JPH06506115A

JPH06506115A - 新規ベータインテグリンサブユニット

Info

Publication number: JPH06506115A
Application number: JP4509327A
Authority: JP
Inventors: モイル，マシュー; マクリーン，ジョン・ダブリュ
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1994-07-14
Also published as: US5635601A; EP0575554A1; WO1992016621A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ベーターンテグリンサブユニツト本発明は新規ベータインテグリンサブユニットポリペプチドの単離と、該ポリペプチドをコード化するＤＮＡに関する。さらに本発明は該ベータインテグリンサブユニットの変種を調製する方法に関する。

背景技術と関連技術の説明インテグリンは原形質膜に結合した細胞表面タンパク質の一群（ファミリー）である。多くのインテグリンが存在し、あるものは細胞型特異的であり、またあるものは数種類の細胞中に存在する。評価された動物細胞型のほとんどすべての中に少なくとも１つのインテグリンが認められており（ヘルマー、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｓ■ｕｎｏ１．　。

が動物界のいたるところに存在し得ることを示唆している。

各インテグリンはアルファポリペプチドサブユニットとベータポリペプチドサブユニットからなる。これらのサブユニットは、複合体に全体として配位子結合活性を付与するような様式で非共有結合的に結合している。これらのサブユニットは共に３つのドメインを有しており、それらは１）そのポリペプチドのカルボキシ末端である細胞質ドメイン、２）カルボキシ末端近くに位置し、そのポリペプチドを原形質膜中に固定するように機能する膜透過ドメインもしくは貫膜ドメイン、および３）配位子を結合する細胞外ドメインである。

数種類のアルファサブユニットが知られており（ルオスラーチ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　。

８７　：　１［１９９０］　）、３種類のヒトベータサブユニットががなり長い間知られてきた。

最近さらに３種類のヒトベータサブユニットが同定され、クローン化され、配列決定され、ベーター４（スズキら、ＥＭＢＯＪ、、９ニア５７０９９０］　；　＊カー７オルストラ、ＥＭＢＯＪ、　、　９ニア６５［１９９０］）、ベーター５（マクレーンら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　、　２６５：　１７１２６［１９９O］）；ラマスワミーら、ＥＭＢＯ］、、９：１５６１［１９９０］）およびベーター６（シェパードら、　２６５　：　１１５０２［１９９０］）と命名されている。７番目のベータサブユニットであるベーター７は＊　サ＋：報告さレタばかりである（ユアンら、　Ｉｎｔｅｒｎｔ’　１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　２：１０９７［１９９０］）。

アルファサブユニットとベータサブユニットは互いに様々な組み合わせで結合して、多数の異なるインテグリンを生成させることができる（アルベルダら（上記）およびヘルマーら（上記）を参照のこと）。

現在までに同定されているヒトベータインテグリンサブユニットは３２〜５６％程度のアミノ酸配列同一性を共有しており、約５０のシスティン残基の保存を示す（ユアンら（上記））。ベーター１インテグリンサブユニツトはヒト、ニワトリ、カエルおよびマウスの間で８２〜９０％の相同性を有しくヘルマー（上記））、このサブユニットの高度に保存された機能的役割を示唆している。

インテグリンは細胞接着を媒介することが知られている。この媒介が起こり得る様式の一つは細胞外マトリックスに対するインテグリンの結合によるものである。いくつかのインテグリンがフィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、いくつかのコラーゲン、テナシン、ビトロネクチンおよびフオンビルプラント因子などの細胞外マトリックスタンパク質に結合することが明らかにされている（ルオスラーチ（上記））。インテグリンが細胞接着を媒介することができる第２の様式は細胞−細胞結合によるものである。例えば血小板の表面に位置するインテグリン糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａは媒介分子（具体的にはフィブリノーゲン）によって血小板が互いに結合するのを促進する。他のインテグリンは循環中の白血球の組織に対する結合を媒介することによってそれらを循環系から除去する際に役割を果たしていることが示されており、これは組織の回復にとって重要なことである（ルオスラーチ（上記））。

多くの腫瘍形成細胞を取り巻く細胞外マトリックスは正常な非腫瘍形成細胞について観測されるものより少量であり、正常細胞と比べて増大した腫瘍細胞の移動性をもたらしていることが観測されている（ルオスラーチ（上記））。いくつかの他のインテグリンと同様にインテグリンアルファー５／ベーター１がいくつかの腫瘍細胞中で変化した発現レベルを有することが示されている（プランテフェイバーら、Ｃｅ１１．５６：２８１［１９８９］）。

最近の研究は、いくつかのインテグリンが小脳の発育と分化の間にダリア線維に沿うニューロンの移動を媒介する際にある役割を持っているであろうことを示唆している（バッテン、　Ｔｒｅｎｄｓ、　Ｎｅｕｒａｌ、　Ｓｃｉ、　、　１３：１７９［１９９０］　；サネス、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　mｅｕｒｏｓｃｉ、　、　１２＋４９１［１９８９］）。

当該技術分野では新しいインテグリンサブユニットを同定し、細胞−細胞接着、細胞の移動性および細胞外マトリックスに対する細胞接着を媒介する際のそれらの役割を含む、それらの生物学的役割を同定することを現在も必要とし続けている。

したがって本発明の目的は、ベータインテグリンサブユニット１〜７と共通する構造上の特徴をいくらか共有する新規ベータサブユニットインテグリンポリペプチドを同定することである。

新規ベータインテグリンサブユニットポリペプチドをコード化する核酸を提供し、研究的または診断的使用のために、もしくはある種の神経学的または免疫学的障害およびある種の腫瘍および腫瘍形成細胞に関する潜在的な医療的使用のために、この核酸を用いて組換え細胞中で該ポリペプチドを生産することがもう１つの目的である。

アミノ酸配列変種や共有結合誘導体を含む新規ベータインテグリンサブユニットの誘導体および修飾型を提供することもさらなる目的である。

新規ベータインテグリンサブユニットに対する抗体を生じさせるための免疫原を調製すると共に、該ベータインテグリンサブユニットに結合することができる抗体を得ることもさらなる目的である。アルファインテグリンサブユニットと結合した新規ベータインテグリンサブユニットからなる複合体に対する抗体を生じさせるための免疫原を調製することもさらなる目的である。これらの新規免疫原に対して生じた抗体はベータインテグリンサブユニット１〜７を結合しないことが好ましい。

本発明のこれらの目的および他の目的は本明細書全体を考慮すれば当業者には明らかになるであろう。

発明の要約ある側面として、ベータインテグリンサブユニット１〜７に構造的に関連する単離された新規ベータインテグリンサブユニットポリペプチドを提供することによって、これらの目的が達成される。これ以降このポリペプチドをベーター８インテグリンサブユニツトと呼び、このポリペプチドはそのＮ末端およびＣ末端断片を包含することとする。

もう１つの側面として、本発明は、そのベーター８インテグリンサブユニツトが由来する動物種のポリペプチドが混入していないベーター８インテグリンサブユニツトからなる組成物を提供する。別の側面として、提供されるベーター８インテグリンサブユニツトはアルファインテグリンサブユニットと結合している。

ベーター８インテグリンサブユニツトまたはその断片（これは化学的方法によって合成することもできる）を（組換え発現またはインビトロ共有結合法によって）免疫原性ポリペプチドに融合し、次いで、この融合ポリペプチドを動物の免疫化に用いてベーター８インテグリンサブユニツトエビトープに対する抗体を生じさせる。抗ベーター８インテグリンサブユニット抗体は免疫化した動物の血清から回収される。別法として、免疫化した動物の細胞から従来の方法でモノクローナル抗体を調製する。日常的なスクリーニングによって同定される抗体はベーター８インテグリンサブユニツトには結合するであろうが、ベータインテグリンサブユニット１〜７を含む他の既知のベータインテグリンサブユニットとは実質上交差反応しないであろう。

固定化した抗ベーター８インテグリンサブユニット抗体はベーター８インテグリンサブユニツトの診断（インビボまたはインビトロ）や精製にとりわけ有用であり、例えばベーター８インテグリンサブユニツトの混合物を、該抗体が結合しているカラムに通す。

ベーター８インテグリンサブユニツトの置換、欠失または挿入変種はインビトロまたは組換え法で調製され、ベーター８インテグリンサブユニツトとの免疫交差反応性と、ベーター８インテグリンサブユニツト拮抗剤または作用剤活性についてスクリーニングされる。

とりわけベーター８インテグリンサブユニツトまたはその抗体の診断のため、もしくはベータ−８インテグリンサブユニツト抗体のアフィニティー精製のために、ベーター８インテグリンサブユニツトをインビトロで誘導体化して、固定化されたベーター８インテグリンサブユニツトおよび標識されたベーター８インテグリンサブユニツトを調製する。

とりわけ医薬的使用のために、ベーター８インテグリンサブユニツト、その誘導体もしくはその抗体を生理学的に許容される賦形剤中に製剤化する。そのような賦形剤にはベーター８インテグリンサブユニツトの徐放性製剤が含まれる。

さらに異なる側面として本発明は、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する単離された核酸分子でありて標識されているものあるいは標識されていないもの、並びに、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸配列に相補的であるかもしくは厳密な条件下で該核酸配列とハイブリッド形成する核酸配列であって、ベータインテグリンサブユニット１〜７（即ちベーター８インテグリンサブユニツトでない既知のベータインテグリンサブユニット）をコード化する核酸に相補的な核酸配列を除くものを提供する。

さらに本発明は、そのベクターによって形質転換された宿主によって認識される制御配列に機能可能に連結したベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸配列からなる複製可能なベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸分子を用いてその生産を達成する方法を提供する。該核酸配列はベーター８インテグリンサブユニツト核酸に関するハイブリッド形成検定法にも有用である。

さらなる態様として本発明は、ベーター８インテグリンサブユニツトを生産する方法であって、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸を含有する細胞のＤＮＡ中に、ベーター８インテグリンサブユニツト核酸に対してその転写に影響を与えるに足る近さと配向で転写変調要素を挿入ことがらなり、さらにその転写変調要素とベーター８インテグリンサブユニツト核酸とを含有する細胞を培養するという随意の段階を伴ってもよい方法を提供する。

さらに異なる態様として、本発明は、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸とベーター８インテグリンサブユニツト核酸に対してその転写に影響を与えるに足る近さと配向にある外因的な転写変調要素とを含む細胞、並びに、宿主細胞によって認識される外因的制御配列に機能可能に連結したベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸を含有する宿主細胞を提供する。

さらにベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸の転写が増大または減少している細胞を得る方法であって、（ａ）ベーター８インテグリンサブユニツト核酸を含有する細胞を用意し、（ｂ）該細胞中に転写変調要素を導入し、（Ｃ）ベーター８インテグリンサブユニツト核酸の転写が増大もしくは減少している細胞について、上記細胞をスクリーニングする、ことからなる方法をも提供する。

図面の簡単な説明図ＩＡ−Ｅ（配列番号３）はウサギのベーター８インテグリンサブユニツトの完全な核酸配列を表す。この配列は非翻訳５°領域と３′非翻訳領域の一部を含有する。推定したＡＴＧ翻訳開始コドンを示しである。推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。

図２Ａ−Ｈ（配列番号４）は実施例に記述するヒトの骨肉腫細胞系ＭＧ−６３から得たベーター８インテグリンサブユニツトの完全な核酸配列を表す。この配列は非翻訳５°領域と３゛非翻訳領域を含有する。推定したＡＴＧ翻訳開始コドンを示しである。推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。

一般に下記の用語または表現が本明細書の説明、実施例および請求の範囲で用いられる場合、それらは次に示す定義を有する。

用語「ベーター８インテグリンサブユニツト」または「β−８インテグリンサブユニツト」は、図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈのベーター８インテグリンサブユニツトに共通する定性的な生物学的活性を有するペプチドであって、図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈのベーター８インテグリンサブユニツトと少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するものと定義される。好ましくは、ベーター８インテグリンサブユニツトは少な（とも５アミノ酸残基からなる。

本明細書ではベーター８インテグリンサブユニツトに関する同一性または相同性を、候補配列を図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈの配列と並列させ、必要であれば最大の相同性が得られるように間隙を導入した後に、図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ〜Ｈ中の残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義し、保存的な置換を配列同一性の一部とは見なさないこととする。Ｎ末端伸長、Ｃ末端伸長および挿入はいずれも同一性または相同性を減じるものと見なされないであろう。

ベーター８インテグリンの定性的な生物学的活性は、１）ベーター８インテグリンサブユニツトの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的な交差反応性、もしくは、２）ベーター８インテグリンサブユニツトに定性的に共通する少なくとも１つの接着、調節またはエフェクター機能の保持、のいずれがと定義される。

本明細書で用いる免疫学的な交差反応性とは、既知の活性類縁体に対して生じたポリクローナル抗体または抗血清に関してこの活性を有するベーター８インテグリンサブユニツトの定性的な生物学的活性を、候補ポリペプチドが競争的に阻害できるということを意味する。そのような抗体および抗血清は、ヤギやウサギなどの動物に完全フロインドアジュバント中の既知の天然ベーター８インテグリンサブユニツトを例えば皮下注射し、次いで不完全フロイントで腹腔内または皮下に追加免疫注射することにより、従来の方法で調製される。

本明細書で用いる用語としてのベーター８インテグリンサブユニツトの範囲には、図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈに記載のウサギまたはヒトのベーター８インテグリンサブユニットの翻訳されたアミノ酸配列もしくは翻訳された成熟アミノ酸配列を有するベーター８インテグリンサブユニツト、ベーター８インテグリンサブユニツトの脱グリコジル化誘導体または非グリコジル化誘導体、図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈの配列の相同的なアミノ酸配列変種、並びに、ベーター８インテグリンサブユニツトの相同的なインビトロ生成変種および誘導体であって、図ＩＡ〜Ｅｔたは図２Ａ−Ｈのベーター８インテグリンサブユニツトに共通する生物学的活性を発揮し得るものが含まれる。天然のベーター８インテグリンサブユニツトは膜結合ポリペプチドであるが、機能的な貫膜ドメインを欠いたものなどの可溶型もこの定義に包含される。

また、図２Ａ−Ｈに記載のヒトのベータ−８インテグリンサブユニツト核酸配列によってコード化されるポリペプチドまたはタンパク質、１５アミノ酸残基（好ましくは３０アミノ酸残基）を有するその断片、ベーター８インテグリンサブユニツトの免疫エピトープまたは他の生物学的に活性な部位からなる約５残基以上を有するその断片、該図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈ配列のアミノ酸配列変種であって、アミノ酸残基が該図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈ配列もしくは上に定義したその断片のＮ末端またはＣ末端もしくはその内部に挿入されているもの、および／または、該図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈ配列またはその断片のアミノ酸残基が別の残基に置換されている該図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈ配列もしくは上に定義したその断片のアミノ酸配列変種であって、例えば部位特異的突然変異誘発法やＰＣＲ突然変異誘発法による予め決定された突然変異、およびウサギ、ラットブタ、ヒト以外の霊長類、ウマ、ネズミおよびヒツジのベーター８インテグリンサブユニットなどの他の動物種のベーター８インテグリンサブユニツト、および対立遺伝子および他の天然に存在する上記配列およびヒト配列の変種を含むもの、並びに、ベーター８インテグリンサブユニツトまたは上に定義したその断片の誘導体であって、そのベーター８インテグリンサブユニツトまたはその断片が置換、化学的手段、酵素的手段または他の適当な手段によって天然に存在するアミノ酸以外の部分で共有結合的に修飾されているものも本発明の範囲に包含される。

このような断片および変種は、ベータインテグリンサブユニット１〜７を含むあらゆる動物種の既知のベータインテグリンサブユニットまたはそのようなベータインテグリンサブユニットの既知の断片を含めて現在までに同定されたポリペプチドのいずれをも包含しない。ベータ−８インテグリンサブユニツトアミノ酸配列変種は、一般的には図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈに示す翻訳された配列と少な（とも７５％（好ましくは〉８０％、より好ましくは〉８５％）の配列同一性を共有するであろう。

好ましいベーター８インテグリンサブユニツトはヒトのベーター８インテグリンサブユニツトである。ヒトのベーター８インテグリンサブユニツトは既知のヒトのベータインテグリンサブユニット１〜７とそれぞれ約３５％、３２％、３４％、３１％、３４％、３７％および３１％のポリペプチド配列同一性を共有する。

「単離された」ベーター８インテグリンサブユニツト核酸またはポリペプチドとは、そのベーター８インテグリン核酸またはポリペプチドの動物またはヒトの供給源中に存在する混入核酸またはポリペプチドから分離され同定されたベーター８インテグリンサブユニツト核酸またはポリペプチドである。該核酸またはポリペプチドを診断のためおよびプローブのために、下記の診断的検定法の議論で記述し定義する標識を用いて標識してもよい。単離されたベーター８インテグリンサブユニットをいずれかのアルファインテグリンサブユニットと結合させて、例えばアルファーＶ／ベーター８複合体などの複合体を形成させることができる。

アルファインテグリンサブユニットおよび／またはベーター８インテグリンサブユニツトの先端欠失型からなる結合した複合体も本発明によって予期されるものである。

ベーター８インテグリンサブユニツト「核酸」はベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する１０塩基以上を含有するＲＮＡまたはＤＮＡと定義され、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸配列に相補的であり、そのような核酸とハイブリッド形成して厳密な条件下でそれに安定に結合したままであり、あるいは図ＩＡ−Ｅまたは２Ａ−Ｈに示す翻訳されたアミノ酸配列と少な（とも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少な（とも８５％の配列同一性を共有するポリペプチドをコード化する。図ＩＡ−Ｅまたは図２Ａ−Ｈの核酸にハイブリッド形成するＤＮＡは好ましくは少なくとも２ｏ塩基、より好ましくは少なくとも４０塩基、さらに好ましくは少なくとも６ｏ塩基を含有する。最も好ましくは、ハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡは４５塩基、さらにより好ましくは９０塩基を含有する。しかしこのようなハイブリッド形成核酸または相補的核酸はさらに、ベータインテグリンサブユニット１〜７を含む既知のベータインテグリンサブユニットをコード化する核酸をコード化し、厳密な条件下で該核酸とハイブリッド形成し、あるいは該核酸に相補的な核酸を含めて、先行技術のいずれの核酸に対しても新規であって自明でないものと定義される。

「厳密な条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度と高温（例：５０℃で０゜０１５Ｍ　ＮａＣ］１０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム１０．１％ＮａＤｏｄＳ０４）を使用する条件であるか、もしくは（２）ハイブリッド形成の間にホルムアミドなどの変性剤（例、４２℃で７５０ｍＭＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う０．１％牛血清アルブミン１０．１％フィコール１０．１％ポリビニルピロリドン１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）と共に５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）を使用する条件をいう。もう１つの例は、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０Ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランの使用と、それに伴う０．２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄である。

用語「制御配列」は特定の宿主生物中で機能可能に連結した配列の発現に必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えばプロモーター、随意にオペレーター配列、リポソーム結合部位、並びに、おそらくはまだよく理解されていない他の配列が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用することがわかっている。

ある核酸がもう１つの核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、その核酸は「機能可能に連結」している。例えばプレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される時、そのポリペプチドのＤＮＡに機能可能に連結している。またプロモーターやエンハンサ− は、それがコード配列の転写に影響を与える時、そのコード配列に機能可能に連結している。さらにリポソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置にある時、コード配列に機能可能に連結している。「機能可能に連結している」とは、一般的には連結されているＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合には隣接していて且つ解読相が一致していることを意味する。しかしエンハンサ−は隣接している必要がない。連結は都合のよい制限部位での連結（ライゲーション）によって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を従来の慣用に従って使用する。

本明細書において「外因的な」要素とは、その細胞にとって異種である核酸配列、もしくはその細胞にとって同種であるが、通常はその要素が認められない宿主細胞核酸内の位置にある核酸配列と定義される。

本明細書で使用される表現「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は相互に交換して使用することができ、これらの名称はすべて子孫を包含する。したがって「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、−次対象細胞と移送の数にかかわらずそこから導かれる培養とを包含する。計画的な突然変異や偶然の突然変位ゆえに、すべての子孫がＤＮＡ内容物に関して必ずしも正確に同一でなくてもよいということも理解されるであろう。最初に形質転換された細胞をスクリーニングした時と同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫も含まれる。別々の名称を意図するところは、その文脈から明らかになるであろう。

「プラスミド」は大文字および／または数字に先立つ小文字ｐ、および／または、小文字ｐとそれに続く大文字および／または数字によって指定される。本明細書での出発プラスミドは市販されており、制限なく公に使用することができるか、もしくは上記の利用可能なプラスミドから公表されている手法に従って構築することができる。さらに他の等価なプラスミドは当該技術分野で知られており、当業者には明らかであろう。

ＤＮＡの「制限酵素消化Ｊとは、そのＤＮＡ中のある種の位置にしか作用しない酵素によるＤＮＡの触媒的切断を意味する。そのような酵素は制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、そのそれぞれが特異的な部位を制限部位と呼ぶ。本明細書で使用される様々な制限酵素は市販されており、その酵素の供給者が確立したそれらの反応条件、補因子および他の必要条件を使用する。一般に制限酵素は、各制限酵素を最初に与えた微生物を表す大文字とそれに続く他の文字、次いで特定の酵素を指定する数字という構成からなる略号によって指定される。一般的には約１ μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を約１〜２単位の酵素と共に約２０μｍの緩衝溶液中で使用する。特定の制限酵素について適当な緩衝液と基質の量はその製造者によって指定される。通常は３７℃で約１時間のインキュベーションを用いるが、これらの条件は供給者の指示に従って変化し得る。インキュベーション後、フェノールとクロロホルムを用いる抽出によってタンパク質またはポリペプチドを除去し、エタノールを用いる沈殿によって、消化した核酸を水性画分から回収する。ある制限酵素による消化の後に、ＤＮＡ断片の２つの制限切断された末端が「環化」するかもしくは閉環を形成する（これらは別のＤＮＡ断片のその制限部位への挿入を妨害するであろう）のを防止するために、末端５°リン酸エステルの細菌アルカリ性ホスファターゼ加水分解を行ってもよい。特に明言しない限り、プラスミドの消化後に５′末端脱リン酸化を行わない。脱リン酸化のための手法と試薬類はサムプルツクらｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊにューヨーク、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、　１９８９）の１．５６〜１．６１章に記述されているように従来技術に属する。

ある与えられたＤＮＡ断片の制限消化からの「回収」または「単離」とは、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で電気泳動によりて消化物を分離し、既知の分子量を有するマーカーＤＮＡ断片の移動度とその移動度とを比較することによって興味ある断片を同定し、消化断片を含有するゲル切片を取り出し、ＤＮＡをそのゲルから分離することを意味する。この手法は一般的に知られている。例えばローンら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　９：６１０３−６１１４（１９８１）およびゲラデルら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０）を参照のこと。

「サザンプロット分析」は、ＤＮＡまたはＤＮＡ含有組成物の制限エンドヌクレオアーゼ消化物中のＤＮＡ配列の存在を既知の標識されたオリゴヌクオチドまたはＤＮＡ断片にハイブリッド形成させることによって確認する方法である。サザン分析は典型的にはサムプルツクら（上記）の９．３７〜９．５２章に記述されているように、アガロースゲルでＤＮＡ消化物を電気泳動的に分離し、電気泳動後にＤＮＡを変性させ、そのＤＮＡをニトロセルロース、ナイロンまたは他の適当な膜支持体に転写して、放射線標識したプローブ、ビオチニル化したプローブまたは酵素標識したプローブで分析することからなる。

「ノーザン分析」はオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡまたはその断片、あるいはＲＮＡ断片などの既知のプローブにハイブリッド形成するＲＮＡ配列を同定するために使用する方法である。上記プローブは３２−Ｐなどの放射性同位体で標識されるか、ビオチニル化によって標識されるか、あるいは酵素で標識される。サムプルツクら（上記）の７．３９〜７．５２章に記述されているような当該技術分野でよく知られている標準的技術を用いて、普通は分析すべきＲＮＡをアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース、ナイロンまたは他の適当な膜に転写し、プローブとハイブリッド形成させる。

「連結（ライゲーション）」は２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる工程を意味する。ＤＮＡ断片を互いに連結するためには、そのＤＮＡ断片の末端が互いに適合するものでなければならない。ある場合にはエンドヌクレアーゼ消化後にそれらの末端が直接適合するであろう。しかし、エンドヌクレアーゼ消化後によく生成するスタッガー末端（互い違い末端）をまず平滑末端に変換することによって、それらを連結に適合させることが必要なこともある。末端を平滑にするためには、そのＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片またはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ約１０単位と共に４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で適当な緩衝液中で少なくとも１５分間１５℃で処理する。次にフェノール−クロロホルム抽出とエタノール沈殿によってそのＤＮＡを精製する。

互いに連結すべきＤＮＡ断片を約等モル量で溶液中に置く。その溶液はＡＴＰ。

リガーゼ緩衝液およびＴ４　ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼ（ＤＮＡ０．５μｇあたり約１０単位）をも含有するであろう。ＤＮＡをベクター中に連結すべき場合には、そのベクターをまず適当な制限エンドヌクレアーゼ（単数または複数）で消化することによって直線化する。次に、連結操作中の自己連結を防止するために、直線化した断片を細菌アルカリ性ホスファターゼまたは牛腸ホスファターゼで処理する。

細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。ＤＮＡの調製に一般的に使用される方法はサムプルツクら（上記）の１．２５〜１．３３章に記述されている大規模および小規模プラスミド調製である。ＤＮＡを調製した後、例えばサムプルツクら（上記）の１．４０章に記述されているような当該技術分野でよく知られている方法によりて、それを精製することができる。

［オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（例えば１９８８年５月４日に公開されたＥＰ２６６０３２に記述されているような固相技術を用いるホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミド化学や、フレーラーら、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　、　１４　：５３９９−５４０７［１９８６］に記述されているようなデオキシヌクレオチドバーホスホネート中間体を介して）によって化学的に合成される短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。次に、それらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

本明細書で用いられる［ポリメラーゼ連鎖反応」またはｒＰｃＲｊの技術は一般に、微量の特定の核酸断片（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）を、１９８７年７月２８日に発効した米国特許第４６８３１９５号に記述されているように増幅する操作を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、興味ある領域またはそれ以上の領域の両末端からの配列情報が利用可能でなければならず、これらのプライマーは増幅すべき鋳型の反対側の鎖に対して配列が同一であるか類似しているであろう。２つのプライマーの５°末端ヌクレオチドは増幅される物質の末端と合致するであろう。全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などからの特定のＤＮＡ配列、特定のＲＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲを用いることができる。一般的にはムリスら、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　５ｙｉｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　、　５１：２６３’（１９８７）　；エルリッヒ編ｒＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　（ストックトン・プＬ／ス、：！−ヨーク、　１９８９）などを参照のこと。本明細書で用いる場合、ＰＣＲは既知の核酸配列をプライマーとして使用することからなる、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の（唯一の方法ではなくて）−例であると見なされ、またＰＣＲは核酸の特定の断片を増幅または作成するために核酸ポリメラーゼを使用する。

ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡは、ベーター８インテグリンサブユニツトｍＲＮＡを保持していてそれを検出可能なレベルで発現させていると考えられる組織から調製されるどのようなｃＤＮＡライブラリーからも得ることができる。ベーター８インテグリンサブユニツトをゲノムライブラリーから得ることもできる。興味ある遺伝子またはそれによってコード化されているタンパク質を同定するために設計されたプローブを用いてライブラリーをスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについては、ベーター８インテグリンサブユニツトを認識し、それに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、同じ種または異なる種から得たベーター８インテグリンサブユニツトｃＤＮＡの既知のもしくは推測される部分をコード化する約２０〜８０塩基長のオリゴヌクレオチド、および／または、同じ遺伝子または類似の遺伝子をコード化する相補的なもしくは相同なｃＤＮＡまたはその断片が好適なプローブに含まれる。ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに適したプローブには、オリゴヌクレオチド、同じ遺伝子または類似の遺伝子をコード化するｃＤＮＡまたはその断片、および／または、相同なゲノムＤＮＡまたはその断片が含まれるが、これらに限定されない。選択したプローブによるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、サムプルツクら（上記）の１０〜１２童に記述されているような標準的な手法を用いて実行することができる。

ベーター８インテグリンをコード化する遺伝子を単離する代替手段は、サムプルツクら（上記）の１４章に記述されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることである。この方法はベーター８インテグリンにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択法は後述する。

興味ある遺伝子を得るためのもう１つの代替法は、エンゲルスら（Ａｇｎｅｔ　ＣｈｅｔＩｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、　、　２８ニア１６−７３４［１９８９］）に記述されている方法の１つを使用して、それを化学的に合成することである。これらの方法にはトリエステル、ホスファイト、ホスフォルアミダイトおよびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー法、および固相上でのヌクレオチド合成が含まれる。その遺伝子の全核酸配列が知られているか、あるいは標的アミノ酸配列が知られている場合にこれらの方法を使用することができ、各アミノ酸残基について既知の好ましいコード残基を用いることにより、考え得る核酸配列を推論することができる。

本発明を実施する好ましい方法は、様々な組織（好ましくは哺乳動物の胎盤、胎児、脳および癌腫細胞系）からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用することである。さらに好ましくは、ヒトまたはウサギの胎盤、胎児、脳および癌腫細胞系ｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。

プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最小限にするのに充分な長さと充分な明確さを有すべきである。実際のヌクレオチド配列（単数または複数）は通常は、他のベータインテグリンサブユニットの保存されたヌクレオチド配列または領域もしくは高度に相同なヌクレオチド配列または領域に基づく。オリゴヌクレオチドは１またはそれ以上の位置で縮重していてもよい。

縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、その種における優先的なコドン使用剤が知られていない種からのライブラリーをスクリーニングする際には特に重要であり得る。スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリッド形成した時に検出され得るように、オリゴヌクレオチドを標識しなければならない。標識化の好ましい方法は、当該技術分野でよく知られているように３２−Ｐで標識されたＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼと共に使用してオリゴヌクレオチドを放射線標識することである。しかし他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識することもでき、それらの方法にはビオニチル化や酵素標識化が含まれるが、これらに限定されない。

とりわけ興味があるものは完全な長さのポリペプチドをコード化するベーター８インテグリンサブユニツト核酸である。いくつかの好ましい態様では、核酸配列が天然のベータ−８インテグリンサブユニツトシグナル配列を含む。選択したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、必要であれば、サムプルツクら（上記）の７．７９章に記述されている従来のプライマー伸長法を用いて前駆体を検出し、ｃＤＮＡに逆転写されていないかもれないｍＲＮＡの中間体をプロセシングすることによって、全タンパク質コード配列を有する核酸を得る。

Ｂ、ベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列変種ベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列変種は、ベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入するが、もしくは所望のベーター８インテグリンボリベブチドのインビトロ合成によって調製される。

そのような変種には、例えばヒトのベーター８インテグリンサブユニツトにつぃて図２Ａ−Ｈに示したアミノ酸配列内の残基からの欠失体、挿入体または置換体が含まれる。最終構築物が所望の特性を有する限り、最終構築物に到達するために欠失、挿入および置換のどのような組み合わせを行ってもよい。先行技術に対して新規でなく非自明でないベータ−８変種またはポリペプチド配列は本発明の範囲から除外される。アミノ酸変化がベーター８インテグリンサブユニツトの翻訳後プロセシングを変化させてもよ（、これらの変化は例えばグリコジル化部位の数または位置の変化、膜固定特性の変化および／または天然のベーター８インテグリンサブユニツトのリーダー配列を挿入するか、欠失させるか、あるいは他の影響を与えることによるベーター８インテグリンサブユニツトの細胞内位置の変化などである。

ベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列変種を設計するにあたって、突然変異部位の位置と突然変異の性質は修飾されるべきベーター８インテグリンサブユニツトの特性（単数または複数）に依存するであろう。突然変異の部位は個別に修飾することもでき、連続的に修飾することもできる。例えば、（１）まず保存的アミノ酸選択物で置換した後に、達成された結果に応じてより過激な選択物で置換するか、（２）標的残基を削除するか、あるいは（３）位置を特定した部位に隣接して同じ種類か異なる種類の残基を挿入するか、もしくは選択技（１）〜（３）の組み合わせによる。

突然変異誘発法にとって好ましい位置にあるベーター８インテグリンサブユニットボリベブチドの残基または領域を同定する有用な方法は「アラニン走査突然変異誘発法（ａｌａｎｉｎｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれ、カニングハムとウェルスによって記述されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４４　：　１０８１−１０８５０９８９コ）。ここでは−残基または標的残基の群（例　ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニルまたはポリアラニン）で置換することによってそれらのアミノ酸とそれらを取り巻く細胞内外の水性環境との相互作用に影響を与える。次に、置換の部位にさらなる変化または他の変化を導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示したドメインを詳細に調べる。したがってアミノ酸配列変化を導入する部位は予め決定されるが、置換の性質そのものは予め決定しておく必要がない。例えばある与えられた部位での突然変異の効果を最適化するために、ａｌａ走査または無作為突然変異誘発法を標的コドンまたは領域で行い、発現したベータ−８インテグリンサブユニツト変種を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。

一般に改変にとって好ましいベータ−８インテグリンサブユニツト分子の領域は他の既知のベータインテグリンサブユニットに関して高度に保存されている領域である。例えばヒトベーター８インテグリンのアミノ酸１１８と１８０（番号付与は図２Ａ−Ｈに従う）の間の領域は他のベータインテグリンと高度に相同的であり、それゆえに突然変異誘発にとって好ましい領域である。もう１つの好ましい領域はアミノ酸２４０と２７５の間の領域である。アミノ酸配列欠失は一般に約１残基から３０残基までの範囲にわたり、より好ましくは約１ないし１０残基であり、典型的には連続的である。ベーター８インテグリンサブユニツトの活性を改変するために、ベーター８インテグリンサブユニツトと他のベータインテグリンサブユニットの間で相同性が低い領域中に欠失を導入することができる。他のベータインテグリンサブユニットとかなりの相同性を有する領域でのベーター８インテグリンサブユニツトからの欠失は、ベーター８インテグリンサブユニツトの生物学的活性をより有意に変化させる可能性が高いであろう。連続的な欠失の数は影響を受けるドメイン内でベーター８インテグリンの三次構造（例えばベータひだ状シートまたはアルファへリックス）が保存されるように選択されるであろう。

アミノ酸配列挿入には、１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにわたるアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物、並びに、１または複数アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（即ちベータ−８インテグリン配列内の挿入）は一般的には約１から１０残基までにわたり、より好ましくは１ないし５、最も好ましくは１ないし３である。末端挿入の例には、細菌組換え宿主細胞培養中でのベーター８インテグリンの直接発現の人工の産物であるＮ末端メチオニル残基を伴うベーター８インテグリンサブユニツト、および、組換え宿主細胞からの成熟ベーター８インテグリンサブユニツトの分泌を容易にするためのベーター８インテグリンサブユニツトのＮ末端の異種Ｎ末端シグナル配列の融合物が含まれる。そのようなシグナル配列は一般に意図する宿主細胞種から得られ、それゆえにその宿主にとっては同種である。好適な配列には、大腸菌については５ＴＩＩまたはｌｐｐ、酵母についてはアルファ因子、哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤなどのウィルスシグナルである。

ベーター８インテグリンサブユニツトの他の挿入変種には、１９８９年４月６日に公開されたＷＯ３９１０２９２２に記述されているような、ベーター８インテグリンサブユニツトのＮ末端またはＣ末端への免疫原性ポリペプチド（例：べ一ターラクタマーゼや大腸菌ｔｒｐ遺伝子座がコード化している酵素などの細菌ポリペプチドまたは酵母タンパク質）の融合物、並びに、免疫グロブリン定常領域（または他の免疫グロブリン領域）、アルブミンまたはフェリチンなどの長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物が含まれる。

変種のもう１つの群はアミノ酸置換変種である。これらの変種ではベーター８インテグリンサブユニツト中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換的突然変異誘発にとって最も興味深い部位には、ベーター８インテグリンサブユニツトの活性部位と同定される部位、および様々な種から得たベーター８インテグリンサブユニツト中に認められるアミノ酸が、側輪のかさ高さ、電荷および／または疎水性の点で本質的に異なっている部位が含まれる。

その他の興味深い部位は、様々な種から得たベーター８インテグリンサブユニツトの特定の残基が同一である部位である。これらの位置はベーター８インテグリンサブユニツトの生物学的活性にとって重要であり得る。これらの部位（とりわけ少なくとも３つの他の同等に保存された部位の配列内にあるもの）は比較的保存的な方法で置換される。このような保存的置換を、好ましい置換と題した表１の欄に示す。このような置換が生物学的な活性の変化をもたらす場合には、表１で代表的な置換と名付けた、より本質的な変化、もしくはアミノ酸の種類に関してさらに後述するようなより本質的な変化を導入し、その産物をスクリーニングする。

Ａｈａ　（Ａ）　ｖａｌ；ｌｅｕ：ｉｌｅ　ｖａｌＡｒｇ（Ｒ）　Ｉｙｓ；ｇｌｎ；ａｓｎ　ＩｙｓＡｓｎ（Ｎ）　ｇｌｎ；ｈｉｓ；ｌｙｓ；ａｒｇ　ｇｌｎＡｓｐ（Ｄ）　ｇｌｕ　ｇｌｕＣｙｓ　（Ｃ）　ｓｅｒ　５ｅｒＧｉｎ（Ｑ）　ａｓｎ　ａｓｎＧｌｕ（Ｅ）　ａｓｐ　ａｓｐＧｌｙ（Ｇ）　ｐｒｏ　ｐｒ。

Ｈ４５（Ｈ）　ａｓｎ；ｇｉｎ；ｌｙｓ；ａｒｇ　ａｒｇｌｌｅ　（１）　Ｉｅｕ；ｖａｌ；ｍｅｔ：ａｌａ；　Ｉｅｕｐｈｅ：ノルロイシンＬｅｕ（Ｌ）　ノルロイシン；ｉｌｅ；　１ｌｅｖａｌ：ｍｅｔ；ａｌａ；ｐｈｅＬｙｓ　（Ｋ）　ａｒｇ；ｇｌｎ；ａｓｎ　ａｒｇＭｅｔ　（Ｍ）　ｌｅｕ：ｐｈｅ；ｉｌｅ　ＩｅｕＰｈｅ（Ｆ）　ｌｅｕ；ｖａｌ；ｔｉｅ；ａｌａ　１ｅｕＳｅｔ　（Ｓ）　ｔｈｒ　ｔｈｒＴｈｒ（Ｔ）　ｓｅｔ　５ｅｔＴｒｐ（Ｗ）　ｔｙｒ　ｔＶｒＴｙｒ　（Ｙ）　ｔｒｐ；ｐｈｅ；ｔｈｒ；ｓｅｒ　ｐｈｅＶａｌ　（Ｖ）　ｉｌｅ；Ｉｅｕ；ｍｅｔ；ｐｈｅ；　１ｅｕａｌａ：ノルロイシンベーター８インテグリンサブユニツトの機能的または免疫学的同一性の本質的な改変は、（ａ）置換の領域のポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたは螺旋立体配置）、（ｂ）標的部位におけるその分子の電荷または疎水性、あるいは（Ｃ）側鎖のかさ高さの維持に対するそれらの効果がかなり異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖特性に基づいていくつかの群に分類される。

（１）疎水性二ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ＩｅｕＳ　ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、５ｅｒＳｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ：（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓＳｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙＳｐｒｏ；（６）芳香族：　ｔ　ｒ　ｐＳｔ　ｙｒＳｐｈｅ。

非保存的置換はこれらの種類の一つの構成要素を別のものに交換することを必然的に伴うであろう。他のインテグリンと相同なベーター８インテグリンサブユニツトの領域に、より好ましくは該分子の非相同領域に、そのような置換された残基を導入することができる。

本発明の一態様として、分子中に存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ切断部位を不活化することが好ましい。これらの部位はコード化されたアミノ酸配列を点検することによって同定される。プロテアーゼ切断部位が同定されたら、標的残基を別の残基（好ましくはグルタミンなどの塩基性残基またはセリンなどの疎水性残基）で置換することによって、あるいはその残基を削除することによって、あるいはその残基の直後にプロリル残基を挿入することによって、それらをタンパク質加水分解に対して不活性にする。

もう一つの態様として、シグナル配列の開始メチオニル残基を除くあらゆるメチオニル残基もしくはそのような各メチオニル残基のＮ末端側またはＣ末端側の約３残基内に位置するあらゆる残基を別の残基（好ましくは表１に従って）に置換するか、欠失させる。別法として、約１〜３残基をそのような部位の隣りに挿入する。

またベーター８インテグリンの適性な立体配置の維持に関与していないシスティン残基はいずれも一般的にはセリンで置換することによってその分子の酸化的安定性を改善し、常軌を逸した架橋を防止し得る。

ベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列変種をコード化するＤＮＡは当該技術分野で知られている様々な方法で調製される。これらの方法には天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変種の場合）あるいはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法、および先に調製されたベーター８インテグリンサブユニツトの変種または非変種型のカセット突然変異誘発法などが含まれるが、これらに限定されない。

オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法は、ベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡの置換、欠失および挿入変種を調製する際に好ましい方法である。この技術はアデルマンら、ＤＮＡ、２：１８３（１９８３）に記述されているように当該技術分野ではよ（知られている。簡単に述べると、ベーター８インテグリンサブユニツトの未改変のＤＮＡ配列または天然のＤＮＡ配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖型であるＤＮＡ鋳型に所望の変異をコード化するオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させることによって、ベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡを改変する。ハイブリッド形成の後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記鋳型の完全な第２の相補鎖を合成すれば、その相補鎖は上記オリゴヌクレオチドブライマーを組み込み、ベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡ中の選択された改変をコード化するであろう。

一般に少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは突然変異をコードするヌクレオチド（単数または複数）の両側に鋳型に対して完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドを有するであろう。

このことはそのオリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に対して適切にハイブリッド形成することを保証する。オリゴヌクレオチドは、フレアら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５：５７６５［１９７８］）が記述しているような当該技術分野で既知の技術を用いて容昌に合成される。

一本鎖ＤＮＡ鋳型は標準的な技術を用いて二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡを変性させることによっても生成させることができる。

（例えばアミノ酸配列変種を生成させるべく）天然のＤＮＡ配列を改変するために、適当なハイブリッド形成条件下でオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型にハイブリッド形成させる。次にＤＮＡ重合酵素（通常はＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片）を加えることにより、上記オリゴヌクレオチドを合成のプライマーとして用いて鋳型の相補鎖を合成する。したがってＤＮＡの１つの鎮はベーター８インテグリンサブユニツトの突然変異型をコード化し、他方の鎖（元の鋳型）はベーター８インテグリンサブユニットの天然の変化していない配列をコード化しているというヘテロ二本鎖分子が形成される。次にこのヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞（通常は大腸菌ＪＭＩ０１などの原核生物）中に導入する。細胞を生育した後、それらをアガロースプレートに接種し、３２−ホスフェートで放射線標識したオリゴヌクレオチドブライマーを用いてスクリーニングすることにより、突然変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定する。次に突然変異した領域を取り出し、タンパク質の生産に適したベクター（一般的に適当な宿主の形質転換に典型的に使用される種類の発現ベクター）中に入れる。

プラスミドのどちらの鎖も突然変異（単数または複数）を含有するようなホモ二本鎖分子を作成するように、すぐ上に記述した方法を改変することができる。この改変は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを上述の一本鎖鋳型にアニールさせる。３種類のチオキシリポヌクレオチド（即ちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ））の混合物をｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる改良されたチオ− デオキシリボンドシン（これはアマンヤム・コーポレイションから入手できる）と混合する。

この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異させた塩基以外は鋳型と同一な鎖が生成する。

さらにこの新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含有し、これは制限エンドヌクレアーゼ消化からその鎖を保護するように機能するであろう。

二本鎖になったヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で裂は目を入れた後、その鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼを用いて、突然変異を誘発すべき部位を含有する領域を通過して消化することができる。次に、一部分のみが一本鎖である分子が残るように反応を停止させる。次に４種類すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いることによって完全な二本鎖になったＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。次にこのホモ二本鎖分子を大腸菌ＪＭＩＯＩなどの適当な宿主細胞中に上述の如く導入することができる。

置換すべきアミノ酸が１より多いベータ−８インテグリンサブユニツト突然変異体をコード化するＤＮＡは数種類の方法の１つで作成することができる。それらのアミノ酸がそのポリペプチド鎖中で互いに接近して位置する場合には、所望のアミノ酸置換のすべてをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを突然変異させることができる。しかしそれらのアミノ酸が互いにいくらか離れて位！する場合（約１０アミノ酸以上によって分離されている場合）には、所望の変化のすべてをコード化する１本のオリゴヌクレオチドを作成することがより困難になる。その代わりとして２つの代替方法のいずれかを使用することができる。

第１の方法では、置換すべき各アミノ酸について別個のオリゴヌクレオチドを作成する。次にこれらのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールさせると、その鋳型から合成される第２のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換のすべてをコード化するであろう。

代替的な方法は所望の突然変異体を作成するために２回またはそれ以上の突然変異誘発を伴う。第１回は単一の突然変異体について記述した通りであり、野生型ＤＮＡを鋳型として使用し、第１の所望のアミノ酸置換をコード化するオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、次いでヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。第２回の突然変異誘発では第１回の突然変異誘発で作成された突然変異したＤＮＡを鋳型として使用する。したがってこの鋳型はすでに１またはそれ以上の突然変異を含有している。次に追加の所望のアミノ酸置換（単数または複数）をコード化するヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせると、得られたＤＮＡ鎖は第１回と第２回の突然変異誘発の両方に由来する突然変異をコード化していることになる。この得られたＤＮＡを第３回の突然変異誘発などで鋳型として用いる。

ＰＣＲ突然変異誘発法もベーター８インテグリンのアミノ酸変種を作成するのに適している。以下の議論ではＤＮＡについて述べるが、この技術がＲＮＡにも応用され得ることは理解されるであろう。ＰＣＲ技術とは一般的には下記の操作を意味する（アールリッヒ（上記）、アール・ヒグチによる章、６１〜７０頁）。

少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおける出発物質として使用すると、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーを用いることによって、そのプライマーが鋳型と異なる位置だけが鋳型と異なる特異的なりＮＡ断片を比較的大量に生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、プライマーの１つを、それが突然変異の位置と重複し、その突然変異を含有するように設計する。他方のプライマーはそのプラスミドの反対鎮の配列と同一でなれけばならないが、この配列はプラスミドＤＮＡに沿うどの位置にあってもよい。

しかし、これらのプライマーによって挟まれた増幅されるＤＮＡの全領域が最終的には容易に配列決定することができるように、第２のプライマーの配列が第１のプライマーの配列から２００ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。ここに記述したような一対のプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、プライマーによって指定される突然変異の位置と、鋳型複写かい（らか誤りがちであるのでおそらく他の位置とで異なるＤＮＡ断片の集団をもたらす。

生成物に対する鋳型の比率が極端に低い場合には、生成物ＤＮＡ断片の大部分が所望の突然変異（単数または複数）を組み込む。この生成物を用いて、標準的なりＮＡ技術によって、ＰＣＲ鋳型として機能したプラスミドの対応する領域を置換する。離れた位置にある突然変異は、突然変異第２プライマーを用いるか、あるいは異なる突然変異プライマーを用いて第２ＰＣＲを行い、得られた２つのＰＣＲ断片をベクター断片に三（またはそれ以上）部分連結で同時に連結することによって、同時に導入することができる。

ＰＣＲの特定の例では、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を、そのプラスミドＤＮＡ中の増幅されるべき領域外に唯一の認識部位を持つ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって直線化する。この物質のうち１１００ｎをＰＣＲ緩衝液（この緩衝液は４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸を含有しており、シーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ’）キット（パーキン−エルマー・シータス、コネティカット州ノルウオークおよびカリフォルニア州エメリービルから入手される）に含まれている）の入ったＰＣＲ混合物に加え、各ヌクレオチドブライマー２５ｐｍｏｌを５０μｍの最終体積に加える。この反応混合物に鉱油３５μｍを重層する。この反応液を１００℃で５分間変性させ、短時間氷上に置いた後、サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔ　ａ　ｑ　）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｍ：パーキンーエルマー・シータス、コネティカット州ノルウオークおよびカリフォルニア州エメリービルから購入）１μｌを鉱油層の下に加える。次にこの反応混合物を、下記の如くプログラムしたＤＮＡサーマル・サイクラ−（パーキン−エルマー・ンータスより購入）中に挿入する：２分　５５℃：３０秒　７２℃：次いで下記のサイクルを１９回：３０秒　９４℃：３０秒　５５℃；３０秒　７２℃。

上記プログラムの終了時に、反応バイアルをサーマル・サイクラ−から取り出し、その水層を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０体積比）で抽出し、エタノール沈殿を行い、標準的な手法でそのＤＮＡを回収する。次いで、ベクター中に挿入するために、この物質を適当な処理に付す。

変種を作成するもう１つの方法であるカセット突然変異誘発法はウェルスらが記述した技術（Ｇｅｎｅ、　３４：３１５［１９８５］）に基づく。出発物質は突然変異させるべきベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。突然変異させるべきベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡ中のコドン（単数または複数）を同定する。同定した突然変異部位（単数または複数）の両側には唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上述のオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いてそれらの部位を作成し、それらをベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡ中の適当な位置に導入する。制限部位をプラスミド中に挿入し終えた後、そのプラスミドをこれらの部位で切断することによってそれを直線化する。上記制限部位間のＤＮＡの配列をコード化するが、所望の突然変異（単数または複数）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを標準的な手法を用いて合成する。２つの鏑を個別に合成した後、標準的な技術を用いてそれらを互いにハイブリッド形成させる。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットは、プラスミドに直接連結することができるように、直線化したプラスミドの両末端と適合し得る３°末端および５′末端を有するように設計される。ここに至ってこのプラスミドは突然変異したベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡを含有し天然のベーター８インテグリンサブユニツトまたは変種ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらなるクローニングのため（ＤＮＡの増幅）、あるいは発現のために複製可能なベクター中に挿入する。多くのベクターを利用することができ、適当なベクターの選択は、１）それをＤＮＡ増幅に使用するのか、それともＤＮＡ発現に使用するのかということ、２）ベクター中に挿入されるべきＤＮＡの大きさ、および３）そのベクターによって形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各ベクターはその機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）とそれが適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。ベクター成分には一般に下記成分の１またはそれ以上が含まれるが、それらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上の標識遺伝子、エンハンサ−要素、プロモーターおよび転写終止配列。

（ｉ）シグナル配列成分一般にシグナル配列はベクターの一成分であるか、もしくはベクター中に挿入されるベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡの一部であり得る。天然のプロベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡはそのポリペプチドのアミノ末端（ＤＮＡの５′末端）にシグナル配列をコード化しており、これは該ポリペプチドの翻訳後プロセシングの間に切断されて成熟したベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドを形成する。しかし天然のベーター８インテグリンサブユニツトはそのペプチドのカルボキシル末端近（に膜固定化ドメインを含有するので、天然のベーター８インテグリンサブユニツトは細胞から分泌されない。したがってベーター８インテグリンサブユニツトの分泌型を形成させるために、通常は膜固定化ドメインを含めてその分子のカルボキシル末端を削除する。この先端を削除された変種ベーター８インテグリンサブユニツトボリペプチドは、その先端削除変種をコード化するＤＮＡがアミノ末端シグナル配列を保持している限り、細胞から分泌され得る。

天然のシグナル配列が削除されて異種シグナル配列で置換されているベーター８インテグリンサブユニツトも本発明の範囲に包含される。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されてプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。

天然のベータ−８インテグリンサブユニツトシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核宿主細胞については、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペプチダ −ゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーという群から選択される原核生物シグナル配列で天然のシグナル配列を置換する。酵母分泌については天然のベータ−８インテグリンサブユニツトシグナル配列を酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼリーダーで置換することができる。哺乳類細胞発現では、他の哺乳類シグナル配列も適切であり得るが、天然のシグナル配列で充分である。

（Ｕ）複製の起点成分発現ベクターとクローニングベクターは共に、１またはそれ以上の選択された宿主細胞中でそのベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと（ま独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自律的複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母およびウィルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム陰性菌：こ適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウィルス起点（ＳＶ４０、アデノウィルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞中でのクローニングベクターに有用である。一般的には復製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要でない（ＳＶ４０起点は典型的に使用され得るが、これは単にそれが初期プロモーターを含有しているからに過ぎない）はとんどの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ち、それらのベクターは少なくとも１種類の細胞中で複製することができ、発現のために別の生物中にトランスフェクトすることができるのである。例えばあるベクターを大腸菌中でクローン化し、次いで同じベクターを（宿主細胞染色体と独立して複製することはできないカリ発現のために酵母や哺乳類細胞中にトランスフェクトする。

宿主ゲノム中に挿入することによってＤＮＡを増幅することもできる。これはバチルス種を宿主として使用し、例えばバチルスゲノムＤＮＡ中に認められる配列と相補的なりＮＡ配列をベクター中に含めることによって容易に達成される。

このベクターによるバチルスのトランスフェクションはゲノムとの相同的な組換えとベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡの挿入をもたらす。しかしベーター８インテグリンサブユニットをコード化するゲノムＤＮＡの回収は外因的１こ複製されるベクターの場合より複雑である。なぜならベーター８インテグ１ノンサブユニツトＤＮＡを切り出すためには制限酵素消化が必要だからである。

発現ベクターとクローニングベクターは選択可能標識とも呼ばれる選択遺伝子を含有すべきである。この遺伝子は形質転換された宿主細胞の選択培養培地中での成長または生存にとって必要なタンパク質をコード化する。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は上記培養培地中で生存できないであろう。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例：アンビシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）複雑な培地から利用することができない必須の栄養素を供給するタンパク質（例：バチルスにとってＤ−アラニンラセマーゼをコード化する遺伝子）をコード化する。

選択法の一例では宿主細胞の成長を抑制するために薬物を使用する。異種遺伝子で成功裏に形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、それゆえにその選択法を生き抜くことができる。そのような優性選択の例では薬物ネオマイシン（サザンら、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、＾ｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１　：３２７［１９８２］）、ミコフェノール酸部リガンら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９＋１４２２［１９８０］）またはハイグロ”ｚイシン（サジエンら、　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　５：４１０−４１３［１９８５］）を使用する。

これら上記の二側では適当な薬物（それぞれＧ４１８またはネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）もしくはハイグロマイシン）に対する耐性を伝えるために真核制御下で細菌遺伝子を使用する。

哺乳類細胞に適する選択標識のもう１つの例は、ベーター８インテグリンサブユニツト核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするもの、例えばジヒドロフオレート・レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジン・キナーゼなどである。

その標識を取り込んでいるがゆえに形質転換体のみが唯一生存に適合する選択圧下に哺乳類細胞形質転換体を置く。培地中の選択剤の濃度が連続的に変化するような条件下で形質転換体を培養し、それによって選択遺伝子とベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡの両方の増幅を導くことにより、選択圧をかけることができる。増幅とは、組換え細胞の連続的世代の染色体内で、成長にとって重要なタンパク質の生産がより強くめられる遺伝子が直列して反復されろ過程である。

例えばＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競争的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって最初に同定される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適当な宿主細胞はＤＨＦＲ活性力炊損しているチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、これはウルラウブおよびチェイシン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ＾、　７７：４２１６［１９８０］に記述されているように調製され、増殖される。次に形質転換細胞を増大したレベルのメトトレキセートにさらす。これはＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーの合成を導き、これに付随して、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡなど、発現ベクターからなる他のＤＮＡの複数コピーを導く。この増幅技術は、例えばＭｔｘに対して高度に耐性な突然変異ＤＨＦＲ遺伝子使用すれば、内因的なりＨＦＲの存在にもかかわらず、他の適当な宿主のいずれでも使用することができる（例：ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１　ＣＨＯ−Ｋｌ）。別法として、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびもう１つの選択可能標識（アミノグリコシド３°ホスホトランスフエラーゼ（ＡＰＲ）など）で同時形質転換した宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）を、アミノグリコシド性抗生物質（例：カナマイノン、ネオマイシンまたはＧ４１８）などの選択可能標識のための選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。

酵母での使用に適した選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐＴ中に存在するｔｒｌ）１遺伝子である（ス＋７クコームら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２：３９［１９７９］　；キンゲスマンら、Ｇｅｎｅ、　７：１４１［１９７９コまたはチェンバーら、Ｇｅｎｅ、　１０：１５７［１９８０］）。ｔ　ｒｐｌ遺伝子はトリプトファン中での生育能を欠く酵母の突然変異株（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８５：１２［１９７７］）に選択標識を提供する。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔ　ｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファンの非存在下ての成長によって形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はＬｅｕ２遺伝子を保持する既知のプラスミドによって補完される。

（ｔｖ）プロモーター成分発現ベクターとクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有しており、それがベーター８インテグリンサブユニツト核酸に機能可能に連結している。プロモーターは構造遺伝子の開始コドンの上流（５゛側）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ内）に位置する翻訳されない配列であり、この配列は、それが機能的に連結している特定の核酸配列（ベーター８インテグリンサブユニツトなど）の転写と翻訳を制御する。そのようなプロモーターは典型的には２つの種類、即ち、誘導性と構成性に分類される。誘導性のプロモーターは培養条件の何らかの変化（例：栄養素の存在と非存在あるいは温度の変化）に応答してその制御下にあるＤＮＡからの増大したレベルの転写を開始させるプロモーターである。現在では様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからそのプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡに機能可能に連結される。天然のベータ−８インテグリンサブユニツトプロモーター配列と多くの異種プロモーターは共に、ベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡの増幅および／または発現を管理するために使用することができる。しかし異種プロモーターは一般に天然のベーター８インテグリンサブユニットプロモーターと比較してより高い転写と発現されるベーター８インテグリンサブユニツトのより高い収率を可能にするので、異種プロモーターが好ましい。

原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターにはβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チヤツクら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５：６１５［１９７８］　：ゴエツデルら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８１・５４４［１９７９］）、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）ブロモーター系（ゴエッデルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５１．８：４０５７［１９８０］およびＥＰ３６７７６）、並びに、ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（デボアーら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９８３］）が含まれる。しかしその他の細菌プロモーターも好適である。それらのヌクレオチド配列は公表されているので、当業者は、必要な制限部位を供給するためにリンカ−やアダプターを使用することによって、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡにそれらを機能可能に連結することができる（シーベンリストら、Ｃｅ１ｌ、　２０：２６９［１９８０］）。

細菌系で使用されるプロモーターは一般に、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡに機能可能に連結したシャイン・ダルガノ（Ｓ、Ｄ、）配列をも含有するであろう。

酵母宿主と共に使用するのに適した促進配列には３−ホスホグリセレート・キナーゼ（ヒラチェマンら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　、　２５５：２０７３［１９８０］）または他の解糖系酵素（ヘスら、Ｊ、＾ｄｖ、　Ｅｎｚｙａ＋ｅ　Ｒｅｇ、　、　７：１４９［１９６ｇ］　；ホーランド、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７：S９００［１９７８］）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれる。

生育条件によって転写を制御できるという追加の利点を有する他の酵母プロモーターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド −３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びに、マルトースおよびガラクトース利用の原因である酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適した好適なベクターおよびプロモーターはさらにヒラチェマンら、ＥＰ７３６５７Ａに記述されている。酵母のエンハンサ−も酵母プロモーターと共に有利に使用される。

真核生物のためのプロモーター配列が知られている。実買上すべての真核遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域を有する。多（の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に認められるもう１つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここにＸはいずれのヌクレオチドでもよい。はとんどの真核遺伝子の３゛末端にはＡＡＴＡＡＡ配列があり、この配列はコード配列の３゛末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであるらしい。

これらの配列はすべて好適に哺乳類発現ベクター中に挿入される。

哺乳類宿主細胞におけるベクターからのベーター８インテグリンサブユニツトの転写は、ポリオーマウィルス、家禽ポックスウィルス（１９８９年７月５日に公表されたＵＫ２２１１５０４）、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、牛パピローマウィルス、ニワトリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、そして最も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーター（例、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から得られるプロモーター、熱シヨツクプロモーターから得られるプロモーター、並びに、ベータ−８インテグリンサブユニツト配列に正常に伴っているプロモーター（ただしそのようなプロモーターが宿主細胞系に適合する場合に限る）によって制御される。

ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０制限断片として都合よく入手することができ、その断片はＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有している。フィアースら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３：１１３（１９７８）　；ムリガンおよびバーブ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９：１４２２−１４２７（１９８０）　；バブラキスら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾、　７８ニア３９８−７S０２（１９８１）。ヒトサイトメガロウィルスの即時初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として都合よく入手される。グリーンアウェイら、　Ｇｅｎｅ、　１８：３５５−３６０（１９８２）。牛パピローマウィルスをベクターとして使用することにより哺乳類宿主中でＤＮＡを発現させる系は米国４４１９４４６に開示されている。この系の変法は米国４６０１９７８に記述されている。サル細胞中で免疫インターフェロンをコード化するｃＤＮＡを発現させることについてはグレイら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５：５０３−５０８（１９ｇ２）を、マウス細胞中でヘルペスンンブレックスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡを発現させることについてはレイニスら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９７：５９８−６０１（１９８２）を、マウスおよびウサギの培養細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現についてはカナｍ；およびバーブ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔ！ＳＡ、　７９：５１６６−５１７０（１９８２）を、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡ前記列の発現についてはゴーマンら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９：６７７７−６７８１（１９８２）をも参照のこと。

（Ｖ）エンハンサ−要素成分本発明のベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡの高等真核生物による転写はそのベクター中にエンハンサ−配列を挿入することによってしばしば増大する。エンハンサ−は通常１０〜３００ｂｐのシス作用性のＤＮＡ要素であって、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エン／１ンサーは配向と位置には比較的非依存性であり、転写単位の５°側（ライミンスら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：９９３［１９８１］）および３′側（ラスキーら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　、　３F１１０８［＋９８３］）、イントロン内（バネルジら、　Ｃｅ１１．３３＋７２９［１９８３］、並びに、コード配列自体の中（オスポーンら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　、　４：１２９３［１９８４］）に認められている。現在では哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロティンおよびインスリン）から多くのエンハンサ−配列が知られている。しかし典型的には、真核細胞ウィルスから得られるエン／１ンサーを使用するであろう。その例には、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）のＳ　Ｖ　４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、復製起点の後期側のポリオーマエンハンサ−およびアデノウィルスエンハンサ−が含まれる。真核プロモーターの活性化のための増進要素についてはヤニブ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１７−１８（１９８２）をも参照のこと。ベクター中のベーター８インテグリンサブユニツトＤＮＡに対して５゛側または３′側の位置にエンハンサ−を接合することができるが、プロモーターの５゜側に位置させることが好ましい。

（ｖｉ）転写終止成分真核宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物から得られる有核細胞）中で使用される発現ベクターは転写の停止とそのｍＲＮＡの安定性にとって必要な配列をも含有するであろう。そのような配列は一般に真核またはウィルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５”非翻訳領域と、時には３°非翻訳領域から入手することができる。これらの領域は、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチド分節を含有する。３°非翻訳領域は転写終止部位をも含む。

１またはそれ以上の上記成分を含有する好適なベクターの構築では標準的な連結技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、加工し、所望の形態で再連結して必要なプラスミドを作成する。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析については、連結混合物を用いて大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピンリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析し、および／または、メッシングら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

、　９：３０９（１９８１）の方法またはマキサムら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５：４９９（１９８０）の方法によって配列決定する。

本発明の実施において特に有用なものは、ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡの哺乳類細胞における一時的発現を供給する発現ベクターである。一般に一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次いでその発現ベクターによってコード化されている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率よく複製することができる発現ベクターの使用を伴う。適当な発現ベクターと宿主細胞からなる一時的発現系はクローン化したＤＮＡによってコード化されるポリペプチドの便利な陽性同定を可能にすると共に、そのようなポリペプチドを所望の生物学的または生理学的特性について迅速にスクリーニングすることを可能にする。したがって一時的発現系はベーター８インテグリンサブユニツト様活性を有するベーター８インテグリンサブユニットの類縁体および変種を同定する目的にとって本発明において特に有用である。

組換えを椎動物細胞培養におけるベーター８インテグリンサブユニツトの合成に適合させるのに適した他の方法、ベクターおよび宿主細胞はゲシングら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３：６２０−６２５［１９８１］　：７ンテルら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０−４６［１９７９］　：レビンソンら、ＥＰ１１７０６０およびＥＰ１１７０５８に記述されている。ベーター８インテグリンサブユニツトの哺乳類細胞培養発現にとって特に有用なプラスミドはｐＲＫ５（ＥＰ公開番号３０７２４７）である。

Ｄ宿主細胞の選択と形質転換本明細書においてベクターをクローン化または発現させるのに適した宿主細胞は上述の原核生物、酵母または高等真核細胞である。好適な原核生物にはグラム陰性生物やグラム陽性生物などの真正細菌（例えば大腸菌、枯草菌などのバチルス、緑膿菌などのツユ−トモナス、ネズミチフス菌またはセラチア・マルセサンス）が含まれる。大腸菌Ｂ１大腸菌χ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）などの他の株も好適ではあるが、好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２４９（ＡＴＣＣ３１４４６）である。

これらの例は限定的なものではなく単なる例示である。好ましくは宿主細胞が最小量のタンパク質加水分解酵素を分泌すべきである。別法として、インビトロ・クローニング法（例：　ＰＣＲまたは池の核酸ポリメラーゼ反応）も好適である。

原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物もベーター８インテグリンサブユニットＤＮＡを含有するベクターにとって好適な宿主である。サツカロミセス・セレビシェや一般的なパン酵母は下等真核宿主微生物のなかでは最も一般的に使用されるものである。しかし、他の属、種および株のいくつかも一般的に利用可能で、本発明において有用であり、例えばニス・ボムベ（Ｓ、ｐｏｍｂｅ）　［ビーチおよびナース、Ｎａｔｕｒｅ、２９０＋１４０（１９８１）］　、クルイベ０フイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　［ルーベンコートら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　７３７（１９８３）］　、ヤロウィア（ｙａｒｒｏｖｉａ）［ＥＰ４０２２２６］　、ビチア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　［Ｅ　Ｐ　１８３０７０］、トリコデルマ・レーンア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｉａ）　［Ｅ　Ｐ　２４４２３４〕、ニューロスポラ・クラッヤ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）　［ケースら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７６：５２５９−５２６３（１９７９）］　、およびエイ・ニドユランス（＾、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　［バランスら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｎｕｎ、　、　１１２：２８４−２８９（１９８３）　；チルバー唐轣A　Ｇｅｎｅ、　２６：２０５−２２１（１９８３）　：サルトンら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１：１４７０−１S７４（１９１１１４）］やエイ・ニガー［ケリーおよびハイネス、　ＥｌｉＢＯＪ、　、　４　：４７５−４７９（１９８５）］などのアスペルギラス宿主などである。

グリコジル化されたベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドの発現に適した宿主細胞は多細胞生物から誘導される。そのような宿主細胞は複雑なプロセシングとグリコジル化活性の能力を有する。を椎動物培養に由来するか非を椎動物培養に由来するかにかかわりなく、原則としてどのような高等真核細胞培養でも役に立つ。非を椎動物細胞の例には植物および昆虫細胞が含まれる。例えばスポドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、アエデス・アエジブチ（＾ｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉＸ蚊）、アエデス・アルボビクツス（＾ｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）宿主細胞から数多くのバクロウィルス株と変種および対応する許容昆虫細胞が同定されている。

例えばルコウら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

６：４７−５５（１９８８）　；ミラーら、　ｒＧｅｎｅｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪ　（セトロウ、ジェイ・ケイら編。

第８巻、プレナム・パブリッシング、　１９８６）中の２７７〜２７９頁、マエダら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照のこと。

そのような様々なウィルス株は公に利用可能であり（例、アウトグラフ７’カリフオルニカＮＰＶ（＾ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＮＰＶ）のＬ１変種およびボムビクス・モリのＢｍ−５株）、そのようなウィルスを本発明に従って本発明でのウィルスとして（とりわけスポドブテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに）使用することができる。

綿、トウモロコン、ジャガ芋、大豆、ツクバネアサガオ、トマトおよびタバコの植物細胞培養を宿主として使用することができる。典型的には、予めベーター８インテグリンＤＮＡを含有するように操作しておいた細菌アグロバクテリウム・ツメファシェンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のいくつかの株と共にインキュベートすることによって植物細胞をトランスフェクトする。植物細胞培養をエイ・ツメファシェンスと共にインキュベートする間にベーター８インテグリンをコード化するＩ）ＮＡが植物細胞宿主に移送されることによってそれがトランスフェクトされて、適当な条件下でベーター８インテグリンＤＮＡを発現させるであろう。

さらに植物細胞に適合する調節およびシグナル配列も利用することができ、それらは例えばツバリン・ノンターゼ・プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列である。デビッカーら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　、　１　：５６１（１９ｇ２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流域から単離されたＤＮＡ分節も組換えＤＮＡ含有植物組織における植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増大させることができる。

１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ３２１１９６を参照のこと。

しかし、最も興味を集めてきたものはを椎動物細胞であり、を椎動物細胞の培養中での増殖（組織培養）が近年に日常的な手法となった［　ｒＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＪ　（アカデミツク・プレス、クルセおよびパダーリン編（１９７３）］。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系（ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、ヒト胚腎臓系（２９３または懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、グラハムら、　Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　、　３６：５９［１９７１］）、幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ウルラウブおよびチェシン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：４２１６０９８０］）、マウスセリトーり細胞（ＴＭ３．７ザー、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　。

２３：２４３−２５１　［１９８０コ）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ　７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ− １５８７）、ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４）、バッファローラノド肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８．ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ　８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ　０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（マザーら、＾ｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　３８３：４４−６８［１９８２］）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌細胞系（Ｈｅｐ　Ｇ２）である。好ましい宿主細胞はヒト胚腎臓２９３細胞およびチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞である。

宿主細胞を上述した本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクト（好ましくは形質転換）し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、もしくは所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するのに適するように改変した従来の栄養培地中で培養する。

トランスフェクションとは宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味し、何らかのコード配列が実際に発現されるかどうかにかかわらない。当業者には数多（のトランスフェクション法が知られており、例えばＣａＰＯ，およびエレクトロポレーションなどである。トランスフェクションの成功は一般にこのベクターの機能の何らかの指標が宿主細胞内で起こる時に認識される。

形質転換とは、ある生物にＤＮＡを導入することであって、そのＤＮＡが染色体外要素として、あるいは染色体統合によって、複製可能であるような導入を意味する。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、その細胞に適した標準的な技術を用いて行われる。サムプルツクら（上記）の１８２章に記述されているような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、一般に原核生物や強固な細胞壁境界を含有する他の細胞に用いられる。アグロバクテリウム・ツメファシェンスによる感染は、シャクら、Ｇｅｎｅ、２３：３１５（１９８３）と１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ３９１０５８５９に記述されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。上述のような細胞壁を持たない哺乳類細胞については、サムプルツクら（上記）の１６．３０〜１６．３７章に記述されているリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な側面はアレマウスらが１９８３年８月１６日に発効した米国４３９９２１６に記述している。酵母への形質転換は典型的にはファン・ゾーリンゲンら、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　、　１３０：９４６（１９７７）とシャオら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかし核注射、エレクトロポレーションあるいはプロトプラスト融合など、細胞にＤＮＡを導入する他の方法も使用することができる。

（以下余白）Ｅ、宿主細胞の培養本発明のベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドを生産するために使用する原核細胞を、サムプルツクら（上記）に一般的に記述されているような適当な培地中で培養する。

本発明のベーター８インテグリンサブユニツトを生産するために使用する哺乳類宿主細胞は様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（シグマ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］　、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）およびダルベツコ変法イーグル培地（［ＤＭＥＭ］　、シグマ）などの市販の培地は上記宿主細胞の培養に適しティる。さらに、ハムおよびワラス、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　、　５８：４４（１９７９）、バーンズおよびサトー、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　、　１０２：２５５（１９８０）、米国４７６７７０４．４６５７８６６．７９２７７６２または４５６０６５５、Ｗ０９０１０３４３０、ＷＯ３７゜００１９５または米国特許Ｒｅ、３０９８５に記述されている培地はいずれも上記宿主細胞のための培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは表皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンやチミジンなど）、抗生物質（ジエンタマイシン（Ｇｅｎｔａ＋ｍｙｃｉｎ”）薬物など）、微量元素（通常はμＭ範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）およびグルコースや等価なエネルギー源を補足することができる。また他の必要ないずれの補足物も当業者が知っているであろう適当な濃度で加えることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞について過去に用いられた条件であり、当業者には明白であろう。

この開示で言う宿主細胞はインビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内にある細胞をも包含する。

本発明のベーター８インテグリンサブユニツトを相同組換えによって生産し得ること、あるいは、ベーター８イ：ノテグリンをコード化するＤＮＡを既に含有している細胞中に導入されるこの分野で現在使用されている制御要素を利用する組換え生産法によって生産し得ることもさらに予期されることである。例えば強力なプロモーター／エンハンサ−要素、サプレッサーまたは外因的転写変調要素を、所望のベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡの転写に影響を与えるに足る近さと配向で意図する宿主細胞のゲノム中に挿入する。制御要素は本発明のベーター８インテグリンサブユニツトをコード化しないが、宿主細胞のゲノム中に存在するＤＮＡである。次いで、所望に応じて、本発明のベーター８インテグリンサブユニツトを生産する細胞、あるいは発現レベルの減少または増大に関してスクリーニングする。

Ｆ遺伝子増幅７允現の検出試料中の遺伝子の増幅および／または発現は、例えば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を提供するためのノーザンブロッティング（トーマス、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：５２０１−５２０５［１９８０］）、ドツトブロッティング（ＤＮＡ分析）、あるいは原位置ハイブリッド形成などによって、本明細書に開示する配列に基づき、適切に標識されたプローブを用いることによって直接測定することができる。

様々な標識を使用することができるが、最も一般的なものは放射性同位体、とりわけ３２ｐである。しかし、ポリヌクレオチド中へ導入するためにビオチン修飾核酸を使用することなど、他の技術を使用することもできる。次いでこのビオチンはアビジンまたは抗体に対する結合の部位として機能し、このアビジンや抗体は例えば放射性核種、蛍光剤、酵素などの様々な標識で標識することができる。

別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗体を使用してもよい。次いでこの抗体を標識することができ、上記二本鎖が表面に結合して、表面上での二本鎖の形成時にその二本鎖に結合している抗体の存在が検出できるような検定法を行うことができる。

別法として、免疫学的方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色や細胞培養または体液の検定法などによって、遺伝子産物の発現を直接定量するために、遺伝子発現を測定することもできる。免疫組織化学染色技術の場合、典型的には脱水と固定によって細胞試料を調製し、次いで結合した遺伝子産物に特異的な標識化抗体と反応させる。ここで用いる標識は通常、例えば酵素標識、蛍光標識、発光標識など、視覚的に検出可能なものである。本発明での使用に適した特に感度の高い染色技術はシュら、　Ａａ＋、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、　、　７５：　７３４−７３８（１９８０）に記述されている。

免疫組織化学的染色および／または試料液の検定に有用な抗体はモノクローン性であってもポリクローン性であってもよ（、どのような哺乳動物中でも調製することができる。好都合なことに、天然のベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドに対して、あるいは下記第４章に記述するように本明細書に記載のＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して抗体を調製することができる。

Ｇ、ベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドの調製ベーター８インテグリンサブユニツトは、分泌シグナルを伴わずに直接発現される場合には宿主細胞溶解液から回収することもできるが、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収することが好ましい。

正常にアルファインテグリンサブユニットを生産する培養細胞（２８３細胞など）中でベーター８インテグリンサブユニツトを生産する場合、しばしばそのアルファサブユニットとベータサブユニットが複合体に会合していることがわかるであろう。この複合体は膜中、細胞の細胞質中、あるいはそれが機能的なシグナル配列と共に発現される先端の欠失したベーター８インテグリンサブユニツトである場合には細胞培養培地中に認めることができる。精製を目的として、その複合体をＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたは他のカルシウムおよびカチオンキレート剤で処理することによって、アルファサブユニットとベータサブユニットを互いに分離することができる。アルファ／ベータ−８インテグリン複合体を崩壊させる場合、各サブユニットの三次構造に何らかの変化が起こり得、これらの変化が各サブユニットの生物学的活性に影響を与えることがある。アルファサブユニットを生産しない宿主細胞を選択するか、あるいはベータ−８インテグリン断片で宿主細胞をトランスフェクトすることによって、複合体の形成を避けることができるであろう。

ベーター８インテグリンサブユニツトがヒト起源の細胞以外の組換え細胞中で発現される場合には、そのベーター８インテグリンサブユニツトはヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを全く含有しない。しかし、ベーター８インテグリンサブユニットに関して実質上均一な調製物を得るためには、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからベーター８インテグリンサブユニツトを精製する必要がある。第１段階として、培養培地または溶解液を遠心分離することにより粒子状細胞残渣を除去する。次に膜画分と可溶性タンパク質画分を分離する。次に、そのベーター８インテグリンサブユニツトが膜結合性であるか否かに応じて、培養溶解液の可溶性タンパク質画分および膜画分からベーター８インテグリンサブユニツトを精製することができる。下記の手法は適切な精製手法の具体例である：免疫アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ，ンリカまたはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過、ＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロティンＡセファロースカラム。

残基が欠失、挿入または置換されているベータ−８インテグリンサブユニツト変種は、その変種が引き起こす特性の大きな変化を考慮に入れて、天然のベーター８インテグリンサブユニツトと同じ方法で回収される。例えば別のタンパク質またはポリペプチド（例　細菌またはウィルス抗原）を伴うベータ−８インテグリンサブユニツト融合物の調製は精製を容易にする：その融合物を吸着させるためにその抗原に対する抗体を含有する免疫アフィニティーカラムを使用することができる。ウサギポリクローナル抗ベーター８インテグリンサブユニットカラムなどの免疫アフィニティーカラムを利用して、少なくとも１つの残存する免疫エピトープにそれを結合させることによってベータ−８インテグリンサブユニツト変種を吸収することができる。精製中のタンパク質加水分解による分解を阻害するために、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害因子も有用であり、付随的な混入物の発達を防止するために抗体を含めてもよい。組換え細胞培養における発現時のベーター８インテグリンサブユニツトの特性の変化を説明するために、天然のベーター８インテグリンサブユニツトに適した精製法を改変する必要があり得ることは当業者には理解されるであろう。

Ｈ，ベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドの共有結合的修飾ベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。天然のベーター８インテグリンサブユニツトとベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列変種の両方を共有結合的に修飾することができる。本発明に包含される共有結合的修飾の一つの種類はベーター８ンテグリンサブユニツトポリペプチド断片である。約４０アミノ酸残基までを有するベータ−８インテグリンサブユニツト断片は化学合成によって、あるいは全長ベーター８インテグリンサブユニツトまたはベータ−８インテグリンサブユニツト変種ポリペプチドの酵素的または化学的切断によって、便利に調製することができる。

ベーター８インテグリンサブユニツトまたはその断片の共有結合的修飾の他の種類は、ベーター８インテグリンサブユニツトまたはその断片の標的にしたアミノ酸残基を、選択した側鎖もしくはＮ末端またはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによってその分子中に導入される。

最も一般的には、システイニル残基をα−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸やクロロアセタミドと反応させることによって、カルボキンメチルまたはカルボキノアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はプロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２− ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロノルクリ−ニトロトロフェノールまたはクロロ−７− ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基はｐＨ５，５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。なぜならこの試薬はヒスチジル側鎖に特異的だからである。パラーブロモフエナンルブロミドも有用であり、その反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６，０）中で行われる。

リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷の反転という効果を持っている。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル、ピリドキサルホスフエエート、ピリドキサール、クロロポロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ− メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応が含まれる。

アルギニル残基は１または数種類の従来の試薬との反応によって修飾され、それらの試薬にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンンオンおよびニンヒドリンなどがある。アルギニン残基を誘導体化する際には、そのグアニジン官能基の高いｐＫ、ゆえに、その反応をアリカリ性条件下で行う必要がある。さらにこれらの試薬はアルギニンのイプシロン−アミノ基とチロノン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシン残基中に分光標識を導入するという特別な目的をもって行うことができる。最も一般的にはＮ−アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロンル種と３−二トロ誘導体を形成させる。チロジル残基は、放射線免疫検定法用に標識されたタンパク質を調製するために１２６１または＋３１　■を用いてヨウ素化され、上述のクロラミンＴ法が好適である。

カルボキシル基鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ’ 　−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　、ここにＲとＲ′は異なるアルキル基を表す）、例えば１−クロロへキ／ルー３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどとの反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。

二官能性試薬による誘導体化は、抗ベーター８インテグリンサブユニット抗体を精製する方法で使用するために水不溶性の支持基盤または表面にベーター８インテグリンを架橋するのに有用であり、その逆もまた同じである。一般的に使用される架橋剤には例えば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３°−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのンスクシンイミジルエステルを含むホモニ官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオコブロビオイミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を与える。別法として、臭化ジアゾ活性化炭水化物および米国３９６９３８７．３６９１０１６．４１９５１２８．４２４７６４２４２２９５３７および４３３０４４０に記述されている反応性基質をタンパク質の固定化に使用することができる。

グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしばそれぞれ対応するグルタミル残基とアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいはこれらの残基を穏やかな酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。

他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシルのリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖ノ α−アミノ基のメチル化（ティ・イー・フレイト：／　ｒＰｒｏｔｅｉｎ　：　５ｔｕｒｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＰｒｏｐｅｒｔｉｅＪ　（タフリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー、サンフランシスコ）の７９〜８６頁０９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

本発明の範囲に包含されるベーター８ポリペプチドの共有結合的修飾のもう１つの種類はこのポリペプチドの天然のグリコジル化様式を改変することからなる。

改変とは、天然のベーター８中に認められる１またはそれ以上の炭水化物の削除、および／または、天然のベーター８ポリペプチドには存在しない１またはそれ以上のグリコジル化部位の付加を意味する。

ポリペプチドのグリコジル化は典型的にはＮ−結合型または〇−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とはアスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合していることを意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここにＸはプロリン以外のあらゆるアミノ酸を表す）はアスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合にとっての認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコジル化部位を作り出す。〇−結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンや５−ヒドロキシリジンも使用できるが、最も一般的にはセリンまたはスレオニン）に対する、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのひとつの結合を意味する。

ベーター８インテグリンポリペプチドに対するグリコジル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列の１またはそれ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位について）。

天然のベータ−８インテグリンサブユニツト配列に１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加するか、それらの残基で置換することによっても、この改変を施すことができる（〇−結合型グリコシル化部位について）。容易のために、ベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列をＤＮＡレベルでの変化によって、とりわけベーター８インテグリンサブユニツトボリベブチドをコード化するＤＮＡを予め選択した塩基で突然変異させて所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンを作成することによって、改変することが好ましい。「ベーター８インテグリンサブユニツトポリベブチドのアミノ酸配列変種」と題した項で上述した方法を用いてＤＮＡ突然変異（単数または複数）を作成することができる。

ベーター８ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増大させるもう１つの手段は、このポリペプチドに対して化学的または酵素的にグリコシドを結合させることによる。これらの手法は、Ｎ−および〇−結合型グリコンジルに関してグリコジル化能を有する宿主細胞中で該ポリペプチドを生産する必要がないという点で有利である。使用する結合様式に応じて、糖（単数または複数）を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（Ｃ）システィンのスルフヒドリル基などの遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基などの遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ３７１０５３３０とアブリンおよびリストン、　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　、　２５９−３０６頁［１９８１］に記述されている。

天然のベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチド上の炭水化物部分の除去は化学的もしくは酵素的に達成され得る。化学的脱グリコジル化の場合、化合物トリフルオロメタンスルホン酸や等価な化合物に該ポリペプチドをさらす必要がある。この処理は結合糖（Ｎ−７セチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどの糖もしくはすべての糖の切断をもたらすが、ポリペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコジル化はハキマツディンら（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　２５９：５２［１９８７］）およびエツジら（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ　、　１１８：１３ｔm１９８１］）に記述されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、ホタクラら（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、　１３８：３５０［１９８７］）が記述しているように様々なエンドグリコシダーゼとエキソグリコンダーゼを使用することによって達成し得る。

ダスキンら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５７：３１０５［１９８２］）が記述している化合物ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の使用によって、潜在的グリコジル化部位でのグリコジル化を防止することができる。ツニカマイシンはタンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。

ベーター８インテグリンサブユニツトの共有結合的修飾のもう１つの種類は、米国４６４０８３５．４４９６６８９．４３０１１４４．４６７０４１７．４７９１１９２または４１７９３３７に説明されている方法で、ベーター８インテグリンサブユニツトボリペプチドを様々な非タンパク質ポリマー（例、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキンアルキレン）に連結させることからなる。

例えばコアセルベージ３ン技術や界面重合（それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポ１バメチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、あるいはマクロエマルジョン中にベーター８インテグリンサブユニツトを封入することもできる。そのような技術はｒ　Ｒｅ＋ｅｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＪ　（第１６版、オソル、エイ編、１９８０）に開示されている。

またベーター８インテグリンサブユニツト調製物は、抗体を生成させる際に、あるいはベーター８インテグリンサブユニツトについての検定における標品として（例：放射線免疫検定法、酵素結合免疫検定法または放射線受容体検定法において標品として使用するためにベーター８インテグリンサブユニツトを標識することによって）、アフィニティー精製技術において、また放射性ヨウ素、酵素、発蛍光団、スピンラベルなどで標識されている場合には競争型受容体結合検定法において有用である。

変種ベーター８インテグリンサブユニツトの特性を前辺て予測することはしばしば困難であるので、最適な変種を選択するためには回収した変種の何らかのスクリーニングが必要になるであろうことは理解されるであろう。例えば、ある与えられた抗体に関する親和性などのベータ−８インテグリンサブユニツト分子の免疫学的特性の変化は、競争型免疫検定法によって測定される。同じ検定法で天然のベーター８インテグリンサブユニツトについて観測される活性との比較によってその活性の抑制や増進の変化を検定する。タンパク質またはポリペプチド特性（例えば酸化還元安定性や熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解的分解に対する感受性あるいは担体との会合傾向もしくは多量体への会合傾向など）の他の潜在的改変は当該技術分野でよく知られている方法によって検定される。

３、ベーター８インテグリンの医薬的組成物とその投与ベーター８インテグリンサブユニツトの医薬製剤は、所望の純度を有するベーター８インテグリンサブユニツトを生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒａ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（上記））と混合することによって、凍結乾燥ケーキか水性溶液の形態で保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は使用される投与量および濃度で受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、三糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオンおよび／またはツウイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

インビボ投与に使用されるべきベーター８インテグリンサブユニツトは滅菌状態でなければならない。これは凍結乾燥および再構成の前もしくは後に滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。ベーター８インテグリンサブユニツトは通常は凍結乾燥された形態か溶液状で保存されるであろう。

医薬的なベータ−８インテグリンサブユニツト組成物は一般に滅菌注入口を有する容器、例えば静脈内バックや皮下注射針によって突き刺すことができる蓋をもつバイアルなどの中に入れられる。

ベーター８インテグリンサブユニツトまたはベータ−８インテグリンサブユニツト抗体を投与する経路は、例えば静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または外傷内経路による注射または注入、あるいは後述する徐放性系によるなど、既知の方法に従って行われる。ベータ−８インテグリンサブユニツト抗体も同じ様式で、あるいは血流またはリンパ中に投与することによって、投与される。

徐放性調製物の好適な例には、成型品の形態（例・フィルムまたはマイクロカブセル）にある半透過性ポリマー基盤が含まれる。徐放性基盤にはポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国３７７３９１９、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸ガンマエチルの共重合体（シトマンら、　ｔｔｉｏｐｏｔｙ■ｅｒｓ、２２：５４７−５５６［１９８３］）、ボ１バ２−ヒドロキシエチルーメタクリレート）（ランガーら、Ｊ、　Ｂｉｏｌｅｄ、　Ｒｅｓ、　、　１５：１６７−２７７［１９８１］およびランガー、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　、　１２：９ｇ−１０５［１X８２］）、エチレンビニルアセテート（ランガーら（上記））またはポリ−Ｄ−（−）−３− ヒドロ！ンラク酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。徐放性ベータ−８インテグリン組成物にはリポソームに封入したベーター８インテグリンサブユニトも含まれる。ベーター８インテグリンサブユニツトを含有するリポソームはそれ自体は既知の方法によって調製される：ＤＥ３２１８１２１、エプスタインら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２：３６８８−３６９２（１９８５）　；　’７　：／グら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：Sθ３０−４０．３４（１９８０）＋ＥＰ５２３２２、ＥＰ３６６７６、ＥＰ８８０４６、ＥＰ１４３９４９、ＥＰ１４２６４１、日本国特許出願８３００１１８００８、米国４４８５０４５お。

よび４５４４５４５、ＥＰ１０２３２４゜通常リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％以上であるが、選択される比率は最適なベーター８インテグリンサブユニツト療法のために調節される。

本発明のもう１つの使用はベーター８インテグリンサブユニツトボリペプチドの小脳の分子層への顆粒細胞の移動などの細胞移動を調節する際に使用することができる。さらに創傷の治癒中や腫瘍の浸潤中の細胞移動をこれらの製品を用いて変調させることができる。

治療的に使用すべきベーター８インテグリンサブユニツトの有効量は、例えば治療する対象、投与経路および患者の状態などに依存するであろう。したがって治療者は投与量を滴定し、必要に応じて投与経路を変更することによって最適な治療効果を得る必要があるであろう。典型的な日用量は上記の因子に応じて約１μ ｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上までにわたるかもしれない。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果を達成する量に至るまでベーター８インテグリンサブユニツトを投与するであろう。この療法の進歩は従来の検定法によって容易に監視できる。

４、ベータ−８インテグリンサブユニツト抗体の調製一般にベーター８インテグリンサブユニツトとアジュバントの複数回の皮下（ＳＣ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、ベーター８インテグリンサブユニツトに対するポリクローナル抗体を動物中で生じさせる。二官能性試薬または誘導体化試薬（例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システィン残基による結合）、Ｎ− ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、５ＯＣＩ！またはＲＩＮ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１は異なるアルキル基を表す））を用いることによって、ベーター８インテグリンサブユニツトまたは標的アミノ酸配列を含有する断片を、免疫化する種牛で免疫原性であるタンパク質（例：キーホール・リムベット・ヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリンまたは大豆トリプシン阻害因子）に結合させることが有用であり得る。

１ｍｇまたは１ｇｇの複合体（それぞれウサギまたはマウス）を３体積のフロイント完全アジュバントと混合し、その溶液を複数部位の陵内に注射することによって、動物を免疫原性複合体または誘導体に対して免疫化する。１力月後に、元の量の１１５〜１／１０のフロイント完全アジュバント中の複合体を用いて複数部位に皮下注射することによって動物を追加免疫する。７〜１４日後に動物から採血し、その血清を抗ベーター８インテグリン力価について検定する。力価が平坦になるまで動物を追加免疫する。好ましくは同じベーター８インテグリンサブユニツトの複合体で追加免疫するが、異なるタンパク質に結合させてもよく、かつ／または、異なる架橋剤によって結合させてもよい。組換え細胞培養中でタンパク質融合物として複合体を作成することもできる。また、免疫応答を増進させるためには明響などの凝集剤を用いる。

免疫化した動物から膵臓細胞を回収し、従来の方法で（例えば骨髄腫細胞との融合によって、あるいはエプスタイン−バー（Ｅ　Ｂ）ウィルス形質転換によって）その細胞を不死化し、所望の抗体を発現させるクローンをスクリーニングすることによってモノクローナル抗体を調製する。このモノクローナル抗体は好ましくは他の既知のベータインテグリンサブユニットポリペプチドと交差反応しない。

５ベーター８インテグリンおよびその抗体の使用ベーター８インテグリンサブユニツトをコード化する核酸を、組織特異的分類のための診断剤として使用することができる。例えば原位置ハイブリッド形成やノーザンブロツティングおよびサザンブロッティング並びにＰＣＲ分析などの手法を用いることによって、評価される細胞型（単数または複数）中にベーター８インテグリンサブユニツトをコード化するＤＮＡおよび／またはＲＮＡが存在するか否かを決定することができる。具体的には、該核酸はある種の腫瘍細胞（例えば脳腫瘍、グリオーム、起源がニューロン性である他の腫瘍細胞およびいくつかの他の非ニューロン性癌腫（腺癌、骨癌腫および肺癌腫など））に関する特異的プローブとして有用であり得る。ベーター８インテグリンサブユニツトの核酸配列またはポリペプチド配列に基づくプローブを用いて新規なベータインテグリンサブユニットの位置を特定することもできる。

単離されたベーター８インテグリンサブユニツトボリペプチドを定量的な診断的検定法での標品または対照として使用することができ、これに対して未知量のベーター８インテグリンサブユニツトを含有する試料を比較することができる。

ベータ−８インテグリンサブユニツト抗体は特定の細胞又は組織におけるベータ −８インテグリン発現に関する診断的検定法で有用である。上述したベーター８インテグリンサブユニツトと同じ様式で抗体を標識し、かつ／または、不溶性基盤上に固定化する。

ベータ−８インテグリンサブユニツト抗体は、組換え細胞培養もしくは天然の供給源からベーター８インテグリンサブユニツトをアフィニティー精製する際にも有用である。他のベータインテグリンサブユニットと検出可能なほどには交差反応しないベータ−８インテグリンサブユニツト抗体を用いて、他の既知のべ一タインテグリンを含有しないベーター８インテグリンサブユニツトを精製することができる。

ベーター８インテグリンサブユニツトとその抗体に関する好適な診断的検定法それ自体はよく知られている。このような検定法には競争的検定法、サンドイッチ検定法および立体的阻害検定法が含まれる。競争的検定法とサンドイッチ検定法ではその方法の必須部分として相分離段階を使用するが、立体的阻害検定法は単一の反応混合物で行われる。検定される物質の分子量に応じである種の方法が好まれるであろうが、基本的にはベーター８インテグリンサブユニツトの検定とベーター８インテグリンサブユニツトを結合する物質には同じ手法が用いられる。

したがって本明細書では、それが抗原であるか抗体であるかにかかわらず試験される物質を分析物と呼び、それらが抗体であるか、細胞表面受容体であるか、あるいは抗原であるかにかかわらず、その分析物に結合するタンパク質を結合相手と呼ぶ。

ベーター８インテグリンサブユニツトまたはその抗体に関する分析法はすべて、下記の試薬のうちの１または複数を使用する二標識された分析物類縁体、固定化された分析物類縁体、標識された結合相手、固定化された結合相手および立体的複合体。標識された試薬は「トレーサー」としても知られている。

使用される標識（これはプローブとして使用するためにベーター８インテグリンサブユニツト核酸を標識する際にも有用である）は、分析物とその結合相手の結合を妨害しないものであれば、どのような検出可能な官能基であってもよい。数多くの標識が免疫検定法での使用について知られており、その例には直接検出することができる部分（蛍光発色団、化学発光標識および放射能標識）と、検出するためには反応または誘導体化しなければならない部分（酵素など）が含まれる。そのような標識の例には、放射性同位体３２ｐ、＋４０．＋２３■、３）（および１３１１１発蛍光団（粘土酸化物キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルなど）、アンベリフェロン、ルシフェラーゼ（例：ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６））、ルシフニリン、２．３−ジヒドロフタルアジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼなど）と共役させた複素環オキシダーゼ（ウリカーゼやキサンチンオキシダーゼなど）、糖類オキシダーゼ（例−グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離基などが含まれる。

これらの標識をタンパク質またはポリペプチドに共有結合させるためには従来法を利用することができる。例えばジアルデヒド、カルボジイミド、シマレイミド、ビスイミデート、ビスジアゾ化ベンジジンなどの結合試薬を用いて上述の蛍光、化学発光および酵素標識で抗体を標識することができる。例えば米国特許第３９４０４７５号（蛍光測定）および第３６４５０９０号（酵素）、ハンターら、Ｎａｔｕｒｅ、　１４４：９４５（１９６２）、ディピッドら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１３：１０１４−１０２１（１９７４）、ペインら、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｌｏＭｅｔｈｏｄｓ、　４０：２１９−２３０（１９８１）、ナイグレン、　Ｊ、　Ｉ（ｉｓｔｏｃｈｅＩＩｌ、@ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　３０：４０７−４］２（１９８２）を参照のこと。本明細書において好ましい標識は西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素である。酵素を含む上記の標識を抗体に結合させることは免疫検定技術の当業者には標準的な操作法である。例えばオサリバンら［酵素免疫検定法で使用する酵素−抗体複合体の調製法（原題：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ刀@ｆｏｒＬ！ｓｅ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）Ｊ　（ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　）ｘイ“ンエイ０ラ塔S ンおよびエイチ・ファン・フナキス編、第７３巻（アカデミツク・プレス、ニューヨーク、　＋９８１）の１４７〜１６６頁を参照のこと。このような結合法は、すべてタンパク質性であるベーター８インテグリンまたはその断片での使用に適している。

ある種の検定法では試薬の固定化が必要である。固定化には、溶液中に遊離して残っている分析物から結合相手を分離することが伴う。これは従来から、検定法の前に結合相手か分析物類縁体のいずれかを不溶化することによって、水不溶性の基盤または表面への吸着によって（ベニツヒら、米国３７２０７６０）、（例えばグルタルアルデヒド架橋を用いて）共有結合することによって、もしくは相手または類縁体を（免疫沈降などによって）後で不溶化することによって達成される。

競争的検定法またはサンドイッチ検定法として知られている他の検定法は充分に確立されており、商業的な診断薬産業において広く用いられている。

競争的検定法は、共通する結合相手上の限られた数の結合部位について試験試料分析物と競争するというトレーサー類縁体の能力によっている。結合相手は一般に競争の前または後に不溶化され、次いで結合相手に結合したトレーサーおよび分析物を未結合のトレーサーおよび分析物から分離する。この分離はデカンテーションすることによって（結合相手が予め不溶化されている場合）あるいは遠心分離によって（結合相手が競争反応後に沈殿された場合）達成される。試験試料分析物の量は、標識物質の量によって測定される結合したトレーサーの量に逆比例する。既知量の分析物を用いて服量一応答曲線を調製し、試験結果と比較することによって試験試料中に存在する分析物の量を定量的に決定する。これらの検定法は酵素を検出可能な標識として使用する場合にはＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。

「均一」検定法と呼ばれるもう１つの種類の競争的検定法は相分離を必要としない。ここでは、抗分析物が分析物に結合したときに、抗分析物の存在が酵素活性を変化させるように酵素と分析物の複合体を調製し、使用する。この場合、ベーター８インテグリンサブユニツトまたはその免疫学的に活性な断片を二官能性有機橋でペルオキシダーゼなどの酵素に結合させる。抗ベーター８インテグリンの結合が標識である酵素の活性を阻害もしくは強化するように、抗ベーター８インテグリンサブユニットと共に使用するための複合体を選択する。この方法自体はＥＭＩＴという名称で広〈実施されている。

立体的複合体は均一検定のための立体的障害法において使用される。これらの複合体は、ハブテンに対する抗体が実質上杭分析物と同時には複合体に結合できないように低分子量のハブテンを小さい分析物に共有結合させることによって合成される。この検定法では試験試料中に存在する分析物が抗分析物を結合し、それによって抗ハプテンが複合体に結合することを可能にし、複合体ノーブテンの特性の変化（例：ハブテン発蛍光団である場合には蛍光の変化）をもたらす。

サンドイッチ検定法はベーター８インテグリンサブユニツトまたはベータ−８インテグリンサブユニツト抗体の決定にとりわけ有用である。逐次的サンドイッチ検定法では固定化した結合相手を用いて試験試料分析物を吸着し、試験試料を洗浄などによって除去し、結合した分析物を用いて標識した結合相手を吸着し、次いで結合した物質を余ったトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は試験試料分析物に直接比例する。「同時」サンドイッチ検定法では、標識した結合相手を添加する前に試験試料を分離しない。抗ベーター８インテグリンサブユニットモノクローナル抗体を１つの抗体として使用し、ポリクローナル抗ベーター８インテグリンサブユニット抗体をもう１つの抗体として使用する逐次的サンドイッチ検定法はベーター８インテグリン活性について試料を試験する際に有用である。

上の記述はベーター８インテグリンと抗体に関する診断的検定法の具体例に過ぎない。これらの分析物を測定するためにここで開発された方法もしくは今後開発される方法は、上述の生物検定法を含めて本発明の範囲に包含される。

以下の実施例は例示を目的とするものであって、限定を目的とするものではない。

（以下余白）実施例１　ウサギおよびヒトベーター８インテグリンのクローニングおよび配列最初にベーター８インテグリンを、下記の方法で構築したウサギ胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。グアニジウムチオシアナート抽出法［マクドナルドら（ＭｃＤｏｎａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。、　１５２＋２１９（１９８７）］によってウサギ胎胎盤縁から全ＲＮ　Ａ　（ｔｏｔａｌＲＮ　Ａ）を単離した。ＭＡＰペーパー（＾ｍｅｒｓｈａｓＣｏｒｐ、　）を用いて胎盤全ＲＮＡ２ｆｆｉｇからＰｏ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡを精製した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてＰｏ１ｙ（＾）”ＲＮＡから２本鎮ｃＤＮＡを合成した。２−３キロ塩基対以上のｃＤＮＡ断片を５％ポリアクリルアミドゲルで精製し、標準的な手法でＥｃｏＲＩリンカ−と結合させた。結合したｃＤＮＡをラムダｇｔｌ　Ｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングした。

最初に、オリゴ（ｄＴ）でプライムしたウサギ胎盤ライブラリー（未増幅）の約１．６　ｘ　１０’組換えファージを３個の３２ｐ−標識プローブでスクリーニングした。第１のプローブはベーター１、ベーター２およびベータ−３インテグリン間で保存されている９７ヌクレオチドの内、５４ヌクレオチドを有する公開されたプローブであり、ウサギおよびヒトのベーター１、ベーター３およびベーター５インテグリンサブユニツトとハイブリダイズすることが知られている。このプローブは配列：ＡＡＧＣＡＧＡＧＴＧ　ＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡ　ＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧ　ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴ　ＧＴＧＡＴＧＡＡＡＡ　ＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧ　（ＳＥＱ、［）、Ｎｏ、１）［このプローブは、マツクリーンら（ＭｃＬｅａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５＋１７１２６　（１９９０）で１ｎｔｂ　５と命名されている］。この第１オリゴヌクレオチドプローブは、あらゆる既知のベータインテグリン内でＤＮＡレベルで保存されているヒトベータ−３インテグリンサブユニツト配列で構成されている。

さらに、ウサギベーター１インテグリンサブユニツトとウサギベーター５インテグリンとをコードするプローブを、これらのより豊富なベータインテグリン類をコードする陽性物質を選別するために用いた。第２プローブはウサギベータ−５サブユニツト配列とのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチド２、下記のベーター５インテグリンサブユニットオリゴヌクレオチド、である。

５°　−ＡＣＧＴＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＡＴＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧ−３°　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）第３のプローブはベーター１インテグリンサブユニツトｃＤＮＡの一部である。

プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの条件は、５ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭ　クエン酸三＋トリウム）、０．０５Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ６，８，５Ｘデンハートの溶液、１０％硫酸デキストラン、および煮沸し剪断した鮭精子ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌである。ホルムアミドを、終濃度２０％（オリゴヌクレオチドプローブ用）または５０％（ｃＤＮＡプローブ用）で加えた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは４２℃で行い、フィルターを２ｘＳＳＣ，４５℃（オリゴヌクレオチドプローブ）または領１ｘｓｓｃ、６５℃（ｃＤＮＡプローブ）で３０分間洗浄した。

フィルターを、２枚の強化スクリーンを用い、７０℃で一部Ｘ線フィルムに暴露した。オリゴヌクレオチド１とハイブリダイズするが、ウサギベーター１インテグリンサブユニツトｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド２にはハイブリダイズしない６個のファージ単離体からのｃＤＮＡインサートを、ラムダｇｔｌＯベクターから切除しバクテリオファージＭ１３にサブクローンし、ＤＮＡを部分的に配列決定した。これらクローンの内の２個はオーバーラツプする配列を含有していた。Ｒａ−１と命名された、このオーバーラツプした配列は、ベータインテグリンサブユニット１−７に類似するが別個のものであることが分かった。このようにＲａ−１クローンは、新規なベータインテグリンサブユニットであると同定され、ベーター８インテグリンサブユニツトと命名された。このＲａ−１（ベーター８インテグリンサブユニツト）クローンを第２の、ランダムにプライムしたウサギ胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡをランダムヘキサマー（＾ｍｅｒｓｈａｎ＋　Ｃｏｒｐ、）を用いてプライムした外はオリゴ（ｄＴ）ライブラリーに関する記載と同様に構築した）から得たフィルターのスクリーニングに用いた。

このウサギ胎盤ライブラリーから、さらに３個のベータ−８インテグリンサブユニツト単離体を得た。

ウサギ由来の完全長さベータ−８インテグリンサブユニツト配列を２つのオーバラップするクローンから２９７２ヌクレオチドと推量した（図ＩＡ−Ｅ参照）。

これは２３０４ヌクレオチド（ｎｔ）のオーブンリーディングフレーム、６５１ｎｔの５゛非翻訳領域（５°ＵＴＲ）および１７ｎｔの３’ＵＴＲを含んでいた。

次いで、ベーター８インテグリンサブユニツトのヒト相同体を得るために、ウサギベーター８インテグリンサブユニツトｃＤＮＡを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。まず、増幅したヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを下記の方法でスクリーニングした二ランダムにプライムしたヒト胎盤ライブラリーの約１．２ｘｌＯ’組換えファージをウサギベーター８インテグリンサブユニツトｃＤＮＡプローブにより、中程度のストリンジエンシー（３０％ホルムアミドを含有する上記と同じハイブリダイゼーション溶液）でスクリーニングし、これらフィルターを５５℃において１ｘＳＳＣで洗浄した。このライブラリーから、ヒトベーター８インテグリンサブユニツトをコードする配列の約４０％と、少量の３’　ＵＴＲを含む約９００塩基対（ｂ　ｐ）の単一クローンを得た。

ＰＣＲ分析を用い、ベーター８インテグリンサブユニツトｍＲＮＡはＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞内に存在することが分かった。そこで、ＭＧ−６３ライブラリーを、ヒトベータ−８インテグリンサブユニツト部分ｃＤＮＡ（ヒト胎盤ライブラリーから入手）をプローブとしてスクリーニングした。出発物質として５ｘｌＯ ’ＭＧ−６３細胞を用い、ｐｏｌｙ（＾）４をｐｏｌｙ（Ｕ）セファ０−スアフィニティークロマトグラフィーを用いて調製し、３ｋｂ以上のｃＤＮＡ断片をラムダｇｔｌＯに結合させたことを除いて、上記のウサギ胎盤ライブラリーに関して述べたと同様の方法でランダムプライムＭＧ−６３ライブラリーを構築した。

パッケージングはＧｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ＩＩＸＬ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。このライブラリーから３個のオーバーラツプするクローンを得、その最長のもの、Ｈｕ　２、は３７８９ｂｐ（図２Ａ−Ｈ）であり、２３０７ヌクレオチドのオーブンリーディングフレーム、６８０ヌクレオチドの５ °ＵＴＲおよび８０２ヌクレオチドの３°ＵＴＲを含有していた。

ウサギおよびヒトベーター８インテグリンサブユニツトクローンの両鏡を配列決定した。ベータ−８インテグリンサブユニツト単離体を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンし、その配列を５ｅｑｕｎｃｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．　Ｏｋｉｔ（１１，Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）および合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いて決定した。長い範囲のＤＮＡの配列決定を容易にするために、エキソヌクレアーゼＩＩＩとｍｕｎｇ　ｂｅａｎヌクレアーゼにより巣欠失（ｎｅｓｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を創造した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得たキットを用いた）。得られたｃＤＮＡによってコードされているウサギおよびヒトベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドは、ｃＤＮＡ配列の翻訳から計算したとき、それぞれ７６８（分子量計算値、８４，４０６）および７６９（分子量計算値、８５，６３１）アミノ酸残基であった。これらのベータ−８インテグリンサブユニツトアミノ酸配列は非常に類似している（アミノ酸レベルで８９％）。ベーター８インテグリンサブユニツトは５４個のシスティン残基を有し、その内の１個を除くすべてがウサギおよびヒトの間で共直線的に保存されていた。ヒトベーター８インテグリンサブユニツトのアミノ酸配列は既知のベータインテグリン類と非常に異なることが分かった：ベーター８インテグリンサブユニットアミノ酸配列と、ヒトベータインテグリンサブユニツト１−７の各々との同一性は順番に、はぼ、３５％、３２％、３４％、３１％、３４％、３７％、および３１％であった。

ＰＣＲ分析法を用い、幾つかのヒト細胞系でのベーター８インテグリンサブユニツトｍＲＮＡの発現を検出した。評価した細胞系は以下の通りである：２９３ヒト腎腺癌細胞（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ１５７３）、ＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ１４２７）　、ＵＣＬＡ−Ｐ３ヒト肺癌細胞（カリフォルニア州立大学ロスアンジエルス校のＤｏｎａｒｄ　Ｍｏｒｔｏｎ博士から入手）およびＨＥＬヒト券白血病細胞（カリフォルニア州立大学、サンフランシスコ細胞培養部から入手）。ＰＣＲプライマーはベータ−８インテグリンサブユニツトヌクレオチド配列から導いた。幾つかの細胞系からのｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡ　［ポダリイら（Ｂｏｄａｒｙ　ｅｔａｌ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６５：５９３８（１９９０）の記載に従い調製］１μｇをランダムへキサヌクレオチドでブライミングし、鳥筋芽細胞腫ウィルス逆転写酵素（ｃＤＮＡ合成キット、＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　）で伸長することで１本鎮ｃＤＮＡを合成した。反応生成物の１／２０をＰ　ＣＲＧｅｎｅＡｍｐ　ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）を用い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＣｅｔｕｓＤＮＡｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒにより、１００μｌの反応容量で、５０ｐｍ。

１のオリゴヌクレオチドブライマー（２４Ｍ体）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りである。サイクル１９８℃、２分間の変性；４５℃で３０秒間のアニーリング；７２℃で３０秒間の伸長；サイクル２−５　：　９８℃、１５秒間の変性；アニーリングおよび伸長はサイクル１と同様（ただし、伸長時間は１秒／サイクルに短縮）。反応産物の１／１０を６．４％アクリルアミドゲルで分析した。

２７６塩基の予測された増幅ＤＮＡを与えるプライマー類［５’　−ＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＣＡＴＴＣ−３°　（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、６）および５’　−ＣＡＴＴＡＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴ−３’　（ＳＥＱ。

ＩＤ、Ｎｏ、７）］を選択した。

結果は２９３、ＭＧ−６３およびＵＣＬＡ　Ｐ−３細胞がベーター８インテグリンサブユニツトメツセージを発現しているが、ＨＥＬ細胞はしないことを示し様々なウサギ組織におけるベーター８インテグリンサブユニツトｍＲＮＡの発現を試験するために、ウサギベーター８インテグリンサブユニツトｃＤＮＡをノーザン分析法のプローブとして用いた。妊娠ウサギを殺し、その組織（全胎児、心臓、肺、すい臓、膵臓、脳、卵巣、骨髄、全血、子宮、平滑筋、腎臓、肝臓および胎盤）を切除した。下記のようにこれらの組織から全ｍＲＮＡを調製した。

全ＲＮＡを各組織１ｇからグアニジウムチオシアナート抽出法で得た。オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）用いて全ＲＮＡ５００μｇからＰｏ１ｙ（＾ドＲＮＡを精製した。このＰｏ１ｙ（Ａ）’ＲＮＡの１／２を次いで２％ホルムアルデヒド含有変性性１．２％アガロースゲルで分画し、バイオトレース膜（Ｂｉｏｔｒａｃｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　（Ｇｅｌｉａｎ　５ｃｉｅｎｃｅ）に１夜ブロツテイングした。ホルムアルデヒド濃度を５０％に高めたことおよび全溶液（洗浄液をも含め）が０２％ＳＤＳを含有していることを除き、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの場合と同様に、膜をプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションした。、ランダムにプライムした、Ｕｐ −標識部分的、ウサギベーター８インテグリンサブユニツトＣＤＮＡ、ベーター１インテグリンサブユニツトｃＤＮＡ、およびベーター３インテグリンサブユニツトｃＤＮＡで膜をプローブし、０．１ｘＳＳＣで６０℃で洗浄した。新しいプローブを加える前に、膜を０２％ＳＤＳで８０℃においてゆるく撹拌しながら５分間洗浄して裸にした。

約８キロベース（ｋ　ｂ’）のベータ−８インテグリンサブユニツトメツセージ陽性組織には、腎臓、脳、胎盤、卵巣および子宮が含まれていた。この発現パターンがベーター８インテグリンサブユニツトに特異的であることを証明するために、ウサギベーター１インテグリンサブユニツトおよびベーター３インテグリンサブユニットをコードするｃＤＮＡプローブと結合したプロットを再プローブした。

これらの実験で、全組織において、約３．５ｋｂベーター１インテグリンサブユニツトメツセージが検出された。また、子宮および骨髄のみに、２つの約３．５および５．５ｋｂのベーター３インテグリンサブユニツトメソセーノが検出された。これらおよび下記の結果から、ベーター８インテグリンサブユニツトは他と別個の、分離したベータインテグリンサブユニツトであると思われる。

実施例４　ヒトベーター８インテグリンサブユニツトの発現および検出３７８９ｂｐのヒトベーター８インテグリンサブユニツトｃＤＮＡをｐＲＫ５発現ベクター（ＥＰＯ７１５６０，４８２に記載）にサブクローニングし、この構築物でヒト肝腎２９３細胞を、標準的なりん酸カルシウム沈澱法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌ、、前掲）によつてトランスフェクションした。１日目に細胞を濃度２ｘ１０６でプレートし、２日目に発現プラスミド１０μｇまたはＤＮＡ不含（対照）のりん酸カルシウム沈澱物に暴露し、４日目にＣａ２＋／Ｍｇ２＋−不含ＰＢＳ（りん酸緩衝化バッファー、サムプルツクら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）のＢ、１２節参照）中、５＋ａＭＥＤＴＡで収穫した。

細胞（１−２ｘ１０’）の表面を０．００１５％Ｈ６０，の存在下、１ｍｃｉＮａ”’　ｌ　（ＡｍｅｒｓｈａＩＩＣａｒｐ、　）および１００μｇラクトペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で標識した。１０分間標識処理した後、室温で、細胞をＰＢＳ中５ｍＭ　Ｋｌで１回洗浄した後、ＰＢＳで２回洗浄した。標識した細胞を抽出バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，２０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ　ｐ）１７．５．１５０　ｄ　ＮａＣ１，Ｉｄ　ＣａＣ１ｔ）０．５ｇ＋１中、時々ポルテックスしながら４℃で３０分間可溶化した。次いで、５０００ｘｇ、５分間の遠心で細胞片をベレット化し、細胞抽出上清にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有しない抽出バッフ　ｙ　（０，５ｍ１）を加えて０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に希釈した。

ベーター８インテグリンサブユニツトに特異的な抗ペプチドポリクローナル抗体を用い、免疫沈降により、ベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドを検出した。ｃＤＮＡ配列から推測したヒトベーター８インテグリンＣ−末端残基を含む合成ペプチドＨ２Ｎ−ＥＥＩＫＭＤＩＳＫＬＮＡＨＥＴＦＲＣＮＦ−Ｃ００Ｈ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）を免疫原として用いた。ペプチドは、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　９０５０ペプチドシンセサイザー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を用いるＦ −ｍｏｃ化学によって合成された。免疫のために、ｓｕｌｆｏ−ＭＢ　Ｓ　（Ｐｉｅｒｃｅ）を業者の指示に従って用い、ペプチド１１０ｌｌ１を大豆トリプシンインヒビター２０ｍｇと結合させた。３週間間隔でペプチド２００μｇ当量を皮下注射してウサギを免疫した。初期免疫から約２−３力月後に高力価の血液が得られた。

免疫沈降のために、標識細胞抽出物４００μｍを１／１００容量の抗体（腹水、培養上清または抗血清）と４℃で１夜インキユベートし、５ｅｐｈａｒｏｓｅＴ ′ＣＬ−４Ｂ（Ｐａｒｍａｃｉａ）によるプレクリーニング（前洗浄）の後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ”４ＦＦ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて免疫沈降を行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ”ビーズを０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２０．２０ｎｉｌ　Ｔｒｉｓ　（ｐｔｌ　８）、　１２０　ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＣａＣ１１で３回洗浄した。標識細胞抽出物からのタンパク質沈澱物を試料バッファー中で加熱することによって可溶化し、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いでオートラジオグラフィーにかけることで分析した。

その結果、ベーター８インテグリンサブユニツトポリペプチドは形質転換された２９３細胞の表面で発現しているが、対照２９３細胞の表面では発現していないことが示された。

実施例５　ベータ−８／アルフアー■複合体の検出新規なベータ−８／アルフアー■インテグリン複合体の存在を証明するために上記実施例の記載と同様にしてトランスフェクションされたヒト肝腎２９３細胞を用いた。これらの細胞はアルファー■を含む様々な内因性アルファインテグリンサブユニットを発現している。免疫沈降のために、実施例４に記載の方法でベーター８インテグリンでトランスフェクションされた細胞タンパク質を調製した。

ベーター８インテグリンが複合体を形成するアルファインテグリンサブユニットを同定するために、幾つかの異なるアルファインテグリンサブユニットに対するモノクローナル抗体を免疫沈降に用いた。アルファー１［抗体ＴＳ　２／７．ヘムラーら（ＲｅＩｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．、１３２：３０１１　（１９８４）］　、アルファー２［抗体ＰＩＨ５，ウニイナーら（Ｗａｙｎｅｒ）　、前掲〕、アルファー３（抗体ＰＩＢ５、ウニイナーら、前掲）、アルファー５（抗体ＰＩＤ６、ウニイナーら、前掲）およびアルファーＶＥ抗体１３Ｃ２，モートン（Ｍ、Ｈｏｒｔｏｎ）　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　Ｓｔ、Ｂａｒｔｈｌｏｍｅｖ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄから入手］に対するマウスモノクローナル抗体、およびアルファー６（抗体ＧｏＨ３）［ソネンバーグら（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６２：１０３７６　（１９８７）から入手］に対するラットモノクローナル抗体を試験した。免疫沈降は実施例４に記載のようにして行った。

これら免疫沈降の結果、アルファー■サブユニットはトランスフェクションされたヒト肝腎２９３細胞内で、ベーター８インテグリンサブユニットと容易に会合し複合体を形成するが、アルファインテグリンサブユニット１．２．３．５および６とは会合をしないことが示された。

（以下余白）配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）発明の名称：新規ベータインテグリンサブユニット（ｉｉｉ）配列の数ニア（ｉｖ）通信先住所：（Ａ）宛て名：ジエネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）町名：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシスコ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　９４０８０（Ｖ）コンピューター読み取り形式：（＾）媒体の種類：５．２５　インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテイン（ｐａｔｉｎ）（ジェネンテック）（ｖｉ）本願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日＋　１９９２年２月２６日（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）　原出願データ：（Ａ）出願番号：米国特許出願第０７／６７０６０７号（Ｂ）出願日＋　１９９１年３月１４日（ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人　情報：（Ａ）氏名ニアドラ−、カロライン・アール（Ｂ）登録番号：　３２．３２４（Ｃ）参照／整理番号二６９９（ｉｘ）通信情報：（＾）電話：　４１５／２６６−２６１４（Ｂ）ファクシミリ：　４１５／９５２−９８８１（Ｃ）テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）配列番号１に関する情報；（ｉ）配列の特徴；（＾）長さ＝９７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｖ）配列の記載：配列番号１：＾＾ＧＣＡＧＡＧＴＧ　ＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡ　ＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧ　ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＣ５０ＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧ　ＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴ　ＧＴＧＡＴＧＡＡ＾＾ＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧ　ＡＧＧ＾訂Ｇ　９７（２）配列番号２に関する情報。

（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ＝４５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｉｖ）配列の記載：配列番号２：＾ＣＧＴＧＣＧＡＧＡ　ＡＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＡＴ　ＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡ　ＣＣＡＡＧ　４５（２）配列番号３に関する情報：ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣＡＡＣ＾＾Ｔ　ＡＴＡ　Ｇ＾＾＾＾Ａ　ＴＴＡ＾＾Ｔ　ＴＣＴ　１１５５Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅｔ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　５ｅｒＧＴＴ　ＧＧ＾＾＾Ｔ　ＧＡＣＴＴＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　Ａ＾＾＾ＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＴＣＣ１１９４Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　５ｅｒＣＧＴ　ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＴＴ　ＧＧＧ　ＴＴＣＧＧＣＴＣＣＴＡＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴ＾＾＾１２３３＾ｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ＾ＣＡ　ＧＴＣＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＴＣＡＧＴ　ＡＴＣＣＡＣＣＣＡ　Ｇ＾＾＾ＧＧ　ＡＴＴ　１２７２Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌ１ｅＣＡＣ＾＾ＣＣ＾＾ＴＧＣＡＧＴ　ＧＡＣＴＡＣ＾＾ｃ　ＴＴＡ　ＧＡＣＴＧＣＡＴＧ　ＣＣＣ１３１１Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

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Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたベーター８インテグリンサブユニットポリペプチド。２．ヒト由来である請求項１のベーター８インテグリンサブユニットポリペプチド。３．請求項１のベーター８インテグリンサブユニットポリペプチドを含む組成物であって、そのポリペプチドの供給源である動物種のポリペプチドが混入していない組成物。４．請求項１のベーター８インテグリンサブユニットポリペプチドを結合することができる抗体であって、ベータインテグリンサブユニット１〜７を結合することができる抗体を含まない抗体。５、単離されたベーター８インテグリンサブユニットポリペプチドを含む複合体に結合することができる抗体であって、ポリペプチドがアルファインテグリンサブユニットポリペプチドと結合しており、抗体がベータインテグリンサブユニット１〜７を結合することができる抗体を含まない抗体。６．ベーター８インテグリンサブユニットをコード化する単離された核酸分子。７．ＤＮＡであって、かつ、図２Ａ〜Ｈに示す翻訳されたＤＮＡ配列を有する請求項６の核酸分子。８．ＤＮＡであって、かつ、約４５塩基以上を含有する請求項６の核酸分子。９．該核酸配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む請求項６の核酸分子。１０．発現ベクターであって、そのベクターで形質転換される宿主細胞によって認識される制御配列に機能可能に連結した請求項６の核酸配列を含む発現ベクター。１１．請求項１０のベクターによって形質転換された宿主細胞。１２．アルファーｖインテグリンサブユニットをコード化する核酸分子を含む発現ベクターによってさらに形質転換された請求項１１の宿主細胞。１３．ベーター８インテグリンサブユニットをコード化する核酸分子を使用する方法であって、そのベクターによって形質転換される宿主細胞によって認識される制御配列に機能可能に連結したベーター８インテグリンサブユニットをコード化する核酸分子を含むベクターで形質転換された培養宿主細胞中で該核酸分子を発現させ、その宿主細胞からベーター８インテグリンサブユニットを回収することからなる方法。１４．ベーター８インテグリンサブユニットを宿主細胞培養培地から回収する請求項１３の方法。１５．ベーター８インテグリンサブユニットを生産する方法であって、ベーター８インテグリンサブユニットをコード化する核酸を含有する細胞のＤＮＡ中に、該核酸分子に対してその転写に影響を与えるに足る近さと配向で転写変調要素を挿入することからなる方法。１６．ベーター８インテグリンサブユニットをコード化する核酸の転写が増大または減少している細胞を得る方法であって、（ａ）該核酸を含有する細胞を用意し、（ｂ）該細胞に転写変調要素を導入し、（ｃ）該核酸分子の転写が増大または減少している細胞に関して上記細胞をスクリーニングすることからなる方法。１７．ベーター８インテグリンサブユニットの存在を決定する方法であって、ベーター８インテグリンサブユニットをコード化するＤＮＡを試験試料核酸にハイブリッド形成させ、ベーター８インテグリンサブユニットＤＮＡの存在を決定することからなる方法。１８．核酸試験試料を増幅する方法であって、ベーター８インテグリンサブユニットをコード化する核酸で核酸ポリメラーゼ反応を始動させることからなる方法。１９．請求項１のベーター８インテグリンサブユニットおよび医薬的に許容される担体からなる組成物。２０．アルファインテグリンサブユニットポリペプチドに結合している単離されたベーター８インテグリンサブユニットポリペプチド。２１．異種ポリペプチドに融合されたベーター８インテグリンサブユニットからなる単離されたポリペプチド。