JP2002509438A - 単離された樹状細胞膜タンパク質遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 霊長類を含む哺乳動物からの種々のリンパ球細胞タンパク質をコードする核酸、特異的抗体を含むそれに関連する試薬、および精製されたタンパク質が、記載される。この試薬を使用する方法および関連の診断キットもまた提供される。タンパク質は、レクチンおよびアシアロ糖タンパク質レセプターとの類似性を有する樹状細胞膜タンパク質（DCMP）である。

Description

【発明の詳細な説明】 単離された樹状細胞膜タンパク質遺伝子 本出願は、1997年7月9日に出願された米国特許仮出願USSN 60/053,080から優 先権を主張し、これは参考として本明細書に援用される。 発明の分野 本発明は、リンパ球、例えば、免疫系で機能する細胞に見られる遺伝子に関連 する組成物を包含する。これらの遺伝子は、有用なマーカーであり、そして哺乳 動物免疫系の発生、分化、および／または生理機能を制御することに機能し得る 。特に、本出願は、核酸、タンパク質、抗体、およびこれらを使用する方法を提 供する。 発明の背景 哺乳動物循環系の循環成分は、赤血球系および骨髄性細胞系統の赤血球および 白血球を含む種々の細胞タイプを含む。例えば、Rapaport（1987）Introduction to Hematology （第2版）Lippincott，Philadelphia，PA；Jandl（1987）Blood: Textbook of Hematology ，Little，Brown and Co.，Boston，MA；およびPaul(編 )(1993)Fundamental Immunology（第3版）Raven Press，N.Y.を参照のこと。 樹状細胞（DC）は、抗原プロセシングまたは提示細胞であり、そして体のすべ ての組織で見られる。Steinman（1991）Annual Review of Immunology 9:271-29 6；ならびにBanchereauおよびSchmitt（1994年編）Dendritic Cells in Fundame ntal and Clinical Immunology Plenum Press，NYを参照のこと。これらのDCは 、種々のカテゴリーに分類され得、これらには、以下を含む：心臓、腎臓、腸、 および肺の間質樹状細胞；皮膚および粘膜のランゲルハンス細胞；胸腺髄質およ び二次リンパ組織における指状（interdigitating）突起樹状細胞；ならびに血 液およびリンパ樹状細胞。これらのコンパートメントのそれぞれにおける樹状細 胞は骨髄から明らかに生じるCD45+白血球であるが、これらは、成熟状態および 微 小環境に関連する差を示し得る。 これらの樹状細胞は、例えば、Ｔ細胞に対する抗原を効率的にプロセスしそし て提示する。これらは、未処置および記憶Ｔ細胞からの応答を刺激する。 一次および二次Ｂ細胞濾胞は、長い期間にわたって免疫複合体としてインタク トの抗原を捕獲および保持する濾胞樹状細胞を含む。これらの樹状細胞は、Ｂ細 胞に対する天然の抗原を提示し、そして抗体の親和性成熟、免疫記憶の生成、お よび体液性免疫応答の維持に関与するようである。 単球は、単核食細胞系に属しそして循環中に存在する食細胞である。Roitt（ 編）Encyclopedia of Immunology Academic Press，San Diegoを参照のこと。こ れらの細胞は、骨髄に起源し、そして一旦これらが分化すると、骨髄コンパート メント中に短期間のみ残存する。次いで、これらは、循環中にはいり、そして比 較的長期間、例えば、２、３日間そこに残存し得る。単球は、漏出と命名された プロセスによって組織および体腔に入り得、そこで、これらは、マクロファージ におよびおそらく樹状細胞に分化する。炎症応答において、循環中の単球の数は 倍化し得、そして増加した数の単球の多くは炎症の部位に対して漏出する。 抗原提示とは、タンパク質性抗原が取り込まれ、抗原提示細胞（APC）によっ てプロセスされ、次いで認識されて免疫応答を開始する細胞事象をいう。最も活 性な抗原提示細胞は、マクロファージとして特徴づけられており、これは、単球 ；樹状細胞；およびある種のＢ細胞からの直接発生産物である。 マクロファージは、ほとんどの組織で見られ、そして種々のタンパク質抗原お よび微生物のインターナリゼーションに非常に活性である。これらは、非常に発 生したエンドサイトーシス活性を有し、そして免疫応答の開始に重要な多くの産 物を分泌する。この理由のために、単球によって発現されるかまたは単球活性化 によって誘導される多くの遺伝子が、抗原取り込み、プロセシング、提示、また は得られる免疫応答の調節に重要なようであると考えられる。 しかし、樹状細胞および単球は、これらが発現するタンパク質に関して、なら びに活性化状態を含む活性の機能およびメカニズムの多くに関して両方ともほと んど特徴づけられていない。特に、抗原プロセシングおよび提示を含む、免疫応 答の開始に関連するプロセスおよびメカニズムは、不明のままである。これらの 細胞の構造的、生物学的、および生理学的特性についての知見の不在は、その理 解を制限する。したがって、抗原提示細胞の調節、発生、または生理機能が異常 である医学的状態は、取り扱いにくいままである。 発明の要旨 本発明は、一部は、種々の哺乳動物樹状細胞膜タンパク質（DCMP）遺伝子の発 見に基づき、特定のDCMP1およびDCMP2の実施態様による例示に基づく。分布デー タは、より広い細胞分布を示し、そして構造データはいくつかの機能を示唆する 。DCMP1は、レクチンおよびアシアロ糖タンパク質レセプターのクラスとの類似 性を示す。記載されたDCMP2の実施態様は、マクロファージ細胞アシアロ糖タン パク質レセプターとの顕著な配列類似性を示す。本発明は、遺伝子産物のアゴニ ストおよびアンタゴニスト、例えば、天然配列の変異（ムテイン）、融合タンパ ク質、化学模倣物、抗体、および他の構造的または機能的アナログを包含する。 また、本発明のタンパク質をコードする単離された遺伝子に関する。これらの異 なるタンパク質または核酸組成物の種々の使用もまた提供される。 特定の実施態様では、本発明は、DCMP1タンパク質；または以下から選択され るポリペプチドに特異的に結合する抗体結合部位を含む結合化合物を提供する： Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro（配列番号４の残基118〜144）；Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys（配列番号４の残 基166〜181）；またはTrp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Gly Leu Gly（配列番号４の残基263〜277）。好ましい実施態様では、結合化合物に おいて、抗体結合部位は、配列番号２または８のタンパク質と特異的に免疫反応 性であり；配列番号４の残基118〜144のタンパク質と特異的に免疫反応性であり ；精製されたまたは組換え産生されたヒトDCMP1タンパク質に対して惹起され； 配列番号４の残基118〜144の配列を含む精製したまたは組換え産生したヒトタン パク質に対して惹起され；モノクローナル抗体、Fab、またはF(ab)2であり；あ るいは、結合化合物は、検出可能に標識され；滅菌的であり；または緩衝化組成 物中にある。 本発明は、これらの結合化合物を使用する方法を包含し、結合化合物：抗原複 合体を形成するために、この結合化合物と抗原を含む生物学的試料と接触させる 工程を包含する。ある実施態様では、生物学的試料はヒトであり、そして結合化 合物は抗体である。本発明はまた、このような結合化合物：および検出のための このような結合化合物の使用のためのインストラクション物質；または結合化合 物の分離を提供するコンパートメントを含む検出キットを提供する。 本発明はまた、実質的に精製されたまたは単離されたポリペプチドを提供し、 これはこのような結合化合物に特異的に結合する。種々の実施態様では、ポリペ プチドは、霊長類DCMP1タンパク質からの少なくとも14アミノ酸残基の少なくと も１つのフラグメントを含み；配列番号４の残基118〜144の少なくとも14アミノ 酸を含み；可溶性ポリペプチドであり；検出可能に標識され；滅菌組成物中にあ り；緩衝化組成物中にあり、シアル酸残基に結合し；組換え産生され；または天 然に存在するポリペプチド配列を有する。 精製された場合に上記のポリペプチドをコードする核酸を含む、核酸実施態様 が提供される。しばしば、核酸は：配列番号１または７のコード部分の数なくと も30ヌクレオチドを含み；配列番号３のヌクレオチド608〜688からの少なくとも 30ヌクレオチドを含み；または配列番号３のヌクレオチド752〜799からの少なく とも30ヌクレオチドを含み；あるいは上で定義されたポリペプチドをコードする 核酸に選択的にハイブリダイズするインサートを含み得る。本発明はまた、この ような核酸でトランスフェクトされた細胞を提供し、例えば、この核酸は、配列 番号１、７のタンパク質コード部分、または配列番号３の適切な部分からなる。 本発明は、二重鎖核酸を形成するために核酸の少なくとも１本の鎖を使用する 方法を提供し、特異的にハイブリダイズし得る相補鎖に対する試料にこのような 鎖を接触させる工程を包含する。好ましい実施態様では、この方法は、二重鎖の 検出を可能にし；または二重鎖を組織学的に局在化させる。 あるいは、本発明は、記載された結合組成物を使用する方法を提供し、結合組 成物：抗原複合体を形成するために結合組成物を試料と接触させる工程を包含す る。好ましい実施態様では、試料は、体液を含む生物学的試料であり；抗原は、 細胞上にあり；または抗原は、さらに精製される。 本発明は、これらのポリペプチドを使用する方法をさらに包含し、結合組成物 ：ポリペプチド複合体を形成するためにポリペプチドを試料と接触させる工程を 包含する。好ましい実施態様では、ポリペプチドはさらに精製される。 樹状細胞生理機能または機能を調節するための他の方法が提供され、細胞を、 記載のような結合組成物と；記載のようなDCMP1タンパク質と；または記載のよ うなポリペプチドと接触させる工程を包含する。機能はまた、免疫応答の開始ま たは進行を生じ得る。代表的には、接触させる工程は、細胞表面抗原、MHCクラ スＩ抗原、またはMHCクラスII抗原を含む抗原との組み合わせになる。 詳細な説明 本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許出願が 、すべての目的でその全体が参考として援用されることを特定におよび個々に示 す場合と同じ程度まで、参考として本明細書に援用される。 Ｉ．総論 本発明は、樹状細胞（DC）上で発現される哺乳動物タンパク質をコードするDN A配列を提供する。樹状細胞の概論については、Steinman（1991）Annual Review of Immunology 9:271-296；およびBanchereauおよびSchmitt（1994年編）Dendr itic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press，NYを参照 のこと。これらのタンパク質は、樹状細胞上で見られそしてその発現においてい くつかの特異性を示すようであるので、樹状細胞タンパク質と命名される。 特定の霊長類、例えば、ヒトのこれらのタンパク質の実施態様を、以下に提供 する。齧歯類、例えば、マウスの対応物も存在する。以下の説明は、例示の目的 のために、ヒトDC遺伝子に関するが、構造的に、例えば、配列、他のソースまた は哺乳動物種からの関連実施態様（多型または個々の改変体を含む）に同様に適 用可能である。これらは、配列の比較的少ない変化（例えば、約５％未満）、お よび、例えば、20残基より少ない置換、代表的には15未満、好ましくは10未満、 およびより好ましくは５未満（４、３、２、または１を含む）の置換の数を示す タンパク質を含む。これらはまた、記載のような全長から短縮されるバージョン 、 およびこれらの配列の実質的なセグメントを含む融合タンパク質を含む。 II．定義 用語「結合組成物」とは、例えば、抗体−抗原相互作用において、これらのDC タンパク質に特異性をもって結合する分子をいう。他の化合物、例えば、タンパ ク質はまた、それぞれのタンパク質と特異的に会合し得る。代表的には、特異的 会合は、天然の生理学的に関連のあるタンパク質−タンパク質相互作用において 、共有または非共有のいずれかであり、そしてキャリア化合物または二量体化パ ートナーを含む、多タンパク質複合体のメンバーを含み得る。分子は、ポリマー または化学試薬であり得る。機能的アナログは、構造的改変を有するタンパク質 であり得、または完全に関連のない分子であり得、例えば、これは、適切な相互 作用する決定基と相互作用する分子形状を有する。改変体は、タンパク質のアゴ ニストまたはアンタゴニストとして作用し得、例えば、Goodmanら（編)（1990）Goodman & Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics (第8版)Perga mon Press，Tarrytown，N.Y.を参照のこと。 本明細書で使用する場合、用語「結合剤：DCタンパク質複合体」とは、結合剤 およびDCタンパク質の複合体をいう。結合剤の特異的結合は、結合剤が、それぞ れのDCタンパク質上の部位を認識する特異的結合部位を有することを意味する。 例えば、DCタンパク質に対して惹起されそしてDCタンパク質上のエピトープを認 識する抗体は、特異的結合によって抗体：DCタンパク質複合体を形成し得る。代 表的には、結合剤：DCタンパク質複合体の形成は、他のタンパク質および生物製 剤の混合物におけるそのDCタンパク質の測定を可能にする。用語「抗体：DCタン パク質複合体」とは、結合剤が抗体である結合剤：DCタンパク質複合体をいう。 抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、または抗体の抗原結合フラグメント （Fv、Fab、またはFab2フラグメントを含む）ですらあり得る。 「相同な」核酸配列は、比較した場合、顕著な類似性を示す。核酸における相 同性についての標準は、配列比較および／または系統発生関連によって当業者に 一般的に使用される相同性についての測定であるか、またはハイブリダイゼーシ ョン条件に基づいてのいずれかである。配列比較およびハイブリダイゼーション 条件についての両方のアルゴリズムは、以下により詳細に説明される。 「単離された」核酸は、核酸、例えば、RNA、DNA、または混合されたポリマー であり、これは、天然にそれを付随する他の成分、例えば、タンパク質およびも との種からのフランキングゲノム配列から実質的に分離される。この用語は、そ の天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、そして組換えま たはクローニングされたDNA単離物、および化学合成されたアナログまたは異種 系によって生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子 の単離された形態を含む。単離された核酸は、一般的に、分子の均一の組成物で あるが、いくつかの実施態様では、少数の不均一性を含む。この不均一性は、代 表的には、ポリマーの末端、あるいは所望の生物学的機能または活性に重要でな い部分で見られる。 本明細書で使用する場合、用語「DCMPIタンパク質」は、タンパク質の文脈で 使用される場合、配列番号２または８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク 質、あるいはこのようなタンパク質の重要なフラグメントを包含する。これは、 それぞれのDCMP1タンパク質特異的結合成分と相互作用するポリペプチドをいう 。これらの結合成分、例えば、抗体は、代表的には、高い親和性で、例えば、少 なくとも約100nM、通常は約30nMより良好、好ましくは約10nMより良好、および より好ましくは約3nMより良好に、DCMP1タンパク質に結合する。 用語「DCMP2形態」とは、配列番号４および10で提供される配列をいう。霊長 類（例えば、ヒト）のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列、レクチン／ア シアロ糖タンパク質ファミリーメンバーに関連するタンパク質は、DCMP2と命名 され、樹状細胞ライブラリーから単離され、これは配列番号３および４で提供さ れる。長い形態は示されるとおりであるが、短い形態は、残基118〜144に対応す る配列がない。短い形態はまた、ヌクレオチド1064で異なり得る。これは、残基 173と174との間の挿入によっておよび残基270で異なる（表１を参照のこと）ASG PRの単球形態、およびヌクレオチド775〜776の間のGEEをコードする配列のイン サートに関連する。他の改変体形態は、配列番号９および10に記載される。 本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、そ のタンパク質の重要なフラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも 約８アミノ酸のアミノ酸残基、一般的には少なくとも10アミノ酸、より一般的に は少なくとも12アミノ酸、頻繁には少なくとも14アミノ酸、より頻繁には少なく とも16アミノ酸、代表的には少なくとも18アミノ酸、より代表的には少なくとも 20アミノ酸、通常少なくとも22アミノ酸、より通常には少なくとも24アミノ酸、 好ましくは少なくとも26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、およ び特に好ましい実施態様では少なくとも約30以上のアミノ酸、例えば、35、40、 45、50、60、70などのストレッチを包含する。 好ましい実施態様は、特定の長さの複数の異なる（例えば、重複しない）セグ メントを示す。代表的には、複数は、少なくとも２、より通常には少なくとも３ 、および好ましくは５、７、またはそれ以上である。長さの最小が提供されるが 、種々のサイズのより長い長さ、例えば、１つの長さ７、および２つの長さ12が 、適切であり得る。セグメントは、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれ かをいい得る。 「組換え」核酸は、代表的には、その構造によって定義される。これは、互い に天然には隣接しないが、天然の産物、例えば、天然に存在する変異体形態を排 除することを意味する、２つのフラグメントの融合物を含む配列を生成すること によって作成される核酸であり得る。 ある種の形態は、産生の方法によって定義される。このような、例えば、プロ セスによって作成される産物に関して、このプロセスは、組換え核酸技法（例え ば、ヌクレオチド配列におけるヒトの介入、代表的には選択または産生を含む） の使用である。 したがって、本発明は、例えば、合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して 誘導される配列を含む核酸、およびこれらのタンパク質をコードする天然に存在 しないベクターで細胞を形質転換することによって作成される産物を包含する。 このようなものは、しばしば、あるコドンを同じまたは保存的アミノ酸をコード する重複コドンと置換するために行われるが、代表的には、例えば、制限酵素に ついて配列認識部位を導入または除去する。あるいは、これは、普通に利用可能 な天然形態で見られない機能の所望の組み合わせを含む単一遺伝的実体を生成す るために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結するために行われる。制限 酵素認識部位は、しばしば、このような人工的操作の標的であるが、他の部位特 異的標的（例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列）、また は他の有用な特徴（例えば、プライマーセグメント）は、設計によって組み込ま れ得る。類似の概念が、組換え（例えば、融合）ポリペプチドについて意図され る。詳細には、遺伝コード重複によって、これらの抗原のフラグメントに類似の ポリペプチドをコードする合成核酸、および種々の異なる種の改変体からの配列 の融合物が含まれる。 「溶解度」は、スベドベリ単位で測定される沈降によって反映され、これは特 定の条件下で分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定を、分析用超遠心分 離機で古典的に行ったが、代表的には、現在は標準的超遠心分離機で行われる。 Freifelder（1982）Physical Biochemistry（第2版）W.H．Freeman & Co.，San Francisco，CA；ならびにCantorおよびSchimmel（1980）Biophysical Chemistry 1-3部，W.H．Freeman & Co.，San Francisco，CAを参照のこと。粗決定として 、推定可溶性ポリペプチドを含む試料を、標準的フルサイズの超遠心分離機で約 50K rpmにて約10分間回転し、そして可溶性分子は上清に残る。可溶性粒子また はポリペプチドは、代表的には、約30S未満、より代表的には約15S未満、通常は 約10S未満、より通常には約6S未満、ならびに特定の実施態様では好ましくは約4 S未満、およびより好ましくは約3S未満である。ポリペプチドまたはフラグメン トの溶解度は、環境およびポリペプチドに依存する。多くのパラメータは、ポリ ペプチド溶解度に影響を及ぼし、これには、温度、電解質環境、ポリペプチドの サイズおよび分子特徴、ならびに溶媒の性質を含む。代表的には、ポリペプチド が使用される温度は、約４℃〜約65℃の範囲にある。通常、使用時の温度は、約 18℃以上、およびより通常には約22℃以上である。診断目的については、温度は 、通常、ほぼ室温またはより温かであるが、アッセイにおける成分の変性温度未 満である。治療目的では、温度は、通常体温、代表的にはヒトについては約37℃ であるが、ある状況下では、温度は、インサイチュまたはインビトロで上昇また は低下し得る。 ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的には、実質的に安定な生理学的活 性状態にあるべきであり、そして通常、変性状態にはない。ポリペプチドは、例 えば、溶解度を与えるために、４次構造で他のポリペプチドと会合し得るか、あ るいは天然の脂質二重層相互作用に近い様式で脂質またはデタージェントと会合 し得る。 溶媒は、通常、生物学的活性の保存に使用されるタイプの、生物学的適合可能 な緩衝液であり、そして通常、生理学的溶媒に近い。通常、溶媒は、中性pH、代 表的には約５〜10の間、および好ましくは約7.5を有する。時々、デタージェン トが添加され、代表的には穏和な非変性デタージェント、例えば、CHS（コレス テリルヘミスクシネート）またはCHAPS（3-([3-コラミドプロピル]ジメチル-ア ンモニオ)-1-プロパンスルホン酸）、またはタンパク質の構造的または生理学的 特性の有意な破壊を避けるために十分に低いデタージェント濃度である。 「実質的に純粋」とは、代表的には、タンパク質が、他の夾雑タンパク質、核 酸、またはもとのソース生物に由来する他の生物製剤から単離されることを意味 する。純度、または「単離」は、代表的に重量によって標準的方法によってアッ セイされ得、そして普通は、少なくとも約50％純粋、より普通には少なくとも約 60％純粋、一般的には少なくとも約70％純粋、より一般的には少なくとも約80％ 純粋、頻繁には少なくとも約85％純粋、より頻繁には少なくとも約90％純粋、好 ましくは少なくとも約95％純粋、より好ましくは少なくとも約98％純粋、および 最も好ましい実施態様では少なくとも約99％純粋である。キャリアまたは賦形剤 は、しばしば、添加され、または処方物は、滅菌であり得るかまたは緩衝液成分 を含み得る。 核酸配列比較の文脈において「実質的に類似性」とは、比較した場合、セグメ ントまたはその相補鎖のいずれかが、最適にアラインした場合に、適切なヌクレ オチド挿入または欠失をともない、少なくとも約50％のヌクレオチド、一般的に は少なくとも56％、より一般的には少なくとも59％、普通は少なくとも62％、よ り普通には少なくとも65％、頻繁には少なくとも68％、より頻繁には少なくとも 71％、代表的には少なくとも74％、より代表的には少なくとも77％、通常は少な くとも80％、より通常には少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、よ り好ましくは少なくとも約95〜98％以上、および特定の実施態様では約99％以上 のヌクレオチドの高さで同一であることを意味する。あるいは、実質的な類似性 は、セグメントが、代表的には、配列番号１または７に由来する配列または３お よび９の適切な部分を使用して、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖ま たはその相補物にハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、少なくとも 約30ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約55％類似性、好ましくは 少なくとも約25ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約65％、より好 ましくは少なくとも約75％、および最も好ましくは約20ヌクレオチドにわたって 少なくとも約90％である場合に、選択的ハイブリダイゼーションは起こる。Kane hisa（1984）Nuc ．Acids Res．12:203-213を参照のこと。記載のように、類似性 比較の長さは、より長いストレッチ以上であり得、そしてある実施態様では、少 なくとも約17ヌクレオチド、通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には 少なくとも約24ヌクレオチド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、より代 表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド 、およびより好ましくは少なくとも約75〜100以上のヌクレオチド以上にわたる 。DCMP1についての比較の尺度は、DCMP2実施態様についての比較尺度に反映しな い。 「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーションの文脈において相同性 または実質的な類似性に関して、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメータの ストリンジェントな組み合わせた条件、代表的にはハイブリダイゼーション反応 において制御される条件である。パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラ メータの尺度よりも重要である。例えば、WetmurおよびDavidson（1968）J ．Mol ．Biol． 31:349-370を参照のこと。ストリンジェント条件下で標的核酸に結合す る核酸プローブは、この標的核酸に特異的である。このようなプローブは、代表 的には、11ヌクレオチド長以上であり、そしてストリンジェントハイブリダイゼ ーション条件下で標的を結合するためにプローブの配列によって特定される領域 にわたる標的核酸に十分に同一または相互的である。 他の哺乳動物種からの対応物DCMPタンパク質は、密接に関連する種の交差種ハ イブリダイゼーションによってクローニングおよび単離され得る。例えば、以下 を参照のこと。類似性は、遠い関係の種間では比較的低いものであり得、したが って比較的近い関係の種のハイブリダイゼーションが得策である。あるいは、よ り低い種特異性を示す抗体調製物の調製は、発現クローニングアプローチに有用 であり得る。 用語「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性」とは、タンパ ク質またはペプチドに対していう場合、タンパク質および他の生物学的成分の不 均一性集団の存在下でタンパク質の存在の決定要因である結合反応をいう。した がって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定化された抗体は特定のタンパ ク質に結合し、そして試料中に存在する他のタンパク質に有意に結合しない。こ のような条件下での抗体の特異的結合は、特異的のタンパク質に対するその特異 性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、配列番号２または８に示す アミノ酸配列を有するヒトDCMP1タンパク質免疫原に対して惹起された抗体は、 そのDCMPタンパク質と特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質とは反応性で はない抗体を得るために選択され得る。これらの抗体は、相同のヒトDCMP1タン パク質に非常に類似のタンパク質を認識する。 III．核酸 これらのDCMP遺伝子は、樹状細胞上で選択的に発現される。開示されるような 好ましい実施態様は、他の種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物） から遺伝子を単離するための標準的手順に有用である。交差ハイブリダイゼーシ ョンは、個体、株、または種からの関連タンパク質の単離を可能にする。多くの 異なるアプローチは、本明細書に提供される情報に基づいて適切な核酸クローン を首尾良く単離するために利用可能である。サザンブロットハイブリダイゼーシ ョン研究は、適切なハイブリダイゼーション条件下で他の種において相同な遺伝 子を同定するべきである。 精製したタンパク質または定義されたペプチドは、以下に記載のような標準的 方法によって抗体を産生するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパ ク質は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するために免疫系に提 示され得る。例えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley /Greene，NY；ならびにHarlowおよびLane（1989）Antibodies:A Laboratory Man ual Cold Spring Harbor Press，NYを参照のこと、これらは参考として本明細書 に援用される。あるいは、DCMP抗原結合組成物は、特異的結合試薬として有用 であり得、そして例えば、DCMPタンパク質の精製のために、結合の特異性を利用 し得る。 特異的結合組成物は、それぞれのDCMPタンパク質を発現する細胞株から作成さ れる発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニン グのための多くの方法が利用可能であり、例えば、表面で発現したリガンドの標 準的染色、またはパンニングによる。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々 の染色または免疫蛍光手順によって行われ得る。結合組成物は、抗原を発現する 細胞をアフィニティー精製または分類するために使用され得る。 表１：霊長類（例えば、ヒト）のレクチン／ASGPRファミリーメンバーのアライ ンメント。ASGPRh1およびASGPRh2は、肝臓アシアロ糖タンパク質レセプターであ り（配列番号５および６を参照のこと）；ASGPRmは、マクロファージ由来のASGP Rであり；DCMP2は、短い形態、長い形態、および改変体形態、配列番号４および 10を有し；DCMP1は、配列番号２および８に示される。 特徴：^***インターナライゼーションドメイン（伸長したドメインEITYAEVは、NK レセプターNKAに見られる）；+++膜貫通ドメイン；...C-タイプレクチンドメイ ン；XXX糖特異的ドメイン。DCMP1レセプターは、レクチンドメインにおけるマク ロファージレクチンに対する相同性が最も近い。 配列分析は、これらのDCMPが、レセプターのレクチン／アシアロ糖タンパク質 スーパーファミリーのメンバーであることを示唆する。ペプチドセグメントはま た、適切なオリゴヌクレオチドを設計および産生するために使用して、類似の遺 伝子、例えば、同一または多型改変体の存在を決定するために、あるいはDCを同 定するためにライブラリーをスクリーニングし得る。遺伝コードを、スクリーニ ングのためのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するために 使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術と組み合わせて、合成オリゴヌ クレオチドは、ライブラリーから所望のクローンを選択することに有用である。 相補配列はまた、プローブまたはプライマーとして使用される。それらしいア ミノ末端の同定に基づいて、例えば、係留したベクターまたはポリＡ相補的PCR 技術とあるいは他のペプチドの相補的DNAとカップリングされる他のペプチドは 、特に有用であるべきである。 これらのDCタンパク質をコードする遺伝子の核酸操作のための技術、例えば、 発現ベクターにポリペプチドをコードする核酸配列をサブクローニングすること 、プローブを標識すること、DNAハイブリダイゼーションなどは、Sambrookら（1 989）Molecular Cloning-A Laboratory Manual（第2版）Vol．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NYに一般的に記載され、これ は参考として本明細書に援用され、そして以下で「Sambrookら」という。Coliga nら（1987および定期的補遺）Current Protocols in Molecualr Biology Greene /Wiley，New York，NY（「Coliganら」という）も参照のこと。 これらのDCタンパク質をコードするDNA配列を単離する種々の方法がある。例 えば、DNAを、本明細書に開示される配列と同一またはこれに相補的な配列を有 する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムまたはcDNAライ ブラリーから単離する。全長プローブを使用し得、あるいはオリゴヌクレオチド プローブを、他のタンパク質と開示された配列との比較、および特異的プライマ ーを選択することによって生成し得る。このようなプローブを、DCタンパク質を コードするDNAを単離するためにハイブリダイゼーションアッセイで直接使用し 得、あるいはプローブを、DCタンパク質をコードするDNAの単離について、PCRの ような増幅技術における使用のために設計し得る。 cDNAライブラリーを調製するために、mRNAを、DCタンパク質を発現する細胞か ら単離する。cDNAを、mRNAから調製し、そして組換えベクターにライゲートする 。ベクターを、増殖、スクリーニング、およびクローニングのための組換え宿主 にトランスフェクトする。cDNAライブラリーを作成およびスクリーニングする方 法は周知である。GublerおよびHoffman（1983）Gene 25:263-269；Sambrookら； またはColiganらを参照のこと。 ゲノムライブラリーについて、DNAを、組織から抽出し、そして機械的剪断ま たは酵素的切断のいずれかにより、約12〜20kbのフラグメントを得ることができ る。次いで、フラグメントを、グラジエント遠心分離によって分離し、そしてバ クテリオファージλベクターにクローニングする。これらのベクターおよびファ ージを、例えば、SambrookらまたはColiganらに記載のように、インビトロでパ ッケージする。組換えファージを、BentonおよびDavis（1977）Science 196:180 -182に記載のように、プラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロ ニーハイブリダイゼーションを、例えば、Grunsteinら（1975）Proc ．Natl．Aca d．Sci．USA 72:3961-3965に一般的に記載されるように行う。 DCタンパク質をコードするDNAを、例えば、コロニーまたはプラークハイブリ ダイゼーション実験において、本明細書に記載の核酸プローブとハイブリダイズ する能力によって、cDNAまたはゲノムライブラリーのいずれかで同定し得る。対 応するDNA領域を、当業者に熟知の標準的方法によって単離する。Sambrookらを 参照のこと。 標的配列を増幅する種々の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）はまた、DC タンパク質をコードするDNAを調製するために使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反 応（PCR）技術を、mRNA、cDNA、およびゲノムライブラリーまたはcDNAライブラ リーから直接的にこのような核酸配列を増幅するために使用する。DCタンパク質 をコードする単離された配列はまた、PCR増幅のためのテンプレートとして使用 し得る。 PCR技術において、増幅されるべきDNA領域において２つの5'領域に相補的なオ リゴヌクレオチドプライマーを合成する。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応を、２ つのプライマーを使用して行う。Innisら(編)（1990）PCR Protocols:A Guide t o Methods and Applications Academic Press，San Diego，CAを参照のこと。プ ライマーを、選択された全長DCタンパク質をコードする完全な領域を増幅するた めに、または所望により、より小さいDNAセグメントを増幅するために、選択し 得る。一旦このような領域をPCR増幅すると、これらを配列決定し得、そしてオ リゴヌクレオチドプローブを、標準的技術を使用して得られる配列から調製し得 る。次いで、これらのプローブを使用して、DCタンパク質の他の形態をコードす るDNAを単離し得る。 プローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドを、BeaucageおよびCarrut hers（1983）Tetrahedron Lett ．22(20):1859-1862によって最初に記載された固 相ホスホルアミダイトトリエステル方法に従って、またはNeedham-VanDevanter ら（1984）Nucleic Acids Res ．12:6159-6168に記載のように自動化合成機を使 用して、化学合成する。オリゴヌクレオチドの精製を、例えば、天然アクリルア ミドゲル電気泳動によって、またはPearsonおよびRegnier（1983）J ．Chrom．25 5:137-149に記載のように陰イオン交換HPLCによって行う。合成オリゴヌクレオ チドの配列を、MaxamおよびGilbert，GrossmanおよびMoldave(1980年編)Methods in Enzymology 65:499-560 Academic Press，New Yorkの化学分解方法を使用し て確認し得る。 本発明は、記載のように、DCタンパク質をコードするための単離されたDNAま たはフラグメントを提供する。さらに、本発明は、適切な条件下、例えば、高い ストリンジェンシーで、本明細書に記載のDNA配列とハイブリダイズし得る生物 学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離されたまたは組 換えDNAを提供する。この生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、 天然に存在する形態、または組換えタンパク質もしくはフラグメントであり得、 そして配列番号２、４、８、または10に開示されるアミノ酸配列を有する。好ま しい実施態様は、例えば、霊長類からの全長の天然単離物である。グリコシル化 形態で、タンパク質はより大きなサイズを示すべきである。さらに、本発明は、 単離されたまたは組換えDNA、あるいはそのフラグメントの使用を包含し、これ は、各それぞれのDCタンパク質に相同であるタンパク質をコードする。単離され たDNAは、5'および3'フランクにそれぞれの調節配列、例えば、プロモーター、 エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなどを有し得る。 IV．DC遺伝子産物の作成 これらのDCタンパク質またはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成 、cDNAライブラリーのスクリーニング、あるいは広範な種々の細胞株または組織 試料から調製したゲノムライブラリーのスクリーニングによって得られ得る。 これらのDNAを、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成す るために使用され得る全長タンパク質またはフラグメントの合成のために；結合 研究のために；改変された分子の構築および発現のために；ならびに構造／機能 研究のために、広範な種々の宿主細胞で発現し得る。これらのDCタンパク質また はそのフラグメントのそれぞれを、適切な発現ベクターで形質転換またはトラン スフェクトされる宿主細胞で発現し得る。これらの分子を、組換え宿主に由来す る以外の、タンパク質または細胞夾雑物を含まないように実質的に精製し得、し たがって薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と組み合わせた場合 、薬学的組成物に特に有用である。抗原、またはその一部は、他のタンパク質と の融合物として発現され得る。 発現ベクターは、代表的には、所望のDC遺伝子またはそのフラグメントを含む 自己複製DNAまたはRNA構築物であり、通常、適切な宿主細胞で認識される適切な 遺伝子制御エレメントに作動可能に連結される。これらの制御エレメントは、適 切な宿主内で発現をもたらし得る。発現をもたらすために必要な制御エレメント の特定のタイプは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般的には、遺伝 子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現 制御系を含み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する ための任意のオペレーター、mRNA発現のレベルを上昇させるための転写エンハン サー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を 終結する配列を含む。発現ベクターはまた、通常は、ベクターを宿主細胞から独 立して複製させる複製起点を含む。 本発明のベクターは、種々のDCタンパク質またはそのフラグメントをコードす る、例えば、代表的には、生物学的に活性ナポリペプチドまたはタンパク質をコ ードする、DNAを含む。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下であり得、そして 選択マーカーをコードし得る。本発明は、さらに、原核生物または真核生物宿主 中でDCタンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得るこのような発現ベクタ ーの使用を包含し、ここで、ベクターは、宿主と適台可能であり、そしてタンパ ク質をコードする真核生物cDNAは、ベクターを含有する宿主の増殖が目的のcDNA を発現するベクター中に挿入される。通常は、発現ベクターは、宿主細胞におけ る安定な複製のために、または細胞当たり所望の遺伝子の総コピー数を非常に増 加させるための増幅のために設計される。発現ベクターが宿主細胞で複製するこ とが必ずしも必要ではなく、例えば、宿主細胞によって認識される複製起点を含 まないベクターを使用して、種々の宿主においてタンパク質またはそのフラグメ ントの一過性の発現をもたらすことが可能である。また、組換えによって宿主DN AにDC遺伝子またはそのフラグメントの組込みを引き起こすベクターを使用する こと、または内因性遺伝子の発現を制御するプロモーターを組込むことが可能で ある。 本明細書で使用する場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオフ ァージ、組込み可能DNAフラグメント、および宿主のゲノムへのDNAフラグメント の組込みを可能にする他のベヒクルを含む。発現ベクターは、作動可能に連結さ れた遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む特定化されたベクター である。プラスミドは、ベクターの最も普通に使用される形態であるが、等価の 機能を作用するベクターのすべての他の形態は、本明細書の使用に適切である。 例えば、Pouwelsら(1985年および補遺）Cloning Vectors:A Laboratory Manual Elsevier，N.Y.；およびRodriquezら(編)（1988）Vectors:A Survey of Molecul ar Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth，Boston，MAを参照のこと。 適切な宿主細胞には、真核生物、下等真核生物、および高等真核生物が挙げら れる。原核生物には、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物、例えば、E．c oliおよびB．subtilisが挙げられる。下等真核生物には、酵母、例えば、S．cer evisiaeおよびPichia、ならびにDictyostelium属の種が挙げられる。高等真核生 物には、動物細胞からの樹立された組織培養細胞株、非哺乳動物起源（例えば、 昆虫細胞、および鳥類）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧 歯類）の両方が挙げられる。 原核生物宿主−ベクター系には、多くの異なる種についての広範な種々のベク ターが挙げられる。本明細書で使用する場合、E．coliおよびそのベクターは、 他の原核生物で使用される等価のベクターを含むように一般に使用される。DNA を増幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその誘導体である。DCタン パク質またはフラグメントを発現するために使用され得るベクターには、lacプ ロモーターを含むベクター（pUC-シリーズ）；trpプロモーターを含むベクター （pBR322-trp）；Ippプロモーターを含むベクター（pIN-シリーズ）；λpPまた はpRプロモーターを含むベクター（pOTS）；またはptacのようなハイブリッドプ ロモーターを含むベクター（pDR540）が挙げられるが、これらに限定されない。 Brosiusら(1988)「Expression Vectors Employing Lambda-，trp-，lac-，and I pp-derived Promoters」RodriguezおよびDenhardt(編)Vectors:A Survey of Mol ecular Cloning Vectors and Their Uses 10:205-236，Buttersworth，Boston， MAを参照のこと。 下等真核生物、例えば、酵母およびDictyosteliumは、DC遺伝子配列含有ベク ターで形質転換され得る。本発明の目的のために、最も普通の下等真核生物宿主 は、パン酵母、Saccharomyces cerevisiaeである。これは、下等真核生物を表す ために一般的に使用されるが、多くの他の株および種も利用可能である。酵母ベ クターは、代表的には、複製起点（組込みタイプでなければ）、選択遺伝子、プ ロモーター、所望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするDNA、およ び翻訳終結、ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母に適 切な発現ベクターには、3-ホスホグリセレートキナーゼおよび種々の他の解糖系 酵素遺伝子プロモーターのような構成的プロモーター、またはアルコールデヒド ロゲナーゼ２プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターのような誘導性 プロモーターが挙げられる。適切なベクターには、以下のタイプの誘導体が挙げ られる：自己複製低コピー数（例えば、YRp-シリーズ）、自己複製高コピー数（ 例えば、YEp-シリーズ）；組込みタイプ（例えば、YIp-シリーズ）、またはミニ 染色体（YCp-シリーズ）。 高等真核生物組織培養細胞は、DCタンパク質の発現に好ましい宿主細胞である 。主として、ほとんどの任意の高等真核生物組織培養細胞株（例えば、昆虫バキ ュロウイルス発現系）は、無脊椎動物または脊椎動物供給源からであろうと使用 し得る。しかし、哺乳動物細胞は、同時翻訳および翻訳後の両方で、適切なプロ セシングを達成することが好ましい。このような細胞の形質転換またはトランス フェクションおよび増殖は、日常的である。有用な細胞株には、HeLa細胞、チャ イニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、ベビーラット腎臓（BRK）細胞株、昆虫 細胞株、鳥類細胞株、およびサル（COS）細胞株が挙げられる。このような細胞 株のための発現ベクターには、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、 RNAスプライス部位（例えば、ゲノムDNAが使用される場合）、ポリアデニル化部 位、 および転写終結部位が挙げられる。これらのベクターはまた、選択遺伝子または 増幅遺伝子を含み得る。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、SV40 、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような 供給源に由来するプロモーターを有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウ イルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例には、pCDNA1；pCD（Okaya maら（1985）Mol ．Cell Biol．5:1136-1142を参照のこと）；pMClneo Poly-A（T homasら（1987）Cell 51:503-512を参照のこと）；およびpAC373またはpAC610の ようなバキュロウイルスベクターが挙げられる。 ある場合には、DCタンパク質は、あるアッセイにおいて生物学的応答を誘起す るためにグリコシル化される必要がない。しかし、しばしば、特定のまたは所定 のグリコシル化パターンを提供する系でDCポリペプチドを発現することが望まし い。この場合、通常のパターンは、発現系によって天然に提供されるものである 。しかし、パターンは、異種発現系に導入される適切なグリコシル化タンパク質 に、例えば、非グリコシル化形態で、ポリペプチドを曝露することによって改変 可能である。例えば、DC遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコー ドする１つ以上の遺伝子で同時形質転換され得る。過剰グリコシル化が、DCタン パク質の生物学的活性に有害であり得、そして当業者が、最適な生物学的活性を 与えるグリコシル化の程度を最適にするために日常的なテストを行い得ることが さらに理解される。 DCタンパク質、またはそのフラグメントは、細胞膜に連結されたホスファチジ ルイノシトール（PI）に操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素 、例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣでの処理によって膜か ら取り出され得る。これは、生物学的に活性な形態で抗原を放出し、そしてタン パク質化学の標準的手順による精製を可能にする。例えば、Low（1989）Biochem ．Biophys．Acta 988:427-454；Tseら（1985）Science 230:1003-1008；Brunner ら（1991）J ．Cell Biol．114:1275-1283；およびColiganら(編)（1996年および 定期的補遺）Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，New York，NYを参照のこと。 これらのDCタンパク質が特徴づけられているので、そのフラグメントまたは誘 導体は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調製され得る。これ らには、StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis Pierce C hemical Co.，Rockford，IL；BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag，New York，NY；およびBodanszky（198 4）The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag，New York，NYに記 載されるようなプロセスが挙げられる。Merrified（1986）Science 232:341-347 ；およびDawsonら（1994）Science 266:776-779も参照のこと。例えば、アジド プロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エ ステルプロセス（例えば、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイ ミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス 、酸化還元プロセス、またはジクロロヘキシルカルボジイミド(DCCD)/付加プロ セスが、使用され得る。固相および液相合成は、両方とも上記のプロセスに適用 可能である。 調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段によっ て、例えば、抽出、沈殿、電気泳動、および種々の形態のクロマトグラフィーな どによって、反応混合物から単離および精製され得る。本発明のDCタンパク質は 、所望の使用に依存して種々の程度の純度で得られ得る。精製は、公知のタンパ ク質精製技術の使用によって、または例えば、免疫吸着アフィニティークロマト グラフィーにおいて本明細書に記載の抗体または結合パートナーの使用によって 、達成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、最初に抗 体を固体支持体に連結する工程、および連結された抗体を、適切な供給源細胞の 可溶化溶解物、タンパク質を発現する他の細胞の溶解物、またはDNA技術の結果 としてタンパク質を産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させる工程によっ て行われ、以下を参照のこと。 多くの細胞株は、他の細胞と比較して高レベルでこのタンパク質を発現するも のについてスクリーニングされ得る。種々の細胞株、例えば、マウス胸腺間質細 胞株TA4は、その好ましい取り扱い特性についてスクリーニングおよび選択され る。天然のDC細胞タンパク質は、天然の供給源から、または適切な発現ベクター を使用して形質転換された細胞からの発現によって単離され得る。発現されたタ ンパク質の精製は、標準的手順によって達成され、または細胞溶解物もしくは上 清から高い効率で効果的な精製のための操作手順と組み合わせ得る。FLAGまたは His₆セグメントは、このような精製の特徴について使用され得る。 Ｖ．抗体 抗体は、種々のDCタンパク質に対して惹起され得、これには、天然に存在する （全長）形態および組み換え形態での両方で、個々の改変体、多型性改変体、対 立遺伝子改変体、株改変体、または種改変体、およびそのフラグメントが挙げら れる。さらに、抗体は、活性形態または不活性形態のいずれかでDCタンパク質に 対して惹起され得る。高イディオタイプ抗体も使用され得る。 ａ．抗体産生 多くの免疫原は、これらのDCタンパク質と特異的に反応性の抗体を産生するた めに使用され得る。組換えタンパク質は、モノクローナルまたはポリクローナル 抗体の産生に好ましい免疫原である。天然に存在するタンパク質はまた、純粋ま たは非純粋形態のいずれかで使用され得る。本明細書に記載のヒトDCタンパク質 配列を使用して作成される合成ペプチドはまた、DCタンパク質に対する抗体の産 生のための免疫原として使用し得る。組換えタンパク質を、本明細書に記載のよ うに真核生物または原核生物細胞で発現させ、そして記載のように精製し得る。 次いで、産物を、抗体を産生し得る動物に注射する。モノクローナルまたはポリ クローナル抗体のいずれかを、タンパク質を測定するためのイムノアッセイにお けるその後の使用のために生成し得る。 ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。簡単にいえば、 免疫原、好ましくは精製されたタンパク質を、アジュバントと混合し、そして動 物を混合物で免疫接種する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、テスト採 血すること、および目的のDCタンパク質に対する反応性の力価を決定することに よってモニターする。免疫原に対する抗体の適切に高い力価を得る場合、血液を 動物から採集し、そして抗血清を調製する。所望であれば、タンパク質に反応性 の抗体を富化するための抗血清のさらなる分画を行い得る。例えば、Harlowおよ びLaneを参照のこと。 モノクローナル抗体は、当業者に熟知の種々の技術によって得られ得る。簡単 にいえば、所望の抗原で免疫した動物からの脾臓細胞を、一般には、ミエローマ 細胞との融合によって不死化する。例えば、KohlerおよびMilstein（1976）Eur ．J．Immunol． 6:511-519（これは参考として本明細書に援用される）を参照の こと。不死化の代わりの方法は、エプスタイン・バーウイルス、ガン遺伝子、ま たはレトロウイルス、あるいは当該技術分野で公知の他の方法での形質転換を含 む。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原に対して所望の特異性および 親和性の抗体の産生についてスクリーニングし、そしてこのような細胞によって 産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む、 種々の技術によって増強し得る。あるいは、Huseら（1989）Science 246:1275-1 281に概説される一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からDNAライブラリーを スクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメ ントをコードするDNA配列を単離し得る。 これらのDCタンパク質の所定のフラグメントに対する、結合フラグメントおよ び一本鎖型を含む、抗体を、上記のようにキャリアタンパク質とのフラグメント の結合体での動物の免疫によって惹起し得る。モノクローナル抗体は、所望の抗 体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常または防御DCタンパク 質への結合についてスクリーニングされるか、あるいはアゴニストまたはアンタ ゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は 、通常は、少なくとも約１mM、より通常には少なくとも約300μM、代表的には少 なくとも約10μM、より代表的には少なくとも約30μM、好ましくは少なくとも約 10μM、およびより好ましくは少なくとも約3μMより良好のK_Dで結合する。 いくつかの場合には、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどのような種々の哺乳 動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このようなモノク ローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Stitesら(編)Basic and Clinical Immunology （第4版）Lange Medical Publications，Los Altos，CAお よびそれに引用される参考文献；HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Labor atory Manual CSH Press；Goding（1986）Monoclonal Antibodies:Principles a nd Practice （第2版）Academic Press，New York，NY；ならびに特にKohlerお よびMilstein（1975）Nature 256:495-497（これはモノクローナル抗体を生成す る１つの方法を議論する）で見られ得る。簡単にまとめると、この方法は、体液 性免疫応答を開始するために、動物に免疫原を注射する工程を包含する。次いで 、動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、次いでミエローマ細胞と融 合する。結果は、インビトロで再生し得るハイブリッド細胞または「ハイブリド ーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、個々のク ローンを単離し、そのそれぞれは免疫原に対する単一抗体種を分泌する。このよ うにして、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質で認識される特異的部位に応 じて生成した免疫動物からの、不死化されかつクローニングされた単一のＢ細胞 の産物である。 他の適切な技術には、ファージまたは類似のベクターにおいて抗体のライブラ リーの選択を包含する。Huseら(1989)「Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda」Science 246:12 75-1281；およびWardら（1989）Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポ リペプチドおよび抗体を、改変ありまたはなしで使用し得、これらには、キメラ またはヒト化抗体が含まれる。頻繁には、ポリペプチドおよび抗体を、検出可能 なシグナルを提供する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかによって標 識する。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学および特許 文献の両方に広く報告される。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、 補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。 このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,7 52号；第3,939,350号；第3,996,345号：第4,277,437号；第4,275,149号；および 第4,366,241号が挙げられる。組換え免疫グロブリンもまた、産生され得る。Cab illy，米国特許第4,816,567号；およびQueenら（1989）Proc ．Natl．Acad．Sci ．USA 86:10029-10033を参照のこと。 本発明の抗体はまた、各DCタンパク質を単離することにおけるアフィニティー クロマトグラフィーのために使用され得る。カラムが調製され得、ここで、抗体 は、固体支持体、例えば、粒子（例えば、アガロース、SEPHADEXなど）に連結さ れ、細胞溶解物がカラムを通過し得、カラムが洗浄され、次いで穏和な変性剤の 濃度を上昇させ、それによって精製したDCタンパク質が放出される。 抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングする ために使用され得る。通常、このような手順で使用される抗体を、抗体結合によ って抗原の存在の検出を容易にする部分で標識する。 DCタンパク質に対する抗体を、分析のために、あるいはそれぞれのタンパク質 を発現する特異的細胞集団成分の同定のために使用し得る。DCタンパク質を発現 する細胞の発現産物をアッセイすることによって、疾患、例えば、免疫が損なわ れた状態、DC枯渇症状、またはDCの過剰産生を診断することが可能である。 各DCに対して惹起された抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するために 有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的状態を 検出または診断することに有用である。 ｂ．イムノアッセイ 特定のタンパク質を、種々のイムノアッセイ方法によって測定し得る。一般的 に、免疫学的およびイムノアッセイ手順の総説については、StitesおよびTerr（ 編）1991 Basic and Clinical Immunology（第7版）を参照のこと。さらに、本 発明のイムノアッセイを、任意のいくつかの立体配置で行い得、これは、Maggio (編)（1980）Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca Raton，Florida；TiJan(198 5)「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ，Elsevier Science Publishers B.V.，A msterdam；ならびにHarlowおよびLane Antibodies ，A Laboratory Manual，前出 に広く総説され、そのそれぞれは参考として本明細書に援用される。Chan（編） (1987)Immunoassay:A Practical Guide Academic Press，Oriando，FL；Priceお よびNewman（編）(1991)Principles and Practice of Immunoassays Stockton P ress，NY；およびNgo（編）(1988)Non-isotopic Immunoassays Plenum Press，N Yも参照のこと。 これらのDCタンパク質の測定のためのイムノアッセイを、当業者に公知の種々 の方法によって行い得る。簡単にいえば、タンパク質を測定するためのイムノア ッセイは、競合または非競合の結合アッセイであり得る。競合結合アッセイでは 、分析されるサンプルは、固体表面に結合した捕獲薬剤上の特異的結合部位につ い て、標識された分析物と競合する。好ましくは、捕獲薬剤は、上記のように産生 したDCタンパク質と特異的に反応する抗体である。捕獲薬剤に結合した標識され た分析物の濃度は、サンプルに存在する遊離の分析物の量に反比例する。 競合結合イムノアッセイにおいて、サンプルに存在するDCタンパク質は、特異 的結合剤（例えば、DCタンパク質と特異的に反応する抗体）への結合について標 識されたタンパク質と競合する。結合剤は、結合していない標識されたタンパク 質からの結合した標識されたタンパク質の分離をもたらすために、固体表面に結 合され得る。あるいは、競合結合アッセイは、液相中で行われ得、そして当該技 術分野で公知の種々の技術のいずれかを使用して、結合していない標識されたタ ンパク質から結合した標識されたタンパク質を分離し得る。分離後、結合した標 識されたタンパク質の量を決定する。サンプル中に存在するタンパク質の量は、 標識したタンパク質結合の量に反比例する。 あるいは、分離工程を必要としない均質なイムノアッセイが行われ得る。これ らのイムノアッセイにおいて、タンパク質上の標識を、その特異的結合剤へのタ ンパク質の結合によって変化させる。標識されたタンパク質におけるこの変化に よって、標識によって発されるシグナルの減少または増加を生じ、そのため、イ ムノアッセイの最後での標識の測定は、タンパク質の検出または定量を可能にす る。 これらのDCタンパク質はまた、種々の非競合イムノアッセイ方法によって定量 的に決定され得る。例えば、２部位固相サンドイッチイムノアッセイを使用し得 る。このタイプのアッセイでは、タンパク質、例えば抗体についての結合剤は、 固体支持体に付着される。第２のタンパク質結合剤(これはまた、抗体であり得 、そして異なる部位でタンパク質と結合する)を標識する。タンパク質上の両方 の部位で結合が生じた後、結合していない標識された結合剤を除去し、そして固 相に結合した標識された結合剤の量を測定する。結合した標識された結合剤の量 は、サンプル中のタンパク質の量に正比例する。 ウエスタンブロット分析を使用して、サンプル中のDCタンパク質の存在を決定 し得る。電気泳動を、例えば、タンパク質を含む疑いのある組織サンプルで行う 。タンパク質を分離するための電気泳動、およびニトロセルロースフィルターの よ うな適切な固体支持体へのタンパク質の転写後、固体支持体を、変性したタンパ ク質と反応する抗体とインキュベートする。この抗体を標識し得、あるいは、一 次抗体と結合する二次標識された抗体とその後のインキュベーションによって検 出し得る。 上記のイムノアッセイ形式は、標識されたアッセイ成分を用いる。標識は、種 々の形態であり得る。標識は、当該技術分野で周知の方法に従って、アッセイの 所望の成分に直接または間接的にカップリングされ得る。広範な種々の標識を使 用し得る。成分は、いくつかの方法のいずれか１つによって標識され得る。伝統 的に、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³²Pを導入する放射性標識を使用する。非放 射性標識には、標識された抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光薬剤、酵 素、および標識されたタンパク質に特異的な結合対メンバーとして作用し得る抗 体が挙げられる。標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、 安定性条件、および利用可能な器具に依存する。使用され得る種々の標識または シグナル生成系の総説については、米国特許第4,391,904号を参照のこと（これ は参考として本明細書に援用される）。 特定のタンパク質と反応する抗体もまた、種々のイムノアッセイ方法によって 測定され得る。イムノアッセイ技術による抗体の測定に適用可能な免疫学的およ びイムノアッセイ手順の総説については、例えば、StitesおよびTerr（編）Basi c and Clinical Immunology （第7版）前出；Maggio（編）Enzyme Immunoassay， 前出；ならびにHarlowおよびLane Antibodies ，A Laboratory Manual，前出を参 照のこと。 種々の異なるイムノアッセイ形式、分離技術、および標識もまた、特異的タン パク質の測定のために、上記のものと同様に使用され得る。 VI．精製されたDCタンパク質 霊長類（例えば、ヒト）のDCMP1ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番 号１および２に提供される。齧歯類（例えば、マウス）のDCMP1ヌクレオチドお よびアミノ酸配列は、配列番号７および８に提供される。霊長類（例えば、ヒト ）のDCMP2ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号３および４に提供さ れる。他の改変体は、配列番号９および10に記載される。類似の霊長類肝臓アシ アロ糖タンパク質配列は、配列番号５および６に提供される。ペプチド配列は、 このようなセグメントを認識するための抗体を生成するためのペプチドの調製を 可能にし、そしてこのような配列をコードするオリゴヌクレオチドの調整を可能 にする。 VII．物理的改変体 本発明はまた、配列番号２または８のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類 似性を有するタンパク質またはペプチド、あるいは配列番号４または10の選択さ れた部分を包含する。置換、例えば、20以下、好ましくは10以下、およびより好 ましくは５以下の置換を示す改変体もまた可能である。置換が保存的置換である 場合、改変体は、免疫原性または抗原性類似性、あるいは対応する天然の配列の タンパク質との交差反応性を共有する。天然の改変体には、個々の、対立遺伝子 、多型性、株、または種の改変体が挙げられる。 アミノ酸配列類似性、または配列同一性を、必要であれば、必要とされるギャ ップを導入することによって、残基適合を最適にすることによって決定する。こ れは、保存的置換を適合とみなす場合に変化する。保存的置換は、代表的には、 以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシ ン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレ オニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同種のアミ ノ酸配列には、天然の対立遺伝子および各それぞれのタンパク質配列における種 間改変を含む。代表的な同種タンパク質またはペプチドは、関連のDCタンパク質 のアミノ酸配列と、50〜100％類似性（ギャップが導入され得る場合）から75〜1 00％類似性（保存的置換が含まれる場合）までを有する。同一性の尺度は、少な くとも約50％、一般的には少なくとも60％、より一般的には少なくとも65％、通 常少なくとも70％、より通常には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、 およびより好ましくは少なくとも80％、および特に好ましい実施態様では少なく とも85％以上である。Needlehamら（1970）J ．Mol．Biol．48:443-453；Sankoff ら（1983）Time Warps ，String Edits，and Macromolecules:The Theory and P ractice of Sequence Comparison 第１章，Addison-Wesley，Reading，MA；なら びにIntelliGenetics，Mountain View，CA；およびthe University of Wisconsi n Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WIからのソフトウエアパッケージ も参照のこと。 配列比較については、代表的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照 配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配 列をコンピュータに入力し、必要ならばサブ配列の座標を指定し、そして配列ア ルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは 、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列につ いてのパーセント配列同一性を算出する。 比較のための配列の光学的整列は、例えば、SmithおよびWaterman（1981）Adv ．Appl．Math． 2:482の局所相同性アルゴリズムによって、NeedlmanおよびWunsc h（1970）J ．Mol．Biol．48:443の相同性整列アルゴリズムによって、Pearsonお よびLipman（1988）Proc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 85:2444の類似性方法につい ての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Wisconsin Ge netics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madis on，WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または可視検 査（一般的に、Ausubelら，前出を参照のこと）によって行われ得る。 有用なアルゴリズムの１つの例は、PILEUPである。PILEUPは、関連性およびパ ーセント配列同一性を示すために、連続的な対方法(Pairwise)の整列を使用して 、関連配列の群から多数の配列整列を生成する。また、整列を生成するために使 用されるクラスター関係を示すツリーまたは樹状図をプロットする。PILEUPは、 FengおよびDoolittle（1987）J ．Mol．Evol．35:351-360の連続的整列方法の簡 易化を使用する。使用される方法は、HigginsおよびSharp（1989）CABIOS 5:151 -153によって記載される方法に類似する。プログラムは、300配列、5,000ヌクレ オチドまたはアミノ酸の最大長のそれぞれまで整列し得る。多数の整列手順は、 ２つの最も類似の配列の対方法整列で開始し、２つの整列した配列のクラスター を生じる。次いで、このクラスターを、整列した配列の次の最も関連した配列ま たはクラスターに対して整列させる。配列の２つのクラスターを、２つの個々の 配 列の対方法整列の単純伸長によって整列させる。最後の整列を、一連の連続的な 対方法整列によって達成する。プログラムを、配列比較の領域に対して特異的配 列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって、および プログラムパラメータを指定することによって実行する。例えば、参照配列を、 以下のパラメータを使用してパーセント配列同一性関係を決定するために、他の 試験配列と比較し得る：デフォルトギャップ重(3.00)、デフォルトギャップ長重 (0.10)、および加重末端ギャップ。 パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリ ズムの他の例は、BLASTアルゴリズムであり、これは、Altschulら（1990）J ．Mo l．Biol． 215:403-410に記載される。BLAST分析を行うためのソフトウエアは、t he National Center for Biotechnology Information(http:www.ncbi.nlm.nih.g ov/)によって公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に問題の配列に おける長さＷの短い語を同定することによって高いスコアリング配列対（HSP） を同定することを包含し、これは、データベース配列において同じ長さの語と整 列した場合、いくつかのポジティブな値の閾値スコアＴに適合するかまたはそれ を満たすかのいずれかである。Ｔは、近傍語スコア閾値と呼ばれる（Altschulら ，前出）。これらの最初の近傍語ヒットは、それらを含むより長いHSPを見いだ すために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、語ヒットは、累 加した整列スコアが増加し得る限り各配列に沿った両方向に伸長させる。各方向 の語ヒットの伸長は、以下の場合停止される：累加した整列スコアがその最大達 成値から量Ｘによって減少する場合；１つ以上のネガティブナスコアリング残基 整列の蓄積に起因して、累加したスコアがゼロ以下になる場合；あるいは、いず れかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、および Ｘは、整列の感度およびスピードを決定する。BLASTプログラムは、デフォルト として、11の語長（Ｗ）、50のBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoffおよ びHenikoff（1989）Proc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 89:10915を参照のこと）整列 （Ｂ）、10の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する 。 パーセント配列同一性を算出することの他に、BLASTアルゴリズムもまた、２ つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、KarlinおよびAltschul（19 93）Proc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 90:5873-5787を参照のこと）。BLASTアルゴ リズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（P(N)）であり 、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が、偶然に生じる確 率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合 計確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.0 01未満である場合、核酸は、参照配列に類似するとみなされる。 ポリペプチドの２つの核酸配列が、実質的に同一であることのさらなる指標は 、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載のように、第２ の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることで ある。したがって、ポリペプチドは、代表的には、例えば、２つのペプチドが保 存的置換のみによって異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。 ２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、以下に記載のように、 ２つの分子が、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである 。 対応する哺乳動物DCタンパク質をコードする核酸は、代表的には、ストリンジ ェント条件下で、配列番号１もしくは７、または３の適切な部分にハイブリダイ ズする。例えば、それぞれのDCタンパク質をコードする核酸は、代表的には、ス トリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、７、３、または ９の核酸にハイブリダイズするが、誤ったポジティブハイブリダイセーションシ グナルをほとんど提供しない。一般的に、ストリンジェント条件は、所定のイオ ン強度およびpHでハイブリダイズされる配列について、熱融解点（Tm）よりも約 10℃低く選択される。Tmは、標的配列の50％が、完全に適合したプローブに（所 定のイオン強度およびpH下で）ハイブリダイズする温度である。代表的には、ス トリンジェント条件は、洗浄における塩濃度がpH７で約0.02Mであり、そして温 度は少なくとも約50℃である条件である。他の因子は、ハイブリダイゼーション のストリンジェンシーに著しく影響を及ぼし得、特に、相補鎖の塩基組成および サイズ、ホルムアミドのような有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度が 挙げられる。好ましい実施態様は、50％ホルムアミドおよび20〜50mM NaCl中42 ℃にて、開示された配列に結合する核酸を包含する。ストリンジェント条件下 でのハイブリダイゼーションは、バックグラウンドに対して少なくとも２倍、好 ましくは少なくとも３〜５倍以上のバックグラウンドを与えるべきである。 単離されたDC遺伝子DNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオ チド挿入、およびヌクレオチドストレッチの介入によって、容易に改変され得る 。これらの改変は、これらのDC抗原、その誘導体、または非常に類似する生理学 的、免疫原性、もしくは抗原性活性を有するタンパク質をコードする新規DNA配 列を生じる。 改変された配列は、変異体抗原を産生するために、または発現を増強するため に、使用され得る。増強された発現は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻 訳、および他のメカニズムを包含し得る。このような変異体DCタンパク質誘導体 は、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの所定のまたは部位特異的変 異を含む。「変異体DCタンパク質」は、上記のDCタンパク質の相同性定義内には いるが、欠失、置換、または挿入によるいずれかで、天然で見られるDCタンパク 質とは異なるアミノ酸配列を有する、その他のポリペプチドを包含する。特に、 「部位特異的変異体DCタンパク質」は、一般的に、配列番号２または８の配列を 有するタンパク質と有意な類似性を有するタンパク質を包含する。一般的に、改 変体は、多くの物理化学的および生物学的活性、例えば、抗原性または免疫原性 を、その配列とともに共有し、そして好ましい実施態様では、開示された配列の ほとんどまたはすべてを含む。同様の概念を、特に、種々の温血動物、例えば、 霊長類および哺乳動物で見られる、これらの種々のDCタンパク質に適用する。 部位特異的変異部位は所定であるが、変異体は部位特異的である必要はない。 DCタンパク質変異誘発は、アミノ酸挿入または欠失の作製によって行われ得る。 置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせは、最終構築物で到達するために生 成され得る。挿入は、アミノまたはカルボキシル末端融合を包含する。ランダム 変異誘発は、標的コドンで行われ得、次いで発現した変異体は、所望の活性につ いてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するDNAにおいて所定の部位に置 換変異を作成する方法は、例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラーゼ 連鎖反応（PCR）技法によって、当該技術分野で周知である。Sambrookら（1989 ）およびAusubelら(1987年および補遺)も参照のこと。DNAの変異は、正常には、 リーディングフレームの外のコード配列に配置すべきではなく、そして好ましく は、ループまたはヘアピンのような二次mRNA構造を産生するためにハイブリダイ ズし得る相補領域を生成しない。 本発明はまた、これらのタンパク質からのセグメントを使用して、組換えタン パク質、例えば、異種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は、天然 では同じ方法で正常には融合しないタンパク質または他のセグメントの融合物で ある。したがって、それぞれのDCポリペプチドとの免疫グロブリンの融合産物は 、代表的なペプチド結合で融合され、代表的には単一の翻訳産物として作成され 、そして各ソースペプチドに由来する特性を示す配列を有する、連続するタンパ ク質分子である。同様の概念は、異種核酸配列に適用する。 さらに、新しい構築物は、他のタンパク質からの類似の機能的ドメインを合わ せることから作成され得る。例えば、ドメインまたはセグメントは、異なる新し い融合ポリペプチドまたはフラグメント間で、代表的には関連のタンパク質と、 例えば、レクチンまたはアシアロ糖タンパク質ファミリーと、「交換」され得る 。好ましくは、インタクトな構造ドメイン、例えば、インタクトなIg部分を使用 する。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243:1330-1336；およびO'Dowdら （1988）J ．Biol．Chem．263:15985-15992を参照のこと。したがって、特異性の 新しい組み合わせを示す新しいキメラポリペプチドは、タンパク質結合特異性お よび他の機能的ドメインの機能的連結から生じる。また、アラニンスキャンニン グ変異誘発は、好ましくは構造的に二次構造の外にある残基であり、一般的に三 次構造を破壊する重要な残基のほとんどを避ける残基に適用され得る。 これらのDC抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、 および他の化学部分との共有結合体または凝集結合体を含む。共有誘導体は、当 該技術分野で周知の手段によって、これらのDCタンパク質アミノ酸側鎖またはＮ もしくはＣ末端で見られる基への機能性の連結によって調製され得る。これらの 誘導体には、カルボキシル末端の、またはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族 エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミ ノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）の N-アシル誘導体が非限定的に含まれ得る。アシル基は、C3〜C18直鎖状アルキル を含むアルキル部分の群から選択され、それによってアルカノイルアロイル種を 形成する。キャリアタンパク質への共有付加は、免疫原性部分がハプテンである 場合、重要であり得る。 特に、グリコシル化変化が含まれ、例えば、その合成およびプロセシング中に 、または更なるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パター ンを改変することによって作製される。これを達成するために特に好ましい手段 は、このようなプロセシングを正常に提供する細胞に由来するグリコシル化酵素 、例えば、哺乳動物グリコシル化酵素に、ポリペプチドを曝露することによる。 脱グリコシル化酵素も意図される。また、他のマイナーな改変を有する同じ一次 アミノ酸配列の型を含み、これには、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチ ロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）、あるいはリボシル基または 架橋試薬を含む他の部分を含む。また、置換を含むタンパク質を包含し、これは 配列番号２、４、８、または10のタンパク質を認識する抗体を産生するために、 実質的な免疫原性を保持するべきである。代表的に、これらのタンパク質は、開 示された配列からの20残基未満の置換、より代表的には10残基未満の置換、好ま しくは５未満、およびより好ましくは３未満を含む。あるいは、構造ドメインで 始まりそして終わるタンパク質は、通常、抗原性および交差免疫原性を保持する 。 誘導体の主な群は、他のタンパク質またはポリペプチドとDCタンパク質または そのフラグメントの共有結合体である。これらの誘導体は、N-またはC-末端融合 体のような組換え培養物中で、あるいは反応性側基によってタンパク質を架橋す るにおける有用性について当該技術分野で公知の薬剤の使用によって、合成され 得る。架橋剤との好ましいタンパク質誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭水化物 部分、およびシステイン残基にある。 これらのDCタンパク質と他の同種または異種タンパク質との間の融合ポリペプ チドも提供される。異種ポリペプチドは、異なる表面マーカー間の融合物であり 得、例えば、ハイブリッドタンパク質を生じる。同様に、誘導体タンパク質の特 性または活性の組み合わせを示す異種融合物が、構築され得る。代表的な例は、 リポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）のタンパク質のセグメント またはドメイン（例えば、レセプター結合セグメント）との融合物であり、その ため融合したタンパク質の存在または位置が容易に決定され得る。例えば、Dull ら，米国特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、細 菌性β-ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、β-ラクタマーゼ、αアミラー ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる。例えば 、Godowskiら（1988）Science 241:812-816を参照のこと。 このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または 他の部分の付加もしくは除去によって化学的に改変されているアミン酸残基、特 にリン酸基に類似の分子形状を有する残基を有し得る。いくつかの実施態様では 、改変は、有用な標識試薬であり、または精製標的、例えば、アフィニティーリ ガンドとして用いる。 本発明はまた、アミノ酸配列の変更またはグリコシル化以外のこれらのDCタン パク質の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合 的または凝集的会合を含む。これらの誘導体は、一般的に、これらのクラスには いる：(1)塩、(2)側鎖および末端残基共有改変、および(3)例えば、細胞膜との 吸着複合体。このような共有結合的または凝集誘導体は、免疫原として、イムノ アッセイにおける試薬として、リガンドまたは他の結合リガンドのアフィニティ ー精製のためのような精製方法において、有用である。例えば、DCタンパク質抗 原は、当該技術分野で周知の方法によって臭化シアン活性化Sepharoseのような 固体支持体への共有結合によって固定され得、または抗DCタンパク質抗体のアッ セイまたは精製における使用のために、グルタルアルデヒド架橋ありまたはなし で、ポリオレフィン表面上に吸着され得る。DCタンパク質はまた、検出可能な基 で標識され得、例えば、クロラミンＴ手順によって放射性ヨウ素化され、希土類 キレートに共有結合され、診断アッセイにおける使用について他の蛍光部分に結 合される。これらのDCタンパク質の精製は、固定された抗体によってもたらされ 得る。 単離されたDCタンパク質遺伝子は、対応するDCタンパク質の発現のない細胞、 例えば、対応するタンパク質がなくそしてネガティブバックグラウンド活性を示 す種タイプまたは細胞のいずれか、の形質転換を可能にする。形質転換された遺 伝子の発現により、所定のまたは単一の種改変体を有する、抗原的に純粋な細胞 株の単離を可能にする。このアプローチによって、これらのDCタンパク質の生理 学的効果をより高い感度で検出および識別することを可能にする。細胞下のフラ グメント、例えば、細胞質体または膜フラグメントは、単離および使用され得る 。 VIII．結合剤：DCタンパク質複合体 配列番号２、４、８、または10のアミノ酸配列からなる免疫原のような、所定 の免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するかまたは特異的に免疫反応 性であるDCタンパク質は、イムノアッセイで決定される。イムノアッセイは、配 列番号２、４、８、または10のタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗 血清を使用する。この抗血清を、関連のファミリーの他のメンバーに対する低い 交差反応性を有するように選択し、そして任意のこのような交差反応性を、イム ノアッセイでの使用前に免疫吸着によって取り出す。 イムノアッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、配列番号２、 ４、８、または10のタンパク質を、本明細書に記載のように単離する。例えば、 組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株で産生され得る。balb/cのような近交系の マウスに、フロイントアジュバントのような標準的アジュバント、および標準的 マウス免疫プロトコル（HarlowおよびLane、前出を参照のこと）を使用して、適 切なタンパク質で免疫接種する。あるいは、本明細書に開示された配列に由来し そしてキャリアタンパク質に結合した合成ペプチドを、免疫原に使用し得る。ポ リクローナル血清を採取し、そしてイムノアッセイ、例えば、固体支持体に固定 した免疫原との固相イムノアッセイにおいて、免疫原タンパク質に対して滴定す る。10⁴以上の力価のポリクローナル抗血清を選択し、HarlowおよびLane，前出 の570〜573頁に記載のような競合結合イムノアッセイを使用して、他の関連タン パク質に対する交差反応性についてテストする。好ましくは、２つの異なる関連 のタンパク質を、所定のDCタンパク質とともにこの決定方法に使用する。例えば 、レクチンタンパク質とともに、少なくとも２つの他のファミリーメンバーを使 用して、共有するエピトープから吸着する。DCMP1ファミリーメンバーとともに 、ファミリーの２つの他のメンバーを使用する。これらの他のファミリーメンバ ーを、組換えタンパク質として産生し、そして本明細書に記載のように標準的分 子 生物学技法およびタンパク質化学技法を使用して単離し得る。 競合結合形式におけるイムノアッセイを、交差反応性決定方法について使用し 得る。例えば、配列番号２または８のタンパク質を、固体支持体に固定し得る。 アッセイに添加されるタンパク質は、固定された抗原に対する抗血清の結合で競 合する。固定されたタンパク質への抗血清の結合と競合する上記タンパク質の能 力を、配列番号２または８のタンパク質と比較する。上記タンパク質のパーセン ト交差反応性を、標準的計算を使用して計算する。上記に列挙したタンパク質の それぞれと10％未満の交差反応性を有する抗血清を選択しそしてプールする。次 いで、交差反応する抗体を、上記のタンパク質との免疫吸着によってプールした 抗血清から取り出す。 次いで、免疫吸着しそしてプールした抗血清を、免疫原タンパク質（例えば、 配列番号２または８のDCタンパク質）に対して第２のタンパク質を比較するため に、上記のように競合結合イムノアッセイで使用する。この比較を作成するため に、２つのタンパク質を、広範な濃度でそれぞれアッセイし、そして固定された タンパク質への抗血清の結合の50％を阻害するために必要とされる各タンパク質 の量を決定する。必要とされる第２のタンパク質の量が、必要とされる配列番号 ２または８のタンパク質の量の２倍未満である場合、第２のタンパク質を、免疫 原に対して産生された抗体に特異的に結合するという。 DCタンパク質が、おそらく２つ以上の遺伝子を含む同種タンパク質のファミリ ーであることが理解される。ヒトIgファミリーメンバータンパク質のような特定 の遺伝子産物について、本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列だけでな く、対立遺伝子、多型、非対立遺伝子、または種改変体である他のタンパク質も また包含する。用語「ヒトDCタンパク質」には、単一部位変異のような従来の組 換え技術を使用する意図的な変更によって、あるいは遺伝子からのこれらのタン パク質またはスプライス改変体をコードするDNAの短い切片を切り取ることによ って、あるいは少数の新しいアミノ酸を置換または付加することによって導入さ れる非天然変異を包含することも理解される。このようなマイナーな変化は、も との分子および／またはその生物学的活性の免疫同一性を実質的に維持しなけれ ばならない。したがって、これらの変化には、指定された天然に存在するそれぞ れのDCタンパク質、例えば、配列番号４を示すヒトDCタンパク質と特異的に免疫 反応性であるタンパク質が挙げられる。マイナーと考えられる特定のタンパク質 改変には、全体として各タンパク質ファミリーについて上記のように、類似の化 学特性を有するアミノ酸の保存的置換が挙げられる。タンパク質を配列番号２ま たは８のタンパク質と最適にアラインすることによって、そして免疫同一性を決 定するために本明細書に記載の従来のイムノアッセイを使用することによって、 本発明のタンパク質組成物を決定し得る。 IX．用途 本発明は、本明細書の他の箇所に、例えば、発育異常についての一般的説明に 、または以下の診断のためのキットの説明に記載のような診断適用において、用 途を見いだす試薬を提供する。特に、遺伝子は、細胞のゲノム局面、ならびにmR NAおよびタンパク質発現パターンを含む、細胞タイプを区別するためのマーカー として有用である。 DC遺伝子、例えば、DNAまたはRNAは、法医学アッセイにおける成分として使用 され得る。例えば、提供されるヌクレオチド配列は、例えば、³²Pまたはビオチ ンを使用して標識され、そして標準的制限フラグメント多型ブロットをプローブ するために使用され得、個体間を区別することを補助するための測定可能な特徴 を提供する。このようなプローブは、遺伝子フィンガープリンティングのような 周知の法医学技法で使用され得る。さらに、DC配列から作成されるヌクレオチド プローブは、染色体異常を検出するためにインサイチュアッセイで使用され得る 。 DCタンパク質または核酸に対する抗体および他の結合剤は、対応するDCタンパ ク質分子を精製するために使用され得る。以下の実施例に記載のように、DCタン パク質の抗体精製は、可能および実施可能の両方である。抗体および他の結合剤 はまた、DC成分が本明細書に記載の周知の技法を使用して、組織試料または細胞 集団に存在するかどうかを決定するために、診断様式で使用され得る。DCタンパ ク質へ結合剤を付着させる能力は、発現の誤調節に関連する障害を診断するため の手段を提供する。抗体および他のDCタンパク質結合剤はまた、組織学的または 法医学的マーカーとして有用であり得る。以下の実施例に記載のように、これら のタンパク質のそれぞれの発現は、特異的組織タイプに限定される。それぞれの DCタンパク質に対する抗体または核酸のような、プローブを指示することによっ て、インサイチュまたはインビトロで組織および細胞タイプを区別するためにプ ローブを使用することが可能である。 本発明はまた、顕著な治療値を示し得る試薬を提供する。DCタンパク質（天然 に存在するまたは組換え）、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は、DC タンパタ質への結合親和性を有すると同定された化合物とともに、異常増殖、例 えば、ガン様症状または変性性症状を含む、異常な生理機能または発育に関連す る状態の処置に有用であり得る。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細 書で提供される組成物を使用する適切な治療処置によって調節され得る。例えば 、例えば抗原提示細胞として、DCによる異常発現または異常シグナリングに関連 する疾患または障害は、タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストについて の標的である。タンパク質は、おそらく、免疫学的応答（例えば、抗原提示およ び得られるエフェクター機能）に影響を及ぼす造血細胞（例えば、リンパ様細胞 ）の調節または発達における役割を果たす。 他の異常な発達状態は、ノーザンブロット分析によってDCタンパク質mRNAを有 することが示される細胞タイプで公知である。Berkow（編）The Merck Manual o f Diagnosis and Therapy ，Merck & Co.，Rahway，NJ；およびThornらHarrison' s Principles of Internal Medicine ，McGraw-Hill，NYを参照のこと。例えば、 免疫系の、発達または機能異常は、本明細書で提供される組成物を使用する予防 または処置を受け得る顕著な医学的異常および症状を引き起こす。 組換えDCタンパク質または抗体は、精製され、次いで患者に投与され得る。こ れらの試薬を、生理学的に無害の安定化剤および賦形剤とともに、例えば、従来 の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫アジュバント）中の 追加の活性または不活性成分と治療用途のために組み合わせ得る。特に、これら は、ワクチン状況において有用であり得、ここで抗原はアゴニストまたはアンタ ゴニストのこれらの治療型の１つと合わせられる。これらの組み合わせ物を滅菌 濾過し、そして投与バイアル中の凍結乾燥によるような投与形態中、または安定 化した水性調製物中での貯蔵に置かれ得る。本発明はまた、相補結合ではない形 態を含む、抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。 抗体またはレセプターまたはそのフラグメントを使用する薬物スクリーニング は、会合した成分の単離を含む、これらのDCタンパク質への結合親和性を有する 化合物を同定し得る。次いで、その後の生物学的アッセイは、化合物が本来の刺 激活性を有するかどうかを決定するために利用され得、したがって、タンパク質 の活性をブロックするブロッカーまたはアンタゴニストである。同様に、本来の 刺激活性を有する化合物は、タンパク質によって細胞を活性化し得、したがって 、細胞を刺激するアゴニストである。本発明は、さらに、アンタゴニストとして のタンパク質に対する抗体の治療使用を意図する。 効果的治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、 および投与される他の製剤を含む、多くの異なる因子に依存する。したがって、 処置投与量は、安全性および効率を最適にするために滴定されるべきである。代 表的には、インビトロで使用される投与量は、これらの試薬のインサイチュ投与 に有用な量で有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置に有効な用量の 動物テストは、ヒト投与量の予測効能をさらに提供する。種々の考察が、例えば 、Gilmanら（編）(1990)Goodman and Gilman's:ThePharmacological Bases of T herapeutics （第8版）Pergamon Press；および(1990)Remington's Pharmaceutic al Science （第17版）Mack Piblishing Co.，Easton，PAに記載される。投与方 法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散などについ て、本明細書中および以下に議論される。薬学的に受容可能なキャリアには、水 、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index，Merck & Co.，Rahway，NJ に記載の他の化合物が挙げられる。投与量範囲は、適切なキャリアとともに、通 常は1mMより低い濃度、代表的には約10μMより低い濃度、通常は約100nMより低 い濃度、好ましくは約10pMより低い濃度、および最も好ましくは約1fM（フェム トモル）より低い濃度の量であると予測される。徐放性処方物、または徐放性装 置は、しばしば、持続投与に利用される。 DCタンパク質、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグ メントに対する抗体、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に 直接投与され得、あるいは化合物のサイズに依存して、投与前にオボアルブミン または血清アルブミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合することが望 ましくあり得る。治療処方物は、多くの従来の投与処方物中で投与され得る。活 性成分を単独で投与することは可能であるが、薬学的処方物としてそれを提示す ることが好ましい。処方物は、代表的には、その１つ以上の受容可能なキャリア とともに、上記で定義したように、少なくとも１つの活性成分を含む。各キャリ アは、他の成分と適合可能である点で薬学的および生理学的に受容可能であり、 そして患者に有害でないことの両方であるべきである。処方物は、経口、直腸、 鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内をふくむ）投与に適切な ものを含む。処方物は、便利に単位投与形態で存在され得、そして薬学の当該技 術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら（編）(199 0)Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics（第8版 ）Pergamon Press；および(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences（第17 版）Mack Piblishing Co.，Easton，PA；Avisら（編）(1993)Pharmaceutical Do sage Forms:Parenteral Medications Dekker，NY；Liebermanら（編）(1990)Pha rmaceutical Dosgae Forms:Tablets Dekker，NY；およびLiebermanら（編）(199 0)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker，NYを参照のこと。 本発明の治療は、他の化学療法剤または化学予防剤と合わせ得あるいは関連して 使用され得る。 本発明のDCタンパク質の天然に存在するおよび組換えの両方の形態とも、タン パク質への結合活性について化合物をスクリーニングし得るキットおよびアッセ イ方法に、特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法は、短期間で数万 の化合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されている。例えば、 Fodorら（1991）Science 251:767-773、および化学多様性ライブラリーの他の説 明を参照のこと、これらは、複数の化合物による結合親和性のテストのための手 段を記載する。適切なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような大量 の精製された（例えば、可溶性型の）DCタンパク質の利用可能性によって、非常 に容易にされ得る。 例えば、一旦タンパク質が構造的に定義されると、アンタゴニストが、しばし ば見いだされ得る。可能性のあるタンパク質アナログのテストをすることは、現 在、精製された表面タンパク質を使用する、高度に自動化されたアッセイの開発 の可能性がある。特に、新しいアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書に 記載のスクリーニング技法を使用することによって発見される。多数の関連細胞 表面抗原に対して組み合わされた結合親和性を有することが見いだされた化合物 、例えば、DCタンパク質の種改変体に対するアンタゴニストとして作用し得る化 合物は、特に重要である。 本発明は、種々の薬物スクリーニング技法において組換えDCタンパク質を使用 することによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。特異的リ ガンドについてのスクリーニングにおいて組換えタンパク質を使用する利点は、 (a)特異的ソースからのタンパク質の改良された再生可能なソース；(b)アッセイ においてより良好なシグナル／ノイズ比を与える潜在的により多数の細胞当たり の抗原；および(c)種改変体特異性（より大きな生物学的および疾患特異性を理 論的に与える）を包含する。 薬物スクリーニングの１つの方法は、DCタンパク質を発現する組換えDNA分子 で安定に形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。任意の他 の細胞からの単離において、そのタンパク質を発現する細胞を単離し得る。この ような細胞は、生存可能なまたは固定された形態のいずれかで、標準的表面タン パク質結合アッセイに使用され得る。Parceら（1989）Science 246:243-247；お よびOwickiら（1990）Proc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 87:4007-4011も参照のこと 、これらは、細胞性応答を検出するための感度の高い方法を記載する。細胞（DC タンパク質のソース）が、¹²⁵I-抗体のような、抗原に対する公知の結合親和性 を有する抗体、および結合組成物に対する結合親和性が測定されるテスト試料と 接触およびインキュベートされる場合、競合アッセイは、特に有用である。次い で、結合および遊離の標識された結合組成物を分離して、タンパク質結合の程度 を評価する。結合したテスト化合物の量は、公知のソースへの標識された抗体結 合の量に反比例する。多くの技法を使用して、結合の程度を評価するために遊離 の試薬から結合したものを分離し得る。この分離工程は、代表的には、フィルタ ーへの接着その後の洗浄、プラスチックへの接着その後の洗浄、または細胞膜の 遠心分離のような手順を包含し得る。生存可能細胞はまた、これらのDCタンパク 質媒 介機能（例えば、抗原提示またはヘルパー機能）における薬物の効果についてス クリーニングするために使用され得る。 他の方法は、DCタンパク質のソースとして形質転換した真核生物または原核生 物宿主細胞からの膜を利用する。これらの細胞は、適切な（sppropriate）タン パク質（例えば、操作された膜結合型）の発現を指示するDNAベクターで安定に 形質転換される。本質的に、膜は、細胞から調製され、そして上記の競合アッセ イのような結合アッセイで使用される。 さらに他のアプローチは、形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞か らの可溶化した精製されていない、または可溶化した精製されたDCタンパク質を 使用することである。これは、増加した特異性、自動化する能力、および高い薬 物テスト処理能力比の有利点を有する「分子」結合アッセイを可能にする。 薬物スクリーニングのための他の技法は、それぞれのDCタンパク質に対する適 切な結合親和性を有する化合物についての高い処理能力比のスクリーニングを提 供するアプローチを包含し、そしてGeysen，ヨーロッパ特許出願84/03564（1984 年9月13日に公表）に詳細に記載される。最初に、多数の異なる小ペプチドテス ト化合物を、固体基材、例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の適切な 表面上で合成する。Fodorら，前出を参照のこと。次いで、すべてのピンを、可 溶化した精製されていない、または可溶化した精製されたDCタンパク質と反応さ せ、そして洗浄する。次の工程は、結合した試薬、例えば、抗体を検出する工程 を包含する。 特異的な他のタンパク質と相互作用する部位を決定するための１つの手段は、 物理的構造決定方法、例えば、x線結晶学または２次元NMR技法である。これらは 、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについてのガイダンスを提供す る。タンパク質構造決定方法についての詳細な記載については、例えば、Blunde llおよびJohnson（1976）Protein Crystallography Academic Press，NYを参照 のこと。 Ｘ．キット 本発明はまた、DCタンパク質またはメッセージの存在を検出するための種々の 診断キットおよび方法における、これらのDCタンパク質、そのフラグメント、ペ プチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的には、キットは、所 定のDCペプチドまたは遺伝子セグメントまたは１つもしくは他を認識する試薬、 （例えば、抗体）のいずれかを含むコンパートメントを有する。 それぞれのDCタンパク質に対するテスト化合物の結合親和性を決定するための キットは、代表的には、テスト化合物；標識された化合物、例えば、タンパク質 に対する公知の結合親和性を有する抗体；DCタンパク質のソース（天然に存在す るまたは組換え）；およびDCタンパク質を固定するための固相のような。遊離の 標識された化合物から結合したものを分離するための手段を含む。一旦化合物が スクリーニングされると、タンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物 は、DC機能を調節するようにアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか どうかを決定するために、当該技術分野で周知のように、適切な生物学的アッセ イで評価され得る。組換えDCポリペプチドの利用可能性はまた、このようなアッ セイを構成するための十分定義された標準を提供する。 例えば、試料中のDCタンパク質の、濃度を決定するために好ましいキットは、 代表的には、DCタンパク質に対する公知の結合親和性を有する標識された化合物 （例えば、抗体）、DCタンパク質（天然に存在するまたは組換え）のソース、お よび遊離の標識された化合物から結合したものを分離するための手段（例えば、 DCタンパク質を固定するための固相）を含む。試薬を含むコンパートメント、お よび器具は、正常に提供される。 それぞれのDCまたはそのフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを含 む、抗体は、タンパク質および／またはそのフラグメントの上昇したレベルの存 在を検出するための診断適用に有用である。このような診断アッセイは、ライセ ート、生存細胞、固定した細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液、を用い得、そし てさらに、血清中の抗原の検出などを包含し得る。診断アッセイは、均質（遊離 の試薬と抗原−DCタンパク質複合体との間の分離工程なし）または不均質（分離 工程あり）であり得る。種々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオイムノ アッセイ（RIA）、固相酵素免疫検定法（ELISA）、酵素免疫検定法（EIA）、多 元酵素免疫検定法（EMIT）、基質標識蛍光イムノアッセイ（SLFIA）などである 。 例えば、非標識抗体を、標識され、そしてDCタンパク質またはその特定のフラグ メントに対する抗体を認識する、二次抗体を使用することによって行い得る。類 似のアッセイはまた、文献で広く議論されている。例えば、HarlowおよびLane（ 1988）Antibodies:A Laboratory Manual，CSH Press，NY；Chan（編）(1987)Imm unoassay:A Practical Guide Academic Press，Orlando，FL；PriceおよびNewma n（編）(1991)Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press，NY； およびNgo（編）(1988)Nonisotopic Immunoassay Plenum Press，NYを参照のこ と。特に試薬は、試料中の過剰または不足のDCのいずれかを検出するために、生 物学的試料中でDC集団を診断するために有用であり得る。アッセイは、血液また は組織試料において、バイオプシーの組織学的分析、またはDC数の上昇に関し得 る。 抗イディオタイプ抗体は、このようなものが種々の異常状態の診断であり得る 場合、DCタンパク質に対する抗体の存在を診断するための類似の用途を有し得る 。例えば、DCタンパク質の過剰産生は、特に、ガンまたは異常分化のような増殖 性細胞症状において、異常な生理学的状態の診断であり得る種々の免疫学的反応 を生じ得る。 頻繁には、診断アッセイのための試薬は、アッセイの感度を最適にするように 、キット中に供給される。本発明については、アッセイの性質に依存して、プロ トコル、および標識、標識されたまたは標識されていない抗体またはレセプター 、あるいは標識されたDCタンパク質が提供される。これは、通常、緩衝液、安定 化剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質などのような、他の 添加物と一緒である。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使用後の内 容物の処理の仕方の指示書を含む。代表的には、キットは、各有用な試薬のため のコンパートメントを有する。望ましくは、試薬が、アッセイを行うための試薬 の適切な濃度を提供する水性培地中で再構築され得る場合、試薬は、凍結乾燥し た粉末として提供される。 薬物スクリーニングおよび診断アッセイの上記の構成成分の多くは、改変なし で使用され得、あるいは種々の方法で改変され得る。例えば、標識することは、 検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する部分を共有または非共有結合 によって達成され得る。これらのアッセイの多くでは、タンパク質、テスト化合 物、DCタンパク質、またはそれに対する抗体は、直接または間接的に標識され得 る。直接的に標識するための可能性は、以下の標識群を包含する：¹²⁵Iのような 放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米 国特許第3,645,090号）、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光極性化の変 化をモニタリングし得る蛍光標識（米国特許第3,940,475号）。間接的に標識す るための可能性は、１つの構成成分のビオチン化、次いで上記の標識群の１つに カップリングしたアビジンに結合することを包含する。 また、遊離のタンパク質から結合したものを、あるいは遊離のテスト化合物か ら結合したものを分離する多くの方法がある。DCタンパク質は、種々のマトリク ス上に固定されて洗浄され得る。適切なマトリクスには、ELISAプレートのよう なプラスチック、フィルター、およびビーズが挙げられる。マトリクスにDCタン パク質を固定する方法には、限定することなく、プラスチックへの直接付着、捕 獲抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが挙げられる。 このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機 溶媒、または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含む、いくつかの方 法の１つによって、タンパク質／抗体複合体の沈殿を包含する。他の適切な分離 技法には、限定することなく、Rattleら（1984）Clin ．Chem．30:1457-1461に記 載のフルオレセイン抗体磁化可能粒子方法、および米国特許第4,659,678号に記 載のような二重抗体磁性粒子分離方法が挙げられる。 種々の標識へタンパク質またはそのフラグメントを連結する方法は、文献に広 く報告されており、そして本明細書での詳細な議論の必要はない。技法の多くは 、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれか の使用による活性化されたカルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチル のような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとメルカプ ト基の反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、 これらの適用における使用を見いだす。 本発明の別の診断局面は、それぞれのDCタンパク質の配列から得たオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドの使用を包含する。これらの配列は、異常症状 、 例えば、ガンまたは免疫問題を有する疑いのある患者からの試料においてメッセ ージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよびDNAの両 方のヌクレオチド配列の調製、配列の標識化、および好ましいサイズの配列は、 文献において広い説明および議論を受け入れている。正常には、オリゴヌクレオ チドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常は少なくとも約18ヌクレオ チドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロ塩基まで であり得る。種々の標識は、最も普通の放射性核種、特に³²Pを用い得る。しか し、他の技法はまた、例えば、ポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変 されたヌクレオチドを使用して、用いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジン または抗体に結合するための部位として作用し、これは、放射性核種、蛍光団、 酵素などのような種々の標識で標識され得る。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖 、DNA-RNAハイブリッド二重鎖、またはDNA-タンパク質二重鎖を含む、特異的二 重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。次に、抗体が標識され得、そして二重鎖 が表面に結合される場合にアッセイを行い得、そのため表面上の二重鎖の形成の 際に、二重鎖へ結合した抗体の存在が検出され得る。新規抗七ンスRNAに対する プローブの使用は、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリ ーニング、リコンビナトリアルプロービング、ハイブリッド放出翻訳（HRT）、 およびハイブリッド停止翻訳（HART）のような任意の従来の技法において行われ 得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅技法を包含する 。 他のマーカーの定性的または定量的存在についてもテストする診断キットも意 図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わ せに依存し得る。したがって、キットは、マーカーの組み合わせについてテスト し得る。例えば、Vialletら（1989）Progress in Growth Factor Res ．1:89-97 を参照のこと。 XI．結合パートナー単離 特異的相互作用の結合パートナーの１つのメンバーを単離した場合、対応パー トナーを単離するための方法が存在する。Gearingら（1989）EMBO J ．8:3667-36 76を参照のこと。例えば、レセプターへの結合を妨害することなくDC表面タンパ ク質を標識する手段が、決定され得る。例えば、アフィニティー標識は、リガン ドのアミノまたはカルボキシルのいずれかの末端に融合され得る。発現ライブラ リーは、例えば、細胞ソーティング、またはこのような結合成分を発現するサブ 集団を検出するための他のスクリーニングによって、DCタンパク質への特異的結 合についてスクリーニングされ得る。例えば、Hoら（1993）Proc ．Nat'l．Acad ．Sci．USA 90:11267-11271を参照のこと。あるいは、パンニング方法が使用さ れ得る。例えば、SeedおよびAruffo（1987）Proc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 84:3 365-3369を参照のこと。ツーハイブリッド選択システムも、利用可能なDCタンパ ク質配列を有する適切な構築物を作製することに適用され得る。例えば、Fields およびSong（1989）Nature 340:245-246を参照のこと。 標識とのタンパク質架橋技法は、DCタンパク質の結合パートナーを単離するた めに適用され得る。これは、適切なDCタンパク質と特異的に相互作用するタンパ ク質の同定を可能にする。 本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考にして最良に理解され、この実施例 は、本発明を特定の実施態様に限定することを意図しない。 実施例 Ｉ．一般的方法 以下の標準的方法の多くは、例えば、Maniatisら（1982）Molecular Cloning ，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY；Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第2 版）Vol．1-3，CSH Press，NY；AusubelらBiology Greene Publishing Associat es，Brooklyn，NY；またはAusubelら（1987年および補遺）Current Protocols i n Molecular Biology Wiley/Greene，NY；Innisら（編）(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications Academic Press，NYに記載または参照さ れる。 タンパク質精製の方法には、硫酸アンモニウム沈殿法、カラムクロマトグラフ ィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる。例えば、Au subelら(1987年および定期的補遺)；Deutscher(1990)「Guide to Protein Pur ification Methods in Enzymology vol．182およびこのシリーズの他の巻；Coli ganら（1996年および定期的補遺）Current Protocols in Protein Science Wile y/Greene，NY；およびタンパク質精製産物の使用における製造業者の文献（例え ば、Pharmacia，Piscataway，NJ、またはBio-Rad，Richmond，CA）を参照のこと 。組換え技法との組み合わせは、適切なセグメント（例えば、FLAG配列またはプ ロテアーゼ除去可能配列によって融合され得る等価物）への融合を可能にする。 例えば、Hochuli（1989）Chemische Industrie 12:69-70；Hochuli(1990)「Puri fication of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」Setlow（ 編）Genetic Engineering ，Principle and Methods 12:87-98，Plenum Press，N Y；およびCroweら（1992）QIAexpress:The High Level Expression & Protein P urification Sysytem QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CAを参照のこと。 免疫学的機能を決定するための方法は、例えば、Coliganら（1992年および定 期的補遺）Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NYに記載さ れる。例えば、Paul（編）(1993)Fundamental Immunology（第3版）Raven Press ，N.Y．も参照のこと。 FACS分析は、Melamedら（1990）Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss，In c.，New York，NY；Shapiro（1988）Practical Flow Cytometory Liss，New Yor k，NY；およびRobinsonら（1993）Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley- liss，New York，NYに記載される。 II．樹状細胞の生成 ヒトCD34+細胞を以下のように得た。例えば、Cauxら（1995）1-5頁Banchereau およびSchmitt Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Ple num Press，NYを参照のこと。末梢または脊髄血細胞、ときどきCD34+を選択し、 これを、10％(v/v)熱不活性化ウシ胎児血清(FBS；Flow Laboratories，Irvine， CA)、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、5×10^-5M 2-メルカプトエタノール、ペニ シリン（100mg/ml）を補充したエンドトキシンを含まないRPMI 1640培地（GIBCO ，Grand Island，NY）中の幹細胞因子（SCF）、GM-CSF、およびTNF-aの存在下で 培養した。これを、完全培地という。 CD34+細胞を、25〜75cm²フラスコ（Corning，NY）中に2×10⁴細胞/mlで拡張の ために播種した。最適条件を、新鮮なGM-CSFおよびTNF-aを含む５および10日目 にこれらの培養物を分割させることによって維持した（細胞濃度：1〜3×10⁵細 胞/ml）。ある場合には、細胞を、約６日目にCDla発現についてFACSソーティン グした。 ある状況では、細胞を、12日の培養後にルーチンに採集し、最終的には、付着 細胞を、5mM EDTA溶液を使用して回収した。他の状況では、CD1a+細胞を、完全 培地中の5×10⁶細胞/mlでの再懸濁によって活性化し、そして1mg/mlホルボール1 2-ミリステート13-アセテート（PMA，Sigma）および100ng/mlイオノマイシン（C albiochem，La Jolla，CA）で適切な時間（例えば、１または６時間）活性化し た。これらの細胞を、さらに６日間拡張し、そしてcDNAライブラリー調製のため にRNAを単離した。 III．RNA単離およびライブラリー構築 トータルRNAを、例えば、Chirgwinら（1978）Biochem ．18:5294-5299に記載の ようにグアニジンチオシアネート/CsClグラジエント手順を使用して単離する。 あるいは、ポリ(A)+を、OLIGOTEX mRNA単離キット（QIAGEN）を使用して単離 する。二本鎖cDNAを、cDNA合成およびプラスミドクローニングのために、例えば 、SUPERSCRIPTプラスミドシステム（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）を使用して 生成する。得られる二本鎖cDNAを、例えば、pSport1に一方向にクローニングし 、そしてELECTROMAX DH10CTM細胞（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）へのエレク トロポレーションによってトランスフェクトする。 IV．配列決定 ランダムに取り出したクローンから単離したDNA、または不活性化した細胞を 使用する差し引きハイブリダイゼーション後のDNAを、標準的技法を使用してヌ クレオチド配列分析にかけた。Taqジデオキシターミネーターサイクル配列決定 キット（Applied Biosystems，Foster City，CA）を使用し得る。標識されたDNA フラグメントを、適切な自動化配列決定機のDNA配列決定ゲルを使用して分離す る。あるいは、単離したクローンを、例えば、Maniatisら（1982）Molecular Cl oning ，A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring H arbor Press；Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，( 第2版)，第1-3巻，CSH Press，NY；Ausubelら，Biology，Greene Publishing As sociates，Brooklyn，NY；またはAusubelら（1987年および補遺）Current Proto cols in Molecular Biology ，Greene/Wiley，New Yorkに記載のように配列決定 する。化学的配列決定方法も、例えば、MaxamおよびGilbert配列決定技法を使用 して利用可能である。 Ｖ．組換えDC遺伝子構築物 ポリ(A)⁺RNAを、例えば、FastTrack mRNAキット（Invitrogen，San Diego，CA ）を使用して、適切な細胞集団から単離する。試料を、例えば、ホルムアルデヒ ドを含む１％アガロースゲルで電気泳動し、そしてGeneScreenメンブラン（NEN Research Products，Boston，MA）にトランスファーする。ハイブリダイゼーシ ョンを、例えば、10⁷cpm/mlで³²P-dCTP標識したDC遺伝子cDNAと、65℃にて0.5M NaHPO₄ pH7.2、7％SDS、1mM EDTA、および1％ BSA(フラクションV)中で行う。ハ イブリダイゼーション後、フィルターを、0.2×SSC、0.1％SDS中で50℃にて３回 洗浄し、そして24時間フィルムに曝露する。 組換え遺伝子構築物を使用して、メッセージを検出するためのプローブを生成 し得る。インサートを切り出し、そして上記の検出方法で使用し得る。 VI．E．coliにおけるDC遺伝子タンパク質の発現 PCRを使用して、好ましくは、適切なプロモーター、選択、および調節配列と 作動可能に会合して、オープンリーディングフレームを含む構築物を作成する。 得られる発現プラスミドを、適切な、例えば、Topp5、E．coli株（Stratagene， La Jolla，CA）に形質転換する。アンピシリン耐性（50μg/ml）形質転換体を、 550nmでの光学密度が0.7であるまで、37℃にてLuria Broth(Gibco)中で増殖する 。組換えタンパク質を、0.4mMイソプロピル-bD-チオガラクトピラノシド（Sigma ，St．Louis，MO）で誘導し、そして細胞のインキュベーションを、20℃にて さらに18時間続ける。１リットル培養物からの細胞を、遠心分離によって採取し 、そして例えば、200mlの氷冷30％スクロース、50mM Tris HCl pH8.0、1mMエチ レンジアミン四酢酸に再懸濁する。氷上で10分後、氷冷水を添加して２リットル の総容量にする。氷上で20分後、細胞を、遠心分離によって除去し、そして上清 を、５μM Millipak 60（Millipore Corp.，Bedford，MA）による濾過によって 澄明にする。 組換えタンパク質を、標準的精製方法、例えば、種々のイオン交換クロマトグ ラフィー方法によって精製する。以下に記載の抗体を使用するイムノアフィニテ ィー方法も使用し得る。エピトープタグを発現構築物中に操作する場合、アフィ ニティー方法を使用し得る。 VII．ヒトDC遺伝子のマッピング DNA単離、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットトランス ファー、およびハイブリダイゼーションを、標準的技法に従って行う。Jenklns ら（1982）J ．Virol．43:26-36を参照のこと。ブロットを、Hybond-Nナイロンメ ンブラン（Amersham）で調製し得る。プローブを、³²P-dCTPで標識し；洗浄を例 えば、0.1×SSC、0.1％SDS、65℃の最終ストリンジェンシーまで行う。 あるいは、BIOS Laboratories(New Haven，CT)マウス体細胞ハイブリッドパネ ルを、PCR方法と組み合わせ得る。Fanら（1996）Immunogenetics 44:97-103を参 照のこと。 Stanford G3パネルでの染色体局在は、7.7のロッドを有する最も近いマーカー SHGC-12041として得た。このマーカーは、M130抗原をコードする遺伝子であり、 染色体12p13に局在する。この局在は、Ｃタイプのレクチンファミリー、明らか にはCD69、およびNKレセプターファミリーのレセプターをコードする多くの遺伝 子のための宿主である。 VIII．個々の変異の分析 分布データから、豊富な容易に利用可能な細胞タイプを、個体からのサンプリ ングについて選択する。PCR技法を使用して、個々の大きな集団を、この遺伝子 について分析する。cDNAまたは他のPCR方法を使用して、種々の個体において対 応する遺伝子を配列決定し、そしてその配列を比較する。これは、人種または他 の集団の中の多様性の程度、およびどの残基が機能における劇的な効果なしに改 変可能であるようであるかを決定することの両方を示す。 IX．抗体の調製 組換えDCタンパク質を、上で示すようにE．coliでの発現によって生成し、そ して生物学的活性についてテストする。あるいは、天然のタンパク質ソースを、 利用可能になった精製方法で使用し得る。抗体試薬を、免疫精製で、または分離 方法を探知するために使用し得る。活性または変性したタンパク質を、ポリクロ ーナル血清産生またはモノクローナル抗体産生のいずれかに適切な哺乳動物の免 疫接種に使用し得る。 Ｘ．対応物霊長類または齧歯類DC遺伝子の単離 これらの遺伝子をコードするヒトcDNAクローンを、プローブとして、または種 々の霊長類種、例えば、チンパンジーにおける対応物を見いだすためにPCRプラ イマーを設計するために使用する。 DCMP1（tblastnアルゴリズム）の予測ポリペプチド配列を使用するESTデータ ベース（GenBank dbEST）の生物情報(bioinformatics)検索は、霊長類DCMP1に相 同なタンパク質をコードするマウスクローンを示した。この配列に対応する４つ のクローンがわかった：AA387662 Koマウス胚11 5dpc；AA170532マウス脾臓；AA 475012マウス乳腺；およびAA423158マウス乳腺。配列分析によって全長クローン であると見積もった、これらのうちの１つのAA170532を選択し、そしてDNA配列 決定した。このクローンは、DCMP1に類似の特徴を含んでいた。全長クローンは 、ポリＡ配列を除いて1418bpであり、そして278bpの5'UTRを含む。hDCMP1につい ては、推定開始コドンはコンセンサスKozak領域内に含まれないが、このコドン は上流の停止コドンにより前にある。5'UTRは、３つのコンセンサスATTTA部位を 含む、急速分解シグナルに類似の配列を含む。潜在的なポリアデニル化配列が見 られる。予測ポリペプチドは、約238残基長であり、そしてITIMおよびC-タイプ レ クチンドメインを有するタイプII膜タンパク質をコードする。３つの潜在的なN- グリコシル化部位が見られる。これおよびヒトタンパク質のアラインメントは、 全体の配列に対して約54％同一性、65％相同性を示す。顕著には、ITIMドメイン は非常に保存される（15残基のうちの13が同一である）。目的は、保存された膜 筋異のグルタミンモチーフ（FQKYSQLLE）であり、そしてシステイン残基は、潜 在的にジスルフィド架橋形成に関与した。同様に、C-タイプレクチンドメインは 、EPSモチーフを含む保存のブロックを示す。hDCMP1とヒト肝臓レクチンとの間 で見られる差は、マウス配列、顕著には、119および163位でのトリプトファンの 置換；177位でのグルタミン；および228位でのトリプトファンの代わりのセリン で保持される。したがって、このクローンがhDCMP1のマウスホモログであるよう である。 XI．細胞集団を分析するための試薬の使用 試料に存在する樹状細胞のレベルの検出は、異常な疾患症状の診断に重要であ る。例えば、組織またはリンパ系における樹状細胞の数の増加は、DC過形成の存 在、または組織もしくは移植拒絶の指標であり得る。低いDC集団は、例えば、細 菌またはウイルス感染への異常な反応を示し得、これはDC応答を正常にするため の適切な処置を必要とし得る。 細胞表面DCタンパク質に特異的な標識された結合剤を使用するFACS分析（例え ば、Melamedら（1990）Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss，Inc.，New Yo rk，NY；Shapiro（1988）Practical Flow Cytometory Liss，New York，NY；お よびRobinsonら（1993）Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss，New York，NYを参照のこと）は、細胞混合物、例えば、PBMC、接着細胞などに存在 するDCの数を決定することに使用される。結合剤はまた、DCの浸潤を分析するた めに、新鮮または固定したいずれかの組織試料の組織学的分析に使用される。多 様な細胞集団はまた、細胞破壊性アッセイで、または細胞が生存したままである 特定のアッセイでのいずれかで、評価され得る。 可溶性細胞内分子の存在の分析を、例えば、Openshawら（1995）J ．Exp．Med ． 182:1357-1367に記載のように、DCに特異的な蛍光結合剤で行う。あるいは、 組 織または細胞固定方法を使用し得る。 DC転写物のレベルを、例えば、Murphyら（1993）J ．Immunol．Methods 162:21 1-223に記載のように半定量性PCRを使用して定量する。プライマーを、ゲノムDN Aが検出されないように設計する。 XII．発現分布 配列データベースにおける完全なDCMP1 cDNA配列の分析は、限定された数のラ イブラリーに制限された発現パターンを表した。最大数の配列（10）を、樹状細 胞ライブラリーで検出し、破骨細胞腫細胞のライブラリーで４つの配列、および 単球、LPS活性化好中球、軟骨肉腫、結腸ガン、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚腫瘍、お よび慢性滑膜炎からインビトロで生成したマクロファージのライブラリーからシ グナル配列を検出した。GenBank dbESTにおいて、４つのクローンを検出した：A A418441、差し引きしたライブラリー；AA446401、総胎児；AA677149、胎児肝臓 脾臓；C01555、ヒト遺伝子特徴；AA380065、皮膚腫瘍。 多くの異なる細胞株および新鮮に単離した細胞に対するRT-PCRによるDCMP1発 現の分析は、DCMP1の発現が、TF1（骨髄性前駆体）、Jurkat（Ｔ細胞株）、CHA （腎臓ガン腫）、MRC5（胎児肺線維芽腫）、JY（Ｂ細胞株）、U937（骨髄-単球 性リンパ腫細胞株）で検出されないが、造血細胞に制限されることを示した。新 鮮に単離した細胞では、発現は、不活化および活性化された両方のDC；活性化さ れた顆粒球；不活化および活性化された両方のPBLで見られ；そして低レベルの 発現が、活性化された単球；および活性化されたＢ細胞で見られる。すべての活 性化試料は、PMA/イオノマイシンで１および６時間処理した細胞のプールであっ た。 追加の分析は、DCMP1の発現が細胞の活性化状態で変化することを示した。RT- PCRも、異なる活性化状態下でDCMP1の発現を検出するために使用した。扁桃組織 から単離したＢ細胞を、PMA/イオノマイシンで１または６時間処理し、あるいは CD40L発現Ｌ細胞と３、12、および24時間同時培養することによって処理した。m RNAを、不活化細胞で検出した。この発現は、PMA/イオノマイシン処理について は１時間以内に、およびCD40L処理の３時間後に失われ得た。逆に、抗CD3/抗CD2 8インキュベーション後でさえも、Ｔ細胞において発現を検出し得なかった。 CD34+由来細胞では、DCMP1の発現は、M-CSFの存在下でCD34+前駆細胞に由来す るマクロファージで強かった。この発現は、PMA/イオノマイシンに応じて変化し ないようであった。GM-CSFおよびTNFの存在下でCD34+前駆細胞に由来するDCでは 、mRNAのレベルは、培養の12日目で検出されたより大量のmRNAで、培養の時間経 過にわたって変化することが見られた。CD40Lを有するＬ細胞との同時培養の48 時間後、DCMP1の発現がなくなった。マーカーCD1a/CD14の存在について６日目に FACSソートし、そしてさらに６日間培養を続けたインビトロDCでは、CD1a亜集団 よりもより多くのmRNAを、ＣＤ１４で検出した。この発現を、PMA/イオノマイシ ン処理によってダウンレギュレートした。 血液から単離された単球では、不活化細胞でmRNAを検出しなかった。しかし、 DCMP1の発現を、PMA/イオノマイシンでの処理の６時間後に検出した。GM-CSFお よびIL-4での処理による単球に由来するDCでは、DCMP1発現をアップレギュレー トした。この発現は、PMA/イオノマイシンでの処理によって変化し得ないが、CD 40L発現Ｌ細胞との同時培養によってダウンレギュレートされ得た。この場合、D CMP1 mRNA発現は、培養の24時間までにすっかりなくなった。ヒトタンパク質の 発現を、抗体検出方法を使用して確認した。 DCMP1を、エクスビボ単離したDCのサブセットで発現した。血液または扁桃組 織から単離したDCサブセットを、インテグリンCD11cの存在または不在によって 特徴づけた。LarsonおよびSpringer（1990）Immunol ．Rev．114:181-217。血液 から単離されたDCのCD11c+サブセット（GCDCとしても公知）はDCMP1を発現する 。しかし、抗CD40LまたはPMA/イオノマイシン処理による活性化の後、mRNAは検 出されない。逆に、扁桃組織から単離された細胞の同じサブセットは、もはやDC MP1を発現しない。CD11c-DCサブセットの場合では、低レベルの発現は、血液か ら単離された細胞で観察される。この発現は、扁桃組織から単離された細胞でよ り大きいが、また、抗CD40抗体によってまたはPMA/イオノマイシン処理での活性 化でダウンレギュレートされる。皮膚から単離されたランゲルハンス細胞はDCMP 1を発現するが、周囲の基底細胞は発現を示さない。 XIII．霊長類DCMP1 配列分析は、これらのDCMPが、レセプターのレクチン／アシアロ糖タンパク質 スーパーファミリーのメンバーであることを示唆する。特に、肝臓およびマクロ ファージレクチンは、タンパク質およびペプチドのインターナリゼーションに関 連しており、これは、例えば、樹状細胞による抗原の取り込みおよび提示に重要 であり得る。DCMP1は、インターナリゼーションモチーフ（YxxV）またはITIM様 モチーフ（IxYxxV；配列番号２の残基5〜10；より伸長したモチーフは残基1〜24 に広がる）を含む。これは、タンパク質が、阻害レセプター（KIR；LIRなど）の ファミリーの樹状細胞型であり得、これが細胞機能を阻害するためにネガティブ シグナルを送ることを示唆する。 推定オープンリーディングフレームは、約ヌクレオチド242で始まる。この潜 在的な開始コドンは、コンセンサスKozak配列にはないが、代わりのATGの前にな くそして停止コドンが200位の上流に存在するので、これがコードされたタンパ ク質の開始であることを予測する。約237アミノ酸のポリペプチドを、この配列 から予測した。シグナルペプチドを検出しなかったが、推定膜貫通配列は、約38 6〜443位に及ぶ。このクローンは、C-タイプレクチンドメインを有するタイプII 膜タンパク質をコードする。3'UTRは、コンセンサス配列ATTTAの３つのリピート を含む、多くの潜在的な急速分解シグナルを含む。シグナルペプチドを検出しな かったが、推定膜貫通配列は、45〜62位、あるいは386〜443位に及ぶ。このクロ ーンは、C-タイプレクチンドメインを有するタイプII膜タンパク質をコードする 。 配列分析から予測されるポリペプチドは、残基７に中心があるチロシンベース のモチーフを含む、49アミノ酸細胞内ドメインを有する。この性質のYXX(L/V)モ チーフは、肝臓レクチンおよびCD23（Fce RIIa）の場合においてインターナリゼ ーションモチーフとして作用することが示されている。このタイプのドメインは 、Ly49、NKG2Aのような分子、および免疫グロブリン様分子のKIRファミリーにお いて、活性化（ITAM）または阻害（ITIM）モチーフとして作用することが示され ている。阻害は、コンセンサスドメイン(I/V)XYXX(L/V)へのSHP2/SHIPホスファ ターゼの漸増によって媒介される。DCMP1の最初の15アミノ酸は、伸長したITIM ドメインへの保存を示し、そしておそらく、細胞機能の阻害がDCMP1の特質の１ つ であるようである。単一の潜在的N-グリコシル化部位は、約185位に存在する。 DCMP1のC-タイプレクチンドメインのアミノ酸配列の、C-タイプレクチンドメ インを含む他のタンパク質との比較は、DCMP1が、肝臓レクチンおよびマクロフ ァージレクチンに最大の相同性を有することを示した（表１を参照のこと）。C- タイプレクチンフォールドの保存されたシステイン残基は、このファミリーのメ ンバーにわたって明らかに保存されるが、多くの区別する特徴が見られ得る。肝 臓レクチンのように、DCMP1は、レクチンドメインの開始で二重のシステインモ チーフを有する。この残基とジスルフィド架橋を形成し得るレクチンドメインに 明らかに他のシステインが存在しないので、この補充システインの機能は未知で ある。この残基が分子間ジスルフィド架橋形成に関連し得ることは可能であるが 、おそらくこの機能を果たす91位でのDCMP1中のもう１つのシステインが存在す る。DCMP1レクチンドメインのN-末端部分は、肝臓レクチンおよびマクロファー ジレクチンでの最大の保存を示す。カルシウム結合ドメインは、DCMP1に保存さ れ、そしてCD23に最大の相同性を示し、EPSモチーフ（残基195〜197）、201位で のグルタミン酸(E)、および218〜219位でのアスパラギンアスパラギン酸（ND） を含む。これらのモチーフは、NKレセプター（本明細書ではNKGEと示される）お よびCD94には明らかに不在である。 DCMP1は、約残基45〜62からの予測された膜貫通セグメントを有するタイプII 膜タンパク質である。これは、アシアロ糖タンパク質レセプター、肝臓レクチン 、CD69、CD72、CD23、およびNKレセプターを含むタンパク質のファミリーに関連 する。このタンパク質は、カルボキシ末端に細胞外Ca依存性C-タイプレクチンド メインを含み（約残基104〜237）、これは、糖残基特異性の特徴的なモチーフを 示す。表１を参照のこと。これらのタンパク質は、代表的には、糖タンパク質上 の糖残基に結合し、そして一次免疫応答に関連する。このファミリーのいくつか のメンバー、顕著にはCD69、NKレセプター、およびCD72は、特異的遺伝子の増殖 および誘導を含む細胞活性化事象中にシグナルを伝達することが示されている。 DCMP1は、マウスC-タイプレクチンKIRレセプター、Ly49と同様に、阻害レセプ ターの群に対して広がった相同性を有するインターナリゼーションモチーフを含 む（ITIMドメイン、VivierおよびDaeron（1997）Immunology Today 18:286-29 1；ならびにKatzおよびAusten（1997）J Immunol ．158:5065-5070による最近の 総説を参照のこと）。これらのレセプターの、免疫グロブリンスーパーファミリ ー（IgSF）メンバーまたはC-タイプレクチンのいずれかは、ホスファターゼ、例 えば、SHIP、SHP-1、およびSHP-2を含むSH2-ドメインによってネガティブシグナ ルを伝達する。証拠は、これらのレセプターが、活性化シグナルをブロックする ために、他の活性化レセプターと会合することを示唆する。証拠はまた、このタ イプの分子についてのリガンドがIgSF分子であることを示唆する。この例は、MH CクラスＩ分子（Cd94/NKレセプターおよびLy-49によって認識される）およびFcg R（CD23；IgGを認識する）である。 システイン残基91は、もう１つのポリペプチド、おそらくホモまたはヘテロダ イマーへのジスルフィド結合に関連するようである。 PCR分析は、遺伝子が活性化樹状細胞および非活性化樹状細胞で発現されるこ とを示す。検出可能なシグナルは、TF1（造血細胞株）、Jurkat（Ｔ細胞株）、M RC5（肺線維芽腫肉腫細胞株）、JY（Ｂ細胞株）、U937（前単球細胞株）、また はCHA（ガン腫細胞株）細胞のいずれでも見いだされなかった。ポジティブシグ ナルを、新鮮に単離した活性化したまたは不活化したPBL、および顆粒球で検出 したが、新鮮に単離したＴ細胞、Ｂ細胞、NK細胞、または単球からはわずかに弱 いシグナルを検出した。 配列分析は、樹状細胞、活性化抗中球、マクロファージ（GM-CSFで活性化され た）、破骨細胞腫、皮膚腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、結腸ガン、慢性滑膜炎、および 軟骨肉腫として特徴づけられる試料中の遺伝子の発現を示す。 XIV．齧歯類対応物DCMP1 表２は、齧歯類対応物配列の配列を示す。 表２：配列は、DCMP1のマウス対応物（配列番号８を参照のこと）をコードする マウスの２つのEST、W33446（配列番号11を参照のこと）およびAA170532（配列 番号８を参照のこと）に対する相同性を示す。 XV．霊長類DCMP2 DCMP2、推定アシアロ糖タンパク質レセプターは、タイプII膜貫通タンパク質 である。その細胞外領域では、DCMP2は、レクチンのC-タイプ（Ca++依存性）フ ァミリーに特徴的な、単一の炭水化物認識ドメイン（CRD）の特徴がある（Drick amerおよびTylor（1993）Ann ．Rev．Cell Biol．9:237-264を参照のこと）。DCM P2は、ヒト肝臓アシアロ糖タンパク質レセプターのサブユニットをコードする ２つの遺伝子（H1およびH2）とかなりの相同性を示す。Stockert（1995）Physio l ．Revs． 75:591-609。これらの肝臓レセプターは、タイプII C-タイプレクチン ファミリーメンバーのプロトタイプを示す。肝臓ASGPRは、末端ガラクトシル残 基を提示する脱アシアロ化糖タンパク質に対する結合特異性を有し、そしてクラ スリン被覆小孔経路によって肝細胞へのエンドサイトーシスを媒介する。顕著に は、これらの両方の機能に関連する特徴は、肝臓ASGPRとDCMP2との間で保存され る。従って、DCMP2は、５位にチロシン残基を含む細胞内モチーフを含み、そし てこれはリガンドエンドサイトーシス能力に関連する。Fuhrerら（1991）J ．Cel l Biol． 114:423-431を参照のこと。さらに、DCMP2は、その糖認識ドメインにQP D（Gln-Pro-Asp）ガラクトース認識タイプ配列（Drickamer（1992）Nature 360: 183- 186）を提示する。 DCMP2をコードするいくつかの改変体cDNAクローンは、ほとんど代替スプライ シングの結果として単離されている。３つの改変体が以下に記載される：短形態 、長形態、およびDCMP2vと命名された第３の形態。配列番号４および10；表１を 参照のこと。短および長形態は、短形態クローンの細胞外領域に挿入された独特 の27アミノ酸インサートの存在によって異なる。DCMP2の短形態は、ヒトマクロ ファージから得られた最近クローニングしたASGPR（M-ASGPR）に対して細胞外領 域で４残基の差を示す。Suzukiら（1996）J ．Immunol．156128−135。 DCMP21に関連して、ASGPRmは、GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP（配列番号４の 残基118〜144）に対応するセグメントがなく、そしてASGPRmは、GEEのインサー トを含む（配列番号４の残基173と174との間）。DCMP2sは、GVSELQEHTTQKAHLGHC PHCPSVCVP（配列番号４の残基118〜144）の不在、およびヌクレオチド1064でのG からAへ、それによってaspよりもasnをコードする配列の差を除いて、DCMP21と 同一である。DCMPvは、DCMPsと類似するが、膜貫通セグメントの重要の部分に対 応するLLQRLRSGPCHLLLSLGLG（配列番号４の残基30〜48）がなく；そしてASGPRm に見られるようなGEEのインサート（配列番号４の残基173と174との間）を含む 。例えば、エピトープ長の範囲内、例えば、12〜17アミノ酸のこれらの差のまわ りの領域は、重要である。 組換えDCMP2長形態タンパク質が利用可能であり、そしてmABが生成されている 。さらに、マウス細胞株は、長および短形態の両方の安定な発現のためにトラン スフェクトされている。 遺伝子を、最初は、GM-CSFおよびTNFaで培養したCD34⁺造血前駆細胞に由来す る70％純粋CD1a⁺DCから単離した（Cauxら（1992）Nature 360:258-261）。クロ ーンは、pSport1ベクターに挿入されている（NotI/SalI制限部位）。 PCR分析は、樹状細胞におけるDCMP2遺伝子の発現、およびTF1（造血細胞株） 細胞でのおそらく非常に弱い発現を示唆する。Jurkat（Ｔ細胞株）、CHA（ガン 腫細胞株）、MRC5（肺線維芽腫肉腫細胞株）、またはJY（Ｂ細胞株）からは検出 可能なシグナルはなかった。シグナルは、新鮮に単離した不活化したまたは活性 化した（PMAおよびイオノマイシン）樹状細胞、顆粒球、および不活化したまた は活性化したPBLで検出された。シグナルは、単球、不活化したまたは活性化し たＴ細胞、あるいは不活化したまたは活性化したＢ細胞では検出されなかった。 DC-ASPGRは、ヒト単球ASGPRのマウス対応物（M-ASGPR）とのかなりの相同性を 示す。相同性は、ガラクトースおよびN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）につ いてマウス単球ASGPRへの特異性を与える炭水化物認識ドメイン内で著しい（約6 0％）。Satoら（1992）J ．Biochem．111:331-336。これは、肝臓ASGPRのH1およ びH2サブユニットでも見いだされる、QPDモチーフを含む。さらに、マウス単球A SGPRは、その細胞質ドメインにおいてYENLインターナリゼーションシグナルを有 する。 マウスM-ASGPRは、ガラクトシル化糖タンパク質のエンドサイトーシスのため のレセプターとして機能し（Ozakiら（1992）J ．Biol．Chem．2679229-9235）、 そして腫瘍破壊性マクロファージによる悪性細胞の認識を可能にする（Kawakami ら（1994）Jpn ．J．Cancer Res．85:744-749）。これに関して、マウスM-ASGPR が、OV2944-HM-1転移性卵巣腫瘍細胞（Imaiら（1995）Immunol ．86:591-598）を 有するマウスの肺転移性小節内で発現することを見いだした。興味深いことに、 ヒトM-ASGPRは、Tn抗原（Suzukiら（1996）J ．Immunol．156:128-135）に対する 著しい特異性を示し、これはセリンまたはトレオニン結合した末端GalNAcのクラ スターを有し、そしてヒトガン腫に関連する（Springer（1989）Mol ．Immunol． 配列相同性に基づいて、DCMPがまた、ガラクトシル化糖タンパク質についての エンドサイトーシスレセプターとして機能することが予測され得る。さらに、も う１つのC-タイプ膜貫通エンドサイトーシスレクチンである、マンノースレセプ ターによるリガンドインターナリゼーションは、MHCクラスII経路を介してDCに よって非常に効率的な抗原提示を生じる。Cellaら（1997）Current Opinion Imm unol ． 9:10-16。類推によって、DCMPが、抗原提示経路にインターナライズした リガンドを送ることに類似の役割を果たすことが可能である。 従って、DCMP2は、免疫ベースのアジュバント治療においてＴ細胞に対する提 示を増強するために、DCに抗原をロードするための潜在的な高い効率の標的であ り得る。これを、抗原のガラクトシル化形態で、または抗原にカップリングした 抗DCMP2 mAbでのいずれかで、インビトロでDCをパルスすることによって、アプ ローチし得る。提示のインビトロ効率を、抗原特異的Ｔ細胞の活性化によってア ッセイし得る。これは、このようなアプローチの本来の治療展望のため、腫瘍関 連抗原（TAA）の提示に焦点を集める。悪性黒色腫と関連するTAAが、特に重要で ある。 さらに、Tn抗原に対するヒトM-ASGPRの特異性は、このガン腫TAAを、DCMP2を 標的するための選択の候補にする。 外因性抗原がプロセシングされ、そしてMHCクラスＩ経路で提示され得ること が、最近示されている。PorgadorおよびGilboa（1995）J ．Exp．Med．182:255-2 60；Pagliaら（1996）J ．Exp．Med．183:317-322を参照のこと。特定化されたレ セプターは、DCにおいてこのような機能を行うようである。 CTLが腫瘍拒絶の誘導に関連するようであるので、DCにおけるこれらのレセプ ターは、著しい治療可能性を有する、TAA特異的細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）を産生 することを助けることが引き起こされ得る。 XVI．DCMPインターナリゼーション GM-CSFおよびTNFa中で培養したCD34+前駆細胞から得られたDCを、抗DCMP2 mAb で、またはコントロールとして抗CD13で、４℃にて染色した。その後の37℃にて 約20分までの期間インキュベーション後、細胞表面結合したmAbを分析した。イ ンターナリゼーションを、細胞表面蛍光の減少によって観察した。 DCMP21は、37℃で迅速にインターナライズするが、４℃ではしない。約60％の 表面標識は、約15分以内に消失した。これは、DCMP2が、細胞質内ドメインにお いてインターナライゼーションモチーフ（YENF）の存在に一致する、エンドサイ トーシスレセプターとして機能し得ることを証明する。 XVII．結合対応物の単離 DCタンパク質は、結合の特異性を利用することによって、特異的結合試薬とし て使用され得、同様に抗体が使用される。結合試薬は、例えば、蛍光などで上記 のように標識されるか、またはパンニング方法のための基材に固定されるかのい ずれかである。 DCタンパク質を使用して、結合を示す細胞株についてスクリーニングする。標 準的染色技術を使用して、細胞内または表面発現したリガンドを検出またはソー トし、あるいは表面発現する形質転換した細胞を、パンニングによってスクリー ニングする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色または免疫蛍光手順に よって行う。McMahanら（1991）EMBO J ．10:2821-2832も参照のこと。 例えば、０日目に、2-チャンバーpermanoxスライドを、チャンバー当たり1ml のフィブロネクチン、PBS中10ng/mlで、室温にて30分間プレコーティングする。 PBSで１回リンスする。次いで、1.5mlの増殖培地中チャンバー当たり2〜3×10⁵ 細胞でCOS細胞をプレーティングする。37℃にて一晩インキュベートする。 各試料について１日目に、無血清DME中、66mg/ml DEAE-デキストラン、66mMク ロロキン、および4mg DNAの0.5mlの溶液を調製する。各セットについて、例えば 、1および1/200希釈でヒトレセプター-FLAG cDNAのポジティブコントロール、お よびネガティブモックを調製する。無血清DMEで細胞をリンスする。DNA溶液を添 加し、そして37℃にて５時間インキュベートする。培地を取り出し、そしてDME 中の0.5ml 10％DMSOを2.5分間で添加する。培地を取り出しそしてDMEで１回洗浄 する。1.5ml増殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。 ２日目に、培地を交換する。3または4日目に、細胞を固定し染色する。ハンク ス緩衝化生理食塩溶液（HBSS）で細胞を２回リンスし、そして４％パラホルムア ルデヒド(PFA)/グルコース中で５分間固定する。HBSSで３回洗浄する。すべての 液体を除去した後、スライドを−80℃にて貯蔵し得る。各チャンバーについて、 0.5mlインキュベーションを以下のように行う。HBSS/サポニン(0.1％)を32ml/ml の1M NaN₃とともに20分間で添加する。次いで、細胞をHBSS/サポニンで１回洗浄 する。タンパク質またはタンパク質／抗体複合体を細胞に添加し、そして30分間 インキュベートする。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。適切ならば、最初 に抗体を30分間で添加する。二次抗体、例えば、ベクター抗マウス抗体を、1/20 0希釈で添加し、そして30分間インキュベートする。ELISA溶液、例えば、Vector Elite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を調製し、そして30分間プレインキ ュベートする。例えば、2.5ml HBSS/サポニン当たり、１滴の溶液Ａ（アビジ ン）および１滴の溶液Ｂ（ビオチン）を使用する。HBSS/サポニンで細胞を２回 洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、そして30分間インキュベートする。HBSSで細 胞を２回洗浄し、２分間第２の洗浄をし、細胞の間をつめる。次いで、ベクター ジアミノ安息香酸（DAB）を5〜10分間添加する。5mlのガラス蒸留した水当たり ２滴の緩衝液＋４滴のDAB+２滴のH₂O₂を使用する。チャンバーを注意深く取り出 し、そして水でスライドをリンスする。2〜3分間空気乾燥し、次いで１滴のCrys tal Mountおよびカバースリップを添加する。85〜90℃で５分間焼成する。 あるいは、他の単球タンパク質特異的結合試薬を使用して、レセプターを発現 する細胞をアフィニティー精製またはソーティングする。例えば、Sambrookらま たはAusubelらを参照のこと。 他のストラテジーは、パンニングによって膜結合レセプターについてスクリー ニングすることである。レセプタ−cDNAを、上記のように構築する。リガンドを 固定し、そして発現する細胞を固定するために使用し得る。固定は、例えば、単 球タンパク質融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体の使用によって、また は第１の抗体に対して惹起した抗体の使用によって、達成され得る。選択および 増幅の繰り返しサイクルは、適切なクローンの富化およびリガンド発現クローン の最終的単離を導く。 ファージ発現ライブラリーを、単球タンパク質によってスクリーニングし得る 。適切な標識技術、例えば、抗FLAG抗体は、適切なクローンの特異的標識付けを 可能にする。 本発明の多くの改変および変更は、当業者には明らかであるので、本発明の意 図および範囲から逸脱せずに行われ得る。本明細書に記載の特定の実施例は、例 示の目的でのみ提供され、そして本発明は、このような請求の範囲が権利を与え られるものと等価の完全な範囲とともに、添付の請求の範囲によってのみ限定さ れるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，Ｉ Ｄ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ベイツ，エリザベス エスサー メアリー フランス国 エフ―69001 リヨン，リュ テルム 13 (72)発明者 フォード，ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94304, パロ アルト，オーク クリーク ドライ ブ ナンバー 402 1380 (72)発明者 サエランド，セム フランス国 エフ―69005 リヨン，リュ ソアズ ブービエ ６ (72)発明者 レベーク，セルグ ジェイ．イー. フランス国 エフ―69380 シビリューク ス ドゥアゼーグ，ケミン ドゥ マラン ド 514

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号２または８と少なくとも約85％配列同一性を示す、実質的に純粋 または組換えDCMP1ポリペプチド。 ２．実質的に純粋または組換えDCMP2ポリペプチドであって、以下： ａ）以下： １）Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro（配列番号４ の残基118〜144）； ２）Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys（配列番号４の残基166〜181）；または ３）Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Gly Leu Gly （配列番号４の残基263〜277）； から選択されるポリペプチド、あるいは、 ｂ）以下の両方： １）配列番号10に記載のようなDCMP2からの少なくとも17の連続するア ミノ酸；および ２）FKNGPLPLQS LLQRLRWGPC HLLLWLGLGLLLLVIIC（配列番号４の残基20 〜56）からの少なくとも１２の連続するアミノ酸のセグメントの欠 損 を示す配列、 を含む、ポリペプチド。 ３．請求項１または２に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。 ４．請求項１または２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、結合化合物 。 ５．抗体または抗体フラグメントである、請求項４に記載の結合化合物。 ６．請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、核酸。 ７．請求項６に記載の核酸を含む、発現ベクター。 ８．請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。 ９．ポリペプチドを組換え産生するためのプロセスであって、該プロセスが該 ポリペプチドが発現される条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養する工程を 包含する、プロセス。