JPH11100400A

JPH11100400A - インターロイキン−１８受容体蛋白質

Info

Publication number: JPH11100400A
Application number: JP9366674A
Authority: JP
Inventors: Kakuji Torigoe; 角二鳥越; Shinpei Ushio; 真平牛尾; Toshio Kunikata; 敏夫國方; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-12-26
Filing date: 1997-12-26
Publication date: 1999-04-13

Abstract

(57)【要約】【課題】インターロイキン−１８を認識する受容体
及びその受容体に特異的なモノクローナル抗体並びにそ
れらの用途を提供することを課題とする。【解決手段】インターロイキン−１８を認識する受容体
蛋白質、その受容体蛋白質を有効成分として含んでなる
感受性疾患剤、該受容体蛋白質に特異的なモノクローナ
ル抗体、そのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリ
ドーマ、同モノクローナル抗体を用いるインターロイキ
ン−１８受容体蛋白質の精製方法及び検出方法、有効成
分として同モノクローナル抗体を含んでなるインターロ
イキン−１８に対する阻害剤、同モノクローナル抗体を
インターロイキン１８受容体蛋白質に作用させることを
特徴とするインターロイキン−１８の阻害方法、有効成
分として同受容体蛋白質を含んでなるインターロイキン
−１８に対する中和剤、そして、インターロイキン−１
８に同受容体蛋白質を作用させることを特徴とするイン
ターロイキン−１８の中和方法により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明はサイトカインを認
識する新規な受容体蛋白質に関するものであり、詳細に
は、インターロイキン−１８を認識する受容体（以下、
「ＩＬ−１８Ｒ」と略記する。）を構成する蛋白質、す
なわち、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質と、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ
−１８」と略記する。）は、免疫系における情報伝達物
質であるサイトカインの一種である。ＩＬ−１８は、特
開平８−２７１８９号公報、特開平８−１９３０９８号
公報及びハルキ・オカムラら『ネイチャー』、第３７８
巻、第６，５５２号、８８乃至９１頁（１９９５年）に
見られるように、発見当初、インターフェロン−γ誘導
因子として記載されていたが、その後、シンペイ・ウシ
オら『ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー』、第１５
６巻、４，２７４乃至４，２７９頁（１９９６年）にお
ける提案にしたがって、「ＩＬ−１８」と呼称されるよ
うになった。成熟型のＩＬ−１８は１５７個のアミノ酸
からなり、免疫担当細胞において生理活性物質として有
用なインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略
記する。）の産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞
障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質
を兼備している。これらの性質故に、ＩＬ−１８は抗ウ
イルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬
品として広範な用途が期待され、鋭意研究が進められて
いる。

【０００３】前述のとおり、ＩＬ−１８にかぎらず、サ
イトカインは、本来、免疫系における情報伝達を担う物
質として産生され、分泌される。したがって、サイトカ
インが哺乳類の体内で過剰に産生されたり、外部から過
剰に投与されたりすると、免疫系のバランスに片寄りを
生じる可能性がある。哺乳類の細胞の表面には、通常、
受容体と呼ばれるサイトカインを認識する部位があり、
分泌されたサイトカインは、この受容体に結合すること
によって、初めて所期の情報を細胞に伝達することがで
きる。正常な免疫系においては、サイトカインとサイト
カインを認識する受容体がある一定のバランスを保って
いると考えられる。したがって、斯界においては、ＩＬ
−１８を医薬品として実用化するためにも、ＩＬ−１８
そのものの生理作用の解明に加えて、ＩＬ−１８Ｒ蛋白
質の性質・性状が一刻も早く解明され、量産されること
が期待されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、ＩＬ−１８を認識する受容体を
提供することにある。

【０００５】さらに、この発明の第二の課題は、斯かる
受容体の医薬としての用途を提供することにある。

【０００６】加えて、この発明の第三の課題は、斯かる
受容体に対するモノクローナル抗体を提供することにあ
る。

【０００７】さらに加えて、この発明の第四の課題は、
斯かるモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ
を提供することにある。

【０００８】さらに加えて、この発明の第五の課題は、
斯かるモノクローナル抗体の製造方法を提供することに
ある。

【０００９】さらに加えて、この発明の第六の課題は、
斯かるモノクローナル抗体を用いてＩＬ−１８を認識す
る受容体を精製する方法を提供することにある。

【００１０】さらに加えて、この発明の第七の課題は、
斯かるモノクローナル抗体を用いてＩＬ−１８を認識す
る受容体を検出する方法を提供することにある。

【００１１】さらに加えて、この発明の第八の課題は、
斯かるモノクローナル抗体を用いてＩＬ−１８を認識す
る受容体を検出するための試薬を提供することにある。

【００１２】さらに加えて、この発明の第九の課題は、
斯かるモノクローナル抗体を用いるＩＬ−１８に対する
阻害剤を提供することにある。

【００１３】さらに加えて、この発明の第十の課題は、
斯かるモノクローナル抗体によるＩＬ−１８の阻害方法
を提供することにある。

【００１４】さらに加えて、この発明の第十一の課題
は、ＩＬ−１８を認識する受容体を用いるＩＬ−１８に
対する中和剤を提供することにある。

【００１５】さらに加えて、この発明の第十二の課題
は、ＩＬ−１８を認識する受容体を用いてＩＬ−１８を
中和するＩＬ−１８の中和方法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者がこれらの課題
を解決すべく鋭意研究したところ、ホジキン病患者に由
来するリンパ芽球様細胞の一種であるＬ４２８細胞中に
ＩＬ−１８を認識する物質が存在していることを突き止
めた。本発明者がこの物質を分離し、性質・性状を調べ
たところ、その本質は蛋白質であり、分離された状態に
おいてもＩＬ−１８をよく認識し、結合することが判明
した。斯くして存在が確認されたＩＬ−１８Ｒ蛋白質
は、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩ
Ｌ−１８を認識・結合し、自己免疫疾患を始めとする過
剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に効果
を発揮することが判明した。さらに、このＩＬ−１８Ｒ
蛋白質を抗原に用いてＩＬ−１８Ｒ蛋白質に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを樹立す
るとともに、その産生するモノクローナル抗体がＩＬ−
１８Ｒ蛋白質の精製、検出に極めて有用であること、な
らびに、当該モノクローナル抗体がＩＬ−１８の生理作
用を効果的に阻害することを確認してこの発明を完成し
た。

【００１７】すなわち、この発明は前記第一の課題を、
ＩＬ−１８を認識するＩＬ−１８Ｒ蛋白質により解決す
るものである。

【００１８】この発明は前記第二の課題を、有効成分と
してＩＬ−１８Ｒ蛋白質を含んでなる感受性疾患剤によ
り解決するものである。

【００１９】この発明は前記第三の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体により解決する
ものである。

【００２０】この発明は前記第四の課題を、斯かるモノ
クローナル抗体を産生し得るハイブリドーマにより解決
するものである。

【００２１】この発明は前記第五の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生し得るハ
イブリドーマを生体外又は生体内で培養する工程と、そ
の培養物又は体液からモノクローナル抗体を採取する工
程を含んでなるモノクローナル抗体の製造方法により解
決するものである。

【００２２】この発明は前記第六の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体をＩＬ−１８Ｒ
蛋白質と夾雑物質を含む混合物に接触せしめてモノクロ
ーナル抗体にＩＬ−１８Ｒ蛋白質を吸着せしめる工程
と、吸着したＩＬ−１８Ｒ蛋白質をモノクローナル抗体
から脱着させ、採取する工程を含んでなるＩＬ−１８Ｒ
蛋白質の精製方法により解決するものである。

【００２３】この発明は前記第七の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を被検試料に接
触せしめ、免疫反応によりＩＬ−１８Ｒ蛋白質を検出す
るＩＬ−１８Ｒ蛋白質の検出方法により解決するもので
ある。

【００２４】この発明は前記第八の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を含むＩＬ−１
８Ｒ蛋白質の検出試薬により解決するものである。

【００２５】この発明は前記第九の課題を、有効成分と
してＩＬ−１８Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体
を含んでなるＩＬ−１８に対する阻害剤により解決する
ものである。

【００２６】この発明は前記第十の課題を、ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体をＩＬ−１８Ｒ
蛋白質に作用させることを特徴とするＩＬ−１８の阻害
方法により解決するものである。

【００２７】この発明は前記第十一の課題を、有効成分
としてＩＬ−１８Ｒ蛋白質を含んでなるＩＬ−１８に対
する中和剤により解決するものである。

【００２８】この発明は前記第十二の課題を、ＩＬ−１
８にＩＬ−１８Ｒ蛋白質を作用させることを特徴とする
ＩＬ−１８の中和方法により解決するものである。な
お、この発明で用いるＬ４２８細胞は、平成８年１２月
２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通
商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所に受託
番号『ＦＥＲＭＢＰ−５７７７』で寄託されている。

【００２９】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態につ
き説明すると、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、ＩＬ
−１８を認識する性質により特徴付けられる。前述のと
おり、ＩＬ−１８は、すでに、ヒト及びマウスに由来す
るものが知られており、これらはいずれも１５７個のア
ミノ酸を含んでなり、それぞれ、配列表における配列番
号１に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付
して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを
表すものとする。）、及び、配列表における配列番号２
に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して
示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを表すも
のとする。）を有する。この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質
はＩＬ−１８を認識し、結合する部位を有し、免疫担当
細胞において、この部位にＩＬ−１８が結合すると、Ｉ
ＦＮ−γの産生が誘導される。この発明のＩＬ−１８Ｒ
蛋白質は、１００℃で５分間加熱すると、これらの性質
を失い、また、ＩＬ−１８が結合した状態で還元剤存在
下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）
を適用すると、見掛け上、分子量約５０，０００乃至２
００，０００ダルトンを示す。さらに、この発明のＩＬ
−１８Ｒ蛋白質は、部分アミノ酸配列として、配列表に
おける配列番号３乃至１０に示すアミノ酸配列の１又は
複数を有する。

【００３０】この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、斯かる
性質を指標にして、ヒトを含む哺乳類由来の細胞から得
ることができる。細胞の具体例としては、上皮細胞、内
皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ
球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られる細胞株
であって、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を発現している細胞が望
ましい。とりわけ、リンパ球を含む造血系細胞などを培
養株化して得られる、例えば、ジュン・ミノワダ『キャ
ンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８
８年）に記載されているＪＭ細胞、ＨＤＬＭ−２細胞、
ＭＯＬＴ−１６細胞及びＰＥＥＲ細胞、さらには、Ｌ４
２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）、ＫＧ−１細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４６）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ−１５９３．２）などのリンパ芽球様細胞
株は、増殖させ易く、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質が収量良く得
られるので、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の給源として好適であ
る。これらの細胞からＩＬ−１８Ｒ蛋白質を採取するに
は、細胞の培養物に、例えば、超音波などを印加して細
胞を破砕した後、細胞破砕物を含む培養物からＩＬ−１
８を認識する蛋白質の画分を採取する。細胞の培養に当
たって、培養培地に上述のごとき哺乳類由来の細胞にお
いてＩＬ−１８Ｒの発現を誘発する物質、とりわけ、Ｉ
Ｌ−１２やＩＬ−１８を細胞１×１０⁶個当り約０．０
１ｐｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１ｐｇ乃至１００ｎ
ｇ含有せしめると、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の収量が著増す
る。これは造血系細胞において特に顕著であり、例え
ば、ＩＬ−１２を共存させると、細胞によってはＩＬ−
１８Ｒ蛋白質の収量が２倍以上にも高まる。ＩＬ−１８
Ｒ蛋白質の採取には、生理活性物質を精製するための慣
用の方法が採用され、具体的には、塩析、透析、濾過、
濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等
電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などを単独又は
適宜組合せて適用する。とりわけ、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質
が特異的に認識するＩＬ−１８そのもの、あるいは、Ｉ
Ｌ−１８Ｒ蛋白質に特異的なこの発明のモノクローナル
抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー
によるときには、高純度のＩＬ−１８Ｒ蛋白質が最少の
時間と労力で得られる。

【００３１】この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、ヒトを
含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８を
認識・結合して免疫反応を抑制したり調節する性質を有
するので、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療
・予防に著効を発揮する。免疫系は、本来、有害な異物
から生体を防御するためのものであるが、ときとして、
その働き故に、却って、生体に有害な結果をもたらすこ
とがある。哺乳類に、例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心
臓、骨髄などの臓器を移植すると、同種異系抗原に対す
る拒絶反応や免疫反応により、Ｔ細胞が活性化され、リ
ンパ球が増殖したり、炎症が生じることがある。症状の
程度こそ違え、同様の現象は、例えば、アレルゲンのよ
うに、宿主が固有のものと見做さない異種異系抗原が侵
入した場合にも観察される。自己免疫疾患においては、
本来、固有のものと見做されるべき成分がアレルギー反
応を惹起する。この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、ヒト
を含む哺乳類に投与すると、斯かる拒絶反応や免疫反応
を抑制又は調節し、それらに起因する各種疾患の治療・
予防に著効を発揮する。したがって、この発明でいう感
受性疾患とは免疫反応の亢進に起因する疾患であって、
ＩＬ−１８Ｒ蛋白質が直接又は間接に作用して治療又は
予防し得るすべての疾患ということになり、個々の感受
性疾患としては、例えば、上記のごとき臓器移植に伴う
拒絶反応や、悪性貧血、萎縮性胃炎、インスリン抵抗性
糖尿病、ウェジナー肉芽腫症、円板状エリテマトーデ
ス、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症
候群、クローン病、原発性胆汁性肝硬変症、交感性眼
炎、甲状腺機能亢進症、若年性糖尿病、シェーグレン症
候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、重症筋
無力症、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデ
ス、多発性寒冷血色素尿症、多発性筋炎、多発性結節性
動脈炎、多発性硬化症、特発性アジソン病、特発性血小
板減少性紫班病、バセドウ病、白血球減少症、ベーチェ
ット病、早発性更年期、慢性関節リウマチ、リウマチ
熱、慢性甲状腺炎、ホジキン病、ＨＩＶ感染症、喘息、
アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症及びハチ
毒アレルギーを含む自己免疫疾患及びアレルギー性疾患
が挙げられる。なお、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質
は、ＩＦＮ−γの過剰産生や過剰投与などに起因する敗
血症ショックの治療や予防にも有効である。

【００３２】斯くして、有効成分としてＩＬ−１８Ｒ蛋
白質を含んでなるこの発明の感受性疾患剤は、上記のご
とき感受性疾患を治療・予防するための抗自己免疫疾患
剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、増血剤、
白血球増多剤、血小板増多剤、鎮痛剤、解熱剤などとし
て多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受
性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受性疾
患剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形状に
調製され、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質を０．０００
０１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００
１乃至２０％（ｗ／ｗ）含んでなる。

【００３３】この発明の感受性疾患剤は、ＩＬ−１８Ｒ
蛋白質単独の形態はもとより、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質とそ
れ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、
希釈剤、アジュバント、安定剤、さらには、必要に応じ
て、他の生理活性物質の１若しくは複数種類との組成物
としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、
血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、
シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラク
チトールなどの糖質及びクエン酸塩若しくは燐酸塩を主
体とする緩衝剤が、また、併用し得る他の生理活性物質
としては、例えば、ＦＫ５０６、グルココルチコイド、
シクロフォスファミド、ナイトロゲンマスタード、トリ
エチレンチオフォスファミド、ブズルファン、フェニラ
ミンマスタード、クロランブシル、アザチオプリン、６
−メルカプトプリン、６−チオグアニン、６−アザグア
ニン、８−アザグアニン、フルオロウラシル、シタラビ
ン、メトトレキセート、アミノプテリン、マイトマイシ
ンＣ、塩酸ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、クロ
モマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、塩酸ドキソルビ
シン、サイクロスポリンＡ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビ
ンクリスチン、ビンブラスチン、ヒドロキシウレア、塩
酸プロカルバジン、副腎皮質ホルモン、金製剤などの他
に、ＩＬ−１８以外のサイトカインの受容体アンタゴニ
スト、例えば、インターロイキン−１受容体蛋白質、イ
ンターロイキン−２受容体蛋白質、インターロイキン−
５受容体蛋白質、インターロイキン−６受容体蛋白質、
インターロイキン−８受容体蛋白質及びインターロイキ
ン−１２受容体蛋白質に対するそれぞれの抗体、さらに
は、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、インターロ
イキン−１受容体、インターロイキン−５受容体及びイ
ンターロイキン−８受容体に対するそれぞれのアンタゴ
ニストなどが挙げられる。

【００３４】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬
単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤と
は、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を、例えば、１回当りの用量又
はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０
まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的
に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単
位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、
錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤など
が挙げられる。この発明の感受性疾患剤は経口的に投与
しても非経口的に投与してもよく、いずれの場合にも、
感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患
の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投
与後の経過を観察しながら、成人当り約１μｇ乃至１ｇ
／回、通常、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回のＩＬ−１
８Ｒ蛋白質を１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量
で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮
下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。

【００３５】ところで、この発明はＩＬ−１８Ｒ蛋白質
に特異的なモノクローナル抗体に関するものでもある。
この発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質
又はその抗原性フラグメントを抗原として用いることに
より得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗
原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生
細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイブリド
ーマを作製し、これよりこの発明のモノクローナル抗体
を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、得ら
れたクローンを生体内外で培養することにより得ること
ができる。抗原としてのＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、通常、
完全精製又は部分精製した状態で用いられ、これらは、
例えば、前述したＩＬ−１８Ｒ蛋白質の製造方法によっ
ても得ることができる。抗原性フラグメントを得るに
は、これらの完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵
素的に分解するか、ペプチド合成すればよい。また、Ｉ
Ｌ−１８Ｒ蛋白質を発現している細胞は、そのまま抗原
として用いることができる。

【００３６】免疫感作は慣用の方法によればよく、例え
ば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとと
もに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種
し、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所
期の抗体産生細胞が得られるかぎり、種類、大きさ、雌
雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなど
のげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可能な哺乳類由来
の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択さ
れる。用いる哺乳動物の種類や大きさにもよるが、抗原
の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹
とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至２０
回に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日
後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細
胞を得る。

【００３７】次に、斯くして得られた抗体産生細胞と無
限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて目的のハ
イブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能
な哺乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａ
ｇ４−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）、Ｐ３Ｘ６３
Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−９）及びＳｐ２／Ｏ−
Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１）などのマ
ウス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられる。
細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダ
イウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる
慣用の方法が用いられ、一例を挙げると、融合促進剤を
含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由
来の細胞を約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、こ
の状態のまま約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキ
ュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地及びイスコフ改変ダルベコ培地を
始めとする通常一般のものを用い得るが、ウシ血清など
の血清類は除いておくのが望ましい。

【００３８】目的のハイブリドーマを選択するには、先
ず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地な
どの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至
３週間培養してハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ
る。次に、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物
中に分泌された抗体につき、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質との結
合性を試験する。試験には、例えば、エンザイムイムノ
アッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイな
どの抗体を検出するための慣用の方法が用いられ、例え
ば、富山朔二、安東民衛編『単クローン抗体実験マニュ
アル』、１９９１年、講談社サイエンティフィック発
行、１０５乃至１５２頁にはそのための方法が種々詳述
されている。ＩＬ−１８Ｒ蛋白質に特異的な抗体を産生
するハイブリドーマは、限界希釈法などにより直ちにク
ローニングされ、単一クローン化されたこの発明のハイ
ブリドーマを得る。

【００３９】この発明のモノクローナル抗体は、斯かる
ハイブリドーマを生体内外で培養することにより得るこ
とができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するた
めの慣用の方法が用いられ、例えば、生体外の培養培地
で培養するときには、その培養物から、一方、ヒト以外
の温血動物に移植して生体内で培養するときには、その
腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取す
る。後述のハイブリドーマ＃１１７−１０Ｃはこの発明
のモノクローナル抗体の産生能が高く、しかも、生体内
外における培養が容易であるという特徴がある。培養物
又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を採取す
るには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の
方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩
析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳
動が挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用され
る。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾
燥し、用途に応じて液状又は固状とする。

【００４０】なお、サイトカインの一種であるインター
ロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」と略記する。）は、
この発明のモノクローナル抗体の製造に極めて有用であ
る。すなわち、抗原により哺乳動物を免疫感作する際
に、抗原接種と同時又は抗原接種の前後にＩＬ−６を注
射投与すると、哺乳動物における抗体価が著しく上昇す
る。さらに、抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来
の細胞を細胞融合させるための融合培地にＩＬ−６を共
存させると、細胞融合における抗体陽性率が飛躍的に上
昇し、ハイブリドーマのクローニングが極めて容易とな
り、一方、単一クローン化されたハイブリドーマを増殖
させるための培養培地にＩＬ−６を共存させると、ハイ
ブリドーマの増殖が促進され、この発明のモノクローナ
ル抗体の収量が著増する。ＩＬ−６としては、それが哺
乳動物や無限増殖可能な哺乳類由来の細胞と同一の種に
由来するものであれば、天然型であるか組換え型である
かは問わない。

【００４１】この発明のモノクローナル抗体は、通常、
蛋白質工学の手法によって調製される、いわゆる、「ヒ
ト化抗体」をも包含する。ヒト化抗体を調製するには、
例えば、上述のようにして得た哺乳動物由来のハイブリ
ドーマからｍＲＮＡを採取し、逆転写酵素を作用させて
ｃＤＮＡとし、ＰＣＲ反応により増幅した後、クローニ
ングして、この発明のモノクローナル抗体における重鎖
及び軽鎖の塩基配列、とりわけ、重鎖及び軽鎖における
可変領域の塩基配列をそれぞれ決定する。そして、それ
らの可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させたポリペ
プチドをコードするキメラ遺伝子を作製する。このキメ
ラ遺伝子は、適宜宿主中で発現させると、元のモノクロ
ーナル抗体と同様の結合特異性を示しつつ、ヒトに対す
る抗原性が顕著に低減したモノクローナル抗体を産生す
る。

【００４２】さらに、その重鎖及び軽鎖における抗原結
合部位を構成する「相補性決定部位（ＣＤＲ）」のアミ
ノ酸配列を解明し、このアミノ酸配列と、必要に応じ
て、可変領域におけるＣＤＲ周辺のアミノ酸数個ととも
に、元のモノクローナル抗体と同様の三次元構造を有す
るヒト抗体に移植するときには、ヒト抗体に共通する定
常領域と可変領域の枠組構造を有し、本質的にＣＤＲの
みが哺乳動物に由来するヒト化抗体を得ることができ
る。ちなみに、後述するこの発明のハイブリドーマ＃１
１７−１０Ｃが産生するモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１
１７−１０Ｃは、重鎖及び軽鎖の可変領域において、そ
れぞれ配列表における配列番号１１及び１２に示すアミ
ノ酸配列を含有しており、ハイブリドーマ＃１１７−１
０Ｃにおいては、その配列番号１１及び１２に示すアミ
ノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１９及
び２０に示す塩基配列によりコードされている。また、
モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃにおいて
は、配列表における配列番号１３乃至１５に示すアミノ
酸配列が、それぞれ、重鎖における３種類のＣＤＲ、す
なわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配
列に相当し、また、配列表における配列番号１６乃至１
８に示すアミノ酸配列が、それぞれ、軽鎖における３種
類ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
のアミノ酸配列に相当する。なお、哺乳動物由来の抗体
をヒト化する方法自体は公知であり、例えば、エス・ポ
ール監修『メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー』、第５１巻、１９９５年、ヒューマナ・プレス発行
には関連する種々の技法が記載されている。

【００４３】この発明のモノクローナル抗体は、イムノ
アフィニティークロマトグラフィーによるＩＬ−１８Ｒ
蛋白質の精製に極めて有用である。斯かる精製方法は、
この発明のモノクローナル抗体をＩＬ−１８Ｒ蛋白質と
それ以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物
に接触させてモノクローナル抗体にＩＬ−１８Ｒ蛋白質
を吸着させる工程と、吸着したＩＬ−１８Ｒ蛋白質をモ
ノクローナル抗体から脱着させ、採取する工程を含んで
なり、両工程は、通常、水性媒体中で行なわれる。この
発明のモノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性
担体に結合した状態で用いられ、その水不溶性担体を円
筒管などにカラム状に充填し、これに、例えば、細胞培
養液又はその部分精製品を通液すると、実質的にＩＬ−
１８Ｒ蛋白質のみが水不溶性担体上のモノクローナル抗
体に吸着する。吸着したＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、モノク
ローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることによ
り、容易に脱着させることができ、例えば、イムノグロ
ブリンＧのクラスに属するモノクローナル抗体を用いる
場合は酸性側のｐＨ、通常、ｐＨ２乃至３で、一方、イ
ムノグロブリンＭのクラスに属するモノクローナル抗体
を用いる場合はアルカリ側のｐＨ、通常、ｐＨ１０乃至
１１で脱着・溶出させる。この発明の精製方法によると
きには、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を最少の時間と労力で高度
に精製できる。

【００４４】この発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ−
１８Ｒ蛋白質を検出するための試薬としても広範な用途
を有する。すなわち、この発明のモノクローナル抗体に
よるラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適
用するときには、被検試料中のＩＬ−１８Ｒ蛋白質を迅
速且つ正確に定性又は定量分析することができる。斯か
る標識イムノアッセイにおいて、この発明のモノクロー
ナル抗体は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光
物質により標識して用いられる。この発明のモノクロー
ナル抗体はＩＬ−１８Ｒ蛋白質に特異的に反応し、免疫
反応を呈するので、その免疫反応を標識物質を指標に測
定すれば、被検試料中のごく微量のＩＬ−１８Ｒ蛋白質
を精度良く検出することができる。標識イムノアッセイ
は、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試
料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少な
くてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴があ
る。したがって、この発明による検出方法は、ＩＬ−１
８Ｒ蛋白質を製造する際の工程管理や製品の品質管理、
さらには、組織や体液におけるＩＬ−１８及び／又はＩ
Ｌ−１８Ｒ蛋白質のレベルを指標とする種々の感受性疾
患の診断に極めて有用である。この発明はモノクローナ
ル抗体の標識や標識イムノアッセイそのものに係わるも
のではないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・テ
ィッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセ
イ』、１９８９年、東京化学同人発行、１９６乃至３４
８頁などにはそのための方法が種々詳述されている。

【００４５】なお、この発明のモノクローナル抗体は、
ヒトを含む哺乳類において、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を発現
している細胞へのＩＬ−１８の結合に対して拮抗的に働
き、ＩＬ−１８の生理作用を阻害するので、当該モノク
ローナル抗体をＩＬ−１８Ｒ蛋白質に作用させるこの発
明の阻害剤及び阻害方法は、ＩＬ−１８が直接又は間接
的に関与する、例えば、炎症性疾患、アレルギー性疾患
及び自己免疫疾患を初めとする種々の疾患の治療や、臓
器移植に伴う拒絶反応や過剰な免疫反応の抑制にも有効
である。一方、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質には、Ｉ
Ｌ−１８を認識し、結合して、その生理作用を中和する
性質があるので、ＩＬ−１８に当該ＩＬ−１８Ｒ蛋白質
を作用させるこの発明の中和剤及び中和方法は、生体内
で過剰産生されたＩＬ−１８や生体内に過剰投与された
ＩＬ−１８の中和に有用である。さらに、この発明のＩ
Ｌ−１８Ｒ蛋白質は、ＩＬ−１８を認識し、結合する性
質があるので、当然のことながら、ＩＬ−１８を精製し
たり検出するためのアフィニティークロマトグラフィー
や標識アッセイにおいて、上記したこの発明のモノクロ
ーナル抗体と同様の用途を有する。なお、この発明のＩ
Ｌ−１８Ｒ蛋白質及びモノクローナル抗体並びにそれら
の断片は、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬を検索
するための試薬としても有用であることを付言してお
く。

【００４６】以下、実施例に基づきこの発明を説明する
が、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多
様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明
がこれらの実施例のみに限定されるべきでないことは言
うまでもない。

【００４７】

【実施例１】〈ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の調製〉常法により、生後間もな
いハムスター新生児の腹腔内にウサギ由来の抗リンパ球
抗体を注射して免疫反応を減弱させた後、背部皮下にホ
ジキン病患者に由来するリンパ芽球様細胞株の一種であ
るＬ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を約５×
１０⁵個／匹注射移植し、通常の方法で３週間飼育し
た。皮下に生じた腫瘍塊（約１０ｇ／匹）を摘出し、常
法により血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ
７．４）により分散させ、洗浄して増殖細胞を得た。

【００４８】この増殖細胞に対して０．８３％（ｗ／
ｖ）塩化アンモニウムと１７０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．７）との混液（容量比９：１）を細胞湿重量
の１０倍量加え、撹拌した後、２，０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離して細胞を回収した。次に、細胞を適量の
燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と言う。）に浮遊さ
せ、撹拌し、２，０００ｒｐｍで遠心分離して再度回収
し、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０⁸個／ｍ
ｌになるように浮遊させ、キネマティカ製細胞破砕機
『ポリトロン』により破砕し、１ｍＭ塩化マグネシウム
及び１Ｍシュークロースをそれぞれ含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）をシュークロースの最終濃
度が０．２Ｍになるように加えた後、１，０００ｒｐｍ
で遠心分離して上清を採取し、これを２５，０００ｒｐ
ｍでさらに６０分間遠心分離し、沈澱部を採取した。こ
の沈澱に１２ｍＭ３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（以
下、「ＣＨＡＰＳ」と言う。）、１０ｍＭＥＤＴＡ及
び１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドをそ
れぞれ適量加え、４℃で１６時間撹拌した後、２５，０
００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、上清を採取した。

【００４９】この上清を１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰ
ＢＳにより平衡化しておいたファルマシア製アフィニテ
ィークロマトグラフィー用ゲル『ウィート・ジャーム・
レクチン・セファロース６Ｂ』のカラムに負荷し、カラ
ムを１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより洗浄した
後、溶出液の蛋白質含量を波長２８０ｎｍの紫外線に対
する吸光度でモニターしながら、０．５ＭＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン及び１２ｍＭＣＨＡＰＳをそれ
ぞれ含むＰＢＳを通液した。そして、吸光度が０．１６
乃至０．２０の画分を採取し、合一したところ、蛋白質
含量約１ｍｇ／ｍｌの水溶液が原料細胞１０¹²個当り約
２５ｌ得られた。

【００５０】この水溶液の一部を小分し、常法にしたが
って ¹²⁵Ｉで標識したヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加
え、４℃で１時間インキュベートし、担体としてγ−グ
ロブリンと平均分子量６，０００ダルトンのメルク製ポ
リエチレングリコール『ポリエチレングリコール６００
０』をそれぞれ適量加え、氷冷下で３０分間静置して結
合反応させた後、反応物を６，０００ｒｐｍで５分間遠
心分離し、生じた沈澱を採取し、放射能強度を測定し
た。同時に、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８に加えて未標識
のヒトＩＬ−１８を３μｇ用いる系を設け、これを上記
と同様に処置して対照とした。対照と比較したところ、
被検水溶液から生じた沈澱の放射能強度は有意に高かっ
た。このことは、上記で得た水溶液が正にＩＬ−１８Ｒ
蛋白質を含有するものであり、ＩＬ−１８に作用させる
と、このＩＬ−１８Ｒ蛋白質がＩＬ−１８を認識し、結
合したことを示している。

【００５１】

【実施例２】〈ハイブリドーマ＃１１７−１０Ｃの調製〉常法にした
がって、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＬ４２８細胞
（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を５×１０⁷個／匹／回の
接種量で６箇月間に１３回注射してマウスを免疫感作し
た。脾臓摘出の６日前と３日前に、マウスの腹腔内に実
施例１の方法により得たＩＬ−１８Ｒ蛋白質を１μｇ／
匹それぞれ注射接種し、最後の接種から３日目にマウス
から脾臓を摘出し、分散させて抗体産生細胞としての脾
細胞を得た。

【００５２】この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳｐ２／
Ｏ−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１）を３
７℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０
培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ３×１０⁴個／ｍｌ及び
１×１０⁴個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離し
た後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５
００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコー
ルを含む血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ
７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分
間インキュベートし、全量が５０ｍｌになるまで血清無
含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加
え、遠心分離した後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨ
ＡＴ培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに２
００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１週間インキュ
ベートして約１，２００種類のハイブリドーマを得た。
これらのハイブリドーマの培養上清に後記実施例３−２
（ａ）で述べる２種類の結合試験法をそれぞれ適用し、
ＩＬ−１８のＩＬ−１８Ｒ蛋白質及びＬ４２８細胞への
結合を顕著に阻害する培養上清を与えたハイブリドーマ
を選別し、これに通常の限界希釈法を繰返し適用し、こ
の発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドー
マのクローン＃１１７−１０Ｃを得た。

【００５３】

【実施例３】〈モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの調製と
性質〉

【００５４】

【実施例３−１】〈モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの調製〉
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１
６４０培地（ｐＨ７．２）に実施例２の方法により得た
ハイブリドーマ＃１１７−１０Ｃを細胞密度約１×１０
⁶個／ｍｌになるように浮遊させ、培養規模を拡大しな
がら５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で培養し
た。所期の細胞密度に達した時点で、プリスタンを０．
５ｍｌ／匹腹腔内注射しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹腔内にハイブリドーマ＃１１７−１０Ｃを１×１０⁷
個／匹接種し、通常の方法で１週間飼育した。

【００５５】マウスから腹水を採取し、硫酸アンモニウ
ムを６０％飽和になるように加え、４℃で５時間静置し
た後、遠心分離し、沈澱部を採取した。この沈澱を５０
ｍＭ燐酸二水素カリウム溶液（ｐＨ６．８）に溶解し、
新鮮な同一溶液に対して一晩透析した後、５０ｍＭ燐酸
二水素カリウム溶液（ｐＨ６．８）により平衡化してお
いたヒドロキシアパタイトのカラムに負荷し、先ず、１
００ｍＭの燐酸二水素カリウム溶液（ｐＨ６．８）を、
次に、３００ｍＭの燐酸二水素カリウム溶液（ｐＨ６．
８）を通液したところ、燐酸二水素カリウム濃度が３０
０ｍＭのときにこの発明のモノクローナル抗体ＭＡｂ＃
１１７−１０Ｃが溶出した。収量は、マウス１匹当り約
５ｍｇであった。常法にしたがって分析したところ、モ
ノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃはイムノグロ
ブリンＭのクラスに属していた。

【００５６】

【実施例３−２】〈モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの性質〉

【００５７】

【実施例３−２（ａ）】〈ＩＬ−１８Ｒ蛋白質に対する結合性〉Ｌ４２８細胞
（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を０．１％（ｗ／ｖ）ア
ジ化ナトリウムを含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清ア
ルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．
４）に細胞密度４×１０⁷個／ｍｌになるように浮遊さ
せる一方、実施例３−１の方法により得たモノクローナ
ル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃度０．０１９μｇ／
ｍｌ、０．２０９μｇ／ｍｌ、２．３μｇ／ｍｌ、２
５．３μｇ／ｍｌ又は１３９．５μｇ／ｍｌになるよう
に０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足した別
のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に溶解した。

【００５８】次に、上記で調製した細胞浮遊液を５０μ
ｌずつとり、これに濃度の相違する上記モノクローナル
抗体溶液のいずれかを５０μｌずつ加え、４℃で２時間
振盪した後、常法にしたがって ¹²⁵Ｉにより標識したヒ
トＩＬ−１８を４ｎｇ含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血
清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ
７．５）を５０μｌずつ加え、同じ温度でさらに３０分
間振盪した。その後、各細胞浮遊液にジブチルフタレー
ト／ジオクチルフタレート混液（容量比１：１）を２０
０μｌずつ加え、２０℃、１０，０００ｒｐｍで５分間
遠心分離した後、細胞を含む沈澱部を採取し、アロカ製
ガンマカウンター『ＡＲＣ−３００型』を用いて放射能
強度を測定した。

【００５９】同時に、モノクローナル抗体を省略する一
方、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識
ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と
未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれ
ぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、
「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察され
た放射能強度と、試験区において観察された放射能強度
をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算
した。結果を図１に示す。

【００６０】

【数１】

【００６１】さらに、実施例１の方法により得たＩＬ−
１８Ｒ蛋白質を含む水溶液を５０μｌずつとり、これに
上記と同様の濃度に調整したモノクローナル抗体ＭＡｂ
＃１１７−１０Ｃを５０μｌ加え、４℃で２時間振盪し
た後、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、同
じ温度でさらに３０分間振盪した。その後、４ｍｇ／ｍ
ｌ γ−グロブリンを５０μｌ加え、氷冷下で３０分間
静置した後、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
を含むＰＢＳを２５０μｌ加え、氷冷下でさらに３０分
間静置し、４℃、６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、沈澱部を採取し、その放射能強度を上記と同様にし
て測定した。

【００６２】同時に、モノクローナル抗体を省略する一
方、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識
ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と
未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれ
ぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、
「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察され
た放射能強度と、試験区において観察された放射能強度
をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算
した。結果を図１に併記する。

【００６３】図１に見られるように、Ｌ４２８細胞を用
いる場合も、溶液状のＩＬ−１８Ｒ蛋白質を用いる場合
も、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの濃度
が上昇するにしたがって、ＩＬ−１８のＬ４２８細胞及
びＩＬ−１８Ｒ蛋白質への結合がより強く阻害された。
このことは、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０
Ｃが溶液中のＩＬ−１８Ｒ蛋白質及びＬ４２８細胞の表
面に存在すると考えられるＩＬ−１８ＲにＩＬ−１８と
競合して結合したことを示すと同時に、実施例１の方法
により得た水溶液がＩＬ−１８を認識する性質ある蛋白
質、すなわち、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を含有し、そして、
モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがそのＩＬ
−１８Ｒ蛋白質に特異的に反応するモノクローナル抗体
であることを示している。

【００６４】

【実施例３−２（ｂ）】〈ウェスタン・ブロッティング分析〉実施例１の方法に
より得たＩＬ−１８Ｒ蛋白質溶液の一部をとり、これに
２．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム及び５０％
（ｖ／ｖ）グリセリンからなる混液を２／３容量加え、
３７℃で１時間インキュベートした後、常法にしたがっ
て、還元剤非存在下においてゲル濃度１０乃至２０％の
グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分を
分離した。常法によりゲルをニトロセルロース膜上に移
取り、適量の大日本製薬製固定化剤『ブロックエース』
に１時間浸漬し、実施例３−１の方法により得たモノク
ローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ、『ブロックエー
ス』及びツイーン２０をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、１０
％（ｖ／ｖ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬
した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰
の抗体を除いた。ニトロセルロース膜を西洋ワサビパー
オキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグ
ロブリン抗体の適量と１０％（ｖ／ｖ）ブロックエース
及び０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０をそれぞれ含む
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬して反
応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄した
後、アマシャム製染色キット『ＥＣＬｋｉｔ』を用いて
発色させた。

【００６５】同時に、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１
７−１０Ｃを省略した系を設け、上記と同様に処置して
対照とした。なお、分子量マーカーには、ウシ血清アル
ブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４
５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドロラーゼ
（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター
（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン
（１４，４００ダルトン）を用いた。結果を図２に示
す。

【００６６】図２のゲル電気泳動像において、モノクロ
ーナル抗体無添加のレーン３には見られないバンドが、
モノクローナル抗体添加のレーン２には観察されるが、
このバンドはＩＬ−１８Ｒ蛋白質に相当するバンドであ
る。

【００６７】

【実施例３−２（ｃ）】〈ＩＬ−１８に対する活性阻害〉ヒト急性骨髄性白血病
患者に由来する株化細胞の一種であるＫＧ−１細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−２４６）を１００μｇ／ｍｌカナマイ
シンと１８．８ｍＭ燐酸水素二ナトリウムをそれぞれ含
み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ
−１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度１×１０⁷個
／ｍｌになるように浮遊させ、実施例３−１の方法によ
り得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃
度１０μｇ／ｍｌになるように加えた後、３７℃で３０
分間インキュベートした。

【００６８】次に、９６ウェルマイクロプレートに上記
ＫＧ−１細胞浮遊液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、そ
れに、ヒトＩＬ−１８を上記と同一の新鮮な培地に濃度
０ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２ｎｇ／ｍ
ｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎ
ｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌになるように溶解したもの
を５０μｌ／ウェルずつ加え、さらに、上記と同一の新
鮮な培地に濃度５μｇ／ｍｌになるように溶解したリポ
多糖を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で２４時間イ
ンキュベートした後、培養上清を採取し、そのＩＦＮ−
γ含量を通常の酵素免疫アッセイにより調べた。並行し
て、各々のヒトＩＬ−１８濃度につき、ヒトＩＬ−１８
モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを省略した
系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照
とした。結果を図３に示す。なお、図３に示すＩＦＮ−
γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手した
ＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づ
き国際単位（ＩＵ）に換算して表示している。

【００６９】図３に示す結果は、モノクローナル抗体Ｍ
Ａｂ＃１１７−１０Ｃが共存すると、免疫担当細胞とし
てのＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ
産生の誘導が阻害されることを示している。このこと
は、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがＩＬ
−１８と競合してＫＧ−１細胞の表面に存在するＩＬ−
１８Ｒを封鎖し、結果として、ＩＬ−１８によるＫＧ−
１細胞への情報伝達を妨げたことを示している。

【００７０】

【実施例３−３】〈可変領域のアミノ酸配列と相補性決定部位の決定〉

【００７１】

【実施例３−３（ａ）】〈重鎖における可変領域のアミノ酸配列〉常法にしたが
って、ハイブリドーマ＃１１７−１０Ｃを１０％（ｖ／
ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地
（ｐＨ７．２）に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、
３７℃で増殖させた。所期の細胞密度に達した時点で増
殖細胞を採取し、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナ
ート及び０．５％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む
１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）に浮
遊させ、ホモジナイザーで破砕した。

【００７２】次に、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セ
シウムを含む０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を注入
し、その上部に上記で得られた細胞破砕物を重層し、こ
の状態のまま、２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間
超遠心分離し、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分
を１５ｍｌ容遠心管にとり、クロロホルム／１−ブタノ
ール混液（容量比４：１）を等容量加え、５分間振盪
し、４℃，１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した
後、水層部を採取し、これにエタノールを２．５倍容加
え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。
この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで
洗浄した後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解してハイブリ
ドーマ＃１１７−１０Ｃ由来の全ＲＮＡを含む水溶液を
得た。

【００７３】斯くして得られた水溶液に１ｍＭＥＤＴ
Ａ及び０．１％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ
加え、全量を１ｍｌとした。この混液に日本ロシュ製オ
リゴ（ｄＴ）３０ラテックス『オリゴテックスｄＴ３０
スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間反応させた
後、氷浴中で急冷した。次いで、反応物に５Ｍ塩化ナト
リウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で１０分間インキュベ
ートした後、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、生成したペレット状の沈澱を採取し、これを
滅菌蒸留水０．５ｍｌに懸濁し、６５℃で５分間インキ
ュベートしてラテックスからｍＲＮＡを溶離させた。得
られた水溶液に適量のエタノールを加え、生成した沈澱
を採取し、凍結乾燥して、ｍＲＮＡの固状物を得た。

【００７４】０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネ
シウムを４μｌ、５００ｍＭ塩化カリウムを含む１００
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を２μｌ、２５
ｍＭｄＮＴＰミツクスを１μｌ、４０単位／μｌのリボ
ヌクレアーゼインヒビターを０．５μｌ、そして、２０
０単位／μｌの逆転写酵素を１μｌそれぞれ加えた後、
５０μＭランダムヘキサヌクレオチドの適量と上記で得
られたｍＲＮＡの固状物を１０ｎｇ加え、滅菌蒸留水で
全量を２０μｌとした。得られた混合物を４２℃で２０
分間インキュベートし、さらに、９９℃で５分間インキ
ュベートすることにより反応を終結させて第一ストラン
ドｃＤＮＡを含む反応物を得た。

【００７５】この反応物を２０μｌとり、これに２．５
単位／μｌのストラタジーン製ＤＮＡポリメラーゼ『ク
ローンドＰｆｕポリメラーゼ』を１μｌ、ストラタジー
ン製専用緩衝液を１０μｌ、そして、２５ｍＭｄＮＴ
Ｐミックス１μｌをそれぞれ加え、さらに、センスプラ
イマー及びアンチセンスプライマーとして、ケイゾウ・
イノウエら『ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッズ』、第１９５巻、２７乃至３２頁（１９９６年）に
記載されたＰＣＲプライマーに基づき化学合成した５´
−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧ
ＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ−３´及び５´−ＣＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡ−
３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞ
れ適量加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした後、
９４℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で２分間この
順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰ
ＣＲ反応させて、配列表における配列番号２１に示す塩
基配列を含むＤＮＡ断片を得た。

【００７６】

【実施例３−３（ｂ）】〈軽鎖における可変領域のアミノ酸配列〉実施例３−３
（ａ）の方法により得た第一ストランドＤＮＡを含む反
応物を、センスプライマー及びアンチセンプライマーと
して、それぞれ、エス・タラン・ジョーンズら『バイオ
テクノロジー』、第９巻、８８乃至８９頁（１９９１
年）に記載されたＰＣＲプライマーに基づき化学合成し
た５´−ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴ
ＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴＧ−３´及び５
´−ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡ
ＧＡＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチ
ドを用いた以外は実施例３−３（ａ）と同様に処理し
て、配列表における配列番号２２に示す塩基配列を含む
ＤＮＡ断片を得た。

【００７７】

【実施例３−３（ｃ）】〈相補性決定部位の決定〉抗体における重鎖及び軽鎖の
可変領域は、通常、４種類の枠組構造が３種類の相補性
決定部位（ＣＤＲ）を介して連結してなる、互いに類似
した構造を有している。また、同種抗体同士の場合、一
般に、枠組構造のアミノ酸配列は比較的よく保存されて
いるのに対して、ＣＤＲのアミノ酸配列は抗体ごとに顕
著な変異が見られる。そこで、実施例３−３（ａ）及び
実施例３−３（ｂ）で決定したアミノ酸配列と、マウス
抗体についてすでに報告されている可変領域のアミノ酸
配列とを比較・照合したところ、モノクローナル抗体Ｍ
Ａｂ＃１１７−１０Ｃにおいては、重鎖における可変領
域のＣＤＲは、配列表における配列番号１３（ＣＤＲ
１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）及び配列番号１５（Ｃ
ＤＲ３）に示すアミノ酸配列を有し、また、軽鎖におけ
る可変領域のＣＤＲは、配列表における配列番号１６
（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）及び配列番号
１８（ＣＤＲ３）に示すアミノ酸配列を有しているもの
と結論された。

【００７８】

【実施例３−３（ｄ）】〈可変領域をコードする組換えＤＮＡの構築〉重鎖にお
ける可変領域をコードする実施例３−３（ａ）の方法に
より得たＤＮＡ断片を１０ｎｇとり、これに２．５単位
／μｌのストラタジーン製ＤＮＡポリメラーゼ『クロー
ンドＰｆｕポリメラーゼ』を１μｌ、ストラタジーン製
専用緩衝液を１０μｌ、そして、２５ｍＭｄＮＴＰミ
ックス１μｌをそれぞれ加え、さらに、センスプライマ
ー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´
−ＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＣ
ＡＧＣＴＧＧＧＴＴ−３´及び５´−ＧＡＧＧＡＴＣＣ
ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣ−３´で表される塩基配
列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留
水を加えて全量を１００μｌとした。この混合物を９４
℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序
でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さら
に、９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間
この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返し
てＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２
１に示す塩基配列、その塩基配列の５´末端に連結され
た制限酵素ＸｈｏＩによる切断部位とコザック配列、そ
して、３´末端に連結された制限酵素ＢａｍＨＩにより
切断部位とリンカーの一部をコードする塩基配列からな
るＤＮＡ断片を得た。

【００７９】並行して、軽鎖における可変領域をコード
する実施例３−３（ｂ）の方法により得たＤＮＡ断片を
１０ｎｇとり、センスプライマー及びアンチセンスプラ
イマーとして、それぞれ、５´−ＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧ
ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧ
ＡＣＴＣＡＧ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ
ＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧ−３´で表される塩基
配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は上記と同様に
処理して、配列表における配列番号２０に示す塩基配
列、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素Ｂａ
ｍＨＩによる切断部位とリンカーの一部をコードする塩
基配列、そして、３´末端に連結された制限酵素Ｎｏｔ
Ｉによる切断部位と（Ｈｉｓ）₆タグをコードする塩基
配列からなるＤＮＡ断片を得た。

【００８０】斯くして得られた２種類のＤＮＡ断片を制
限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＮｏｔＩ若しくはＸｈｏ
Ｉによりそれぞれ処理し、あらかじめ制限酵素ＸｈｏＩ
及びＮｏｔＩにより切断しておいたインビトロジェン製
プラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』を１０ｎｇ加えた
後、宝酒造製ライゲーションキット『ライゲーション・
キット・バージョン２』を用いて１６℃で２時間反応さ
せてプラスミドベクター内に上記２種類のＤＮＡ断片を
挿入した。次いで、常法にしたがって、このプラスミド
ＤＮＡを用いてインビトロジェン製大腸菌『ＭＣ１０６
１／Ｐ３』を形質転換する一方、得られた形質転換体
『ＣＤＭ／１１７−ＶＬ−ＶＨ』を調べたところ、形質
転換体『ＣＤＭ／１１７−ＶＬ−ＶＨ』に導入された組
換えＤＮＡ『ｐＣＤＭ／１１７−ＶＬ−ＶＨ』において
は、図６に示すように、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１
１７−１０Ｃにおける重鎖及び軽鎖の可変領域を共にコ
ードするｃＤＮＡ『１１７−ＶＬ−ＶＨｃＤＮＡ』が
サイトメガロウイルス・プロモーターＰｃｍｖの下流に
連結されていた。

【００８１】

【実施例３−３（ｅ）】〈形質転換体の調製とＤＮＡの発現〉実施例３−３
（ｄ）の方法により得た形質転換体『ＣＤＭ／１１７−
ＶＬ−ＶＨ』をアンピシリン２０μｇ／ｍｌとテトラサ
イクリン１０μｇ／ｍｌをそれぞれ含むＬＢ培地（ｐＨ
７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養
物から菌体を採取し、これを常法により処理してプラス
ミドＤＮＡを得た。別途、アフリカミドリザルの腎臓に
由来する線維芽細胞株の１種であるＣＯＳ−１細胞（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ−１６５０）を常法にしたがって増殖さ
せる一方、上記で得たプラスミドＤＮＡを２０μｇと
り、これを通常一般のエレクトロポレーション法により
１×１０⁷個のＣＯＳ−１細胞に導入して形質転換体を
得た。平底培養瓶に味の素製無血清培地『ＡＳＦ１０
４』をとり、これに形質転換したＣＯＳ−１細胞を１×
１０⁵個／ｍｌの割合で接種し、常法にしたがって５％
ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で４日間培養し、配
列表における配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを発現させた。培養物から培養液を採取し、
キアジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル
『Ｎｉ−ＮＴＡ』のカラムに負荷し、２０ｍＭイミダゾ
ールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除去した後、
カラムに２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液
し、溶出液を一定量ずつ分画した。

【００８２】次に、Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５
７７７）を細胞密度１×１０⁸個／ｍｌになるように浮
遊させた、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含
み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（ｐＨ７．４）を５０μｌずつ小分
し、これに上記で得られた溶出液の画分のいずれかを５
０μｌずつ加えた後、４℃で１時間振盪した。その後、
上記と同様のＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解した ¹²⁵Ｉ
標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、全量を１５０μ
ｌとし、同じ温度でさらに３０分間振盪し、ジブチルフ
タレート／ジオクチルフタレート混液（容量比１：１）
２００μｌに重層し、２０℃、１０，０００ｒｐｍで５
分間遠心分離した後、生じた沈澱を採取し、その放射能
強度をアロカ製ガンマカウンター『ＡＲＣ−３００型』
を用いて測定した。その結果、発現させたポリペプチド
を含む画分から生じた沈澱は、その余の画分と比較した
ところ、放射能強度が有意に低かった。このことは、配
列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列
が、それぞれ、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１
０Ｃにおける重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列で
あることを裏付けている。

【００８３】

【実施例４】〈ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の精製と部分アミノ酸配列〉

【００８４】

【実施例４−１】〈ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の精製〉実施例３−１の方法によ
り調製したモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ
７８ｍｇを適量の蒸留水に溶解し、溶液を０．５Ｍ塩
化ナトリウムを含む硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して
４℃で１６時間透析した。その後、常法にしたがって、
透析内液にファルマシア製臭化シアン活性化ゲル『ＣＮ
Ｂｒ−アクティベーテッド・セファロース４Ｂ』を適量
加え、穏やかに撹拌しながら４℃で１８時間反応させて
ゲルにモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固
定化した。

【００８５】次に、プラスチック製円筒管に上記のゲル
をカラム状に充填し、２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ
により平衡化した後、実施例１の方法により得たＩＬ−
１８Ｒ蛋白質を含む水溶液を負荷し、１２ｍＭＣＨＡ
ＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着成分を除いた。その
後、カラムに２ｍＭＣＨＡＰＳ含む３５ｍＭエチルア
ミン（ｐＨ１０．８）を通液しつつ、溶出液を８ｍｌず
つ採取し、それぞれの画分におけるＩＬ−１８Ｒ蛋白質
の有無を実施例１の ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる
方法により判定した。このとき得られたクロマトグラム
を図４に示す。

【００８６】図４に見られるように、実施例１のＩＬ−
１８Ｒ蛋白質を含む水溶液のようなＩＬ−１８Ｒ蛋白質
と夾雑物質を含む混合物にこの発明のモノクローナル抗
体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを
適用すると、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質がシャープな単一ピー
クとなって溶出した。この単一ピークに相当する画分を
採取し、合一し、凍結乾燥して、精製ＩＬ−１８Ｒ蛋白
質の固状物を得た。

【００８７】その後、このようにして精製したＩＬ−１
８Ｒ蛋白質の一部をとり、ＰＢＳ中、１００℃で５分間
インキュベートした後、実施例３−２（ａ）の方法によ
り残存活性を測定したところ、ＩＬ−１８に対する結合
性が全く観察されず、加熱により失活したことが判明し
た。このことは、この受容体の本質が蛋白質であること
を裏付けている。

【００８８】さらに、上記のようにして得た精製ＩＬ−
１８Ｒ蛋白質を適量のＰＢＳに溶解し、室温下、ＰＢＳ
に対して一晩透析し、実施例１の方法により ¹²⁵Ｉ標識
ヒトＩＬ−１８の適量とピアース製架橋試薬『ＢＳ³』
を１ｍＭそれぞれ加えた後、０℃で２時間静置してＩＬ
−１８Ｒ蛋白質と ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体
を形成させた。反応物にトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を濃度５０ｍＭになるように加え、０℃でさらに１
時間静置して反応を停止させ、常法にしたがって、反応
物に分子量マーカーとともに還元剤としてジチオトレイ
トールを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分
を分離した後、オートラジオグラム分析した。

【００８９】得られたオートラジオグラムにおける分子
量マーカーの易動度に基づき計算したところ、このＩＬ
−１８Ｒ蛋白質と ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体
の分子量は、見掛け上、約５０，０００乃至２００，０
００ダルトンであることが判明した。ヒトＩＬ−１８の
分子量は約２０，０００ダルトンであるから、ＩＬ−１
８Ｒ蛋白質にヒトＩＬ−１８が１分子結合したと仮定す
ると、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の分子量は、約３０，０００
乃至１８０，０００ダルトンということになる。

【００９０】

【実施例４−２】〈ＩＬ−１８Ｒ蛋白質のペプチド・マッピング〉実施例
４−１の方法により得た精製ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を、還
元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在
下、ゲル濃度７．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よりゲル電気泳動し、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマ
シーブリリアントブルーを含む４０％（ｖ／ｖ）水性メ
タノールと１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に５分間浸
漬して染色し、４０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１％
（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に２時間浸漬した後、ゲル
における分子量約８０，０００乃至１１０，０００ダル
トンに相当する染色部分を切出し、０．２Ｍ炭酸アンモ
ニウムを含む５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを加
え、室温下で繰返し振盪した。次いで、ゲルを真空乾燥
し、０．２Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）を加え、
５分間静置して膨潤させた後、プロメガ製トリプシン製
剤『シーケンシング・グレード・モディファイッド・ト
リプシン』を０．１μｇ／μｌ含む１ｍＭ塩酸と０．２
Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．９）をそれぞれ適量加
え、３７℃で一晩反応させた。１０％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸水溶液により反応を停止させ、反応物に０．
１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液と６０％（ｖ／
ｖ）水性アセトニトリルの混液を加え、室温下で振盪し
た後、上清を採取し、真空乾燥し、遠心濾過してペプチ
ド断片を含む濃縮物を得た。

【００９１】この濃縮物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）
トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化しておいたファル
マシア製高速液体クロマトグラフィー用カラム『μＲＰ
ＣＣ２／Ｃ１８ＳＣ２．１／１０』に負荷し、通液開
始から１６０分間でアセトニトリル濃度が０％（ｖ／
ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するアセト
ニトリルの濃度勾配下、８０％（ｖ／ｖ）水性アセトニ
トリルを含む０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
水溶液を１００μｌ／分の流速で通液した。波長２１４
ｎｍにおける溶出液の吸光度をモニターしながら溶出液
を分画し、溶出開始から約４５分後、約５０分後、約５
５分後、約５８分後、約６２分後、約７２分後、約７５
分後及び約７７分後に溶出したペプチド断片をそれぞれ
別々に採取した。常法にしたがって、これらのペプチド
断片（以下、溶出時間の早い順に「ペプチド断片１」、
「ペプチド断片２」、「ペプチド断片３」、「ペプチド
断片４」、「ペプチド断片５」、「ペプチド断片６」、
「ペプチド断片７」及び「ペプチド断片８」と言う。）
のアミノ酸配列をパーキン・エルマー製プロテイン・シ
ーケンサー『４７３Ａ型』により調べたところ、ペプチ
ド断片１乃至８は、それぞれ、配列表における配列番号
３乃至１０に示すアミノ酸配列を有することが判明し
た。このとき得られたペプチド・マップを図５に示す。

【００９２】

【実施例５】〈液剤〉安定剤として林原製結晶トレハロース粉末『ト
レハオース』を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に実施例
４の方法により得た精製ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を１ｍｇ／
ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過に
より除菌して液剤を得た。

【００９３】安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含
む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、
点鼻剤などとして有用である。

【００９４】

【実施例６】〈乾燥注射剤〉安定剤としてシュークロースを１％（ｗ
／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例４の方法によ
り得た精製ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を１００ｍｇ溶解し、常
法にしたがって精密濾過により除菌した後、バイアル瓶
に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥した後、密栓した。

【００９５】安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含
む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として
有用である。

【００９６】

【実施例７】〈軟膏剤〉滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニ
ルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレ
ハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ濃度１．４％
（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解
し、実施例１の方法により得たＩＬ−１８Ｒ蛋白質を均
一に混合した後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当りＩＬ
−１８Ｒ蛋白質を約１ｍｇ含むペースト状物を得た。

【００９７】延展性と安定性に優れた本品は、自己免疫
疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤と
して有用である。

【００９８】

【実施例８】〈錠剤〉林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイン
トース』に実施例４の方法により得たＩＬ−１８Ｒ蛋白
質と細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られ
た混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍ
ｇ）当りＩＬ−１８Ｒ蛋白質及びルミンをそれぞれ約１
ｍｇ含む錠剤を得た。

【００９９】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有
する本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予
防するための錠剤として有用である。

【０１００】

【実験】

〈急性毒性試験〉常法にしたがって、８週齢のマウスに
実施例５乃至８の方法により得た種々剤型の感受性疾患
剤を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、
被検試料のＬＤ５０は、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質の量に換算
すると、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／マウス
体重以上であった。このことは、この発明のＩＬ−１８
Ｒ蛋白質がヒトを含む哺乳類に投与する医薬品に配合し
て安全であることを裏付けている。

【０１０１】

【発明の効果】以上説明したとおり、この発明はＩＬ−
１８を認識する新規な受容体蛋白質の発見に基づくもの
である。この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質は、ヒトを含む
哺乳類において免疫反応を抑制したり調節する性質を有
するので、臓器移植に伴う拒絶反応の緩和や、過剰な免
疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮
する。さらに、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質はＩＬ−
１８の生理作用の解明や、ＩＬ−１８Ｒ蛋白質に特異的
なモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマの樹
立にも有用である。

【０１０２】この発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ−
１８Ｒ蛋白質に特異的に反応するので、ＩＬ−１８Ｒ蛋
白質の精製及び検出に極めて有用である。この発明のモ
ノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマ
トグラフィーをＩＬ−１８Ｒ蛋白質と夾雑物質を含む混
合物に適用するときには、高純度のＩＬ−１８Ｒ蛋白質
が最少の時間と労力で得られ、また、この発明のモノク
ローナル抗体を用いる検出方法によるときには、微量の
ＩＬ−１８Ｒ蛋白質を短時間で精度良く検出することが
できる。さらに、この発明のモノクローナル抗体を用い
る阻害剤及び阻害方法は、ＩＬ−１８が直接又は間接に
関与する種々の疾患の治療や、臓器移植に伴う拒絶反応
や過剰な免疫反応の抑制にも有効である。斯くも有用な
るモノクローナル抗体は、この発明の製造方法により、
所望量を容易に製造することができる。加えて、この発
明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質及びモノクローナル抗体並びに
それらの断片は、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬
を検索するための試薬としても有用である。

【０１０３】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある
発明であると言える。

【０１０４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155

【０１０５】配列番号：2 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

【０１０６】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１０７】配列番号：4 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１０８】配列番号：5 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ser Ser Gly Ser Gln Glu His Val Glu Leu Asn Pro Arg 1 5 10

【０１０９】配列番号：6 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１０】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１１】配列番号：8 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１２】配列番号：9 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Thr Val Lys Pro Gly Arg Asp Glu Pro Glu Val Leu Pro Val Leu 1 5 10 15

【０１１３】配列番号：10 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１４】配列番号：11 配列の長さ：119 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ile 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115

【０１１５】配列番号：12 配列の長さ：108 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Ile Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

【０１１６】配列番号：13 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１７】配列番号：14 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe Gln 1 5 10 15 Asp Lys

【０１１８】配列番号：15 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１１９】配列番号：16 配列の長さ：11 トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１２０】配列番号：17 配列の長さ：7 トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１２１】配列番号：18 配列の長さ：9 トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１２２】配列番号：19 配列の長さ：357 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..357 特徴を決定した方法：E 配列 GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCA GTC AAA TTG TCC TGC ACA ACT TCT GGC TTC AAC ATC AAA GAC ATA 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ile 20 25 30 TAT ATC TAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG GTT 144 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT GAT ACT AAA TAT GGC CCG AAT TTC 192 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60 CAG GAC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 240 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTG CAG CTT CGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT 288 Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCT AGA CGG GGT AAC TAC GGG GCG GGG TTT GGT TAC TGG GGC CAA GGG 336 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115

【０１２３】配列番号：20 配列の長さ：324 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..324 特徴を決定した方法：E 配列 GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT CAC AAT TAT 96 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 TTA GCA TGG TAT CAG CAG AGA CAG GGA AAA TCT CCT CAG ATC CTG GTC 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Ile Leu Val 35 40 45 TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA AGG TTC AGT GGC 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAC TCT CTC AAT ATC AAC AGC CTG CAG CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 GAA GAT TTT GGG ACT TAT TTC TGT CAA CAT TTT TGG AGT ACT CCG TAC 288 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

【０１２４】配列番号：21 配列の長さ：414 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..57 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：58..414 特徴を決定した方法：E 配列 ATG AAA TGC AGC TGG GTT TTT CTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA GGG 48 Met Lys Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly -15 -10 -5 GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG 96 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 1 5 10 CCA GGG GCC TCA GTC AAA TTG TCC TGC ACA ACT TCT GGC TTC AAC ATC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile 15 20 25 AAA GAC ATA TAT ATC TAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG 192 Lys Asp Ile Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT GAT ACT AAA TAT GGC 240 Glu Trp Val Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly 50 55 60 CCG AAT TTC CAG GAC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC 288 Pro Asn Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 ACA GCC TAC CTG CAG CTT CGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCT AGA CGG GGT AAC TAC GGG GCG GGG TTT GGT TAC TGG 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp 95 100 105 GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 414 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115

【０１２５】配列番号：22 配列の長さ：384 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：61..384 特徴を決定した方法：E 配列 ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GCG TTG CTG CTG CTG TGG CTT ACA 48 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr -20 -15 -10 -5 GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTT TCT 96 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 1 5 10 GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT 144 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 15 20 25 ATT CAC AAT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AGA CAG GGA AAA TCT CCT 192 Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro 30 35 40 CAG ATC CTG GTC TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA 240 Gln Ile Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser 45 50 55 60 AGG TTG AGT GGC AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAC TCT CTC AAT ATC AAC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn Ile Asn 65 70 75 AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GGG ACT TAT TTC TGT CAA CAT TTT TGG 336 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp 80 85 90 AGT ACT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG 384 Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 95 100 105

【０１２６】配列番号：23 配列の長さ：248 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ile 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys 165 170 175 Ser Pro Gln Ile Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val 180 185 190 Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn 195 200 205 Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His 210 215 220 Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Arg His His His His His His 245

【図面の簡単な説明】

【図１】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ
が、ＩＬ−１８と競合してＬ４２８細胞及びＩＬ−１８
Ｒ蛋白質に結合する様子を示す図である。

【図２】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを
用いるウェスタン・ブロッティング法により可視化し
た、この発明のＩＬ−１８Ｒ蛋白質のゲル電気泳動のデ
ィスプレー上に表示した中間調画像である。

【図３】ＩＬ−１８Ｒ蛋白質によるＩＬ−１８の活性阻
害を示す図である。

【図４】ＩＬ−１８Ｒ蛋白質にモノクローナル抗体ＭＡ
ｂ＃１１７−１０Ｃを用いるイムノアフィニティークロ
マトグラフィーを適用したときのクロマトグラムであ
る。

【図５】ＩＬ−１８Ｒ蛋白質のペプチド・マップであ
る。

【図６】組換えＤＮＡ『ｐＣＤＭ／１１７−ＶＬ−Ｖ
Ｈ』の構造を示す図である。

【符合の説明】

ｐＣＤＭ／１１７−ＶＬ−ＶＨｃＤＮＡモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃにおける重
鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡＰｃｍｖサイトメガロウイ
ルスプロモーター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡＰＧ０１Ｎ 33/53 33/577 ＢＣ０７Ｋ 14/54 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ // Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 15/02 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号特願平9−215490 (32)優先日平９(1997)７月28日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−１８を認識するイン
ターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項２】ヒト又はマウスに由来する請求項１に記
載のインターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項３】ヒトリンパ芽球様細胞に由来する請求項
１又は２に記載のインターロイキン−１８受容体蛋白
質。
【請求項４】ヒトリンパ芽球様細胞がＬ４２８細胞
（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）である請求項３に記載の
インターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項５】インターロイキン−１８が配列表におけ
る配列番号１に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａ
ａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレ
オニンを表すものとする。）、又は、配列表における配
列番号２に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」
を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニン
を表すものとする。）を有する請求項１、２、３又は４
に記載のインターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項６】ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動において分子量３０，０００乃至１
８０，０００ダルトンを示す請求項１、２、３、４又は
５に記載のインターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項７】部分アミノ酸配列として、配列表におけ
る配列番号３乃至１０に示すアミノ酸配列の１又は複数
を有する請求項１、２、３、４、５又は６に記載のイン
ターロイキン−１８受容体蛋白質。
【請求項８】有効成分としてインターロイキン−１８
受容体蛋白質を含んでなる感受性疾患剤。
【請求項９】安定剤として血清アルブミン、ゼラチ
ン、糖質及び／又は緩衝剤を含んでなる請求項８に記載
の感受性疾患剤。
【請求項１０】抗自己免疫疾患剤としての請求項８又は
９に記載の感受性疾患剤。
【請求項１１】免疫抑制剤としての請求項８又は９に記
載の感受性疾患剤。
【請求項１２】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体。
【請求項１３】重鎖及び軽鎖の可変領域が、それぞれ、
配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配
列を含有する請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】重鎖及び軽鎖の可変領域における相補性
決定部位が、それぞれ、配列表における配列番号１３乃
至１５及び配列番号１６乃至１８に示すアミノ酸配列を
含有する請求項１２又は１３に記載のモノクローナル抗
体。
【請求項１５】ヒト化抗体である請求項１２、１３又は
１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドー
マ。
【請求項１７】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドー
マを生体外又は生体内で培養する工程と、その培養物又
は体液からモノクローナル抗体を採取する工程を含んで
なるモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１８】培養物又は体液からモノクローナル抗体
を塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は
等電点電気泳動により採取する請求項１７に記載のモノ
クローナル抗体の製造方法。
【請求項１９】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体をインターロイキン−１８
受容体蛋白質と夾雑物質を含む混合物に接触させてモノ
クローナル抗体にインターロイキン−１８受容体蛋白質
を吸着せしめる工程と、吸着したインターロイキン−１
８受容体蛋白質をモノクローナル抗体から脱着させ、採
取する工程を含んでなるインターロイキン−１８受容体
蛋白質の精製方法。
【請求項２０】モノクローナル抗体が水不溶性担体に結
合している請求項１９に記載のインターロイキン−１８
受容体蛋白質の精製方法。
【請求項２１】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体を被検試料に接触せしめ、
免疫反応によりインターロイキン−１８受容体蛋白質を
検出するインターロイキン−１８受容体蛋白質の検出方
法。
【請求項２２】モノクローナル抗体が放射性物質、酵素
及び／又は蛍光物質により標識されている請求項２１に
記載のインターロイキン−１８受容体蛋白質の検出方
法。
【請求項２３】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体を含むインターロイキン−
１８受容体蛋白質の検出試薬。
【請求項２４】モノクローナル抗体が放射性物質、酵素
及び／又は蛍光物質により標識されている請求項２３に
記載のインターロイキン−１８受容体蛋白質の検出試
薬。
【請求項２５】有効成分としてインターロイキン−１８
受容体蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を含んでな
るインターロイキン−１８に対する阻害剤。
【請求項２６】インターロイキン−１８受容体蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体をインターロイキン−１８
受容体蛋白質に作用させることを特徴とするインターロ
イキン−１８の阻害方法。
【請求項２７】有効成分としてインターロイキン−１８
受容体蛋白質を含んでなるインターロイキン−１８に対
する中和剤
【請求項２８】インターロイキン−１８にインターロイ
キン−１８受容体蛋白質を作用させることを特徴とする
インターロイキン−１８の中和方法。