JPH06506697A - ヒトｐｆ４ａ受容体とその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＰＦ４Ａ受容体とその使用 本発明は、血小板因子４スーパーフアミリーの構成要素（以下ｒＰＦ４ＡＪと略 記する）を検定する分野と、このファミリーの構成要素に対する作用薬および拮 抗薬の調製に関する。

発明の背景 インターロイキン８は好中球にとっての化学誘引物質として最初に同定され、好 中球上の受容体を結合することが知られていたが１１０．この物質はさらに、脱 顆粒の刺激や細胞接着分子ＭＡＣ−１と補体受容体ＣＲＩ’の上方調節を含む広 範な前炎症活性を持っている。ＩＬ−８は活性化された内皮細胞に対する好中球 の接着の阻害を媒介することもできる２゜ＩＬ−８は約１００００のＭ、を持っ １０またはそれ以上の前炎症性すイトカインのファミリーの構成要素である１゜ このかなり大きいタンパク質ファミリーは血小板因子４スーパーフアミリーと呼 ばれている（ウォルベら、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　３　：２５６５−７３［１９８ ９］）、一般にＣＸＣペプチド（ＩＬ−８を含む）と呼ばれる副集団である血小 板因子４スーパーフアミリーのいくつかの構成要素は、好中球作用薬活性を保持 しテオリ、例えばＮＡＰ−２、ＭＴＰ−２、血小板因子４およびＮＡ　Ｐ−３（ ＭＧ　ＳＡ／ｇｒｏ）などである。このファミリーの他の構成要素であるＣ−Ｃ ペプチドは好中球作用薬ではない。以下ｒＰＦ４ＡＪとはＰＦ４スーパーファミ リーを意味する。

本発明の目的は、ＰＦ４Ａスーパーファミリーの受容体（以下ｒＰＦ４ＡＲＪと 略記する）を同定することである。

本発明のもう１つの目的は、これらの受容体をコード化するＤＮＡもしくはこれ らの受容体にハイブリッド形成するＤＮＡを得ること、並びに、宿主細胞中で該 受容体を発現させることである。

本発明のさらなる目的は、診断的用途および医療的用途のためにＰＦ４ＡＲの単 離物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、該受容体の変種をコード化するＤＮＡを得ること、並 びに、組換え細胞培養中で該変種を調製することである。

本発明のこれらの目的とその他の目的は本明細書全体から明らかになるであろあ る側面として、これらの目的は、構造的にＰＦ４ＡＲに関連するポリペプチドを 含む、単離された新規なＰＦ４ＡＲポリペプチドを提供することによって達成さ れる。この種に属するポリペプチドをこれ以降一般にｒＰＦ４ＡＲＪと呼び、そ れらの誘導体と変種を包含するものとする。

もう１つの側面として本発明は、ＰＦ４ＡＲからなる組成物であって、そのＰＦ ４ＡＲが由来する動物種の混入ポリペプチドを含有しない組成物を提供する。

ＰＦ４ＡＲまたはその断片（これは化学的方法によって合成することもできる） を免疫原性ポリペプチドに（組換え発現またはインビトロ共有結合法によって） 融合し、次いでその融合ポリペプチドを用いて動物を免疫化することにより、Ｐ Ｆ４ＡＲエピトープに対する抗体を生じさせる。抗ＰＦ４ＡＲ抗体は免疫化した 動物の血清から回収される。別法として免疫化した動物の細胞から従来の方法で モノクローナル抗体を作成することもできる。

抗ＰＦ４ＡＲ抗体はＰＦ４ＡＲの診断（インビトロまたはインビボ）やＰＦ４Ａ Ｒの精製（不溶性の基盤に固定化されている場合）にとりわけ有用である。

ＰＦ４ＡＲの置換、欠失または挿入変種はインビトロ法または組換え法によって 作成され、ＰＦ４ＡＲとの免疫交差反応性およびＰＦ４ＡＲ拮抗薬または作用薬 活性についてスクリーニングされる。

特にＰＦ４ＡＲとその抗体の診断のため、あるいはＰＦ４ＡＲ抗体のアフィニテ ィー精製のためには、ＰＦ４ＡＲをインビトロで誘導体化することによって、固 定化したＰＦ４ＡＲや標識したＰＦ４ＡＲを作成する。

特に医療的使用のためには、Ｐ　Ｆ　４　ＡＲ，その誘導体またはその抗体を生 理学的に許容される賦形剤中に製剤化する。そのような賦形剤にはＰＦ４ＡＲの 徐放性製剤が含まれる。

さらに異なる側面として、本発明は、ＰＦ４ＡＲをコード化する単離された核酸 （標識されているもの、あるいは標識されていないもの）およびＰＦ４ＡＲをコ ード化する核酸配列に相補的な核酸配列またはＰＦ４ＡＲをコード化する核酸配 列に対して適当な条件下でハイブリッド形成する核酸配列を提供する。

さらに本発明は、複数可能なベクターであって、そのベクターによって形質転換 される宿主によって認識される制御配列に機能可能に連結したＰＦ４ＡＲをコー ド化する核酸分子からなる複製可能なベクター、並びに、ＰＦ４ＡＲの生産を達 成するためにＰＦ４ＡＲをコード化する核酸を使用する方法であって、形質転換 された宿主細胞の培養中で該核酸分子を発現させ、その宿主細胞培養からＰＦ４ ＡＲを回収することからなる方法を提供する。この核酸配列はＰＦ４ＡＲ核酸に 関するハイブリッド形成検定法においても有用である。上記の組換え宿生細胞は 適当なＰＦ４Ａ構成要素を検定する際にとりわけ有用である。

さらなる態様として、本発明は、ＰＦ４ＡＲを生産する方法であって、ＰＦ４Ａ Ｒをコード化する核酸を含有する細胞のＤＮＡ中に、ＰＦ４ＡＲ核酸に対して、 生物学的に活性なＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡの転写に影響を与えるか、も しくはその転写を破壊するに足る近さと配向で、転写変調要素を挿入することか らなり、さらにその転写変調要素とＰＦ４ＡＲ核酸を含有する細胞を培養すると いう随意の段階を伴う方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、クローンｐＲＫ５Ｂ、　ｉ　ｌ　８　ｒ　１．１でトランスフェクショ ンされたＣＯ８細胞に対するＩＬ−８の高親和性結合を表す。ａ）標識していな いＩＬ−８またはｆＭＬＰとの競争。ｂ）ｌ−８競争データのスカチャード分析 ；見かけ上のＫｄ＝３．６μＭ、平均８２００００結合部位／細胞。ヒト好中球 による同様の競争はＫｄ＝１．１μＭ、３１０００結合部位／細胞を与えた。

図２ａ〜２ｃ（配列番号１）（以下これらを総合して図２と呼ぶ）は、クローン ｐＲＫ５Ｂ、１１８ｒ１．１から得たＩＬ−８受容体ｃＤＮＡ挿入物のアミノ酸 配列とヌクレオチド配列を表す。７つの推定貫膜ドメインを示す。４つの細胞外 セグメントと４つの細胞内セグメントが存在し、それぞれのセグメントは貫膜ド メインの１つによって分離されている。細胞外セグメントはほぼ残基１〜３９． ９９〜１１１．１３４〜１５４．１７５〜２０３および２６５〜２９０によって 表される。このＩＬ−８受容体は最初の細胞外領域に３つの潜在的Ｎ−結合型グ リコシル化部位を含有しており、第３の細胞外ループにさらに３つの潜在的Ｎ− 結合型グリコシル化部位を含有する。

図３ａは、トランスフェクンヨンされたヒトＩＬ−８およびｆＭＬＰ受容体のそ れらの配位子に対する細胞内Ｃａ”応答のフローサイトメトリー測定を表す。

ヒト胚性腎臓２９３細胞をエレクトロポレーション１９によって、ＩＬ−８受容 体（クローンｐＲＫ５Ｂ、　ｉ　Ｉ　８　ｒ　１．１）、ｆＭＬＰ受容体（ベク ターｐＲＫＳ中のヒトｆＭＬＰ受容体ｃＤＮＡ”）またはベクター（ｐＲＫ５Ｂ ”）ＤＮＡでトランスフェクションした。２日後に、ＲＰＭＩ培地中の２μＭイ ンドー１アセトキシメチルエステルを３７℃で３０分間細胞に充填した。４０５ ｎｍと５２５ｎｍの蛍光の比を用いて２３、細胞内Ｃａ”をコールタ−７５３フ ローサイトメーターで測定した。

図３ｂは、ＩＬ−８の添加後の期間（各実験中で約１５秒間）の４００ｎＭＣａ １゛４以上の細胞の百分率を表す。

図４（配列番号２）と図５（配列番号３）は、ヒト単球様細胞系（ＨＬ−６０） とヒトＰＢＬから得たラムダライブラリーをＩＬ−８受容体ＤＮＡの大きい断片 を用いてプローブすることによって同定した２つの追加のＰＦ４ＡＲ構成要素に 関するポリペプチド配列を表す。

発明の詳細な説明 出願人らは、発現クローニングによってヒト好中球ＩＬ−８受容体をコード化す るｃＤＮＡを２つの他の相同な受容体と共に単離した。そのアミノ酸配列は、こ のＩＬ−８受容体が、化学誘引物質ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ３およびＣ５ａ ’にとってのヒト好中球受容体に対して明確な類似性（アミノ酸同一性２９％） を伴うＧ−タンパク質共役受容体ファミリーの構成要素であることを示している 。このＩＬ−８受容体配列はウサギのｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ受容体Ｓのイ ソ型として同定されているもののヒト相同体であり得るが、出願人らは、哺乳類 細胞中にトランスフェクションすると、この受容体クローンがＩＬ−８に対する 高親和性結合を付与し、ｆ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅに対する結合または応答 を伴うことなく、Ｉ　Ｌ−８に応答して一時的なＣａ−の流動化を生み出すこと を明らかにした。

Ｉ　Ｌ−８受容体をコード化するクローンを単離するために、ＣＯ８細胞発現ク ローニング法トフを使用した。ヒト好中球ｍＲＮＡから哺乳類発現ベクターｐＲ Ｋ５Ｂ中に構築したｃＤＮＡライブラリーを２５００クローンのプールとしてＣ ０８−７細胞中にトラシスフエクンヨンし、その細胞を”’　Ｉ　−Ｉ　Ｌ−８ の結合についてスクリーニングした。最初の５８トランスフエクシヨンから得た １つの陽性プールを純粋な１クローン（ｐＲＫ５Ｂ、　ｉ　ｌ　８　ｒ　１．１ ）が得られるまで、より小さいプールに分配した。図１は、単離された上記クロ ーンでトランスフェクションされたＣＯ８細胞に対する、未標識のＩ　Ｌ−８に よるｌ”１−ＩＬ−８結合の競争を示す。このデータの分析により、ＩＬ−８結 合に関するＫｄ値が、ヒト好中球に対するＩ　Ｌ−８結合について報告されてい る０、８〜４ｎＭの範囲内５−ｔｏである３、６μＭであることがわかった。走 化性ペプチドｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）によるＩ　Ｌ−８結合の 競争はない。

単離されたｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（図２）は、翻訳開始部位と予想され るコンセンサスに合致するメチオニン残基１１に始まる１つの長い読み取り枠を 含有している。この読み取り枠は３５０アミノ酸のタンパク質（翻訳されたＭ、 は３９、５　ｋ　Ｄ）をコード化している。そのアミノ酸配列は、細胞膜をまた ぐと予想される７つの疎水性ドメインとＮ−末端近くのＮ−結合型グリコシル化 部位＋２（下記参照）を含むロドプシンスーパーファミリーのＧ−タンパク質共 役受容体といくつかの特徴を共有している。

コード化されているアミノ酸配列は最近クローン化されたウサギｆＭＬＰ受容体 ５に関する配列に最も類似している。その類似性は、これら２つの配列が充分に 同じ受容体の種相同体であり得るほどに高い（２０以上の連続したアミノ酸が合 致する複数の領域を伴う７９％の総合アミノ酸同一性）。ヒトｆＭＬＰ受容体も 既にクローン化されており３、それはウサギｆＭＬＰ受容体と２６％のアミノ酸 同一性しか有さない（また本明細書に開示するヒト好中球受容体に対する同一性 は２９％である）。ウサギｆＭＬＰ受容体アミノ酸配列とヒトｆＭＬＰ受容体ア ミノ酸配列の間のかなりの相違は、これらがｆＭＬＰ受容体の２つのイソ型であ ろう５という示唆を当該技術分野に与えてきた（これは現在ではおそらく誤りで あろうと考えられる）。

好中球は化学誘引物質ＩＬ−８およびｆＭＬＰに対して迅速で一時的な細胞内遊 離Ｃａ”濃度の増大を伴って応答するＩ’　＋１゜本発明においてＩＬ−８受容 体として単離されたクローンの同定を立証するために、出願人らは、添加された ＩＬ−８並びにｆＭＬＰに対する、トランスフェクションされた細胞の細胞内Ｃ ａ４＋応答を決定した。出願人らはトランスフェクションされたヒトｆＭＬＰ受 容体または対照としての発現ベクターを用いて平行実験を行った。フローサイト メーター分析は、トランスフェクションされたＩＬ−８受容体について、ＩＬ− ８に対する応答として、細胞内Ｃａ″３の明らかな一時的増大を示している。ｆ ＭＬＰに対する応答は認められない。逆にヒトｆＭＬＰ受容体でトランスフェク ションした細胞はｆＭＬＰには応答するが、ＩＬ−８には応答しない。ベクター でトランスフェクンヨンされた細胞ではどちらの化学誘引物質に対する応答も認 められない。

トランスフェクション効率は１５〜２５％と見積もられるので、これらの実験に おいて応答すると予期されるのはこれらの細胞の副集団に過ぎない。結合実験１ ４も発現されたＩＬ−８受容体に対する３Ｈ−ｆＭＬＰの結合もしくは発現され たヒトｆＭＬＰ受容体に対する＋１５１−ＩＬ−８の結合を検出することができ なかった。

これらの実験は上記２つの受容体のそれぞれの配位子に対する特異性、即ちＩＬ −８とｆＭＬＰの間の好中球に関する結合競争の欠如に基づいて予期される結果 １、を明確に立証している。またこれらの結果は、クローン化された受容体が配 位子の結合に対する応答として、第２のメツセージを信号化するように機能する ことをも明らかにしている。

ヒト好中球ｍＲＮＡに対するクローン化したＩ　Ｌ−８受容体ｃＤＮＡのプロッ ト・ハイブリッド形成は、２．４ｋｂおよび３．Ｏｋｂの強いバンドと共にかな り弱い３．５ｋｂのバンドを示す。図２に示すＤＮＡ配列データから、受容体の ｍＲＮＡが長い３゛非翻訳領域を持っていることは明らかであるが、複数のＲＮ Ａバンドが複数のポリアデニル化部位によるものであるかどうかを立証するには さらなる研究が必要であろう。Ｂ細胞およびＴ細胞系統であるジュルカット０ｕ ｒｋａｔ）細胞系またはＵ２Ｏ５から得たｍＲＮＡに対するハイブリッド形成は 検出されなかった。これらの細胞に対する低レベルのＩＬ−８結合が報告されて いるにもかかわらず、単球細胞系Ｕ９３７から得たｍＲＮＡについてもやはりハ イブリッド形成は観測されなかった。

３種の好中球化学誘引物質ＩＬ−８、ｆＭＬＰ３およびＣ５ａ’に関する受容体 配列の並列によって、それらが２９〜３４％のアミノ酸同一性を伴うＧ−タンパ ク賃共役受容体のサブファミリーを形成していることが示される。このサブファ ミリーは、β−アドレナリン作動性受容体＋２またはムスカリン性アセチルコリ ン受容体１５などの他のＧ−タンパク質共役受容体と比較して短い第３の細胞内 ループを持っている。このループは少なくとも部分的にはその受容体＋２に対す るＧ−タンパク質の結合の原因である決定基を含有している。ＩＬ−８受容体の 細胞内Ｃ−末端領域はｆＭＬＰおよびＣ５ａ受容体のそれとはあまり類似してい ないものの、リン酸化部位として機能し得る多数のセリンおよびスレオニン残基 を保存している。Ｃ５ａ受容体について注記されているように４、ＩＬ−８受容 体のＮ−末端細胞外領域は数個の酸性残基を持っている。これらは極めて塩基性 であるＩＬ−８（ｐ　Ｉ〜９．５）の結合を促進するのであろう。

■、定義 一般に、この説明、実施例および請求の範囲で使用する下記の用語あるいは表現 は以下に示す定義を有する。

用語ｒＰＦ４ＡＲＪは図２．４または５のポリペプチドに共通する定性的な生物 学的活性を有するポリペプチドと定義される。随意に、ＰＦ４ＡＲは、図２．４ または５のポリペプチドのいずれかと少なくとも３０％、通常は７５％のアミノ 酸配列同一性を有するであろう。随意に、ＰＦ４ＡＲは、ウサギｆＭＬＰ受容体 ５、ヒトｆＭＬＰ受容体３、ヒトＣ５ａ受容体４および／またはマーフィーら、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２５３：１２８０（１９９１）に記述されている受容体を除外 する。

ＰＦ４ＡＲに関する同一性または相同性は、本明細書では、配列を並列させて、 必要であれば最大の相同百分率が得られるように間隙を導入した後に、図２．４ または５中の残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率と定義され、保 存的な置換は残基の同一性を表すものと見なさない。Ｎ−末端またはＣ−末端伸 長や欠失または挿入は同一性または相同性を減少させるものと見なされないであ ろう。

ＰＦ４ＡＲの定性的な生物学的活性は、（１）図２．４または５に記載のポリペ プチドの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性、（２）ＰＦ４ス ーパーファミリーの構成要素に特異的に結合する能力、または（３）図２．４ま たは５のポリペプチドに自然に認められる何らかのエフェクター活性または機能 的活性（スーパーファミリー構成要素以外の何らかの配位子を結合する能力を含 む）のいずれか１つと定義される。

本明細書で使用される場合、免疫学的な交差反応性とは、候補ポリペプチドがＰ Ｆ４ＡＲに対して生じさせた抗血清やポリクローナル抗体に対するＰＦ４ＡＲの 結合を競争的に阻害することができることを意味する。このような抗体や血清は 、ヤギやウサギなどの動物に完全フロインドアジュバント中の既知の天然のＰＦ ４ＡＲを例えば皮下注射し、次いで不完全フロインドアジュバント中で腹腔内ま たは皮下に追加免疫注射することによる従来の方法で調製される。

本明細書で使用する用語としてのＰＦ４ＡＲの範囲には、図２．４または５に記 載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのようなアミツノ酸配列のアミノ酸 配列変種、それらのポリペプチドのグリコリル化変種およびそれらのポリペプチ ドの共有結合修飾体が含まれる。これらのそれぞれを以下に詳述する。

「単離されたＪ　ＰＦ４ＡＲ核酸またはポリペプチドとは、通常自然に伴う少な くとも１つの混入物（それぞれ核酸またはポリペプチド）から（例えばＰＦ４Ａ Ｒ核酸またはポリペプチドの動物またはヒト供給源から）分離され、同定された ＰＦ４ＡＲ核酸またはポリペプチドをいう。好ましい態様では、ＰＦ４ＡＲが、 その起源の種のタンパク質に関して医薬的に許容されるレベルの純度に単離され るであろう。好ましい態様では、ＰＦ４ＡＲタンパク質が、（１）ローリ−法で 決定したタンパク質の９５重量％以上（最も好ましくは９９重量％以上）に精製 されるか、（２）本願の出願日に市販されているアミノ酸配列決定装置によって Ｎ−末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得ること ができる捏度に精製されるか、あるいは（３）クーマシー・ブルー（好ましくは 銀染色）を用いる従来の非還元的５ＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に精製されるで あろう。単離されたＰＦ４ＡＲは組換え細胞内の現位置にあるＰＦ４ＡＲを包含 する。なぜなら、この例ではＰＦ４ＡＲの自然の環境の少なくとも１つの成分が 存在しないであろうからである。単離されたＰＦ４ＡＲはある種の組換え細胞培 養内にある別の種からのＰＦ４ＡＲを包含する。なぜなら、そのような環境にあ る受容体は供給源のポリペプチドを含まないであろうからである。しかし通常は 単離された受容体が少なくとも一つの精製段階によって調製されるであろう。

単離されたＰＦ４ＡＲ核酸は、通常はその受容体核酸の天然の供給源に伴う少な くとも１つの混入核酸から分離され、同定された核酸を包含する。したがって、 単離されたＰＦ４ＡＲ核酸は天然に認められる形態または状況とは異なる形態ま たは状況で存在する。しかし単離された受容体コード化核酸は、その核酸が天然 の細胞とは異なる染色体位置にあるか、もしくは天然に認められるもの以外の異 なるＤＮＡ配列に隣接している、通常に受容体を発現させる細胞中のＰＦ４ＡＲ 核酸を包含する。

該核酸またはポリペプチドを診断のためおよびプローブのために、下記の診断的 検定法の議論で記述し定義する標識を用いて標識してもよい。

ＰＦ４ＡＲｒ核酸」は図２．４または５内のポリペプチド配列をコード化する１ ０塩基以上を含有するＲＮＡまたはＤＮＡと定義され、図２．４または５の核酸 配列に相補的であり、そのような核酸にハイブリッド形成して低い厳密条件下で それに安定に結合したままであるか、あるいは図２．４または５に示す翻訳され たアミノ酸配列またはその断片と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも７５ ％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を共有するポリペプチドをコ ード化する。図２．４または５の核酸にハイブリッド形成するＤＮＡは好ましく は少なくとも２０塩基、より好ましくは４０塩基、さらに好ましくは６０塩基を 含有する。最も好ましくは、ハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡが４５塩 基、さらにより好ましくは９０塩基を含有する。しかしこのようなハイブリッド 形成核酸または相補的核酸はさらに、ウサギｆＭＬＰ受容体５、ヒトｆＭＬＰ受 容体または（随意に）マーフィーら（上記）のＩＬ−８受容体をコード化する核 酸をコード化するか、低い厳密条件下で該核酸とハイブリッド形成するか、ある いは該核酸に相補的な核酸を含めて、先行技術のいずれの核酸に対しても新規で あって自明でないものと定義される。

「高い厳密条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度と高温（例：５０℃で ０．０１５Ｍ　ＮａＣ］１０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム１０．１％ＮａＤ ｏｄＳｏ４）を使用する条件であるか、もしくは（２）ハイブリッド形成の間に ０．１％牛血清アルブミン１０．１％フィコール１０．１％ポリビニルピロリド ン１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）を伴う５０％（体積／体積 ）ホルムアミドを７５０ｍＭ　ＮａＣ］、７７５Ｍクエン酸ナトリウムと共に４ ２℃で使用する条件か、あるいは（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５ ＸＳＳＣ（０，７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５×デンハ ルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｕｇ／ｍ＋）、０．１％ＳＤＳ および１０％硫酸デキストランを使用し、それに伴って０．２ＸＳＳＣおよび０ ．１％ＳＤＳ中４２℃中法２する条件のいずれかである。

用語「制御配列」は、特定の宿主生物中で機能可能に連結したコード配列の発現 に必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えばプロモ ーター、随意にオペレーター配列、およびリポソーム結合部位が含まれる。真横 細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用するこ とがわかっている。

ある核酸がもう１つの核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、その核酸は「機 能可能に連結」している。例えばプレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それ がポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される時、そのポリ ペプチドのＤＮＡに機能可能に連結している。またプロモーターやエンハンサ− は、それがコード配列の転写に影響を与える時、そのコード配列に機能可能に連 結している。さらにリポソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置に ある時、コード配列に機能可能に連結している。「機能可能に連結している」と は、一般的には連結されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダ ーの場合には隣接していて且つ解読相が一致していることを意味する。しかしエ ンハンサ−は隣接している必要がない。連結は都合のよい制限部位での連結（ラ イゲーション）によって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合 成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を従来の慣用に従って使用する 。

本発明における出発プラスミドは市販されており、制限なく公に使用することが できるか、もしくは上記の利用可能なプラスミドから公表されている手法に従っ て構築することができる。さらに他の等価なプラスミドも当該技術分野では知ら れており、当業者には明らかであろう。ＤＮＡの制限酵素消化、回収または単離 、ハイブリッド形成分析および連結（ライゲーション）は慣用の方法であり、現 時点で当業者によ（知られている。

ある与えられたＤＮＡ断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、ポ リアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で電気泳動によって消化物を分離 し、既知の分子量を有するマーカーＤＮＡ断片の移動度とその移動度とを比較す ることによって興味ある断片を同定し、所望の断片を含有するゲル切片を取り出 し、ＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この手法は一般的に知られてい る。例えばローンら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　９：６１ ０３−６１１４（１９８１）およびゲラデルら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０）を参照のこと。

ＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡは、ＰＦ４ＡＲｍＲＮＡを含有していると考え られる組織から調製されるｃＤＮＡライブラリー、一般的にはＨＬ６０またはＰ ＢＬライブラリーから得ることができる。ＰＦ４ＡＲ遺伝子をゲノムライブラリ ーから得ることもできる。興味ある遺伝子またはそれによってコード化されてい るタンパク質を同定するために設計されたプローブを用いてライブラリーをスク リーニングする。出願人らはＩＬ−８受容体と２つの相同的受容体について全ｃ ＤＮＡを記述した。この受容体ファミリーをコード化する核酸は図２．４または ５の受容体遺伝子配列に由来するオリゴヌクレオチド配列を有するプローブを用 いてゲノムＤＮＡまたは好中球ｃＤＮＡライブラリーから低い厳密条件下で容易 に得ることができる。これらのプローブは通常約５００塩基またはそれ以上を含 有するであろう。これらのプローブは３つの代表的ＤＮＡに完全にノ＼イブ１ル ンド形成するであろうから、縮重配列を含有するプローブブールを使用する必要 はない。図２．４または５の受容体を同定するための上記プローブによるスクリ ーニングを高い厳密条件下で行えば、より効率が高い。

図２．４または５に記載したもの以外のＰＦ４ＡＲが存在し、それが上記の代表 的受容体に相同な領域を含有するものと考えられる。したがって図２．４または ５に記載のＤＮＡ配列を有するプローブを用いてこれらの受容体を同様にスクリ ーニングすることができる。プローブとして最もよい候補は３つの代表的ヒト受 容体の間で高度に相同な配列を表す（約１００塩基以上の）長い配列である。Ｉ Ｌ−８残基１５〜３４．７８〜９４．１７６〜１９３．２６４〜２８２および２ ９９〜３１２をコード化するＩ　Ｌ−８ｃＤＮＡ（および１−８Ｒフアミリーの 他の受容体から得られる同等なプローブ）は、とりわけＩＬ−８受容体ＤＮＡに ついてプローブする際に有用である。図４の受容体（および図５の受容体に特有 の単離されたタンパク質）にとって有用なプローブは残基１〜４８．７７〜９２ ．１０７〜１３７．１５６〜１７７．１８９〜２２６．２３９〜２５７および２ ７１〜３１５からなる配列によって表される。図４の受容体の相同的なプローブ と残基、即ち残基１〜３５．６４〜７８．９４〜１２４．１４３〜１６４．１７ ６〜１９７．２１９〜２３９および２５１〜２９５も有用である。図２．４また は５ポリペプチドの下記の領域をコード化するｃＤＮＡからなるｃＤＮＡは他の 受容体をプローブする際に有用である。９２〜１０６．５７〜７２．１３８〜１ ５４．３１４〜３２９および５７〜１５４゜ 一般的には、ある与えられたＰＦ４Ａを特異的に結合することができ、そのＰＦ ４Ａによって活性化される細胞を、典型的にはインビトロ生物検定法によって、 また随意に標識されたＰＦ４Ａを用いる細胞結合分析によって、まず同定する。

それゆえに、この過程によって同定される細胞（いくつかは個々のＰＦ４Ａにつ いて既に知られている）はそのＰＦ４Ａに関する受容体を発現させている。その ような細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、それ自体は慣用の手法によって 受容体プローブを用いてスクリーニングする。しかしこの場合、（実施例２に記 述するような）低い厳密条件を使用することが好ましく、次いで得られた陽性ク ローンを図２、・１または５の受容体に対する相同性について分析する。一般に 、候補ヒトＰＦ４ＡＲは図２．４または５の受容体に対して約３０％以上のアミ ノ酸配列相同性を示し、類似の貫膜ループ構造を保持しているであろう。

次にハイブリッド形成する全長遺伝子が所望のＰＦ４ＡＲであることを確認する ために検定を行う。その候補を単に発現ベクター中に挿入し、それを通常は候補 ＰＦＪＡ配位子に結合しない宿主細胞中に形質転換する。したがって、その配位 子を結合する能力を獲得した形質転換体は所望の受容体遺伝子を保持する。出願 人らは実施例２において、ＰＲ４ＡＲを表す２つの追加の相同なポリペプチド配 列が、特定のプローブが不可欠であるとは思われないが、残基２３〜３１４をコ ード化するＩＬ−８ＲＤＮＡを用いて同定されることを示す。

追加のＰＦ４ＡＲをコード化する遺伝子を単離する代替手段は、例えばサムプル ツクら（上記）の１４章に記述されているようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）法（米国特許第４６８３１９５号；エルリッヒ編ｒＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙＪ　（１９８９））を用いて一的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することである。

この方法はＰＦ４ＡＲにハイブリッド形成すると予期されるオリゴヌクレオチド ブライマーの使用を必要とし、これらは図２．４または５の受容体ｃＤＮＡから 容易に選択される。オリゴヌクレオチドブライマーの選択法は上述の通りである 。

図２．４または５の受容体もしくは相同な受容体をコード化するＤＮＡを得るた めに、様々な組織、好ましくは哺乳類ＰＢＬ、単球、胎盤、胎児、脳および癌腫 細胞系からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。より好ま しくは、ヒトまたはウサギの胎盤、胎児、脳および癌腫細胞系ｃＤＮＡライブラ リーを標識したオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。

興味ある遺伝子を得るためのもう１つの方法は、エンゲルスら（Ａｇｎｅｗ、　 Ｃｈｅｔ　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　ＥｎｇＬ、　、　２８ニア１６−７３４　［１９ ８９］）に記述されている方法の１つを使用して、それを化学的に合成すること である。これらの方法には、典型的には固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合 成によって進行する、トリエステル、ホスファイト、ホスフォルアミダイトおよ びＨ−ホスホネート法が含まれる。その遺伝子の全アミノ酸配列または核酸配列 が知られているか、そのコード鎖に相補的な核酸の配列が利用できる場合に、こ れらの方法を使用することができる。所望のアミノ酸配列が既知である場合には 、各アミノ酸残基について既知の好ましいコード残基を用いることにより、考え 得る核酸配列を推論することができる。

Ｂ、ＰＦ４ＡＲのアミノ酸配列変種 ＰＦ４ＡＲのアミノ酸配列変種は、ＰＦ４ＡＲＤＮＡに適当なヌクレオチド変化 を導入するか、もしくは所望のＰＦ４ＡＲポリペプチドのインビトロ合成によっ て調製される。そのような変種には、例えばそれらの受容体について図２．４ま たは５に示したアミノ酸配列内の残基からの欠失体、挿入体または置換体が含ま れる。最終構築物が所望の特性を有する限り、最終構築物に到達するために欠失 、挿入および置換のどのような組み合わせを行ってもよい。

グリコリル化部位の数または位置の変化、膜固定特性を変化させることによるな ど、アミノ酸変化がＰＦ４ＡＲの翻訳後プロセシングを変化させてもよい。先行 技術に対して法定の新規性および非自明性を持たないＰＦ４ＡＲ変種またはポリ ペプチドは本発明の範囲から除外される。

ＰＦ４ＡＲのアミノ酸配列変種を設計するにあたって、突然変異部位の位置と突 然変異の性質は修飾されるべきＰＦ４ＡＲの特性（単数または複数）に依存する であろう。突然変異の部位は個別に修飾することもでき、連続的に修飾すること もできる。例えば、（１）まず保存的なアミノ酸選択物で置換した後に、達成さ れた結果に応じてより過激な選択物で置換するか、（２）標的残基を削除するか 、あるいは（３）位置を特定した部位に隣接して同じ種類か異なる種類の残基を 挿入するか、もしくは選択枝（１）〜（３）の組み合わせによる。

突然変異誘発法にとって好ましい位置にあるＰＦ４ＡＲポリペプチドのいくつか の残基または領域を同定する有用な方法は「アラニン走査突然変異誘発法（ａｌ ａｎｉｎｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）Ｊと呼ばれ、カニフ グ／１ムとウエルスによって記述されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４４　：１ ０８１−１０８５　［１９８９］　）。ここでは−残基または標的残基の群（例 ：ａｒｇ、ａＳｐＳｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中 性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン ）で置換することによってそれらのアミノ酸とそれらを取り巻く細胞内外の水性 環境との相互作用に影響を与える。次に、置換の部位にさらなる変化または他の 変化を導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示したドメインを 詳細に調べる。したがってアミノ酸配列変化を導入する部位は予め決定されるが 、置換の性質そのものは予め決定しておく必要がない。例えばある与えられた部 位での突然変異の効果を最適化するために、ａｌａ走査または無作為突然変異誘 発法を標的コドンまたは領域で行い、発現したＰＦ４ＡＲ変種を所望の活性の最 適な組み合わせについてスクリーニングする。

一般に改変にとって好ましいＰＦ４ＡＲ分子の領域は非親水性領域または高度に 保存されていない領域である。そのような領域は、ウサギｆＭＬＰ受容体、ヒト ｆＭＬＰ受容体、ヒトＣ５ａ受容体および図２．４および５の受容体中の相同な 位置において本質的に保存されていない５またはそれ以上の残基の配列からなる 領域である。

ＰＦ４ＡＲ変種は少なくとも親配列の生物学的活性、例えば配位子結合活性や抗 原性活性などを示すであろう。抗原的に活性なＰＦ４ＡＲは天然に存在するＰＦ ４ＡＲ配列に対して生じた抗体に対して少なくとも１０−９１／ｍｏ　Ｉの親和 性で結合するポリペプチドである。通常そのポリペプチドは少なくとも約１０− ＠１／ｍｏ＋の親和性で結合する。最も好ましくは、抗原的に活性なＰＦ４ＡＲ が天然の立体配置にある受容体に対して生じた抗体に結合するポリペプチドであ り、ここに「天然の立体配置」とは一般に、受容体の三次構造を本質的に改変す るカオトロピック剤、熱または他の処理によって変性されていない自然に認めら れるままの受容体を意味する（これは例えば非還元的非変性的サイズ分画ゲル上 での移動によって決定することができる）。抗原性活性の決定に使用される抗体 は、フロイント完全アジュバント中に天然の非ウサギ受容体を製剤化し、その製 剤を皮下注射し、抗受容体抗体の力価が平坦になるまでその製剤の腹腔内注射に よっ　−て免疫応答を強化することによって生成させたウサギのポリクローナル 抗体である。

変種の１つの群は欠失突然変異体または図２．４または５に記載の配列または他 のＰＦ４ＡＲの断片である。一般にこれらの断片は受容体の細胞外領域を構成す るものである（これらの受容体は、それらが性質中に輪を作ると考えられる親水 性配列によって分離された複数の疎水性貫層ドメインを含有すると考えられてい る点で最も異なっている）。特に興味深いのは、酸性アミノ酸残基を含有するＮ −末端細胞外領域である。しかし、無傷の受容体と交差反応するであろう抗体を 生じさせることができる配列、もしくはＰＦ４スーパーファミリーの一構成要素 に結合するであろう配列であれば、いずれも有用である。これらの断片は典型的 には少なくとも約５（通常は少なくとも約１０）残基の連続的な配列を含有する であろう。

アミノ酸配列の欠失は一般に約１ないし３０残基の範囲であり、より好ましくは 約１ないし１０残基であり、典型的には連続的である。図２．４および５の受容 体の間で相同性が低い領域中に欠失を導入して、その受容体の活性を変化させる ことができる。そのような欠失は他の位置に行う欠失よりも有意にその受容体の 生物学的活性を改変するものと考えられる。連続的な欠失の数は影響を加えるド メイン中のＰＦ４ＡＲの三次構造（例：ベータひだ状シートまたはアルファへリ ックス）を保存するように選択されるであろう。

アミノ酸配列の挿入には１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドに至 る長さのアミ／−および／またはカルボキシル−末端融合と、１アミノ酸残基ま たは複数アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（即ちＰＦ４ＡＲ配 列内の挿入）は一般に約１ないし１０残基にわたり得、より好ましくは工ないし ５残基、もっとも好ましくは１ないし３残基である。

ＰＦ４ＡＲの挿入変種またはその細胞外セグメントには、ＰＦ４ＡＲのＮ−また はＣ−末端に対する免疫原性ポリペプチド（例：ベーターラクタマーゼや大腸菌 ｔｒｐ遺伝子座によってコード化されている酵素などの細菌ポリペプチド、また は酵母タンパク質）の融合物、並びに、１９８９年４月６日に公開されたＷＯ３ ９１０２９２２に記述されているような、免疫グロブンリン定常領域（または他 の免疫グロブリン領域）、アルブミンまたはフェリチンなどの長い半減期を持つ タンパク質とのＣ−末端融合物が含まれる。

変種のもう１つの群はアミノ酸置換変種である。これらの変種ではＰＦ４ＡＲ分 子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入 されている。置換的突然変異誘発にとって最も興味深い部位には、ＰＦ４ＡＲの 活性部位（単数または複数）と同定される部位、および様々な種から得たＰＦＪ ＡＲ中に認められるアミノ酸が、側鎖のかさ高さ、電荷および／または疎水性の 点で本質的に異なっている部位が含まれる。

その他の興味深い部位は、図２．４および５のＰＦ４ＡＲの特定の残基が同一で ある部位である。これらの位置はＰＦ４ＡＲの生物学的活性にとって重要であり 得る。これらの部位（とりわけ少なくとも３つの他の同等に保存された部位の配 列内にあるもの）は比較的保存的な方法で置換される。このような保存的置換を 、好ましい置換と題した表１の欄に示す。このような置換が生物学的な活性の変 化をもたらす場合には、表１で代表的な置換と名付けた、より本質的な変化、も しくはアミノ酸の種類に関してさらに後述するようなより本質的な変化を導入し 、その産物をスクリーニングする。

Ａｌａ（Ａ）　ｖａｌ；Ｉｅｕ；ｉｌｅ　ｖａｌＡｒｇ（Ｒ）　Ｉｙｓ：ｇｌｎ ；ａｓｎ　１ｙｓＡｓｎ　（Ｎ）　ｇｉｎ；ｈｉｓ；ｌｙｓ；ａｒｇ　ｇｉｎＡ ｓｐ（Ｄ）　ｇｌｕ　ｇｌｕ Ｃｙｓ（Ｃ）　ｓｅｒ　５ｅｒ Ｇｌｎ（Ｑ）　ａｓｎ　ａｓｎ Ｇｌｕ　（Ｅ）　ａｓｐ　ａｓｐ Ｇｌｙ（Ｇ）　ｐｒｏ　ｐｒ。

Ｈ４ｓ　（Ｈ）　ａｓｎ；ｇｉｎ；ｌｙｓ；ａｒｇ　ａｒｇｌｌｅ（１）　Ｉｅ ｕ；ｖａｌ；ｍｅｔ：ａｌａ；　１ｅｕｐｈｅ　；ノルロイシン Ｌｅｕ（Ｌ）　ノルロイシン；ｉｌｅ：　１ｃｅｖａｌ；ｍｅｔ；ａｌａ；ｐｈ ｅ Ｌｙｓ　（Ｋ）　ａｒｇ；ｇｌｎ；ａｓｎ　ａｒｇＭｅｔ　（Ｍ）　Ｉｅｕ：ｐ ｈｅ；ｉｌｅ　ＩｅｕＰｈｅ　（Ｆ）　Ｉｅｕ；ｖａｌ；ｉｌｅ；ａｌａ　Ｉｅ ｕＰｒｏ（Ｐ）　ｇａｙ　ｇｌｙ Ｓｅｒ　（Ｓ）　ｔｈｒ　ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｔ）　ｓｅｒ　５ｅｒ Ｔｒｐ（Ｗ）　ｔｙｒ　ｔｙｒ Ｔｙｒ　（Ｙ）　ｔｒｐ；ｐｈｅ；ｔｈｒ；ｓｅｒ　ｐｈｅＶａｌ　（Ｖ）　ｉ ｌｅ；Ｉｅｕ；ｍｅｔ；ｐｈｅ；　１ｅｕａｈａ；ノルロイシン ＰＦＪＡＲの機能的または免疫学的同一性の本質的な改変は、（ａ）置換の領域 におけるポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたは螺旋立体配置）、（ｂ） 標的部位におけるその分子の電荷または疎水性、あるいは（（）側鎖のかさ高さ 、の維持に対するそれらの効果がかなり興なる置換を選択することによって達成 される。天然に存在する残基は共通の側鎖特性に基づいていくつかの群に分類さ れる。

（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、Ｉｅｕ、ｉｌｅ；（２ ）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性　ａｓｐ、ｇｌｕ： （４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎＳｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影 響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ：（６）芳香族：　Ｌ　ｒ＋）、ｔ）＋ｒ、ｐ ｈｅ０非保存的置換はこれらの種類の一つの構成要素を別のものに交換すること を必然的に伴うであろう。他のＰＦＪＡＲと相同なＰＦＪＡＲの領域に、より好 ましくは該分子の非相同領域にそのような置換された残基を導入することができ る。

ＰＦＪＡＲの適性な立体配置の維持に関与していないンステイン残基はいずれも 一般的にはセリンで置換することによってその分子の酸化的安定性を改善し、常 軌を逸した架橋を防止することができる。

ＰＦＪＡＲのアミノ酸配列変種をコード化するＤＮＡは当該技術分野で知られて いる様々な方法で調製される。これらの方法には天然の供給源からの単離（天然 に存在するアミノ酸配列変種の場合）あるいはオリゴヌクレオチド媒介（または 部位特異的）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法、および先に調製されたＰ ＦＪＡＲの変種または非変種型のカセット突然変異誘発法などが含まれるが、こ れらに限定されない。これらの技術ではＰＦ４ＡＲ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ） またはＰＦ４ＡＲ核酸に相補的な核酸を使用するであろう。

オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法は、ＰＦＪＡＲＤＮＡの置換、欠失およ び挿入変種を調製する際に好ましい方法である。この技術はアデルマンら、ＤＮ Ａ、　２：１８３（１９８３）に記述されているように当該技術分野ではよく知 られている。簡単に述べると、ＰＦＪＡＲＤＮＡの未改変のＤＮＡ配列または天 然のＤＮＡ配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖型であ るＤＮＡ鋳型に所望の突然変異をコード化するオリゴヌクレオチドをハイブリッ ド形成させることによって、ＰＦＪＡＲＤＮＡを改変する。ハイブリッド形成の 後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記鋳型の完全な第２の相補鎖を合成すれば、 その相補鎖は上記オリゴヌクレオチドブライマーを組み込み、ＰＦＪＡＲＤＮＡ 中の選択された改変をコード化するであろう。

一般に少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用される。最適 なオリゴヌクレオチドは突然変異をコードするヌクレオチド（単数または複数） の両側に鋳型に対して完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドを有するであろう 。

このことはそのオリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に対して適切にハイ ブリッド形成することを保証する。オリゴヌクレオチドは、フレアら（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾、７５：５７６５［１９７ｇ］）が記述してい るような当該技術分野で既知の技術を用いて容易に合成される。

一本鎖ＤＮＡ鋳型も標準的な技術を用いて二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮ Ａを変性させることによって生成させることができる。

（例えばアミノ酸配列変種を生成させるべく）天然のＤＮＡ配列を改変するため に、適当なハイブリッド形成条件下でオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型にハイブ リッド形成させる。次にＤＮＡ重合酵素（通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ ー断片）を加えることにより、上記オリゴヌクレオチドを合成のプライマーとし て用いて鋳型の相補鎖を合成する。したがってＤＮＡの１つの鎖はＰＦＪＡＲの 突然変異型をコード化し、他方の鎖（元の鋳型）はＰＦＪＡＲの天然の変化して いない配列をコード化しているというヘテロ二本鎖分子が形成される。次にこの ヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞（通常は大腸菌ＪＭＩＯＩなどの原核生物） 中に導入する。細胞を生育した後、それらをアガロースプレートに接種し、３２ −ホスフェートで放射線標識したオリゴヌクレオチドブライマーを用いてスクリ ーニングすることにより、突然変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定す る。

次に突然変異した領域を取り出し、タンパク質の生産に適したベクター（一般的 に適当な宿主の形質転換に典型的に使用される種類の発現ベクター）中に入れる 。

プラスミドのどちらの鎖も突然変異（単数または複数）を含有するようなホモ二 本鎖分子を作成するように、すぐ上に記述した方法を改変することができる。こ の改変は以下の通りである。−末鎖オリゴヌクレオチドを上述の一本鎖鋳型にア ニールさせる。３種類のデオキシリボヌクレオチド（即ちデオキシリボアデノシ ン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボアデシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジ ン（ｄＴＴＰ））の混合物をｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる改良されたチオ−デ オキシリボシトノン（これはアマジャム・コーポレイションから入手できる）と 混合する。

この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポ リメラーゼを加えると、突然変異させた塩基以外は鋳型と同一な鎖が生成する。

さらにこの新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含有し、 これは制限エンドヌクレアーゼ消化からその鏑を保護するように機能するであろ う。

二本鎖になったヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で裂は目を入れた後、そ の鋒型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼを用いて、 突然変異を誘発すべき部位を含有する領域を通過して消化することができる。次 に、一部分のみが一本鎖である分子が残るように反応を停止させる。次に４種類 すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存 在下でＤＮＡポリメラーゼを用いることによって完全な二本鎖になったＤＮＡホ モ二本鎖を形成させる。次にこのホモ二本鎖分子を大腸菌ＪＭＩＯＩなどの適当 な宿主細胞中に上述の如く導入することができる。

１換すべきアミノ酸が１より多いＰＦ４ＡＲ突然変異体をコード化するＤＮＡは 数種類の方法の１つで作成することができる。それらのアミノ酸がそのポリペプ チド鎖中で互いに接近して位置する場合には、所望のアミノ酸置換のすべてをコ ードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを突然変異させること ができる。しかしそれらのアミノ酸が互いにいくらか離れて位置する場合（約１ ０アミノ酸以上によって分離されている場合）には、所望の変化のすべてをコー ド化する１本のオリゴヌクレオチドを作成することがより困難になる。その代わ りとして２つの代替方法のいずれかを使用することができる。

第１の方法では、置換すべき各アミノ酸について別個のオリゴヌクレオチドを作 成する。次にこれらのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニール させると、その鋳型から合成される第２のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換のすべ てをコード化するであろう。

代替的な方法は所望の突然変異体を作成するために２回またはそれ以上の突然変 異誘発を必要とする。第１回は単一の突然変異体について記述した通りであり、 野生型ＤＮＡを鋳型として使用し、第１の所望のアミノ酸置換をコード化するオ リゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、次いでヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を 生成させる。第２回の突然変異誘発では第１回の突然変異誘発で作成された突然 変異したＤＮＡを鋳型として使用する。したがってこの鋳型はすでに１またはそ れ以上の突然変異を含有している。次に追加の所望のアミノ酸置換（単数または 複数）をコード化するヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせると、得られるＤ ＮＡ鎖は第１回と第２回の突然変異誘発の両方に由来する突然変異をコード化し ていることになる。この得られたＤＮＡを第３回の突然変異誘発などで鋳型とし て用いることができる。

ＰＣＲ突然変異誘発法もＰＦＪＡＲのアミノ酸変種を作成するのに適している。

以下の議論ではＤＮＡについて述べるが、この技術がＲＮＡにも応用されること は理解されるところである。ＰＣＲ技術とは一般的には下記の操作を意味する（ アールリッヒ（上記）、アール・ヒグチによる章、６１〜７０頁）。少量の鋳型 ＤＮＡをＰＣＲにおける出発物質として使用すると、鋳型ＤＮＡ中の対応する領 域とは配列がわずかに異なるプライマーを用いることによって、そのプライマー が鋳型と異なる位置だけが鋳型配列と異なる特異的なりＮＡ断片を比較的大量に 生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、 プライマーの１つを、それが突然変異の位置と重複し、その突然変異を含有する よう１ニ設計する。他方のプライマーの配列はそのプラスミドの反対鎖の配列と 同一でなれけばならないが、この配列はプラスミドＤＮＡに沿うどの位置にあっ てもよい。

しかし、これらのプライマーによって挟まれた増幅されるＤＮＡの全領域が最終 的には容易に配列決定することができるように、第２のプライマーの配列が第１ のプライマーの配列から２００ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。こ こに記述したような一対のプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、プライマーによっ て指定される突然変異の位置と、鋳型の複写がいくらか誤りがちであるのでおそ らく他の位置とで異なるＤＮＡ断片の集団をもたらす。

生成物に対する鋳型の比率が極端に低い場合には、生成物ＤＮＡ断片の大部分が 所望の突然変異（単数または複数）を組み込む。この生成物を用いて、標準的な りＮＡ技術によって、ＰＣＲ鋳型として機能したプラスミドの対応する領域を置 換する。離れた位置にある突然変異は、突然変異第２プライマーを用いるか、あ るいは異なる突然変異プライマーを用いて第２ＰＣＲを行い、得られた２つのＰ ＣＲ断片をベクター断片に三（またはそれ以上）部分連結で同時に連結すること によって、同時に導入することができる。

変種を作成するもう１つの方法であるカセット突然変異誘発法はウエルスらが記 述した技術（Ｇｅｎｅ、　３４：３１５０９８５］）に基づく。

Ｃ，クローニングベヒクルへのＤＮＡの挿入天然のＰＦ４ＡＲまたは変種ＰＦ４ ＡＲをコード化するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらなるクローニングのた め（ＤＮＡの増幅）、あるいは発現のために、複製可能なベクター中に挿入する 。多くのベクターを利用することができ、適当なベクターの選択は、（１）それ をＤＮＡ増幅に使用するのか、それともＤＮＡ発現に使用するのかということ、 （２）ベクター中に挿入されるべきＤＮＡの大きさ、および（３）そのベクター によって形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各ベクターはその機能 （ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）とそれが適合する宿主細胞に応じて様々な 成分を含有する。ベクター成分には一般に下記成分の１またはそれ以上が含まれ るが、それらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上の標 識遺伝子、エンハンサ−要素、プロモーターおよび転写終止配列。

（ｉ）シグナル配列成分 一般にシグナル配列はベクターの一成分であるか、もしくはベクター中に挿入さ れるＰＦ４ＡＲＤＮＡの一部であり得る。天然のプロＰＦ４ＡＲＤＮＡは、出願 人らの組換え細胞においてその細胞表面に向けられるが、それは従来のシグナル を含有しておらず、ＰＦ４ＡＲの膜挿入中に、そのポリペプチドの翻訳後プロセ シングの間に切断されるＮ−末端ポリペプチドはない。

（ｉｉ）複製起点成分 発現ベクターとクローニングベクターは共に、１またはそれ以上の選択された宿 主細胞中でそのベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般 にクローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿生染色体ＤＮＡとは独 立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自律的複製配列を 含む。このような配列は様々な細菌、酵母およびウィルスについてよく知られて いる。プラスミドｐＢＲ３２２から得られる複製起点はほとんどのゲノム陰性菌 に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウィルス起点（ ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ｖｓＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞中 でのクローニングベクターに有用である。一般的に複製起点成分は哺乳類発現ベ クターには必要でない（ＳＶ４０起点は典型的に使用され得るが、これは単にそ れが初期プロモーターを含有しているからに過ぎない）。

はとんどの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ち、それらのベクタ ーは少なくとも１種類の細胞中で複製することができ、発現のために別の生物中 にトランスフェクションすることができるのである。例えばあるベクターを大腸 菌中でクローン化し、次いで同じベクターを（宿生細胞染色体から独立して複製 することはできないが）発現のために酵母や哺乳類細胞中にトランスフエフシラ ンする。

宿主ゲノム中に挿入することによってＤＮＡを増幅することもできる。これはバ チルス種を宿主として使用し、例えばバチルスゲノムＤＮＡ中に認められる配列 と相補的なりＮＡ配列をベクター中に含めることによって容易に達成される。

このベクターによるバチルスのトランスフェクションはゲノムとの相同的な組換 えとＰＦ４ＡＲＤＮＡの挿入をもたらす。しかしＰＦ４ＡＲをコード化するゲノ ムＤＮＡの回収は外因的に複製されるベクターの場合より複雑である。なぜなら ＰＦ４ＡＲＤＮＡを切り出すためには制限酵素消化が必要だからである。

（迅）選択遺伝子成分 発現ベクターとクローニングベクターは選択可能標識とも呼ばれる選択遺伝子を 含有すべきである。この遺伝子は形質転換された宿主細胞の選択培養培地中での 成長または生存にとって必要なタンパク質をコード化する。選択遺伝子を含有す るベクターで形質転換されなかった宿主細胞は上記培養培地中で生存できないで あろう。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例：アンピシ リン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性 を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠損を補足するタンパク質、または （Ｃ）複合培地から利用することができない必須の栄養素を供給するタンパク質 （例：バチルスにとってＤ−アラニンラセマーゼをコード化する遺伝子）をコー ド化する。

選択法の一例では宿主細胞の成長を抑制するために薬物を使用する。異種遺伝子 で成功裏に形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現させ、そ れゆえにその選択法を生き抜（ことができる。そのような優性選択の例では薬物 ネオマイシン（サザンら、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　 、　１　：３２７　［１９８２］　）、ミコフェノール酸（ムリガンら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２０９：１４２２［１９８０コ）またはハイグロマイシン（サシェン ラｌＭｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　、　５：４１０−４１３０９８５コ） を使用する。上記の二側では適当な薬物（それぞれＧ４１８またはネオマイシン （ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）もしくはハイグロマイシン） に対する耐性を伝えるために真核性制御下で細菌遺伝子を使用する。

哺乳類細胞に適する選択標識のもう１つの例は、ＰＦ４ＡＲ核酸を取り込む能力 のある細胞の同定を可能にするもの、例えばジヒドロフオレート・レダクターゼ （ＤＨＦＲ）またはチミジン・キナーゼなどである。その標識を取り込んでいる がゆえに形質転換体のみが唯一生存に適合する選択圧下に哺乳類細胞形質転換体 を置く。培地中の選択剤の濃度が連続的に変化するような条件下で形質転換体を 培養し、それによって選択遺伝子とＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡの両方の増 幅を導（ことにより、選択圧をかけることができる。増幅とは、組換え細胞の連 続的世代の染色体内で、成長にとって必須のタンパク質の生産がより強（求めら れる遺伝子が直ダルで反復される過程である。増大した量のＰＦ４ＡＲが増幅し た遺伝子から合成される。

例えばＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競争的拮 抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中ですべての形質転 換体を培養することによって最初に同定される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合 に適当な宿主細胞はＤＨＰＲ活性が欠損しているチャイニーズ・ハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞であり、これはウルラウブおよびチェイシン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７７・４２１６［１９８１Ｄに記述されているように調製され、増殖 される。次に形質転換細胞を増大したレベルのメトトレキセートにさらす。これ はＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーの合成を導き、これに付随して、ＰＦ４ＡＲをコ ード化するＤＮＡなど、発現ベクターからなる他のＤＮＡの複数コピーを導く。

この増幅技術は、例えばＭｔｘに対して高度に耐性な突然変異ＤＨＦＲ遺伝子使 用すれば（ＥＰＩＩ７０６０）、内因的なりＨＦＲの存在にもかかわらず、他の 適当な宿主のいずれでも使用することができる（例：ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１　 ＣＨＯ−Ｋｌ）。別法として、ＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡ配列、野生型Ｄ ＨＦＲタンパク質およびもう１つの選択可能標識（アミノグリコシド３゛ホスホ トランスフエラーゼ（ＡＰＨ）など）で形質転換または同時形質転換された宿主 細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）を、アミノグリコシド性抗生 物質（例：カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）などの選択可能標識の ための選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択することができる。米 国特許第４９６５１９９号を参照のこと。

酵母での使用に適した選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐＴ中に存在するｔｒｐ １遺伝子である（スチンクコームら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２：３９［１９７ ９］　；キンゲスマンら、Ｇｅｎｅ、　７：１４１［１９７９］またはチェンバ ーら、　Ｇｅｎｅ、　１０：１５７［１９８０］）。ｔ　ｒｐｌ遺伝子はトリプ トファン中での生育能を欠く酵母の突然変異株（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６ またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８５：１２［１９７ ７］））のための選択標識を提供する。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔ　ｒｐｌ 損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での成長によって形質転換を検出する ための効果的な環境を提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２ ２または３８６２６）はＬｅｕ２遺伝子を保持する既知のプラスミドによって補 完される。

（ｉｖ）プロモーター成分 発現ベクターは通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有しており 、それがＰＦ４ＡＲ核酸に機能可能に連結している。プロモーターは構造遺伝子 の開始コドンの上流（５゛側）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ内）に位置 する翻訳されない配列であり、この配列は、それが機能的に連結している特定の 核酸配列（ＰＦ４ＡＲなど）の転写と翻訳を制御する。そのようなプロモーター は典型的には２つの種類、即ち、誘導性と構成性に分類される。誘導性のプロモ ーターは培養条件の何らかの変化（例・栄養素の存在または不在あるいは温度の 変化）に応答してその制御下にあるＤＮＡからの増大したレベルの転写を開始さ せるプロモーターである。現在では様々な潜在的宿主細胞によって認識される多 数のプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化 によって供給源ＤＮＡからそのプロモーターを取り出し、単離されたプロモータ ー配列をベクター中に挿入することによって、ＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡ に機能可能に連結される。天然のＰＦ４ＡＲプロモーター配列と多くの異種プロ モーターは共に、ＰＦ４ＡＲＤＮＡの増幅および／または発現を管理するために 使用することができる。しかし異種プロモーターは一般に天然のＰＦ４ＡＲプロ モーターと比較してより高い転写と発現されるＰＦ４ＡＲのより高い収率を可能 にするので、異種プロモーターが好ましい。

原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターにはβ−ラクタマーゼおよびラ クトースプロモーター系（チャンクら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５＋６１５［１ ９７８］　：ゴエーＪデルら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８１　：５４４　［１９７９ コ）、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ ゴエツデルら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　８：４０５７［ １９８０］およびＥＰ３６７７６）、並びに、ｔａｃプロモーターなどのハイブ リッドプロモーター（デボアーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ、　８０：２１−２５［１９８３］）が含まれる。しかしその他の 既知の細菌プロモーターも好適である。それらのヌクレオチド配列は公表されて いるので、当業者は、必要な制限部位を供給するためにリンカ−やアダプターを 使用することによって、ＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡにそれらを機能可能に 連結することができる（シーベンリストら、　Ｃｅ１１．２０：２６９［１９８ ０］）。細菌系で使用されるプロモーターは一般に、ＰＦ４ＡＲをコード化する ＤＮＡに機能可能に連結したンヤイン・ダルガノ（Ｓ、Ｄ、）配列をも含有する であろう。

酵母宿主と共に使用するのに適した促進配列には３−ホスホグリセレート・キナ ーゼ（ヒソチェマンら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５５：２０７３ ［１９８０］）または他の解糖系酵素（ヘスら、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍ ｅ　Ｒｅｇ、　、　７　：１４９［１９６８］　；ホーランド、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、　１７F４９００［１９７８］ ）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナ ーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナ ーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート ・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホ スホグルコース・イソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのプロモーターが含ま れる。

生育条件によって転写を制御できるという追加の利点を有する他の酵母プロモー ターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフア ターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド −３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びに、マルトースおよびガラクトー ス利用の原因である酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適した 好適なベクターおよびプロモーターはさらにヒソチェマンら、ＥＰ７３６５７Ａ に記述されている。酵母のエンハンサ−も酵母プロモーターと共に有利に使用さ れる。

真核生物のためのプロモーター配列が知られている。実質上すべての真核遺伝子 が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域 を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に認められるもう １つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここにＸはいずれのヌクレオチドでもよ い。はとんどの真核遺伝子の３′末端にはＡＡＴＡＡＡ配列があり、この配列は コード配列の３′末端へのポリ八尾部の付加のためのシグナルであるらしい。

これらの配列はすべて好適に哺乳類発現ベクター中に挿入される。

哺乳類宿主細胞におけるベクターからのＰＦ４ＡＲの転写は、ポリオーマウィル ス、家禽ポックスウィルス（１９８９年７月５日に公表されたＵＫ２２１１５０ ４）、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、牛パピローマウィルス、ニワ トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス 、そして最も好ましくはノミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲ ノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーター（例；アクチンプロモ ーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から得られるプロモーター、熱シヨ ツクプロモーターから得られるプロモーター、並びに、ＰＦ４ＡＲ配列が正常時 に伴っているプロモーター（ただしそのようなプロモーターが宿主細胞系に適合 する場合に限る）によって制御される。

Ｓ　Ｖ　４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０制限断片として 都合よく入手することができ、その断片はＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有し ている。フィアースら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３：１１３（１９７８）　：ム リガンおよびバーブ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９：１４２２−１４２７（１９ ８０）　：バブラキスら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 　７８ニア３９８−７４０２i１９８ １）。ヒトサイトメガロウィルスの即時初期プロモーターはＨ４ｎｄＩＩＩＥ制 限断片として制限法く入手される。グリーンアウェイら、　Ｇｅｎｅ、　１８　 ：３５５−３６０（１９８２）。牛パピローマウィルスをベクターとして使用す ることにより哺乳類宿主中でＤＮＡを発現させる系は米国４４１９４４６に開示 されている。この系の変法は米国４６０１９７８に記述されている。サル細胞中 で免疫インターフェロンをコード化するｃＤＮＡを発現させることについてはグ レイら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５：５０３−５０８（１９８２）を、マウス細 胞中でヘルペスシンプレックスウィルスに由来するチミジンキナーゼプロモータ ーの制御下でヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡを発現させることニツイてはレ イニスら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：５９８−６０１（１９８２）を、マウスおよ びウサギの培養細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現については カナｍ＝およびバーブ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ ＩＳＡ、　７９：５１６６−５１７０（１９８２）を、ラウス肉腫ウィルX 長末端反復をプロモーターとして使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線 維芽細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞およびマウスＮＩ Ｈ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現についてはゴーマンら、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９：６７７７−６７８１（１９ｇ２）をも 参照のこと。

（ｖ）エンハンサ−要素成分 本発明のＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡの高等真核生物による転写はそのベク ター中にエンハンサ−配列を挿入することによってしばしば増大する。エン／％ ンサーは通常１０〜３００ｂｐのシス作用性のＤＮＡ要素であって、プロモータ ーに作用してその転写を増大させる。エン／％ンサーは配向と位置には比較的非 依存性であり、転写単位の５°側（ライミンスら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７ｇ＋９９３［１９８１コ）および３°側（ラ スキーら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　、　３：１１０８［１９８３］）、イ ントロン内（）くネルジら、　Ｃｅ１１．３３＋７２９０９８３コ）、並びに、 コード配列自体の中（オスポーンら」０１゜Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、、４：１２９３ ［１９８４］）に認められティる。現在では哺乳類遺伝子（グロビン、エラスタ ーゼ、アルブミン、α−フェトプロティンおよびインスリン）から多くのエンハ ンサ−配列が知られている。しかし典型的には、真核細胞ウィルスから得られる エンハンサ−を使用するであろう。その例には、複製起点の後期側（１００〜２ ７０ｂｐ）のＳＶ４０エンハンサ−、サイトメガロウィルス初期プロモーターエ ンハンサ−１複製起点の後期側のポリオーマエン／１ンサーおよびアデノウィル スエンハンサ−が含まれる。真核プロモーターの活性化のための増進要素につい てはヤニブ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１’？”１８（１９８２）をも参照のこと 。ＰＦ４ＡＲＤＮＡに対して５゛側または３゛側の位置でベクターにエンハンサ −を接合することができるが、プロモーターの５゛側に位置させることが好まし い。

（＠）転写終止成分 真核宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物から 得られる有核細胞）中で使用される発現ベクターは転写の停止とそのｍＲＮＡの 安定性にとって必要な配列をも含有するであろう。そのような配列は一般に真核 またはウィルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５′非翻訳領域と、時には３′非翻訳 領域から入手することができる。これらの領域は、ＰＦ４ＡＲをコード化するｍ ＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチド セグメントを含有する。３′非翻訳領域は転写終止部位をも含む。

１またはそれ以上の上記成分と所望のコードおよび制御配列を含有する好適なベ クターは、標準的な連結技術によって構築される。単離されたプラスミドまたは ＤＮＡ断片を切断し、加工し、所望の形態で再連結して必要なプラスミドを作成 する。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析については、連結混合 物を用いて大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功し た形質転換体を、それが適当な場合には、アンピシリンまたはテトラサイクリン 耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレ アーゼ消化によって分析し、かつ／または、メッシングら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

９：３０９（］、９８１）の方法またはマキサムら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５：４９９（１９８０）の方法によって配列決定す る。

本発明の実施において特に有用なものは、ＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡの哺 乳類細胞における一時的発現を供給する発現ベクターである。一般に一時的発現 は、宿主細胞が発現ベクターの多（のコピーを蓄積し、次いでその発現ベクター によってコード化されている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、 宿主細胞中で効率よく複製することができる発現ベクターの使用を必要とする。

適当な発現ベクターと宿主細胞からなる一時的発現系はクローン化したＤＮＡに よってコード化されるポリペプチドの便利な陽性同定を可能にすると共に、その ようなポリペプチドを所望の生物学的または生理学的特性について迅速にスクリ ーニングすることを可能にする。したがって一時的発現系はＰＦＪＡＲ様活性を 有するＰＦ４ＡＲの類縁体および変種を同定する目的にとって本発明において特 に有用である。

組換えを椎動物細胞培養におけるＰＦ４ＡＲの合成に適合させるのに適した他の 方法、ベクターおよび宿主細胞はゲシングら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３：６２ ０−６２５［１９８１］　；　ｖンテイら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０−４６ ［１９７９］　；レビンソンら、ＥＰ１１７０６０およびＥＰ１１７０５８に記 述されている。ＰＦ４ＡＲの哺乳類細胞培養発現にとって特に有用なプラスミド はｐＲＫ５（ＥＰ公開番号３０７２４７）である。

Ｄ、宿主細胞の選択と形質転換 本発明においてベクターをクローン化または発現させるのに適した宿主細胞は上 述の原核生物、酵母または高等真核細胞である。好適な原核生物にはグラム陰性 生物やグラム陽性生物などの真正細菌（例えば大腸菌、枯草菌などのバチルス、 緑膿菌などのシュードモナス、ネズミチフス菌またはセラチア・マルセサンス） が含まれる。大腸菌Ｂ１大腸菌χ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌 Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）などの他の株も好適ではあるが、好ましい大 腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２４９（ＡＴＣＣ３１４４６）である。こ れらの例は限定的なものではなく単なる例示である。好ましくは宿主細胞が最小 量のタンパク質加水分解酵素を分泌すべきである。別法として、インビトロ・ク ローニング法（例：　ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応）も好適である。

原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物もＰＦ４ＡＲＤＮＡを含有す るベクターにとって好適な宿主である。サツカロミセス・セレビシェや一般的な パン酵母は下等真核宿生微生物のなかでは最も一般的に使用されるものである。

しかし、他の属、種および株のいくつかも一般的に利用可能で、本発明において 有用であり、例えばニス・ボムベ（Ｓ、　ｐｏｍｂｅ）　［ビーチおよびナース 、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９０：１４０（１９８１）］　、］クルイベロマイセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　［ルーペンコートら 、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　７３７（１９８３）］　、ヤロウィア（ ｙａｒｒｏｖｉａ）　［Ｅ　Ｐ　４０２２２６］、ピチア・パストリス（Ｐｉｃ ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）［Ｅ　Ｐ　１８３０７０］、トリコデル？−レーン ア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｉａ）　［Ｅ　Ｐ　２４４２３４　］　 、ニューロスポラ・クラノサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）　［ケー スら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６：５２ ５X−５２６３（１ ９７９）］　、およびエイ・ニドユランス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　［バラン スら、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　 １１２：２８４−２８９（１９８３）　；チルバーンら、　Ｇｅｎｅ、　２６： ２０５−２２１（１９８３j　；ヤル トンら、　ｐｒ□（、１ｌａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１：１ ４７０（４７４（１９８４）］やエイ・ニガー［ケリーおよびハイネス、ＥＭＢ ＯＪ、、４：４７５−４７９（１９８５）］などのアスベルギラス宿主などであ る。

グリコリル化されたＰＦ４ＡＲポリペプチドの発現に適した宿主細胞は多細胞生 物から誘導される。そのような宿主細胞は複雑なプロセシングを行う能力とグリ コノル化活性を有する。を椎動物培養に由来するか非を椎動物培養に由来するか にかかわりなく、原則としてどのような高等真核細胞培養でも役に立つ。非を椎 動物細胞の例には植物および昆虫細胞が含まれる。例えばスボドプテラ・フルギ ベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＸイモムシ）、アエデス ・アエジブチ（＾ｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉＸ蚊）、アエデス・アルボビクツス （＾ｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓＸ蚊）、ドロソフイラ・メラノガステル（ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）およびボムビク ス・モリ（Ｂｏｗｂｙｘ　ｍｏｒｉ）宿生細胞などの宿主から数多（のバクロウ ィルス株と変種および対応する許容昆虫細胞が同定されている。例えばルコウら 、　Ｂｉｏ／丁ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：４７−５５（１９８８）　：ミラー ら、　ｒＧｅｎｅｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪ　（セトロウ、ンエイ・ケ イら編、第８巻。

ブレナム・パブリソノング、　１９８６）中の２７７〜２７９頁；マエダら、Ｎ ａｔｕｒｅ、　３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照のこと。そのような 様々なウィルス株は公に利用可能であり（例ニアウドグラフ７’カリフォルニカ ＮＰＶ（＾ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＮＰＶ）のＬ１変種 およびボムビクス・そりのＢｍ−５株）、そのようなウィルスを本発明に従って 本発明でのウィルスとして（とりわけスボドブテラ・フルギベルダ細胞のトラン スフェクションに）使用することができる。綿、トウモロコシ、ジャガ芋、大豆 、ツクバネアサガオ、トマトおよびタバコの植物細胞培養を宿主として使用する ことができる。典型的には、予めＰＦ４ＡＲＤＮＡを含有するように操作してお いた細菌アグロバクテリウム・ツメファシェンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ鵬 ｔｕ■ｅｆａｃｉｅｎｓ）のい（つかの株と共にインキュベートすることによっ て植物細胞をトランスフェクションする。植物細胞培養をエイ・ツメファシェン スと共にインキュベートする間にＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡが植物細胞宿 主に移送されることによってそれがトランスフェクションされて、適当な条件下 でＰＦ４ＡＲＤＮＡを発現させるであろう。さらに植物細胞に適合する調節およ びシグナル配列も利用することができ、それらは例えばツバリン・シンターゼ・ プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列である。デピッカーら、　Ｊ、 　１ｌｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　、　１：５６１（１９８２）。

さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流域から単離されたＤＮＡセグメントは、 組換えＤＮＡ含有植物組織における植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化ま たは増大させることができる。１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ３２１１ ９６を参照のこと。

しかし、最も興味を集めてきたものはを椎動物細胞であり、を椎動物細胞の培養 中での増殖（組織培養）は近年日常的な手法になっている［　ｒＴｉｓｓｕｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅＪ（アカデミツク・プレス、クルセおよびバダーリン編（１９７ ３）］。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓Ｃ ＶＩ系（ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、ヒト胚腎臓系（２９３また は懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、グラハムら Ｊ、Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、、３６：５９［１９７１］）、幼若ハムスター腎臓細 胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞／− ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ウルラウブおよびチェシン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：４２１６Ｄ９８０］）、マウスセリトーり細胞（７ Ｍ４．ｖザー、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　。

２３：２４３−２５１［１９８０コ）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ 　７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１ ５８７）、ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２）、イヌ腎臓細胞 （ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ 、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８．ＡＴＣＣＣＣＬ　７５ ）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ　８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ　 ０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（マザーら、　Ａｎｎａｌｓ 　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　３８３：４４−６８［１９８２］）、Ｍ ＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）である。好まし い宿主細胞はヒト胚腎臓２９３細胞およびチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞で ある。

宿主細胞を上述した本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターでトラン スフェクション（好ましくは形質転換）し、プロモーターを誘導するか、形質転 換体を選択するか、もしくは所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するのに適 するように改変した従来の栄養培地中で培養する。

トランスフェクションとは宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味し、何 らかのコード配列が実際に発現されるかどうかにかかわらな０゜当業者１ま数多 （のトランスフェクション法を知っており、例えばＣａＰＯ５およびエレクトロ ポレーションなどである。トランスフェクションの成功は一般にこのベクターの 機能の何らかの指標が宿主細胞内で起こる時に認識される。

形質転換とは、ある生物にＤＮＡを導入することであって、そのＤＮＡ力（染色 体外要素として、あるいは染色体統合によって、複製可能であるような導入を意 味する。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、その細胞１；適しｔこ標準的 な技術を用いて行われる。サムプルツクら（上記）の１．８２章に記述されてし ）るような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、一般に原核生物や強固 な細胞壁障壁を含有する他の細胞に用いられる。アグロノくクチＩ功ムパノメフ ァンエンスによる感染は、ンヤウら、Ｇｅｎｅ、２３＋３１５（１９８３）と１ ９８９年６月２９日１こ公開されたＷＯ３９１０５８５９に記述されているよう に、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。上述のような細胞壁を持たない 哺乳類細胞につＩＮて（ま、サムプルツクら（上記）の１．６．３０〜１６．３ ７章に記述されているリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳類細胞宿主系形 質転換の一般的な側面はアレ・マウスら力＜１９８３年８月１６日に発効した米 国４３９９２１６に記述して（Ｘる。酵母への升ユ質転換は典型的１：ハ７７　 ンーゾーリンゲンら、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　、　１３０：９４６（１９７７）と シャオら、　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７６：３８２９（１ ９７９）の方法に従って行われる。しかし核注射、エレクトロポレーションある いはプロトプラスト融合などの、細胞にＤＮＡを導入する他の方法も使用するこ とができる。

（以下余白） Ｅ、宿主細胞の培養 本発明のＰＦ４ＡＲポリペプチドを生産するために使用する原核細胞を、サムプ ルツクら（上記）に一般的に記述されているような適当な培地中で培養する。

本発明のＰＦ４ＡＲを生産するために使用する哺乳類宿主細胞は様々な培地中で 培養することができる。／’ＡＦ　１０（シグマ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］ 　、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）およびダルベ・ソコ変法イーグル 培地（［ＤＭＥＭ］、シグマ）などの市販の培地は上記宿主細胞の培養に適して いる。さらに、ノ＼ムおよびマウス、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　、　５８：４４ （１９７９）、ノく−ンズおよびサトー、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ　。

１０２：２５５（１９８０）、米国４７６７７０４．４６５７８６６．７９２７ ７６２または４５６０６５５、ＷＯ９０１０３４３０、ＷＯ３７１００１９５ま たは米国特許Ｒｅ、３０９８５に記述されている培地はいずれも上記宿主細胞の ための培養培地として使用できる。これらの培地には必要に応じてホルモンおよ び／また（′１他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは表皮成長因 子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など） 、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンやチミジンなど）、抗 生物質（ジエンタマイシン（ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴ′）薬物など）、微量元素 （通常はμＭ範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）およびグルコ ースや等価なエネルギー源を補足することができる。また池の必要な補足物はい ずれも当業者が知ってＬするであろう適当な濃度で加えることができる。温度、 ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞について過去に用いられ た条件であり、当業者には明白であろう。

この開示で言う宿生細胞はインビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内１こある細 胞をも包含する。

本発明のＰＦ４ＡＲを相同的組換えによって生産し得ること、あるＬＮは、ＰＦ ４ＡＲをコード化するＤＮＡを既に含有している細胞中に導入される制御要素を 利用する組換え生産法によって生産し得ることも、さらに予期されるところであ る。例えば強力なプロモーター／エン／Ｘ：／サー要素、サプレッサーまた（言 外因的転写変調要素を、所望のＰＦ４ＡＲをコード化するＤＮＡの転写ζ；影響 を与えるに足る近さと配向で意図する宿主細胞のゲノム中に挿入する。制御要素 は本発明のＰＦ４ＡＲをコード化しないが、宿主細胞のゲノム中に存在するＤＮ Ａである。

次いで、所望に応じて、本発明のＰＦ４ＡＲを生産する細胞、あるいは発現レベ ルの減少または増大に関してスクリーニングする。

Ｆ、遺伝子増幅／発現の検出 試料中の遺伝子の増幅および／または発現は、例えば従来のサザンブロッティン グ、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング（トーマス、Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：５２０１−５２０５［１ ９８０コ）、ドツトブロッティング（ＤＮＡ分析）、あるいは原位置ハイブリッ ド形成などによって、本明細書に開示する配列に基づき、適切に標識されたプロ ーブを用いることによって直接測定することができる。

様々な標識を使用することができるが、最も一般的なものは放射性同位体、とり わけ３２ｐである。しかし、ポリヌクレオチド中へ導入するためにビオチン修飾 核酸を使用することなど、他の技術を使用することもできる。次いでこのビオチ ンはアビジンまたは抗体に対する結合の部位として機能し、このアビジンや抗体 は例えば放射性核種、蛍光剤、酵素などの様々な標識で標識することができる。

別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡ、−イブリッド 二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することがで きる抗体を使用してもよい。次いでこの抗体を標識することができ、上記二本鎖 が表面に結合して、表面上での二本鎖の形成時にその二本鎖に結合している抗体 の存在が検出できるような検定法を行うことができる。

別法として、遺伝子産物の発現を直接定量するために、免疫学的方法、例えば組 織切片の免疫組織化学的染色や細胞培養または体液の検定などによって、遺伝子 発現を測定することもできる。免疫組織化学染色技術の場合、典型的には脱水と 固定によって細胞試料を調製し、次いで結合した遺伝子産物に特異的な、標識さ れた抗体と反応させる。ここで用いる標識は通常、例えば酵素標識、蛍光標識、 発光標識など、視覚的に検出可能なものである。本発明での使用に適した特に感 度の高い染色技術はシュら、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、　、　７ ５ニア３４−７３８（１９８０）に記述されてい免疫組織化学的染色および／ま たは試料液の検定に有用な抗体はモノクローン性であってもポリクローン性であ ってもよく、どのような哺乳動物中でも調製することができる。好都合なことに 、天然のＰＦ４ＡＲポリペプチドに対して、あるいは下記第４章にさらに記述す るように本明細書に記載のＤＮＡ配列に基づ（合成ペプチドに対して抗体を調製 することができる。

Ｇ、ＰＦ４ＡＲポリペプチドの調製 ＰＦ４ＡＲは界面活性剤中で細胞膜を可溶化することによって細胞培養から回収 される。

ヒトＰＦ４ＡＲがヒト起源の細胞以外の組換え細胞中で発現される場合、そのＰ Ｆ４ＡＲはヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを全く含有しない。しかし 、ＰＦ４ＡＲに関して実質上均一な調製物を得るためには、組換え細胞タンパク 質またはポリペプチドからＰＦ４ＡＲを精製する必要がある。第１段階として、 細胞を遠心分離することによってそれらを培養培地から分離する。次に膜画分と 可溶性タンパク質画分を分離する。次に、界面活性剤による可溶化と、それに続 く適当な精製法（免疫アフィニティーカラムまたはイオン交換カラムにおける分 画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ１シリカまたはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥ など）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカソング、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、 硫酸アンモニウム沈殿、例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過、基板 上に固定された適当なＰＦ４Ａを用いる配位子アフィニティーおよび疎水性アフ ィニティー樹脂）によって培養溶解液の膜画分からＰＦ４ＡＲを精製することが できる 残基が欠失、挿入または置換されているＰＦ４ＡＲ変種は、その変化が引き起こ す特性の本質的な変化を考慮に入れて、天然のＰＦ４ＡＲと同じ方法で回収され る。例えば別のタンパク質またはポリペプチド（例：細菌またはウィルス抗原） とＰＦ４ＡＲの融合物を調製すれば精製が容易になる。その融合物を吸着させる ためにその抗原に対する抗体を含有する免疫アフィニティーカラムを使用するこ とができる。ウサギポリクローナル抗ＰＦ４ＡＲカラムなどの免疫アフィニティ ーカラムを利用して、少なくとも１つの残存する免疫エピトープにそれを結合さ せることによってＰＦ４ＡＲ変種を吸収することができる。精製中のタンパク質 加水分解による分解を阻害するためにはフェニルメチルスルホニルフルオライド （ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害因子も有用であり、付随的な混入物の発達 を防止するために抗体を含めてもよい。組換え細胞培養における発現時のＰＦ４ ＡＲまたはその変種の特性の変化を説明するために、天然のＰＦ４ＡＲに適した 精製法を改変する必要があり得ることは当業者には理解されるであろう。

Ｈ，ＰＦ４ＡＲポリペプチドの共有結合的修飾ＰＦ４ＡＲポリペプチドの共有結 合修飾は本発明の範囲に包含される。天然のＰＦ４ＡＲとＰＦ４ＡＲのアミノ酸 配列変種の両方を共有結合的に修飾することができる。ＰＦ４ＡＲ，その断片ま たはそれに対する抗体の共有結合的修飾は、ＰＦ４ＡＲ１その断片またはＰＦ４ ＡＲ抗体の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖もしくはＮ−末端またはＣ−末端 残基と反応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによって、その 分子中に導入される。最も一般的には、ＰＦ４ＡＲまたはその抗体を診断で使用 する検出可能な基（例：酵素、放射性同位体、抗原、蛍光または化学発光基など ）に共有結合させる。

システイニル残基を、最も一般的にはα−ハロアセテート（および対応するアミ ン）、例えばクロロ酢酸やクロロアセタミドと反応させることによって、カルボ キシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はプ ロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン 酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２− ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ ベンゾエート、２−クロロヌルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７− ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化さ れる。

ヒスチジル残基はｐＨ５，５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応に よって誘導体化される。なぜならこの試薬はヒスチジル側鎖に比較的特異的だか らである。バラ−ブロモフェナシルプロミドも有用であり、その反応は好ましく は１１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６，０）中で行われる。

リンニルおよびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と 反応させる。これらの試薬による誘導体化はリンニル残基の電荷の反転という効 果を持っている。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、 メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル、ピリドキサルホスフエエート 、ピリドキサール、クロロポロヒドリド、トリニトロベンゼンスルポン酸、０− メチルイソ尿素、２，４−ペンタンンオン、およびトランスアミナーゼが触媒す るグリオキシレートとの反応が含まれる。

アルギニル残基は１または数種類の従来の試薬との反応によって修飾され、それ らの試薬にはフェニルグリオキサール、２．３−ブタンノオン、１．２−シクロ ヘキサンジオンおよびニンヒドリンなどがある。アルギニン残基を誘導体化する 際には、そのグアニジン官能基の高いｐＫｌゆえに、その反応をアリ力り性条件 下で行う必要がある。さらにこれらの試薬はアルギニンのイプシロン−アミノ基 と同様にリジンの基とも反応し得る。

チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメ タンとの反応によってチロシン残基中に分光標識を導入するという特別な目的を もって行うことができる。最も一般的にはＮ−アセチルイミジゾールとテトラニ トロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロンル種と３−ニトロ誘導体を形 成させる。チロンル残基は、放射線免疫検定法用に標識されたタンパク質を調製 するため１コ２６７または＋３１１を用いてヨウ素化され、上述のクロラミンＴ 法が好適である。

カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒｏ −Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　、ここにＲとＲ゛は異なるアルキル基を表す）、例えば１ −シクロへキンルー３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまた は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミ ドなどとの反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグル タミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタ ミニル残基に変換される。

二官能性試薬による誘導体化は、抗ＰＦ４ＡＲ抗体を精製する方法またはその逆 の方法で使用するために、ＰＦ４ＡＲ，その断片または抗体を水不溶性の支持基 盤または表面に架橋するのに有用である。固定化されたＰＦ４ＡＲは、その受容 体が結合するＰＦ４スーパーファミリーの構成要素をスクリーニングする際にも 有用である。一般的に使用される架橋剤には例えば１．１−ビス（ジアゾアセチ ル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）、３．３°−ジチオビ ス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含 むホモ三官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタ ンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル ）ジチオコブロピオイミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成 することができる光活性化中間体を与える。別法として、臭化シアン活性化炭水 化物や米国３９６９２８７．３６９１０１６．４１９５１２８．４２４７６４２ ．４２２９５３７および４３３０４４０に記述されている反応性基質が、タンパ ク質の固定化に使用される。

グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしばそれぞれ対応するグルタミル 残基とアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいはこれらの残基を穏やかな 酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に包 含される。

他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニ ル残基のヒドロキシルのリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の α−アミノ基のメチル化（ティ’イー・クレイトンｒＰｒｏｔｅｉｎ　：　５ｔ ｕｒｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　ＰｒｏｐｅｒｔｉｅＪ　（ダ ブリュ・エイチ・フリーマン−アンド・カンパニー、サンフランシスコ）の７９ 〜８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化およびＣ末端カルボキシル 基のアミド化が含まれる。

本発明の範囲に包含されるベーター８ポリペプチドの共有結合的修飾のもう１つ の種類はこのポリペプチドの天然のグリコノル化様式を改変することからなる。

改変とは、天然の受容体中に認められる１またはそれ以上の炭水化物の削除、お よび／または、天然の受容体には存在しない１またはそれ以上のグリコジル化部 位の付加を意味する。

ポリペプチドのグリコノル化は典型的にはＮ−結合型または〇−結合型のいずれ かである。Ｎ−結合型とはアスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合 を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン− Ｘ−スレオニン（ここにＸはプロリン以外のあらゆるアミノ酸を表す）はアスパ ラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合にとっての認識配列である。した がって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的な グリコノル化部位を作り出す。〇−結合型グリコノル化とは、ヒドロキシアミノ 酸（５−ヒドロキシプロリンや５−ヒドロキシリジンも使用できるが、最も一般 的にはセリンまたはスレオニン）に対する、糖類Ｎ−アセチルガラクトザミン、 ガラクトースまたはキンロースのひとつの結合を意味する。上述のように０Ｌ− ８受容体は６つの推定Ｎ−結合型グリコノル化部位を含有している。

ＰＦ４ＡＲポリペプチドに対するグリコノル化部位の付加は、上述のトリペプチ ド配列の１またはそれ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによっ て都合よく達成さ第１る（Ｎ−結合型グリコノル化部位について）。天然のＰＦ ４ＡＲ配列に１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加するか、そ れらの残基で置換することによっても、この改変を施すことができる（〇−結合 型グリコリル化部位について）。容易のために、ＰＦ４ＡＲのアミノ酸配列をＤ ＮＡレベルでの変化によって、とりわけＰＦ４ＡＲポリペプチドをコード化する ＤＮＡを予め選択した塩基で突然変異させて所望のアミノ酸に翻訳されるであろ うコドンを作成することによって、改変することが好ましい。ｒＰ　Ｆ　４　Ａ Ｒポリペプチドのアミノ酸配列変種」と題した項で上述した方法を用いてＤＮＡ 突然変異（単数または複数）を作成することができる。

ＰＦＪＡＲ上の炭水化物部分の数を増大させるもう１つの手段は、このポリペプ チドに対して化学的または酵素的にグリコシドを結合させることによる。これら の手法は、Ｎ−および〇−結合型グリコシル化に関するグリコジル化能を有する 宿主細胞中で該ポリペプチドを生産する必要がないという点で有利である。使用 する結合様式に応じて、糖（単数または複数）を（ａ）アルギニンおよびヒスチ ジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（Ｃ）システィンのスルフヒドリル基など の遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリ ンのヒドロキシル基などの遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チ ロシンまたはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基あるいは（ｆ）グル タミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１ １日に公開されたＷＯ８７１０５３３０とアブリンおよびリストン、　ＣＲＣＣ ｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　２５９−３０６頁［１９８１１に 記述されている。

天然のＰＦ４ＡＲポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は化学的もしく は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコジル化の場合、化合物トリフルオロメ タンスルホン酸や等価な化合物に該ポリペプチドをさらす必要がある。この処理 は結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外 のほとんどの糖もしくはすべての糖の切断をもたらすが、ポリペプチドは無傷の ままである。化学的脱グリコジル化はハキマツディンら（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　２５９：５２［１９８７］）およびエツジら （＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１８：　１３１０９８１］）に記述さ れている。

ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、トタクラら（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、　、　１３８３５０［１９８７］）が記述しているように様々なエ ンドグリコンダーゼとエキソグリコ／ダーゼを使用することによって達成するこ とができる。

ダスキンら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｆｆｉ、　、　２５７　：３１０５　［１ ９ｇ２］　）が記述している化合物ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ） の使用によって、潜在的グリコノル化部位でのグリコノル化を防止することがで きる。ツニカマイシンはタンパク質＝Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。

例えばコアセルベーション技術や界面重合（それぞれ例えばヒドロキシメチルセ ルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート） マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中、コロイド薬物送達系 （例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルンヨシ、ナノ粒子およ びナノカプセル）中、あるいはマクロエマルション中にＰＦ４ＡＲを封入するこ ともできる。そのような技術はｒＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｅｅ ｕｔｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＪ　（第１６版。

オソル、エイ編、１９８０）に開示されている。

またＰ　Ｆ　、４　Ａ　Ｒ調製物は、抗体を生成させる際に、あるいはＰＦ４Ａ Ｒに関する検定における標品として（例：放射線免疫検定法、酵素結合免疫検定 法または放射線受容体検定法において標品として使用するためにＰＦ４ＡＲを標 識することによって）、アフィニティー精製技術において、並びに、放射性ヨウ 素、酵素、発蛍光団、スピンラベルなどで標識されている場合には競争型受容体 結合検定法において、６用である。

変種ＰＦ４ＡＲの特性を削具て予測することはしばしば困難であるので、最適な 変種を選択するためには回収した変種の何らかのスクリーニングが必要になるで あろうことは理解されるであろう。例えば、ある与えられた抗体に対する親和性 などのＰ　Ｆ　、４　Ａ　Ｒ分子の免疫学的特性の変化は、競争型免疫検定法に よって測定される。同じ検定法で天然のＰＦ４ＡＲについて観測される活性との 比較によって、その活性の抑制や増進の変化を検定する。タンパク質またはポリ ペプチド特性（例えば酸化還元安定性や鴫安定性、疎水性、タンパク賃加水分解 的分解に対する感受性あるいは担体との会合傾向もしくは多量体への会合傾向な ど）の他の潜在的改変は当該技術分野でよく知られている方法によって検定され る。

３、ＰＦ４ＡＲの医薬的組成物とその投与ＰＦ４ＡＲ（ＰＦ４ＡＲ結合断片を含 む）またはそれに対する抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するＰＦ４ＡＲを随 意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ 　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（上記））と混合するこ とによって、凍結乾燥ケーキか水性溶液の形態で保存のために調製される。許容 される担体、賦形剤または安定化剤は使用される投与量および濃度で受容者に対 して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤、アス コルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清 アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロ リドンなどの親水性ポリマー、グリシジ、グルタミン、アスパラギン、アルギニ ンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンを 含む単糖類、三糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡなとのキレート剤、マンニト ールやソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオンおよ び／またはツウイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ） などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

インビボ投与に使用されるべきＰＦ４ＡＲまたは抗体は滅菌状態でなければなら ない。これは凍結乾燥および再構成の前もしくは後に滅菌濾過膜を通して濾過す ることによって容易に達成される。ＰＦ４ＡＲは通常は凍結乾燥された形態か溶 液状で保存されるであろう。

医薬的なＰＦ４ＡＲまたは抗体組成物は一般に滅菌注入口を有する容器、例えば 静脈内バックや皮下注射針によって突き刺すことができる蓋をもつバイアルなど の中に入れられる。

ＰＦ４ＡＲまたは抗体を投与する経路は、例えば静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉 内、眼球内、動脈内または外傷内経路による注射または注入、あるいは後述する 徐放系によるなど、既知の方法に従って行われる。

徐放性調製物の好適な例には、成型品の形態（例：フィルムまたはマイクロカプ セル）にある半透過性ポリマー基盤が含まれる。徐放性基盤にはポリエステル、 ヒドロゲル、ポリラクチド（米国３７７３９１９、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グル タミン酸とＬ−グルタミン酸ガンマエチルの共重合体（シトマンら、Ｂｉｏｐｏ ｌｙｍｅｒｓ、　２２：５４７−５５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシ エチル−メタクリレート）（ランガーら、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｔｅｒ 、　Ｒｅｓ、　、　＋５：１６７−２７７［１９８１コおよびランガー、　Ｃｈ ｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　、　１２　：X８−１０５　［１９８２］ ）、エチレンビニルアセテート（ランガーら（上記））またはポリ−Ｄ−（−） −３−ヒドロキシラフ酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。徐放性ＰＦ４ＡＲま たは抗体組成物にはリポソームに封入したＰＦ４ＡＲまたは抗体も含まれる。Ｐ Ｆ４ＡＲまたは抗体を含有するリポソームはそれ自体は既知の方法によって調製 される・ＤＥ３２１８　］、　２１、エプスタインら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８２　：３６８８−３６９２（P９８ ５） 、ワンプら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７ ：４０３０−４０３４（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ　５２３２Q、Ｅ Ｐ３６６７６、ＥＰ８８０４６、ＥＰ１４３９４９、ＥＰ１４２６４１、日本国 特許出願８３−１１８００８、米国４４８５０４５および４５４４５４５、ＥＰ １０２３２４゜通常リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム） 単層型であり、その脂質含量は約３０モル％コレステロール以上であるが、選択 される比率は最適なＰＦ４ＡＲまたは抗体療法のために調節される。

治療的に使用すべきＰＦ４ＡＲまたは抗体の有効量は、例えば治療する対象、投 与経路および患者の状態などに依存するであろう。したがって治療者は投与量を 滴定し、必要に応じて投与経路を変更することによって最適な治療効果を得る必 要があるであろう。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果を達成する量に至 るまでＰＦ４ＡＲまたは抗体を投与するであろう。この療法の進行は従来の検定 法によって容易に監視できる。

４、ＰＦ４ＡＲ抗体の調製 一般にＰＦ４ＡＲとアジュバントの複数回の皮下（Ｓ　Ｃ）または腹腔内（ｉｐ ）注射によって、ＰＦ４ＡＲに対するポリクローナル抗体を動物中に生じさせる 。ＰＦ４ＡＲで形質転換した組換え細胞（例：ｈｕＰＦ４ＡＲによって形質転換 されたマウスまたはＣＨＯ細胞）による免疫化は満足できる結果を与え得る。あ るいはＰＦ４ＡＲを分離し、それ、または標的アミノ酸配列を含有する断片を、 二官能性試薬または誘導体化試薬（例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシン イミドエステル（ノステイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシン・ｒミ ド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、５ＯＣ１□ま たはＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここにＲおよびＲ１は異なるアルキル基を表す））を用 いて、免疫化する種の中で免疫原性であるタンパク質（例：キーホール・リムペ ット・ヘモンアニン、血清アルブミン、キナログロブリンまたは大豆トリプシン 阻害因子）に結合させることも有用である。

通常は、１ｍｇまたは１μｇのＰＦ４ＡＲをフロイント完全アジュバントと混合 し、その溶液を複数部位の皮肉に注射することによって、動物を細胞または免疫 原性複合体または誘導体に対して免疫化する。１力月後に、元の量の１１５〜１ ／１０のフロイント完全アジュバント中の複合体を用いて複数部位に皮下注射す ることによって動物を追加免疫する。７〜１４日後に動物から採血し、その血清 を抗ＰＦ４ＡＲ力価について検定する。力価が平坦になるまで動物を追加免疫す る。好ましくは同じＰＦ４ＡＲの複合体で追加免疫するが、異なるタンパク質に 結合させてもよく、かつ／または、異なる架橋剤によって結合させてもよい。

組換え細胞培養中でタンパク質融合物として複合体を作成することもできる。ま た、免疫応答を増進させるためには明ｗなどの凝集剤を用いる。

もう１つの選択枝は結合可変ドメインライブラリーと所望の抗ＰＦ４ＡＲ抗体を 同定するためのスクリーニング法を使用することである。

免疫化した動物から膵臓細胞を回収し、従来の方法で（例えば骨髄腫細胞との融 合によって、あるいはエプスタイン−バー（Ｅ　Ｂ）ウィルス形質転換によって ）その細胞を不死化し、所望の抗体を発現させるクローンをスクリーニングする ことによ１てモノクローナル抗体を調製する。

このモノクローナル抗体は好ましくは各標的ＰＦ４ＡＲポリペプチドに特異的で あって、ウサギｆＭＬＰ受容体５、ヒトｆＭＬＰ受容体、ヒトＣ５ａ受容体、低 親和性ＩＬ−８受容体またはＰＦ４ＡＲファミリーの他の構成要素とは交差反応 しないであろう。図２．４または５の受容体に特異的な抗体が好ましい。作用薬 性、拮抗薬性であるか、あるいは受容体を結合または活性化する際のＰＦ４スー パーファミリー構成要素の活性に対して効果を持たない抗体を選択する。

マーフィーら（上記）は図２の受容体に対して高度な相同性を有する受容体を記 述している。マーフィーらは組換え卵母細胞中で彼らの受容体を、ＩＬ−８の「 低親和性」受容体であって、ＭＧＳＡを結合する能力をほとんど持たないと特徴 づけており、したがってＩＬ−８およびＭＧＳＡのインビボでの生物学的活性に 関してわずかな役割しか果たしていないことを示唆している。しかしながら出願 人らの研究は、マーフィーらの受容体が図２の受容体と同等かそれ以上のＩｆ、 −８親和性を示し、ＭＧＳＡに対しても同様に高い親和性（約１〜１０ｎＭ）を 示すことを明らかにした。したがって、リンパ様細胞のＩＬ−８および／または ＭＧＳＡ応答の拮抗性は両受容体が共に阻害または遮断されることを必要とする と思われる。例えば、マーフィーらの受容体と共通する図２の受容体のエピトー プに結合するＩＬ−８拮抗性抗体を選択すべきである。これは慣用のスクリーニ ング法によって容易に達成されるであろう。例えば、図２の受容体を保持する細 胞への結合に関して標識したＩＬ−８に対して競争するというそれらの能力につ いて候補抗体を検定し、次いで、同じ研究をマーフィーらの受容体を保持する細 胞を用いて実行することができる。次に、両細胞に対する結合またはＩＬ−８活 性化を阻害する抗体を医薬候補として選択する。他方、図２の受容体とマーフィ ーらの受容体を識別することができ、どちらか一方のみに結合する抗体は診断の 際に有用である。マーフィーらの受容体とは対照的に、図２の受容体はＭＧＳＡ をわずかにしか結合しない。

５、ＰＦ４ＡＲ１その核酸および抗体の使用ＰＦ４ＡＲをコード化する核酸を、 組織特異的分類のための診断剤として使用することができる。例えば原位置ハイ ブリッド形成やノーザンブロツテイングおよびササンブロノティング並びにＰＣ Ｒ分析などの手法を用いることによって、評価される細胞型（単数または複数） 中にＰＦ４ΔＲをコード化するＤＮＡおよび／またはＲＮＡが存在するか否かを 決定することができる。これらの受容体は典型的にはＰＢＬまたは単球細胞の診 断剤である。

単離されたＰ　Ｆ　４　Ａ　Ｒポリペプチドを定量的な診断的検定法での標品ま たは対照として使用することができ、これに対して未知量のＰＦ４ＡＲを含有す る、例えばＰＢＬまたは単球細胞から得た試料を比較することができる。ＩＬ− ８受容体を発現させる組換え細胞は、例えばＩＬ−８検定法において好中球が用 いられるのと同じ方法でＰＦ４ＡＲ配位子に関する検定法で使用することができ る。ＰＦ４ＡＲに対する抗体を生産する際の免疫原として、あるいは腹水または 組換え細胞培養からそのような抗体を精製するために、あるいはスーパーファミ リー配位子（例：■Ｌ〜８）の競争的拮抗薬として使用するために、ＰＦ４ＡＲ ポリペプチド、断片または細胞（そのままであるか、もしくは誘導体化したもの ）を使用することができる。

ＰＦ４ＡＲはＰＦ４スーパーファミリー構成要素のアミノ酸配列変種または他の 変種についてスクリーニングする際に有用である。例えば候補ＩＬ−８アミノ酸 配列変種の一群を部位特異的突然変異誘発法によって調製する。ＩＬ−８変種の 拮抗薬性または作用薬性を同定するために、これらを、図２のＩＬ−８受容体を 保持する細胞について標識した天然のＩＬ−８と競争させてインキュベートする 。結合または細胞の活性化は好適な検定終点である。別法として、受容体を細胞 非含型で回収し、１１、−８および候補変種の結合を検定する。

ＰＦ４ＡＲ抗体は特定の細胞または組織におけるＰＦ４ＡＲ発現に関する診断的 検定法で有用である。ここにおいて該抗体は上述のＰＦ４ＡＲと同じ方法で標識 され、かつ／または、不溶性基盤に固定化される。ＰＦ４ＡＲ抗体は、組換え細 胞培養もしくは天然の供給源からＰＦ４ＡＲをアフィニティー精製する際にも有 用である。他のＰＦ４ＡＲと検出可能なほどには交差反応しないＰＦ４ＡＲ抗体 を用いて、他の相同的受容体を含有しない各ＰＦ４ＡＲを精製することができる 。ＰＦ４拮抗薬であるＰＦ４ＡＲ抗体は他のＰＦ４スーパーファミリーが媒介す る障害の治療において、あるいは抗炎症剤として有用である。

Ｐ　Ｆ　４　Ａ　Ｒとその抗体に関する好適な診断的検定法それ自体はよく知ら れている。そのような検定法には競争的検定法、サンドイッチ検定法および立体 的阻害検定法が含まれる。競争的検定法とサンドイッチ検定法ではその方法の必 須部分として相分離段階を使用するが、立体的阻害検定法は単一の反応混合物で 行われる。検定される物質の分子量に応じである種の方法が好まれるであろうが 、基本的にはＰＦ４ＡＲの検定とＰＦ４ＡＲを結合する物質には同じ手法が用い られる。

したがって本明細書では、それが抗原であるか抗体であるかにかかわらず試験さ れる物質を分析物と呼び、それらが抗体であるか、細胞表面受容体であるか、あ るいは抗原であるかにかかわらず、その分析物に結合するタンパク質を結合相手 と呼ぶ。

ＰＦ４ＡＲまたはその抗体に関する分析法はすべて、下記の試薬のうちの１また は複数を使用する二標識された分析物類縁体、固定化された分析物類縁体、標識 された結合相手、固定化された結合相手および立体的複合体。標識された試薬は 「トレーサー」としても知られている。

使用される標識（これはプローブとして使用するためにＰＦ４ＡＲ核酸を標識す る際にも有用である）は、分析物とその結合相手の結合を妨害しないものであれ ば、どのような検出可能な官能基であってもよい。数多くの標識が免疫検定法で の使用について知られており、その例には直接検出することができる部分（蛍光 発色団、化学発光標識および放射能標識）と、検出するためには反応または誘導 体化しなければならない部分（酵素など）が含まれる。そのような標識の例には 、放射性同位体＄２ｐ、＋４Ｃ１１２５Ｉ、３Ｈおよび＋３１１、発蛍光団（希 土酸化物キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘 導体、ダンシルなど）、アンベリフェロン、ルシフェラーゼ（例　ホタルルシフ ェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号））、ルンフ エリン、２．３−ジヒドロフタルアンンンオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトノダーゼ、グルコアミラー ゼ、リゾチーム、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素（ＨＲ Ｐ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼなど）と共役させた 複素環オキ／ダーゼ（ウリカーゼやキサンチンオキシダーゼなど）、糖類オキシ ダーゼ（例：グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキ／ダーゼおよびグルコ ース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ビオチン／アビシン、スピンラベ ル、バクテリオファージラベル、安定な遊離基などが含まれる。

これらの標識をタンパク質またはポリペプチドに共有結合させるためには従来法 を利用することができる。例えばンアルデヒド、カルボジイミド、シマレイミド 、ビスイミデート、ビスンアゾ化ベンジジンなどの結合試薬を用いて上述の蛍光 、化学発光および酵素標識で抗体を標識することができる。例えば米国特許第３ ９４０４７５号（ｌ測定）おヨヒ第３６４５０９０号（酵素）、ハンターラ、Ｎ ａｔｕｒｅ、　１４４：９４５（１９６２）、ディピッドら、　Ｂｉｏｃｈｅｌ ｉｓｔｒｙ、　１３：１０１４−１０２１（１９７４）、ペインら、　Ｊ、　ｌ ｍ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　４０：２１９−２３０（１９８１）、ナイ グレン、　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ａ獅п@Ｃｙｔｏｃｈ ｅｍ、　、　３０：４０７−４１２（１９ｇ２）を参照のこと。本発明において 好ましい標識は西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの 酵素である。

酵素を含む上記の標識を抗体に結合させることは免疫検定技術の当業者には標体 複合体の調製法（原題：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃ。

ｎｊｕｇａｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ）Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙAジエイ暑 ンエイ・ランボンおよびエイチ・ファン・フナキス編、第７３巻（アカデミツク ・プレス、ニューヨーク、　１９８１）の１４７〜１６６頁を参照のこと。この ような結合法は、すべてタンパク質性であるＰＦ４ＡＲまたはその抗体での使用 に適している。

ある種の検定法では試薬の固定化が必要である。固定化には、溶液中に遊離して 残っている分析物から結合相手を分離することが伴う。これは従来がら、検定の 前に結合相手か分析物類縁体のいずれかを不溶化することによって、水不溶性の 基盤または表面への吸着によって（ベニッヒら、米国３７２０７６０）、（例え ばグルタルアルデヒド架橋を用いて）共有結合することによって、もしくは相手 または類縁体を（免疫沈降などによって）後で不溶化することによって、達成さ れる。

競争的検定法またはサンドイッチ検定法として知られている他の検定法は充分に 確立されており、商業的な診断薬産業において広く用いられている。

競争的検定法は、共通する結合相手上の限られた数の結合部位について試験試料 分析物と競争するというトレーサー類縁体の能力によっている。結合相手は一般 に競争の前または後に不溶化され、次いで結合相手に結合したトレーサーおよび 分析物を未結合のトレーサーおよび分析物から分離する。この分離はデヵンテー ンヨンすることによって（結合相手が予め不溶化されている場合）あるいは遠心 分離によって（結合相手が競争反応後に沈殿された場合）達成される。試験試料 分析物の量は、標識物質の量によって測定される結合したトレーサーの量に逆比 例する。既知量の分析物を用いて服量一応答曲線を調製し、試験結果と比較する ことによって試験試料中に存在する分析物の量を定量的に決定する。これらの検 定法は酵素を検出可能な標識として使用する場合にはＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。

「均一」検定法と呼ばれるもう１つの種類の競争的検定法は相分離を必要としな い。ここでは、抗分析物が分析物に結合したときに、抗分析物の存在が酵素活性 を変化させるように酵素と分析物の複合体を調製し、使用する。この場合、ＰＦ ４ＡＲまたはその免疫学的に活性な断片を二官能性有機橋でペルオキシダーゼな どの酵素に結合させる。抗ＰＦ４ＡＲの結合が標識である酵素の活性を阻害もし くは強化するように、抗ＰＦ４ＡＲと共に使用するための複合体を選択する。

この方法自体はＥＭＩＴという名称で広〈実施されている。

立体的複合体は均一検定のための立体的障害法において使用される。これらの複 合体は、ハブテンに対する抗体が実質上杭分析物と同時には複合体に結合できな いように低分子量のハブテンを小さい分析物に共有結合させることによって合成 される。この検定法では試験試料中に存在する分析物が抗分析物を結合し、それ によって抗ハブテンが複合体に結合することを可能にし、複合体ハブテンの特性 の変化（例、ハブテンが発蛍光団である場合には蛍光の変化）をもたらすであろ う。

す〉ドイソチ検定法はＰＦ４ＡＲまたはＰＦ４ＡＲ抗体の決定にとりわけ有用で ある。逐次的サンドイッチ検定法では固定化した結合相手を用いて試験試料分析 物を吸着し、試験試料を洗浄などによって除去し、結合した分析物を用いて標識 した結合相手を吸着し、次いで結合した物質を余ったトレーサーから分離する。

結合したトレーサーの量は試験試料分析物に直接比例する。「同時」サンドイッ チ検定法では、標識した結合相手を添加する前に試験試料を分離しない。抗ＰＦ ４ＡＲモノクローナル抗体を１つの抗体として使用し、ポリクローナル抗ＰＦ４ ＡＲ抗体をもう１つの抗体として使用する逐次的サンドインチ検定法はＰＦ４Ａ Ｒ活性について試料を試験する際に有用である。

上の記述はＰＦ４ＡＲと抗体に関する診断的検定法の具体例に過ぎない。これら の分析物を測定するためにここで開発された方法もしくは今後開発される方法は 、上述の生物検定法を含めて本発明の範囲に包含される。

図４および５に記載のポリペプチドはＰＦ４スーパーファミリー（これはｃ−Ｃ およびＣＸＣサブファミリーを含む）の異なる構成要素であって、今までのとこ ろはまだ決定されていない構成要素のための受容体であると考えられる。図２の ＩＬ−８受容体と同様に、これらはＧ−タンパク質共役スーパーファミリーの構 成要素であり、他の受容体よりもＩＬ−８受容体に対してより高い類似性を保持 している。予備実験では、これらの受容体を保持する組換え細胞はランテス（Ｒ ａｎｔｅＳ）、ＭＣＰＩ、１．Ｌ−８またはＭＧＳＡに対して応答しなかったが 、それらは最終的にはＰＦ４スーパーファミリーの他の構成要素または現在知ら れていない配位子を結合することが示されるであろう。しかし、図４または５の ポリペプチドがＰＦ４スーパーファミリーの構成要素を結合するか否かにかかわ らず、これらのポリペプチドはその受容体の組織分布を決定する際の診断的使用 のために抗体を調製するのに有用であり、したがってそのような組織に関する組 織化学的診断剤として、具体的にはＰＢＬまたは単球細胞に関する診断剤として 有用である。

なぜならそのような細胞が図４および５の受容体を発現させることがわかってい るからである。当然のことながら、これらの受容体に結合するＰＦ４スーパーフ ァミリーの構成要素が同定されたら、その同定された構成要素の存在を診断する ためにこれらの受容体を使用するか、あるいは特異的なアフィニティー法による それら構成要素の精製にこれらの受容体を使用することができる。図４および５ に記載のＤＮＡは低い厳密条件を使用するとき、Ｉ　Ｌ−８受容体をコード化す るＤＮＡまたはＲＮＡの存在に関する診断にも有用である。

以下の実施例は例示を目的とするものであって、限定を目的とするものではない 。

実施例１ りｏ−ンｐＲＫ５Ｂ、　ｉ　］　８　ｒ　１．１を得るために、１．ＯＯＯ’、 ０００クローンのｃＤＮＡライブラリー＋６をヒト好中球ｍＲＮＡ＋７からベク ターｐＲＫ５Ｂ中にｂｓｔＸＩリンカ−を用いて構築した。ｃＤＮＡは平滑型で 作成された。ヘミキナーゼｂｓｔＸＩリンカ−をｃＤＮＡに連結し、ｂｓｔＸＩ で消化してホスファターゼ処理してその長いベクター断片を単離しておいたＰＲ Ｋ５Ｂベクター中に、上記リンカ−を連結した。どのような哺乳類細胞発現ベク ターでもよいことは理解されるであろうが、ＰＲＫ５Ｂはサイトメガロウィルス プロモータ・−とそれに続＜５′イントロン、ｂｓｔＸＩクローニング部位およ びＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含有するＰＲＫ５”の誘導体である。

それぞれ２５００クローンの５８プールを、３，７５０．０００細胞へのＤＮＡ ２０μｇのエレクトロボレー／ジンＩＩＪこよって、ＣＯ３−７細胞中にトラン スフェクションした。１０％０％牛脂清を含有する培地（５０：５０：　）弘Ｆ １２：ＤＭＥＭ）中１５０ｍｍディツシュ上で２日間成長させた後、＋２’１− ＩＬ−８結合を行った。大腸菌２°中で作成された精製したヒトの７２アミノ酸 Ｉ　Ｌ−８をラクトベルオキシダーゼ法２′によって約１１００Ｃｉ／ｍｍｏ　 ｌに標識し、これは少なくとも８５％結合可能であった。ディノ／ユをリン酸緩 衝化食塩水で２回濯ぎ、２５％牛脂児血清と約Ｑ、　５　ｎＭ”　ｌ　−Ｉ　Ｌ −８を含有する成長培地を１デイ・ノシュあたり８ｍｌ用いて結合を行った。３ ７°で２時間の後、プレートをリン酸緩衝化食塩水で３回濯ぎ、底部を切り抜き ２２、オートラノオグラフイーに付した。次に、２５００　ｃ　ＤＮＡクローン のそれぞれの陽性プールを８００クローンのプールに分配し、これらのそれぞれ をトランスフェクションし、検定した。次にそれぞれの陽性プールを１８５クロ ーン、３０クローンのプールを通してさらに分割し、最終的に単一のクローンを 同定することによって純粋な単離物を得た。各プールの一部のみをトランスフェ クションに使用したので、形質転換体からクローンを回収する必要はなかった。

６穴ギイノノユ中で１日の発現の後、エレクトロボレー／ジンにかけたＣｏ５− ７細胞を用いて結合競争を行った（約１７５０００細胞／デイツシユ）。結合培 地（２５ｎＭ　Ｈｅｐｅｓで緩衝化し、０．５％ＢＳＡを補足したＣａ！４およ びＭｇ　２４を含まないハンクス）中４℃で約２時間、放射性ヨウ素化した野生 型のＩＬ−８を用いて結合を行った。次にウェルを洗浄し、細胞をトリプシンを 用いて収集し、計数した。ベクターｐＲＫ５ＢからのＤＮＡでトランスフェクシ ョンした細胞を含有する平行したウェルで非特異的な結合を観測した。好中球結 合は記述されているように行ったが２２、ただし４°で２時間とした。

実施例２ ヒト細胞系ＨＬ６０およびヒト末梢血液リンパ球から得られた現存するλｇｔｌ ＱｃＤＮＡライブラリーを、クローン化した高親和性ヒトＴＩ、−８受容体（図 ２）のコード領域からのプローブを用いて低い厳密性でスクリーニングした。こ のプローブはアミノ酸２３〜３１４のコード領域を含有する該受容体の８７４ｂ ｐのＰｓｔｌ／Ｎｃｏｌ断片であった。２０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ，５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．２ｇ／ｌ超音波処理サケ精子ＤＮ Ａ、５×デンハルト、１０％硫酸デキストラン中４２℃でハイブリッド形成を行 い、ｌＸ５ＳＣ１０１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄した。変化する強度のいくつかの 複製スポット（約６０）を拾いあげ、プラーク精製し、プラスミドベクター中に サブクローニングし、配列決定した。最も強い強度のスポットの選択から核酸配 列決定を始めた。ある与えられたスポット（ファージ）について、ＩＬ−８受容 体と構造上または配列上の相同性が存在するか否かを決定するに足る配列を得た 。そのような相同性が存在する場合には、その遺伝子の残りの部分を得（必要な 場合）、その全体を配列決定した。次いで、ハイブリッド形成するクローンすべ ての配列決定を避けるために、その配列を用いて、同じハイブリッド形成遺伝子 を含有する他のスポットを同定してそれを捨てるべく、クローンＩＬ−８受容体 ＤＮＡハイブリツド形成りローンの親収集物をプローブした。この技術は配列決 定の負担を減じる上で極めて効果的であった。例えば、１クローンは最初の６０ クローンのうちの約１／３によって表され、この結果のみに基づいて、それらの クローンを配列決定する際に必要な仕事を考慮すれば、陰性スクリーニングは減 少することができた。

このスクリーニングから、２つの新しい遺伝子配列がＩ　Ｌ−８受容体と明らか に関連していることがわかった。新しい遺伝子の１つのコード領域は２つのクロ ーン（８ｒｒ、２０および８ｒｒ、１５）に分割された。この遺伝子の組み合わ せた配列（８ｒｒ、２０．１５）を図４に示す。第２の遺伝子に関する完全なコ ード領域はクローン８ｒｒ、９上に認められる（図５）。３ｒｒ、２０．１５の 予想アミノ酸配列は高親和性および低親和性１１、−８受容体配列の両方と３４ ％同一である。

８　ｒ　ｒ、　９の配列は高親和性および低親和性ＩＬ−８受容体配列と、それ ぞれ３６％オヨび３８％同一である（ダブリュ’イー・ホルメスら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２５３１２７８（１９９１’）オヨＵヒ＝工し−マーＴ’イーら、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２５３．１２８０（１９９１））。８ｒｒ、２０．１５と８　ｒ　 ｒ、　９のアミノ酸配列は３１％同一である。低い厳密条件下でのこのプローブ の使用は、これらのライブラリー中に認められると予期されたｆＭＬＰ受容体遺 伝子に対して検出可能なハイブリッド形成をもたらさなかった。

参考文献 １　オソペンハイム、ノエイ・ノエイら、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　、　９：６１７−６４８（１９９１）２　ギムブロン、エニーｘイ・ツユ ニアら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６＋１６０１−３（１９８９）３　ホウしイ、エ フら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｏｍ、　、　１ ６８　：　１１０３−１１０９（１９９０j ４　ヶラード、エヌ・ビーおよびケラード、　ソー、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４９ ：６１４−６１７（１９９］）５、トーマス、ケイ・エム、ピウン、エイチ・ワ イおよびナバツ０．シエイ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ａ、　２６５：２００ ６１−２００６４（１９９０）６　／ムス、ンエイ・イーら、　５ｃｉｅｎｃｅ 、　２４１　：５８５−５８９（１９８ｇ）７　ドウアンドリュー、エイ・デ仁 　ロデイッンユ、エイチ・エフおよびウオング。

ジー・ジー、Ｃｅ１１．５７：２７７−２８５（１９８９）８　サマンタ、エイ ・ケイ、オッペンノ＼イム、ノエイ・ノエイおよびマツシマ。ケイ。

Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　、　１６９：１１８５−１１８９（＋９８９）９、 ベセマー、ジエイ、ヒユーバー、エイおよびクーン、ビー、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、　、　２６４　：　１１０　グロップ、ビー・エムら、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２６５：８３１１−８３１６（１９９０）１１、コ サック、エム、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　、　１２：８５７−８ ７２（１９８４）１２　ディクソン、アール・エイ・エフ、シーガル、アイ・ニ スおよびストレイジー。

ンー゛ディ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［ｌａｒ、　Ｓｙｍ、　Ｑｕａｎｔ、 　Ｂｉｏｌ、　、　５３：４８７−４９７（１９８８）１３　コルチャ’ｙり、 エイチ・エムら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９　：４０７６−４０ ８２（１９８４）１４、テンネンバーグ、ニス・ディ、チェムラン、エフ・ビー およびソロムキン、ジエイ・ｘス、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１４１：３９ ３７−３９４４（１９８８）１５　ラマチャンドラン、ジエイら、　ＢｉｏＥｓ ｓａｙ、　１０：５４−５７（１９８９）１６　カルプラー、ニーおよびホフマ ン、ビー・ジエイ、Ｇｅｎｅ、　２５：２６３−２６９（１９８３）１７　チグ ウィン、ンエイ・ジエイら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１８：５２９４−５２９ ９（１９７９）１８、ＥＰ３０７２４７ １９、ゲーリング、ディ・ビーら、　Ｅ）ＩＢＯＪ、　、　８：３６６７−３６ ７６（１９８９）２０　ヘベルト、シー４イら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、 　１４５：３０３３−３０４０（１９９１）２１、　モ’Ｊ　ソン、　ｘＬおよ びバイゼ、シーーニス、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９　：２９９５−３０００（１ ９７０）２２　パチョルクチク、ティ、ブライクレイ、アール・ディおよびアマ ラ、ニス・ジー、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　９：５５６−５５８（１９ ９０）２３　グリンキヴイック、ノー、ポエニー、エムおよびチェン、アール・ ワイ、　Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｆｆｉ、　、　２６０＋３４４０−３４５０（１９８５）配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）発明の名称：ヒト ＰＦ４ＡＲ受容体とその使用（ｉｉｉ）配列の数＝３ （ｉｖ）宛て先。

（＾）宛て名：ジエネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）町名：ポイント・サ ン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ（ Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号＋　９４０８０ （Ｖ）コンピューター読み取り形式。

（Ａ）媒体型・　５．２５インチ、３６０Ｋｂプロツピーデイスク（Ｂ）コンピ ューター・　ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペ−レーティングシステム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：バチイン（ｐａｔｉｎＸジエネンテク ）（ｖｉ）本願のデータ： （＾）出願番号・ （Ｂ）出願日＋　１９９２年３月２３日（Ｃ）分類。

（ｖｉｉ）先の出願のデータ： （＾）出願番号：　０７／６７７２１１（Ｂ）出願日・１９９１年３月２９日 （ｖｉｉ）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号：　０７／８１０７８２（Ｂ）出願日：　１９９１年１２月１９ 日（ｖＨｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ヘンズレイ、マックス・ディ（Ｂ）登録番号：２７．０４３ （Ｃ）参照／整理番号：　７０６Ｐ１ （ｉｘ）通信情報： （＾）電話：　４１５／２６６−１９９４（Ｂ）ファクシミリ：　４１５／９５ ２−９８８１（Ｃ）テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）配列番号１ に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１９３３塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号に ＾ＴＧ　ＴＣ＾＾ＡＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　Ｔ ＧＧ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　８６Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　ＰｈｅＧＡＴ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　 ＡＡＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＧＧＣＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡ Ａ　１２５＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ 　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ａｓｐ　ＧｌｕＧＡＴ　ＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴ　 ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＧＡ＾＾ＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＣＴＣＡＡＣ１６４＾ｓｐ　 Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＡＡＧ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＧＣＣ ＴＡＴ　ＧＣＣＣＴＡ　ＧＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　２０３Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ 　Ｖａｌ、Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ 　ＬｅｕＣＴＧ　ＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧ＾＾＾ＣＴＣＣＣＴＧ　ＧＴＧ　 ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＴＣ２４２Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ 　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＩｌｅＴＴＡ　 ＴＡＣＡＧＣＡＧＧ　ＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＣＡＣＴ　ＧＡＴ　ＧＴＣ ＴＡＣ２８１Ｌｅｕ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅ ｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＴｙｒＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＣＴＧ　 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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＣＡ、ＪＰ Ｉ （７２）発明者　ウッド、ウィリアム・アイアメリカ合衆国カリフォルニア９４ ４０２、サン・マテオ、テリータウン・ストリート１４００番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．単離されたＰＦ４ＡＲポリペプチド。
2. ２．ヒトに由来する請求項１のＰＦ４ＡＲポリペプチド。
3. ３．請求項１のＰＦ４ＡＲポリペプチドを含む組成物であって、そのＰＦ４ＡＲ ポリペプチドの供給源である動物種のポリペプチドが混入していない組成物。
4. ４．請求項１のＰＦ４ＡＲポリペプチドを結合することができる抗体であって、 ＰＦ４スーパーファミリーの池の構成要素を結合することができる受容体と交差 反応しない抗体。
5. ５．ＰＦ４ＡＲを結合することができる抗体。
6. ６．ＰＦ４ＡＲをコード化する単離された核酸分子。
7. ７．ＤＮＡであり、かつ、図２、４または５に記載の翻訳されたＤＮＡ配列を有 する請求項６の核酸分子。
8. ８．ＤＮＡであり、かつ、約４５塩基以上を含有する請求項６の核酸分子。
9. ９．該核酸配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む請求項６の核酸 分子。
10. １０．発現ベクターであって、そのベクターによって形質転換される宿主細胞に よって認識される制御配列に機能可能に連結した請求項６の核酸配列を含む発現 ベクター。
11. １１．請求項１０のベクターで形質転換された宿主細胞。
12. １２．ＰＦ４ＡＲをコード化する核酸分子を使用する方法であって、そのベクタ ーで形質転換される宿主細胞によって認識される制御配列に機能可能に連結した ＰＦ４ＡＲをコード化する核酸分子を含むベクターで形質転換された培養宿主細 胞中で該核酸分子を発現させ、その宿主細胞からＰＦ４ＡＲを回収することから なる方法。
13. １３．該ＰＦ４ＡＲを宿主細胞膜から回収する請求項１２の方法。
14. １４．ＰＦ４ＡＲを存在を決定する方法であって、ＰＦ４ＡＲをコード化するＤ ＮＡまたはＰＦ４ＡＲに相補的なＤＮＡを試験試料核酸にハイブリッド形成させ 、ＰＦ４ＡＲ　ＤＮＡの存在を決定することからなる方法。
15. １５．核酸試験試料を増幅する方法であって、ＰＦ４ＡＲ核酸をコード化する核 酸またはＰＦ４ＡＲ核酸に相補的な核酸で核酸ポリメラーゼ反応を始動させるこ とからなる方法。
16. １６．請求項１のＰＦ４ＡＲと医薬的に許容される担体からなる組成物。
17. １７．ＰＦ４ＡＲ抗体と医薬的に許容される担体からなる組成物。
18. １８．その受容体にとって異種であるポリペプチドに融合されたＰＦ４ＡＲか、 らなる単離されたポリペプチド。
19. １９．ＩＬ−８受容体をコード化するＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、その宿主 細胞を培養して該受容体をその表面上に発現させ、それらの細胞を収集し、それ らの細胞をＩＬ−８変種と接触させ、その変種の該受容体に対する生物学的効果 を決定することからなる方法。
20. ２０．該ＩＬ−８変種がＩＬ−８のアミノ酸配列変種である請求項１９の方法。