성 세포들이 평가되었다. 도 22는 대식세포-구동 HTS 세포들에서 식작용 활성의 전형적인 프로파일을 도시한다. 대략, 94%의 세포들이 작은 그리고 큰 구슬들에 대하여 식작용을 나타내었다.
NO의 생산이 대식세포 구동 HTS 세포들을 10 ng/ml의 LPS, 100 U/ml의 인간 인터페론-γ (IFN-γ) 또는 양쪽 모두와 총 부피 200 μl로 웰 당 200,000 세포로 접종된 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 배양함으로써 평가되었다. 하룻밤 자극 후, 50 μl의 세포 없는 상청액이 50μl의 Griess 시약 (1% 설파닐아마이드, 0.1% 나프탈렌디아민 디하이드로클로라이드, 2.5% H3PO4)으로 실온에서 5분간 배양되었고, 550nm에서의 흡수율이 마이크로플레이트 해독기에서 선택되었다. NO의 농도는 소듐 나이트라이트 표준 커브의 선형회귀분석으로 측정되었다. 도 23에 도시된 바와 같이, 대식세포 허용 배지에 노출된 후 HST 세포들은 LPS 및 IFN의 자극에 반응하여 나이트릭 옥사이드를 생산하였다.
실시예 5
5.
HTS
세포들의 상이한 세포 표현형들로의 성숙한 표현형의 세포들과의
하이브
리드화에 의한 교차분화
HTS의 다목적성 및 적용된 교차분화의 메카니즘에 대한 이것의 둔감성(insensitivity)을 추가로 증명하기 위하여, HTS 세포들이 성숙한 작용 T 또는 B 세포와 하이브리드 되었다. 동일한 전략이 또한 상이한 표현형의 교차-분화 세포들에 대하여 적용될 수 있다.
5.1
HTS
세포들의
CD4
양성 T 세포들로의 일차
CD54
+
T 세포와
하이브리드화에
의한 교차-분화
HTS 서브집단들에서 유래된 B 세포들이 전기적 세포 하이브리드화를 통한 CD54+ T 세포들로의 교차-분화에 사용되었다. 특히, 항목 3.1.4에 기재된 HTS-KMW.5 (단일 CD19+ 세포들) , 항목 3.2.3.3에 기재된 HTS-KBTAE.6 (단일 CD19+ 세포들) 및 항목 3.2.3.5에 기재된 HTS-KBTDP.13 (CD20+CD72+ 세포들)에서 유래된 세포들이 이 특정 실시예에서 교차분화에 사용되었다. 항목 1.3.8에 기재된 바와 같이 분리된 일차 인간 CD54 양성 T 세포들이 CD54+ T 세포들의 공급원으로서 사용되었다. 하이브리드화 절차는 필수적으로 대응되는 HTS의 창조에 사용된 것과 동일하였다. (항목 3.1.2 참조). 도출되는 하이브리드들이 안정화된 후, 이들은 표준 배양 조건들 하에서(항목 1.1 참조) 하나의 세포 라인으로서 유지되었으며 항목 1.3.3에 기재된 프로토콜을 따라 표면 마커 발현에 대하여 분석되었다. 이 방법으로 교차-분화된 모든 B 세포 서브집단들은 도 24A에서 대표적 실시예에 의하여 입증된 바와 같이 그들의 CD19+를 상실하고 CD3+ 세포들이 되었다. 이들은 CD54 발현에 대하여 추가로 분석되었다. 요약하면, 100μl 분액들 당 1 x 105 세포들이 항목 1.3.8 에 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따라 마우스 항-인간 CD54-FITC 및 마우스 항-인간 C3-PE 항체들로 표지되었다.(CD54+ T 세포들의 분리) CD54에 대하여 양성인 세포들의 수는 도 24(B)에 제공된 바와 같이 42 내지 85% 범위였다.
5.2
HTS
세포들의
CD19
양성 B 세포들로의 일차
Ig
분비 B 세포들과의
하이
브리드화에 의한 교차-분화
다음의 HTS 서브집단들 유래의 T 세포들이 이뮤노글로불린 (Ig) 분비 세포들로의 교차-분화에 사용되었다. 항목 3.1.4에 기재된 HTS-KMW.6 세포들 (단일 CD4+ 집단), 항목 3.2.3.3에 기재된 HTS-KBTAE.4 (단일 CD3+ 집단), 항목 3.2.3.5에 기재된 HTS-KBTDP.4 (CD4+CD8+ 집단)이 이 목적을 위하여 사용되었다. 항목 1.4에 기재된 바와 같이 분리된 일차 CD40 활성화된 IgM 양성 또는 IgG 양성 B 세포들 중 하나가 일차 Ig 분비 B 세포의 공급원으로 사용되었다. 전기적 세포 하이브리드화 절차는 필수적으로 항목 3.1.2에 기재된 바와 같은 대응되는 HTS의 창조에 사용되는 바와 같은 동일한 절차였다. 도출된 하이브리드들이 안정화된 후, 이들은 유지되고 CD19, CD40 및 표면 Ig의 발현에 대하여 분석되었다. 이 방식으로 교차-분화된 모든 HTS 서브집단들은 그들의 T 세포 마커 발현 (CD3, CD4, 및 CD8)을 상실하였고 CD19, CD40 및 sIg 양성 세포들이 되었다. 도 25는, CD3 발현의 상실 및 표면 IgM의 획득을 나타내는, CD40 활성화된 IgM 양성 B 세포들과 하이브리드화 후 교차-분화 CD3+ HTS-KBTAE.4 세포들의 대표적 실시예를 도시한다.
B 교차-분화된 T 세포 배양들의 상청액들이 앞서 설명된 ELISA법에 의하여 (항목 1.4 참조) IgM 또는 IgG의 존재에 대하여 분석되었다. 세포들은 둥근 바닥 96-웰 플레이트들에서 웰 당 1 x 105 세포들로 접종되었고 표준 조건들 하에서 24 시간 동안 배양되었다. 결과들은 표 8에 요약되어 있다. 각각의 값들은 세 독립적 측정들의 평균 + SD로 주어진다.
표 8. B 세포들로 교차분화 후
HTS
T 세포들에 의한 인간
IgM
및
IgG
의 생산
실시예 6
6. 환경 조건들의 변화에 노출을 통하여
HTS
세포들 유래의 성숙한 B 림포사이트들의
탈분화
항목 4.3.1.1에 기재된 바와 같은 B 림프계 촉진 환경에서 배양된 HTS-WTM.1 및 HTS-WTM.7 유래의 CD19+ 세포들은, 다른 B 림프계 마커들의 발현, 특히 CD10의 상향-조정 및 표면 IgM 발현의 하향 조정,에 대하여 연구되는 경우 (항목 4.3.1.1 참조), 덜 성숙한 B 세포 타입들로의 탈분화의 징후를 보여준다. 이들 배양들에서 개시된 탈-분화 과정을 확인하기 위하여, 이들 세포들은 항목 7.1에서 설명된 조혈 줄기 세포 촉진 환경에 놓였고 그러한 배양에서 5일 후 또한 다른 초기 B 세포 마커들 이를테면 Pax-5, λ-유사 및 CD34의 전사체 존재에 대하여 조사되었다.
요약하면, 총 RNA가 배양된 세포들로부터 RNeasy 키트 (RNeasy Mini kit, Qiagen)를 사용하여 준비되었다. cDNA 합성은 cDNA-키트 (Amersham Pharmacia)로 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행되었고, PCR은 필수적으로 Sewing et al에 기재된 바와 같이 수행되었다. PCR 반응 혼합물은 아가로스 젤 (2%) 전기영동 및 에티딘 브로마이드 염색에 의한 가시화로 분석되었다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍들은 다음의 서열을 가졌다:
인간 β2-마이크로글로뷸린: 센스,
도 26은 HTS-WTM 배양들이 실제로 초기 B 세포 발달에 대한 전사체들, 이를테면 Pax-5 및 λ-유사,의 발현을, 그러한 전사체들을 함유하지 않는 HTS-KMW.1 배양들과 비교하였을 때, 나타낸다는 것을 도시한다. 추가로, CD34 또한 HTS-WTM.7 배양들에서 전사되고 있다. 이 결과는 성숙한 CD19+ 세포들이 변화된 환경 조건에 반응하여 초기 단계 B 세포들로의 탈-분화된다는 것을 강력하게 지시한다.
실시예 7
7. 체세포
하이브리드화를
통한
HTS
세포들에서
유래된
상이한 표현형들의 성숙한 세포들의
탈분화
HTS의 유연성을 추가로 입증하기 위하여, 다양한 HTS 배양들 유래의 표현형적으로 구별되는 서브집단들이 일차 조혈 줄기 세포들과의 체세포 하이브리드화를 통하여 탈-분화에 도입되었다. CD34+ 골수 줄기 세포들이 항목 1.2.2에 기재된 바와 같이 선택되었다. 필수적으로, 항목 3.1.2에 기재된 것과 같은 체세포 하이브리드화를 위한 동일한 프로토콜이 사용되었다.
7.1
HTS
배양들로부터 교차-분화된 B 세포들의 탈-분화
B 림프계 촉진 환경에서 성장된 KBTAE.6 및 KMW.5의 배양들 유래의 B 세포들이 이 특정 실시예에 사용되었다. 이 배양들은 양쪽 모두의 배양들의 모든 세포들의 100%가 CD19+에 대하여 양성으로 그들의 순도가 선택되었다. B 림프계 촉진 환경에 노출 후 이들 HTS 배양들의 마커 발현 프로파일이 표 5에 요약되어 있다 (항목 4.3.1.1 참조). KMW.5는 HTS의 창조에 사용된 모든 세 세포들이 불멸 표현형을 갖는 경우를 대표하며, KBTAE.6는 불멸 골수계 기원세포 및 일차 B 및 T 림포사이트들 유래의 것이었다. 골수 유래의 CD34+ 줄기 세포와 하이브리드화 후, HTS 배양들은 인간 IL-6 20 ng/ml, 인간 SCF 300 ng/ml, 인간 fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드 (hFLT3L) 100 ng/ml, 인간 트롬보포이어틴(thrombopoietin) (hTPO) 20 ng/ml, 및 인간 IL-3 60 ng/ml으로 보충된 표준 배양 배지에서 성장되었다. 배양에서 1개월 후, 세포 집단은 항목 4.3.1.1에 기재된 B 림포사이트 관련 마커들은 물론, CD34 및 CD130의 발현에 대하여 분석되었다. 세포들은 항목 1.2.2에 기재된 것과 같은 동일한 마우스 항체들은 물론, 마우스 항-인간 CD34-PE 및 마우스 항-인간 CD130-FITC로 골수로부터 CD34+ 세포들의 분리에 대하여 기재된 바와 같은 동일한 프로토콜을 사용하여 (항목 1.2. 참조) 표지되었다. 표 9는 탈-분화 개시 후 세포들의 CD 프로파일을 요약한 것이다.
표 9.
HTS
배양들 유래의 B
림포사이트들로부터
탈-분화된 세포들의 표현형 프로파일 (%)
양쪽 모두의 배양들에서 막대한 다수의 세포들이 이의 B 세포 계통의 랜드마크 마커들, 이를테면 표면 Ig 및 CD19, 을 상실한 한편, 상향-조정된 CD10 발현 및 CD34 획득을 나타냈다.
7.2
HTS
배양들로부터 교차-분화된
CD4
+
T 세포들의 탈-분화
T 림프계 촉진 환경에서 성장된 KMW.6의 배양 유래의 CD4+ T 세포들이 이 특정 실시예에 사용되었다. 이 배양들은 100%의 모든 세포들이 CD4+에 대하여 양성으로 순도가 선택되었다. T 림프계 촉진 환경에 노출된 후 이들 HTS 배양의 마커 발현 프로파일은 표 2에 요약되어 있다. (항목 4.1.1.1 참조). 골수에서 유래된 CD34+ 줄기 세포와 하이브리드화 된 후, 이 HTS 배양들은 조혈 줄기 세포들 (HSC)의 성장을 촉진하는 다양한 사이토카인들로 보충된 표준 배양 배지에서 성장되었다. (항목 7.1 참조) HSC 환경에서 1개월 후, 세포들은 항목 4.1.1.1에 기재된 CD4+ T 세포들 관련 마커들은 물론, CD34 및 CD130의 발현에 대하여 분석되었다. 아래의 표 10은 탈분화된 CD4+ 세포들의 표면상의 CD 발현의 프로파일을 도시한다.
표 10.
HTS
배양들 유래의
탈분화된
CD4
+
T 세포들의 표현형 프로파일 (%)
막대한 다수의 세포들이 CD4 및 TCR의 발현을 상실하는 한편, CD25의 발현을 상향-조정하고 CD34의 발현을 획득하였다.
7.3
HTS
배양들로부터 교차-분화된
CD8
+
T 세포들의 탈-분화
T 림프계 촉진 환경에서 성장된 KBTDP.12의 배양 유래의 CD8+ T 세포들이 이 특정 실시예에 사용되었다. 이 배양들은 100%의 모든 세포들이 CD8+에 대하여 양성으로 그들의 순도가 선택되었다. T 림프계 촉진 환경에 노출 후 이들 HTS 배양의 마커 발현 프로파일은 표 4에 요약되어 있다. (항목 4.2.1.1 참조). 골수 유래의 CD34+ 줄기 세포와 하이브리드화 된 후, 이 HTS 배양은 조혈 줄기 세포들 (HSC)의 성장을 촉진하는 다양한 사이토카인들로 보충된 (항목 7.1 참조) 표준 배양 배지에서 성장되었다. HSC 환경에서 1개월 후, 세포들은 항목 4.2.1.1에 기재된 CD8+ T 세포들 관련 마커들은 물론, CD34 및 CD130의 발현에 대하여 분석되었다. 아래의 표 11은 탈분화된 CD8+ 세포들의 표면상의 CD 발현 프로파일을 도시한다.
표 11.
HTS
배양들 유래의
탈분화된
CD8
+
T 세포들의 표현형 프로파일 (%)
거의 모든 세포들이 그들의 CD8 및 TCR 발현을 상실한 한편 CD34의 발현을 획득하였다.
비록 본 발명은 특정 실시예들을 참조하여 설명되었으나, 이 분야의 통상의 기술자들은 본 발명이 여기에 기재된 본 발명의 기술적 사상 및 광의의 원칙들을 유지하면서 많은 다른 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Stephen Sanig Institute
<120> Methods of generating cells exhibiting phenotypic plasticity
<130> 62260WOP00
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
acccccactg aaaaagatga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atcttcaaac ctccatgatg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctcttctgtc cagtcacaga cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gaatagctct ggtggcttgc aa 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ctgtgacaat gatcgcactc tatg 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gattccagtg cattcatagt aatctc 26
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atgcatgcgg ccgcggcatg tgtttggcag c 31
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
atccgcggcc gcatcgatag gtcaccgtca agatt 35
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
agcaggacag gacatggagg a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atcctgttga tggaactgac gc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
tcaccgtggc aacctgacca tg 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
gagacagcac gttcccgtta ctg 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gacacggccg tgtattactg 20
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
atccgcggcc gcggaattct cacacaggag acga 34
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
atgacccagt ctccatcctc cctg 24
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
atgcggccgc gggaagatga agacagatg 29
Claims (40)
- 이하의 단계들을 포함하는, 소정의 표현형의 세포 제조 방법:
제 1 세포, 여기서 상기 제 1 세포는 줄기 세포 또는 미구속(uncommitted) 기원(progenitor) 세포 유래의 세포임;
공통 림프계 기원세포 유래의 제 2 세포; 그리고
공통 림프계 기원세포 유래의 제 3 세포를 하이브리드시켜 하이브리드(hybrid) 세포를 제조하는 단계 및
하이브리드 세포를 소정의 환경에 노출시켜 상기 하이브리드 세포가 상기 소정의 표현형을 갖는 세포로 되는 단계. - 제 1항에 있어서, 상기 소정의 표현형은 B 세포, T 세포 또는 골수계(myeloid) 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 소정의 표현형은 상기 하이브리드 세포에 비하여 탈-분화된 표현형임을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 탈-분화된 표현형은 CD 34 또는 CD10 또는 Pax-5 또는 λ-유사(like) 중에서 하나 이상을 발현을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 세포는 B 림프계 계통 유래의 세포이고 상기 제 3 세포는 T 림프계 계통 유래의 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 세포는 공통 골수계 기원세포 유래의 세포임을 특징을 하는 세포.
- 제 6항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원세포 세포 유래의 세포는, 골수 단구 세포 기원세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기구임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 CD 항원들 CD16, CD15 또는 CD14 중 하나 이상을 디스플레이함을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 단핵구임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 일차(primary) 골수 단구 세포 기원세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포는 불멸화된(immortalized) 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포가 비장, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포가 프리(pre)-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브(naive) B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작용(effector) B 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 작용 B 세포는 항원-경험 B-세포 또는 플라즈마 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 또는 제 13항에 있어서, 세포 B 림프계 계통 유래의 세포는 이하의 CD 항원들 CD19, CD20, CD72 또는 CD5 중 하나 이상을 디스플레이함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작용 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 또는 제 16항에 있어서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 이하의 CD 항원들 CD 3, CD4, CD5 또는 CD 8중 하나 이상을 디스플레이함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 불멸화된 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포는 림프계 조직으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 림프계 조직은 말초혈, 탯줄 혈액(cord blood), 비장, 골수, 가슴샘, 편도, 아데노이드, 및 국소 림프절로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세포가 인간 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세포가 마우스 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서 상기 공통 골수계 기원세포 유래의 세포가 K562 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 세포 또는 상기 제 3 세포가 WIL2NS 세포 또는 MOLT4 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 B 림프계 계통 유래의 세포가 WIL2NS 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 T 림프계 계통 유래의 세포가 MOLT4 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 세포가 K562 세포이고, 상기 제 2 세포가 WIL2NS 세포이며 상기 제 3 세포가 MOLT4 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제 1 세포가 K562 세포, 상기 제 2 세포가 일차 B 세포이고 상기 제 3 세포가 일차 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 B 세포 및 상기 T 세포가 CD5를 발현함을 특징으로 하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 B 세포가 CD20 및 CD72을 발현하고 상기 T 세포가 CD4 및 CD8을 발현함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 세포가 일차 인간 단핵구이고, 상기 제 2 세포가 WIL2NS 세포이며 상기 제 3 세포가 일차 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 세포가 일차 인간 골수 단구 세포 기원세포이고, 상기 제 2 세포가 WIL2NS 세포이며 상기 제 3 세포가 일차 인간 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 세포는 K562 세포이며, 상기 제 2 세포는 WIL2NS 세포이고 상기 제 3 세포는 일차 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 한에 있어서, 상기 하이브리드 세포는 줄기 세포와 더 하이브리드 됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 한에 있어서, 상기 소정의 환경은 가슴샘버팀질세포(thymic stromal cells), 사이토카인, 성장 인자, 이뮤노글로불린, 수용체 리간드 또는 이들의 조합을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 성장 인자는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-1베타, IL-7, IL-23, TGF-β, M-CSF, GM-CSF, 및 IFN-γ로 구성되는 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린은 항-IL-4, 항-IFN-감마 및 항-CD3/CD28로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 상기 수용체 리간드는 Flt 3 리간드 또는 CD40 리간드임을 특징으로 하는 방법.
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