JP2000514295A

JP2000514295A - 哺乳動物のケモカイン試薬

Info

Publication number: JP2000514295A
Application number: JP10505213A
Authority: JP
Inventors: シー．ギシュ，カート; ジェイ．スカル，トーマス; ビカリ，アライン; ズロトニック，アルバート; ワン，ウェイ
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2000-10-31
Also published as: WO1998001557A2; EP0909321A2; WO1998001557A3; AU3574997A

Abstract

(57)【要約】哺乳動物由来の新規のケモカイン、精製タンパク質を含むそれに関連する試薬、特異的な抗体、および上記のケモカインをコードする核酸。ケモカインレセプターもまた提供される。上記の試薬を使用する方法、および診断用キットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物のケモカイン試薬発明の分野本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細胞）の生理学、発生、および／または分化の制御において機能するタンパク質に関する組成物に関する。特に、本発明は、造血細胞を含む種々の細胞型の生理学、発生、分化、および機能を調節するタンパク質および模倣物を提供する。本発明はまた、ケモカイン様タンパク質に対するレセプター試薬を提供する。発明の背景哺乳動物循環系の循環成分は、種々の細胞型（赤血球細胞系統または骨髄細胞系統の赤血球および白血球細胞を含む）を含む。例えば、Rapaport（1987）Intr oduction to Hematology （第２版）Lippincott，Philadelphia，PA;Jandl（1987 ）Blood:Textbook of Hematology，Little，Brown and Co.，Boston，MA.;およびPaul（編）(1993)Fundamental Immunology 第３版，Raven Press，N.Y.を参照のこと。分化の種々の段階を介する進行は、細胞に提供される種々のシグナルにより調節され、しばしばサイトカインとして知られるタンパク質のクラスにより媒介される。この群の分子のうち、化学遊走物質サイトカインすなわちケモカインとして知られるさらなる群が存在する。例えば、Schall（1994）「The Chemoki nes」Thomson（編）The Cytokine Handbook（第２版）Academic Press;ならびにS challおよびBacon（1994）Current Opinion in Immunology 6:865-873を参照のこと。ケモカインの生物学的活性の完全なスペクトルは広範には調べられていないが、走化性物質効果は認識されている。これらの分子の最も良く知られている生物学的機能は、白血球の走化性に関する。しかし、新たなケモカインが発見され、そして免疫学的応答に応答可能な種々の細胞に対するそれらの生物学的効果は、継続される研究のトピックである。特定のケモカインレセプターはまた、特徴づけられている。例えば、Samsonら、（1996）Biochemistry 35:3362-3367;およびRapportら、（1996）J．Leukocyt e Biology 59:18-23を参照のこと。これらの観察は、造血、免疫発生、および白血球輸送における機能がこれまで未確認であった他の因子が存在することを示す。これらの因子は、効果スペクトルが公知の分化因子、活性化因子、または他のシグナリング因子と異なる生物学的活性を提供する。インビボでの造血細胞の生理を調節する調節因子の構造的、生物学的、および生理学的特性についての知識がないため、この様な因子の効果の改変が妨げられる。従って、関連細胞の発生または生理の調節が必要とされる医療条件は、依然として解決されていない。発明の要旨本発明は、ケモカインをコードする新規の遺伝子、およびケモカインの種々のレセプターをコードする新規の遺伝子の発見に部分的に基づく。本発明は、ケモカインのアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。特に、種々のケモカインの配列（例えば、称される胸腺発現ケモカイン（TECK）；MIP-3α；MIP-3β；および「ケモカインに対する樹状細胞レセプター」（DC CR）および「ケモカインに対する単球／樹状細胞レセプター」（M/DC CR）と称されるケモカインレセプター）；ならびにそれぞれの天然配列の変異体（ムテイン）、融合タンパク質、化学的模倣物、抗体および他の構造的または機能的アナログが提供される。本発明のそれぞれのタンパク質をコードする単離された遺伝子もまた指向される。これらの異なるタンパク質または核酸組成物の種々の使用もまた、提供される。本発明は、実質的に純粋なポリペプチドまたは単離されたポリペプチドを提供し、これは成熟TECK、MIP-3α、MIP-3β、DC CR、またはM/DC CRの対応する部位に対する配列相同性を示すセグメントを含む。ここで、相同性は少なくとも約70 ％の同一性であり、そしてその部分は少なくとも約25アミノ酸である。好ましくは、タンパク質はさらに、少なくとも９アミノ酸を越える少なくとも約90％の相同性；または少なくとも17アミノ酸を越える少なくとも約80％の相同性を示す第２のセグメントを含む。他の好ましい実施態様において、ポリペプチドは：鳥類および哺乳動物（マウスまたはヒトを含む）から選択される温血動物由来であり；配列番号２、４、６、８、10、または12に示される天然配列を含み；ポリペプチドの天然形態とは区別される転写後改変パターンを示し；組換え核酸の発現によって作製され；合成配列を含み；検出可能に標識され；固体基質に結合され；別の化学的部分と結合され；融合タンパク質であり；変性された構造内に存在し（界面活性剤変性を含む）；エピトープタグをさらに含み；免疫原生ポリペプチドであり；規定された同一の分子量を有し；炭素源として有用であり；配列番号２、４、６、８、10、または12の対立遺伝子改変体であり；天然配列の３倍以下の置換された形態であり；無菌組成物中にあり；緩衝化溶液または懸濁物中に存在し；調節された放出デバイス中にあり；転写後修飾を含み；細胞内にあり；またはキットにおける使用もしくは試薬の配置の指示をさらに含むキット中に存在する。他の局面において、本発明は、このようなタンパク質をコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。ここで、この部分は、配列番号１、３、５、７、９、または11のコード領域由来の配列からなる。他の局面は、以下のような核酸を含む：上記のセグメントをコードする天然のcDNAに対して少なくとも約80 ％の相同性を示す；発現ベクター中に存在する；プロモーターをさらに含む；複製起点をさらに含む；天然の供給源由来である；検出可能に標識されている；合成核酸配列を含む；６kb未満である；哺乳動物由来である；配列をコードする天然の完全長成熟体を含む；キットにおける使用または試薬の配置についての指示もまた含むキット中に存在する；タンパク質をコードする遺伝子のための特異的ハイブリダイゼーションプローブである；PCR産物である；または細胞内に存在する。本発明は、核酸を発現することによって精製された核酸を用いてタンパク質を産生する方法もまた提供する。あるいは、本発明は、配列番号２、４、６、８、10、または12の少なくとも８つの連続した残基をコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。好ましくは、核酸は少なくとも以下をコードする：配列番号２からの12の連続する残基、および配列番号１からの少なくとも17ヌクレオチドのコード配列をさらに含む；配列番号４からの12の連続する残基、および配列番号３からの少なくとも 17ヌクレオチドのコード配列をさらに含む；配列番号６からの12の連続する残基、および配列番号５からの少なくとも17ヌクレオチドのコード配列をさらに含む；配列番号８からの12の連続する残基、および配列番号７からの少なくとも17ヌクレオチドのコード配列をさらに含む；配列番号10からの12の連続する残基、および配列番号９からの少なくとも17ヌクレオチドのコード配列をさらに含む；または配列番号12からの12の連続する残基、および配列番号11からの少なくとも17 ヌクレオチドのコード配列をさらに含む。他の好ましい実施態様において、核酸は：セグメントをコードする天然のcDNAに対する少なくとも約80％の同一性を示す；発現ベクター中に存在する；プロモーターをさらに含む；複製起点をさらに含む；天然配列からの３倍以下の置換された配列をコードする；天然の供給源由来である；検出可能に標識されている；合成ヌクレオチド配列を含む；６kb未満である；哺乳動物由来である；固体基質に結合される（サザンまたはノーザンブロット中を含む）；天然の完全長コード配列を含む；細胞内に存在する；またはキットにおける使用もしくは試薬の配置のための指示もまた含む検出キット中に存在する。さらなる実施態様は、55℃および150mM未満の塩のストリンジェントな洗浄条件下で核酸にハイブリダイズする核酸を含む；一方、好ましい実施態様は、配列番号１、３、５、７、９、または11の一次配列に、少なくとも約30ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約85％の同一性を示す核酸を含む；またはこの同一性は、少なくとも90％である；またはそのストレッチは少なくとも75ヌクレオチドである；またはその同一性は、少なくとも95％である；またはそのストレッチは少なくとも100ヌクレオチドである。他の実施熊様において、本発明は、成熟TECK、MIP-3α、MIP-3β、DC CR、またはM/DC CRタンパク質に結合する抗体からの抗原結合フラグメントを含む結合化合物を提供する。種々の実施態様において、結合化合物は、以下のものである：ポリペプチドは、マウスまたはヒトタンパク質である；抗体は、配列番号２、４、６、８、10、または12の成熟ペプチド配列に対して惹起される；抗体はモノクローナル抗体である；結合化合物は固体基質に結合される；結合化合物は無菌組成物中にある；結合化合物は変性した抗原（界面活性剤変性した抗原を含む）に結合する；結合化合物は検出可能に標識されている；結合化合物はFv、Fab、またはFab2フラグメントである；結合化合物は化学的部分に結合される；結合化合物はキットにおける使用または試薬の配置についての指示もまた含む検出キット中に存在する。本発明は、抗体を作製する細胞もまた提供する。本発明は、以下の方法を包含する：他からの特異的に分離した上記のポリペプチドに結合する化合物を用いてポリペプチドを精製する方法；抗原を含む試料を結合化合物を含む試料と接触させる工程を含む、抗原結合化合物複合体を生成する方法；またはTECK、MIP-3α、もしくはMIP-3βから選択されるケモカインに対するレセプターを発現する細胞の生理学または発生を調節する方法；上記のケモカインのアゴニストまたはムテインもしくはケモカインの抗体アンタゴニストを含む組成物と細胞を接触させる工程を含む方法。本方法の特定の実施態様において、細胞は、マクロファージ、リンパ球、または好酸球である；あるいは生理学は、細胞性カルシウム流動、走化性物質応答、細胞性形態学的改変応答、ホスホイノシチド脂質回転、または抗ウイルス応答である。他の実施態様において、レセプターはDC CRであり、ケモカインはMIP-3αであり、生理学は肺の生理学であり、または細胞は好酸球である。図面の説明図１および２Ａ〜２Ｄは、mTECK組換えタンパク質の走化性特性を示す。図１は、マウス胸腺細胞の組換えmTECKへの移動、および百日咳トキシンの効果を示す。走化性アッセイは、記載されたように行われた。組換えマウスリンホタクチン（lymphotactin）は、ポジティブコントロールとして使用された。データは、重複における３つの別の実験から得られた細胞数の平均±SEMとして表される。１つの実施態様において、細胞は、アッセイの前に、10ng/mlの百日咳トキシン（PTX）とともに１時間予めインキュベートされた。図２Ａ〜２Ｄは、他の白血球サブセットの組換えmTECKへの移動を示す。マウス脾臓樹状細胞（図２Ａ）およびマウス活性化マクロファージ（図２Ｂ）が得られた。THP-1ヒト単球細胞は、IFN-γとの16時間の活性化を伴わずに使用されたか(図２Ｃ)、または伴って使用された（図２Ｄ）。結果は、細胞型あたり別の３つの二連の実験からの走化性指数の平均±SDとして得られる。媒体単独へ移動する細胞の数は、各実験において、５つの高出力領域（high power field）あたり40細胞を越えた。組換えMIP- １αは、ポジティブコントロールとして使用された。好ましい実施態様の詳細な説明Ｉ．総括本発明は、走化性のサイトカインすなわちケモカインの特徴的な構造特性を示す種々の哺乳動物タンパク質をコードするDNA配列を提供する。他の実施態様は、ケモカインレセプターに指向される。例えば、Lodiら，（1994）Science 263: 1762-1767;GronenbornおよびClore（1991）Protein Engineering 4:263-269;Mil lerおよびKranger（1992）Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA 89:2950-2954;Matsushi maおよびOppenheim（1989）Cytokine 1:2-13;StoeckleおよびBaker（1990）New Biol ．2:313-323;Oppenheimら（1991）Ann ．Rev．Immunol．9:617-648;Schall（ 1991）Cytokine 3:165-183;およびThe Cytokine Handbook Academic Press，NY. を参照のこと。マウスおよびヒトの実施態様が、本明細書中に記載される。ケモカインは、白血球の移動および接着を誘導することにより、免疫応答および炎症性応答において重要な役割を果たす。これらの小さな分泌分子は、保存された４つのシステインモチーフにより特徴づけられる８〜14kDaのタンパク質の増大するスーパーファミリーである。例えば、Schall（1991）Cytoklne 3:165-1 83；およびThomson（編）The Cytokine Handbook Academic Press，NY.を参照のこと。ケモカインは、活性化された白血球により分泌され、そして炎症に関与する種々の細胞に対する走化性物質として作用する。走化性物質特性の他に、ケモカインは、他の生物学的応答（例えば、Ca⁺⁺のような２次メッセンジャーレベルの調節；イノシトールリン酸プール変化(例えば、Berridge（1993）Nature 361: 315-326またはBillahおよびAnthes（1990）Biochem.J ．269:281-291を参照のこと)；細胞性形態学的改変応答；ホスホイノシチド脂質代謝回転；潜在的な抗ウイルス応答；およびその他）を誘導することが示されている。従って、本明細書中に提供されるケモカインは、（単独または他の治療薬との組合せで）有利な組合せの効果を有し得る。さらに、ケモカインが、他の細胞型（例えば、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、好酸球の誘引または活性化）ならびに／または、おそらく好塩基球および／または好中球における効果を有し得ることを示唆する理由がある。それらはまた、種々の神経細胞（例えば、末梢神経系および／または中枢神経系ニューロンにおける後根神経節ニューロンを含む）における化学遊走効果を有し得る。ケモカインレセプターは、ケモカインによって媒介されるシグナル伝達メカニズムにおいて重要である。それらは、細胞集団を区別するのに有用なマーカーであり、そしてレトロウイルス感染に対する特異的なレセプターとして関係している。ケモカインスーパーファミリーは、特徴的な構造モチーフを示す２つの群（Cy s-X-Cys（C-X-C）およびCys-Cys（C-C）ファミリー）に分割して分類された。これらは、システイン残基のNH-近位対と配列類似性との間の１つのアミノ酸挿入物に基づいて区別された。代表的には、C-X-Cケモカイン（すなわち、IL-8およびMGSA/Gro-α）は好中球に作用するが単球には作用しないが、C-Cケモカイン（すなわちMIP-1αおよびRANTES）は、単球およびリンパ球について潜在的な化学走化性物質であるが好中球については潜在的な化学走化性物質ではない。例えば、Millerら、（1992）Crit．Rev．Immunol．12:17-46を参照のこと。最近単離されたケモカイン（リンホタクチン）は、いずれの群にも所属せず、そして第３のケモカインファミリー（Ｃファミリー）の最初のメンバーを構築し得る。リンホタクチンは、特徴的なCCまたはCXCモチーフを有さず、そしてリンパ球には作用するが好中球および単球には作用しない。例えば、Kelnerら、（1994）Science 266:1395-1399を参照のこと。このケモカインは、新規のC-Cケモカインファミリーを規定する。さらにより最近では、CX3Cモチーフを示す別のケモカインが同定されており、これは第４の構造クラスを確立する。本発明は、さらなるケモカイン試薬(例えば、核酸、タンパク質およびペプチド、抗体など)を提供し、これは、TECK；MIP-3α、およびMIP-3βと称される新たに発見されたそれぞれのケモカインに関する。他の実施態様において、本発明は、新規のケモカインレセプター（DC CRおよびM/DC CRと称される）をコードする２つの遺伝子を提供する。これらのリガンドは、まだ特異的に同定されていない。しかし、レセプターは、公知のケモカインレセプターの代表的な構造特徴（例えば、７回膜貫通型構造（Transmembrane spanning structure）を示す。これらは、種々の特異性（共有結合特性または無差別の結合特異性）で多くの異なるケモカインと結合する特性を示し得るか、またはケモカインの１つ（特異的）またはサブセット（共有する）に対する高い親和性を示し得る。記載されたケモカインおよびレセプターは、細胞、器官、組織、または元の生理学もしくは発生の種々の局面を媒介するのに重要であるべきである。 II.精製ケモカインマウス胸腺発現ケモカイン（TECK）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示される。シグナル配列は、１（Met）から約23（Ala ）まで続くべきであり、そしてシグナル配列の除去は、24（Gln）で始まる１つの天然の成熟配列を提供するべきである。ヒトTECKヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４に示される。シグナル配列切断は、おそらくほぼThrとGlnとの間である。別の新規のケモカイン（ヒト由来、MIP-3αと称される）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および６に提供される。第３の新規のケモカイン（ヒト由来、MIP-3βと称される）のヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および８に示される。シグナル配列切断は、ほぼSerとGlyとの間である。１つの実施態様に明確に指向される、ポリペプチド、核酸、および抗体の生理学的特性の遺伝的説明は、本明細書中に記載の他のケモカインまたはレセプターに、一般的に適用可能である。樹状細胞（DC）上に見出される新規のケモカインレセプター（ヒト由来、DC C Rと称される）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９および10に提供される。マクロファージおよび樹状細胞上に見出される別の新規のケモカインレセプター（ヒト由来、M/DC CRと称される）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号11および12に提供される。以前に同定されたケモカインレセプターCKR-1〜CKR-4とのM/DC CRのアラインメントは、表１に示す。CKR-1〜 CKR-4についてのアミノ酸配列は、配列番号13〜17に提供される。これらの新規のケモカインおよびレセプターについてのアミノ酸配列（アミノからカルボキシが提供される）は、ケモカインリガンドまたはレセプターの配列情報を提供することにおいて重要であり、他のタンパク質からこのタンパク質を区別するのを可能にする。さらに、配列は、このようなセグメントを認識および区別するための抗体を作製するためのペプチドの調製を可能にし、そしてオリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にし、その両方は、このような配列、または関連する配列（例えば天然の多型または他の改変体）をコードする遺伝子の単離（例えば、クローニング）のためのストラテジーである。ケモカインの類似性は、他のケモカインで観察されている。例えば、Bosenbergら、（1992）Cell 71:1 157-1165；Huangら、（1992）Molecular Biology of the Cell 3:349-362；およびPandiellaら、（1992）J．Biol．Chem．267:24028-24033を参照のこと。レセプターについても同様である。表１：CKR-1〜CKR-4とのM/DC CRのアラインメント。他のケモカインレセプターは、配列番号13〜17である。アスタリスクは、すべての５つのレセプターの間で完全に保存された残基を示す；ピリオドは、すべての５つのレセプターの間の保存的な置換を示す。本明細書中で用いられる用語「TECK」は、タンパク質の文脈において用いられる場合、配列番号２または配列番号４に示されるような成熟マウスたはヒトアミノ酸配列を有するタンパク質を包含するべきである。本発明はまた、このようなタンパク質の有意なフラグメントを含むポリペプチドを包含する。ポリペプチドはまた、種対応物（例えば、類似の生物学的機能を示す）であり、天然のコード配列において、その種からの他の遺伝子よりも相同的であるポリペプチドをいう。代表的には、このようなケモカインはまた、その特異的な結合成分（例えば、レセプター）と相互作用する。これらの結合成分（例えば、抗体）は、代表的には、高い親和性（例えば、少なくとも約100nM、通常は約30nMより多く、好ましくは約10nMより多く、そしてより好ましくは約3nMより多い）を有するケモカインに結合する。相同なタンパク質は、マウスとは異なる哺乳動物種（例えば、ラット、イヌ、ネコ、および霊長類）において見出される。非哺乳動物種はまた、構造的または機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有するはずである。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、重要なフラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも10アミノ酸、より一般的には少なくとも12アミノ酸、しばしば少なくとも14アミノ酸、よりしばしば少なくとも16アミノ酸、代表的には少なくとも18アミノ酸、より代表的には少なくとも20アミノ酸、通常は少なくとも22アミノ酸、より通常は少なくとも24アミノ酸、好ましくは少なくとも26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、および、特に好ましい実施態様では、少なくとも約30以上（例えば、約35、40、45、50、60、75、80、100、120など）のアミノ酸の一続きのアミノ酸残基を包含する。同様のタンパク質が、このような多数のセグメントのを含むようである。このようなフラグメントは、実質的に全ての部位で始まる末端および／または終わる末端（例えば、残基１、２、３などで始まり、そして例えば、69、68、67、66などで終わる、全ての組合せ）を有し得る。特に目的のペプチドは、構造的なドメイン結合に対応する末端を有する。用語「結合組成物」は、例えば、リガンド-レセプター型の様式または抗体-抗原相互作用で、それぞれケモカインまたはレセプターと特異的に結合する分子をいう。これらの組成物は、ケモカインまたはレセプターと特異的に会合する化合物（例えば、タンパク質）であり得る。会合は、天然の、生理学的に関連するタンパク質-タンパク質相互作用（共有結合または非共有結合のいずれでも）を含む。結合組成物は、ポリマー、または別の化学試薬であり得る。ケモカインが、そのリガンド-レセプター相互作用において、凹または凸の形状を呈するかどうかについては、その相互作用が、同様の特異性（例えば、特異的親和性）を示す以外は、言及されない。機能的アナログは、構造的な修飾を有するリガンドであり得るか、または例えば、適切なリガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有する、全く無関係な分子であり得る。リガンドは、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る。例えば、Goodmanら、（編）（1990）Goodm an & Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics（第８版）,Pergam on Pressを参照のこと。実質的に純粋は、タンパク質が、他の混在するタンパク質、核酸、および／または元の供給源の生物に代表的に由来する他の生物製剤を含まないことを意味する。純度は、標準的方法でアッセイされ得、そして通常には少なくとも約40％純粋、より通常には少なくとも約50％純粋、一般的には少なくとも約60％純粋、より一般的には少なくとも約70％純粋、しばしば少なくとも約75％純粋、よりしばしば少なくとも約80％純粋、代表的には少なくとも約85％純粋、より代表的には少なくとも約90％純粋、好ましくは少なくとも約95％純粋、より好ましくは少なくとも約98％純粋、そして最も好ましい実施態様では、少なくとも99％純粋である。分析は、代表的には重さによるが、分子量により得る。ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、環境およびそのポリペプチドに依存する。多くのパラメーターがポリペプチドの可溶性に影響し、温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子的特徴、および溶媒の性質を包含する。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約65℃の範囲である。通常、使用時の温度は、約18℃より高く、そしてより通常は、約22℃よりも高い。診断目的には、温度は通常はおよそ室温かまたはそれより暖かいが、アッセイ中の成分の変性温度よりは低い。治療目的では、温度は通常体温、代表的にはヒトで約37℃であるが、特定の状況下では、温度は、インサイチュまたはインビトロで上昇または低下させてもよい。電解質は、通常は、インサイチュでの生理学的条件に近いが、有利な高イオン強度または低イオン強度に改変され得る。実際のイオンは、例えば、生理学的または分析的関連に用いられる標準的な緩衝液に適合するように改変され得る。ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的に、実質的に安定な状態であり、そして通常、変性した状態ではないべきである。ポリペプチドは、他のポリペプチドと、四次構造に会合して、例えば、可溶性を付与し得るか、または天然脂質二重層の相互作用に近い様式で、脂質または界面活性剤と会合し得る。溶媒は、通常、生物学的活性の保存に用いられるタイプの生物学的に適合性のある緩衝液であり、そして通常、生理学的溶媒に近い。通常は、溶媒は、中性の pH、代表的には約５〜10の間、そして好ましくは約7.5を有する。いくつかの場合、界面活性剤が添加され、代表的には緩和な非変性界面活性剤（例えば、CHS またはCHAPS)が添加されるか、またはタンパク質の構造的または生理学的特性の重大な破壊を回避するに十分低い濃度で添加される。可溶性は、Svedberg単位（特定の条件下での分子の沈降速度の尺度）で測定された沈降により反映される。沈降速度の決定は、古典的には分析的超遠心分離で行われたが、代表的には現在は標準超遠心分離で行われる。Freifelder（1982） Physical Biochemistry（第二版），W．H．Freeman;ならびにCantorおよびSchim mel（1980）Biophysical Chemistry，parts 1-3，W．H．Freeman & Co.，San Fr anciscoを参照のこと。粗決定としては、推定の可溶性ポリペプチドを含む試料を、標準完全サイズの超遠心分離で、約50K rpmで約10分間遠心し、そしてその可溶性分子が上清に残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、代表的には約30S 未満、より代表的には約15S未満、通常は約10S未満、より通常は約６S未満、そして、特定の実施態様においては、好ましくは約４S未満、そしてより好ましくは約３S未満である。 III.物理的変異体本発明はまた、それぞれケモカインまたはレセプターの各々のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相同性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。変異体は、種変異体または多型変異体を包含する。アミノ酸配列相同性または配列同一性は、必要であれば、必要なギャップを導入して、残基のマッチを最適化することにより決定される。これは、保存的置換をマッチとして考慮する場合は、変化する。保存的置換は、代表的には以下のグループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ酸配列は、代表的にはそれぞれのタンパク質配列における天然の対立遺伝子変異体および種間変異体を包含すると意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、適切なケモカインまたはレセプターのアミノ酸配列と25〜100 ％の相同性（ギャップを導入可能な場合）から50〜100％の相同性（保存的置換が包含される場合）を有する。相同性の程度は、少なくとも約35％、一般的には少なくとも40％、より一般的には少なくとも45％、しばしば少なくとも50％、よりしばしば少なくとも55％、代表的には少なくとも60％、より代表的には少なくとも65％、通常は少なくとも70％、より通常には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、そしてより好ましくは少なくとも80％であり、そして特に好ましい実施態様では、少なくとも85％以上である。Needlehamら(1970)J.Mol.Blol．4 8:443-453;Sankoffら（1983）Time Warps，String Edits，and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison第１章，Addison-Wesley，Re ading，MA;およびIntelliGenetics（Mountain View，CA）社のソフトウェアパッケージ;およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，W Iもまた参照のこと。単離されたケモカインまたはレセプターの各々のDNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの倒置により容易に改変され得る。これらの改変により、これらの抗原、その誘導体、または同様の生理学的、免疫原もしくは抗原活性を有するタンパク質をコードする新規のDNA配列が得られる。これらの改変された配列は、変異抗原を生成するため、または発現を増強するために使用され得る。増強された発現は、遺伝子の増幅、転写の増大、翻訳増大、および他の機構を包含し得る。このような変異ケモカインまたはレセプター誘導体は、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの予め決定された(predetermined)変異体または部位特異的変異体を包含する。「変異ケモカイン」は、他の点では上述のケモカインの相同性の定義に該当するが、しかし、欠失、置換、または挿入のいずれによろうと、天然に見出されるケモカインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。これらは、０、１、２、３などからの置換レベルを含む。特に、「部位特異的変異ケモカイン」は、一般に配列番号２、４、６、または８の配列を有するリガンドと顕著な相同性を有し、そして種々の生物学的活性（例えば、抗原活性または免疫原活性）をこれらの配列と共有するタンパク質を包含し、そして好ましい実施態様では、開示された配列の大部分を含有するタンパク質を包含する。同様の概念は、異なるケモカインタンパク質の実施態様、特に種々の温血動物（例えば、哺乳動物および鳥類）に見出されるケモカインタンパク質に適用される。前に述べたように、記載は、一般に種々のケモカインタンパク質を包含することを意図しており、具体的に論じたマウスまたはヒトの実施態様に限定されないことを強調する。部位特異的変異部位はしばしば予め決定されているが、変異体が部位特異的である必要はない。ケモカインの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を作製することにより行われ得る。置換、欠失、挿入、または組み合わせが行われて、最終構築物に到達し得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末端融合物を包含する。ランダムな変異誘発は、標的コドンにて行われ得、次いで、発現された変異体が所望の活性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有する DNA中の予め決定された部位での置換変異の作製方法は、当該分野で周知である（例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による）。Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1987および補遺)もまた、参照のこと。 DNA中の変異は、通常、コード配列をリーディングフレームの外にするべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような２次mRNA構造を生成し得る相補的な領域を作らない。本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、本来、同じ方式では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。従って、免疫グロブリンとケモカインポリペプチドまたはレセプターポリペプチドとの融合産物は、代表的なペプチド結合で融合される配列を有し、代表的には単一の翻訳産物として作られ、そしてそれぞれの供給源のペプチドに由来する特性を示す連続的なタンパク質分子である。同様のキメラの概念が異種核酸配列に適用される。さらに、新たな構築物が他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインの組み合わせから作製され得る。例えば、リガンド結合セグメントまたは他のセグメントが、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントとの間で「交換」され得る。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243:1330-1336;およびO'Dowdら（19 88）J.Biol.Chem ．263:15985-15992を参照のこと。従って、特異性の新たな組み合わせを示す新たなキメラポリペプチドは、リガンド結合特異性および他の機能的ドメインの機能的結合により得られる。 BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts．22:1859-1862に記載されたホスホラミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメントはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で鎖を互いにアニールすること、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加すること（例えば、PCR技術）のいずれかにより得られる。 IV．機能的変異体これらのケモカインの種々の実施態様に対する生理学的な応答のブロックは、例えば、競合的阻害を介しての、そのレセプターへのリガンドの結合の阻害により生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、しばしば単離されたタンパク質、組換え膜結合ケモカインを発現する細胞に由来する膜、これらのリガンドのレセプター結合セグメントを含む可溶性のフラグメント、または固相基質に付着したフラグメントを使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメント変異および改変、またはリガンド変異および改変（例えば、リガンドアナログ）のいずれかの効果の診断的測定を可能にする。本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイ（例えば、ここで、抗原に対する中和抗体またはレセプターフラグメントが、タンパク質との結合について試験化合物と競合する）の使用を意図する。この方式では、抗体はリガンドの１またはそれより多い抗原結合部位を共有するポリペプチドの存在を検出するために使用され得、そしてまた、さもなければレセプターと相互作用し得るタンパク質上の結合部位を占めるために使用され得る。さらに、特異的なケモカインの実施態様に対する中和抗体および高親和性レセプター結合部位を含むケモカインの可溶性フラグメントは、組織（例えば、異常な生理学を経験している組織）におけるケモカイン活性を阻害するために使用され得る。ケモカイン抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体、および他の化学的部分との共有結合的または凝集結合物を包含する。共有結合誘導体は、当該分野で周知の手段により、ケモカインのアミノ酸側鎖中あるいはＮ末端またはＣ末端で見出される基への官能基の連結により調製され得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖を含有する残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のN-アシル誘導体を包含し得るが、これに限定されない。アシル基は、C3〜C18 の正常な直鎖アルキルを包含するアルキル部分の群から選択され、これにより、アルカノイルアロイル種が形成される。キャリアタンパク質への共有結合的付着は、免疫原性部分がハプテンである場合には重要であり得る。特に、グリコシル化改変（例えば、その合成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシングの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変により作られるもの）が包含される。これを達成する特に好ましい手段は、通常そのようなプロセシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵素もまた、意図される。他の小さい改変を有する同一の１次アミノ酸配列のバージョンもまた包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）を包含する。誘導体の主要な群は、それぞれケモカインまたはレセプターまたはそれらのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合物である。これらの誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端融合物のような組換え培養物中で、または反応性側鎖基を介してのタンパク質の架橋結合に有用な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。架橋結合剤を用いる好ましいケモカイン誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素部分、およびシステイン残基である。これらのケモカインと他の相同性タンパク質または異種タンパク質（例えば、他のケモカイン）との融合ポリペプチドもまた、提供される。多くの増殖因子およびサイトカインがホモ２量体の存在であり、そして反復構築物(repeat constr uct)は、タンパク質分解的切断に対する感受性の減少を包含する種々の利点を有し得る。さらに、多くのレセプターはシグナルの伝達のために２量体化が必要であり、そして種々の２量体リガンドまたはドメイン反復が所望され得る。相同性ポリペプチドは、異なる表面マーカー間での融合物であり得、例えば、レセプター結合特異性を示すハイブリッドタンパク質が得られる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が構築され得る。代表的な例は、融合リガンドの存在または位置を容易に測定し得るための、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）とリガンドのセグメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合セグメント）との融合物である。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌β−ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、FLAG融合物、および酵母のα接合因子を包含する。例えば、Godowskiら（1988）Science 241:812-816を参照のこと。 BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts．22:1859-1862に記載されたホスホラミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメントはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で鎖を互いにアニールすること、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することのいずれかにより得られる。そのようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分（特にリン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加または除去により化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改変は有用な標識試薬であるか、または精製の標的（例えば、FLAGのような親和性タグ）として作用する。融合タンパク質は、代表的には、組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかにより作製される。核酸操作および発現の技術は、例えば、Sambrookら（ 1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第２版）、1-3巻、Cold Sprin g Harbor Laboratoryに一般的に記載されている。ポリペプチド合成の技術は、例えば、Marrifield（1963）J ．Amer．Chem．Soc．85:2149-2156;Merrifield（1 986）Science 232:341-347;およびAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Syn thesis:A Practical Approach ， IRL Press，Oxford;および化学的連結については、例えば、Dawsonら（1994）Science 266：776-779、ペプチド結合による長い合成ペプチドの連結の方法、に記載されている。本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化での変化以外のこれらのケモカインまたはレセプターの誘導体の使用を意図する。そのような誘導体は、化学部分との共有結合または凝集会合を包含し得る。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分類される：(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合改変、および (3)例えば細胞膜との、吸着複合体。そのような共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、あるいは精製法（例えば、リガンドまたは他の結合リガンドの親和性精製のための）において有用である。例えば、ケモカイン抗原は、抗ケモカイン抗体またはそのレセプターのアッセイあるいは精製に使用するために、臭化シアン活性化Sepharoseのような固体支持体への共有結合により、当該分野で周知の方法により固定化され得るか、あるいは、グルタルアルデヒド架橋結合を有して、あるいは有さないで、ポリオレフィン表面に吸着され得る。これらのケモカインはまた、検出可能な基で標識され得る。例えば、クロラミンＴ手順により放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共有結合され、または診断的アッセイで使用するために蛍光部分と結合される。ケモカインの精製は、固定化抗体またはレセプターにより行われ得る。他の改変が、標的ケモカインの治療的薬物動態力学または薬動力学を改変する目的で、導入され得る。例えば、要素（entity）のサイズを最小化するための特定の手段は、その薬剤接触性（pharmacoaccessibillty）を改善し；サイズを最大化するための他の手段は、薬動力学に影響し得る。本発明の可溶化されたケモカインまたは適切なフラグメントは、リガンドまたはそのフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使用され得る。精製されたケモカインは、タンパク質を含む不純な調製物の種々の形態での免疫化により調製されるモノクローナル抗体またはケモカイン結合フラグメントをスクリーニングするために使用され得る。特に、抗体等価物は、天然の抗体（例えば、Fv、Fab、またはF(ab)₂）の抗原結合フラグメントを包含する。精製されたケモカインはまた、タンパク質またはタンパク質を含む細胞フラグメントレベルの上昇（これらは両方とも、異常なもしくは特定の生理学的状態または疾患状態の診断基準になり得る）があることに反応して産生された抗体を検出するための試薬として使用され得る。さらに、ケモカインタンパク質フラグメント、またはその連結物はまた、直後に記載するように、本発明の抗体を産生するための免疫原として役立ち得る。例えば、本発明は、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列に対して惹起された抗体、またはそれらを含むタンパク質を意図する。特に、本発明は、特定のフラグメント（例えば、タンパク質の三次構造の外側の表面上にあることが予測されるフラグメント）に結合親和性を有する抗体またはこれに対して惹起される抗体を意図する。同様の概念が、本発明のレセプターに特異的な抗体に適用される。本発明は、さらなる密接に関連した種改変体の単離を意図する。サザンブロット分析またはノーザンブロット分析は、類似の遺伝的要素が他の哺乳類動物において存在することを確立するべきであり、そしてこのように単離するためのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが、確立されるべきである。これらのケモカインおよびレセプターは、種改変体（例えば、齧歯類、ウサギ目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目、および霊長類）において広範なようである。本発明はまた、構造、発現、および機能において性質および類似性の両方を示す関連したケモカインの群を単離する手段を提供する。このタンパク質の多くの生理学的影響の解明は、リガンドの別個の種改変体の単離および特徴付けにより大いに加速される。特に、本発明は、異なる種におけるさらなる相同的な遺伝的要素の同定に有用なプローブを提供する。単離された遺伝子により、ケモカインに対応する発現を欠く細胞（例えば、対応するリガンドを欠きそしてネガティブバックグラウンド活性を示す、種の型または細胞）の形質転換が可能になる。形質転換された遺伝子の発現により、規定されたまたは単一の種改変体を用いて、抗原性が純粋な細胞株の単離が可能となる。このアプローチにより、ケモカインレセプタータンパク質の生理学的影響のより高い感度の検出および区別が可能になる。亜細胞フラグメント（例えば、細胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は単離され、そして使用され得る。リガンドにより提供される、種々の分化機能をもたらす決定的な構造エレメントの分析（特に、関連するクラスのメンバーの比較）は、現代の分子生物学の標準的な技術を用いて可能である。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243:13 39-1336において記載されたホモログ走査変異誘発技術(homolog-scanning mut agenesis technique);およびO'Dowdら（1988）J ．Biol．Chem．263:15985-15992 において使用されたアプローチ；およびLechleiterら（1990）EMBO J ．9:4381-4 390を参照のこと。さらに、レセプター結合セグメントは、レセプター結合親和性および特異性の両方、ならびにシグナル伝達においてどの構造的特徴が重要であるかを決定するために、種改変体の間で置換され得る。異なるケモカイン改変体の配列は、異なるレセプター種改変体との相互作用の組み合わせられた特性を示すリガンドについてスクリーニングするために使用される。細胞内機能は、おそらく、サイトゾルに通常接近し得るレセプターのセグメントに関与する。しかし、リガンドの内部移行は、特定の状況下で起こり得、そして細胞内成分と「細胞外」セグメントとの間の相互作用が起こり得る。特定のケモカインと他の細胞内成分との間の相互作用の特異的セグメントは、変異誘発または直接的な生化学的手段（例えば、架橋法またはアフィニティー法）により同定され得る。結晶学的方法または他の物理的方法による構造分析もまた、適用可能である。シグナル伝達機構のさらなる調査は、アフィニティー法によりまたは遺伝的手段（例えば、変異体の相補性分析）により単離可能であり得る結合した成分の研究を含む。種々のケモカインの発現および制御のさらなる研究が探求される。タンパク質に結合した制御エレメントは、異なる発生パターン、組織特異的パターン、または他の発現パターンを示し得る。遺伝子領域の上流または下流（例えば、制御エレメント）が目的である。メッセージのディファレンシャルスプライシング（di fferential splicing）は、膜に結合した形態、可溶性形態、およびリガンドの改変された型を導き得る。タンパク質の構造の研究により、新しいリガンド（特に、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストの特性を示すアナログ）の設計が導かれる。これは、所望の活性スペクトルを示すリガンドを単離するために、前に記載したスクリーニング方法と組み合わせられ得る。他の細胞型における発現はしばしば、特定のケモカインにおいてグリコシル化の差異を生じる。種々の種改変体は、アミノ酸配列以外の構造的な差異に基づく別個の機能を示し得る。異なる改変は種々の機能の応答の原因であり得、そしてその効果の解明が、現在可能である。従って、本発明は、生理学的ケモカイン結合タンパク質相互作用に関連する重要な薬剤を提供する。以前の記載は、主に特に記載されたケモカインのマウスおよびヒトの実施態様に焦点を合わせているが、本発明が他の種の対応物（例えばラットおよび他の哺乳動物種または対立遺伝子変異体または多型変異体）を提供することが、当業者により即座に認識される。Ｖ．抗体抗体は、種変異体、または多型性変異体を含むこれらのケモカイン、ならびにそのフラグメントに対して、天然に存在する形態およびそれらの組換え形態の両方において、惹起され得る。さらに、抗体は、これらの活性形態または不活性形態のいずれかのケモカインに対して惹起され得る。抗イディオ型抗体もまた意図され得る。リガンドの予め決定されているフラグメントに対する、抗体（結合フラグメントおよび単一鎖バージョン（single chain version）を含む）が、免疫原性タンパク質とのフラグメントの鎖状体または結合体で動物を免疫することにより惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常型ケモカインまたは欠陥型ケモカインに対する結合についてスクリーニングされ得るか、または、例えば、ケモカインのレセプターを介して媒介されるアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１mMのＫ_Dで結合され、より通常には少なくとも約300μＭ、好ましくは少なくとも約10μＭ、より代表的には少なくとも約30μＭ、好ましくは少なくとも約10μＭ、およびより好ましくは少なくとも約３μＭのＫ_Dで、またはより良好に結合する。本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、有意な診断的または治療的価値を有し得る。それらはリガンドに結合し、そしてレセプターへの結合を阻害するか、または生物学的応答を誘発するリガンドの能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、非中和抗体として有用であり得、そしてトキシンまたは放射性核種に連結され得る。その結果、抗体がリガンドへ結合する場合、例えば、レセプターを介して細胞表面でリガンドを発現する細胞は殺滅される。さらに、これらの抗体は、直接的にまたはリンカーにより間接的にのいずれかで、薬物または他の治療剤に結合され得、そして薬物標的化を達成し得る。レセプターに対する抗体はリガンド結合およびシグナル伝達をブロックするためにより容易に使用され得る。本発明の抗体はまた、診断的適応または試薬精製適応において有用であり得る。捕獲または非中和抗体として、これらはレセプター結合を阻害せずにケモカインへ結合する能力についてスクリーニングされ得る。中和抗体として、これらは競合的結合アッセイに有用であり得る。これらはまた、例えば、免疫アッセイにおいて、ケモカインのまたは間接的にレセプターの検出または定量に有用である。これらは、イムノアフィニティーカラムにおける精製試薬としてまたは免疫組織化学因子として使用され得る。リガンドフラグメントは、免疫原として使用される融合または共有結合ポリペプチドとして、他の物質、特にポリペプチドに連結または結合され得る。好ましくは、サイズを増大させるために短いペプチドが繰り返し構造として作製され得る。リガンドおよびそのフラグメントは、種々の免疫原（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキシンなど）へ融合または共有結合され得る。Microbiology，Hoeber Medical Division，HarperおよびR ow，1969;Landsteiner（1962）Specificity of Serological Reactions，Dover Publications，NeW York，およびWilliamsら、（1967）Methods in Immunology and Immunochemistry ,第１巻、Academic Press，New Yorkを、ポリクローナル抗血清の調製方法の記載について参照のこと。典型的な方法は、抗原での動物の過免疫を含む。次いで、繰り返した免疫の少し後に、動物の血液が回収され、そしてガンマグロブリン画分が単離される。いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら（編）Basic and Clinical Immunology（第４版）、Lange Medical Publication s，Los Altos，CA、およびそこで引用される参考文献；HarlowおよびLane（1988 ）Antibodies:A Laboratory Manual，CSH Press；Goding（1986）Monoclonal An tibodies:Principles and Practice （第２版）Academic Press，New York；および特に、KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256:495-497（これは、モノクローナル抗体を産生する一つの方法を議論する）において見出され得る。簡潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注入することを包含する。次いで、動物は屠殺され、そして細胞は、例えばその脾臓から採取され、次いでその細胞は骨髄腫細胞に融合される。これにより、インビトロで再生され得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を生じる。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。この様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される特異的部位に応答して作製される免疫動物由来の不死化およびクローン化されたＢ単細胞の生産物である。大量の抗体が動物由来の腹水液から得られ得る。他の適切な技術は、リンパ球の抗原性ポリペプチドへの、またはファージもしくは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択へのインビトロ曝露を包含する。Huseら(1989)「λファージにおける免疫グロブリンレパートリーのラージコンビナトリアルライブラリーの作製」、Science 246:1275-1281：およびWar dら(1989)Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴ってまたは伴わずに使用され得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する基質を共有結合または非共有結合のいずれかで結合することにより標識される。広範に種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方で広範囲に報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性部分などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号：同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；および同第4,366,241号が挙げられる。組換え免疫グロブリンもまた産生され得る。Cabilly、米国特許第4,816,567号；およびQueenら（1989）Proc ．Nat'l．Acad．Sci． 86:10029-10033を参照のこと。本発明の抗体はまた、タンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーに使用され得る。カラムは、抗体を固相支持体（例えば、アガロース、Se phadexなどのような粒子）に連結させて調製され得、ここで、細胞溶解物は、カラムを通過され得、カラムは洗浄され、続いて温和な変性剤の濃度を増加させることによって、精製ケモカインタンパク質が遊離される。抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合により抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。これらのケモカインに対して惹起される抗体はまた、抗イディオ型の抗体を惹起するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的症状を検出または診断するにおいて有用である。 VI．核酸記載されたペプチド配列および関連試薬は、これらのケモカインをコードする DNAクローンを、例えば天然の供給源から単離するにおいて有用である。典型的に、これは別の個体からの遺伝子の単離において有用であり、そして同様な手順は他の種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）から遺伝子を単離するために適用される。クロスハイブリダイゼーションは、他の種からのリガンドを単離し得る。多くの異なるアプローチが、適切な核酸クローンを首尾よく単離するために利用可能であるべきである。同様な構想が、レセプター実施態様にあてはまる。精製タンパク質または定義されたペプチドは、上記のように標準的な方法により抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は免疫系に提示され、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生じ得る。例えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene;ならびに HarlowおよびLane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbo r Pressを参照のこと。あるいは、ケモカインレセプターは、特異的結合試薬として使用され得、そして、その結合の特異性が利用され得る。抗体が最も利用されるであろう。しかし、ケモカインレセプターは、代表的には７つの膜貫通タンパク質であり、脂質または膜との適切な相互作用に感受性であり得る。シグナル伝達は、代表的には、G-タンパク質を介して媒介され得る。例えば、特異的結合組成物は、特定のケモカインを発現する細胞株から作製される発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングは、表面に発現されるリガンドの標準的な染色であり得るか、またはパニングにより得る。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色または免疫蛍光手順により行われ得る。結合組成物は、リガンドを発現する細胞をアフィニティ精製するために、または選別するために使用され得る。ペプチドセグメントはまた、ライブラリーをスクリーニングするため（例えば、種変異体を単離するため）の適切なオリゴヌクレオチドを予測するために使用され得る。遺伝子コードが、スクリーニングのためのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(P CR)技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドはライブラリーから正しいクローンを選択するにおいて有用である。相補的な配列もまた、プローブまたはプライマーとして使用される。可能なアミノ末端の同定に基づいて、第３ペプチドは、例えば、アンカーベクターもしくはポリＡ相補的PCR技術と組み合わせて、または、他のペプチドの相補的なDNAと組み合わせて特に有用である。本発明は、生物学的に活性な対応するケモカインポリペプチドをコードする単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図する。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるDNA配列に適切な条件下でハイブリダイズし得る生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離、または組換えDNAを含む。上記の生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトなリガンド、またはフラグメントであり得、そして配列番号１、３、５、および７に開示されるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明は、ケモカインに相同であるタンパク質をコードするか、またはケモカインをコードするcDNAをプローブとして用いて単離した、単離DNAもしくは組換えDNA、またはそれらのフラグメントの使用を含む。この単離DNAは、5'および3'隣接においてそれぞれの制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなど）を有し得る。「単離」核酸は、内生配列に天然に伴う他の成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、およびもとの種からの隣接するゲノム配列）から実質的に分離された核酸（例えば、RNA、DNA、混合ポリマー）である。この用語は、天然に生じる環境から取り除かれた核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化DNA単離物および化学的に合成されたアナログ、または異種の系により生物学的に合成されるアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含む。単離された核酸は、一般に、分子の均質な組成物であるが、いくつかの実施態様において、少量の不均質成分を含む。この不均質成分は、典型的にポリマー末端または所望される生物学的機能または活性に重要でない部分に見出される。「組換え」核酸は、その生産方法またはその構造のいずれかにより定義される。その生産方法を参照すると、例えば、生産物はあるプロセスにより作製され、このプロセスは組換え核酸技術の使用であり、例えば、ヌクレオチド配列における人の介入、代表的には、選択または生産を包含する。あるいは、天然ではお互いに隣接しない２つのフラグメントの融合物を含む配列を生成することにより作製される核酸であり得るが、天然の生産物（例えば、天然に存在する変異体）は排除することを意味する。従って、例えば、細胞を、天然に存在しない任意のベクターで形質転換することによって作製される生産物が包含され、この生産物は、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導される配列を含む核酸である。このようなことをしばしば行って、コドンを、同一または保存アミノ酸をコードする縮重コドンで置換し、同時に、代表的には配列認識部位を導入するかまたは除去する。あるいは、一般に利用可能な天然の形態では見出されない所望の組み合わせの機能を含む単一の遺伝子物質(entity)を生成するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合することが行われる。制限酵素認識部位は、しばしばこのような人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴）が設計により組み込まれ得る。同様の構想が、組換え体（例えば、融合ポリペプチド）について意図される。具体的には、遺伝子コードの縮重性により、これらの抗原のフラグメントに類似のポリペプチドをコードする合成核酸および種々の異なる種変異体由来の配列融合物を包含する。核酸の文脈において、重要な「フラグメント」は、少なくとも約17ヌクレオチドの連続するセグメントであり、一般的には少なくとも約20ヌクレオチドであり、より一般的には少なくとも約23ヌクレオチドであり、通常、少なくとも約26ヌクレオチドであり、より通常には少なくとも約29ヌクレオチドであり、しばしば、少なくとも約32ヌクレオチドであり、さらにしばしば少なくとも約35ヌクレオチドであり、代表的には少なくとも約38ヌクレオチドであり、より代表的には少なくとも41ヌクレオチドであり、通常は少なくとも約44ヌクレオチドであり、より通常には少なくとも47ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約53ヌクレオチドであり、そして特に好ましい実施態様において少なくとも約56以上のヌクレオチド（例えば、60、65 、75、85、100、120、150、200、250、300、400など）である。このようなフラグメントは、実施的に全ての位置の任意の組合せ（例えば、ヌクレオチド１、２、３などで始まり、そして例えば300、299、298、287などで終わる）で始まり、そして／または終わる末端を有し得る。特に興味深いポリヌクレオチドは、構造ドメイン境界に対応する末端を有し得る。特定のケモカインタンパク質またはペプチドをコードするDNAは、関連するかまたは相同であるリガンドをコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA種、ならびに異なる種由来の相同タンパク質をコードするDNAを同定するために特に有用である。これらは、霊長類を含む他の種において相同であるようである。種々のケモカインタンパク質が相同であるはずであり、そして本明細書中に含まれる。しかし、リガンドに進化的により遠い関連を有するタンパク質でさえ、それらが十分に相同である場合、これらの配列を用いて適切な条件下で容易に単離され得る。霊長類ケモカインが特に興味深い。本発明はさらに、本明細書中に示される単離されたDNAに同一であるかまたは高く相同であるDNA配列を有する組換えDNA分子およびフラグメントをカバーする。詳細には、この配列は、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメントにしばしば作動可能に連結される。あるいは、ゲノム配列由来の組換えクローン（例えば、イントロンを含む）は、トランスジェニック実験（例えば、トランスジェニック細胞および生物）ならびに遺伝子治療に有用である。例えば、Goodno w（1992）「Transgenic Animals」、Roitt（編）、Encyclopedia of Immunology Academic Press，SanDiego，1502-1504頁；Travis（1992）Science 256:1392-1 394；Kuhnら、（1991）Science 254:707-710；Capecchi（1989）Science 244:12 88；Robertson（1987）編、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Pra ctical Approach IRL Press，Oxford；およびRosenberg（1992）J ．Clinical On cology 10:180-199を参照のこと。比較される場合、相同な核酸配列は有意な類似性または同一性を示す。核酸における相同性についての基準は、当該分野で一般的に使用される配列比較による相同性の程度、またはハイブリダイゼーション条件に基づく程度のいずれかである。ハイブリダイゼーション条件は以下にさらに詳細に記載される。核酸配列比較の状況に関する「実質的な相同性」は、比較される場合、セグメントまたはその相補鎖のいずれかが、適切なヌクレオチドの挿入または欠失で最適に配置される場合に、少なくとも約50％のヌクレオチドが同一であり、一般的には少なくとも約56％、より一般的には少なくとも約59％、通常少なくとも約62 ％、より通常は少なくとも約65％、しばしば少なくとも約68％、よりしばしば少なくとも約71％、代表的には少なくとも約74％、より代表的には少なくとも約77 ％、通常は少なくとも約80％、より通常は少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95〜98％、またはそれ以上であり、そして特に好ましい実施態様においては、最高約99％以上のヌクレオチドが同一であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で、代表的には配列番号１、３、４、７、９、または 11に記載される配列を用いて１本鎖またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、少なくとも約30ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約55％の相同性が存在する場合、好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約65％の相同性が存在する場合、より好ましくは少なくとも約75％、そして最も好ましくは約20ヌクレオチドにわたって少なくとも約 90％の類似性が存在する場合、選択的なハイブリダイゼーションが生じる。Kane hisa（1984）Nuc ．Acids Res．12:203-213を参照のこと。相同性比較の長さは、記載のように、より長い範囲にわたり得、そして特定の実施態様では、少なくとも約17ヌクレオチド、通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には少なくとも約24ヌクレオチド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約75〜100またはそれ以上のヌクレオチドの範囲にわたる。「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションの状況において相同性をいうとき、塩、温度、有機溶媒、および代表的にはハイブリダイゼーション反応において制御される他のパラメーターの、ストリンジェントに組み合わされた条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃以上、より通常には、約37℃以上、代表的には約45℃、より代表的には約55℃以上、好ましくは約 65℃以上、そしてより好ましくは約70℃以上の温度が含まれる。ストリンジェントな塩条件は、通常、約1000mM未満であり、通常は約500mM未満であり、より通常は約400mM未満であり、代表的には約300mM未満であり、好ましくは約200mM未満であり、そしてより好ましくは約150mM未満である。しかし、パラメーターの組み合わせは、任意の単一のパラメーターの測定よりもはるかにより重要である。例えば、WetmurおよびDavidson（1968）J ．Mol．Biol．31:349-370を参照のこと。他の哺乳動物種由来の対応するケモカインは、密接に関連する種の種交差ハイブリダイゼーションによりクローニングされ、そして単離され得る。あるいは、データベースからの配列は、類似性を有すると認識され得る。相同性は、遠縁種間では比較的低くあり得、従って、比較的密接に関連する種のハイブリダイゼーションが望ましい。あるいは、低い種特異性を示す抗体調製物の調製は、発現クローニングアプローチに有用であり得る。保存された配列のセグメントを使用するPCRアプローチもまた使用される。 VII ケモカインの作製；模倣物各々のケモカインまたはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成、cDN Aライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株または組織試料から調製されるゲノムライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。このDNAは、完全長リガンドまたはフラグメントの合成のために広範な種々の宿主細胞で発現され得、これは次いで、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製するために；結合研究のために；改変された分子の構築および発現のために；ならびに構造／機能研究のために使用され得る。各々の抗原またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞で発現され得る。これらの分子は、実質的に精製され得て、タンパク質または細胞性の夾雑物を除かれるか、そうでなければ、組換え宿主から誘導され得、それゆえ、薬学的に受容可能なキャリアーおよび／または希釈剤と組み合わされる場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原またはその一部は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。発現ベクターは、代表的には所望の抗原遺伝子またはそのフラグメントを含有する、通常は、適切な宿主細胞で認識される適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結される、自己複製するDNAまたはRNA構築物である。これらの制御エレメントは、適切な宿主内で発現を達成し得る。発現を達成するのに必要な制御エレメントの特定の型は、使用される最後の宿主細胞に依存する。一般に、遺伝子制御エレメントは、原核細胞のプロモーター系または真核細胞のプロモーター発現制御系を包含し得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオペレーター、mRNAの発現レベルを高めるための転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終止させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常、ベクターを宿主細胞とは独立に複製させ得る複製開始点を含有する。本発明のベクターは、ケモカイン、レセプター、またはそれらのフラグメントの実施態様をコードするDNA（これは、代表的には、生物学的に活性なポリペプチドをコードする）を含む。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下であり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主中で各ケモカインをコードする真核生物のcDNAを発現し得るこのような発現ベクターの使用を包含し、ここで、ベクターは宿主に適合性であり、そしてリガンドをコードする真核生物のcDNAは、ベクターを含む宿主の増殖により問題のcDNAが発現されるようにベクターに挿入される。通常、発現ベクターは、宿主細胞内での安定な複製、または１細胞あたりの所望の遺伝子の総コピー数を著しく増大させる増幅のために設計される。発現ベクターが宿主細胞内で複製する必要は必ずしもなく、例えば、宿主細胞によって認識される複製開始点を含有しないベクターを使用して、種々の宿主におけるリガンドまたはそのフラグメントの一時的な発現を達成することが可能である。ケモカイン遺伝子またはそのフラグメントの宿主DNAへの組換えによる組込みを生じるベクターを使用すること、または内因性遺伝子の発現を制御するプロモーターを組込むこともまた可能である。本明細書中で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主ゲノムへのDNAフラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、作動可能に連結される遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含有する、特殊化したベクターである。プラスミドは、最も多く共通に使用される形態のベクターであるが、同等の機能を供し、当該分野で公知であるかまたは公知になる全ての他の形態のベクターが、本明細書中で使用するのに適切である。例えば、Pouwelsら（1 985および補遺）Cloning Vectors;A Laboratory Manual Elsevier，N.Y.;および、Rodriquezら（編）(1988)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors a nd Their Uses ，Buttersworth，Boston，MAを参照のこと。形質転換された細胞は、組換えDNA技術を用いて構築されたベクターを含有するケモカイン遺伝子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を含む。形質転換された宿主細胞は、通常、リガンドまたはそのフラグメントを発現するが、クローニング、増幅、およびそのDNAの操作の目的のためには、そのタンパク質の発現を必要としない。本発明はさらに、栄養培地で形質転換細胞を培養することを包含し、従って、培養物中にタンパク質を蓄積することを可能にする。タンパク質は、培養物または培養培地のいずれかから回収され得る。本発明の目的のために、DNA配列は、それらが互いに機能的に関連している場合、作動可能に連結される。例えば、前配列または分泌リーダーについてのDNA は、前タンパク質として発現されるか、または細胞膜へのポリペプチドの指向または分泌に関与する場合、ポリペプチドに作動可能に連結される。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置づけられる場合、コード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されたとは、隣接およびリーディングフレーム内を意味する。しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝子エレメントは、隣接しては連結されないが、オペレーター配列になお結合されて、次に発現を制御する。適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を包含する。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性の生物（例えば、E.coliおよびB.su btills）の両方を包含する。下等真核生物は、酵母（例えば、S.cerevisiaeおよびPichia）、およびDictyostelium属の種を包含する。高等真核生物は、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞、および鳥類）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯動物）の両方の動物細胞に由来する確立された組織培養細胞株を包含する。原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種に対して広範な種々のベクターを包含する。本明細書中で使用するように、E.coliおよびそのベクターは、他の原核生物に使用される同等のベクターを包含するために一般的に使用される。DN Aを増幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその多くの誘導物である。これらのケモカインまたはそのフラグメントを発現するために使用され得るベクターとしては、lacプロモーター(pUC−シリーズ)；trpプロモーター(pBR322-t rp)；Ippプロモーター(pIN-シリーズ)；λ-pPまたはpRプロモーター(pOTS)；またはptac(pDR540)のようなハイブリッドプロモーターを含有するベクターが挙げられるが、これに限定されない。Brosiusら（1988）「λ-、trp-、lac-、およびI pp-由来プロモーターを用いる発現ベクター」,RodriguezおよびDenhardt（編）Ve ctors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses ，Buttersworth ，Boston，10章、205-236頁を参照のこと。下等真核生物(例えば、酵母およびDictyostelium)は、ケモカイン配列含有ベクターで形質転換され得る。本発明の目的のためには、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母、Saccharomyces cerevisiaeである。これは下等真核生物を総称的に代表するように使用されるが、多数の他の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは、代表的には、複製起点（組込み型でない限り）、選択遺伝子、プロモーター、所望されるタンパク質またはそのフラグメントをコードするDNA、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母のために適切な発現ベクターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよび種々の他の解糖系酵素の遺伝子プロモーターのような構成性プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチオネイプロモーターのような誘導性プロモーターが挙げられる。適切なベクターとしては、以下の型の誘導体が挙げられる：自己複製低コピー数（例えば、YRp-シリーズ）、自己複製高コピー数（例えば、YEp−シリーズ）；組込み型（例えば、YIp -シリーズ）、またはミニ染色体（例えば、YCp-シリーズ）。高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なケモカインタンパク質の発現のために好ましい宿主細胞である。原則的には、無脊椎動物供給源に由来しても脊椎動物供給源に由来しても、任意の高等真核生物組織培養細胞株のほとんど（例えば、昆虫のバキュロウイルス発現系）が作用可能である。しかし、プロセシング（翻訳と同時および翻訳後の両方）の点で、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は慣例的な手順となっている。有用な細胞株の例としては、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞株、ベビーラット腎臓(BRK)細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル(COS)細胞株が挙げられる。このような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプライス部位（ゲノムDNAが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、SV40、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、もしくはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、pCDNA1；pCD（Okayamaら（1985）Mol ．Cell Blol．5:11 36-1142を参照のこと）;pMC1neo Poly-A（Thomasら（1987）Cell 51:503-512を参照のこと）;および、pAC 373またはpAC 610のようなバキュロウイルスベクターが挙げられる。特異的なまたは規定されたグリコシル化パターンを提供する系においてケモカインポリペプチドを発現させることがしばしば所望される。この場合、通常のパターンは、発現系により天然に提供されるパターンである。しかし、パターンは、ポリペプチド（例えば、グリコシル化されていない形態）を、異種発現系中に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝すことにより改変可能である。例えば、ケモカイン遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上の遺伝子と同時形質転換され得る。このアプローチを使用して、原核生物または他の細胞において、特定の哺乳動物グリコシル化パターンが達成可能であるかまたは近づけられる。ケモカイン、またはそのフラグメントは、細胞膜に連結されるホスファチジルイノシトール(PI)を設計され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）での処理により膜から除去され得る。これは、抗原を生物学的に活性な形態で放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Low（1989）Biochim ．Bi ophys．Acta 988:427-454；Tseら（1985）Science 230:1003-1008；およびBrunn erら（1991）J ．Cell Blol．114:1275-1283を参照のこと。現在これらのケモカインが特徴付けられており、そのフラグメントまたは誘導体がペプチドを合成するための従来のプロセスにより調製され得る。これらとしては、StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Ch emical Co.，Rockford，IL;BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesis ，Springer-Verlag，New York;およびBodanszky（1984）The Principles of Peptide Synthesis ，Springer-Verlag，New Yorkに記載されているようなプロセスが挙げられる。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、p- ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、もしくはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化的−還元的プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)／追加の(additive)プロセスが使用され得る。固相および液相の合成が、共に前記のプロセスに適用可能である。これらのケモカイン、フラグメント、または誘導体は、一般に、いわゆる段階的プロセス（これはアミノ酸を末端アミノ酸に、１つずつ順番に、縮合する工程を包含する）によるか、またはペプチドフラグメントを末端アミノ酸にカップリングすることによるかのいずれかで、代表的にペプチド合成において用いられるような上記のプロセスに従って適切に調製される。カップリング反応において使用されないアミノ基は、代表的には不正確な位置でのカップリングを防止するために保護される。固相合成が採用される場合、Ｃ末端アミノ酸は、代表的には、そのカルボキシル基を介して、不溶性キャリアまたは支持体に結合される。不溶性キャリアは、それが反応性カルボキシル基への結合能力を有する限り、特に限定されない。そのような不溶性キャリアの例としては、ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert -アルキルオキシカルボニル-ヒドラジド化樹脂などが挙げられる。アミノ基保護アミノ酸が、その活性化カルボキシル基と以前に形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチドが一tuずつ合成される。完全な配列の合成後、ペプチドは不溶性キャリアからはずされて、ペプチドが生成される。この固相アプローチは、Merrifieldら(1963)J ．Am．Chem．Soc． 85:2149-2156により一般的に記載されている。調製されたリガンドおよびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段（例えば、抽出、沈殿、電気泳動、および種々の形態のクロマトグラフィーなどにより）により、反応混合物から単離および精製され得る。本発明の種々のケモカインは、その所望される使用に依存して、変化する度合いの純度で得られ得る。精製は、本明細書において開示されるタンパク質精製技術の使用によるか、または例えば，免疫吸着剤（immunoabsorbant）親和性クロマトグラフィーにおいて本明細書中に記載の抗体の使用により達成され得る。この免疫吸着剤親和性クロマトグラフィーは、まず、抗体を固相支持体に連結し、次いで、連結した抗体を、適切な供給源細胞の可溶化された溶解物、リガンドを発現する他の細胞の溶解物、またはDNA技術の結果として所望のケモカインを産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることにより行われる（以下を参照のこと）。 VIII.使用本発明は、本明細書中の他所に（例えば、発達異常についての一般的な記載において）、または以下に（診断用のキットの記載において）記載されるような診断的適用における使用を見出す試薬を提供する。本発明はまた、顕著な治療的価値を有する試薬を提供する。これらの（天然に生じるかまたは組換え）ケモカイン、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は、それらに対する結合親和性を有するとして同定された化合物とともに、異常な生理現象または発達（炎症状態（喘息を含む）を含む）に関連する状態の処置において有用であるはずである。特に、白血球の運搬の調節は生物学的活性の１つのようであるが、より広い組織分布は、より広範な生物学的活性（例えば、抗ウイルス効果を含む）を示唆するかもしれない。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書中に提供される組成物を使用する適切な治療的処置により調整され得る。例えば、ケモカインによる異常な発現または異常なシグナリングに関連する疾患または障害は、このリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストの標的のようであるはずである。種々の異常な生理的または発達的状態は、ノーザンブロット分析によってケモカインmRNAを有すると示される細胞型において公知である。Berkow（編）The Me rck Manual of Diagnosis and Therapy ，Merck & Co.，Rahway，N.J.；およびTh ornらHarrison's Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.を参照のこと。発達的または機能的異常（例えば、免疫系の異常）は、本明細書中に提供される組成物を使用する予防または処置に感受性であり得る、顕著な医学的異常および状態を引き起こす。組換え体を含むケモカイン抗体は精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は治療的使用のためにさらなる活性成分または不活性成分と（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中で）、生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせ物は濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメント（相補的結合でない形態を含む）の使用を意図する。さらに、治療的要素の薬物動態学的または薬動力学的に影響する抗体分子またはその抗原結合フラグメントに対する改変が適用され得る。、抗体もしくはレセプターまたはそれらのフラグメントを使用する薬物スクリーニングを実施して、各ケモカインまたはレセプターに対する結合親和性を有する化合物（会合成分の単離を含む）を同定し得る。次いで、その化合物が固有の刺激活性を有し、それゆえ、リガンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうか決定するために、次の生物学的アッセイが利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、レセプターを活性化し得、従って、それがケモカインの活性を刺激するという点で、アゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのこれらのケモカインに対する抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のケモカイン種変異体について特に有用であるはずである。効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の薬物(medic ant)を含む。従って、処置用量は、種々の集団（人種サブ集団、年齢、性別など）における安全性および有効性を最適化するために滴定(titrate)されるべきである。代表的には、インビトロで使用される用量は、これら試薬のインサイチュでの投与に有用な量における有用なガイダンスを提供し得る。特定の疾患の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの用量のさらなる予測的な指標を提供する。以下には、種々の考察が記載される、例えば、Gilmanら（編）（1990）Goodma n and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics （第８版)Pergamo n Press:および(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences（第17版）Mack Pu blishing Co.，Easton Penn.。投与方法は、それらの中および以下で考察されている。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアは代表的には、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index，Merck & Co.,Rahway，New Jerseyに記載された他の化合物を包含する。用量の範囲は通常、適切なキャリアを有して、１mM濃度より低い量であり、代表的には約10μＭ濃度未満、通常約100nM未満、好ましくは約10pM（picomolar）未満、そして最も好ましくは約1fM（femtomolar）未満の範囲であると期待される。徐放性処方物または徐放性装置が、持続的な投与にしばしば利用される。ケモカイン、そのフラグメント、またはそれに対する抗体もしくはそのフラグメント、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置されるべき宿主に直接投与され得るか、または、化合物のサイズに依存して、それらを投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンバク質に結合させることが所望され得る。治療的処方物は、任意の従来の投与処方物中で投与され得る。活性な成分を単独で投与することは可能であるが、しばしば治療的処方物として呈することが好ましい。処方物は、上記で定義したように、１またはそれより多いその受容可能なキャリアとともに、代表的には少なくとも１つの活性な成分を包含する。それぞれのキャリアは、他の成分に適合性であり、そして患者に対して有害でないという意味で薬学的および生理学的の両方で受容可能であるべきである。キャリアは、貯蔵生命および安定性などを改善し得る。処方物は、経口投与、直腸投与、鼻投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与を包含する）に適切な処方物を包含する。処方物は、便宜的に単位用量形態で存在し得、そして薬学の当該分野で周知の任意の方法により調製され得る。例えば、Gilmanら（編）(1990)Goodman およびGilman's：The Pharmacologic al Bases of Therapeutics ，第８版、PergamonPress;およびRemington's Pharma ceutical Science ，第17版(1990)、Mack Publishing Co.，Easton，Penn.;Avis ら（編）(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker ，New York;Liebermanら（編）(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets De kker，New York;およびLiebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Form s:Disperse Systems Dekker，New Yorkを参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と併用されるかまたは関連して使用され得る。本発明のケモカインの天然に存在する形熊および組換えの形態の両方は、このタンパク質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし得る、キットおよびアッセイ方法に特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が、短期間に多数の化合物のスクリーニングを可能にするように近年開発されている。例えば、固体基質上に合成された多数の所定のポリマーによる結合親和性の試験のための手段を記載しているFodorら（1991）Science 251:767-773を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明で提供される大量の精製可溶化ケモカインの利用可能性により、非常に容易になり得る。例えば、アンタゴニストは、一旦リガンドが構造的に定義されれば、通常見出され得る。潜在的なリガンドアナログの試験が、生理学的に応答性の細胞を使用する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、現在は可能である。特に、新たなアゴニストおよび新たなアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニング技術を使用することにより発見される。生存細胞はまた、それぞれのケモカイン仲介性機能（例えば、第２メッセンジャーのレベル、すなわち、Ca⁺⁺；イノシトールリン酸のプールの変化(例えば、B erridge（1993）Nature 361:315-325またはBillahおよびAnthes（1990）Biochem .J ． 269:281-291を参照のこと)；細胞形態学改変応答；ホスホイノシチド脂質ターンオーバー；抗ウイルス応答など）に対する薬物の効果をスクリーングするために使用され得る。いくつかの検出方法は、分離工程の削除を可能にする（例えば、近接感受性検出システム(proximity sensitive detection system)）。カルシウム感受性の色素は、蛍光計測器または蛍光細胞選別装置を用いてCa⁺⁺レベルを検出するために有用である。合理的なドラッグデザインはまた、ケモカインおよび他のエフェクターまたはアナログの分子の形の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機能を仲介する他のタンパク質、または通常はレセプターと相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定する１つの手段は、物理的構造決定（例えば、Ｘ線結晶学または２次元NMR技術）である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての手引きを提供する。タンパク質の構造決定の詳細な記載は、例えば、BlundellおよびJohnson（1976）Protein Crystallography，Academic Press ，New Yorkを参照のこと。精製ケモカインは、前述の薬物スクリーニング技術において使用するプレートに直接コートされ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体は、それぞれのリガンドを固相に固定化する捕捉抗体として使用され得る。同様の概念もまた、本発明のケモカインレセプター実施態様に適用する。 IX.キット本発明はまた、リガンド、抗体、またはケモカインレセプターの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法におけるケモカインタンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的には、キットは、定義されたケモカインペプチドまたは遺伝子セグメント、あるいはどちらか一方を認識する試薬（例えば、抗体）のいずれかを含むコンパートメントを有する。ケモカインに対する試験化合物の結合親和性を測定するためのキットは、代表的には、試験化合物；標識化合物（例えば、リガンドに対する既知の結合親和性を有する抗体）；（天然に存在するかまたは組換えの）ケモカインの供給源；およびリガンドを固定化するための固相のような、遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段を含有する。一旦化合物がスクリーニングされると、リガンドに対する適切な結合親和性を有する化合物が、レセプターに対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否かを決定するために、当該分野で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えケモカインポリペプチドの有効性は、そのようなアッセイを較正するための良く規定された標準またはポジティブコントロール試料としてまた提供する。試料中の、例えばケモカインの濃度を測定するための好ましいキットは、代表的には、標識化合物（例えば、リガンドに対する既知の結合親和性を有する抗体）、（天然に存在するかまたは組換えの）リガンドの供給源、および遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段（例えば、ケモカインを固定化するための固相）を含有する。試薬および使用または廃棄のための説明書を含むコンパートメントが、通常提供される。ケモカインまたはリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを含む抗体は、ケモカインおよび／またはそのフラグメントの上昇したレベルの存在を検出する診断的適用に有用である。このような診断的アッセイは、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を使用し得、そしてさらに血清などの中のリガンドに関連する抗原の検出を包含し得る。診断アッセイは、等質（遊離試薬と抗原−リガンド複合体との間の分離工程を有さない）または異質（分離工程を有する）であり得る。ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、酵素増幅イムノアッセイ技術(E MIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)などのような種々の市販のアッセイが存在する。例えば、未標識抗体は、第２の抗体を使用することにより用いられ得、この第２の抗体は標識され、そしてケモカインまたはその特定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッセイがまた、文献で広範に考察されている。例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Laboratory Manual，CSH を参照のこと。抗イディオ型抗体は、種々の異常な状態の診断であり得るケモカインに対する抗体の存在を診断するための類似の使用を有し得る。例えば、ケモカインの過剰産生により、種々の免疫学的反応の産生を生じ得、この反応は、異常な生理状態（特に種々の炎症性状態または喘息状態）の診断であり得る。しばしば、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適化するようにキット中に供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標識の性質に依存して、標識抗体、未標識抗体または標識ケモカインのいずれかが提供される。これは通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル生成に必要な物質などのような他の添加剤と協力する。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処分のための説明書を含む。代表的には、キットはそれぞれの有用な試薬のためのコンパートメントを有する。望ましくは、試薬は、乾燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここで、試薬は水性の媒体中で再構成され得、アッセイを行うために適切な濃度の試薬を提供し得る。薬物スクリーニングアッセイおよび診断アッセイの任意の前述の成分は、改変なしに使用され得、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分に、共有結合的にまたは非共有結合的に連結することにより達成され得る。これらのアッセイの任意のものにおいて、リガンド、試験化合物、ケモカイン、またはそれらに対する抗体が、直接的または間接的のいずれかで標識され得る。直接標識の可能性は、以下の標識グループを包含する：¹²⁵Ｉのような放射標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第3,645,090号）、および蛍光強度、波長移動、または蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特許第3,940, 475号）。間接標識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く上記の標識グループの１つに結合したアビジンへの結合が含まれる。遊離のリガンドから結合リガンドを分離する、あるいは、遊離の試験化合物から結合試験化合物を分離する多数の方法もまた存在する。ケモカインは、種々のマトリックスに固定化され得、続いて洗浄される。適切なマトリックスには、EL ISAプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが含まれる。ケモカインをマトリックスに固定化する方法には、プラスチックへの直接接着、捕捉抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが含まれるが、これらに限定されない。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を包含する任意のいくつかの方法によるリガンド／抗体複合体の沈澱を包含する。他の適切な分離技術には、Rattleら（1984）Clin ．Chem．30:1457-1461に記載されるフルオレセイン抗体磁化粒子法、および米国特許第4,659,678号に記載のような２重抗体磁性粒子分離が含まれるが、これらに限定されない。種々の標識にタンパク質またはそれらのフラグメントを連結する方法は、文献で広範に報告されており、ここでは詳細に考察する必要はない。技術の多くは、カルボジイミドまたは活性エステルの使用を介するいずれかのペプチド結合の形成のための活性化カルボキシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイミド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用が見出され得る。本発明の別の診断的局面は、ケモカインの配列から得られたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、異常な状態（例えば、炎症または発達の問題）を有すると疑われる患者由来の試料中のリガンドメッセージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよびDNAヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイズは、文献中に充分記載および考察されている。標準的には、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常は、少なくとも約18ヌクレオチドを有すべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロベースまでであり得る。種々の標識、最も一般的には放射性核種、特に³²Ｐが用いられ得る。しかし、ポリヌクレオチドに導入するためのビオチン改変ヌクレオチドの使用のような他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチンがアビジンまたは抗体への結合のための部位として作用し、これは、広範な種々の標識（例えば、放射性核種、フルオロフォア（fluorescer）、酵素など）で標識され得る。あるいは、特定の２本鎖（DNA２本鎖、RNA２本鎖、DNA−RNAハイブリッド２本鎖、またはDNA−タンパク質２本鎖を含む）を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、抗体が標識され得、そしてアッセイが行われる。ここで、２本鎖は表面に結合され、そして表面での２本鎖の形成により２本鎖に結合する抗体の存在が検出され得る。新規なアンチセンスRNAに対するプローブの使用は、任意の従来技術（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組換えプローブ(recombinational probing)、ハイブリツド放出翻訳(hybrid relea se translation)(HRT)、およびハイブリッド停止翻訳(hybrid arrested transla tion)(HART)）で実行され得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術を包含する。他のマーカーの質的存在または量的存在をまた試験する診断キットもまた意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせを試験し得る。例えば、Vialletら（1989）Progress in Growth Factor Res ．1:89-97を参照のこと。 X.レセプター特異的相互作用のリガンド結合パートナーが単離されれば、対のパートナーを単離するための方法が存在する。Gearingら、EMBO J ．8:3667-4676、またはMcMa hanら、（1991）EMBO J ．10:2821-2832を参照のこと。例えば、そのレセプターへの結合に干渉せずにケモカインを標識する手段が決定され得る。例えば、親和性標識が，リガンドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに融合され得る。発現ライブラリーが、例えば、細胞選別により、またはそのような結合成分を発現するサブ集団を検出するための他のスクリーニングにより、ケモカインの特異的結合についてスクリーニングされ得る。例えば、Hoら（1993）Proc ．Na t'l Acad．Sci． 90:11267-11271を参照のこと。あるいは、パニング法が使用され得る。例えば、SeedおよびAruffo（1987）Proc ．Nat'l Acad．Sci．84:3365-3 369を参照のこと。標識とのタンパク質架橋結合技術は、ケモカインの結合パートナーを単離するために適用され得る。これにより、例えば、リガンド−レセプター様の方法で、ケモカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定が可能となる。種々の実施態様において、DC CRおよびM/DC CRと命名される新たなレセプターが単離された。ヒト構築物の配列が、配列番号10および配列番号12に示される。ヌクレオチドレベルまたはタンパク質レベルで改変体またはフラグメントを作製するための類似の手段、およびケモカイン実施態様を主に指向する抗体を作製するための手段が、上記のように利用可能である。リガンドに対する多くの類似の用途または関連する用途が、特異的な結合試薬としてレセプターに適用される。特に、方法は、各レセプターに特異的なリガンドをについてスクリーニングに適用される。多くの用途（キットを含む）もまた、類似の技術を介して利用可能である。本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考にして最も良く理解されるが、これは、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。実施例 I．一般的方法いくつかの標準的な方法が、例えば以下に記載されるか、または参照される： Maniatisら、（1982）Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press;Sambrookら、（1989）Molecula rCloning:A Laboratory Manual ，(第二版)、第１〜３巻，CSH Press，NY;Ausube lら、Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY;またはAusubel ら、（1987および補遺）Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wil ey，New York;Innisら、（編）(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and A pplications Academic Press，N.Y.。タンパク質精製のための方法には、硫安沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、およびその他が含まれる。例えば、Ausubelら、(1987および定期的増補);Deutscher（1990）「Gu ide to Protein Purification」MethodslnEnzymology，第182巻、およびこのシリーズの他の巻；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造者の刊行物（例えば、Pharmacia，Piscataway，N.J.、またはBio-Rad，Richmond，CA.）を参照のこと。組換え技術との組合せは、適切なセグメント（例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去配列を介して融合され得る等価物）への融合を可能にする。例えば、Hochuli（1989）Chemische Industrie 12:69-70;Hochuli（1990)「Purific ation of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」Setlow（編）G enetic Engineering ，Principle and Methods 12:87-98，Plenum Press，NY;およびCroweら、（1992）QIAexpress:The High Level Expression & Protein Puri fication System QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CAを参照のこと。 FACS分析は、Melamedら、（1990）Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss， Inc.，New York，NY；Shapiro（1988）Practical Flow Cytometry Liss，New Yo rk，NY；およびRobinsonら、（1993）Handbook of Flow Cytometry Methods Wil ey-Liss，New York，NYに記載される。 II．ケモカインcDNAの単離および特徴付けＡ．TECK TECKを、RAG-1「ノックアウト」マウス由来の胸腺細胞から作製されたcDNAライブラリーから単離した。Mombaertsら（1992）Cell 68:869-877を参照のこと。個々のcDNAクローンを標準的な方法、例えば、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems，Foster City，CA）を用いて配列決定し、そしてTECK配列を同定し、そしてさらに特徴付けた。他のC-Cケモカインファミリーメンバーを用いるコンピューター解析は、アミノ酸レベルで他のケモカインとの有意な相同性を明らかにした。マウスのヌクレオチド配列を配列番号１に提供する。これは約144アミノ酸のポリペプチドをコードする。シグナル配列は、１（met）から約23（ala）まで続くべきであり、そしてシグナル配列の除去は、24（gln）で始まる１つの天然の成熟配列を提供するべきである。さらなるプロセシングは、生理学的系において起こり得る。配列は、他のほとんどのCCケモカインよりも長いカルボキシ末端テールを有することにおいて顕著である。TECKは、１つのグルコシル化部位、ならびにいくつかのAAMP、PKC、およびCK2リン酸化部位を示す。Ｂ．MIP-3α MIP-3αを、LPSおよびIFN-γで活性化したヒト単球から作製されたcDNAライブラリーから単離した。個々のcDNAクローンを標準的な方法を用いて配列決定し、そしてMIP-3α配列を同定し、そしてさらに特徴付けた。ヌクレオチド配列を、配列番号５に示す。これは少なくとも約89アミノ酸のポリペプチドをコードする。シグナル配列は約１(met)から21（cys）まで続くべきであり、そしてシグナル配列の除去は、glyで始まる１つの天然の配列を提供するべきである。さらなるプロセシングは、生理学的系において起こり得る。Ｃ．MIP-3β MIP-3βを、ヒト胎児肺細胞から作製されたcDNAライブラリーから単離した。個々のcDNAクローンを、標準的な方法を用いて配列決定し、MIP-3α配列を同定し、そしてさらに特徴付けた。ヌクレオチド配列を、配列番号７に示す。これは約98アミノ酸のポリペプチドをコードする。シグナル配列は、約１（met）から約21（ser）まで続くべきであり、そしてシグナル配列の除去は、glyから始まる１つの成熟な天然配列を提供するべきである。さらなるプロセシングは、生理学的系において起こり得る。Ｄ．ケモカインの樹状細胞レセプター；DC CR DC CRを、標準的な手順により単離されたCD34⁺臍帯血細胞から単離された樹状細胞から作製されたRNAから単離した。それをまた、ケモカインレセプター間にしばしば保存されるTM2およびTM7セグメントの縮重PCRプライマーを使用して、好酸球から単離した。これらの好酸球を、PBLの採取、溶解による赤血球の欠失、および好中球を除去するためのCD16のネガティブ選択により単離した。 PCRフラグメントの配列決定により、潜在的な新規の配列が示され、そしてそのフラグメントを使用して、ハイブリダイゼーションにより全長のクローンを単離した。クローン単離物を、標準的な方法を使用して配列決定し、そしてDC CR 配列を同定し、そしてさらに特徴付けた。ヌクレオチド配列を、配列番号９に提供する。これは約365アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-8Bレセプターへの相同性により決定される膜貫通セグメントは、およそ：39（leu）から64（phe ）のTMI；76（leu）から96（ser）のTM2；111（leu）から132（met）のTM3；151 （thr）から176（phe）のTM4；207（gly）から229（val）のTM5；246（val）から270（ala）のTM6；および291（val）から319（leu）のTM7である。アミノ末端セグメントは、おそらく細胞外セグメントであり、そして他はTM2とTM3；および TM4とTM5；およびTM6とTM7との間である。次いで細胞内セグメントは、TM1とTM2 ；TM3とTM4、TM5とTM6との間、およびTM7の末端からカルボキシ末端に続くべきである。さらなるプロセシングは、生理学的系において起こり得る。レトロウイルス感染におけるケモカインレセプターの意味は、レセプターが感染に対して重要であり得ることを示唆する。感染をブロックする抗体は、日常的にスクリーニングされ得、そして治療的使用のために開発され得る。Ｅ．ケモカインの単球／樹状細胞レセプター；M/DC CR M/DC CRを、IFN-γ（10ng/ml）、LPS（1μｇ/ml）、抗IL-4モノクローナル抗体（５μｇ/ml）、および抗IL-10モノクローナル抗体（５μｇ/ml）を含む培地中で、2.5〜t時間培養したヒト単球細胞から作製されたcDNAライブラリーから単離した。個々のcDNAクローンを標準的な方法を使用して配列決定し、そしてM/DC CR配列を同定し、そしてさらに特徴付けた。ヌクレオチド配列を、配列番号11 に示す。これは約356アミノ酸のポリペプチドをコードする。膜貫通セグメントは、およそ以下のようであるべきである：52（leu）から76（val）のTM1；86（a sn）から107（ala）のTM2；117（ile）から138（val）のTM3；157（val）から18 2（t yr）のTM4；211（phe）から233（val）のTM5；251（leu）から275（phe）のTM6 ；および296（ile）から315（leu）のTM7。DC CRについては、アミノ末端セグメントは、おそらく細胞外セグメントであり、そして他はTM2とTM3；およびTM4とT M5；およびTM6とTM7との間である。次いで細胞内セグメントは、TM1とTM2；TM3 とTM4、TM5とTM6の間、およびTM7の末端からカルボキシ末端に続くべきである。 III．抗体の調製抗体の調製のための多くの標準的な方法が、入手可能である。例えば、合成ペプチドは、抗原として使用するために、そして適切な動物に投与するために調製され得、そしてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかが調製され得る。例えば、約10アミノ酸未満の短いペプチドが反復され得、一方、より長いペプチドが単独でまたはキャリアと結合されて使用され得る。例えば、M/DC CRと共に、動物を、18〜44（LAPで始まり、そしてKYDで終わる；アミノ末端に向かうフラグメント）および183〜204（KPQで始まり、そしてPADで終わる；細胞外ループに対応する）（配列番号13を参照のこと）からのアミノ酸配列に対応するペプチドで免疫した。ポリペプチドが、最も特有である部分（例えば、保存された配列領域からでない）から選択される場合、最も高い特異性が生じる。動物は抗血清を回収するために使用され得るか、またはモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。抗血清を、ELISAに有用であると決定し、そして免疫沈降またはウェスタンブロット分析としての利用について評価する。モノクローナル抗体もまた、これらの同じ使用について評価する。提供される抗体は、免疫組織化学のための免疫親和性試薬として、検出試薬として、および治療試薬として有用である。 IV．ケモカインの走化性活性についてのアッセイケモカインタンパク質は、例えば、エレクトロポレーションによりケモカイン cDNAを保有するプラスミドでトランスフェクトしたCOS細胞において産生される。Haraら（1992）EMBO J．10:1875-1884を参照のこと。物理学的分析方法は、例えば、CD分析に適用され、タンパク質が活性コンホメーションに折り畳まれるようであるかどうか評価するために、他のケモカインと三次元構造を比較し得る。トランスフェクションの後、培養上清を回収し、そしてバイオアッセイに供する。模擬コントロール、例えば、ルシフェラーゼcDNAを保有するプラスミドを使用する。de Wetら（1987）Mol．Cell．Biol．7:725-757を参照のこと。ポジティブコントロール、例えば、R&D系（Minneapolis，MN）からの組換えマウスMIP-1αを、代表的に使用する。同様に、抗体を使用して生物学的活性をブロックし得る（例えば、コントロールとして）。リンパ球走化アッセイを、以前に記載される（例えば、Baconら（1988）Br．J ．Pharmacol．95:966-974における）ように行う。R．CoffmanおよびA．0'Garra （DNAX，Palo Alto，CA）から入手可能に作製されるマウスTh 2Ｔ細胞クローンであるCDC-25（Tonyら（1985）J．Exp．Med．161:223-241を参照のこと）および HDK-1(Cherwinskiら（1987）J．Exp．Med．166:1229-1244を参照のこと）を、それぞれコントロールとして使用する。ケモカイン刺激におけるCa2⁺流動を、Baconら（1995）J．Immunol．154:3654- 3666に記載の公開された手順に従って測定する。 MIP-1αに応答した走化細胞の最大数は、代表的には、10^-8Mの濃度で起こり、これはヒトＴ細胞のCD4⁺集団についての元の報告と一致する。Schall（1993）J ．Exp．Med．177:1821-1826を参照のこと。用量反応曲線を決定し、好ましくは特徴的なベル型の用量反応曲線を生じる。 C-Cケモカインでの刺激の後、リンパ球は、一般に測定可能な細胞内Ca2⁺流動を示す。MIP-1αは、カルシウム流動の即時型の過渡応答を誘導し得る。代表的に、これらのアッセイにおいて使用されるケモカインのレベルは、走化性アッセイのために使用されるアッセイに匹敵する（馴化上清の1/1000希釈）。レトロウイルス感染アッセイもまた記載され、そしてレトロウイルス感染プロセスにおける特定のケモカインレセプターの最近の記載は、同様の役割が、DC C Rおよび／またはM/DC CRに適用され得ることを示し得る。例えば、Balter（1996 ）Science 272:1740（HIVの補助レセプターとしてのケモカインレセプターの証拠を記載する）；およびDengら（1996）Nature 381:661-666を参照のこと。Ｖ．ケモカイン／レセプター遺伝子の発現分析 RNAブロットおよびハイブリダイゼーションを、Maniatisら（1982）Molecular Cloning:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Sp ring Harbor，NYにおける標準的な方法に従って行う。cDNAフラグメントの適切なフラグメントを、プローブとして使用するために選択する。各レーンにロードされたRNAの量を変化させるために、基質膜を、コントロールcDNA、例えば、グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）cDNA（Clontech，Palo A lto CA）と共に再びプローブ（reprobe）する。プローブを使用する適切な細胞供給源からのmRNAの分析は、メッセージの天然のサイズを決定する。それはまた、異なるサイズのメッセージが存在するかどうかを示す。メッセージは、例えば、PCRまたはハイブリダイゼーション技術による単離の後、分析に供される。ノーザンブロット分析が、多くの異なったmRNA供給源において行われ得る。しかし、特定の場合、cDNAライブラリーは、調製することが困難である供給源を、評価するために使用され得る。「逆ノーザン」は、ベクターから除去されたcDNA挿入物を使用するが、バンドの多様性は、異なるサイズのメッセージを反映するか、またはcDNAライブラリーの調製における不完全な逆転写に起因する人工産物であるかのいずれかであり得る。このような場合、標準的なノーザン分析による確認が適切であり得る。同様に、サザンブロットは、遺伝子の種の分布を評価するために使用され得る。ブロットの洗浄のストリンジェンシーはまた、種々の種の対応物の相同性の程度について情報を提供する。組織分布および細胞分布は、抗体を使用して免疫組織化学により評価され得る。あるいは、インサイチュ核酸ハイブリダイゼーションはまた、このような分析において使用され得る。Ａ．TECK TECKを、RAG-1「ノックアウト」マウスから単離した。この動物は、非常に優勢なpro-Tまたはpre-T細胞により特徴付けられ、それはＴ細胞レセプターの再構成のブロック時点の後、より成熟なＴ細胞を欠失する。これはpro-Tまたはpre-T 細胞、胸腺の間質細胞、およびおそらくマクロファージ、上皮、および樹状細胞により発現され得る非常に初期のＴ細胞発達における役割を示唆する。これは、組織分布の観察に適合する。表２：組織および細胞におけるmTECKmRNA発現 mTECKmRNAの分析を、記載されるように行った。+から+++は、シグナルの相対強度を示す。R/A：休止または活性化。種の分析は、ヒト、ラット、およびハムスターDNAにおけるハイブリダイゼーションによりポジティブシグナルを示した。組織分布分析は、遺伝子がヒト小腸において発現されることを示し、これはまたＴ細胞分化を補助する組織である。このケモカインの構造および分布の組合せは、胸腺において通常起こるＴ細胞発生における役割を示唆する。Ｂ．MIP-3α MIP-3αを、抗IL-10の存在下で、LPSおよびIFN-γで活性化されたヒト単球から作製されたcDNAライブラリーから同定した。これはまた、膵臓島細胞、胎児肺、および肝臓HEPG2細胞において検出されている。遺伝子は、CLONTECHからの組織ブロットにおける探索により決定されるように、HL-60（前骨髄球白血病）；S3（HeLa細胞）；K562（慢性骨髄性白血病）；MOL T-4（リンパ骨芽細胞白血病）；Raji（バーキットリンパ種）；SW480（結腸直腸の腺ガン）；A549（肺ガン）；およびG361（黒色腫）細胞株において発現される。この組織発現は、リンパ節、虫垂、末梢血リンパ球、胎児肝臓、および胎児肺においてポジティブシグナルを生じる；しかし脾臓、骨髄、脳、および腎臓において検出可能なシグナルは生じなかった。主要な転写物は、胎児肺RNAにおける２つのさらなる転写物サイズと共に、約1 .2kbであるようである。種々の組織の中で、1.8、2.7、および4.2kbの転写物サイズが検出された。ポジティブシグナルもまた、以下のcDNAライブラリーにおいて検出された：LP Sで活性化された樹状細胞、しかし、GM-CSFおよびIL-4で活性化された場合は検出されない；LPS、IFN-γ、および抗IL-10で処置された単球、しかし、LPS、IFN -γ、およびIL-10で処置された場合は検出されない；および活性化されたPBMC。これらの発現データは、細胞活性化における炎症性応答におけるこのケモカインを関連づける。リンパ節、虫垂、およびPBLは、炎症性プロセスが起こる部位である。MIP-3αは、単球および炎症性事象に関与する細胞においてその効果を発揮し得る。他の構造的特徴は、好酸球および肺生理学（例えば、喘息徴候）におけるこのケモカインを関連づける。従って、ケモカインのアンダゴニスト（例えば、抗体）は、喘息状態の処置のために重要であり得る。また、IL-10は、MIP -3α発現を阻害するようである。ヒトMIP-3αは、DC CRのリガンドである。従って、ポジティブコントロールは、そのレセプターのためのCa++流動アッセイのために存在する。これは、DC CR のアゴニストリガンドのさらなるスクリーニングを可能にする。さらに、DC CR は、好酸球cDNAから単離され、そしてインビトロで好酸球がMIP-3αへ移動する観察を行った。これは、DC CRとのMIP-3α相互作用は、エオタキシン（eotaxin）リガンドおよびCCR3と共に起こるので、好酸球の補充において重要であることを示唆する。このように、DC CRとのMIP-3αの相互作用のアンタゴニストは、特に肺、または肺の炎症において好酸球増加症を阻害することにおいて有用であるようである。これらは喘息または他の肺の状態を付随し得る。 MIP-3αに対するアンタゴニストは、抗体またはレセプター相互作用を阻害する他の結合組成物のいずれかで作製され得る。抗体は、リガンド、MIP-3α自体に対する、またはレセプターDC CRの結合部分に対する抗体であり得る。ケモカインのムテインは、レセプター相互作用をブロックし得、そしてポジティブコントロールと共に、ケモカンムテインは、種々の濃度で野生型ケモカインと競合する変異体についてスクリーニングされ得る。例えば、Kenakin（1987）Pharmacol ogical Analysis of Drug-Receptor Interaction Raven Press，NY;Arunlakshan aおよびSchild（1959）Br．J．Pharmacol．14:48-58;Black（1989）Science 245 :486-493;Zurawsklら（1986）J．Immunol．137:3354-3360;ZurawskiおよびZuraw ski（1988）EMBO J.7:1061-1069;ZurawskiおよびZurawski（1992）EMBO J.11:39 05-3910;ImlerおよびZurawski（1992）J．Biol．Chem 267:13185-13190を参照のこと。Ｃ．MIP-3β MIP-3βを、抗ILの存在下で、LPSおよびIFN-γで活性化されたヒト単球から作製されたcDNAライブラリーから同定した。他の細胞および組織におけるこの分布は、完全に決定されていない。Ｄ．ケモカインの樹状細胞レセプター；DC CR DC CRを、樹状細胞cDNAライブラリーから作製されたcDNAライブラリーから単離した。それは、特定のＴ細胞、脾臓細胞サブセット、NK細胞、および樹状細胞において豊富な他の細胞集団（CD1a⁺、CD14⁺、およびCD1Aa⁺細胞を含む）において発現されるようである。それはTF1、Jurkat、MRC5、JY、またはU937細胞において検出可能なシグナルを生じなかった。樹状細胞、そのリガンド（MIP-3αを含む）において見られることは、免疫応答の開始のために適切な細胞を引き寄せることにおいて重要であり得る。それゆえ、MIP-3αは、樹状細胞を引きつけるようであり、免疫応答の開始を誘導する。肺の生理学が、レセプターおよびリガンドの両方の分布から示唆される。レセプターはまた、このような応答に重要な他の細胞において存在し得る。Ｅ．ケモカインに対する単球／樹状細胞レセプター；M/DC CR M/DC CRを、LPSおよびIFN-γで活性化した初期単球細胞から作製されたcDNAライブラリーから単離したが、これらの細胞由来の既知の高い量の遺伝子を除いた。この遺伝子の量は、おそらくこれらの細胞由来のメッセージの約１％未満である。組織発現では、脾臓、PBL、肺、胎盤、および小腸において陽性シグナルが生じたが、脳、肝臓、腎臓、および筋肉においては検出可能なシグナルはなかった。この分布は、造血系の役割を示唆する。１つの主要な転写物が存在するようであるが、付加的なメッセージまたは代替的にスプライシングされたメッセージの存在は除去されていない。陽性シグナルはまた、続くcDNAライブラリー（単球および樹状細胞）において検出されたが、シグナルはCD8⁺Ｔ細胞、あるいは休止しているかもしくは活性化された脾臓細胞、ガンマ-デルタＴ細胞、NK細胞、またはＢ細胞のいずれにおいても検出可能ではなかった。免疫組織化学を行い、Ｔ細胞およびＢ細胞区画における不在を確認し、そして扁桃腺において、特に脾臓および胎盤においては位置を考慮して調べた。単球および樹状細胞上の比較的制限された分布により、その命名が導かれ、そしてこれらの細胞型における機能的役割もまた示唆される。それらは、それらがＴ細胞に対して抗原をプロセスし、提示する能力による免疫応答の開始において重要である。 VI.TECKの特異的特徴づけ新規のCCケモカインを、マウスおよびヒトの胸腺において同定し、そしてThym us Expressed ChemoKineとしてTECKと命名した。TECKは、他のCCケモカインと弱い相同性を有し、そしてマウス第８番染色体にマップする。胸腺の他に、TECKをコードするmRNAは、小腸において実質的なレベルで、および肝臓において低いレベルで検出された。胸腺内のTECKの供給源は胸腺樹状細胞であることが決定されたが、対照的に骨髄由来の樹状細胞は、TECKを発現しない。マウスTECK組換えタンパク質は、活性化マクロファージ、樹状細胞および胸腺細胞に対して走化性活性を示した。本発明者らは、TECKが、おそらくＴ細胞発生に関与している新規の胸腺樹状細胞特異的CCケモカインを表すと結論する。ケモカインは、その最良に記載された生物学的機能が、炎症の局在化部位への特定の白血球集団の移動を制御することである小ペプチド（６〜15kDa）のファミリーに属する。Baggiolini，ら、(1994)Adv ．in Immun．55:97-179;SchallおよびBacon（1994）Curr Opin Immun 6:865-873;HedrickおよびZlotnik(1996)Cur r ．Opin．Immunol． 8:343-347。最近の２、３年において、ケモカインスーパーファミリーの多くの新しいメンバーが、特徴づけられている。最初に、新しいケモカインは、白血球に対するそれらの走化性効果によって同定され(Baggiolini ら，(1994);SchallおよびBacon(1994))、そして主に血液白血球または細胞株から単離された。より最近では、シグナル配列トラップによる分泌分子の選択的クローニングに基づくか(Tashiroら（1993）Science 261:600-603;Imaiら（１996 ）J ．Biol．Chem．271:21514-21521)、または生命情報科学を介する発現配列タグ(EST)の公共および私有のデータベースの検索に基づく(Hieshimaら（1997）J ．Biol．Chem． 272:5846-5853;Patelら（1997）J ．Exp．Med．185:1163-1172、およびRossiら（1997）J ．Immunol．158:1033-1036)アプローチにより、配列および構造的な相同性に基づく新規のケモカインの迅速な同定が可能となっている。これらのアプローチは、ケモカインの大部分が、そのタンパク質配列が４つの保存されたシステインを含む分泌因子である事実を利用する(Schall（1994）「Th e Chemokines」 419-460頁、Thomson編、The Cytokine Handbook,，Academic Pre ss，New York。CXCまたはαケモカインファミリーは、非保存的アミノ酸によって分離された２つの最初のアミノ末端システインを有する。CCまたはβケモカインファミリーでは、これらの２つのシステインは連続的である。ケモカインの第３の型（Cまたはγファミリー）は、リンフォタクチン(lymphotactin)により代表され、これは、元の４つのかわりに２つのシステイン（１および３）を保存する(Kelnerら(1994)Science 266:1395-1399)。最後に、最初の２つのシステインを分離する３つのアミノ酸を有する最近同定されたケモカインは、第４のCX₃C ファミリーを規定する(Bazanら（1997）Nature 385:640-644)。興味深いことに、発見された新しいケモカインのいくつかは、発現の比較的制限されたパターンを示す(Imalら(1996);Hieshimaら(1997))。これらの新規のアプローチは、組織特異的または細胞特異的なケモカインの発見を導き得る。さらに、新しい生物学的証拠が、造血におけるケモカインの重要な新しい役割について存在する(Cook（1996）J ．Leukoc．Biol．59:61-66;およびNagasawaら（1996 ）Nature 382:635-638)、およびHIVを含むウイルス感染の制御(Cocchiら（1995 ）Science 270:1811-1815;およびCookら（1995）Science 269:1583-1585)。従って、DNAに基づくストラテジーによる新規のケモカインの分子クローニングは、ケモカインスーパーファミリーに属するが、その生理学的役割が炎症の制御を越える新規のタンパク質を明らかにする。Ｔ細胞発生に関与する新規遺伝子を同定するための試みにおいて、本発明者らは、Recombinase Activation Gene-1(RAG-1)欠損マウスの胸腺由来のcDNAライブラリーを解析した。本発明者らは、他の既知のケモカインとの配列相同性に基づき、Thymus Expressed ChemoKineについてTECKと命名された新規のCCケモカインを同定した。次いで、本発明者らは、TECKのヒトホモログを単離した。TECK mRN Aの発現のパターンは、ヒトおよびマウスの両方において胸腺および小腸に非常に制限されている。さらに、マウス胸腺において、TECKタンパク質は樹状細胞により産生される一方、脾臓の樹状細胞はTECK mRNAを発現しない。組換えTECKは、胸腺細胞、マクロファージ、THP-1細胞および樹状細胞において走化性活性を示す一方、末梢血リンパ球および好中球に対しては不活性であった。TECKの生物学的特性と共にTECKの発現パターンが制限されることにより、Ｔ細胞発生におけるこの新規の樹状細胞特異的ケモカインの役割が示唆される。Ａ．マウスTECKのクローニングおよび構造解析方向性cDNAライブラリーを、RAG-1欠損マウス胸腺から作製し、ランダムシーケンシングにより解析した。クローンの１つが、先に記載されたCCケモカインに対し有意な相同性を有するオープンリーディングフレームを含んだ。全長cDNAは、 142アミノ酸のタンパク質をコードする426bpのオープンリーディングフレームを含む1037bpを含み、そして本報告においてmTECK（配列番号１を参照のこと）として同定される。3'非翻訳領域において、ノーザンブロットにおいて観察される単一のmRNA種と一致する１つのユニークなポリアデニル化シグナルが存在する。 mTECK cDNAは、いずれのATTTA転写不安定化モチーフも含まない(ShawおよびKamr n（1986）Cell 46:659-667)。mTECKと先に記載されたマウスCCケモカインとのアミノ酸配列の比較は、全てのこれらのケモカインにおいて存在する４つのシステインの保存を示す。しかし、mTECKは、これらのタンパク質とのさらなる同一性はほとんど示さない。Ｂ．ヒトTECKのクローニングおよび分子的特徴づけ他の哺乳動物種におけるmTECKと相同的な遺伝子の存在の可能性を研究するために、種々の種由来のゲノムDNAに対するサザンブロットを、mTECK cDNAプローブでハイブリダイズした。高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズバンドが、マウス、ラット、ハムスター、およびヒトのゲノムDNAにおいて検出された。興味深いことに、単一のバンドがヒトにおいて検出され、このことは単一の遺伝子がこの種においてTECKをコードすることを示唆する。マウス、ラットおよびハムスターにおいて存在する複数のバンドは、TECK遺伝子内の内部のEcoRI部位の結果であり得た。あるいは、TECK遺伝子は、これらの種で複製されているかもしれない。 mTECKのヒトホモログをクローン化するために、ヒトcDNAライブラリーのパネル由来のcDNAのブロットを、mTECK cDNAプローブでハイブリダイズした。１つのシグナルが、胎児小腸cDNAライブラリーにおいて観察された。mTECKプローブでのこのライブラリーのスクリーニングは、151アミノ酸のタンパク質をコードする453bpのオープンリーディングフレームを有する1012bpのいくつかの同一のクローンの単離を可能にした。このタンパク質は、他の既知のCCケモカインよりmT ECKに対して核酸レベルで非常により高い程度の相同性を有し（オープンリーディングフレームについて71％の核酸同一性、および49.3％のアミノ酸同一性）、従ってhTECKと命名した。Ｃ．mTECKの染色体配置ほとんどのケモカインをコードする遺伝子は、ゲノム中でクラスター形成されることが示されている。CCケモカインをコードする遺伝子は、マウス第11番染色体およびヒト第17番q11-12染色体上にクラスター形成する。Schall(1994)；ならびにHedrickおよびZlotnik(1996)。mTECKの染色体配置（遺伝子記号Teckと命名される）を、([C57B1/6JXM.spretus]F1×C57B1/6J)マウス間で種間戻し交配分析により決定した。Jenkinsら，（1982）J ．Virol．43:26-36。マッピング結果はT eck遺伝子座が、マウス第８番染色体の近位部分に位置することを示した。ヒトT eck遺伝子座の染色体配置は、決定され得なかったが、マウス第８番染色体のこの領域は、ヒト第19番染色体p13.3および第13番染色体q34領域にシンテニーである。しかし、Teck遺伝子座はまた、ヒト第４番染色体にシンテニーである領域に非常に近い。最も近い既知の遺伝子であるInsrはインスリンレセプターをコードし、TeckとInsrとの間の遺伝的距離は0.9±0.9cMと見積もられた。本発明者らは、第８番染色体の本発明者らの種間マップと多くのマウス非クローン化変異のマップ配置を報告する複合マウス連鎖マップと比較した(Mouse Genome Database， The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。Teckは、この遺伝子座における変化が期待されるべき表現型を有するマウス変異体を欠く複合マップの領域内に存在する。Ｄ．細胞および組織内でのmTECKおよびhTECK mRNA分布の分析ノーザンブロットによるかまたはマウスcDNAライブラリーのサザンブロットによる組織および細胞内でのmTECK mRNAの分布の分析は、mTECKが胸腺においてのみ有意なレベルで発現され、そして小腸においてはより小さい程度で発現されることを明らかにした（表２）。mTECK mRNAの弱い発現は、脳、精巣、および肝臓 RAG-1-/-cDNAライブラリーにおいて観察された。興味深いことに、mTECK mRNAは、活性化プロＴ細胞のcDNAライブラリーにおいて検出された。プロＴ細胞は、完全にはＴ細胞系統に方向づけられていない、胸腺内Ｔ細胞前駆細胞の初期段階を代表する。なぜならそれらはNK細胞および樹状細胞を生じさせ得るからである。 MooreおよびZlotnik（1995）Blood 86;1850−1860；Wuら(1996)J ．Exp．Med．18 4:903-911)。対照的に、mTECK mRNAは、休止している胸腺細胞または活性化された胸腺細胞、末梢Ｔ細胞またはＢ細胞、マクロファージ、PBL．脾臓樹状細胞、およびLPSで注射されたマウスから回収された脾臓を除いては試験された他の組織のすべてにおいて検出不能であった（表２）。興味深いことに、mTECK mRNAは、PCRにより妊娠14日目の胎児胸腺において検出され、このことはmTECKがＴ細胞発生の最も初期の段階で胸腺において発現されることを示す。 hTECK mRNAの分布もまた、同様に分析した。マウスでのように、hTECK mRNA発現は、胸腺および小腸に非常に制限された。弱い発現がまた、炎症を起こした扁桃腺および胎児の脾臓で検出されたが、胸腺において観察されたよりずっと低いレベルであった。なぜなら、この特定のブロットは長時間暴露されたからである。重要なことに、hTECK mRNAは、骨髄CD34+前駆細胞または末梢血単球にインビトロで由来する樹状細胞由来の一連のcDNAライブラリーには存在しなかった。さらに、hTECK mRNAはまた、LPSまたはTNF-α、IL-1αおよび単球上清の組み合わせで４および16時間刺激した単球由来樹状細胞のライブラリーには存在しなかった。総括して、これらのデータは、TECK mRNAが、インビボで胸腺および小腸において高いレベルで特異的に発現されることを示す。Ｅ．インビボでのmTECK産生細胞の同定 RAG-I欠損胸腺におけるmTECK mRNA発現の豊富さ、およびその胸腺Ｔ細胞における不在は、mTECKが、正常マウスにおいて胸腺間質成分により発現されることを示唆した。本発明者らは、PCRにより作製されたセンスまたはアンチセンスのm TECKプローブとのインサイチュmRNAハイブリダイゼーションを実施した。センスプローブ（陰性コントロール）とハイブリダイスされた胸腺切片は、特異的な染色がないことを示し、一方同じ濃度のアンチセンスプローブとハイブリダイズされた切片は、胸腺髄質において特異的な染色を示した。より高い拡大率で、陽性細胞は、リンパ球細胞の周囲の突起をともなう非リンパ形態を有するようであった。この実験は、インビボで、mTECK mRNAが、髄質性間質（おそらく樹状細胞）の非リンパ成分により発現されることを示した。胸腺間質は、血管系および神経組織のネットワークと共に、主に上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞、および線維芽細胞から構成される。Boydら（1993）Im munol ．Today 14:445-459。本発明者らは、以前には、IFN-γによる活性化を用いてもまたは用いなくても、胸腺上皮またはマクロファージの細胞株においてmT ECK mRNAの発現を検出できなかったので（表２）、本発明者らは、胸腺樹状細胞をそれらのMHCクラスIIおよびCD11c(N-418抗体)の高発現に基づいて選別した。R T-PCRによるmTECK発現の分析は、新たに単離されたMHCクラスII+CD11c+胸腺樹状細胞がmTECK mRNAを発現する一方、MHCクラスII+CD11c-サブセットは陰性であることを明らかにした。対照的に、mTECK mRNAは、新たに単離された肺臓樹状細胞から作製されたcDNAライブラリーにおいては検出不能であった（表２）。次いで、本発明者らは、胸腺切片および精製胸腺樹状細胞を、mTECKのＣ末端に対応する10ペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体を用いて免疫染色することを行った。このポリクローナル抗体は、ELISAおよびウェスタンブロットにおいて組換えmTECKと反応するが、正常ウサギ血清には陰性であった。胸腺切片において、ポリクローナル抗ペプチド抗体は、インサイチュハイブリダイゼーションデータと一貫して胸腺髄質の間質成分と反応するが、正常ウサギ血清を用いた染色は陰性であった。興味深いことに、抗体はまた、いくつかの内皮細胞に弱く反応し、これはmTECKが、胸腺内皮細胞により産生され得る可能性を生じる。最終的に、抗mTECKポリクローナル抗体は、分別された胸腺樹状細胞を染色するが、コントロール血清は陰性であった。高い拡大率は、特徴的な樹状の形態を有する細胞の細胞内染色を示した。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、胸腺樹状細胞およびおそらく胸腺内皮細胞が、インビボでTECKを産生していることを示す。Ｆ．mTECKタンパク質の走化性活性 mTECKの生物学的特性を評価するために、Ｎ末端FLAGペプチドを有する組換えタンパク質を、細菌発現系において得た。いくつかの実験において、Ｃ末端FLAG を有する組換えmTECKタンパク質を使用し、そして同様の結果を得た。興味深いことに、mTECKはマウス胸腺細胞の移動を誘導した（図１Ａ）。至適な応答が、１0ng/mlのTECKの用量で得られた。細胞移動を、交差(checkerboard)分析によって、走化性であって化学運動性でないことを決定した。さらに、ケモカインがヘテロトリマーＧタンパク質を介して細胞内情報伝達経路へ連結される特異的レセプターへ結合することが確立される。Murphy（1994）Annu ．Rev．Immunol．12:593-6 33。胸腺細胞の走化性がＧタンパク質連結レセプターを関与させたかを決定するために、細胞を、アッセイの前に、Ｇ_αiタンパク質をADPリボシル化する10ng/m １の百日咳トキシンとともにインキュベートした。Katzら（1992）Nature 360:6 86-689。この前処理は、mTECKに対する胸腺細胞の走化性応答を完全に抑止した（図１Ａ）。組換えmTECKタンパク質はまた、IFN-γで16時間活性化されたヒト単球THP-1細胞の移動を誘導し（図１Ｂ）、一方休止しているTHP-1細胞に対しては有意な活性はなかった。この実験は、mTECKがヒト細胞に対して活性であることを示した。さらに、mTECKは、活性化マウス腹腔マクロファージを、非常に精製されたマウス脾臓樹状細胞と同様に移動させるように誘導した（図１Ｂ）。これらの全ての実験において、mTECKの至適な用量は、10ng/mlであった。対照的に、骨髄細胞、精製好中球、肺臓Ｂ細胞、脾臓Ｔ細胞、または成熟Ｔリンパ球およびＢリンパ球を欠く住-2活性化RAG-1欠損マウス脾臓細胞に関しては、走化性は観察されず( Mombaertsら（1992）Cell 68:869-877)、それゆえNK細胞において富化された。これらのデータは10μｇのmTECKの腹腔内注射の２および５時間後の好中球、単球、またはリンパ球のインビボ蓄積がなかったことと一貫する。集団的に、これらのデータは、TECKが、胸腺細胞、マクロファージおよび樹状細胞の走化性因子であることを示す。Ｇ．TECK、CCケモカインファミリーの遠いメンバーこの報告において、本発明者らは、TECK（新規なマウスおよびヒトCCケモカイン）の分子の単離および特性を記載する。その予測されるアミノ酸配列の分析は、TECKが先に記載したCCケモカインに遠く相関することを示した。ほとんどのCC ケモカインの中の特定のアミノ酸の保存は、それらの機能的な重要性に相関し得る。Beallら(1992)J ．Biol．Chem．267:3455-3459;および、Lusti-Narasimhanら（1995）J ．Biol．Chem．270:2716-2721。特に、第２および第３のシステインの間のチロシン残基は、単球走化性について（50位において）重要であることを示した(Beallら(1992))。TECKがこの特定の位置にチロシンを有さない場合、TECK は活性化単球について走化性であるので、それは同じ機能を有し得る52位にチロシンを有する。一次構造におけるこれらの差異に加えて、TECKをコードする遺伝子は、第11番染色体上にクラスター形成されるほとんどの他のCCケモカインとは異なり、マウスにおける第８番染色体上にマップされる。これは、CCケモカインについての異常な染色体位置の最初の報告ではない。本発明者らは、ヒトCCケモカインMIP-3βをクローン化し、そしてその遺伝子は、17ではなく第９番染色体上であることを示し(Rossiら(1997))、そして新規なヒトCCケモカインMIP-3α/L ARCをコードする遺伝子(Rossiら(1997))は、第２番染色体上にマップしている（ Hieshimaら(1997)）。マウスにおける第11番染色体およびヒトにおける第17番染色体上のCCケモカインは、始原ケモカインの遺伝子複製を介して生成したようである。本発明者らの結果は、TECKが進化の間のより早期の段階で生成されたことを示唆する。このことについて、TECK遺伝子は、遠い一次構造を有するが、その二次および三次構造によって決定されるような同様のレセプター（単数または複数）を介する他のCCケモカインと類似の機能を確実にするように進化したかもしれない。あるいは、TECKのレセプター（単数または複数）および生理学的役割は、ケモカインの間で特有であり得る。Ｈ．TECK発現および機能は、Ｔ細胞発生に関連する。本発明者らは、TECKがＴ細胞発生が起こる第一のリンパ器官である胸腺において強く発現されるのを観察した。最近、胸腺において高く発現される別のCCケモカインであるTARCが、同定された。Imaiら(1996)。しかし、TARCはまた、肺および大腸、ならびに活性化PBMCにおいて発現されたが(Imaiら(1996))、一方でTECK は、これらの組織に存在しなかった。胸腺に加えて、多くの報告は、Ｔ細胞発生が、TECKがまた発現される小腸において起こり得ることを示す(PoussierおよびJ ulius（1994）Annu ．Rev．Immunol．12:521-553)。興味深いことに、肝臓もまた、Ｔ細胞発生をある程度支持すると考えられており(Aboら(1994)Int ．Rev．Immu nol． 11:61-102)、そして本発明者らは、肝臓cDNAライブラリーにおいて低いTECK発現を観察した。これらのデータは、TECK発現が、Ｔ細胞発生を支持する器官と相関することを示す。Ｔ細胞分化の多くの分子および細胞の局面がよく証明される一方で、Ｔ細胞発生におけるケモカインの正確な役割は、なお知られていない。最近、骨髄間質誘導CXCケモカインSDF-1は、SDF-1-/-マウスがこれらの機能について障害性であるために、Ｂリンパ球新生および骨髄造血に重要であることが示された(Nagasawa ら(1996))。同様に、ケモカインは、Ｔ細胞分化の異なる工程で作用するようである。ケモカインは、適切な接着分子の発現と共に、方向付けられていない前駆体の、骨髄から他の解剖学的位置への移動を指示し得る。実際SDF-1は、ヒトCD3 4+前駆細胞のための化学誘引物質である。Aiutiら(1997)J ．Exp．Med．185:111- 120。TECKが、成熟末梢Ｔ細胞のためではなく胸腺細胞のための化学誘引物質であるとの所見は、TECKが、Ｔ細胞前駆体を胸腺に引きつけ得ることを示唆する。このような集団は、インビトロでの走化性実験を実施するに十分な数で単離することは非常に困難であるが、本発明者らは、最近、この重要な疑問に取り組むための新しい戦略を設計している。さらに、本発明者らは、骨髄細胞に対してはTE CKの有意な走化性活性を見出していない。SDF-1は、骨髄由来のCD34+前駆体に対する効果より、末梢血液由来のCD34+前駆体に対してかなり小さな効果であることが示された。Aiutiら(1997)。TECKに対する前駆細胞の感受性は、これらの細胞が骨髄を離れてリンパ器官に移植するにつれて増加する可能性がある。重要なことに、胸腺内成熟はまた、最も早期の前駆体を含む被膜下領域から、胸腺細胞がそれらの成熟を終える皮質および最終的に髄質への方向性移動によって特徴付けられる(Boydら(1993))。延髄性樹状細胞によるTECKの分泌は、この方向性移動において役割を果たし得る可能性がある。TECKが胸腺間質の組織化および発達において役割を果たし得るというなお別の可能性もある。本発明者らはまた、TECKが、活性化マクロファージおよび樹状細胞について走化性であることを示した。これらの２つの細胞型はまた、Ｔ細胞発生において重要な役割を果たす。ポジティブ選択およびネガティブ選択現象を含む複雑なスクリーニングプロセスを介して、胸腺においてランダムに生成されたほとんどの抗原特異性は、プログラム細胞死によって除去される(Janeway（1994）Immunity 1:3-6)。死滅した胸腺細胞の効率的な捕捉は、おそらく、少なくとも部分的には、胸腺マクロファージによって仲介され、したがってTECKは、活性化マクロファージに対するその作用を介して重要な役割を果たし得る。さらに、自己抗原について高親和性を有し、したがって潜在的に有毒なＴ細胞は、ネガティブ選択を介して除去される(Janeway(1994))。胸腺樹状細胞は、胸腺細胞のネガティブ選択を主に担い、それゆえ寛容の確立において重要な役割を果たすことが考えられる。Inabaら(1991)J ．Exp．Med．173:549-559。中心の寛容の効率的な機構は、胸腺において発現されない自己抗原（例えば、器官特異的自己抗原）に対して潜在的に反応性のＴ細胞を除去する。いくつかの公知のケモカインは、樹状細胞の移動を誘導し、そしてそれゆえ末梢免疫応答の間のそれらの補充に寄与し得る。So zzaniら(1995)J ．Immunol．155:3292-3295;およびXuら(1996)J ．Leukoc．Biol． 60:365-371。同様に、器官特異性または他の抗原を提示する樹状細胞は、胸腺または小腸に補充され、そしてこれらの抗原に特異的なＴ細胞のネガティブ選択を誘導し得る。TECKのような樹状細胞に対して活性な胸腺および小腸特異的ケモカインは、寛容の確立において重要な役割を果たし得る可能性がある。したがって、TECKは、Ｔ細胞発生のいくつかの重要な工程で潜在的に相互作用し得る。将来の実験は、遺伝的に改変したマウスの使用を介してＴ細胞発生および他の生理学的プロセスにおけるTECKの正確な役割を定義することを目的とする。Ｉ．TECKは、胸腺樹状細胞によって特異的に発現される。樹状細胞は、骨髄前駆体由来の異質な細胞集団を意味する。それらは、未成熟樹状細胞（例えば、皮膚におけるランゲルハンス細胞）として非リンパ器官に存在し、ここでそれらは、抗原捕獲について高い能力を呈する。Cellaら(1997)Cur r ．Opin．Immunol． 9:10-16。抗原チャレンジ後、それらは、第２のリンパ器官に移動し、そして特異的な免疫応答を開始するようにナイーブＴ細胞に対してプロセスされた抗原を提示する高い能力を獲得する(Cellaら(1997))。樹状細胞は、GM-CSFおよびTNF-αの存在下で培養されるCD34+前駆体(Cauxら(1992)Nature 3 60:258-261;およびCauxら(1996)J ．Exp．Med．184:695-706)、またはGM-CSFおよびIL-4の存在下での単球由来(SallustoおよびLanzavecchia（1994）J ． Exp ．Med． 179:1109-1118)であり得ることが、示されている。興味深いことに、 GM-CSFの非存在下でリンパ球および樹状細胞の両方を誘導し得る胸腺および骨髄におけるリンパ樹状細胞前駆体についての証拠もまた存在する。Ardavinら(1993 )Nature 362:761-763;Galyら(1995)Immunity3:459-473;Marquezら(1995)J ．Exp ．Med． 181:475-483;およびWuら(1996)。これらのリンパ誘導樹状細胞は、それらはマウスにおいてFasLを発現するので、異なる機能の性質（例えば、Ｔ細胞応答のネガティブ調節）を有し得る。SussおよびShortman（1996）J ．Exp．Med．1 83:1789-1796。本発明者らは、TECKがマウス胸腺樹状細胞において高いレベルで発現されるが、マウス脾臓樹状細胞由来またはインビトロにおいてCD34+前駆体または単球から生成したヒト樹状細胞由来のcDNAライブラリーには存在しないことを見出した。興味深いことに、mTECK mRNAは、樹状細胞をなお誘導し得る、早期の胸腺細胞前駆体の集団において低いレベルで存在した(Wuら(1996))。したがって、TECKはリンパ誘導樹状細胞の特異的なマーカーであり得ることを示唆することが導かれる。しかし、本発明者らは、TECKが、リンパ誘導樹状細胞をおそらく含む脾臓樹状細胞に存在しないことを観察した。LPSを注射したマウスの脾臓において見られるTECK mRNAの発現は、末梢樹状細胞が、活性化の際にTECKを発現し得ることを示唆するが、本発明者らは、TECKがLPS、PMA、およびイオノマイシンまたはIL-1αおよびTNF-αで活性化した骨髄由来樹状細胞のcDNAライブラリーにおいて発現されないことを見出した。TECKの正常な発現は、リンパ誘導樹状細胞に特異的であること、またはあるいはそれは生理的な条件下で胸腺および腸管の微小環境に存在する非常に特異的な刺激によってアップレギュレートされる可能性がある。抗TECK抗体での胸腺内皮細胞の特異的な染色の本発明者らの観察は、後者の仮説と一貫している。なぜなら、本発明者らは、ノーザンブロット分析によって、活性化なし、またはIL-1、TNF-α、IL-4、IL-7およびオンコスタチンの種々の組合せでの16時間の活性化後、ヒトHUVEC内皮細胞においてTECK発現を見出し得なかったが、一方でこれらのいくつかの刺激は、内皮細胞において他のCCケモカインの発現を誘導するからである。RollinsおよびPober（1991）Am ． J．Pathol． 138:1315-1319;Marfaing-Kokaら(1995)J ．Immunol．154:1870-1878; Garcia-Zepedaら(1996)J ．Immunol．157:5613-5626;およびGarc ia-Zepedaら(1996)Nat ．Med．4:449-456。共に取り上げると、本発明者らのデータは、TECKが活性化リンパ誘導樹状細胞によって特異的に発現される新規なケモカインであることを強く示唆する。それらの抗原提示機能を介して、樹状細胞は、寛容の確立および抗原特異的免疫応答の開始において主要な役割を果たす。精製した樹状細胞の使用は、最近、異なる治療プロトコルにおいて提唱されている(Cellaら(1997))。新規なCCケモカインTECKのような、樹状細胞における調節された発現を有する因子の発見は、確かに樹状細胞の生物学の私たちの知識を改善し、そしてインビボにおける関連した応用の設計につながる。Ｊ．マウスおよびインビボ実験手順４〜８週齢および妊娠期(time-pregnant)BALB/cマウスを、Simonsen Laborato ries(Gilroy，CA)から購入した。RAG-1-欠損マウス(Mombaertsら(1992))を、The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)から購入した。インビボでの活性化後、T ECK発現を分析するために、種々の器官を、静脈内LPS注射（200μ1PBS中50μｇのLPSまたはコントロールとしての200μｌのPBS）３時間後の２匹のマウスのプールから回収した。Ｋ．細胞精製、培養、および刺激 THP-1細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD由来のTIB-202 )を、10％のFCS、200mMのL-グルタミン、５×10^-5Mのメルカプトエタノール、ME Mアミノ酸、およびビタミンを補充したRPMI 1640培地(JRH BioSciences，Lenexa ，KS))、炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、ステプトマイシン(すべて、Sigma， ST．Louis，MOから)、およびゲンタマイシン(Boehringer，Indianapolis，IN)からなる完全培地において培養した。活性化したマウスマクロファージを得るために、10mlの冷PBSを、腹膜中に注射し、そして収集した細胞は、完全な培地において24時間プラスチックに接着し得た。次いで、接着した画分（ほとんどがマクロファージ）を収集した。脾臓樹状細胞を得るために、脾細胞懸濁液を、以前に記載のような(例えば、Macatoniaら(1987)J ．Exp．Med．166:1654-1667)、RPM I 1640 Dutch改変培地(Life Technologies，Paisley，Scotland)において調製した。脾細胞を、37℃で16時間、インキュベートし、そして細胞懸濁液を収集して、そしてメトリザミド(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)上に塗布した。1700×ｇで10分間遠心分離した後、低い界面を収集し、そして抗Mac-1(Pharmingen，San Diego，CA)および抗CD11cN-418抗体(Macatoniaら(1993)J ．Immunol．150:3755-3 765)で染色した。脾細胞樹状細胞を、FACStar付きセルソーター(Becton Dickins on，Mountain View，CA)におけるフローサイトメトリーによって分類し、この報告中に含まれるすべての実験における再分析の際に98％より高い純度にした。胸腺樹状細胞を得るために、胸腺を小さな断片に切断し、そして１mg/mlのコラーゲナーゼおよび0.02mg/ml DNaseI（両方ともSigmaから）を含む10mlのRPMI-1640 +10％ FCS中に再懸濁し、そして室温で30分間、連続的な撹拌で消化した。(Shor tmanら(1995)Adv ．Exp．Med．Biol．378:21-29)。1mlの0.1MのEDTA(pH7.2)を、さらなる５分間に添加した。次いで、細胞を完全な培地において洗浄し、完全な培地において再懸濁し、そしてメトリザミド上に塗布した。次いで、胸腺樹状細胞富化調製物を、抗IAd抗体および抗N-418抗体で染色し、そして樹状細胞をフローサイトメトリーによって分類した。Ｌ．マウスおよびヒトTECKの分子クローニングマウスTECKをコードするcDNAを、RAG-1 KOマウス胸腺方向性cDNAライブラリーのランダム配列決定によって得た。手短には、mPNAを、製造者の指示に従って、 RNAzol^TMB(Tel-Test，Friendswood，TX)、および次いでoligotex-dT mRNAキット (Quiagen，Chatsworth，CA)を使用して抽出した。方向性cDNAを、Superscript^TM Plasmld System(Gibco-BRL，Grand Island，NY)を使用して調製し、そしてpME18 sプラスミドベクター中にクローン化した。配列決定を、TaQ DyeDeoxy Terminat or Cycle Sequencingキット(Applied Biosystems，Foster City，CA)を使用して実施した。TECKがヒトを含む他の哺乳類に存在するかどうかを決定するために、異なる種由来のEcoRI消化ゲノムDNAを含むSouthernブロット(Bios Laboratories ，New Haven，CT)を、全長マウスTECK cDNAとハイブリダイズした。ヒトTECKをコードするcDNAが、標準的な手順に従って、全長マウスTECK cDNA をプローブとして使用して、小腸cDNAライブラリーのスクリーニングによって見出された。Ｍ．RNAのノーザンブロット分析およびcDNAライブラリーのサザンブロット分析。すべてのRNAを、RNAzol^TMB(Tel-Test)を使用して組織または細胞から単離し、１％のホルムアルデヒド-アガロースゲル(10μｇ/レーン)における電気泳動後に分析した。次いで、RNAを、Hybond-N+ナイロン膜(Amersham，Arlington Heights ，IL)上にブロットした。mRNAのいくつかのノーザンブロットを、Clontech(Palo Alto，CA)から購入した。cDNAライブラリー(T．MacClanahan，DNAXから得た)におけるTECKの発現を分析するために、10μｇのDNAを、適切な制限酵素によって消化し、それらの挿入物を放出し、そしてナイロン膜上でサザンブロット法によって分析した。ノーザンブロットおよびcDNAライブラリーのブロットを、マウスまたはヒトTECKをコードする全長cDNAに存在する³²P標識プローブで、65℃で16 時間ハイブリダイズし、そして次いで標準的なプロトコルによって洗浄し、そして曝露した。Ｎ．種間マウス戻し交配マッピング種間戻し交配の子孫を、例えば、CopelandおよびJenkins（1991）Trends Gene t．7:113−118に記載されるように、（C57B1/6J×M．spretus）F1雌とC57B1/6J の雄を交配させることによって作製した。総計205匹のN₂マウスを使用して、Tec k遺伝子座をマップした。DNAの単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットトランスファー、および全長mTECK cDNAプローブとのハイブリダイゼーションを、例えば、Jenkinsら（1982）によって記載されるように行った。7.5、6.9、および2.5kbのフラグメントをHincIIで消化したC57B1/6J DNAにおいて検出し、そして8.8および5.4kbのフラグメントをHincIIで消化したM．spret usDNAにおいて検出した。8.8および5.4kbのHincII M．spretus特異的フラグメント（これは同時分離した）の存在または非存在を、戻し交配マウスにおいて追跡した。Insrを含む、Teckにリンクする２つの遺伝子座についてのプローブおよび RFLPの説明は、以前に、例えば、Ceciら（1990）Genomics 6:72-79において報告されている。組換え距離を、コンピュタープログラムSPRETUS MADNESSを使用して、記載（Genetics and Probability in Animal Breeding Experiments，Oxfor d University Press，New YorkのGreen（1981）「連結、組換え、およびマッピング」77〜113頁）されるように計算した。Ｏ．RT-PCTによるTECK mRNA発現の測定ソートした胸腺樹状細胞または胎児胸腺からのRNAを、製造者の指示に従って、RNeasy全RNAキット（Quiagen，Chatsworth，CA）によって調製した。第１の鎖のcDNAを、10μｌの反応物中でランダムヘキサマーを用いる逆転写によって作製し、そしてこの反応物の１μｌを、PCRのための鋳型として使用した。TECK発現をヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）の発現と比較した。プライマー配列は以下のようであった：TECK:5'プライマー、5'C CTTCAGGTATCTGGAGAGGAGATC3'（配列番号１のヌクレオチド58〜72）および3'プライマー、5'CACGCTTGTACTGTTGGGGTTC3'（配列番号１のヌクレオチド447〜468に相補的）、HPRT:5'プライマー、5'GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC3'（配列番号17）および3'プライマー、5'CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA3'（配列番号18）。試料を25サイクルの増幅に供した。各サイクルは、94℃１分間、57℃30秒間、および72℃２分間から構成される。次いで、PCR産物を２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、そして臭化エチジウムで染色したＰ．インサイチュハイブリダイゼーションビオチン-14-CTP標識センスリボプローブおよびアンチセンスリボプローブを、非放射活性RNA標識系（Gibco，Gaithersburg，MD）およびPCRおよびTAクローニング（InVitrogen）によって挿入された400塩基対TECK cDNAフラグメントを含むプラスミドPCRII（InVitrogen，Carlsbad，CA）を使用して作製した。パラフィン包埋組織を、３〜５μｍ切片に切断し、スライド上にマウントし、60℃で１時間ベーキングし、キシレン（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）中で脱パラフィン化し、そして100％エタノール中に浸漬した。次いで、切片をPBS中のプロテイナーゼＫ溶液（40mg/ml）（Gibco）中で37℃にて10分間インキュベートし、そしてPBS中で室温にて２分間リンスした後、PBS中の10％ホルマリン（Fisher S cientific，Pittsburgh，PA）中で１分間再び固定した。次いで、切片をエタノールの特級溶液を介して脱水し、そして風乾した。ハイブリダイゼーションを、 Gibcoインサイチュハイブリダイゼーションおよび検出システムキットを使用して行った。バナジルリボヌクレオシド複合体（Gibco）をハイブリダイゼーション溶液に添加した（最終39mM）。0.1μｇ/ml濃度の各プローブを、42℃での18時間のハイブリダイゼーションの間使用した。ハイブリダイゼーション後の洗浄では、室温の0.2×SSCを使用した。検出および基質視覚化の後、スライドを１％核赤色染色（Sigma，St．Louis，MO）で対比染色した。Ｑ．免疫組織化学マウスのTECK（図１）のＣ末端部分に同一な合成デカペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、Research Genetics（Huntsville，AL）によつてウサギで調製した。50匹の動物のプールからの正常ウサギ血清（Research Genetics）を、ネガティブコントロールとして使用した。マウス胸腺におけるTECKタンパク質発現を研究するために、６μｍの厚さのクリオスタット切片を解凍し、有機ケイ素サブベツド（subbed）スライド（American Histology Reagent Co.，Stockton， CA）上にマウントし、そして0.01MHEPESを有するHankの平衡化塩溶液（HBSS-HEP ES）（pH7.4）中の３％ホルマリン（Fisher Scientific，Spring field，NJ）中で室温にて15分間固定化した。切片を、Vectorブロッキングキット（Vector Lab oratories，Burilngame，CA）を使用して、内在性ビオチン結合について連続してブロックし、そして0.1％サポニンを有するHBSS-HEPES（染色緩衝液）中の１％過酸化水素、0.2Mアジ化ナトリウム溶液溶液を用いて内在性ペルオキシダーゼ活性についてブロックした。次いで、非特異的抗体結合部位を染色緩衝液中の10 ％正常ヤギ血清（Sigma）でブロックした。最初に、上記のように調製した切片を、染色緩衝液中でポリクローナル抗体またはコントロールウサギ血清の500分の１の希釈物とともに25℃にて18時間インキュベートした。第２工程において、切片を、染色緩衝液中でビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG（２μｇ/ml）（Vector L aboratories）とともに室温にて１時間インキュベートし、次いでVectastain El i te ABC Kit（Vector Laboratories）を用いて、染色緩衝液中で室温にて30分間インキュベートした。次いで、切片をサポニンを含まないHBSS-HEPES中でリンスした。0.0075％過酸化水素を含む0.05M Tris（pH7.4）中の3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB）基質（0.5mg/ml）（Sigma）を用いて免疫酵素組織染色を示した。基質反応を、蒸留水中で切片をリンスすることによって停止させた。次いで、切片をHarrisヘマトキシリン（Shandon Lipshaw，Pittsburg ，PA）を用いて対比染色した。マウス成体胸腺におけるTECK mRNAの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって分析し、そして胸腺髄質内で分散したポジティブな非リンパ様集団を明らかにした。TECKタンパク質の発現を、マウスTECKタンパク質配列の最後の12アミノ酸からなるペプチドで免疫化したウサギ内で作製されたポリクローナル抗血清を使用することによって分析した。このポリクローナル抗体は、ELISA およびウェスタンブロットの両方においてDNAXで調製したマウスTECK組換えタンパク質と反応する。この抗血清をマウス成体胸腺切片上に適用することによって、インサイチュハイブリダイゼーションによって得た分布パターンを確認した： TECKを生成する細胞は、髄質性のストロマ細胞であった。マウス胸腺内のTECKを生成する正確な細胞型を、ソートした胸腺サブセットに対して同じ抗血清を使用して同定した。それは胸腺樹状細胞であった。Ｒ．Escherichia coilにおける組換えマウスTECKおよび他のケモカインの生成マウス組換えTECKを、Ｎ末端FLAG（DYKDDDDKL；配列番号19）融合タンパク質としてE．coli中で生成した。簡略には、FLAGに続いてリーダーペプチドを除いたmTECK配列を含む融合構築物（配列番号２を参照のこと）を、コード配列をHin dIIIおよびEcoRI部位と隣接させるためにTECK cDNAのPCR増幅、後続のFLAG配列およびOmpAシグナル配列を含むpFLAG.1ベクター中への連結によって得た。エレクトロコンピテントなUT 4400E．coliを、pFLAG.1-mTECKプラスミドで形質転換した。細胞を２×LB+50μｇ/mlアンピシリン中で増殖させ、2.3のOD.で400μＭI PTGを用いて誘導し、そして採取した。細胞ペレットを冷却溶解緩衝液（20mM Tr is(pH8)、2mM EDTA、20％スクロース、0.1mg/mlリゾチーム、100μｌBenzonas e）中で再び懸濁し、ホモジナイズし、そして30分間放置した。次いで、リゾチームを含まない同じ量の冷却溶解緩衝液の１：４希釈物をさらに10分間添加した。溶液を回転させ、そして上清を0.2μｍ膜を通して濾過し、次いで50mM Tris(p H7.5)で１：１に希釈した。希釈した浸透圧性の抽出物を、50mM Tris(pH7.5)で平衡化したQ-sepharoseカラムのクロマトグラフィーに供し、そして直線塩勾配を用いて溶出した。組換えタンパク質を含む画分をプールした。次いで、その画分を、20mM酢酸（pH4.0）で平衡化したS-sepharoseカラム上にロードした。カラムを、直線塩勾配を用いて溶出し、次いで1.5M NaCl洗浄を用いて溶出した（組換えタンパク質を含んでいた）。最後に、溶出物を逆相カラムにロードした。カラムを20％〜80％アセトニトリル＋0.1％ TFAの直線勾配で溶出した。mTECKタンパク質の濃度を、標準物質としてリゾチームを用いる、10％ Nu-PAGEゲルのComa ssie blue染色および濃度測定スキャニングによって評価した。純度を、組換えタンパク質のＮ末端の配列決定によって100％であると評価した。組換えマウスM IP-1α（R&D Systems，Minneapolls，MN）およびリンホタクチン（Hedrickら（1 997）J．Immunol．158:1533-1540）をコントロールとして使用した。Ｓ．走化性についてのアッセイ上記のように単離した細胞のTECKまたは他の因子に応答してのインビトロ移動を、以前に記載（kelnerら（1994））のように、改変したBoydenマイクロチャンバー（Neuroprobe、Cabin John，MD）で評価した。簡略には、DMEM培地（Gibco ）中の因子希釈物を２連で下の区画にロードし、そしてDMEMの50μｌの容量中の 10⁵個の細胞を上の区画にロードした。２つの区画は５μｍｍまたは８μｍ孔サイズのポリカルボネートフィルター（Nucleopore，Pleasanton，CA）によって分離されていた。37℃での80分間（またはリンパ球については120分間）のインキュベーション後、フィルターをメタノールで固定し、そしてFieldsAおよびField sBで染色した。膜の他方へ移動した、５つの高倍率領域（100×）当たりの細胞を顕微鏡下で計測した。化学走性指標を、培地単独で計測された細胞の数で除算された試験試料で計測された細胞の数から計算した。 mTECK cDNAプローブでハイブリダイズさせる、インビボLPS刺激を伴うかまたはこれを伴わない異なる器官からのRNAのノーザンブロット分析を行った。ハイブリダイズしたバンドは、mTECKm RNAについて予想される約1040bpサイズに対応した。有意な誘導が脾臓（実質的にバックグラウンドはない）ならびに胸腺および小腸（両方とも高いバックグラウンドを有する）において生じた；いずれの条件においても、心臓、肺、腎臓、または肝臓についてはシグナルは検出されなかった。マウス胎児胸腺におけるmTECK mRNA発現を分析した。胎児胸腺葉からのRNAを妊娠の14、15、16、および17日目に抜き出した。ポジティブRT-PCRシグナルを、 14、15、16、および17日目の試料の各々において検出した。胸腺樹状細胞におけるmTECK mRNA発現を評価した。胸腺樹状細胞が富化された集団を15個のプールした成体胸腺から調製した。次いで、＞99％の純度の樹状細胞を、それらのMHCクラスII+N- 418+表現型に基づくフローサイトメトリーによってソートした。次いで、mTECK mRNAをRT-PCRによって分析し、同じ実験でソートしたMHCクラスII+N- 418-集団をネガティブコントロールとして使用した。N41 8+試料は、ポジティブなシグナルを与えたが、N418-試料はポジティブなシグナルを与えなかった。異なるヒト組織および細胞型におけるhTECK mRNAを用いて発現分析を行った。適切な制限酵素で消化したヒトcDNAライブラリーのサザンブロットを、hTECK cD NAプローブでハイブリダイズさせた。hTECK mRNAの予想される長さ（約1040bp）に対応する、ハイブリダイズする主なバンドを、時々、不完全なcDNAを表し得るいくつかの他のバンドとともに観察した。ポジティブなシグナルを、扁桃腺、胎児脾臓、および胎児小腸において検出した。活性化（PMAおよびイオノマイシンで12時間）NK細胞、活性化（抗CD40抗体およびIL-4で６時間および12時間）脾細胞、γδT細胞、活性化（抗CD3およびPMAで６、12、および24時間）PBMC、胎児精巣、C+（IFN-γおよびIL-10とともに培養し、濾した単球）単球、C-単球、70 ％の純度の樹状細胞（CD34+骨髄細胞をGM-CSFおよびTNF-αで増大させ、そして休止させることによって得られたCD1α+樹状細胞集団）、およびDC3（PMAおよびイオノマイシンで１時間および６時間刺激した類似の樹状細胞集団）、DC5（IL- 4およびGM-CSFの存在下で末梢血単球を培養することによって得た樹状細胞）、U 937（前単球細胞株）、およびCD1α細胞株においてはシグナルは検出されなかった。Ras KOマウスcDNAによっても、マウスおよびヒト遺伝子がクロスハイブリダイズすることを確認した。脳においてTECKを発現するトランスジェニックマウスの４つの独立した系統を作製した。全てのマウスが神経学的な障害を有した。さらに、これらのいくつかが、重篤な感染に罹患した。TECKの重要性は脳細胞に対する直接的なもの（その本質は未確認のままである）であり得る。あるいは、TECKは、免疫応答の重要なエフェクターであるマクロファージおよび樹状細胞に対して効果を有することがインビトロで示されているので、TECKの過剰産生は、感染部位でのこれらの細胞に対する遠隔作用の効果を導き得る。これらの結果は、インビボにおけるTECK生成の遮断は、特定の感染症における、特定の病理学的なプロセスを解消するに役立ち得る。 VII．レセプター／リガンドのスクリーニング標識リガンドは、適切な場合、ケモカインまたはレセプターを発現する、細胞株から作製した発現ライブラリーのスクリーニングに有用である。標準的な染色技術を使用して、細胞内もしくは表面発現リガンドを検出またはソートするか、あるいは表面発現形質転換細胞をパニングによってスクリーニングする。細胞内発現のスクリーニングが種々の染色または免疫蛍光手順によって行われた。例えば、McMahanら（1991）EMBO Ｊ．10:2821-2832もまた参照のこと。例えば、０日目に、２-チャンバーpermanoxスライドを１つのチャンバー当たり1mlのフィブロネクチン（PBS中で10ng/ml）で室温にて30分間予めコーティングする。PBSで一旦リンスする。次いで、COS細胞を１つのチャンバー当たり1.5m １の増殖培地中の２〜３×10⁵細胞でプレートする。37℃で一晩インキュベートする。各試料についての１日目に、無血清DME中の66μｇ/ml DEAE-デキストラン、66 μＭクロロキン、および４μｇのDNAの溶液0.5mlを調製する。各セットについて、ポジティブコントロール（例えば、１および1/200希釈のhuIL-10-FLAG cDNA）を調製し、そしてネガティブなモック（mock）を調製する。細胞を無血清のDME でリンスする。DNA溶液を添加し、そして37℃にて５時間インキュベートする。培地を除去し、そしてDME中の10％DMSOを2.5分間添加する。除去し、そして一旦DM Eで洗浄する。1.5mlの増殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。２日目に、培地を交換する。３日目または４日目に、細胞を固定し、そして染色する。細胞をHankの緩衝化生理食塩水溶液（HBSS）で２回リンスし、そして４％パラホルムアルデヒド（PFA）／グルコースで５分間固定する。HBSSで３回洗浄する。スライドを、全ての液体を除去した後-80℃で保存し得る。各チャンバーについて、0.5mlのインキュベーションを以下のように行った。32μｌ/mlの1M NaN₃を有するHBSS/サポニンを20分間添加する。次いで、細胞をHBSS/サポニンで１回洗浄する。細胞に抗体複合体を添加し、そして30分間インキュベートする。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。二次抗体（例えば、Vector抗マウス抗体）を1/200希釈で添加し、そして30分間インキュベートする。ELISA溶液（例えば、Vector Elite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液）を調製し、そして30分間予めインキュベートする。例えば、2.5mlのHBSS/サポニン当たり溶液Ａ（アビジン）の１滴および溶液Ｂ（ビオチン）の１滴を使用する。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、そして30分間インキュベートする。細胞をHBSSで２回洗浄する。第２の洗浄は２分間。これは細胞を接近させる。次いで、Vectorジアミノ安息香酸（DAB）を5〜10分間添加する。ガラス蒸留水の5m l当たり４滴のDABおよび２滴のH₂O₂を加えた緩衝液の２滴を使用する。注意深く、チャンバーを取り出し、そして水中でスライドをリンスする。数分間風乾し、次いで１滴のCrystal Mountおよびカバーガラスをのせる。85〜90℃で５分間ベーキングする。あるいは、結合組成物を使用してリガンドまたはレセプターを発現する細胞をアフィニティー精製するか、または選別する。例えば、Sambrookら、またはAusu belらを参照のこと。本明細書中で引用される全ての参考文献は、あたかも各々の刊行物または特許出願が参考として援用されるべきであることを具体的かつ個々に示されるようであるのと同程度に参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 5/00 Ａ (31)優先権主張番号６０／０４８，５９３ (32)優先日平成９年６月４日(1997．6．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＭＴ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ビカリ，アラインアメリカ合衆国カリフォルニア 94087, マウンテンビュウ，ラサムストリートナンバー54 2250 (72)発明者ズロトニック，アルバートアメリカ合衆国カリフォルニア 94306, パロアルト，アルガードライブ 507 (72)発明者ワン，ウェイアメリカ合衆国カリフォルニア 94306, パロアルト，ミドルフィールドロード 3090

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋または単離されたポリペプチドであって、以下： i）TECK； ii）MIP-3α； iii）MIP-3β； iv）DC CR；および v）M/DC CR；からなる群より選択される成熟タンパク質の対応する部分に相同な配列を示すセグメントを含み、ここで、該相同性が少なくとも約70％の同一性であり、そして該部分が少なくとも約25アミノ酸残基である、ポリペプチド。２．a）少なくとも９アミノ酸残基にわたって少なくとも約90％の同一性；または b）少なくとも17アミノ酸残基にわたって少なくとも約80％の同一性を示す第２のセグメントをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。３．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、および配列番号12からなる群より選択される、請求項１または２のいずれかに記載のポリペプチド。４．請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離されたまたは組換え核酸。５．配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11からなる群より選択される、請求項４に記載の核酸。６．請求項４または５に記載の核酸を含む、ベクター。７．請求項４〜６のいずれかに記載の核酸またはベクターを含む、宿主細胞。８．ポリペプチドを作製するための方法であって、核酸またはベクターが発現される条件下で請求項７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。９．結合化合物であって、抗体またはそれに由来する抗原結合フラグメントを含み、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドに結合する、結合化合物。