JPH11502420A - 哺乳動物ケモカインｃｃｆ８およびケモカインレセプターｃｃｋｒ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物由来の新規のCCケモカイン、これに関連する試薬（精製タンパク質、特異的抗体、およびこのケモカインをコードする核酸を含む）。ケモカインレセプターもまた提供される。これらの試薬を用いる方法および診断キットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物ケモカインCCF8およびケモカインレセプターCCKR3発明の分野 本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細胞）の発生および分化 の制御に機能するタンパク質に関する組成物に関する。特に、造血細胞を含む種 々の細胞型の発生、分化、および機能を調節するタンパク質および模倣物を提供 する。このようなタンパク質に対するレセプター試薬もまた提供する。発明の背景 哺乳動物循環系の循環成分は、種々の細胞型（赤血球細胞系統または骨髄細胞 系統の赤血球および白血球を含む）を含む。例えば、Rapaport（1987）Introduc tion to Hematology （第２版）Lippincott，Philadelphia，PA; Jandl（1987）B lood: Textbook of Hematology ，Little，Brown and Co.，Boston，MA.; および Paul（編）（1993）Fundamental Immunology 第３版，Raven Press，N.Y.を参照 のこと。分化の種々の段階を通した進行は、細胞に提供される種々のシグナルに より調節され、しばしばサイトカインとして知られるタンパク質のクラスにより 媒介される。この群の分子のうち、化学誘引物質サイトカインすなわちケモカイ ンとして知られるさらなる群が存在する。例えば、Schall（1994）「The Chemok ines」The Cytokine Handbook（第２版）Academic Press; SchallおよびBacon（ 1994）Current Opinion in Immunology 6: 865を参照のこと。 ケモカインの生物学的活性の完全なスペクトルは広範に調べられていないが、 化学誘引物質効果は認識されている。これらの分子の最も良く知られている生物 学的機能は、白血球の化学誘引に関する。しかし、新たなケモカインが発見され 、そして免疫学的応答を担う種々の細胞に対するそれらの生物学的効果は、継続 される研究のトピックである。マウスCCF18は、日本人グループにより報告され 、そして本発明者により、Haraら、（1995）J.Immunol．155: 5352において発表 もされている。 これらの観察は、造血、免疫発生、および白血球輸送における機能がこれまで 未確認であった他の因子が存在することを示す。これらの因子は、効果スペクト ルが公知の分化因子、活性化因子、または他のシグナリング因子と異なる生物学 的活性を提供する。インビボでのＴ細胞の生理を調節する調節因子の構造的、生 物学的、そして生理学的特性についての知識がないため、この様な因子の効果の 改変が妨げられる。従って、関連細胞の発生または生理の調節が必要とされる医 療条件は、依然として解決されていない。発明の要旨 本発明は、CCケモカインをコードする新規の遺伝子、およびケモカインの種々 のレセプターをコードする新規の遺伝子の発見に部分的に基づく。CC18と呼ばれ るケモカインのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、天然配列の変異（ム テイン）、融合タンパク質、化学的模倣物、抗体、および他の構造的または機能 的アナログ）を含む。本発明のタンパク質をコードする単離された遺伝子にも関 する。これらの異なるタンパク質または核酸組成物の種々の使用もまた提供され る。レセプターについても同様に、本明細書中に記載される。 本発明は、実質的に純粋なCCF18ケモカイン；CCF18ケモカイン配列を含む融合 タンパク質：CCF18ケモカインへの結合に特異的な抗体；およびCCF18ケモカイン またはその融合タンパク質をコードする核酸を提供する。 CCF18ケモカインの実施態様において、ケモカインは、鳥類、およびマウスま たはヒトを含む哺乳動物からなる群から選択される温血動物由来であり得るか； 表１または３の配列を含み得るか；天然のCCF18ケモカインとは異なる翻訳後修 飾パターンを示し得るか；あるいは表２に開示される特性を示し得る。本発明は また、ケモカインおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を包含する。 融合タンパク質の実施態様において、タンパク質は、表１または３のいずれか の配列；および/または別のサイトカインもしくはケモカインの配列を含み得る 。 抗体の実施態様において、CCF18ケモカインは、マウスまたはヒトを含む哺乳 動物タンパク質であり得るか、あるいは抗体は、表１もしくは３のペプチド配列 に対して惹起され得るか；モノクローナル抗体であり得るか；または抗体は標識 され得る。 核酸の実施態様において、ケモカインは、鳥類、およびマウスまたはヒトを含 む哺乳動物からなる群より選択される温血動物由来であり得る。核酸は、表１も しくは３の配列を含み得るか；発現ベクターであり得るか；またはデオキシリボ 核酸ヌクレオチドを含み得る。 本発明はまた、実質的に純粋なCCF18ケモカインもしくはそのフラグメント； 哺乳動物ケモカインCCF18に特異的に結合する抗体；またはCCF18ケモカインもし くはペプチドをコードする核酸を含むキットを提供する。キットはまた、定性的 分析または定量的分析を行い得る。 別の実施態様において、本発明は、細胞と哺乳動物CCF18ケモカインのアゴニ ストまたはアンタゴニストとを接触させる工程を包含する、細胞の生理または発 生を調節する方法を提供する。アンタゴニストは、哺乳動物CCF18ケモカインに 対する抗体であり得る。細胞は、リンパ球を含む造血細胞；胎盤細胞；生殖線細 胞；または神経細胞（ニューロン細胞もしくは非ニューロン細胞を含む）であり 得る。種々の生理学的効果は、細胞カルシウムフラックス；化学誘引物質応答； 細胞形態改変応答；ホスホイノシチド脂質代謝回転；または抗ウイルス応答をも たらすことを含む。 本発明はまた、CCKR3と呼ばれるケモカインレセプターに関する試薬を提供す る。特定の実施態様において、本発明は、実質的に純粋なCCKR3ケモカインレセ プター、CCKR3ケモカインレセプター配列を含む融合タンパク質；CCKR3ケモカイ ンレセプターへの結合に特異的な抗体；およびCCKR3ケモカインレセプターまた はその融合タンパク質をコードする核酸を提供する。 CCKR3は、鳥類、およびマウスまたはヒトを含む哺乳動物からなる群より選択 される温血動物由来であり得るか；表４の配列を含み得るか、；または天然のCC KR3ケモカインレセプターとは異なる翻訳後修飾パターンを示し得る。 レセプター融合の実施態様において、タンパク質は、表４の配列および/また はケモカインの別のレセプターの配列を含み得る。 レセプター抗体の実施態様において、CCKR3ケモカインレセプターは、マウス またはヒトを含む哺乳動物タンパク質であり得る。抗体は、表４のペプチド配列 に対して惹起され得るか；モノクローナル抗体であり得るか；または標識され得 る。 レセプター核酸の実施態様において、ケモカインレセプターは、鳥類、および マウスまたはヒトを含む哺乳動物からなる群から選択される温血動物由来であり 得る。あるいは、核酸は、表４の配列を含み得るか；発現ベクターであり得るか ；またはデオキシリボ核酸ヌクレオチドを含み得る。発明の詳細な説明 本発明は、走化性のサイトカインまたはケモカインに特徴的な種々の構造特性 を示す哺乳動物タンパク質をコードするDNA配列を提供する。例えば、Lodiら，( 1994)Science 263: 1762; GronenbornおよびClore（1991）Protein Engineering 4: 263; MillerおよびKranger（1992）Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA 89: 2950; MatsushimaおよびOppenheim（1989）Cytokine 1:2; StoeckleおよびBaker（199 0）New Biol. 2: 313; Oppenheimら（1991）Ann ．Rev．Immunol. 9: 617; Schal l（1991）Cytokine 3: 165; およびThe Cytokine Handbook，Academic Press, N Y.を参照のこと。マウスおよびヒト両方の実施態様が、本明細書中に記載される 。 ケモカインは、白血球の移動および接着を誘導することより、免疫応答および 炎症応答において重要な役割を果たす。これらの小さな分泌分子は、保存された ４つのシステインモチーフにより特徴づけられた８〜14kDaタンパク質の増大す るスーパーファミリーである。例えば、Schall（1991）Cytokine 3: 165；およ びThe Cytokine Handbook Academic Press，NY.を参照のこと。ケモカインは、 活性化白血球により分泌され、そして炎症に関与する種々の細胞に対する化学誘 引物質として作用する。化学誘引物質特性の他に、ケモカインは、他の生物学的 応答（例えば、Ca⁺⁺のような２次メッセンジャーレベルの調節；イノシトールリ ン酸プール変化（例えば、Berridge（1993）Nature 361: 315またはBillahおよ びAnthes（1990）Biochem.J. 269: 281）；細胞形態改変応答；ホスホイノシチ ド脂質代謝回転；潜在的な抗ウイルス応答；およびその他）を誘導することが示 されている。従って、CCF18は、単独でまたは他の治療試薬と組合わせて、有利 な 組合せ効果を有し得る。ケモカインが他の細胞型に対する効果（例えば、単球、 樹状細胞、Ｔ細胞、好酸球、ならびに/あるいは、恐らく好塩基球および/または 好中球の誘引または活性化）を有し得ることを示唆する理由が存在する。それら はまた、種々の神経細胞（例えば、末梢神経系における後根神経節ニューロンお よび/または中枢神経系ニューロン）に対する化学誘引性効果を有し得る。 ケモカインスーパーファミリーは、主に、特徴的な構造モチーフ（Cys-X-Cys( C-X-C)およびCys-Cys(C-C)ファミリーを示す２つの主要な群に分けられる。これ らは、システイン残基のNH近位対間の単一アミノ酸挿入および配列類似性に基づ いて区別される。代表的には、C-X-Cケモカイン（すなわち、IL-8およびMGSA/Gr o-α）は、好中球に作用するが、単球には作用しない。一方、C-Cケモカイン(す なわち、MIP-1αおよびRANTES)は、単球およびリンパ球の強力な化学誘引物質で あるが、好中球の強力な化学誘引物質でない。例えば、Millerら、(1992)Crit.R ev.Immunol. 12:17を参照のこと。最近単離されたケモカインであるリンホタク チン(lymphotactin)は、いずれの群にも属せず、第３のケモカインファミリー（ Ｃファミリー）の最初のメンバーを構成し得る。リンホタクチンは、特徴的なCC またはCXCモチーフを有さず、リンパ球に作用するが、好中球および単球には作 用しない。例えば、Kelnerら、(1994)Science 266: 1395を参照のこと。本明細 書中に記載されるケモカイン分子は、C-Cケモカインファミリーのメンバーであ り、CCF18と呼ばれる。 別の実施態様において、本発明は、CCケモカインレセプター３またはCCKR3と 呼ばれるケモカインレセプターをコードする遺伝子を提供する。そのリガンドは 、まだ詳しく同定されていない。しかし、このレセプターは、公知のケモカイン レセプターに代表的な構造的特性（例えば、７つの膜貫通構造である）を示す。 種々の特異性（共有された特異性または無差別的な特異性）で多くの異なるサイ トカインに結合する特性を示し得るか、またはケモカインのうちの１つ（特異的 な）またはサブセット（共有した）に対して高親和性を示し得る。 記載されたケモカインおよびレセプターは、細胞の生理または発生の種々の局 面を媒介するために重要であるはずである。精製CCF18ケモカイン マウスCCF18ケモカインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表１に示す 。ヒトケモカインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表３に示す。マウス およびヒトのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および３に対応し、そし てマウスおよびヒトのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および４に対応する 。ヒトケモカインは、タンパク質レベルでマウスの対応物に対して約50％の類似 性を示す。ケモカインレセプター（CCKR3）のヌクレオチド配列およびアミノ酸 配列を、表４ならびに配列番号６および７に示す。これらのアミノ酸配列（アミ ノ→カルボキシで提供される）は、他のタンパク質からこのタンパク質を区別し 得るリガンドに関する配列情報を提供することにおいて重要である。さらに、ペ プチド配列は、このようなセグメントを認識する抗体を生じるペプチドの調製、 およびオリゴヌクレオチドプローブの調製（両方とも、このような配列をコード する遺伝子の単離（例えば、クローニング）のためのストラテジーである）を可 能にする。類似性は、他のサイトカインとも観察されている。例えば、Bosenber gら、(1992)Cell 71:1157; Huangら、(1992)Molecular Biology of the Cell 3: 349;およびPandiellaら、(1992)J．Biol．Chem．267:24028を参照のこと。この ことは、細胞結合タンパク質とともに作用するか、または細胞結合タンパク質を 投与するという特定の問題を回避し、そして細胞特異性の可能な機構への洞察を 提供する。 本明細書で用いられている用語「CCF18ケモカイン」は、タンパク質の意味に 用いられる場合、表１に示されるマウスアミノ酸配列、または表３に示されるヒ トアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。本発明はまた、このようなタン パク質の重要なフラグメントを含むポリペプチドを包含する。本発明は、同様の 生物学的機能を示すか、またはCCF18ケモカインに特異的な結合成分と相互作用 する、マウスまたはヒト由来のポリペプチドもまた包含する。これらの結合成分 （例えば、抗体）は、代表的には、高い親和性（例えば、少なくとも約100nM、 通常は約30nMより良好、好ましくは約10nMより良好、そしてより好ましくは約３ nMより良好）でCCF18ケモカインに結合する。相同なタンパク質は、マウス以外 の哺乳動物種（例えば、ラット）に見出される。非哺乳動物種もまた、構造的ま たは機能的に関連した遺伝子およびタンパク質を有する。 本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、重要なフラグメントまたはセ グメントを含み、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも10アミ ノ酸、より一般的には少なくとも12アミノ酸、しばしば少なくとも14アミノ酸、 よりしばしば少なくとも16アミノ酸、代表的には少なくとも18アミノ酸、より代 表的には少なくとも20アミノ酸、通常は少なくとも22アミノ酸、より通常は少な くとも24アミノ酸、好ましくは少なくとも26アミノ酸、より好ましくは少なくと も28アミノ酸、および、特に好ましい実施態様では、少なくとも約30以上（例え ば、35、40、45、50、60、75、80、100、120など）のアミノ酸の一続きのアミノ 酸残基を包含する。 用語「結合組成物」は、例えば、リガンド-レセプター型の様式または抗体-抗 原相互作用で、CCF18ケモカインと特異的に結合する分子をいう。これらの組成 物は、CCF18ケモカインと特異的に会合する化合物（例えば、タンパク質）であ り得る。会合は、天然の、生理学的に関連するタンパク質-タンパク質相互作用 （共有結合または非共有結合のいずれでも）を含む。結合組成物は、ポリマー、 または別の化学試薬であり得る。CCF18ケモカインが、そのリガンド-レセプター 相互作用において、凹または凸の形状を呈するかどうかについては、その相互作 用が、同様の特異性（例えば、特異的親和性）を示す以外は、言及されない。機 能的アナログは、構造的な修飾を有するリガンドであり得るか、または例えば、 適切なリガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有する、全く無関係な分子 であり得る。リガンドは、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして 働き得る。例えば、Goodmanら、（編）（1990）Goodman & Gilman's: The Pharm acological Bases of Therapeutics（第８版）,Pergamon Pressを参照のこと。 実質的にというのは、タンパク質が、他の混在するタンパク質、核酸、および 元の供給源の生物に代表的に由来する他の生物製剤を含まないことを意味する。 純度は、標準的方法でアッセイされ得、そして通常には少なくとも約40％純粋、 より通常には少なくとも約50％純粋、一般的には少なくとも約60％純粋、より一 般的には少なくとも約70％純粋、しばしば少なくとも約75％純粋、よりしばしば 少なくとも約80％純粋、代表的には少なくとも約85％純粋、より代表的には少な くとも約90％純粋、好ましくは少なくとも約95％純粋、より好ましくは少なくと も約98％純粋の範囲であり、そして最も好ましい実施態様では、少なくとも99％ 純粋であり得る。 ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、環境およびそのポリペプチドに 依存する。多くのパラメーターがポリペプチドの可溶性に影響し、温度、電解質 環境、ポリペプチドのサイズおよび分子的特徴、および溶媒の性質を包含する。 代表的には、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約65℃の範囲である。 通常、使用時の温度は、約18℃より高く、そしてより通常は、約22℃よりも高い 。診断目的には、温度は通常はおよそ室温かまたはそれより暖かいが、アッセイ 中の成分の変性温度よりは低い。治療目的では、温度は通常体温、代表的にはヒ トで約37℃であるが、特定の状況下では、温度は、インサイチュまたはインビト ロで上昇または低下させてもよい。 電解質は、通常は、インサイチュでの生理学的条件に近いが、有利な場合、高 イオン強度または低イオン強度に改変され得る。実際のイオンは、例えば、生理 学的または分析的に用いられる標準的な緩衝液に合わせるよう改変され得る。 ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的に、実質的に安定な状態であり、 そして通常、変性した状態ではない。ポリペプチドは、他のポリペプチドと、四 次構造に会合して、例えば、可溶性を付与し得るか、または天然脂質二重層の相 互作用に近い様式で、脂質または界面活性剤と会合し得る。 溶媒は、通常、生物学的活性の保存に用いられるタイプの生物学的に適合性の ある緩衝液であり、そして通常、生理学的溶媒に近い。通常は、溶媒は、中性の pH、代表的には約５〜10の間、そして好ましくは約7.5を有する。いくつかの場 合、界面活性剤が添加され、代表的にはマイルドな非変性界面活性剤（例えば、 CHSまたはCHAPS）が添加されるか、またはリガンドの構造的または生理学的性質 の重大な破壊を回避するに十分低い濃度で添加される。 可溶性は、Svedberg単位（特定の条件下での分子の沈降速度の尺度）で測定さ れた沈降に反映される。沈降速度の決定は、古典的には分析的超遠心分離で行わ れたが、代表的には現在は標準超遠心分離で行われる。Freifelder（1982）Phys ical Biochemistry（第二版），W．H．Freeman;ならびにCantorおよびSchimmel( 1980)Biophysical Chemistry，parts 1-3，W．H．Freeman & Co.，San Francisc oを参照のこと。粗決定としては、推定の可溶性ポリペプチドを含むサンプルを 、標準完全サイズの超遠心分離で、約50K rpmで約10分間遠心し、そしてその可 溶性分子が上清に残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、代表的には約30S未 満、より代表的には約15S未満、通常は約10S未満、より通常は約６S未満、そし て、特定の実施態様においては、好ましくは約４S未満、そしてより好ましくは 約３S未満である。物理的変異体 本発明はまた、CCF18ケモカインのアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相同 性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。変異体は、種変異体または対 立遺伝子変異体を包含する。 アミノ酸配列相同性または配列同一性は、必要であれば、必要なギャップを導 入して、残基のマッチを最適化することにより決定される。これは、保存的置換 をマッチとして考慮する場合は、変化する。保存的置換は、代表的には以下のグ ループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロ イシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、 トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同な アミノ酸配列は、代表的にはそれぞれのタンパク質配列における天然の対立遺伝 子変異体および種間変異体を包含すると意図される。代表的な相同タンパク質ま たはペプチドは、CCF18ケモカインのアミノ酸配列と25〜100％の相同性（ギャッ プを導入可能な場合）から50〜100％の相同性（保存的置換が包含される場合） を有する。相同性の程度は、少なくとも約35％、一般的には少なくとも40％、よ り一般的には少なくとも45％、しばしば少なくとも50％、よりしばしば少なくと も55％、代表的には少なくとも60％、より代表的には少なくとも65％、通常は少 なくとも70％、より通常には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、そし てより好ましくは少なくとも80％であり、そして特に好ましい実施態様では、少 なくとも85％以上である。Needlehamら(1970)J.Mol.Biol．48: 443; Sankoffら （1983）Time Warps，String Edits，and Macromolecules: The Theory and Pra ctice of Sequence Comparison 第１章，Addison-Wesley，Reading，MA; および IntelliGenetics（Mountain View，CA）社のソフトウエアパッケージ; およびUn iversity of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，WIもまた参照のこ と。 単離されたCCF18ケモカインDNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌ クレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの倒置により容易に改変され得 る。これらの改変により、これらの抗原、その誘導体、または同様の生理学的、 免疫原もしくは抗原活性を有するタンパク質をコードする新規のDNA配列が得ら れる。これらの改変された配列は、変異抗原を生成するため、または発現を増強 するために使用され得る。増強された発現は、遺伝子の増幅、転写の増大、翻訳 増大、および他の機構を包含し得る。このような変異CCF18ケモカイン誘導体は 、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの予め決定された(predetermin ed)変異体または部位特異的変異体を包含する。「変異CCF18ケモカイン」は、他 の点では上述のマウスCCF18ケモカインの相同性の定義に該当するが、しかし、 欠失、置換、または挿入のいずれによろうと、天然に見出されるCCF18ケモカイ ンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。特 に、「部位特異的変異CCF18ケモカイン」は、一般に表１または３の配列を有す るリガンドと顕著な相同性を有し、そして種々の生物学的活性（例えば、抗原活 性または免疫原活性）をこれらの配列と共有するタンパク質を包含し、そして好 ましい実施態様では、開示された配列の大部分を含有するタンパク質を包含する 。同様の概念は、異なるCCF18ケモカインタンパク質、特に種々の温血動物（例 えば、哺乳動物および鳥類）に見出されるCCF18ケモカインタンパク質に適用さ れる。前に述べたように、記載は、一般に全てのCCF18ケモカインタンパク質を 包含することを意図しており、具体的に議論したマウスまたはヒトの実施態様に 限定されないことを強調する。 部位特異的変異部位は予め決定されているが、変異体が部位特異的である必要 はない。CCF18ケモカインの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を作製する ことにより行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせが生成され て、最終構築物に到達し得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末端 融合物を包含する。ランダムな変異誘発は、標的コドンにて行われ得、次いで、 発現された変異体が所望の活性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を 有するDNA中の予め決定された部位での置換変異の作製方法は、当該分野で周知 である（例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術 による）。Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1987および補遺)もまた、参 照のこと。 DNA中の変異は、通常、コード配列を読み取り枠の外にするべきではなく、そ して好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような２次的なmR NAの構造を生成し得る相補的な領域を作らない。 本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメ ントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、本来 、同じ方式では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。 従って、免疫グロブリンとCCF18ケモカインポリペプチドとの融合産物は、代表 的なペプチド結合で融合される配列を有し、代表的には単一の翻訳産物として作 られ、そしてそれぞれの供給源のペプチドに由来する特性を示す連続的なタンパ ク質分子である。同様の概念が異種核酸配列にも適用される。 さらに、新たな構築物が他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインの組み合 わせから作製され得る。例えば、リガンド結合セグメントまたは他のセグメント が、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」され得る 。 例えば、Cunninghamら（1989）Science 243: 1330; およびO'Dowdら（1988）J.B iol.Chem. 263: 15985を参照のこと。従って、特異性の新たな組み合わせを示す 新たなキメラポリペプチドは、リガンド結合特異性および他の機能的ドメインの 機能的結合により得られる。 BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts. 22: 1859に記載されたホス ホラミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメン トはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で鎖を互いにアニールするこ と、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付 加すること（例えば、PCR技術）のいずれかにより得られる。機能的変異体 CCF18ケモカインに対する生理学的な応答のブロックは、例えば、競合的阻害 を介しての、そのレセプターへのリガンドの結合の阻害により生じ得る。従って 、本発明のインビトロアッセイは、しばしば単離されたタンパク質、組換え膜結 合CCF18ケモカインを発現する細胞に由来する膜、これらのリガンドのレセプタ ー結合セグメントを含む可溶性のフラグメント、または固相基質に付着したフラ グメントを使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメント変異および改変 、またはリガンド変異および改変（例えば、リガンドアナログ）のいずれかの効 果の診断的測定を可能にする。 本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイ（例えば、ここで、抗原に 対する中和抗体またはレセプターフラグメントが、タンパク質との結合について 試験化合物と競合する）の使用を意図する。この方式では、抗体はリガンドの１ またはそれより多い抗原結合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出す るために使用され得、そしてまた、さもなければレセプターと相互作用し得るタ ンパク質上の結合部位を占めるために使用され得る。 さらに、CCF18ケモカインに対する中和抗体および高親和性レセプター結合部 位を含むケモカインの可溶性フラグメントは、組織（例えば、異常な生理学を経 験している組織）におけるケモカイン活性を阻害するために使用され得る。 CCF18ケモカイン抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改 変体、および他の化学的部分との共有結合的または凝集結合物を包含する。共有 結合誘導体は、当該分野で周知の手段により、CCF18ケモカインのアミノ酸側鎖 中あるいはＮ末端またはＣ末端で見出される基への官能基の連結により調製され 得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖を含有する 残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体 、およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたは アルギニン）のN-アシル誘導体を包含し得るが、これに限定されない。アシル基 は、C3〜C18の直鎖アルキルを包含するアルキル部分の群から選択され、これに より、アルカノイルアロイル種が形成される。キャリアタンパク質への共有結合 的付着は、免疫原性部分がハプテンである場合には重要であり得る。 特に、グリコシル化改変（例えば、その合成およびプロセシングの間、または さらなるプロセシングの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変に より作られるもの）が包含される。これを達成する最も好ましい手段は、通常そ のようなプロセシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺 乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵 素もまた、意図される。他の小さい改変を有する同一の１次アミノ酸配列のバー ジョンもまた包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン 、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）を包含する。 誘導体の主要な群は、CCF18ケモカインまたはそのフラグメントと他のタンパ ク質またはポリペプチドとの共有結合物である。これらの誘導体は、Ｎ末端また はＣ末端融合物のような組換え培養物中で、または反応性側鎖基を介してのタン パク質の架橋結合に有用な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。架 橋結合剤を用いる好ましいケモカイン誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素 部分、およびシステイン残基である。 CCF18ケモカインと他の相同性タンパク質または異種タンパク質（例えば、他 のケモカイン）との融合ポリペプチドもまた、提供される。多くの増殖因子およ びサイトカインがホモ２量体の存在であり、そして反復構築物(repeat construc t)は、タンパク質分解的切断に対する感受性の減少を包含する種々の利点を有し 得る。さらに、多くのレセプターはシグナルの伝達のために２量体化が必要であ り、そして種々の２量体リガンドまたはドメイン反復が所望され得る。相同性ポ リペプチドは、異なる表面マーカー間での融合物であり得、例えば、レセプター 結合特異性を示すハイブリッドタンパク質が得られる。同様に、誘導体タンパク 質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が構築され得る。代表的な例 は、融合リガンドの存在または位置を容易に測定し得るための、レポーターポリ ペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）とリガンドのセグメントまたはドメイン（ 例えば、レセプター結合セグメント）との融合物である。例えば、Dullら、米国 特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌β−ガラ クトシダーセ、trpE、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アル コールデヒドロゲナーゼ、FLAG融合物、および酵母のα接合因子を包含する。例 えば、Godowskiら（1988）Science 241: 812を参照のこと。 BcaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts. 22: 1859に記載されたホス ホラミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメン トはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で鎖を互いにアニールするこ と、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付 加することのいずれかにより得られる。 そのようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または 他の部分（特にリン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加または除去により 化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改変は 有用な標識試薬であるか、または精製の標的（例えば、FLAGのような親和性タグ ）として作用する。 融合タンパク質は、代表的には、組換え核酸法または合成ポリペプチド法のい ずれかにより作製される。核酸操作および発現の技術は、例えば、Sambrookら（ 1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）、1-3巻、Cold Spri ng Harbor Laboratoryに一般的に記載されている。ポリペプチド合成の技術は、 例えば、Marrifield（1963）J ．Amer．Chem．Soc. 85:2149; Merrifield（1986 ）Science 232:341;およびAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach ，IRL Press，Oxfordに記載されている。 本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化での変化以外のCCF18ケモカ インの誘導体の使用を意図する。そのような誘導体は、化学部分との共有結合ま たは凝集会合を包含し得る。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分類され る：(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合改変、および(3)例えば細胞膜と の、吸着複合体。そのような共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として 、イムノアッセイにおける試薬として、あるいは精製法（例えば、リガンドまた は他の結合リガンドの親和性精製のための）において有用である。例えば、CCF1 8ケモカイン抗原は、抗CCF18ケモカイン抗体またはそのレセプターのアッセイあ るいは精製に使用するために、臭化シアン活性化Sepharoseのような固体支持体 への共有結合により、当該分野で周知の方法により固定化され得るか、あるいは 、グルタルアルデヒド架橋結合を有して、あるいは有さないで、ポリオレフィン 表面に吸着され得る。CCF18ケモカインはまた、検出可能な基で標識され得る。 例えば、クロラミンＴ手順により放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共有結 合され、または診断的アッセイで使用するために別の蛍光部分と結合される。CC F18ケモカインの精製は、固定化抗体またはレセプターにより行われ得る。 本発明の可溶化されたCCF18ケモカインまたはフラグメントは、リガンドまた はそのフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使 用され得る。精製したケモカインは、タンパク質を含む不純な調製物の種々の形 態での免疫化により調製されるモノクローナル抗体またはケモカイン結合フラグ メントをスクリーニングするために使用され得る。特に、用語「抗体」はまた、 天然の抗体の抗原結合フラグメントも包含する。精製されたCCF18ケモカインは また、タンパク質またはタンパク質を含む細胞フラグメントレベルの上昇（これ らは両方とも、異常なもしくは特定の生理学的状態または疾患状態の診断基準に なり得る）の存在に反応して産生された抗体を検出するための試薬として使用さ れ得る。さらに、ケモカインタンパク質フラグメントはまた、直後に記載するよ うに、本発明の抗体を産生するための免疫原として役立ち得る。例えば、本発明 は、表１もしくは表３に示されるアミノ酸配列に対して惹起された抗体、または それらを含むタンパク質を意図する。特に、本発明は、特定のフラグメント（例 えば、タンパク質の三次構造の外側の表面上にあることが予測されるフラグメン ト）に結合親和性を有する抗体またはこれに対して惹起される抗体を意図する。 本発明は、さらなる密接に関連した種改変体の単離を意図する。サザンブロッ ト分析またはノーザンブロット分析は、類似の遺伝的存在が他の哺乳類動物にお いて存在することを確立するはずである。CCF18ケモカインは、種改変体（例え ば、齧歯類、ウサギ目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目、および霊長類）において広範 であるらしい。 本発明はまた、構造、発現、および機能において性質および類似性の両方を示 す関連したケモカインの一群を単離する手段を提供する。タンパク質の多くの生 理学的影響の解明は、リガンドの別個の種改変体の単離および特徴付けにより大 いに加速される。特に、本発明は、異なる種におけるさらなる相同的な遺伝的存 在の同定に有用なプローブを提供する。 単離された遺伝子により、CCF18ケモカインに対応する発現を欠く細胞（例え ば、対応するリガンドを欠きそしてネガティブバックグラウンド活性を示す種の 型または細胞）の形質転換が可能になる。形質転換された遺伝子の発現により、 規定されたまたは単一の種改変体を用いて、抗原性が純粋な細胞株の単離が可能 となる。このアプローチにより、CCF18レセプタータンパク質の生理学的影響の より感度の高い検出および区別が可能になる。亜細胞フラグメント（例えば、細 胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は単離され、そして使用され得る。 リガンドにより提供される、種々の分化機能をもたらす決定的な構造エレメン トの分析（特に、関連するクラスのメンバーの比較）は、現代の分子生物学の標 準的な技術を用いて可能である。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243: 1 339において記載されたホモログ走査変異誘発技術(homolog-scanning mutagenes is technique);およびO'Dowdら（1988）J ．Biol．Chem. 263:15985において使用 されたアプローチ;およびLechleiterら（1990）EMBO J. 9:4381を参照のこと。 特に、レセプター結合セグメントは、レセプター結合親和性および特異性の両 方、ならびにシグナル伝達においてどの構造的特徴が重要であるかを決定するた めに、種改変体の間で置換され得る。異なるケモカイン改変体の配列は、異なる レセプター種改変体との相互作用の組み合わせられた特性を示すリガンドについ てスクリーニングするために使用される。 細胞内機能は、おそらく、サイトゾルに通常接近し得るレセプターのセグメン トに関与する。しかし、リガンドの内部移行は、特定の状況下で起こり得、そし て細胞内成分と「細胞外」セグメントとの間の相互作用が起こり得る。CCF18ケ モカインと他の細胞内成分との相互作用の特異的セグメントは、変異誘発または 直接的な生化学的手段（例えば、架橋法またはアフィニティー法）により同定さ れ得る。結晶学的方法または他の物理的方法による構造分析もまた、適用可能で ある。シグナル伝達機構のさらなる調査は、アフィニティー法によりまたは遺伝 的手段（例えば、変異体の相補性分析）により単離可能であり得る結合した成分 の研究を含む。 CCF18ケモカインの発現および制御のさらなる研究が探求される。タンパク質 に結合した制御しているエレメントは、異なる発生パターン、組織特異的パター ン、または他の発現パターンを示し得る。遺伝子領域の上流または下流（例えば 、制御エレメント）が目的である。メッセージのディファレンシャルスプライシ ング（differential splicing）は、膜に結合した形態、可溶性形態、およびリ ガンドの改変された型を導き得る。 タンパク質の構造の研究により、新しいリガンド（特に、レセプターのアゴニ ストまたはアンタゴニストの特性を示すアナログ）の設計が導かれる。これは、 所望の活性スペクトルを示すリガンドを単離するために、前に記載したスクリー ニング法と組み合わせられ得る。 他の細胞型における発現はしばしば、特定のケモカインにおいてグリコシル化 の差異を生じる。種々の種改変体は、アミノ酸配列以外の構造的な差異に基づく 別個の機能を示し得る。特異な改変は、特異な機能の原因であり得、そしてその 影響は、現在解明できるようになっている。 従って、本発明は、生理学的ケモカイン結合タンパク質相互作用に関連した重 要な薬剤を提供する。以前の記載は、主にマウスおよびヒトCCF18ケモカインに 焦点を合わせているが、本発明が他の種の対応物（例えばラットおよび他の哺乳 動物種または対立遺伝子変異体）、ならびにそれらの変異体を包含することは、 当業者により即座に認識される。抗体 抗体は、種変異体、または対立遺伝子変異体を含むCCF18ケモカイン、ならび にそのフラグメントに対して、天然に存在する形態およびそれらの組換え形態の 両方において、惹起され得る。さらに、抗体は、活性形態または不活性形態のい ずれかのCCF18ケモカインに対して惹起され得る。抗イディオ型抗体もまた意図 され得る。 リガンドの予め決定されているフラグメントに対する、抗体（結合フラグメン トおよび単一鎖バージョン（single chain version）を含む）が、上記のように フラグメントと免疫原性タンパク質との結合物で動物を免疫することにより惹起 され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。 これらの抗体は、正常型CCF18ケモカインまたは欠陥型CCF18ケモカインに対する 結合についてスクリーニングされ得るか、または、例えば、CCF18のレセプター を介して媒介されるアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリー ニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１mMのＫ_D で結合され、より通常には少なくとも約300μM、代表的に少なくとも約10μM、 より代表的には少なくとも約30μM、好ましくは少なくとも約10μM、およびより 好ましくは少なくとも約３μMのＫ_Dで、またはより良好に結合する。 本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、有意な診断的または治療的 価値を有し得る。それらはレセプターに結合し、そしてリガンド結合を阻害する かまたは生理的応答を誘発するリガンドの能力を阻害する、強力なアンタゴニス トであり得る。それらはまた、非中和抗体として有用であり得、そしてトキシン または放射性核種に連結され得る。その結果、抗体がリガンドへ結合する場合、 例えば、細胞表面でリガンドを発現する細胞は傷害される。さらに、これらの抗 体は、直接的にまたはリンカーの手段により間接的にのいずれかで、薬物または 他の治療剤に結合され得、そして薬物標的化に影響し得る。 本発明の抗体はまた、診断的適応において有用であり得る。捕獲または非中和 抗体として、これらはレセプター結合を阻害せずにケモカインへ結合する能力に ついてスクリーニングされ得る。中和抗体として、これらは競合的結合アッセイ に有用であり得る。これらはまた、CCF18ケモカインの、または間接的にレセプ ターの、検出または定量に有用である。 リガンドフラグメントは、免疫原として使用される融合または共有結合ポリペ プチドとして、他の物質、特にポリペプチドに結合され得る。リガンドおよびそ のフラグメントは、種々の免疫原（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン 、ウシ血清アルブミン、破傷風トキシンなど）へ融合または共有結合され得る。Microbiology ，Hoeber Medical Division，HarperおよびRow，1969; Landsteine r(1962)Specificity of Serological Reactions，Dover Publications，New Yor k，およびWilliamsら、(1967)Methods in Immunology and Immunochemistry,第 １巻、Academic Press，New Yorkを、ポリクローナル抗血清の調製方法の記載に ついて参照のこと。典型的な方法は、抗原での動物の過免疫を含む。次いで、繰 り返した免疫の少し後に、動物の血液が回収され、そしてガンマグロブリンが単 離される。 いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊 長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのよ うなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら（編 ）Basic and Clinical Immunology（第４版）、Lange Medical Publications，L os Altos，CA、およびそこで引用される参考文献；HarlowおよびLane（1988）An tibodies: A Laboratory Manual ，CSH Press；Goding（1986）Monoclonal Antib odies: Principles and Practice （第２版）Academic Press，New York；および 特に、KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256: 495（これは、モノクローナ ル抗体を産生する一つの方法を記載する）において見出され得る。簡潔に要約す ると、この方法は、動物に免疫原を注入することを包含する。次いで、動物は屠 殺され、そして細胞はその脾臓から採取され、次いでその細胞は骨髄腫細胞に融 合される。これにより、インビトロで再生され得るハイブリッド細胞または「ハ イブリドーマ」を生じる。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして 、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。こ の様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される特異的部 位に応答して作製される免疫動物由来の不死化およびクローン化されたＢ単細胞 の生産物である。 他の適切な技術は、リンパ球の抗原性ポリペプチドへの、またはファージもし くは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択へのインビトロ曝露を包 含する。Huseら(1989)「λファージにおける免疫グロブリンレパートリーのラー ジコンビナトリアルライブラリーの作製」、Science 246:1275：およびWardら(1 989)Nature 341:544を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、キメラ 抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴ってまたは伴わずに使用され得る。しばし ば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する基質を共有結合 的にまたは非共有結合的に結合することにより標識される。広範に多様な標識お よび結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方で多数報告さ れている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、コファクター、イン ヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標 識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号； 同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；およ び同第4,366,241号が挙げられる。組換え免疫グロブリンもまた産生され得る。C abilly、米国特許第4,816,567号；およびQueenら（1989）Proc ．Nat'l．Acad．S ci. 86: 10029を参照のこと。 本発明の抗体はまた、タンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラ フィーに使用され得る。カラムは、抗体を固相支持体（例えば、アガロース、Se phadexなどのような粒子）に連結させて調製され得、ここで、細胞溶解物は、カ ラムを通過され得、カラムを洗浄し、続いて温和な変性剤の濃度を増加させるこ とによって、精製CCF18ケモカインタンパク質が遊離される。 抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングする ために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合に より抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。 CCF18ケモカインに対して惹起される抗体はまた、抗イディオ型の抗体を惹起 するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫 学的症状を検出または診断するにおいて有用である。核酸 記載されたペプチド配列および関連試薬は、CCF18ケモカインをコードするDNA クローンを、例えば天然の供給源から単離するにおいて有用である。典型的に、 これはマウスからの遺伝子の単離において有用であり、そして同様の手順は他の 種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）に適用される。クロスハイ ブリダイゼーションは、他の種からのリガンドを単離し得る。多くの異なるアプ ローチが、適切な核酸クローンを首尾よく単離するために利用可能であるべきで ある。 精製タンパク質または定義されたペプチドは、上記のように標準的な方法によ り抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は免疫 系に提示され、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生じ得る。例え ば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; ならび にHarlowおよびLane（1989）Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Ha rbor Pressを参照のこと。あるいは、CCF18レセプターは、特異的結合試薬とし て使用され得、そして、その結合の特異性が利用され得る。抗体が最も利用され るであろう。しかし、ケモカインレセプターは、代表的には７つの膜貫通タンパ ク質であり、脂質または膜との適切な相互作用に感受性であり得る。 例えば、特異的結合組成物は、CCF18ケモカインを発現する細胞株から作製さ れる発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニン グは、例えば、表面に発現されるリガンドの標準的な染色であり得るか、または パニングにより得る。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色または免 疫蛍光手順により行われ得る。結合組成物は、リガンドを発現する細胞をアフィ ニティ精製するために、または選別するために使用され得た。 ペプチドセグメントはまた、ライブラリーをスクリーニングするため（例えば 、種変異体を単離するため）の適切なオリゴヌクレオチドを予測するために使用 され得る。遺伝子コードが、スクリーニングのためのプローブとして有用な適切 なオリゴヌクレオチドを選択するために使用され得る。例えば、表１または３を 参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術と組み合わせて、合成オリゴヌク レオチドはライブラリーから正しいクローンを選択するにおいて有用である。相 補的な配列もまた、プローブまたはプライマーとして使用される。可能なアミノ 末端の同定に基づいて、第３ペプチドは、例えば、アンカーベクターもしくはポ リ Ａ相補的PCR技術と組み合わせて、または、他のペプチドの相補的なDNAと組み合 わせて特に有用である。 本発明は、生物学的に活性な対応するCCF18ケモカインポリペプチドをコード する単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図する。さらに、本発明は、 本明細書中に記載されるDNA配列に適切な条件下でハイブリダイズし得る生物学 的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離、または組換えDN Aを含む。上記の生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、完全なリ ガンド、またはフラグメントであり得、そして表１または３に開示されるアミノ 酸配列を有する。さらに、本発明は、CCF18ケモカインに相同であるタンパク質 をコードするか、またはCCF18ケモカインをコードするcDNAをプローブとして用 いて単離した、単離DNAもしくは組換えDNA、またはそれらのフラグメントの使用 を含む。この単離DNAは、5'および3'隣接においてそれぞれの制御配列（例えば 、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなど）を有し得る。 「単離」核酸は、内生配列に天然に伴う他の成分（例えば、リボソーム、ポリ メラーゼ、およびもとの種からの隣接するゲノム配列）から実質的に分離された 核酸（例えば、RNA、DNA、混合ポリマー）である。この用語は、天然に生じる環 境から取り除かれた核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化DNA単離 物および化学的に合成されたアナログ、または異種の系により生物学的に合成さ れるアナログを含む。実質的に単一な分子は、分子の単離された形態を含む。 単離核酸は、一般に、分子の均質な組成物であるが、いくつかの実施態様にお いて、少量の不均質成分を含む。この不均質成分は、典型的にポリマー末端また は所望される生物学的機能または活性に重要でない部分に見出される。 「組換え」核酸は、その生産方法またはその構造のいずれかにより定義される 。その生産方法を参照すると、例えば、生産物はあるプロセスにより作製され、 このプロセスは組換え核酸技術の使用であり、例えば、ヌクレオチド配列におけ る人の介入、代表的には、選択または生産を包含する。あるいは、天然ではお互 いに隣接しない２つのフラグメントの融合物を含む配列を生成することにより作 製される核酸であり得るが、天然の生産物（例えば、天然に存在する変異体）は 排除することを意味する。従って、例えば、細胞を、天然に存在しない任意のベ ク ターで形質転換することによって作製される生産物が包含され、この生産物は、 任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導される配列を含む核酸であ る。このようなことをしばしば行って、コドンを、同一または保存アミノ酸をコ ードする縮重コドンで置換し、同時に、代表的には配列認識部位を導入するかま たは除去する。あるいは、一般に利用可能な天然の形態では見出されない所望の 組み合わせの機能を含む単一の遺伝子物質(entity)を生成するために、所望の機 能の核酸セグメントを一緒に結合することが行われる。制限酵素認識部位は、し ばしばこのような人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プ ロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴）が設 計により組み込まれ得る。同様の概念が、組換え体（例えば、融合ポリペプチド ）について意図される。具体的には、遺伝子コードの縮重性により、これらの抗 原のフラグメントに類似のポリペプチドをコードする合成核酸および種々の異な る種変異体由来の配列融合物を包含する。 核酸の状況において、重要な「フラグメント」は、少なくとも約17ヌクレオチ ドの連続するセグメントであり、一般的には少なくとも約20ヌクレオチドであり 、より一般的には少なくとも約23ヌクレオチドであり、通常、少なくとも約26ヌ クレオチドであり、より通常には少なくとも約29ヌクレオチドであり、しばしば 、少なくとも約32ヌクレオチドであり、さらにしばしば少なくとも約35ヌクレオ チドであり、代表的には少なくとも約38ヌクレオチドであり、より代表的には少 なくとも41ヌクレオチドであり、通常は少なくとも約44ヌクレオチドであり、よ り通常には少なくとも47ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約50ヌクレ オチドであり、より好ましくは少なくとも約53ヌクレオチドであり、そして特に 好ましい実施態様において少なくとも約56以上のヌクレオチド（例えば、60、65 、75、85、100、120、150、200、250、300、400など）である。 CCF18ケモカインタンパク質またはペプチドをコードするDNAは、関連するかま たは相同であるリガンドをコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA種、ならびに異 なる種由来の相同タンパク質をコードするDNAを同定するために特に有用である 。これらは、霊長類を含む他の種において相同であるようである。種々のCCF18 ケモカインタンパク質が相同であるはずであり、そして本明細書中に含まれる。 し かし、リガンドに進化的により遠い関連を有するタンパク質でさえ、それらが十 分に相同である場合、これらの配列を用いて適切な条件下で容易に単離され得る 。霊長類CCF18ケモカインが特に興味深い。 本発明はさらに、本明細書中に示される単離されたDNAに同一であるかまたは 高く相同であるDNA配列を有する組換えDNA分子およびフラグメントをカバーする 。詳細には、この配列は、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメント にしばしば作動可能に連結される。あるいは、ゲノム配列由来の組換えクローン （例えば、イントロンを含む）は、トランスジェニック実験（例えば、トランス ジェニック細胞および生物）ならびに遺伝子治療に有用である。例えば、Goodno w（1992）「Transgenic Animals」、Roitt（編）、Encyclopedia of Immunology Academic Press，SanDiego，1502-1504頁；Travis（1992）Science 256:1392； Kuhnら、(1991)Science 254:707；Capecchi（1989）Science 244:1288；Roberts on（1987）編、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical App roach IRL Press，Oxford；およびRosenberg（1992）J ．Clinical Oncology 10: 180を参照のこと。 比較される場合、相同な核酸配列は重要な類似性を示す。核酸における相同性 についての標準法は、当業者に一般的に使用される配列比較による相同性の測定 、またはハイブリダイゼーション条件に基づく測定のいずれかである。ハイブリ ダイゼーション条件は以下にさらに詳細に記載される。 核酸配列比較の状況に関する「実質的な相同性」は、比較される場合、セグメ ントまたはその相補鎖のいずれかが、適切なヌクレオチドの挿入または欠失で最 適に配置される場合に、少なくとも約50％のヌクレオチドが同一であり、一般的 には少なくとも約56％、より一般的には少なくとも約59％、通常少なくとも約62 ％、より通常は少なくとも約65％、しばしば少なくとも約68％、よりしばしば少 なくとも約71％、代表的には少なくとも約74％、より代表的には少なくとも約77 ％、通常は少なくとも約80％、より通常は少なくとも約85％、好ましくは少なく とも約90％、より好ましくは少なくとも約95〜98％、またはそれ以上であり、そ して特に好ましい実施態様においては、最高約99％またはそれ以上のヌクレオチ ドが同一であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、セグメントが 選択的なハイブリダイゼーション条件下で、代表的には表１または３に由来する 配列を用いて１本鎖またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。代 表的には、少なくとも約30ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約55％の相 同性が存在する場合、好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの範囲にわたって 少なくとも約65％の相同性が存在する場合、より好ましくは少なくとも約75％、 そして最も好ましくは約20ヌクレオチドにわたって少なくとも約90％の類似性が 存在する場合、選択的なハイブリダイゼーションが生じる。Kenehisa（1984）Nu c ．Acids Res. 12: 203を参照のこと。相同性比較の長さは、記載のように、よ り長い範囲にわたり得、そして特定の実施態様では、少なくとも約17ヌクレオチ ド、通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には少なくとも約24ヌクレオ チド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約40 ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、そしてより好ましくは 少なくとも約75〜100またはそれ以上のヌクレオチドの範囲にわたる。 「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションの状況において相同 性をいうとき、塩、温度、有機溶媒、および代表的にはハイブリダイゼーション 反応において制御される他のパラメーターの、ストリンジェントな組み合わされ た条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃以上、より通常に は、約37℃以上、代表的には約45℃、より代表的には約55℃以上、好ましくは約 65℃以上、そしてより好ましくは約70℃以上の温度が含まれる。ストリンジェン トな塩条件は、通常、約1000mM未満であり、通常は約500mM未満であり、より通 常は約400mM未満であり、代表的には約300mM未満であり、好ましくは約200mM未 満であり、そしてより好ましくは約150mM未満である。しかし、パラメーターの 組み合わせは、任意の単一のパラメーターの測定よりもはるかにより重要である 。例えば、WetmurおよびDavidson（1968）J ．Mol．Biol. 31: 349を参照のこと 。 他の哺乳動物種由来のCCF18ケモカインは、密接に関連する種の種交差ハイブ リダイゼーションによりクローニングされ、そして単離され得る。あるいは、デ ータベースからの配列は、類似性を有すると認識され得る。相同性は、遠縁種間 では比較的低くあり得、従って、比較的密接に関連する種のハイブリダイゼーシ ョンが望ましい。あるいは、低い種特異性を示す抗体調製物の調製は、発現クロ ーニングアプローチに有用であり得る。CCF18 ケモカインの作製；模倣物 CCF18ケモカインまたはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成、cDNA ライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株または組織サンプル から調製されるゲノムライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。 このDNAは、完全長リガンドまたはフラグメントの合成のために広範な種々の 宿主細胞で発現され得、これは順番に、例えば、ポリクローナル抗体またはモノ クローナル抗体を作製するために；結合研究のために；改変された分子の構築お よび発現のために；ならびに構造／機能研究のために使用され得る。各々の抗原 またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフェ クトされた宿主細胞で発現され得る。これらの分子は、実質的に精製され得て、 タンパク質または細胞混入物を除かれるか、そうでなければ、組換え宿主から誘 導され得、それゆえ、薬学的に受容可能なキャリアーおよび／または希釈剤と組 み合わされる場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原またはその一部 は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。 発現ベタターは、代表的には所望の抗原遺伝子またはそのフラグメントを含有 する、通常は、適切な宿主細胞で認識される適切な遺伝子制御エレメントに作動 可能に連結される、自己複製するDNAまたはRNA構築物である。これらの制御エレ メントは、適切な宿主内で発現をもたらし得る。発現をもたらすのに必要な制御 エレメントの特定のタイプは、使用される最後の宿主細胞に依存する。一般に、 遺伝子制御エレメントは、原核細胞のプロモーター系または真核細胞のプロモー ター発現制御系を包含し得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始 を制御する任意のオペレーター、mRNAの発現レベルを高めるための転写エンハン サー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終 止させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常、ベクターを宿主細胞とは独立 に複製させ得る複製開始点を含有する。 本発明のベクターは、CCF18ケモカインをコードするDNAか、または代表的には 、生物学的に活性なポリペプチドをコードするそのフラグメントを含有する。DN A は、ウイルスプロモーターの制御下であり得、そして選択マーカーをコードし得 る。本発明はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主中でCCF18ケモカインを コードする真核生物のcDNAを発現し得るこのような発現ベクターの使用を包含し 、ここで、ベクターは宿主に適合性であり、そしてリガンドをコードする真核生 物のcDNAは、ベクターを含む宿主の増殖により目的のcDNAが発現されるようにベ クターに挿入される。通常、発現ベクターは、宿主細胞内での安定な複製、また は細胞あたりの所望の遺伝子の総コピー数を著しく増大させる増幅のために設計 される。発現ベクターが宿主細胞内で複製する必要は必ずしもなく、例えば、宿 主細胞によって認識される複製開始点を含有しないベクターを使用して、種々の 宿主におけるリガンドまたはそのフラグメントの一時的な発現をもたらすことが 可能である。CCF18ケモカイン遺伝子またはそのフラグメントの宿主DNAへの組換 えによる組込みを生じるベクターを使用すること、または内因性遺伝子の発現を 制御するプロモーターを組込むこともまた可能である。 本明細書中で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファ ージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主ゲノムへのDNAフラグメントの 組込みを可能にする他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、作動可能に連結 される遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含有する、分化したベク ターである。プラスミドは、最も多く共通に使用される形態のベクターであるが 、同等の機能を供し、当該分野で公知であるかまたは公知になる全ての他の形態 のベクターが、本明細書中で使用するのに適切である。例えば、Pouwelsら（198 5および補遺）Cloning Vectors; A Laboratory Manual Elsevier，N.Y.; および 、Rodriquezら（編）(1988)Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses ，Buttersworth，Boston，MAを参照のこと。 形質転換された細胞は、組換えDNA技術を用いて構築されたベクターを含有す るCCF18ケモカイン遺伝子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細 胞（好ましくは哺乳動物細胞）を含む。形質転換された宿主細胞は、通常、リガ ンドまたはそのフラグメントを発現するが、クローニング、増幅、およびそのDN Aの操作の目的のためには、そのタンパク質の発現を必要としない。本発明はさ らに、栄養培地で形質転換細胞を培養することを包含し、従って、培養物中にタ ンパク質を蓄積することを可能にする。タンパク質は、培養物または培養培地の いずれかから回収され得る。 本発明の目的のために、DNA配列は、それらが互いに機能的に関連している場 合、作動可能に連結される。例えば、予備的な配列決定のためのDNAまたは分泌 リーダーは、それがプレタンパク質として発現されるか、または細胞膜へのポリ ペプチドの指向もしくはポリペプチドの分泌に関連する場合、ポリペプチドに作 動可能に連結される。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場 合、コード配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を 可能にするように位置づけられる場合、コード配列に作動可能に連結される。通 常、作動可能に連結されたとは、隣接およびリーディングフレーム内を意味する 。しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝エレメントは、隣接しては連 結されないが、オペレーター配列になお結合されて、次に発現を制御する。 適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を包含する 。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性の生物（例えば、E.coliおよびB.su btilis）の両方を包含する。下等真核生物は、酵母（例えば、S.cerevisiaeおよ びPichia）、およびDictyostelium属の種を包含する。高等真核生物は、非哺乳 動物起源（例えば、昆虫細胞、および鳥類）および哺乳動物起源（例えば、ヒト 、霊長類、および齧歯動物）の両方の動物細胞に由来する確立された組織培養細 胞株を包含する。 原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種に対して広範な種々のベクター を包含する。本明細書中で使用するように、E.coliおよびそのベクターは、他の 原核生物に使用される同等のベクターを包含するために一般的に使用される。DN Aを増幅するための代表的なベクターは、pBR322およびその多くの誘導物である 。CCF18ケモカインまたはそのフラグメントを発現するために使用され得るベク ターとしては、lacプロモーター（pUC−シリーズ）；trpプロモーター(pBR322-t rp)；Ippプロモーター(pIN-シリーズ)；λ-pPまたはpRプロモーター(pOTS)；ま たはptac(pDR540)のようなハイブリッドプロモーターを含有するベクターが挙げ られるが、これに限定されない。Brosiusら(1988)「λ−、trp-、lac-、およびI pp-由来プロモーターを用いる発現ベクター」,RodriguezおよびDenhardt（編）V ec tors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses ，Buttersworth , Boston，10章、205-236頁を参照のこと。 下等真核生物（例えば、酵母およびDictyostelium）は、CCF18ケモカイン配列 含有ベクターで形質転換され得る。本発明の目的のためには、最も一般的な下等 真核生物宿主は、パン酵母、Saccharomyces cerevisiaeである。これは下等真核 細胞を総称的に代表するように使用されるが、多数の他の株および種もまた利用 可能である。酵母ベクターは、代表的には、複製起点（組込み型でない限り）、 選択遺伝子、プロモーター、所望されるタンパク質またはそのフラグメントをコ ードするDNA、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化、および転写終結のための配 列からなる。酵母のために適切な発現ベクターとしては、3-ホスホグリセリン酸 キナーゼおよび種々の他の解糖系酵素の遺伝子プロモーターのような構成性プロ モーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチ オニンプロモーターのような誘導性プロモーターが挙げられる。適切なベクター としては、以下の型の誘導体が挙げられる：自己複製低コピー数（例えば、YRp- シリーズ）、自己複製高コピー数（例えば、YEp-シリーズ）；組込み型（例えば 、YIp-シリーズ）、またはミニ染色体（例えば、YCp-シリーズ）。 高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なCCF18ケモカインタンパク質の 発現のために好ましい宿主細胞である。原則的には、無脊椎動物供給源に由来し ても脊椎動物供給源に由来しても、任意の高等真核生物組織培養細胞株（例えば 、昆虫のバキュロウイルス発現システム）が作用可能である。しかし、プロセシ ング（翻訳と同時および翻訳後の両方）の点で、哺乳動物細胞が好ましい。この ような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は慣例的な手順と なっている。有用な細胞株の例としては、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵 巣(CHO)細胞株、ベビーラット腎臓(BRK)細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およ びサル(COS)細胞株が挙げられる。このような細胞株のための発現ベクターは、 通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプライス部位（ゲノムDNA が使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これら のベクターはまた、通常選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクタ ーは、例えば、アデノウイルス、SV40、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、 も しくはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを有する、 プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクター の代表的な例としては、pCDNA1；pCD（Okayamaら（1985）Mol ．Cell Biol. 5: 1 136を参照のこと）；pMClneo Poly-A（Thomasら（1987）Cell 51: 503を参照の こと）；および、pAC 373またはpAC 610のようなバキュロウイルスベクターが挙 げられる。 特異的なまたは規定されたグリコシル化パターンを提供する系においてCCF18 ケモカインポリペプチドを発現させることがしばしば所望される。この場合、通 常のパターンは、発現系により天然に提供されるパターンである。しかし、パタ ーンは、ポリペプチド（例えば、グリコシル化されていない形態）を、異種発現 系中に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝すことにより改変可能であ る。例えば、CCF18ケモカイン遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素 をコードする１つ以上の遺伝子と同時形質転換され得る。このアプローチを使用 して、原核生物または他の細胞において、特定の哺乳動物グリコシル化パターン が達成可能であるかまたは模倣される。 CCF18ケモカイン、またはそのフラグメントは、細胞膜に連結されるホスファ チジルイノシトール(PI)に加工され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵 素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）での処理により膜 から除去され得る。これは、抗体を生物学的に活性な形態で放出し、そしてタン パク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Low（1989）Bioch im ．Biophys．Acta 988: 427；Tseら（1985）Science 230: 1003；およびBrunne r ら(1991)J ．Cell Biol. 114: 1275を参照のこと。 今やCCF18ケモカインが特徴付けられており、そのフラグメントまたは誘導体 がペプチドを合成するための従来のプロセスにより調製され得る。これらとして は、StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chem ical Co.，Rockford，IL; BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesis ，Springer-Verlag，New York，NY; およびBodanszky（1984 ）The Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York，NYに記 載のようなプロセスが挙げられる。例えば、アジドプロセス、酸性塩化物プロセ ス、酸性無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば 、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、もしくは シアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化的−還元的プロ セス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)／添加的プロセスが使用さ れ得る。固相および液相合成の両方が、前記のプロセスに適用可能である。 CCF18ケモカイン、フラグメント、または誘導体は、一般に、いわゆる段階的 プロセス（これはアミノ酸を末端アミノ酸に、１つずつ順番に、縮合する工程を 包含する）によるか、またはペプチドフラグメントを末端アミノ酸にカップリン グすることによるかのいずれかで、代表的にペプチド合成において用いられるよ うな上記のプロセスに従って適切に調製される。カップリング反応において使用 されないアミノ基は、代表的には不適正な位置でのカップリングを防止するため に保護される。 固相合成が採用される場合、Ｃ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して 、不溶性キャリアまたは支持体に結合される。不溶性キャリアは、それが反応性 カルボキシル基への結合能力を有する限り、特に限定されない。そのような不溶 性キャリアの例としては、ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブ ロモメチル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert-アルキルオ キシカルボニル-ヒドラジド化樹脂などが挙げられる。 アミノ基保護アミノ酸が、その活性化カルボキシル基と以前に形成されたペプ チドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチドが 一歩ずつ合成される。完全な配列の合成後、ペプチドは不溶性キャリアからはず されて、ペプチドが生成される。この固相アプローチは、Merrifieldら(1963)J. Am ．Chem．Soc. 85:2149により一般的に記載されている。 調製されたリガンドおよびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段（例えば 、抽出、沈殿、電気泳動、および種々の形態のクロマトグラフィーなど）により 、反応混合物から単離および精製され得る。本発明のCCF18ケモカインは、その 所望される使用に依存して、変動する程度の純度で得られ得る。精製は、本明細 書において開示されるタンパク質精製技術の使用により、または免疫吸収剤（im munoabsorbant）親和性クロマトグラフィーにおいて本明細書中に記載の抗体の 使 用により達成され得る。この免疫吸収剤親和性クロマトグラフィーは、まず、抗 体を固相支持体に連結し、次いで、連結した抗体を、適切な供給源細胞の可溶化 された溶解物、リガンドを発現する他の細胞の溶解物、またはDNA技術の結果と してCCF18ケモカインを産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることに より行われる（以下を参照のこと）。使用 本発明は、本明細書中の他所に（例えば、発達異常についての一般的な記載に おいて）、または以下に（診断用のキットの記載において）記載されるような診 断的適用における使用を見出す試薬を提供する。 本発明はまた、顕著な治療的価値を有する試薬を提供する。CCF18ケモカイン （天然に生じるまたは組換え）、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は 、CCF18ケモカインに対する結合親和性を有するとして同定された化合物ととも に、異常な生理機能または発達（炎症状態を含む）に関連する状態の処置におい て有用であるはずである。特に、白血球のトラフィッキングの調整はそれらしい が、より広い組織分布はより広い生物学的活性（抗ウイルス効果を含む）を示唆 し得る。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書中に提供される組成物 を使用する適切な治療的処置により調整され得る。例えば、CCF18ケモカインに よる異常な発現または異常なシグナリングに関連する疾患または障害は、このリ ガンドのアゴニストまたはアンタゴニストのためのそれらしい標的であるはずで ある。 種々の異常な生理的または発達的状態は、ノーザンブロット分析によってCCF1 8mRNAを有すると示される細胞タイプにおいて公知である。Berkow（編）The Mer ck Manual of Diagnosis and Therapy ，Merck & Co.，Rahway，N.J.；およびTho rnら Harrison's Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.を参照 のこと。発達的または機能的異常（例えば、免疫系の異常）は、本明細書中に提 供される組成物を使用する予防または処置に感受性であり得る、顕著な医学的異 常および状態を引き起こす。 組換えCCF18ケモカイン抗体は精製され得、次いで患者に投与され得る。これ らの試薬は治療的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分と（例えば、 従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバン ト）中で）、生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る 。これらの組み合わせは濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に 、または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。本発明はまた 、抗体またはその結合フラグメント（補体結合でない形態を含む）の使用を意図 する。 抗体もしくはレセプターまたはそのフラグメントを使用する薬物スクリーニン グを実施して、CCF18ケモカインに対する結合親和性を有する化合物（会合成分 の単離を含む）を同定し得る。次いで、その化合物が固有の刺激活性を有し、そ してそれゆえ、リガンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまたはア ンタゴニストであるかどうか決定するために、次の生物学的アッセイが利用され 得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物はレセプターを活性化し得、そし て従って、それがCCF18ケモカインの活性を刺激するとうい点で、アゴニストで ある。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのCCF18ケモカインに対する抗体 の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のCCF18ケモカイン種変異体に ついて特に有用であるはずである。 効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子は 、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の薬物(medic ant)を包含する。従って、処置用量は、安全性および有効性を最適化するために 滴定(titrate)されるべきである。代表的には、インビトロで使用される用量は 、これら試薬のインサイチュでの投与に有用な量における有用な手引きを提供し 得る。特定の疾患の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの用量のさらなる 予測的な指標を提供する。以下には、種々の考察が記載されている、例えば、Gi lmanら（編）（1990）Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of T herapeutics （第８版）Pergamon Press: および(1990)Remington's Pharmaceuti cal Sciences （第17版）Mack Publishing Co.，Easton Penn.。投与法は、それ らの中および以下で考察されている。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投 与、または筋肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生 理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index，Merck ＆ Co.,Rahway，New Je rsey に記載された他の化合物を包含する。用量の範囲は通常、適切なキャリアを有し て、１mM濃度より低い量であり、代表的には約10μM濃度未満、通常約100nM未満 、好ましくは10pM（picomolar）未満、そして最も好ましくは約１fM（femtomola r）未満の範囲であると期待される。徐放性処方物または徐放性装置が、持続的 な投与にしばしば使用される。 CCF18ケモカイン、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフ ラグメント、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与 され得るか、または、化合物のサイズに依存して、それらを投与前にオボアルブ ミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質に結合させることが所望 され得る。治療的処方物は、任意の従来の投与処方物中で投与され得る。活性な 成分を単独で投与することは可能であるが、治療的処方物として呈することが望 ましい。処方物は、上記で定義したように、その１またはそれより多い受容可能 なキャリアとともに、代表的には少なくとも１つの活性な成分を包含する。それ ぞれのキャリアは、他の成分に適合性であり、そして患者に対して有害でないと いう意味で薬学的におよび生理学的に受容可能であるべきである。処方物は、経 口投与、直腸投与、鼻投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内 投与、および皮内投与を包含する）に適切な処方物を包含する。処方物は、便宜 的に単位用量形態で存在し得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製さ れ得る。例えば、Gilmanら（編）(1990)Goodman およびGilmanの：The Pharmacol ogical Bases of Therapeutics ，第８版、Pergamon Press;およびRemington's P harmaceutical Science ，第17版(1990)、Mack Publishing Co.，Easton，Penn.; Avisら（編）(1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications D ekker ，New York; Liebermanら（編）(1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tab lets Dekker，New York; およびLiebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dos age Forms: Disperse Systems Dekker，New Yorkを参照のこと。本発明の治療は 、他の化学治療剤または化学予防剤と併用されるかまたは関連して使用され得る 。 本発明のCCF18ケモカインの天然に存在する形態および組換えの形態の両方は 、このタンパク質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし得る、キ ッ トおよびアッセイ法に特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法は、短 期間に多数の化合物のスクリーニングを可能にするように近年開発されている。 例えば、固体基質上に合成された多数の所定のポリマーによる結合親和性の試験 のための手段を記載しているFodorら（1991）Science 251: 767を参照のこと。 適切なアッセイの開発は、本発明で提供される大量の精製可溶化CCF18ケモカイ ンの利用可能性により、非常に容易になり得る。 例えば、アンタゴニストは、一旦リガンドが構造的に定義されれば、通常見出 され得る。潜在的なリガンドアナログの試験は、生理学的に応答性の細胞を使用 する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、現在可能である。特に、新た なアゴニストおよび新たなアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニン グ技術を使用することにより発見される。 生存細胞はまた、CCF18ケモカイン仲介性機能（例えば、第２メッセンジャー のレベル、すなわち、Ca⁺⁺；イノシトールリン酸のプールの変化（例えば、Berr idge（1993）Nature 361:315またはBillahおよびAnthes（1990）Biochem ．J. 26 9:281を参照のこと）；細胞形態学改変応答；ホスホイノシチド脂質ターンオー バー；抗ウイルス応答など）に対する薬物の効果をスクリーニングするために使 用され得る。いくつかの検出方法は、分離工程の削除を可能にする（例えば、近 接感受性検出システム(proximity sensitivc detection system)）。カルシウム 感受性の色素は、蛍光計測器または蛍光細胞選別装置を用いてCa⁺⁺レベルを検出 するために有用である。 合理的なドラッグデザインはまた、CCF18ケモカインおよび他のエフェクター またはアナログの分子の形の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、リガン ド結合に応答して他の機能を仲介する他のタンパク質、または通常はレセプター と相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と 相互作用するかを決定する１つの手段は、物理的構造決定（例えば、Ｘ線結晶学 または２次元NMR技術）である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を 形成するかについての手引きを提供する。タンパク質の構造決定の詳細な記載は 、例えば、BlundellおよびJohnson（1976）Protein Crystallography，Academic Press，New Yorkを参照のこと。 精製CCF18ケモカインは、前述の薬物スクリーニング技術に使用するプレート に直接コートされ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体は、それ ぞれのリガンドを固相に固定化する捕獲抗体として使用され得る。キット 本発明はまた、リガンド、抗体、またはCCF18ケモカインレセプターの存在を 検出するための種々の診断キットおよび方法におけるCCF18ケモカインタンパク 質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。 代表的には、キットは、定義されたCCF18ケモカインペプチドまたは遺伝子セグ メント、あるいはどちらか一方を認識する試薬（例えば、抗体）のいずれかを含 む区画を有する。 CCF18ケモカインに対する試験化合物の結合親和性を測定するためのキットは 、代表的には、試験化合物；標識化合物（例えば、リガンドに対する既知の結合 親和性を有する抗体）；CCF18ケモカインの供給源（天然に存在するかまたは組 換えの）；およびリガンドを固定化するための固相のような、遊離標識化合物か ら結合標識化合物を分離するための手段を含有する。一旦化合物がスクリーニン グされると、リガンドに対する適切な結合親和性を有する化合物が、レセプター に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否かを決定するため に、当該分野で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換え CCF18ケモカインポリペプチドの利用可能性は、そのようなアッセイを較正する ための良く規定された標準をまた提供する。 サンプル中の、例えばCCF18ケモカインの濃度を測定するための好ましいキッ トは、代表的には、標識化合物（例えば、リガンドに対する既知の結合親和性を 有する抗体）、リガンドの供給源（天然に存在するかまたは組換えの）、および 遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段（例えば、CCF18ケモ カインを固定化するための固相）を含有する。試薬および説明書を含む区画が、 通常提供される。 CCF18ケモカインまたはリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメ ントを包含する抗体は、CCF18ケモカインおよび／またはそのフラグメントの上 昇したレベルの存在を検出する診断的適用に有用である。このような診断的アッ セイは、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を用い得、そ してさらに血清などの中のリガンドに関連する抗原の検出を包含し得る。診断ア ッセイは、等質（遊離試薬と抗原−リガンド複合体との間の分離工程を有しない ）または異質（分離工程を有する）であり得る。ラジオイムノアッセイ(RIA)、 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、酵素増幅イムノ アッセイ技術(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)などのような種々の 市販のアッセイが存在する。例えば、未標識抗体は、第２の抗体を使用すること により用いられ得、この第２の抗体は標識され、そしてCCF18ケモカインまたは その特定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッセイがまた、文献 で広範に考察されている。例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies: A La boratory Manual ，Cold Spring Harbor Pressを参照のこと。 抗イディオタイプ抗体は、種々の異常な状態の徴候であり得るCCF18ケモカイ ンに対する抗体の存在を診断するための類似の使用を有し得る。例えば、CCF18 ケモカインの過剰産生により、種々の免疫学的応答の生成を生じ得、この応答は 、異常な生理状態（特に種々の炎症性状態）の徴候であり得る。 しばしば、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適化するように キット中に供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標識の 性質に依存して、標識抗体、未標識抗体または標識CCF18ケモカインのいずれか が提供される。これは通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル生 成に必要な物質などのような他の添加剤との結合体である。好ましくは、キット はまた、適切な使用および使用後の内容物の処分のための説明書を含む。代表的 には、キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有する。望ましくは、試薬 は、乾燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここで、試薬は水性の媒体中で再構 成され得、アッセイを行うために適当な濃度の試薬を提供し得る。 薬物スクリーニングアッセイおよび診断アッセイの任意の前述の成分は、改変 せずに使用され得、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、直接ま たは間接的に検出可能なシグナルを提供する部分に、共有結合的にまたは非共有 結合的に連結することにより達成され得る。これらのアッセイの任意のものにお いて、リガンド、試験化合物、CCF18ケモカイン、またはそれらに対する抗体が 、直接または間接のいずれかで標識され得る。直接標識の可能性は、以下の標識 グループを包含する：¹²⁵Ｉのような放射標識、ペルオキシダーゼおよびアルカ リホスファターゼのような酵素（米国特許第3,645,090号）、および蛍光強度、 波長移動、または蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特許第3,940, 475号）。間接標識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く上記の標識 グループの１つに結合したアビジンへの結合が含まれる。 遊離のリガンドから結合リガンドを分離する、あるいは、遊離の試験化合物か ら結合試験化合物を分離する多数の方法もまた存在する。CCF18ケモカインは、 種々の基質に固定化され得、続いて洗浄され得る。適切な基質には、ELISAプレ ート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが含まれる。CCF18ケモ カインを基質に固定化する方法には、プラスチックへの直接接着、捕獲抗体の使 用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンga含まれるがこれらに限定 されない。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールの ような有機溶媒または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を包含する任 意のいくつかの方法によるリガンド／抗体複合体の沈澱を包含する。他の適切な 分離技術には、Rattleら（1984）Clin ．Chem. 30: 1457に記載されるフルオレセ イン抗体磁化粒子法、および米国特許第4,659,678号に記載のような２重抗体磁 性粒子分離が含まれるが、これらに限定されない。 種々の標識にタンパク質またはそれらのフラグメントを連結する方法は、文献 で広範に報告されており、ここでは詳細に考察する必要はない。技術の多くは、 カルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を介してのペプチド結合の 形成のための活性化カルボキシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化 ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイ ミド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はま た、これらの適用における使用が見出され得る。 本発明の別の診断的局面は、CCF18ケモカインの配列から得られたオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、異常 な状態（例えば、炎症または発達の問題）を有すると疑われる患者由来のサンプ ル中のリガンドメッセージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得 る。RNAおよびDNAヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好 ましいサイズは、文献中に充分記載および考察されている。標準的には、オリゴ ヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常は、少なくとも約 18ヌクレオチドを有すべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数kbま でであり得る。種々の標識、最も一般的には放射性核種、特に³²Ｐが用いられ得 る。しかし、ポリヌクレオチドに導入するためのビオチン改変ヌクレオチドの使 用のような他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチンがアビジンまたは抗 体への結合のための部位として作用し、これは、広範な種々の標識（例えば、放 射性核種、フルオロフォア（fluorescer）、酵素など）で標識され得る。あるい は、特定の２本鎖（DNA２本鎖、RNA２本鎖、DNA−RNAハイブリッド２本鎖、また はDNA−タンパク質２本鎖を含む）を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、 抗体が標識され得、そしてアッセイが行われる。ここで、２本鎖は表面に結合さ れ、そして表面での２本鎖の形成により２本鎖に結合する抗体の存在が検出され 得る。新規なアンチセンスRNAに対するプローブの使用は、任意の従来技術（例 えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組 換えプローブ(recombinational probing)、ハイブリッド放出翻訳(hybrid relea se translation)(HRT)、およびハイブリッド停止翻訳(hybrid arrested transla tion)(HART)）で実行され得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のよう な増幅技術を包含する。 他のマーカーの質的存在または量的存在を試験する診断キットもまた意図され る。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わせに依 存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせを試験し得る。例えば、Vi alletら（1989）Progress in Growth Factor Res. 1: 89を参照のこと。レセプター 特異的相互作用のリガンド結合パートナーが単離されれば、対のパートナーを 単離するための方法が存在する。Gearingら、EMBO J. 8: 3667を参照のこと。例 えば、そのレセプターへの結合に干渉せずにCCF18ケモカインを標識する手段が 決定され得る。例えば、親和性標識がリガンドのアミノ末端またはカルボキシル 末端のいずれかに融合され得る。発現ライブラリーが、例えば、細胞選別により 、またはそのような結合成分を発現するサブ集団を検出するための他のスクリー ニングにより、CCF18ケモカインの特異的結合についてスクリーニングされ得る 。例えば、Hoら（1993）Proc ．Nat'l Acad．Sci. 90: 11267を参照のこと。ある いは、パンニング法が使用され得る。例えば、SeedおよびAruffo（1987）Proc ． Nat'l Acad．Sci. 84: 3365を参照のこと。 標識とのタンパク質架橋結合技術は、CCF18ケモカインの結合パートナーを単 離するために適用され得る。これにより、例えば、リガンド−レセプター様の方 法で、CCF18ケモカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定が可能となる 。 別の実施態様において、CC CKR3と命名される新たなレセプターが単離された 。ヒト構築物および産物の配列が、表４に提供される。ヌクレオチドレベルまた はタンパク質レベルで改変体を作製するための類似の手段、および抗体を作製す るための手段が、上記のように利用可能である。リガンドに対する多くの類似の 用途または関連する用途が、特異的な結合試薬としてレセプターに適用される。 多くの用途（キットを含む）もまた、類似の技術を通して利用可能である。 本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考にして最も良く理解されるが、これ は、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。 実施例 一般的方法 いくつかの標準的な方法が、例えば以下に記載されまたは参照される：Maniat isら、(1982)Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory，Cold Spring Harbor Press; Sambrookら、(1989)Molecular Cloning : A Laboratory Manual ，(第二版)、第１〜３刊，CSH Press，NY; Ausubelら、B iology ，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY;またはAusubelら、(198 7および補遺)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New Yo rk; Innisら、（編）(1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicati ons Academic Press，N.Y.。タンパク質精製のための方法には、硫安沈澱、カ ラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、およびその他が含まれ る。例えば、Ausubelら、(1987および定期的増補); Deutscher(1990)「タンパク 質精製へのガイド」Methods in Enzymology，第182刊、およびこのシリーズの他 の刊；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造者の印刷物（例えば、Ph armacia，Piscataway，N.J.、またはBio-Rad，Richmond，CA.）を参照のこと。 組換え技術との組合せは、適切なセグメント（例えば、FLAG配列またはプロテア ーゼ除去配列を介して融合され得る等価物）への融合を可能にする。例えば、Ho chuli（1989）Chemische Industrie 12:69; Hochuli(1990)「Purification of R ecombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」Setlow（編）Genetic En gineering ，Principle and Methods 12:87，Plenum Press，NY;およびCroweら、 （1992）OIAexpress: The High Level Expression ＆ Protein Purification Sy stem QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CAを参照のこと。 FACS分析は、Melamedら、（1990）Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss， Inc.，New York，NY；Shapiro（1988）Practical Flow Cytometry Liss，New Yo rk，NY；およびRobinsonら、(1993)Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley - Liss，New York，NYに記載されている。マウスおよびヒトCCF18 cDNAの単離および配列決定 BF-EGFR/EPORHは、上皮成長因子（EGF）レセプターの細胞外ドメインとエリス ロポエチンレセプターの細胞質ドメインとの間のキメラレセプターを発現するBa /F3（マウスプレＢ細胞株；Palaciosら、(1985)Cell 41:727;およびPalaciosら 、(1984)Nature 309:126を参照のこと）トランスフェクト体であり、そしてIL-3 またはEGFのいずれかに応答して増殖する(例えば、Maruyamaら、(1994)J ．Biol ．Chem. 269:5976を参照のこと)。BF-EGFR/EPORH細胞を、10％仔ウシ血清（FCS ）およびIL-3（100ユニット/ml）を含むRPMI 1640中に維持した。COS細胞を、10 ％FCSを含有するDMEM中で培養した。cDNAライブラリーを、EGF刺激BF-EGFR/EPOR H細胞から作製した（例えば、Yoshimuraら、(1995)EMBO J. 14:2816を参照のこ と)。ポリ(A)+ RNAの単離、cDNA合成、および発現ベクターpME18S中への連結を 、Haraら、(1994)Blood 84:189に記載のように行った。 CCF18 cDNA挿入物の配列を、ベクターおよびcDNA挿入物の配列に対応するオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いてTaq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing キット（Applied Biosystems，Foster City，CA）によって決定した。マウスCCF 18 cDNAのオープンリーディングフレームは、21アミノ酸残基の推定シグナル配 列を含む123アミノ酸のポリペプチドをコードする。成熟タンパク質は、約102ア ミノ酸からなり、11548ダルトンの計算された分子量を有する。他のC-Cケモカイ ンファミリーメンバーを用いたコンピューターによる検索は、アミノ酸レベルで MIP-1β(67％)、MIP-1α(56％)、JE(55％)、RANTES(48％)、リンホタクチン（ly mphotactin）(48％)、およびNSGA/Gro-α(43％)との有意な相同性を明らかにし た。 ヒト胎児脾臓cDNAライブラリーをStratageneから購入したが、他のライブラリ ーもまた首尾良く用いられ得た。ライブラリーを、マウスCCF18をプローブとし て用いる標準的な方法によってスクリーニングした。Haraら、(1995)J ．Immunol . 155:5352を参照のこと。単離物は、上記および表３に記載される。マウスCCF18の染色体位置 種間戻し交雑子孫を、Copelandら(1991)Trends Genet. 7:113に記載される（C 57BL/6J×M．spretus）F1雌およびC57BL/6J雄を交配することによって生成した 。全部で205の戻し交雑マウスが、CCF18遺伝子、Scya10遺伝子座をマップするた めに用いられた。DNA単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブ ロット移動、およびハイブリダイゼーションを、本質的にJenkinsら(1982)J.Vir ol. 43:26に記載のように行った。全てのブロットをHybond-N+ナイロン膜（Amer sham）を用いて調製した。Scya10プローブ、CCF18 cDNAの約1.1kb EcoRI/NotIフ ラグメントを、ニック翻訳標識キット（Boehringer Mannheim）を用いた[α-³²P ]dCTPで標識し；洗浄を0.1×SSCP、0.1％SDS、65℃の最終ストリンジェンシーま で行った。7.8kbフラグメントを、BamHI消化C57BL/6J DNAにおいて検出した一方 、5.1kbフラグメントをM．spretus DNAにおいて検出した。5.1kbのM．spretus特 異的BamHIフラグメントの存在または非存在を、戻し交雑マウスにおいて追跡し た。 神経線維腫症１型（Nf1）およびミエロペルオキシダーゼ（Mpo）を含む、Sca1 0に連鎖した遺伝子座のうち２つについてのプローブおよびRFLPの説明は、以前 にBuchbergら（1988）Oncogene Res. 2:149;およびBuchbergら(1989)Genetics12 2:153に報告されている。Frederick種間戻し交雑マップ上のScya10の位置を決め るために用いられる２つの異なる遺伝子座、Scya1およびScya2の位置は、以前に 報告されていない。約700bp Scya1および約700bp Scya2のマウスcDNAプローブを 、ランダムプライミングによって[α-³²P］dCTPで標識し；洗浄を、0.5×SSCP、 0.1％SDS、65℃の最終ストリンジェンシーまで行った。サイズが10.5kbおよび0. 5kbの２つのScya1フラグメントを、EcoRI消化C57BL/6J DNAにおいて検出した。 一方、3.3kbおよび0.5kbフラグメントを、EcoRI消化M.spretus DNAにおいて検出 した。さらに、1.6kb Scya1フラグメントを、PstI消化C57BL/6J DNAにおいて検 出した。一方、2.6kbおよび1.6kbフラグメントを、PstI消化M．spretus DNAにお いて検出した。3.3kbのM．spretus特異的EcoRIフラグメントおよび2.6kbCのM.sp retus特異的PstIフラグメント（これらは、同時分離されている）の存在または 非存在を、戻し交雑マウスにおいて追跡した。データの２つのセットを組み合わ せてScya1のマップ位置を決定した。同様に、主要な5.5kb Scya2フラグメントを 、TaqI消化C57BL/6J DNAにおいて検出した一方、強力にハイブリダイズする7.4k bおよび6.3kb Scya2フラグメントを、M.spretus DNAにおいて検出した。7.4kbお よび6.3kb M.spretus特異的TaqIフラグメントの存在または非存在を、戻し交雑 マウスにおいて追跡した。戻し交雑マウスは、7.4kbまたは6.3kb TaqIフラグメ ントのいずれかを受け継いだが、両方を受け継ぐことはなかった。この結果は、 Frederick種間戻し交雑を生成するために用いられたM.spretusマウスは、まだ２ つのScya2対立遺伝子について分離していたことを示す。組換え距離（recombina tion distance）を、Green(1981)「連鎖、組換えおよびマッピング」、Genetics and Probability in Animal Breeding Experiments Oxford University Press, NY，77に記載のようにコンピュータープログラムSPRETUS MADNESSを用いて計算 した。遺伝子の順序を、染色体を横切る二重および多重組換え事象の数を最小化 することによって決定した。 CCF18（小さい誘導可能サイトカインa10について命名された遺伝子記号Scya1 0）のマウス染色体位置を、種間戻し交雑分析によって決定し、そしてC57BL/6J およびM.spretus DNAをいくつかの酵素によって消化し、そしてマウスScya10 cD NAプローブを用いて情報を与える制限フラグメント長多型性（RFLP）のためのサ ザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。5.1kb M.spretus特異 的BamHIフラグメントを用いて、戻し交雑DNAにおけるScya10遺伝子座の分離を追 跡した。マッピング結果は、Scya10が、２つの異なるメンバー（C-Cケモカイン ファミリー、Scya1(Tca3)およびScya2（Je））に密接に連鎖したマウス第11染色 体の中央領域に位置していることを示した。55匹のマウスが、ハプロタイプ分析 において５つのマーカーについて分析されたが、134匹までのマウスがマーカー のいくつかの対について分析された。各遺伝子座を、さらなるデータを用いて組 み換え頻度について、対ごとの（pairwise）組合せで分析した。遺伝子座の各対 について分析されたマウスの総数に対する組換え染色体を示すマウスの総数の比 、および最もあり得る遺伝子の順序は：セントロメア-Nf1-5134-scya1-0/107-sc ya10-0/98-Scya2-2/113-Mpoである。組換え頻度（センチモルガン(cM)＋標準偏 差の遺伝的距離として表わされた）は、セントロメア-Nf1-3.7+1.6-(Scya1，Scy a10，Scya2)-1.8+1.2-Mpoである。共通に型分類された107匹の動物におけるScya 1とScya10との間に、または共通に型分類された98匹のマウスにおけるScya10とS cya2との間に、組換え体を検出しなかった。このことは、各対の遺伝子座が、そ れぞれ互いの（信頼限界）2.2cMおよび3cM以内に存在することを示す。 ３つの他のC-Cケモカイン遺伝子が、最近Scya10の近隣にマップされている。 これらには、MIP-1α(Scya3)、MIP-1β(Scya4)、およびRANTES(Scya5)が含まれ る。Scya5は、Scya1、Scya2、およびScya10と組換えを起こさなかった；Scya3お よびScya4は、共通に型分類された189匹の動物において互いに組換えを起こさず 、そして２つの遺伝子が、Scya10遺伝子クラスターの0.6+/-0.6cM遠位にマップ した。これらの結果は、全てのC-Cケモカイン遺伝子が、マウス第11染色体の中 央領域にマップするという初期の観察を確認および拡張する。Wilsonら(1990)J. Exp ．Med. 171:1301; Bergerら(1993)DNA and Cell Biol. 12.839;およびDanoff ら(1994)J ．Immunol. 152:1182を参照のこと。 最後に、マウス第11染色体の中央領域は、ヒト第17q染色体と相同領域を共有 する。特に、SCYA1およびSCYA2は、ヒト17q12および17q11.2-q12にそれぞれマッ プされている。これは、CCF18（Scya10遺伝子座）のヒトホモログが、17q11-q12 にもマップされるべきであることを示唆する。走化性活性についてのアッセイ CCF18タンパク質を得るために、COS細胞を、エレクトロポレーションによって CCF18 cDNAを保有するプラスミドでトランスフェクトした。Haraら(1992)EMBO J . 10:1875を参照のこと。トランスフェクションの３日後、培養上清を回収し、 そしてバイオアッセイに供した。モックコントロールとして、ルシフェラーゼcD NAを保有するプラスミドを用いた。de Wetら(1987)Mol ．Cell．Biol. 7:725を参 照のこと。組換えマウスMIP-1αを、R&D Systems（Minneapolis，MN）から購入 した。 リンパ球遊走アッセイを、Baconら(1988)Br ．J．Pharmacol. 95:966に以前に 記載されたように、至適の遊走が、アッセイのインキュベーションのわずか２時 間後に観察されるという改変を伴って行った。２つのマウスTh2 Ｔ細胞クローン 、CDC-25(Tonyら(1985)J ．Exp．Med. 161:223を参照のこと)、およびHDK-1（Che rwinskiら(1987)J ．Exp．Med. 166:1229参照のこと）を、それぞれR．Coffmanお よびA．O'Garra(DNAX，Palo Alto，CA)から好意により得た。ケモカイン刺激時 のCa²⁺フラックスを、Baconら(1995)J ．Immunol. 154:3654に記載される公開さ れた手順に従って測定した。 MIP-1αに応答する遊走細胞の最大数が、ヒトＴ細胞のCD4+集団についての最 初の報告に一致して10^-8Ｍの濃度にて起こった。Schall(1993)J ．Exp．Med. 177 :1821を参照のこと。マウスＴ細胞クローンは、類似する最大細胞数を伴ってCCF 18およびMIP-1αの両方に応答し、特徴的な釣り鐘状の用量応答曲線を生じた。 Ｔリンパ球の最大数は、CCF18含有上清の500〜1000倍希釈の存在下で遊走した。 より高い濃度のCCF18において、細胞はフィルターの上部表面に接着し、これは 下部表面上で記録された細胞のより少ない細胞数を説明した。全ての実験におい て、モック上清の同一の濃度範囲が試験されたが、細胞に対していかなる効果も 有しなかった。走化性活性対化学運動性活性についてのアッセイは、CCF18が走 化性遊走を誘発したことを実証した。 C-Cケモカインでの刺激の後、リンパ球は一般に、測定可能な細胞内Ca²⁺フラ ックスを示す。これはCCF18を用いた場合も同様であった。MIP-1αおよびCCF18 の両方が、カルシウム可動化の即時的トランジェント(immediate transient)を 誘導し得た。しかし、MIP-1αは、引き続くCCF18の投与に対して細胞を完全に脱 感作した。CCF18の予投与（prior administration）は、より小さいカルシウム フラックスプロフィールによって証明されるように、MIP-1αの引き続く投与に 対する応答を部分的に脱感作しただけであった。 これらのアッセイにおいて用いられるCCF18のレベルは、走化性アッセイにつ いて用いられたレベルと類似していた（調製された上清の1/1000希釈）。全ての 場合において、コントロールCOS上清（モックトランスフェクトされた）は、い かなるカルシウム可動化応答も誘発しなかった。マウスCCF18のノーザンブロット分析 RNAブロットおよびハイブリダイゼーションを、1.1kb EcoRI/NotI CCF18 cDNA フラグメントをプローブとして用いることによって、Maniatisら（1982）Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Co Id Spring Harbor，NYの標準的な方法に従って行った。各レーンにロードされた RNAの量を評価するために、膜をWAF1 cDNAを用いて再びプローブした（El-Deiry ら(1993)Cell 75:817を参照のこと）。WAF1 cDNAを、この研究におけるcDNAライ ブラリーまたはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）cDNA（C lontech，Palo Alto CA）のスクリーニング中に得た。 CCF18 mRNA（主要バンドについてサイズが約1.4kb）は、マクロファージ細胞 株P388D1、およびIL-3-依存性骨髄性細胞株32Dにおいて比較的高いレベルで構成 的に発現した。少量のCCF18 mRNAもまた、IL-3依存性肥満細胞株MC/9、プレＢ細 胞株Y16、および線維芽細胞株NIH3T3において検出された。しかし、Ｔ細胞株、C TLL-2、およびプロＢ株、Ba/F3、は、CCF18 mRNAを発現しない。さらに、Ba/F3 細胞中のCCF18 mRNAの発現レベルは、クローンにより様々であった。BF-EGFR/EP ORHにおいて、CCF18 mRNAは、最も高く検出されそしてサイトカイン刺激なしに 構成的に発現した。一方、他のBa/F3トランスフェクト体である626およびBF-EGF Rにおいて、CCF18転写物の量は低く、そして626細胞においてサイトカイン誘導 性であるようであった。p21 WAF1をコードするcDNA（そのmRNA発現がサイトカイ ン刺激によって増強される）は、それらの細胞株においてRNA量およびサイトカ イン応答を確認するために用いられた。従って、CCF18の産生がどのように調節 されるかは不明である。なぜなら、C-Cケモカインの発現は、種々の刺激によっ て差別的に調節されていると思われるからである。Orlofsky(1994)J ．Immunol. 152:5084を参照のこと。ヒトケモカインレセプターCC CKR3 cDNAの単離 CC CKR3 cDNAを、Neoteら（1993）Cell 72:415-425に記載の手順を用いて単離 した。２つの縮重PCRプライマーを、公知のケモカインレセプターの保存された 領域からの配列を用いて設計した。これらのプライマーを用いて、ヒトゲノムDN Aの特定の領域を増幅した。縮重PCRプライマー １．DRYLAIVHAdeg(+) 5'-GAT CGI TAG CTI GCI ATI; GTI CA(T/C) GC-3' ２．TM7deg(-)α 5'-CG GAA III(C/A)TC IC(G/C)IAC(G/A)AA IGC(G/A)TA-3' Iは、デオキシイノシンを表す。 この方法によって同定されたDNA配列のうち、１つはCC CKR3遺伝子の一部を表 していた。次いで、このDNAフラグメントを用いて、全長cDNAを得るために、T.M cClanahan(DNAX，Palo Alto CA)によって提供されたTh0活性化Ｔ細胞cDNAライブ ラリーをスクリーニングした。CCF18 およびCC CRK3に対する抗体の作製 精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記のような標準的な方法によ って抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を、 免疫系に対して提示し、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成す る。例えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; ならびにHarlowおよびLane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spri ng Harbor Pressを参照のこと。 結合試薬は、上記のように標識される（例えば、蛍光またはその他の方法）か 、あるいはパンニング法のための基質に固定化されるかのいずれかである。 結合組成物は、CCF18ケモカインを発現する細胞株から作製された発現ライブ ラリーをスクリーニングするために用いられる。標準的な染色技術が、細胞内ま たは表面発現リガンドを検出または選別するために用いられるか、あるいは表面 発現形質転換細胞がパンニングによりスクリーニングされる。細胞内発現のスク リーニングは、種々の染色または免疫蛍光手順により実施される。McMahanら、( 1991)EMBO.J. 10: 2821も参照のこと。 例えば、０日目に、30分間室温にて、フィブロネクチンのチャンバー当たり１ ml（PBS中に10ng/ml）で2-チャンバーパーマノックススライド（2-chamber perm anox slide）を予備被覆する。PBSで１回リンスする。次いで1.5mlの増殖培地中 に、チャンバーあたり2〜3×10⁵細胞でCOS細胞を播く。37℃で一晩インキュベー トする。 それぞれのサンプルについて１日目に、血清非含有DME中に66μg/ml DEAE-デ キストラン、66μMクロロキン、および４μg DNAの溶液0.5mlを調製する。それ ぞれのセットについて、ポジティブコントロール（例えば、１および1/200倍の 希釈度のhuIL-10-FLAG cDNA）、およびネガティブモックを調製する。血清非含 有DMEで細胞をリンスする。DNA溶液を添加し、37℃で５時間インキュベートする 。培地を除去し、0.5mlのDME中10％ DMSOを2.5分間添加する。これを除去し、DM Eで１回洗浄する。1.5mlの増殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。 ２日目に、培地を交換する。３日目または４日目に、細胞を固定および染色す る。細胞を、Hankの緩衝化生理食塩溶液（HBSS）で２回洗浄し、そして５分間４ ％パラホルムアルデヒド（PFA）/グルコース中で固定する。HBSSで３回洗浄する 。全ての液体を除去した後、このスライドを-80℃で保存し得る。それぞれの チャンバーについて、0.5mlのインキュベーションを以下のように実施する。20 分間32μl/mlの1M NaN₃とともにHBSS/サポニン（0.1％）を添加する。次いで細 胞を、HBSS/サポニンで１回洗浄する。細胞に抗体複合体を添加し、そして30分 間インキュベートする。HBSS/サポニンで細胞を２回洗浄する。1/200の希釈度で 二次抗体（例えば、Vector抗マウス抗体）を添加し、そして30分間インキュベー トする。ELISA溶液（例えば、Vector Elite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶 液）を調製し、そして30分間予備インキュベートする。例えば、2.5mlのHBSS/サ ポニン当たり、１滴の溶液A（アビジン）および１滴の溶液B（ビオチン）を用い る。HBSS/サポニンで２回細胞を洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、30分間インキ ュベートする。HBSSで２回細胞を洗浄し、２分間の２回目の洗浄で細胞を閉じ込 める。次いでVectorジアミノ安息香酸（DAB）を5〜10分間添加する。５mlのガラ ス滅菌水あたり２滴の緩衝液＋４滴のDAB＋２滴のH₂O₂を用いる。注意深くチャ ンバーを取り出し、水中でスライドをリンスする。数分間風乾し、次いで１滴の Crystal Mountおよびカバー片を添加する。85〜90℃で５分間ベータする。 あるいは、結合組成物は、リガンドを発現する細胞をアフィニティー精製する かまたは選別するために用いられる。例えば、Sambrookら、またはAusubelらを 参照のこと。 本発明の多くの改変および変化は、当業者に明らかなように、その意図および 範囲を逸脱することなく行われ得る。本明細書中に記載した特定の実施態様は、 例示のためのみに提供され、そして本発明は、添付の請求項の用語によってのみ 、そのような請求項が与えられる等価物の全範囲とともに、限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/577 33/577 Ｂ (72)発明者 スカル，トーマス ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロパーク，ミルズ アベニュー 2050 (72)発明者 ワン，ウェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94036, パロアルト，ミドルフィールド ロード 3090 (72)発明者 吉村 昭彦 福岡県久留米市御井町2526―12

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下からなる群より選択される組成物： a) 実質的に純粋なCCF18ケモカイン； b) CCF18ケモカイン配列を含む融合タンパク質； c) CCF18ケモカインへの結合に特異的な抗体；および d) CCF18ケモカインまたはその融合タンパク質をコードする核酸。 ２．請求項１に記載のCCF18ケモカインであって、該ケモカインが： a) 鳥類、およびマウスもしくはヒトを含む哺乳動物の群より選択される温血 動物由来であるか； b) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４によって規定 される配列を含むか； c) 天然のCCF18ケモカインとは異なる翻訳後修飾パターンを示すか；または d) 表２に開示される特徴を示す、 ケモカイン。 ３．請求項２に記載のケモカインおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組 成物。 ４．請求項１に記載の融合タンパク質であって、以下： a) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４によって規定 される配列；および/または b) 別のサイトカインもしくはケモカインの配列 を含む、融合タンパク質。 ５．請求項１に記載の抗体であって、ここで： a) 前記CCF18ケモカインが、マウスもしくはヒトを含む哺乳動物タンパク質で あるか； b) 該抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４に よって規定されるペプチド配列に対して惹起されるか； c) 該抗体が、モノクローナル抗体であるか；または d) 該抗体が、標識されている、 抗体。 ６．請求項１に記載の核酸であって、ここで： a) 前記ケモカインが、鳥類、およびマウスもしくはヒトを含む哺乳動物の群 より選択される温血動物由来であるか； b) 該核酸が、表１もしくは表３に記載の配列を含むか； c) 該核酸が、発現ベクターであるか；または d) 該核酸が、デオキシリボ核酸ヌクレオチドを含む、核酸。 ７．以下からなる群より選択される組成物： a) 実質的に純粋なCCKR3ケモカインレセプター； b) CCKR3ケモカインレセプター配列を含む融合タンパク質； c) CCKR3ケモカインレセプターへの結合に特異的な抗体；および d) CCKR3ケモカインレセプターまたはその融合タンパク質をコードする核酸。 ８．請求項７に記載のCCKR3ケモカインレセプターであって、ここで該レセプタ ーが： a) 鳥類、およびマウスもしくはヒトを含む哺乳動物の群より選択される温血 動物由来であるか； b) 表４に記載の配列を含むか；または c) 天然のCCKR3ケモカインレセプターとは異なる翻訳後修飾パターンを示す、 CCKR3ケモカインレセプター。 ９．請求項７に記載の融合タンパク質であって、以下： a) 配列番号５および配列番号６によって規定される配列；ならびに/または b) ケモカインの別のレセプターの配列、 を含む、融合タンパク質。 １０．請求項７に記載の抗体であって、ここで： a) 前記CCKR3ケモカインレセプターが、マウスもしくはヒトを含む哺乳動物タ ンパク質であるか； b) 該抗体が、配列番号５もしくは配列番号６に規定されるペプチド配列に対 して惹起されるか； c) 該抗体が、モノクローナル抗体であるか；または d) 該抗体が、標識されている、 抗体。 １１．請求項７に記載の核酸であって、ここで： a) 前記ケモカインレセプターが、鳥類、およびマウスもしくはヒトを含む哺 乳動物の群より選択される温血動物由来であるか； b) 該核酸が、表４に記載の配列を含むか； c) 該核酸が、発現ベクターであるか；または d) 該核酸が、デオキシリボ核酸ヌクレオチドを含む、 核酸。