KR20010021597A - 분리된 덴드라이틱 세포막 단백질 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 영장류를 포함하는 포유동물로부터 다양한 임파구 세포 단백질을 암호화하는 핵산, 특이적인 항체를 포함하는 이와 관련된 시약, 및 정제된 단백질에 관한 것이다. 상기 시약 및 관련 진단 키트를 사용하는 방법을 또한 제공한다. 상기 단백질은 렉틴 및 무시알로당단백질 수용체와 유사성을 갖는 덴드라이틱 세포 막 단백질(DCMP)이다.

Description

분리된 덴드라이틱 세포막 단백질 유전자 {Isolated dendritic cell membrane protein genes}

본원은 1997년 7월 9일에 출원된 미국 가출원 제60/053,080호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본원에 참조로 인용된다.

포유동물 순환계의 순환성 성분은 적혈구 발육계 및 골수 세포 발육계 세포계통의 적혈구 및 백혈구 세포를 포함하는 다양한 세포 유형을 포함한다. 문헌 참조[예를 들어, Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2d ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA; and Paul(ed.) (1993) Fundamental Immunology (3d ed.) Raven Press, N.Y.].

덴드라이틱 세포(dendritic cell, DC)는 항원-가공 또는 항원-제시 세포이며, 체내 모든 조직에서 발견된다. 문헌 참조[Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9:271-296; and Banchereau and Schmitt(eds. 1994) Dendritic cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY]. 이러한 DC는 심장, 신장, 내장 및 폐의 간질의(interstitial) 덴드라이틱 세포; 피부 및 점막에서의 랑게르한스 세포; 흉선 수질부 및 제2 유임파구 조직에서의 지상 구조의(interdigitating) 덴드라이틱 세포; 및 혈액 및 림프 덴드라이틱 세포를 포함하는, 다양한 부류로 분류할 수 있다. 비록 이러한 각각의 구획들에서 덴드라이틱 세포는 골수로부터 명백하게 생성되는 CD45+ 백혈구이지만, 이들은 성숙 상태 및 미세환경과 관련하여 상이점을 나타낼 수 있다.

이러한 덴드라이틱 세포는 효과적으로 가공되어 예를 들어, T 세포에 항원을 제시할 수 있다. 이들은 자극받은 적이 없는 기억 T 세포로부터의 반응을 촉진시킨다.

제1 및 제2 B-세포 소포들은 장시간 동안 면역 복합체로서 온전한 항원을 가두어 보유하는 소포성 덴드라이틱 세포를 함유한다. 이러한 덴드라이틱 세포는 B 세포에 천연 항원을 제시하며 항체의 유사 성숙, 면역 기억의 생성, 및 체액성 면역 반응에 관여하는 것으로 보인다.

단핵 세포는 단핵 식세포계에 속하며 순환계에 존재하는 식세포성 세포이다. 문헌 참조[Roitt (ed) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego]. 이러한 세포는 골수에서 기원하며 일단 분화되면 골수 구획내에는 아주 짧은 시간 동안만 잔존한다. 이후 이들은 순환계로 들어가 상대적으로 긴 시간, 예를 들면, 수 일간 순환계에 잔류할 수 있다. 단핵 세포는 삼출(diapedesis)이라고 불리는 과정을 통해 조직 및 체강으로 들어갈 수 있으며, 이때, 이들은 대식세포 및 가능하게는 덴드라이틱 세포로 분화된다. 염증 반응에서, 순환계 중 단핵 세포의 수는 배가될 수 있으며, 증가된 단핵 세포 중 다수가 염증 부위로 삼출된다.

항원 제시(antigen presentation)는 단백질성 항원이 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의해 흡수되어 가공되면, 인식되어 면역 반응을 개시하게 하는 세포성 사건을 의미한다. 가장 활성적인 항원 제시 세포는 대식 세포로서 특성화되었으며, 이는 단핵 세포; 덴드라이틱 세포; 및 특정 B 세포로부터의 직접적인 발생학적 생성물이다.

대식 세포는 대부분의 조직에서 발견되며 광범위하게 다양한 단백질 항원 및 미생물의 내재화(internalization)에서 활성이 높다. 이들은 식세포 활성이 매우 발달해 있으며 면역 반응의 개시에 중요한 수 많은 생성물을 분비한다. 이러한 이유로 인해, 단핵 세포에 의해 발현되거나 단핵 세포 활성화에 의해 유도되는 수 많은 유전자들이 항원 흡수, 가공, 제시 또는 결과적인 면역 반응에서 중요할 것으로 사료된다.

그러나, 덴드라이틱 세포 및 단핵 세포는 이들이 발현하는 단백질 및 이들의 활성화 상태를 포함하는 수 많은 기능과 작용 메카니즘의 두 가지 측면 모두에서 거의 특성화되어 있지 않다. 특히, 항원 가공 및 제시를 포함하는, 면역 반응의 개시와 관련된 과정 및 메카니즘은 여전히 불명확하다. 이러한 세포에 대한 구조적, 생물학적, 및 생리학적 특성에 대한 지식의 부족으로 이들에 대한 이해가 제한적이다. 따라서, 항원 제시 세포의 조절, 발생 또는 생리학이 비정상적인 의학적 상태는 여전히 다루기 어렵다.

발명의 요약

본 발명은 부분적으로는, 특정한 DCMP1 및 DCMP2 양태에 의해 예증되는 다양한 포유동물 덴드라이틱 세포막 단백질(DCMP) 유전자의 발견에 기초한다. 분포 데이터는 보다 넓은 세포성 분포를 나타내며, 구조 데이터는 특정 기능을 제시한다. DCMP1은 렉틴 및 무시알로당단백질 수용체(asialoglycoprotein receptor)의 부류와 유사성을 나타낸다. 기술된 DCMP2 양태는 대식 세포 무시알로당단백질 수용체와 유의한 서열 유사성을 나타낸다. 본 발명은 유전자 생성물의 효능제 및 길항제, 예를 들면, 천연 서열의 돌연변이(뮤테인, mutein), 융합 단백질, 화학적 유사체, 항체 및 기타 구조적 또는 기능적 동족체를 포함한다. 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 분리된 유전자에 관한 것이다. 이러한 상이한 단백질 또는 핵산 조성물의 다양한 용도가 또한 제공된다.

특정 양태들에서, 본 발명은 DCMP1 단백질; 또는 Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro(서열 4의 118 내지 144번 잔기들); Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys(서열 4의 166 내지 181번 잔기들); 또는 Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Gly Leu Gly(서열 4의 263 내지 277번 잔기들)에 특이적으로 결합하는 항체 결합 부위를 포함하는 결합 화합물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 결합 화합물에서, 항체 결합 부위는 서열 2 또는 서열 8의 단백질과 특이적으로 면역 반응성이거나; 서열 4의 118 내지 144번 잔기의 단백질과 특이적으로 면역 반응성이거나; 정제된 또는 재조합적으로 생성된 사람 DCMP1 단백질에 대해 생성되거나; 서열 4의 118 내지 144번 잔기의 서열을 포함하는 정제된 또는 재조합적으로 생산된 사람 단백질에 대해 생성되거나 ; 모노클로날 항체, Fab, 또는 F(ab)₂내에 존재하거나; 결합 화합물은 검출 가능하게 표지되거나; 멸균되거나 완충된 조성물 형태이다.

본 발명은 결합 화합물을 항원을 포함하는 생물학적 샘플과 접촉시켜 결합 화합물:항원 복합체를 형성함을 포함하는, 결합 화합물을 이용하는 방법을 포함한다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 사람이며, 결합 화합물은 항체이다. 본 발명은 또한 상기 결합 화합물 및 검출용으로 상기 결합 화합물을 사용하는 지침서를 포함하는 검출 키트; 또는 결합 화합물의 분리를 제공하는 구획을 제공한다.

본 발명은 또한 실질적으로 순수한 또는 분리된 폴리펩타이드를 제공하며, 이는 특이적으로 상기 결합 화합물에 결합한다. 다양한 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 영장류 DCMP1 단백질로부터의 14개 이상의 아미노산 잔기의 단편 하나 이상을 포함하고; 서열 4의 118 내지 144번의 14개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고; 가용성 폴리펩타이드이고; 검출 가능하게 표지되며; 살균된 조성물 형태이고; 시알산 잔기에 결합하며; 재조합적으로 생산되거나, 천연 폴리펩타이드 서열을 가진다.

정제하는 경우, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 핵산 양태가 제공된다. 종종, 상기 핵산은 서열 1 또는 7의 암호화 부분의 30개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나; 서열 3의 608 내지 688번 뉴클레오타이드로부터의 30개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나; 서열 3의 752 내지 799번 뉴클레오타이드로부터의 30개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나; 상기 정의된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 선택적으로 하이브리드화하는 삽입체를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 핵산으로 형질감염시킨 세포를 제공하며, 예를 들면, 이는 서열 1, 서열 7의 단백질 암호화 부분, 또는 서열 3의 적합한 부분으로 이루어진다.

본 발명은 샘플에 상기 쇄를 접촉시켜 상보적인 쇄가 특이적으로 하이브리드화할 수 있게 하는 단계를 포함하는, 상기 핵산의 하나 이상의 쇄를 사용하여 이량체 핵산을 형성하는 방법을 제공하다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 이량체의 검출을 가능하게 하거나, 이량체의 조직학적 위치화를 가능하게 한다.

대안으로, 본 발명은 결합 조성물을 샘플과 접촉시켜 결합 조성물:항원 복합체를 형성하게 하는 단계를 포함하는, 기술된 결합 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 샘플은 체액을 포함하는 생물학적 샘플이며 항원은 세포 상에 있거나, 항원은 추가로 정제된다.

본 발명은 추가로 폴리펩타이드를 샘플에 접촉시켜 결합 조성물:폴리펩타이드 복합체를 형성시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 추가로 정제된다.

제공되는 또 다른 방법은 세포를 기술된 바와 같은 결합 조성물; 기술된 바와 같은 DCMP1 단백질; 또는 기술된 바와 같은 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 덴드라이틱 세포의 생리학 또는 기능을 조절하는 방법이다. 상기 기능은 또한 면역 반응의 개시 또는 진행을 초래할 수 있다. 전형적으로, 상기 접촉은 세포 표면 항원, MHC I형 항원, 또는 MHC II형 항원을 포함하는, 항원과의 혼합물내에서 수행된다.

본 발명은 임파구, 예를 들어, 면역계에서 기능하는 세포들에서 발견되는 유전자들과 관련된 조성물에 관한 것이다. 이러한 유전자들은 마커(marker)로서 유용하며, 포유동물 면역계의 발생, 분화, 및/또는 생리학의 조절에서 기능할 수 있다. 특히, 본원은 핵산, 단백질, 항체 및 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

본원에서 인용하는 모든 참조 문헌은 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 실제로 이의 전문이 참조 문헌으로서 구체적으로 및 개별적으로 삽입되는 것과 같은 정도로 본원에서 인용된다.

I. 개요

본 발명은 덴드라이틱 세포(DC)에서 발현되는 포유동물 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 제공한다. 덴드라이틱 세포에 대한 개략을 위해서, 문헌 참조[Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9: 271-296; and Banchereau and Schmitt(eds. 1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY]. 상기 단백질들은 덴드라이틱 세포 단백질로 불리며 이들이 이들 세포에서 발견되었고 이의 발현에 있어서 일부 특이성을 나타내는 것으로 보이기 때문이다.

이러한 단백질의 특정 영장류, 예를 들면, 사람 양태는 하기에서 제공한다. 설치류, 예를 들면, 마우스에서 상응하는 단백질이 또한 존재한다. 하기 기술들은 예증을 위한 목적으로 사람 DC 유전자에 관한 것이지만, 다형성 변이체 또는 개체 변이체를 포함하는 기타 공급원 또는 포유동물 종으로부터의 구조적으로(예를 들면, 서열) 관련된 양태들에 마찬가지로 적용할 수 있다. 이들은 예를 들면, 상대적으로 낮은 서열 변화, 예를 들면, 약 5% 미만의 서열 변화를 나타내며 수적으로, 20개 미만의 잔기 치환, 전형적으로는 15개 미만, 바람직하게는 10개 미만, 및 보다 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개를 포함하는 5개 미만의 치환을 나타내는 단백질들을 포함한다. 이들은 또한 기술된 바와 같이, 전장(full length)으로부터 말단 절단된 형태, 및 이들 서열의 실질적인 분절을 함유하는 융합 단백질을 포함한다.

II. 정의

용어 "결합 조성물"은 예를 들면, 항원-항체 상호작용에서 이러한 DC 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 기타 화합물, 예를 들면, 단백질들도 또한 개별적인 단백질과 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적으로, 특이적인 결합은 자연적인 생리학적으로 관련된, 공유 결합적 또는 비공유 결합적 단백질-단백질 상호작용에 속하며, 담체 화합물 또는 이량화 상대를 포함하는, 다중 단백질 복합체의 구성원들을 포함할 수 있다. 분자는 중합체, 또는 화학제일 수 있다. 기능성 동족체는 구조적 변형을 가진 단백질일 수 있거나, 완전히 무관한 분자일 수 있으며, 이는 예를 들면, 적합한 상호작용성 결정 인자와 상호작용하는 분자 형태를 갖는다. 변이체들은 단백질의 효능제 또는 길항제로 작용할 수 있다[예를 들면, 참조: Goodman et al.(eds)(1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.].

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합제:DC 단백질 복합체"는 결합제와 DC 단백질의 복합체를 의미한다. 결합제의 특이적인 결합은 결합제가 개별적인 DC 단백질 상에서 한 부위를 인식하는 특이적인 결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들면, DC 단백질에 대해 생성되어 DC 단백질 상에서 에피토프를 인식하는 항체는 특이적인 결합에 의해 항체:DC 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 전형적으로, 결합제:DC 단백질 복합체의 형성은 기타 단백질 및 생물제(biologics)의 혼합물 중에서 DC 단백질의 측정을 가능하게 한다. 용어 "항체:DC 단백질 복합체"는 결합제가 항체인 결합제:DC 단백질 복합체를 의미한다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 예를 들면, Fv, Fab, 또는 Fab2 단편을 포함하는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.

비교시, "상동성" 핵산 서열은 유의한 유사성을 나타낸다. 핵산에서 상동성의 표준 방법은 서열 비교 및/또는 하이브리드화 조건에 기초한 계통발생학적 상관관계를 통한 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 상동성 측정이다. 서열 비교 및 하이브리드화 조건을 위한 알고리듬 모두는 하기에서 보다 상세히 기술된다.

"분리된" 핵산은 핵산, 예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합된 중합체이며, 이는 기원 종으로부터의 천연적으로 이를 수반하는 기타 성분들, 예를 들면 단백질 및 인접 게놈성 서열로부터 실질적으로 분리된다. 상기 용어는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하며 재조합 또는 클론된 DNA 분리체 및 화학적으로 합성된 동족체 또는 이형 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 동족체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분자의 분리된 형태를 포함한다. 분리된 핵산은 일반적으로 분자의 균일한 조성물이지만, 특정 양태에서는, 소량의 이종 성분을 함유한다. 이러한 이종 성분은 전형적으로 중합체의 말단부 또는 일부에서 발견되지만 바람직한 생물학적 기능 또는 활성에 중요하지는 않다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DCMP1 단백질"은 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 서열 2 또는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 상기 단백질의 유의한 단편을 포함한다. 이는 개별적인 DCMP1 단백질 특이적인 결합 성분과 상호작용하는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 결합 성분들 예를 들면, 항체는 전형적으로 높은 친화도, 예를 들면, 약 100nM 이상, 일반적으로는 약 30nM 이상, 보다 바람직하게는 약 10nM 이상, 및 보다 더 바람직하게는 약 3nM 이상의 친화도로 DCMP1 단백질에 결합한다.

용어 "DCMP2 형태"는 서열 4 및 서열 10에서 제공되는 서열을 의미한다. 영장류, 예를 들면, 사람의 렉틴/무시알로당단백질 패밀리 구성원과 관련되며 덴드라이틱 세포 라이브러리로부터 분리된 DCMP2로 명명된 단백질의 뉴클레오타이드 및 상응하는 아미노산 서열이 서열 3 및 서열 4에서 제공된다. 긴 형태로 나타낸 반면, 짧은 형태는 118 내지 144번 잔기에 상응하는 서열이 결핍되어 있다. 상기 짧은 형태는 또한 1064번 뉴클레오타이드에서 상이할 수 있다. 이는 173 및 174번 사이 및 270번 잔기에서 삽입(표 1 참조), 및 775 및 776번 뉴클레오타이드 사이에서 GEE를 암호화하는 서열 삽입체에 의해 상이해 지는 ASGPR의 단핵 세포 형태에 관한 것이다. 또 다른 변이체 형태는 서열 9 및 서열 10에서 기술된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 상기 단백질의 유의한 단편 또는 분절을 포함하며, 약 8개 이상의 아미노산, 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산, 보다 일반적으로 약 12개 이상의 아미노산, 종종 약 14개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 16개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 18개 이상의 아미노산, 보다 전형적으로 약 20개 이상의 아미노산, 통상적으로 약 22개 이상의 아미노산, 보다 통상적으로 약 24개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 26개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 28개 이상의 아미노산, 및 특히 바람직한 양태에서, 약 30개 이상, 예를 들면, 35, 40, 45, 50, 60, 70개 이상 등의 아미노산 잔기의 길이를 포함한다.

바람직한 양태는 복수의 독특한, 예를 들면, 비 중복성의 특이적인 길이의 분절을 나타낸다. 전형적으로, 상기 복수는 2개 이상, 보다 일반적으로 3개 이상, 및 바람직하게는 5, 7, 또는 그 이상의 갯수일 것이다. 최소 길이가 제공되는 반면, 다양한 크기의 보다 긴 길이, 예를 들면 7개 길이 하나, 및 12개 길이 두 개가 적합할 수 있다. 분절은 펩타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다.

"재조합" 핵산은 전형적으로 이의 구조로서 정의된다. 이는 천연적으로는 서로 인접하지 않는 두 개의 단편의 융합체를 포함하는 서열을 생성시킴으로써 제조된 핵산일 수 있지만, 자연 생성물, 예를 들면, 자연 돌연변이체 형태는 배제됨을 의미한다.

특정 형태는 제조 방법에 의해 정의된다. 그런, 예를 들면, 가공에 의해 제조된 생성물에 있어서, 가공은 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열에 대한 사람의 개입, 전형적으로는 선택 또는 생성과 관련되는 재조합 핵산 기술을 이용하는 것이다.

따라서, 본 발명은 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드 가공법을 사용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산, 및 이러한 단백질을 암호화하는 비-천연 벡터를 사용하여 세포를 형질전환시켜 제조한 생성물을 포함한다. 이는 종종 동일하거나 보존적인 아미노산을 암호화하는 여분의 코돈으로 코돈을 교체시켜 수행하지만, 전형적으로는 예를 들면, 제한 효소의 서열 인식 부위를 도입하거나 제거함으로써 수행한다. 대안으로, 바람직한 기능의 핵산 분절들을 함께 결합시켜 시판중인 자연형에서는 발견되지 않는 바람직한 기능의 혼합물을 포함하는 단일 유전적 실체를 생성시켜 수행한다. 제한 효소 인식 부위는 종종 상기 인공 조작의 표적이 되지만, 기타 부위 특이적인 표적, 예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 조정 서열, 또는 기타 유용한 특성, 예를 들면 프라이머 분절들이 디자인되어 삽입될 수 있다. 유사한 개념이 재조합, 예를 들면, 융합 폴리펩타이드에 대해 의도된다. 구체적으로, 코돈 축퇴성에 의해, 이러한 항원 단편에 유사한 폴리펩타이드 및, 다양한 상이한 종 변이체로부터의 서열 융합체를 암호화하는 합성 핵산이 포함된다.

"용해도"는 스베드베리 단위(Svedberg unit)로 측정되는 침강으로 반영되며, 상기 단위는 특정 조건하에서 분자의 침강 속도를 측정하는 것이다. 침강 속도의 측정은 전통적으로 분석적인 한외 원심분리로 수행되었지만, 현재는 전형적으로 표준 한외 원심분리로 수행한다. 문헌 참조[Freifelder (1982) Physical Biochemistry(2d ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry parts 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA]. 조 측정으로서, 추정적으로 가용성인 폴리펩타이드를 함유하는 샘플을 약 50K rpm으로 표준 보통 크기의 한외 원심분리기에서 약 10분 동안 회전시키면, 가용성 분자는 상등액에 잔류하게 된다. 가용성 입자 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 약 30S 미만, 보다 전형적으로 약 15S 미만, 일반적으로 약 10S 미만, 보다 일반적으로 약 6S 미만이며, 특정 양태에서, 바람직하게는 약 4S 미만, 보다 바람직하게는 약 3S 미만이다. 폴리펩타이드 또는 단편의 용해도는 환경 및 상기 폴리펩타이드에 의존한다. 수 많은 변수들이 폴리펩타이드 용해도에 영향을 미치며, 이에는 온도, 전해질 환경, 크기 및 폴리펩타이드의 분자 특성, 및 용매의 특성이 포함된다. 전형적으로, 폴리펩타이드가 사용되는 온도는 약 4℃ 내지 65℃의 범위이다. 일반적으로 사용되는 온도는 약 18℃ 이상이며 보다 일반적으로 약 22℃ 이상이다. 진단 목적에 있어서, 온도는 일반적으로 약 실온 내지 그 이상이지만, 분석에 있어서는 성분의 변성 온도 미만이다. 치료 목적에 있어서, 온도는 일반적으로 체온, 전형적으로 사람에 있어서 약 37℃이지만, 특정 상황하에서는 원위치 또는 시험관내에서 승온 또는 감온될 수 있다.

폴리펩타이드의 크기 및 구조는 일반적으로 실질적으로 안정한 생리학적으로 활성인 상태이어야 하며, 일반적으로 변성된 상태는 아니어야 한다. 상기 폴리펩타이드는 4차 구조에서 기타 폴리펩타이드와 결합되어 용해도를 줄 수 있거나, 거의 천연 지질 이중층이 상호작용하는 방식으로 지질 또는 세척제와 결합된다.

용매는 일반적으로 생물학적 활성의 보존을 위해 사용되는 유형의 생물학적으로 양립할 수 있는 완충액이며, 일반적으로 거의 생리학적 용매이다. 일반적으로 용매는 중성 pH, 전형적으로 약 5 내지 10 사이, 바람직하게는 약 7.5이다. 특정의 경우에, 세척제, 전형적으로 온화한 비-변성 세척제, 예를 들면, CHS(콜레스테릴 헤미석시네이트) 또는 CHAPS(3-([3-콜아미도프로필]디메틸-암모니오)-1-프로판 설포네이트)가 단백질의 구조 또는 생리학적 특성의 심각한 파괴를 회피할 정도로 충분히 낮은 농도로 부가된다.

"실질적으로 순수한"이란 전형적으로, 단백질이 최초의 공급원 유기체로부터 유도된 기타 오염성 단백질, 핵산, 또는 기타 생물제로부터 분리됨을 의미한다. 정제, 또는 "분리"는 표준 방법, 전형적으로 중량으로 분석될 수 있으며, 통상적으로 약 50% 이상, 보다 통상적으로 약 60% 이상, 일반적으로 약 70% 이상, 보다 일반적으로 약 80% 이상, 종종 85% 이상, 보다 종종 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상 정제되며, 특정 바람직한 양태에서, 약 99% 이상 순수하다. 담체 또는 부형제가 종종 부가되며, 상기 제형은 살균되거나 완충액 성분을 포함할 수 있다.

핵산 서열 비교 내용에서 "실질적인 유사성"이란 분절, 또는 이의 상보성 쇄가 비교시 최적으로 배열시키는 경우 적합한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실과 함께, 뉴클레오타이드 약 50% 이상, 일반적으로 약 56% 이상, 보다 일반적으로 약 59% 이상, 평범하게는 약 62% 이상, 보다 평범하게는 약 65% 이상, 종종 약 68% 이상, 보다 종종 약 71% 이상, 전형적으로 약 74% 이상, 보다 전형적으로 약 77% 이상, 통상적으로 약 80% 이상, 보다 통상적으로 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95 내지 98% 이상 동일하며, 특정 양태에서, 약 99% 또는 그 이상 정도의 뉴클레오타이드가 동일하다. 대안으로, 실질적인 유사성은, 분절들을 선택적인 하이브리드화 조건하에서 전형적으로 서열 1 또는 7, 또는 3 또는 9의 적합한 부분으로부터 유도된 서열을 사용하여 한 쇄 또는 이의 상보체에 하이브리드화될 때, 존재한다. 전형적으로, 선택적인 하이브리드화는, 약 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이에 대해 약 55% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이에 대해 약 65% 이상의 유사성, 및 보다 바람직하게는 약 75% 이상의 유사성, 및 가장 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오타이드에 대해서 약 90% 이상의 유사성이 존재하는 경우에 일어난다. 문헌 참조[Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213]. 상기한 바와 같이, 유사성 비교의 길이는 보다 더 긴 길이에 대해서도 가능하며, 특정 양태에서, 약 17개 이상의 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 일반적으로 약 24개 이상의 뉴클레오타이드, 전형적으로 약 28개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 전형적으로 약 40개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오타이드, 및 보다 바람직하게는 약 75 내지 100개 이상 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 대한 것이다. DCMP1에 대한 비교의 측정은 DCMP2 양태에 대한 비교 측정에 영향을 미치지 않는다.

하이브리드화 내용에서 상동성 또는 실질적인 유사성에 있어서, "엄격한 조건"이란 전형적으로는 하이브리드화 반응에서 조절되는 염, 온도, 유기 용매, 및 기타 변수들의 엄격한 혼합된 조건이다. 변수들의 혼합은 임의의 단일 변수의 측정보다 보다 중요하다. 문헌 참조[예를 들면, Wetmur and Davison (1968) J. Nol. Biol. 31:349-370]. 엄격한 조건하에서 표적 핵산에 결합하는 핵산 프로브는 상기 표적 핵산에 대해 특이적이다. 이러한 프로브는 전형적으로 11개 이상의 뉴클레오타이드 길이이며, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표적에 결합하는 프로브의 서열에 의해 구체화되는 영역 상에서 표적 핵산에 충분히 동일하거나 상보적이다.

기타 포유동물 종으로부터의 상응하는 DCMP 단백질들이 밀접하게 연관된 종들의 교차-종 하이브리드화에 의해 클로닝되고 분리될 수 있다. 하기 참조. 유사성은 유연관계가 먼 종들 사이에서는 상대적으로 낮을 수 있으며, 따라서 상대적으로 유연관계가 가까운 종들의 하이브리드화가 바람직하다. 대안으로, 보다 낮은 종 특이성을 나타내는 항체 제제의 제조는 발현 클로닝 방법에서 유용할 수 있다.

단백질 또는 펩타이드와 관련하여 구 "특이적으로 항체에 결합한다" 또는 "~와 특이적으로 면역반응하는"이란 단백질의 이형 집단 또는 기타 생물학적 성분들의 존재하에서 특정 단백질 존재의 결정 인자가 되는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지명된 면역 분석 조건하에서, 특정화된 항체는 특정 단백질에 결합하며 샘플 중에 존재하는 기타 단백질에는 유의하게 결합하지 않는다. 상기 조건하에서 항체에 대한 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 이의 특이성을 위해 선택된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 서열 2 또는 8에 나타낸 아미노산 서열을 사용하여 사람 DCMP1 단백질 면역원에 대해 생성된 항체는 DCMP 단백질과 특이적으로 면역 반응하지만 기타 단백질과는 반응하지 않는 항체를 수득하기 위해서 선택될 수 있다. 이러한 항체는 상동성 사람 DCMP1 단백질과 매우 유사한 단백질들을 인식한다.

III. 핵산

이러한 DCMP 유전자들은 덴드라이틱 세포에서 선택적으로 발현된다. 기술된 바와 같이, 바람직한 양태들은, 기타 종들, 예를 들면, 조류 또는 포유동물 같은 온혈 동물로부터 유전자를 분리하는 표준 방법에서 유용할 것이다. 교차 하이브리드화는 개체, 균주, 또는 종들로부터 관련 단백질의 분리를 가능하게 한다. 수 많은 상이한 접근법이 본원에서 제공되는 정보에 기초하여 적합한 핵산 클론을 성공적으로 분리하는데 유용하다. 서던 블롯 하이브리드화 연구는 적합한 하이브리드화 조건하에서 기타 종들에서 상동성 유전자를 분리하게 한다.

정제된 단백질 또는 정의된 펩타이드는 하기되는 바와 같이, 표준 방법에 의한 항체 생성에 유용하다. 합성 펩타이드 또는 정제된 단백질을 면역계에 제공하여 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, 본원에 참조로 인용된 Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; and Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY]. 대안으로, DCMP 항원 결합 조성물이 특이적인 결합제로서 유용할 수 있으며, 예를 들면, DCMP 단백질 정제에 있어서, 이의 결합 특이성의 잇점을 취할 수 있다.

특이적인 결합 조성물은 각각의 DCMP 단백질을 발현하는 세조주로부터 제조된 발현 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 수 많은 스크리닝 방법, 예를 들면, 표면 발현된 리간드의 표준 염색법, 또는 패닝(panning)에 의해 유용하다. 세포내 발현의 스크리닝은 또한 다양한 염색법 또는 면역형광 방법으로 수행할 수 있다. 결합 조성물은 항원 발현 세포를 친화도 정제 또는 분류하는데 사용할 수 있다.

영장류, 예를 들면 사람 렉틴/ASGPR 패밀리 구성원의 배열. [ASGPRh1 및 ASGPRh2는 간의 무시알로당단백질 수용체이고(서열 5 및 6 참조); ASGPRm은 대식 세포 유래된 ASGPR이고; DCMP2는 짧거나 길며 변형체 형태이며(서열 4 및 10); DCMP1은 서열 2 및 8에 나타낸다]

서열 분석은 이러한 DCMP들이 수용체의 렉틴/무시알로당단백질 슈퍼패밀리의 구성원임을 제시한다. 펩타이드 분절은 또한 유사한 유전자, 예를 들면, 동일한 또는 다형성 변이체의 존재를 측정하거나, DC를 확인하기 위해 라이브러리를 스크리닝하는데 적합한 올리고뉴클레오타이드를 디자인하고 생산하는데 사용할 수 있다. 유전자 코드는 스크리닝용 프로브로서 유용한 적합한 올리고뉴클레오타이드를 선택하기 위해서 사용할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술과 혼용하여, 합성 올리고뉴클레오타이드는 라이브러리로부터 바람직한 클론을 선택하는데 유용하다.

상보적인 서열은 또한 프로브 또는 프라이머로서 사용된다. 가능성 있는 아미노 말단의 확인에 근거하여, 기타 펩타이드는 예를 들면, 고정된 벡터 또는 폴리-A 상보적인 PCR 기술, 또는 기타 펩타이드의 상보적인 DNA와 함께 결합하여, 특히 유용하다.

이러한 DC 단백질을 암호화하는 유전자들의 핵산 조작 기술, 예를 들면, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 발현 벡터내로의 서브 클로닝, 표지화 프로브, DNA 하이브리드화 등은 문헌[본원에 참조로 인용되며, 이후 "Sambrook, et al"로 인용되는 Sambrook et al.,(1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual(2nd ed.) Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; 또한 "Coligna, et al"로 인용되는 문헌 참조: Coligan, et al.(1987 and periodic suppliments) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York, NY]에 기술되어 있다.

이러한 DC 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 분리하는 다양한 방법이 있다. 예를 들면, DNA는 본원에 기술된 서열과 동일하거나 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 게놈성 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리된다. 전장 프로브를 사용하거나, 올리고뉴클레오타이드 프로브를 기타 단백질과 함께 기술된 서열의 비교에 의해 생성하여 특정 프라이머를 선택할 수 있다. 상기 프로브는 직접적으로 하이브리드화 분석에서 사용하여 DC 단백질을 암호화하는 DNA를 분리할 수 있으며, 프로브는 DC 단백질을 암호화하는 DNA의 분리를 위해서 PCR 같은 증폭 기술에서 사용하기 위해서 디자인될 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제조하기 위해서, mRNA를 DC 단백질을 발현하는 세포로부터 분리한다. cDNA는 mRNA로부터 제조되며 재조합 벡터내로 연결된다. 벡터는 증식, 스크리닝 및 클로닝을 위해서 재조합 숙주내로 형질감염된다. cDNA를 제조하고 스크리닝하는 방법은 숙지되어 있다. 문헌 참조[Gubler and Hoffman (1983) Gene 25:263-269; Sambrook, et al., or Coligan, et al].

게놈성 라이브러리에 있어서, DNA는 조직으로부터 추출되어 기계적으로 전단되거나 효소적으로 절단되어 약 12 내지 20kb의 단편을 형성시킨다. 이후, 상기 단편들을 구배 원심분리시켜 박테리오파아지 람다 벡터내로 클로닝시킨다. 이러한 벡터 및 파아지는 상기된 바와 같이, 예를 들면 문헌[Sambrook et al., or Coligan et al]에서와 같이 시험관내에서 포장된다. 재조합 파아지는 문헌[Benton and Davis (1977) Science 196: 180-182]에 기술된 바와 같이 플라크 하이브리드화에 의해 분석한다. 콜로니 하이브리드화는 일반적으로 문헌[예를 들면, Grunstein, et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961-3965]에 기술된 바와 같이 수행한다.

DC 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들면, 콜로니 또는 플라크 하이브리드화실험에서 본원에 기술된 핵산 프로브와 함께 하이브리드화되는 능력에 의해 cDNA 또는 게놈성 라이브러리에서 분리될 수 있다. 상응하는 DNA 영역은 당해 분야의 숙련자에게 친숙한 표준 방법으로 분리된다. 문헌 참조[Sambrook, et al].

중합효소 연쇄 반응 같은 표적 서열을 증폭시키기 위한 다양한 방법들이 DC 단백질을 암호화하는 DNA를 제조하는데 또한 사용될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 mRNA로부터, cDNA로부터, 및 게놈성 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접적으로 상기 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. DC 당백질을 암호화하는 분리된 서열은 또한 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용할 수 있다.

PCR 기술에서, 증폭시키고자 하는 DNA 영역에서 두 개의 5' 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성한다. 이후, 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한다. 문헌 참조[Innis, et al.(eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Mehods and Applications Academic Press, San Diego, CA]. 프라이머는 선택된 전장 DC 단백질을 암호화하는 전체 영역을 증폭시키기 위해서 또는 바람직한 만큼의 보다 작은 DNA 분절을 증폭시키기 위해서 선택될 수 있다. 일단 상기 영역이 PCR-증폭되면, 이들을 서열 분석하고 표준 기술을 사용하여 수득된 서열로부터 올리고뉴클레오타이드 프로브를 제조할 수 있다. 이후, 이러한 프로브는 DC 단백질의 기타 형태를 암호화하는 DNA를 분리하는데 사용할 수 있다.

프로브로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 문헌[Beaucage and Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20):1859-1862]에서 처음으로 기술된 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성되거나, 문헌[Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168]에서 기술된 바와 같이, 자동화된 합성기를 사용하여 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는 예를 들면, 문헌[Pearson and Regnier (1983) J. Chrom. 255:137-149]에 기술된 바와 같이 천연 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 또는 음이온-교환 HPLC에 의해 수행된다. 합성 올리고뉴클레오타이드의 서열은 막삼 및 길버트(Maxam and Gilvert)의 화학적 분해 방법[Grossman and Moldave(eds. 1980) Methods in Enzymology 65:499-560 Academic Press, New York]을 사용하여 입증할 수 있다.

본 발명은 기술된 바와 같이, DC 단백질을 암호화하는 분리된 DNA 또는 단편을 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 적합한 조건, 예를 들면, 매우 엄격한 조건하에서 본원에서 기술된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 DNA를 제공한다. 상기 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연 형태, 또는 재조합 단백질 또는 단편일 수 있으며, 서열 2, 4, 8 또는 10에서 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태는 예를 들면, 영장류로부터의 전장 천연 분리체이다. 글리코실화된 형태에서, 단백질은 보다 큰 크기를 나타낸다. 추가로, 본 발명은 분리된 또는 재조합 DNA, 또는 이의 단편의 용도를 포함하며, 이들은 각각의 개별적인 DC 단백질에 상동성인 단백질을 암호화한다. 분리된 DNA는 5' 및 3'에 인접한 개별적인 조절 서열들, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리-A 부가 시그날, 및 기타 서열들을 가질 수 있다.

IV. DC 유전자 생성물 제조

DC 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA는 화학적 합성법, cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해, 또는 광범위하게 다양한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈성 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다.

이러한 DNA는 예를 들면, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 전장 단백질 또는 단편의 합성을 위해서; 결합 연구를 위해서; 변형된 분자의 작제 및 발현을 위해서; 및 구조/기능 연구를 위해서, 광범위하게 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 DC 단백질 또는 이의 단편들 각각은 적합한 발현 벡터를 사용하여 형질전환되거나 형질감염되는 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 이러한 분자들은 재조합 숙주로부터 유도된 다른 것 보다, 단백질 또는 세포성 오염물로부터 실질적으로 정제될 수 있으며, 따라서, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 혼합되는 경우 약제학적 조성물에서 특히 유용하다. 항원 또는 이의 일부분은 기타 단백질과의 융합체로서 발현될 수 있다.

발현 벡터는, 일반적으로 적합한 숙주 세포에서 인식되는 적합한 유전자적 조절 인자들에 작동적으로 연결된 바람직한 DC 유전자 또는 이의 단편을 함유하는, 전형적으로 자가-복제하는 DNA 또는 RNA 작제물이다. 이러한 조절 인자들은 적합한 숙주내에서 발현에 영향을 줄 수 있다. 발현에 영향을 주기 위해서 필요한 조절 인자의 특정 유형은 사용되는 숙주 세포에 전적으로 의존한다. 일반적으로, 유전자적 조절 인자는 원핵생물 프로모터 시스템 또는 진핵생물 프로모터 발현 조절 시스템을 포함할 수 있으며, 전형적으로 전사 프로모터, 전사 개시를 조절하는 임의의 오퍼레이터(operator), mRNA 발현 수준을 증가시키는 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독을 종결시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 벡터가 숙주 세포로부터 독립적으로 복제할 수 있게 하는 복제 오리진을 함유한다.

본 발명의 벡터는 다양한 DC 단백질, 또는 전형적으로 예를 들면, 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 이의 단편을 암호화하는 DNA를 함유한다. 상기 DNA는 바이러스성 프로모터의 조절하에 있을 수 있으며, 선택성 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에서 DC 단백질을 암호화하는 진핵생물 cDNA를 발현할 수 있는 상기 발현 벡터의 용도를 추가로 포함하며, 이때, 벡터는 숙주와 양립할 수 있으며 상기 단백질을 암호화하는 진핵생물 cDNA는 벡터내로 삽입되어 상기 벡터를 함유하는 숙주의 성장은 문제의 cDNA를 발현하게 한다. 일반적으로, 발현 벡터는 숙주 세포내에서 안정한 복제 및 증폭을 위해서 디자인되어 세포 당 바람직한 유전자의 전체 복사체 수를 증가시킨다. 발현 벡터가 숙주 세포내에서 항상 복제될 필요성이 있는 것은 아니며, 예를 들면, 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 오리진을 함유하지 않는 벡터를 사용하여 다양한 숙주내에서 단백질 또는 이의 단편의 일시적인 발현을 야기하는 것도 가능하다. 또한 재조합에 의해 숙주 DNA내로 DC 유전자 또는 이의 단편의 통합을 야기하는 벡터를 사용하거나 내인성 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 통합시키는 것도 가능하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합성 DNA 단편 및 숙주의 게놈내로 DNA 단편을 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 발현 벡터는 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 야기시키는 유전자적 조절 인자를 함유하는 특성화된 벡터이다. 플라스미드는 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이지만 상응하는 기능을 하는 기타 형태의 벡터들도 본원에서의 용도에 적합하다. 문헌 참조[Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Clonning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.; and Roudriquez, et al.(eds.) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloninng Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA].

적합한 숙주 세포는 원핵생물, 하등 진핵생물, 및 고등 진핵생물를 포함한다. 원핵생물은 그람 네가티브 및 그람 포지티브 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스를 모두 포함한다. 하등 진핵생물은 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애 및 피치아(Pichia), 및 딕티오스텔륨 속의 종들을 포함한다. 고등 진핵생물은 비-포유동물 오리진(예를 들면, 곤충 세포 및 새) 및 포유동물 오리진(예를 들면, 사람, 원숭이 및 설치류) 둘 모두의 동물 세포로부터의 확립된 조직 배양 세포를 포함한다.

원핵생물 숙주-벡터 시스템은 수 많은 상이한 종들에 있어서 광범위하게 다양한 벡터를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이. 콜라이 및 이의 벡터는 기타 원핵세포에서 사용되는 동등한 벡터들을 포함하여 일반적으로 사용된다. DNA를 증폭시키는 대표적인 벡터는 pBR322 또는 이의 유도체들이다. DC 단백질 또는 이의 단편들을 발현하는데 사용할 수 있는 벡터는 lac 프로모터(pUC-시리즈); trp 프로모터(pBR322-trp); Ipp 프로모터(pIN-시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터(pOTS); 또는 ptac(pDR540) 같은 하이브리드 프로모터를 함유하는 벡터들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 참조[Brosius, et al.(1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez and Denhardt(eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10:205-236 Buttersworth,Boston, MA].

하등 진핵생물, 예를 들면, 효모 및 딕티오스텔륨은 DC 유전자 서열을 함유하는 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 가장 흔한 저등 진핵생물 숙주는 제빵용 효모(baker's yeast)인, 사카로마이세스 세레비지애이다. 수 많은 기타 균주 및 종들이 또한 이용 가능하지만, 상기 효모는 하등 진핵생물을 대표하여 사용된다. 효모 벡터는 전형적으로 복제 오리진(통합되는 유형은 제외), 선택성 유전자, 프로모터, 바람직한 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화 및 전사 종결을 위한 서열로 이루어진다. 효모를 위한 적합한 발현 벡터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다양한 기타 해당 효소(glycolytic enzyme) 유전자 프로모터 같은 구성성 프로모터 또는 알콜 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터 같은 유도성 프로모터를 포함한다. 적합한 벡터는 하기 유형, 즉 자가-복제성 저 복사체 수(YRp-시리즈 같은), 자가-복제성 고 복사체 수(YEp-시리즈 같은), 통합성 유형(YIp-시리즈 같은), 또는 소형-염색체(YCp-시리즈 같은)의 유도체를 포함한다.

고등 진핵생물 조직 배양 세포는 DC 단백질의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포이다. 원칙적으로, 대부분의 임의의 고등 진핵생물 조직 배양 세포주(예를 들면, 곤충 배큘로바이러스 발현 시스템)가 무척추 동물이든 척추 동물 공급원이든 어떠한 것이라도 사용될 수 있다. 그러나, 포유동물 세포가 동시-해독 방식으로 또는 해독 후 방식으로 적절한 가공을 달성하기에 바람직하다. 상기 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 증식은 일상적이다. 유용한 세포주는 헬라(Hela) 세포주, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주, 새끼 쥐 신장(BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주, 및 원숭이(COS) 세포주를 포함한다. 상기 세포주를 위한 발현 벡터는 일반적으로 복제 오리진, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이싱 부위(예를 들면, 게놈성 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이러한 벡터는 또한 선택성 유전자 또는 증폭 유전자를 함유할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스, SV40, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, 사이토메갈로바이러스로부터와 같은 공급원으로부터 유도된 프로모터를 갖는 플라스미드, 바이러스, 레트로바이러스일 수 있다. 대표적인 적합한 발현 벡터의 예는 pCDNA1; pCD[Okayama, et al.(1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142]; pMC1neo Poly-A[Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512]; 및 pAC373 또는 pAC610 같은 배큘로바이러스 벡터를 포함한다.

특정 예에서, DC 단백질은 특정 분석법에서 생물학적 반응을 나타내기 위해서 글리코실화될 필요는 없다. 그러나, 특이적인 또는 정의된 글리코실화 패턴을 제공하는 시스템내에서 DC 폴리펩타이드를 발현시키는 것이 종종 바람직할 것이다. 이러한 경우, 통상적인 패턴은 발현 시스템내에서 자연적으로 제공되는 패턴일 것이다. 그러나, 상기 패턴은 예를 들면, 비글리코실화된 형태로 상기 폴리펩타이드를 이형 발현 시스템내로 도입된 적합한 글리코실화 단백질에 노출시킴으로써 변형가능할 것이다. 예를 들면, DC 유전자는 포유동물의 또는 기타의 글리코실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 공-형질전환될 수 있다. 과-글리코실화는 DC 단백질 생물학적 활성에 해로울 수 있으며, 숙련자는 최적의 생물학적 활성을 제공하는 글리코실화 정도를 최적화시키기 위한 일상적인 테스트를 수행할 수 있다는 것을 추가로 이해해야 한다.

DC 단백질 또는 이의 단편은 세포막에 결합된 포스파티딜 이노시톨(PI)로 유전자 조작될 수 있지만, 포스파티딜 이노시톨 절단 효소, 예를 들면, 포스파티딜 이노시톨 포스포리파제-C를 사용한 처리에 의해 막으로부터 제거될 수 있다. 이는 생물학적으로 활성 형태로 항원을 방출시키며, 단백질 화학의 표준 방법에 의한 정제를 가능하게 한다. 문헌 참조[예를 들면, Low (1989) Biochem, Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al.(1985) Science 230:1003-1008; Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283; and Coligan, et al.(eds.) (1996) and periodic supplements) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, NY].

이러한 DC 단백질들이 특성화되었기 때문에, 이의 단편 또는 유도체들은 펩타이드를 합성하는 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 이는 문헌[Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY; and Bodansky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY. 또한 참조: Merrified (1986) Science 232:341-247; and Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779]에 기술된 바와 같은 방법들을 포함한다. 예를 들면, 아지드 방법, 산 클로라이드 방법, 산 무수물 방법, 혼합된 무수물 방법, 활성 에스테르 방법(예를 들면, p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 방법, 산화-환원 방법, 또는 디사이클로헥실카보디이미드(DCCD)/부가적인 방법이 사용될 수 있다. 고체상 및 액체상 합성은 모두 선행 방법들에 적용 가능하다.

제조된 단백질 및 이의 단편은 단백질 분리 방법, 예를 들면, 추출, 침전, 전기영동 및 다양한 형태의 크로마토그래피 등으로 반응 혼합물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명의 DC 단백질은 바람직한 용도에 따라 다양한 정도의 순도로 수득할 수 있다. 정제는 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 또는 본원에 기술된 항체 및 결합 상대를 사용하여, 예를 들면, 면역 흡착 친화도 크로마토그래피를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 면역 흡착 친화도 크로마토그래피는 우선 항체를 고체 지지체에 결합시키고 결합된 항체를 적합한 공급원 세포의 가용화된 용해액, 상기 단백질을 발현하는 기타 세포의 용해액, 또는 DNA 기술(하기 참조)의 결과로서 상기 단백질을 생산하는 세포의 용해액 또는 상등액과 접촉시킴으로써 수행한다.

다수의 세포주를 기타 세포와 비교하여 높은 수준으로 상기 단백질을 발현하는 세포에 대해 스크리닝할 수 있다. 다양한 세포주, 예를 들면, 마우스 흉선 간질 세포주 TA4를 스크리닝하고 이의 적합한 조작 특성에 대해 선택한다. 천연 DC 세포 단백질은 천연 공급원으로부터 분리되거나, 적합한 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 세포로부터의 발현에 의해 분리될 수 있다. 발현된 단백질의 정제는 표준 방법에 의해 달성되거나, 세포 용해물 또는 상등액으로부터 고효율로 효과적인 정제를 위해 조작된 방법과 함께 혼용할 수 있다. FLAG 또는 His6 단편을 상기 정제 특성을 위해 사용할 수 있다.

V. 항체

항체는 개체 변이체, 다형성 변이체, 대립형질 변이체, 균주 또는 종 변이체를 포함하는 다양한 DC 단백질, 및 이의 단편을 천연(전장) 형태 및 이의 재조합 형태 모두에 대해 생성시킬 수 있다. 부가적으로, 항체는 이의 활성 형태 또는 이의 불활성 형태로 DC 단백질에 대해 생성될 수 있다. 항-이디오타입 항체를 또한 사용할 수 있다.

a. 항체 생산

수 많은 면역원을 사용하여 이러한 DC 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 생산할 수 있다. 재조합 단백질은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생산을 위한 바람직한 면역원이다. 천연 단백질이 또한 정제된 또는 정제되지 않은 형태로 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 사람 DC 단백질 서열을 사용하여 제조된 합성 펩타이드는 또한 DC 단백질에 대한 항체 생산을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 본원에서 기술된 바와 같이 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포에서 발현될 수 있으며, 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 이후 생성물을 항체를 생산할 수 있는 동물내로 주입한다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 단백질을 측정하는 면역 분석법에서의 후속적인 용도를 위해서 생산될 수 있다.

폴리클로날 항체를 생산하는 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 간략하면, 면역원, 바람직하게는 정제된 단백질을 어쥬번트와 혼합하여 동물을 상기 혼합물을 사용하여 면역화시킨다. 면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응을 시험 혈액을 취하고 관심의 대상인 DC 단백질에 대한 반응 역가를 측정함으로써 모니터링한다. 면역원에 대한 대략적으로 고 역가의 항체가 수득되면, 동물로부터 혈액을 수거하고 항혈청을 제조한다. 경우에 따라서, 단백질에 반응성인 항체를 농축하기 위해 항혈청을 추가로 분획시킬 수 있다. 문헌 참조[Harlow and Lane].

모노클로날 항체를 당해 분야의 숙련자에게 친숙한 다양한 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 간략하면, 바람직한 항원으로 면역화된 동물로부터의 췌장 세포를 흔히, 골수종 세포와의 융합으로 불멸화시킨다. 문헌 참조[본원에 참조로 인용된 Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519]. 대안적인 면역화 방법은 엡스타인 바르 바이러스, 종양 유전자, 또는 레트로바이러스를 사용한 형질전환, 또는 당해 분야에 공지된 방법을 포함한다. 단일 불멸화된 세포로부터 야기된 콜로니를 항원에 대한 바람직한 특이성 및 친화도의 항체를 생산하기 위해 스크리닝하고 상기 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 수율을 척추 동물 숙주의 복강내로의 주입을 포함하는, 다양한 기술로 강화시킬 수 있다. 대안으로, 문헌[Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281]에 의해 개략된 일반적인 프로토콜에 따라 사람 B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 모노클로날 항체 또는 이의 결합성 단편을 암호화하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.

이러한 DC 단백질의 예비 결정된 단편에 대한, 결합성 단편 및 단일 쇄 형태를 포함하는 항체는 상기 단편과 상기 기술된 바와 같은 담체 단백질과의 접합체를 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 유도할 수 있다. 모노클로날 항체는 바람직한 항체를 분비하는 세포로부터 제조된다. 이러한 항체는 정상적인 또는 결함성 DC 단백질에 대한 결합에 대해 스크리닝하거나, 효능제성 또는 길항제성 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 일반적으로 약 1mM 이상의 K_D, 보다 일반적으로 약 300μM 이상, 전형적으로는 약 10μM 이상, 및 보다 전형적으로는 약 30μM 이상, 바람직하게는 약 10μM 이상 및 보다 바람직하게는 약 3μM 이상의 K_D값으로 결합한다.

특정 예에서, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 다양한 포유동물로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 상기 모노클로날 항체를 제조하는 기술에 대한 기술은 문헌[예를 들면, 모노클로날 항체를 생산하는 한 가지 방법을 기술하는, Stites, et al. (eds.). Basic and Clinical Immunology(4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, and reference cited therein; Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed.) Academic Press, New York, NY; and particularly in Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에서 발견할 수 있다. 간략히 요약하면, 본 방법은 동물에게 면역원을 주입하여 체액성 면역 반응을 개시하게 하는 것과 관련된다. 이후, 상기 동물을 희생시키고 이의 췌장으로부터 세포를 취하여 골수종 세포와 융합시킨다. 결과적으로 시험관내에서 재생할 수 있는 하이브리드 세포 즉 "하이브리도마"가 수득된다. 이후, 하이브리도마의 집단을 스크리닝하여 개별적인 클론을 분리하며, 이들 각각은 면역원에 대한 단일 항체 종류를 분비한다. 이러한 방식으로, 수득된 개별적인 항체 종은 면역원성 기질 상에서 인식되는 특정 부위에 대한 반응으로 생성된 면역 동물로부터의 불멸화시키고 클로닝한 단일 B 세포의 생성물이다.

기타 적합한 기술들은 파아지 또는 유사 벡터 중의 항체 라이브러리의 선택과 관련된다. 문헌 참조[Huse, et al.(1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275-1281; and Ward, et al.(1989) Nature 341:544-546]. 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 포함하는 변형과 함께 또는 변형 없이 사용될 수 있다. 빈번하게, 폴리펩타이드 및 항체는 검출할 수 있는 신호를 제공하는 물질을 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 결합시킴으로써 표지화될 수 있다. 광범위하게 다양한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있으며 학술지 및 특허 문헌에서 광범위하게 보고되어 있다. 적합한 표지는 방사성 핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제제, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자 등을 포함한다. 상기 표지의 용도를 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,966,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린이 생산될 수 있다. 문헌 참조[Cabilly, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen, et al.(1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:10029-10033].

본 발명의 항체는 또한 각각의 DC 단백질을 분리하는데 있어서 친화도 크로마토그래피를 위해 사용할 수 있다. 컬럼은 항체가 고체 지지체, 예를 들면, 아가로오스, 세파덱스 등과 같은 입자에 결합되게 제조될 수 있으며, 이때, 세포 용해액은 컬럼을 통해 통과시키고, 컬럼을 세척하고 온화한 세척제의 농도를 증가시키면 정제된 DC 단백질이 방출된다.

항체는 또한 특정 발현 생성물을 위한 발현 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 일반적으로 상기 과정에 사용되는 항체는 항체 결합에 의해 항원의 존재를 용이하게 검출할 수 있게 하는 잔기로 표지된다.

DC 단백질에 대한 항체는 개별적인 단백질을 발현하는 특정 세포 집단 성분들을 분석하거나 확인하는데 사용될 수 있다. DC 단백질을 발현하는 세포의 발현 생성물을 분석함으로써, 질병, 예를 들면, 면역-타협된 조건, DC 결핍된 조건 또는 DC 과생산을 진단하는 것이 가능해 진다.

각각의 DC에 대해 생성된 항체는 또한 항-이디오타입 항체를 생성시키는데도 유용하다. 이들은 각각의 항원의 발현과 관련된 다양한 면역학적 조건들을 검출하거나 진단하는데 유용하다.

b. 면역 분석법

특정 단백질은 다양한 면역 분석법으로 측정할 수 있다. 일반적인 면역학적및 면역 분석학적 방법의 개략을 위해서는, 문헌 참조[Stites and Terr(eds.) 1991 Basic and Clinical Immunology (7th ed.)]. 추가로, 본 발명의 면역 분석법은 수 개의 임의 구성으로 수행될 수 있으며, 이는 문헌[Maggio(ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "PRactice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; and Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, 상기, 각각은 본원에 참조로 인용된다; 또한 참조: Chan(ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman(eds.)(1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; and Ngo(ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY]에서 광범위하게 개략된다.

이러한 DC 단백질의 측정을 위한 면역 분석법은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 간략하면, 단백질을 측정하는 면역 분석법은 경쟁적 또는 비경쟁적 결합 분석법일 수 있다. 경쟁적 결합 분석법에서, 분석하고자 하는 샘플은 고체 표면에 결합된 포획제(capture agent) 상에서 특정 결합 부위에 대해 표지된 피검사물(analyte)과 경쟁하게 된다. 바람직하게는 포획제는 상기 기술된 바와 같이 생산된 DC 단백질과 특이적으로 반응하는 항체이다. 포획제에 결합된 표지된 피검사물의 농도는 샘플 중에 존재하는 유리된 피검사물의 양에 반비례한다.

경쟁적 결합 면역 분석법에서, 샘플 중에 존재하는 DC 단백질은 특정 결합제, 예를 들면, DC 단백질과 특이적으로 반응하는 항체에 결합하는데 있어서 표지된 단백질과 경쟁하게 된다. 결합제는 고체 표면에 결합되어 비결합된 표지된 단백질로부터 결합된 표지된 단백질을 분리시킬 수 있다. 대안으로, 경쟁 결합 분석법은 액상에서 수행될 수 있으며 당해 분야에 공지된 다양한 임의의 기술을 사용하여 비결합된 표지된 단백질로부터 결합된 표지된 단백질을 분리할 수 있다. 분리 후, 결합된 표지된 단백질의 양을 측정한다. 샘플 중에 존재하는 단백질의 양은 결합하는 표지된 단백질의 양에 반비례한다.

대안으로, 균질 면역 분석법이 수행될 수 있으며, 이는 분리 단계가 필요없다. 이러한 면역 분석법에서, 단백질 상의 표지는 단백질이 이의 특이적인 결합제에 대한 결합에 의해 변형된다. 표지된 단백질에서 이러한 변화는 표지에 의해 방출되는 신호를 감소시키거나 증가시켜 결과적으로, 면역 분석법의 최종 단계에서 표지의 측정은 단백질의 검출 또는 정량화를 가능하게 한다.

이러한 DC 단백질은 또한 다양한 비경쟁적 면역 분석법으로 정량적으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 2개 위치, 고체상 샌드위치 면역 분석법이 사용될 수 있다. 이러한 분석법 유형에서, 단백질에 대한 결합제, 예를 들면, 항체는 고체 지지체에 부착된다. 제2 단백질 결합제는 또한 항체일 수 있으며 상이한 부위에서 단백질에 결합하는데, 이는 표지된다. 단백질 상의 두 위치 모두에서 결합이 형성되면, 비결합된 표지된 결합제를 제거하고 고체상에 결합된 표지된 결합제의 양을 측정한다. 결합된 표지된 결합제의 양은 샘플 중의 단백질 양에 정비례한다.

웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 샘플 중의 DC 단백질의 존재를 측정할 수 있다. 전기영동은 예를 들면, 단백질을 함유하는 것으로 여겨지는 조직 샘플상에서 수행된다. 단백질을 분리하기 위한 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 필터 같은 적합한 고체 지지체에 전이시키고, 고체 지지체를 변성된 단백질에 반응성인 항체와 함께 항온 처리한다. 상기 항체를 표지시키거나, 대안으로, 제1 항체에 결합하는 제2 표지된 항체를 사용한 후속적으로 항온 처리로 검출할 수 있다.

상기 기술된 면역 분석법 형식은 표지된 분석 성분들을 사용한다. 표지는 다양한 형태일 수 있다.표지는 당해 분야에 숙지된 방법에 따라 분석법의 바람직한 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 광범위하게 다양한 표지가 사용될 수 있다. 성분은 수 개의 방법 중 임의의 하나로 표지할 수 있다. 통상적으로³H,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C, 또는³²P를 삽입하는 방사성 표지를 사용한다. 비-방사성 표지는 표지된 단백질을 위한 특이적인 결합쌍 구성원으로서 작용할 수 있는 항체에 결합된 리간드, 형광단, 화학발광제, 효소 및 항체를 포함한다. 표지의 선택은 요구되는 민감도, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 요건, 및 이용 가능한 장치에 따라 다르다. 사용될 수 있는 다양한 표지화 또는 신호 생성 시스템의 개략을 위해서는, 본원에 참조로 인용된 문헌[미국 특허 제4,391,904호]를 참조.

특정 단백질과 반응하는 항체는 다양한 면역 분석법으로 또한 측정할 수 있다. 면역 분석법 기술에 의한 항체의 측정에 적용할 수 있는 면역학적 및 면역 분석학적 방법의 개략을 위해서는, 문헌 참조[예를 들면, Stites and Terr(eds.) Basic and Clinical Immunology(7th ed.) 상기; Maggio(ed.) Enzyme Immunoassay, 상기; and Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 상기].

다양한 상이한 면역 분석법 형태, 분리 기술, 및 표지가 또한 특정 단백질의 측정을 위해 상기 기술된 바와 같은 방법들과 유사하게 사용될 수 있다.

VI. 정제된 DC 단백질

영장류, 예를 들면, 사람의 DCMP1 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열 1 및 2에서 제공된다. 설치류, 예를 들면, 마우스의 DCMP1 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열 7 및 8에서 제공된다. 영장류, 예를 들면, 사람의 DCMP2 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열 3 및 4에서 제공된다. 또다른 변이체는 서열 9 및 10에서 기술된다. 유사한 영장류 간 무시알로당단백질 서열은 서열 5 및 6에서 제공된다. 펩타이드 서열은 상기 분절을 인식하는 항체를 생산하기 위한 펩타이드의 제조를 가능하게 하며, 상기 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드의 제조를 가능하게 한다.

VII. 물리적인 변이체

본 발명은 또한 서열 2 또는 8의 아미노산 서열, 또는 서열 4 또는 10의 선택된 부분들의 아미노산 서열과 실질적인 아미노산 서열 유사성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 및 보다 바람직하게는 5개 이하의 치환을 나타내는 변이체가 또한 가능하다. 치환이 보존적인 치환인 경우, 변이체는 상응하는 천연 서열 단백질과 면역원성 또는 항원성 유사성 또는 교차-반응성을 공유하게 된다. 자연 변이체는 개체 변이체, 대립 형질 변이체, 다형성 변이체, 균주 또는 종 변이체를 포함한다.

아미노산 서열 유사성, 또는 서열 동일성은 잔기 일치를 최적화시킴으로써 결정되며, 경우에 따라서, 필요한 만큼의 갭을 도입하여 결정한다. 보존적 치환을 일치하는 것으로 간주하는 경우 이는 변화된다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 간의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 상동성 아미노산 서열은 각각의 개별적인 단백질 서열에서 자연 대립 형질성 및 종간 변이를 포함한다. 전형적인 상동성 단백질 또는 펩타이드는 관련된 DC 단백질의 아미노산 서열과 50 내지 100% 유사성(갭이 도입될 수 있는 경우) 내지 75 내지 100% 유사성(보존적 치환이 포함회는 경우)을 갖는다. 동일성 척도는 약 50% 이상, 일반적으로 약 60% 이상, 보다 일반적으로 약 65% 이상, 통상적으로 약 70% 이상, 보다 통상적으로 약 75% 이상이고, 바람직하게는 약 80% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 80% 이상이며; 특히 바람직한 양태에서, 85% 또는 그 이상이다. 또한, 문헌 참조[Needleham, et al.(1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; and software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA; and the University ofWisconsin Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI].

서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 참조 서열로서 역할을 하며, 이에 대해서 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 경우에 따라서, 서열 배열이 지시되며, 서열 알고리듬 프로그램 변수들이 지시된다. 이후, 서열 비교 알고리듬은 지시된 프로그램 변수에 기초하여, 참조 서열에 대해 상대적으로 시험 서열의 서열 동일성(%)을 산출한다.

비교를 위한 서열의 시각적인 배열은 스미스 및 워터맨의 국부적인 상동성 알고리듬[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]에 의해, 니들맨 및 원쉬의 상동성 배열 알고리듬[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만의 유사성 방법을 연구[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444]에 의해, 이러한 알고리듬의 컴퓨터화된 수행들(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)에 의해, 또는 시각에 의한 정밀 조사[일반적으로 문헌 참조: Ausuvbel et al., 상기]에 의해 수행될 수 있다.

유용한 알고리듬의 한 가지 예는 PILEUP이다. PILEUP은 상관 관계 및 서열 동일성(%)를 나타내는 진보적이고, 쌍을 이룬 배열을 사용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 배열을 형성시킨다. 이는 또한 배열을 형성시키는데 사용되는 집단화 상관 관계를 나타내는 트리(tree) 또는 덴도그램(dendogram)을 도시한다. PILEUP은 문헌[Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360]의 단순화된 진보적인 배열 방법을 사용한다. 사용되는 방법은 문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153]에서 기술된 방법과 유사하다. 상기 프로그램은 각각 최대 길이 5,000개 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 300개 서열을 배열할 수 있다. 다중 배열 과정은 두 개의 가장 유사한 서열을 쌍으로 배열하는 것으로 시작하며, 이는 두 개의 배열된 서열의 클러스터(cluster)를 생성시킨다. 이러한 클러스터는 이후 배열된 서열 중 다음으로 가장 관련된 서열 또는 클러스터에 대해 배열된다. 두 클러스터의 서열을 두 개의 개별적인 서열에 대한 쌍 배열의 단순한 신장에 의해 배열한다. 최종 배열은 일련의 진보적인, 쌍 배열에 의해 달성된다. 상기 프로그램은 서열 비교를 위한 영역에 대한 특정 서열 및 이의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 배열을 지시하거나 프로그램 변수를 지시함으로써 운용된다. 예를 들면, 참조 서열은 기타 시험 서열과 비교되어 다음 변수(디폴트(default) 갭 중량(3.00), 디폴트 갭 길이 중량(0.10), 및 중량화된 최종 갭)를 사용한 서열 동일성 상관 관계(%)를 측정한다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하는데 적합한 또 다른 알고리듬의 예는 BLAST 알로리듬이며, 이는 문헌[Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이러한 알고리듬은 우선 요청된 서열 중 길이 W의 짧은 서열을 확인함으로써 고 득점성 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것과 관련되며, 이는 데이터베이스 서열 중의 동일한 길이의 짧은 서열과 함께 배열되는 경우 특정 포지티브-득점의 역치 득점 T와 일치하거나 T를 만족시킨다. T는 가까운 서열 득점 역치로서 인용된다[Altschul, et al., 상기]. 이러한 초기의 가까운 서열 부합(hit)은 이들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 개시하는데 있어서 씨드(seed)로서 작용한다. 이후, 서열 부합은 누적 정렬 득점이 증가될 수 있는 한도까지 각각의 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 양 방향에서 서열 부합의 확장은, 누적 정렬 득점이 이의 최대 도달 값으로부터 X 량 만큼 감소하는 경우; 하나 이상의 네가티브-득점의 잔기 정렬의 누적으로 인해, 누적 득점이 0 또는 그 이하가 되는 경우; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달하는 경우에, 중단된다. BLAST 알고리듬 변수들 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 서열 길이(W), 50의 BLOSUM62 득점 매트릭스[문헌 참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:10915] 정렬(B), 10의 기대치(E) 및 M=5, N=4, 및 양쪽 쇄의 비교를 디폴트로서 사용한다.

서열 동일성(5)을 산출하는데 부가하여, BLAST 알고리듬은 또한 두 개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다[문헌 참조 예를 들면, Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정은 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 두 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에서 일치가 우연히 일어나게 되는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들면, 참조 핵산에 대한 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 참조 핵산과 유사한 것으로 간주된다.

두 개의 폴리펩타이드의 뉴클레오타이드 서열이 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는 제1 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 하기되는 바와 같이, 제2 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드에 실질적으로 동일하며, 예를 들면, 이때, 두 개의 펩타이드는 단지 보존적 치환에 의해서만 상이하다. 두 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 두 개의 분자가 하기되는 바와 같이, 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화한다는 것이다.

상응하는 포유동물 DC 단백질을 암호화하는 핵산은 전형적으로 엄격한 조건하에서 서열 1 또는 7, 또는 3의 적합한 부분에 하이브리드화한다. 예를 들면, 각각의 DC 단백질을 암호화하는 핵산은 전형적으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 서열 1, 7, 3 또는 9의 핵산에 하이브리드화하지만, 수 개의 위 포지티브 하이브리드화 신호를 제공한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 농도 및 pH에서 하이브리드화시키고자 하는 서열에 대한 융점(Tm) 보다 약 10℃ 낮게 선택된다. Tm은 (정의된 이온 농도 및 pH에서) 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브에 하이브리드화되는 온도이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 세척 염 농도가 pH 7에서 약 0.02몰 및 온도가 약 50℃인 조건이다. 기타 인자들은 염기 조성 및 상보성 쇄의 크기, 포름아미드 같은 유기 용매의 존재 및 염기 불일치 정도를 포함하며, 하이브리드화의 엄격함에 현저하게 영향을 미칠 수 있다. 바람직한 양태는 42℃, 50% 포름아미드 및 20 내지 50mM NaCl에서 기술된 서열에 결합하는 핵산을 포함한다. 엄격한 조건하에서 하이브리드화는 바탕값의 2배 이상, 바람직하게는 바탕값의 3 내지 5배 또는 그 이상이 되는 바탕값을 제공해야 한다.

분리된 DC 유전자 DNA는 뉴클레오타이드 치환, 뉴클레오타이드 결실, 뉴클레오타이드 삽입, 및 뉴클레오타이드 길이의 역위에 의해 용이하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 매우 유사한 생리학적, 면역원성 또는 항원성 활성을 갖는 이러한 DC 항원, 이의 유도체, 또는 단백질을 암호화하는 신규한 DNA 서열을 야기한다.

변형된 서열은 돌연변이체 항원을 생산하거나 발현을 강화시키는데 사용할 수 있다. 강화된 발현은 유전자 증폭, 증가된 전사, 증가된 해독, 및 기타 메카니즘이 관련될 수 있다. 그러한 돌연변이체 DC 단백질 유도체는 각각의 단백질 또는 이의 단편의 예비 결정된 또는 부위-특이적인 돌여변이를 포함한다. "돌연변이체 DC 단백질"은 결실, 치환 또는 삽입의 방법에 의해 자연계에서 발견되는 DC 단백질의 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 제외하고는, 상기 설정한 DC 단백질의 상동성 정의에 속하는 폴리펩타이드를 포함한다. 특히, "부위 특이적인 돌연변이체 DC 단백질"은 일반적으로 서열 2 또는 8의 서열을 갖는 단백질과 유의한 유사성을 갖는 단백질을 포함한다. 일반적으로, 변이체는 이의 서열과 함께 수 많은 물리화학적 및 생물학적 활성, 예를 들면, 항원성 또는 면역원성을 공유하게되며, 바람직한 양태에서, 기술된 서열의 대부분 또는 모두를 함유한다. 유사한 개념이 이러한 다양한 DC 단백질, 특히 다양한 온혈 동물, 예를 들면, 영장류 및 포유동물에 발견되는 DC 단백질에 적용된다.

비록 부위 특이적인 돌연변이 부위가 예비 결정되지만, 돌연변이체가 부위 특이적일 필요는 없다. DC 단백질 돌연변이 유발은 아미노산 삽입 또는 결실을 만들어 수행할 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 또는 임의의 혼합을 생성시켜 최종 작제물을 제조할 수 있다. 삽입은 아미노- 또는 카복실-말단 융합을 포함한다. 랜덤 돌연변이 유발은 표적 코돈에서 수행할 수 있으며, 이후, 발현된 돌연변이체는 바람직한 활성에 대해서 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA에서 예비 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 제조하는 방법은 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이 유발 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술에 의해 당해 분야에 숙지되어 있다. 문헌 참조[Sambrook, et al.(1989) and Ausubel, et al.(1987 and Supplements)]. DNA에서 돌연변이는 판독 프레임 밖에 코돈 서열을 위치시키지 않으며 바람직하게는 하이브리드화되어 루프 또는 헤어핀 같은 2차 mRNA를 생성하는 상보적인 영역을 생성시키지 않는다.

본 발명은 또한 재조합 단백질, 예를 들면, 이러한 단백질로부터의 분절을 이용하여 이형 융합 단백질을 제공한다. 이형 융합 단백질은 동일한 방식으로 자연적으로는 정상적으로 융합되지 않는 단백질 또는 분절의 융합이다. 따라서, 면역글로불린과 각각의 DC 폴리펩타이드의 융합 생성물은, 전형적으로 단일 해독 생성물로서 제조되며 각각의 공급원 펩타이드로부터 유도된 특성을 나타내는, 전형적인 펩타이드 결합으로 융합된 서열을 갖는 연속된 단백질 분자이다. 유사한 개념은 이형 핵산 서열에 적용된다.

부가적으로, 신규한 작제물은 기타 단백질로부터의 유사한 기능성 도메인을 혼합하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 도메인 또는 기타 분절은 전형적으로 관련된 단백질, 예를 들면, 렉틴 또는 무시알로당단백질 패밀리 내의 관련된 단백질과 함께, 상이한 신규한 융합 폴리펩타이드 또는 단편 사이에서 "교환"될 수 있다. 바람직하게는, 온전한 구조 도메인, 예를 들면, 온전한 Ig 부분이 사용된다. 문헌 참조[예를 들면, Cunningham, et al.(1989) Science 243:1330-1336; and O'Dowd, et al.(1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992]. 따라서, 신규한 특이성의 혼합을 나타내는 신규한 키메라 폴리펩타이드는 단백질-결합 특이성 및 기타 기능성 도메인의 기능성 결합으로부터 기인한다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 바람직하게는, 구조적으로 2차 구조의 외부에 위치하는 잔기에 적용될 수 있으며, 이는 일반적으로 3차 구조를 파괴하는 중요 잔기의 대부분을 회피하게 된다.

이러한 DC 항원의 "유도체"는 아미노산 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 및 기타 화학적 잔기와의 공유 결합 접합체 또는 집합 접합체를 포함한다. 공유 결합 유도체는 당해 분야에 숙지된 방법에 의해, 이러한 DC 단백질 아미노산 잔기 쇄 또는 N- 또는 C-말단에서 발견되는 그룹에 대한 기능성의 결합에 의해 제조될 수 있다. 이러한 유도체는 카복실 말단 또는 카복실 부분의 쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹-함유 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노 말단 아미노산 또는 아미노-그룹 함유 잔기, 예를 들면, 리신 또는 아르기닌의 N-아실 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 아실 그룹은 이로부터 알카노일 아로일 종을 형성하는, C3-C18개의 통상적인 알킬을 포함하는 알킬-잔기의 그룹으로부터 선택된다. 담체 단백질에 대한 공유 결합 부착은 면역원성 잔기가 합텐(hapten)인 경우 중요할 것이다.

특히, 글리코실화 변형은 예를 들면, 합성 및 가공 동안, 또는 추가의 가공 단계에서 폴리펩타이드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 제조된 것을 포함한다. 이를 달성하기 위한 특히 바람직한 방법은 통상적으로 상기 가공을 제공하는 세포로부터 유도된 글리코실화 효소, 예를 들면, 포유동물 글리코실화 효소에 상기 폴리펩타이드를 노출시키는 것이다. 탈글리코실화 효소가 또한 포함된다. 인산화된 아미노산 잔기(예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌), 또는 리보실 그룹 또는 교차-결합제를 포함하는 기타 잔기를 포함하는, 기타 중요하지 않은 변형을 갖는 동일한 1차 아미노산 서열의 형태를 또한 포함한다. 또한, 치환을 포함하는 단백질을 포함하며, 이는 실질적인 면역원성을 보유함으로써 서열 2, 4, 8, 또는 10의 단백질을 인식하는 항체를 생산한다. 전형적으로, 이러한 단백질은 전형적으로 기술된 서열로부터 20개 미만의 잔기 치환, 보다 전형적으로 10개 미만의 치환, 바람직하게는 5개 미만, 및 보다 바람직하게는 3개 미만의 치환을 함유한다. 대안으로, 구조적 도메인에서 시작되고 끝나는 단백질은 일반적으로 항원성 및 교차 면역원성을 보유한다.

유도체의 주요 그룹은 DC 단백질 또는 이의 단편과 기타 단백질 또는 폴리펩타이드의 공유 결합 접합체이다. 이러한 유도체는 N- 또는 C-말단 융합 같은 재조합 배양에서 합성될 수 있거나 반응성 측쇄 그룹을 통해 교차-결합 단백질에서 이의 유용성으로 인해 당해 분야에서 공지된 제제를 사용하여 합성할 수 있다. 교차-결합제를 사용한 바람직한 단백질 유도화 부위는 유리 아미노 그룹, 탄수화물 잔기 및 시스테인 잔기 부위이다.

이러한 DC 단백질 및 기타 동형 또는 이형 단백질 사이의 융합 폴리펩타이드가 또한 제공된다. 이형 폴리펩타이드는 상이한 표면 마커 사이의 융합체로 예를 들면, 하이브리드 단백질을 생성시킬 수 있다. 마찬가지로, 유도체성 단백질의 특성 또는 활성의 혼합을 나타내는 이형 융합체가 작제될 수 있다. 전형적인 예는 리포터 폴리펩타이드, 예를 들면, 루시퍼라제와 단백질의 분절 또는 도메인, 예를 들면, 수용체-결합 분절의 융합으로, 그 결과 융합된 단백질의 존재 또는 위치가 용이하게 결정될 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Dull, et al., 미국 특허 제4,859,609호]. 기타 유전자 융합 상대는 세균성 β-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, 알파 아밀라제, 알콜 데하이드로게나제, 및 효모 알파 교배 인자를 포함한다. 문헌 참조[예를 들면, Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816].

상기 폴리펩타이드는 또한 인산화, 설폰화, 바이오틴화, 또는 기타 잔기의 부가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형된 아미노산 잔기들, 특히 인산 그룹과 유사한 분자 형태를 갖는 잔기를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 변형은 유용한 표지화제일 수 있으며, 정제 표적 예를 들면, 친화도 리간드로서 작용한다.

본 발명은 또한 아미노산 잔기 또는 글리코실화에서 변이 보다는 상기 DC 단백질의 유도체의 용도를 포함한다. 상기 유도체는 화학적 잔기와의 공유 결합 또는 집합적 결합과 관련될 수 있다. 이러한 유도체는 일반적으로 다음 3가지로 분류된다:(1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기 공유 결합 변형, 및 (3) 예를 들면, 세포막과의 흡착 복합체. 상기 공유 결합적 또는 집합적 유도체는 면역원으로서, 면역 분석법에서 시약으로서, 또는 리간드 또는 기타 결합성 리간드의 친화도 정제에 유용하다. 예를 들면, DC 단백질 항원은 항-DC 단백질 항체의 분석법 또는 정제에서의 용도에 있어서는 당해 분야에 숙지된 방법으로 브롬화시안-활성화된 세파로오스 같은 고체 지지체에 대한 공유 결합에 의해 부동화되거나, 또는 글루타르알데하이드 교차-결합과 함께 또는 없이, 폴리올레핀 표면에 흡착될 수 있다. DC 단백질은 또한 진단 분석법에서의 용도에 있어서, 검출 가능한 그룹으로 표지되거나, 예를 들면, 클로르아민 T 방법에 의해 방사성 요오드화되거나, 희토 산화물 킬레이화제와 공유결합되거나, 또 다른 형광 잔기에 접합될 수 있다. 이러한 DC 단백질의 정제는 부동화된 항체에 의해 영향을 받을 수 있다.

분리된 DC 단백질 항원은 상응하는 DC 단백질의 발현이 결핍된 세포, 예를 들면, 상응하는 단백질이 결핍되어 네가티브 바탕값 활성을 나타내는 종 유형 또는 세포의 형질전환을 가능하게 한다. 형질전환된 유전자의 발현은 정의된 또는 단일 종 변이체와 함께, 항원적으로 순수한 세포주의 분리를 가능하게 한다. 이러한 접근법은 이러한 DC 단백질의 보다 민감한 검출 및 DC 단백질의 생리학적 효과의 식별을 가능하게 한다. 세포내 단편들, 예를 들면, 세포질 또는 막 단편들은 분리되어 사용될 수 있다.

VIII. 결합제:DC 단백질 복합체

아미노산 서열 2, 4, 8, 또는 10으로 이루어지는 면역원 같은 정의된 면역원에 대해 생성된 항체에 특이적으로 결합하거나 상기 항체와 함께 특이적으로 면역 반응하는 DC 단백질은 면역 분석법으로 측정한다. 상기 면역 분석법은 서열 2, 4, 8, 및 10의 단백질에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 사용한다. 이러한 항혈청은 관련된 패밀리의 기타 구성원에 대해서는 낮은 교차 반응성을 갖는 것으로 선택되며, 임의의 상기 교차 반응성은 면역 분석법에서 사용에 앞서 면역 흡착에 의해 제거된다.

면역 분석법의 사용을 위해 항혈청을 제조하기 위해서, 서열 2, 4, 8, 또는 10의 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 분리된다. 예를 들면, 재조합 단백질은 포유동물 세포주에서 생산될 수 있다. balb/c 같은 동계 교배된 마우스 품종은 프로인트 어쥬번트 같은 표준 어쥬번트 및 표준 마우스 면역화 프로토콜[Harlow and Lane, 상기]을 사용하여 적합한 단백질로 면역화시킨다. 대안으로, 본원에 기술된 서열로부터 유도되고 담체 단백질과 접합된 합성 펩타이드를 면역원으로 사용할 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 수거하고 면역 분석법, 예를 들면, 고체 지지체 상에 부동화된 면역원을 사용하는 고체상 면역 분석에서 면역원 단백질에 대해 역가를 계산한다. 10⁴이상의 역가를 갖는 폴리클로날 항혈청을 선택하고 문헌[Harlow and Lane, 상기, pages 570-573]에서 기술된 바와 같이, 경쟁적 결합 면역 분석법을 사용하여 기타 관련된 단백질과의 교차 반응성을 시험한다. 바람직하게는 두 개의 상이한 관련된 단백질이 주어진 DC 단백질과 함께 상기 측정에서 사용된다. 예를 들면, 렉틴 단백질과 함께, 두 개 이상의 기타 패밀리 구성원을 사용하여 공유된 에피토프를 흡착시킨다. DCMP1 패밀리 구성원과 함께, 패밀리의 두 개의 다른 구성원을 사용한다. 이러한 다른 패밀리 구성원은 재조합 단백질로서 생산하거나 본원에 기술된 바와 같은 표준 분자생물학 및 단백질 화학 기술을 사용하여 분리할 수 있다.

경쟁적 결합 형식의 면역 분석법은 교차 반응성 측정을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 2 또는 8의 단백질은 고체 지지체에 부동화될 수 있다. 분석법에 부가되는 단백질은 부동화된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 상기 단백질이 부동화된 단백질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 능력은 서열 2 또는 8의 단백질과 비교한다. 상기 단백질의 교차 반응성(%)을 표준 산출법을 이용하여 산출한다. 상기 목록화된 단백질 각각과 10% 미만의 교차 반응성을 갖는 항혈청을선택하고 한 곳으로 모은다(pooling). 이후, 교차 반응하는 항체를 상기-목록화된 단백질을 사용한 면역 흡착으로 모은 항혈청으로부터 제거한다.

이후, 면역 흡착시키고 모은 항혈청을 상기 기술된 바와 같은 경쟁적 결합 면역 분석법에서 사용하여 면역원 단백질(예를 들면, 서열 2 또는 8의 DC 단백질)에 대해 제2 단백질을 비교한다. 이러한 비교를 위해서, 두 개의 단백질을 광범위한 농도에서 각각 분석하고 부동화된 단백질에 대한 항혈청의 결합의 50%를 억제하는데 필요한 각각의 단백질의 양을 결정한다. 필요한 제2 단백질의 양이 필요한 서열 2 또는 8의 단백질의 양보다 2배 더 낮은 경우, 제2 단백질은 면역원에 대해 생성된 항체에 특이적으로 결합하는 것이다.

DC 단백질은 2개 이상의 유전자를 포함하는 상동성 단백질들의 패밀리일 것이다. 사람 Ig 패밀리 구성원 단백질 같은 특정 유전자 생성물에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 아미노산 서열 뿐만 아니라 대립형질성, 다형성, 비-대립형질성, 또는 종 변이체인 기타 단백질을 포함한다. 용어 "사람 DC 단백질"은 단일 부위 돌연변이 같은 통상적인 재조합 기술을 사용하는 의도된 돌연변이에 의해, 또는 상기 유전자로부터의 이러한 단백질 또는 스플라이스 변이체를 암호화하는 DNA의 짧은 부분을 절단하거나 신규한 아미노산의 작은 구성분을 부가함으로써 생성시킨 비천연 돌연변이를 포함한다. 상기 중요하지 않은 변형은 실질적으로 최초 분자의 면역 동일성 및/또는 이의 생물학적 활성을 유지해야만 한다. 따라서, 이러한 변형은 각각의 지적된 천연 DC 단백질, 예를 들면, 서열 4의 사람 DC 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 단백질을 포함한다. 중요하지 않은 것으로 사료되는 특정 단백질 변형은 전체로서 각각의 단백질 패밀리에 대해 상기 기술된 바와 같이, 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 서열 2 또는 8의 단백질과 함께 하나의 단백질을 최적으로 정렬하고, 본원에 기술된 통상적인 면역 분석법을 사용하여 면역 동일성을 측정함으로써, 본 발명의 단백질 조성을 측정할 수 있다.

IX. 용도

본 발명은 본원의 기타 부분에서 기술되는 바와 같은, 예를 들면, 발생 이상에 대한 일반 기술에서와 같은 진단 적용에서, 또는 하기 진단용 키트에 대한 기술에서 용도를 밝히게 될 시약을 제공한다. 특히, 유전자들은 mRNA 및 단백질 발현 패턴 뿐만 아니라 세포의 게놈성 양태를 포함하는, 세포 유형의 식별을 위한 마커로서 유용할 것이다.

DC 유전자, 예를 들면, DNA 또는 RNA는 수사 분석법(forensic assay)에서 한 성분으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 제공되는 뉴클레오타이드 서열은³²P 또는 바이오틴을 사용하여 표지할 수 있으며, 제한 단편 다형성 블롯을 탐지하여, 개체간의 식별에 도움을 주는 측정 가능한 특성을 제공하는데 사용할 수 있다. 상기 프로브는 유전자 핑거프린팅 같은 숙지된 수사 기술에서 사용될 수 있다. 부가적으로, DC 서열로부터 제조된 뉴클레오타이드 프로브는 원위치 하이브리드화에서 사용하여 염색체 이상을 검출할 수 있다.

DC 단백질 또는 핵산에 대해 지시된 항체 및 기타 결합제를 사용하여 상응하는 DC 분자를 정제할 수 있다. 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, DC 단백질의 항체 정제는 가능하고 실행 가능하다. 항체 및 기타 결합제는 또한 진단 양식으로 본원에 기술된 숙지된 기술을 사용하여 DC 성분이 조직 샘플 또는 세포 집단에 존재하는지를 측정하는데 사용될 수 있다. 결합제가 DC 단백질에 부착되는 능력은 발현 조절 이상과 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 항체 및 기타 DC 단백질 결합제는 또한 조직학적 또는 수사적 마커로서 유용하다. 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 이들 단백질 각각의 발현은 특정 조직 유형에 제한된다. 각각의 DC 단백질에 대해 항체 또는 핵산 같은 프로브를 지시함으로써, 프로브를 사용하여 원위치 또는 시험관내에서 조직 및 세포 유형을 식별하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 유의한 치료학적 가치를 나타낼 수 있는 시약을 제공한다. DC 단백질에 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 화합물과 함께, DC 단백질(천연 또는 재조합 단백질), 이의 단편, 및 이에 대한 항체는 비정상적인 생리학 또는 발생학과 관련된 조건, 예를 들면, 암 조건 또는 퇴행성 조건의 치료에 유용할 수 있다. 비정상적인 증식, 재생, 퇴행, 및 퇴화(atrophy)는 본원에서 제공되는 조성물을 사용한 적합한 치료학적 치료에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, DC, 예를 들면 항원 제시 세포로서 DC에 의한 비정상적인 발현 또는 비정상적인 신호전달과 관련된 질환 또는 질병이 상기 단백질의 효능제 또는 길항제에 대한 표적이 된다. 상기 단백질은 조혈 세포, 예를 들면, 림프구의 조절 또는 발생에서 역할을 하는 것으로 보이며, 이는 면역학적 반응, 예를 들면, 항원 제시 및 결과적인 이펙터 기능에 영향을 미친다.

기타 비정상적인 발생학적 조건들이 노던 블롯 분석에 의해 DC 단백질 mRNA를 보유하는 것으로 나타난 세포 유형에서 공지되어 있다. 문헌 참조[Berkow(ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; and Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY]. 예를 들면, 면역계의 발생학적 또는 기능적인 이상은 중요한 의학적 이상 및 조건을 야기하며, 이는 본원에서 제공되는 조성물을 사용하여 예방 또는 치료할 수 있다.

재조합 DC 단백질 또는 항체는 정제되어 이후, 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 시약은 치료학적 용도를 위해서 생리학적으로 무해한 안정화제 및 부형제와함께 예를 들면, 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 예를 들면, 면역원성 어쥬번트 중 부가적인 활성 또는 불활성 성분과 혼합될 수 있다. 특히, 이들은 백신 성분으로 유용할 수 있으며, 이때, 항원은 효능제 또는 길항제의 이러한 치료학적 형태 중 하나와 혼합된다. 이러한 혼합물은 살균 여과되어 투여형 바이알 중에서 동결건조화에 의해 투여형으로 또는 안정화된 수성 제제 중에 저장될 수 있다. 본 발명은 또한 상보적인 결합을 하지 않는 항체, 또는 이의 결합 단편의 용도를 포함한다.

항체, 또는 이의 수용체 또는 이의 단편을 사용하는 약제 스크리닝은 관련된 성분들의 분리를 포함하여, 이러한 DC 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 화합물을 확인할 수 있다. 이후, 후속적인 생물학적 분석법을 이용하여 상기 화합물이 내재적인 자극 활성을 가지며 따라서 상기 단백질의 활성을 차단하는 차단제 또는 길항제인지를 측정할 수 있다. 마찬가지로, 내재적인 자극 활성을 갖는 화합물은 단백질을 통해 세포를 활성화시킬 수 있으며 따라서, 세포를 자극하는 효능제이다. 본 발명은 단백질에 대한 항체의 길항제로서의 치료학적 용도를 추가로 포함한다.

효과적인 치료를 위해 필요한 시약의 양은 투여 방법, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 및 기타 투여되는 약제를 포함하는 수 많은 상이한 인자들에 따른다. 따라서, 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 적정되어야 한다. 전형적으로, 시험관내에서 사용되는 투여량은 이러한 시약의 원위치 투여를 위해 유용한 양의 유용한 본보기를 제공할 수 있다. 특정 질환의 치료에 대한 효과적인 투여량의 동물 실험은 추가로 사람 투여량의 예견적 지표를 제공할 것이다. 다양한 고찰이 예를 들면, 문헌[Gilman, et al.(eds.)(1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences(17th ed.) Mack Publishing Co. Easton, PA]에 기술되어 있다. 투여 방법은 본원에서 기술되며 하기, 예를 들면, 경구, 정맥내, 복막내, 또는 근육내 투여, 경피 확산 및 기타 방법으로 투여된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 염수, 완충액, 및 문헌[예를 들면, Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ]에서 기술되는 기타 화합물을 포함한다. 투여량 범위는 적합한 담체와 함께, 흔히 1mM 농도 미만의 양일 것으로 예견되며, 전형적으로 약 10μM 농도 미만, 일반적으로 약 100nM 미만, 바람직하게는 약 10pM(피코몰) 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1fM(펨토몰) 미만이다. 서방성 제형 또는 서방성 장치가 지속적인 투여를 위해서 종종 사용된다.

DC 단백질, 이의 단편, 및 이에 대한 항체 또는 이의 단편, 길항제, 및 효능제는 치료하고자 하는 숙주에 직접적으로 투여될 수 있거나, 화합물의 크기에 따라, 이들을 투여하기에 앞서 난알부민 또는 혈청 알부민 같은 담체 단백질에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료학적 제형은 수 많은 통상적인 투여 제형으로 투여될 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 약제학적 제형으로서 투여하는 것이 바람직하다. 제형은 전형적으로 하나 이상의 허용되는 담체와 함께 상기 정의한 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함한다. 각각의 담체는 모두 기타 성분들과 양립할 수 있는 측면에서 약제학적으로 및 생리학적으로 허용되는 것이고 환자에게 무해해야만 한다. 제형은 경구적, 직장내, 비내 또는 비경구적(피하, 근육내, 정맥내 및 경피내를 포함) 투여에 적합한 것을 포함한다. 제형은 단위 투여형으로 편리하게 존재할 수 있으며 제약 분야에서 숙지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Gilman, et al.(ed.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences(17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al.(eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lievberman, et al.(eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Deckker, NY; and Lieberman, et al.(eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY]. 본 발명의 치료법은 기타 화학치료제 또는 화학예방제와 혼합하거나 결합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 DC 단백질의 천연 및 재조합 형태는 상기 단백질에 대한 결합 활성에 대해 화합물을 스크리닝할 수 있는 키트 및 분석법에 특히 유용하다. 자동화 분석법의 수 개의 방법이 최근 수 년간 개발되어 단시간내에 수 만개의 화합물에 대한 스크리닝이 가능하게 되었다. 문헌 참조[Fodor, et al.(1991) Science 251:767-773 및 기타 다양한 화학적 문헌의 기술들(이는 다수의 화합물에 의한 결합 친화도를 시험하는 방법을 기술한다)]. 적합한 분석법의 개발은 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 DC 단백질의 대량의 정제된, 예를 들면, 가용성 형태가 이용 가능해짐에 따라 매우 촉진될 수 있다.

예를 들면, 일단 단백질이 구조적으로 정의되면, 길항제는 대개 발견될 수 있다. 잠재적인 단백질 유사체의 시험은 현재 정제된 표면 단백질을 사용하는 매우 자동화된 분석 방법의 개발에 의해 가능하다. 특히, 신규한 효능제 및 길항제가 본원에 기술된 스크리닝 기술에 의해 발견될 것이다. 특히 중요한 것은 다양한 관련된 세포 표면 항원에 대한 혼합된 결합 친화도를 갖는 화합물, 예를 들면, DC 단백질의 종 변이체에 대한 길항제로서 작용할 수 있는 화합물이 발견되는 것이다.

본 발명은 다양한 약제 스크리닝 기술에서 재조합 DC 단백질을 사용함으로써 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 특정 리간드에 대한 스크리닝에서 재조합 단백질을 사용하는 잇점은 (a) 특정 공급원으로부터의 단백질의 개선된 재생할 수 있는 공급원; (b) 분석법에서 노이즈 비율(noise rate)에 대해 보다 나은 신호를 제공하는 세포당 잠재적으로 보다 더 많은 수의 항원; 및 (c) 종 변이체 특이성(이론적으로는 보다 더 큰 생물학적 및 질병 특이성을 제공한다)을 포함한다.

약제 스크리닝의 한 가지 방법은 DC 단백질을 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환시킨 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 사용하는 것이다. 상기 단백질을 발현하는 세포는 서로로부터 분리될 수 있다. 살아 있거나 고정된 형태 모두의 상기 세포를 표준 표면 단백질 결합 분석법에 사용할 수 있다. 문헌 참조[Parce, et al.(1989) Science 246:243-247; and Owicki, et al.(1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, 이는 세포성 반응을 검출하는 민감한 방법을 기술한다]. 경쟁적 분석법이 특히 유용하며, 이때, 세포(DC 단백질 공급원)는¹²⁵I-항체 같은 항원에 대한 공지된 결합 친화도를 갖는 항체 및 결합 조성물에 대한 결합 친화도를 측정하고자 하는 시험 샘플과 접촉시키고 배양시킨다. 이후, 결합된 및 유리된 표지된 결합 조성물을 분리하여 단백질 결합 정도를 평가한다. 결합한 표지된 항체의 양은 공지된 공급원에 결합된 표지된 항체의 양과 반비례한다. 수 많은 기술을 사용하여 결합 정도를 평가하기 위해서 유리된 시약으로부터 결합된 시약을 분리시킬 수 있다. 이러한 분리 단계는 전형적으로 필터에 대한 부착 및 이어서 세척하거나, 플라스틱에 부착 및 이어서 세척하거나, 세포막을 원심분리시키는 것과 같은 방법과 관계된다. 살아있는 세포는 또한 이러한 DC 단백질 매개된 기능, 예를 들면, 항원 제시 및 헬퍼(helper) 기능에 대한 약제의 효과를 스크리닝하는데 사용할 수 있다.

또 다른 방법은 DC 단백질의 공급원으로서 형질전환된 진핵 생물 또는 원핵 생물 숙주 세포로부터의 막을 사용한다. 이러한 세포들은 적합한 단백질, 예를 들면, 유전자 조작된 막 결합 형태의 발현을 지시하는 DNA 벡터로 안정하게 형질전환시킨다. 필수적으로, 막은 세로부터 제조되고 상기 설명한 경쟁적 분석법 같은 결합 분석법에서 사용된다.

또 다른 접근법은 형질전환된 진핵 생물 또는 원핵 생물 숙주 세포로부터의 가용화되고 정제되지 않은, 또는 가용화되고 정제된 DC 단백질을 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 능력 및 높은 약제 시험 효율의 장점과 함께 "분자" 결합 분석법을 가능하게 한다.

약제 스크리닝을 위한 또 다른 기술은 개별적인 DC 단백질에 대한 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 높은 효율의 스크리닝을 제공하며, 이는 문헌[Geysen, 유럽 특허원 제84/03564호, 1984년 9월 13일에 공개됨]에 상세히 기술되어 있다. 우선, 수 많은 상이한 작은 펩타이드 시험 화합물을 고체 지지체, 예를 들면, 플라스틱 핀 또는 특정 기타 적합한 표면에서 합성한다[Fodor, et al. 상기]. 이후, 모든 핀들을 가용화되고 정제되지 않은, 또는 가용화되고 정제된 DC 단백질과 반응시킨 후 세척한다. 다음 단계는 검출 가능한 결합된 시약, 예를 들면, 항체와 관계된다.

특이적인 기타 단백질과 상호작용하는 부위를 결정하기 위한 한 가지 방법은 물리적인 구조 결정, 예를 들면, x-선 결정법 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 어떤 아미노산 잔기가 분자 접촉 영역을 형성하는지에 대한 보기를 제공한다. 단백질 구조 결정의 상세한 기술을 위해서는, 문헌 참조[Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY].

X. 키트

본 발명은 또한 DC 단백질 또는 메시지의 존재를 검출하기 위한 다양한 진단 키트 및 방법에서 상기 DC 단백질, 이의 단편, 펩타이드 및 이의 융합 생성물의 용도를 포함한다. 전형적으로 키트는 정의된 DC 단백질 또는 유전자 분절, 또는 상기 중 하나를 인식하는 시약, 예를 들면 항체 중 하나를 함유하는 구획을 갖는다.

개별적인 DC 단백질에 대한 시험 화합물의 결합 친화도를 측정하는 키트는 시험 화합물; 표지된 화합물, 예를 들면, 상기 단백질에 공지된 결합 친화도를 갖는 항체; DC 단백질의 공급원(천연 또는 재조합); 및 DC 단백질을 부동화시키기 위한 고체상 같은, 유리된 표지된 화합물로부터 결합된 화합물을 분리하기 위한 수단을 포함한다. 일단 화합물이 스크리닝되면, 상기 단백질에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물은 당해 분야에서 숙지된 바와 같이, 적합한 생물학적 분석법으로 평가하여 이들이 DC 기능을 조절하는 효능제 또는 길항제로서 작용하는지를 측정할 수 있다. 재조합 DC 폴리펩타이드의 이용 가능성은 또한 상기 분석법을 교정하기 위한 잘 정의된 표준을 제공한다.

샘플 중의 예를 들면, DC 단백질의 농도를 측정하기 위한 바람직한 키트는 전형적으로 표지된 화합물, 예를 들면, DC 단백질에 대한 공지된 결합 친화도를 갖는 항체, DC 단백질의 공급원(천연 또는 재조합), 및 DC 단백질을 부동화시키기 위한 고체상 같은, 유리된 표지된 화합물로부터 결합된 화합물을 분리하기 위한 수단을 포함한다. 시약 및 지침서를 함유하는 구획들이 통상적으로 제공된다.

개별적인 DC 단백질 또는 이의 단편에 특이적인, 항원 결합 단편을 포함하는 항체는 상기 단백질 및/또는 이의 단편의 상승된 수준의 존재를 검출하기 위한 진단 적용에 유용하다. 상기 진단 분석법은 용해물, 생세포, 고정된 세포, 면역형광, 세포 배양액, 체액을 사용할 수 있으며, 추가로 혈청 중 항원 등의 검출에 관계할 수 있다. 진단 분석법은 동질성(유리된 시약 및 항원-DC 단백질 복합체 사이의 분리 단계 없음) 또는 이질성(분리 단계 있음)일 수 있다. 다양한 시판중인 분석법이 존재하며, 방사선 면역분석법(RIA), 효소-결합된 면역흡착분석법(ELISA), 효소 면역분석법(EIA), 효소-다중화 면역분석법 기술(EMIT), 기질-표지된 형광 면역분석법(SLFIA) 등이다. 예를 들면, 표지되고 DC 단백질 또는 이의 특정 단편에 대한 항체를 인식하는 제2 항체를 사용함으로써, 표지되지 않은 항체를 사용할 수 있다. 유사한 분석법이 또한 문헌에 광범위하게 기술되어져 왔다. 문헌 참조[예를 들면, Harlow and Lane(1988) Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan(ed.)(1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, Fl; Price and Newman(eds.)(1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY; and Ngo(ed.)(1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY]. 특히, 시약은 생물학적 샘플 중의 DC 집단에서 샘플 중 DC의 초과 또는 결핍을 검출하기 위한 진단에 유용할 수 있다. 상기 분석법은 생검의 조직학적 분석, 또는 혈액 또는 조직 샘플 중 DC 수의 평가에 대해 지시될 수 있다.

항-이디오타입 항체는 다양한 비정상 상태의 병후일 수 있는, DC 단백질에 대한 항체의 존재를 진단하는데 유사한 용도를 갖는다. 예를 들면, DC 단백질의 과생성은 비정상적인 생리학적 상태, 특히 암 또는 비정상적인 분화 같은 증식성 세포 조건에서 비정상적인 생리학적 상태의 병후일 수 있는 다양한 면역학적 반응을 초래할 수 있다.

빈번하게, 진단 분석법을 위한 시약은 분석법의 민감도를 최적화할 수 있는 한, 키트로 공급된다. 본 발명에 있어서, 분석법, 프로토콜, 및 표지의 특성에 따라서, 표지된 또는 표지되지 않은 항체 또는 수용체, 또는 표지된 DC 단백질이 제공된다. 이는 일반적으로 완충액, 안정화제, 효소에 대한 기질 같은 신호 생성에 필요한 물질 등과 같은 부가제와 혼용된다. 바람직하게는, 키트는 또한 적절한 사용 및 사용 후 내용물의 처분에 대한 지침서를 함유한다. 전형적으로 키트는 각각의 유용한 시약에 대한 구획들을 포함한다. 바람직하게는, 시약들은 건조된 동결 건조 분말로서 제공되며, 이때, 시약들은 분석법을 수행하기 위한 시약의 적합한 농도를 제공하는 수성 매질에서 재구성될 수 있다.

약제 스크리닝 및 진단 분석법의 전술된 수 많은 구성 요소들이 변형없이 사용되거나 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 표지화는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공하는 잔기에 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 결합시켜 달성될 수 있다. 이러한 분석법의 많은 경우, 단백질, 시험 화합물, DC 단백질 또는 이에 대한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적인 표지화를 위한 가능성은 표지 그룹을 포함한다:¹²⁵I 같은 방사성 표지, 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파타제 같은 효소[미국 특허 제3,645,090호], 및 형광 강도, 파장 이동, 또는 형광 극성에서의 변화를 모니터링할 수 있는 형광 표지[미국 특허 제3,940,475호]. 간접적인 표지화를 위한 가능성은 하나의 성분을 바이오틴화시킨 후 상기 표지 그룹 중 하나에 결합된 아비딘에 결합시키는 것을 포함한다.

또한, 유리된 단백질로부터 결합된 단백질을 분리하거나, 대안으로, 유리된 시험 화합물로부터 결합된 시험 화합물을 분리하는 무수히 많은 방법들이 있다. DC 단백질은 다양한 매트릭스 상에서 부동화시킨 후 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스는 ELISA 플레이트, 필터 및 비드 같은 플라스틱을 포함할 수 있다. DC 단백질을 매트릭스에 부동화시키는 방법은 플라스틱에 대한 직접 부착, 포획 항체의 사용, 화학적 결합, 및 바이오틴-아비딘을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법에서 마지막 단계는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 같은 유기 용매 또는 암모늄 설페이트 같은 염을 사용하는 방법을 포함하는, 수 개의 방법 중 하나로 단백질/항체 복합체를 침전시키는 것과 관련된다. 기타 적합한 분리 기술은 문헌[Rattle, et al.(1984) Clin. Chem. 30:1457-1461]에 기술된 플루오레세인 항체 자성화될 수 있는 입자 방법, 및 문헌[미국 특허 제4,659,678호]에 기술된 바와 같은 이중 항체 자성 입자 분리를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 또는 이의 단편을 다양한 표지에 결합시키는 방법은 문헌에 광범위하게 공지되어 있으며 본원에서 상세한 토의를 필요로 하지 않는다. 수 많은 기술들은 카보디이미드 또는 활성 에스테르를 통해 활성화된 카복실 그룹을 이용하여 펩타이드 결합을 형성시키는 것, 머캅토 그룹과 클로로아세틸 같은 활성화된 할로겐의 반응에 의한 티오에테르의 형성, 또는 결합을 위한 말레이미드 같은 활성화된 올레핀 등이 관련된다. 융합 단백질은 또한 이러한 적용에서 용도가 있을 것이다.

본 발명의 또 다른 진단 양태는 각각의 DC 단백질의 서열로부터 나온 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도와 관련된다. 이러한 서열은 비정상적인 조건, 예를 들면, 암 또는 면역 이상이 의심되는 환자로부터의 샘플 중의 메시지의 수준을 검출하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. RNA 및 DNA 뉴클레오타이드 서열 모두의 제조, 상기 서열의 표지화 및 서열의 바람직한 크기는 문헌 중 풍부한 기술 및 논의가 있었다. 정상적으로, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 약 14개 이상의 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 18개 이상의 뉴클레오타이드를 가져야 하며, 폴리뉴클레오타이드 프로브는 수 kb일 수 있다. 다양한 표지가 사용될 수 있으며, 가장 흔히 방사성 핵종, 특히³²P가 사용된다. 그러나, 바이오틴 변형된 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드내로 도입하는 것과 같은 기타 기술들이 또한 사용될 수 있다. 이후, 바이오틴은 아비딘 또는 항체의 결합을 위한 부위로서 작용하며, 상기 아비딘 또는 항체는 광범위하게 다양한 표지들, 방사성 핵종, 형광단, 효소 등으로 표지될 수 있다. 대안으로, DNA 이량체, RNA 이량체, DNA-RNA 이량체, 또는 DNA-단백질 이량체를 포함하는, 특이적인 이량체를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 이후, 항체를 표지하고 분석법을 수행할 수 있으며, 이때, 이량체는 표면에 결합되어, 결과적으로 표면상에서 이량체가 형성되면, 이량체에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있게 된다. 신규한 안티센스 RNA에 대한 프로브의 사용은 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 스크리닝, 재조합 프로빙, 하이브리드 방출된 해독(HRT), 및 하이브리드 저지된 해독(HART) 같은 임의의 통상적인 기술로 수행할 수 있다. 이는 또한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 같은 증폭 기술을 포함한다.

또한 기타 마커의 정성적 또는 정량적 존재를 시험하는 진단 키트가 포함된다. 진단 또는 예견은 마커로서 사용되는 다중 지표들의 혼합에 의존할 수 있다. 따라서, 키트는 마커의 혼합물을 시험할 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Viallet, et al.(1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97].

XI. 결합 상대 분리

특이적인 상호작용의 결합 상대의 한 구성원을 분리하는 경우, 역-상대를 분리하는 방법이 존재한다. 문헌 참조[Gearing, et al.(1989) EMBO J. 8:3667-3676]. 예를 들면, 상호작용 없이 이의 수용체에 결합한 DC 단백질을 표지하는 방법이 결정될 수 있다. 예를 들면, 친화도 표지는 리간드의 아미노- 또는 카복실-말단에 융합될 수 있다. 예를 들면, 세포 분류에 의해 DC 단백질에 대한 특이적인 결합에 대해 발현 라이브러리를 스크리닝거나, 상기 결합 성분을 발현하는 서브 집단을 검출하는 다른 스크리닝을 수행할 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Ho, et al.(1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:11267-11271]. 대안으로, 패닝 방법(panning method)이 사용될 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Seed and Aruffo(1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:3365-3369]. 2-하이브리드 선택 시스템을 또한 이용 가능한 DC 단백질 서열을 사용한 적합한 작제물 제조에 적용할 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Fields and Song(1989) Nature 340:245-246].

표지를 사용한 단백질 교차 결합 기술은 DC 단백질의 결합 상대를 분리하는데 적용할 수 있다. 이는 적합한 DC 단백질에 특이적으로 상호작용하는 단백질의 확인을 가능하게 한다.

본 발명의 광범위한 범위는 하기 실시예를 참고하여 잘 이해될 것이며, 실시예는 본 발명을 특정 양태에 제한하고자 하는 것은 아니다.

I. 일반 방법

많은 하기 표준 방법들이 예를 들면, 문헌[Maniatis, et al.(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor Press, NY; Sambrook, et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.) Vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al.(1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis, et al.(eds.)(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY]에 기술되거나 인용된다.

단백질 정제를 위한 방법은 암모늄 설페이트 침전, 컬럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정화 등과 같은 방법을 포함한다. 문헌 참조[예를 들면, Ausubel, et al.(1987 and periodic supplements); Deutscher(1990)"Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series; Coligan, et al,(1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY; and manufacture's literature on use of protein purification products, e.g., Pharmacia, Piscataway, NJ, or Bio-Rad, Richmond, CA]. 재조합 기술을 사용하여 혼합물을 적합한 단편, 예를 들면, 프로테아제-제거할 수 있는 서열을 통해 융합될 수 있는 FLAG 서열 또는 등가물에 대해 융합시키는 것이 가능해 진다. 문헌 참조[예를 들면, Hochuli(1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli(1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow(ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al.(1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA].

면역학적 기능을 측정하기 위한 방법은 예를 들면, 문헌[Coligan, et al.(1992 and periodic Supplements) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, 또한 예를 들면, 참조: Paul(ed.)(1993) Fundamental Immunology(3d ed.) Raven Press, NY]에 기술되어 있다.

FACS 분석법은 문헌[Melamed, et al.(1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro(1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; and Robinson, et al.(1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY]에 기술되어 있다.

II. 덴드라이틱 세포(dendritic cell)의 생성

사람 CD34+ 세포를 하기와 같이 수득한다. 예를 들면, 문헌 참조[Caux, et al.(1995) pages 1-5 in Banchereau and Schmitt Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY]. 말초 혈액 세포 또는 심 혈액 세포(때때로 CD34+ 선택된)를 10%(v/v) 가열-불활성된 소 태아 혈청(FBS; Flow Laboratories, Irvine, CA), 10mM HEPES, 2mM L-글루타민, 5 x 10^-5M 2-머캅토에탄올, 페니실린(100㎎/㎖)이 보충된 내독소 비함유 RPMI1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)에서 간 세포 인자(Stem Cell Factor, SCF), GM-CSF, 및 TNF-a의 존재하에 배양시킨다. 이는 완전 배지로서 인용된다.

증식을 위해서 CD34+를 25 내지 75㎠ 플라스크에 2 x 10⁴세포/㎖로 씨딩(seeding)한다. 신선한 GM-CSF 및 TNF-a를 함유하는 배지를 사용하여 5 및 10일에 상기 배양물을 계대하면서(세포 농도: 1-3 x 10⁵개 세포/㎖), 최적의 조건을 유지시킨다. 특정한 경우, 세포를 약 6일째에서 CD1a 발현에 대해 FACS 분류시킨다.

특정 상황에서, 세포를 배양 12일 후 정규적으로 수집하며, 궁극적으로 점착성 세포를 5mM EDTA 용액을 사용하여 회수한다. 다른 상황에서는, CD1a+ 세포를 5 x 10⁶세포/㎖에서 완전 배지 중 현탁액으로서 활성화시키며 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, Sigma) 1㎎/㎖ 및 이오노마이신(Calbiochem, La Jolla, CA) 100ng/㎖를 사용하여 적합한 시간(예를 들면, 1 내지 6시간) 동안 활성화시킨다. 이러한 세포를 또 다시 6일 동안 증식시키고, cDNA 라이브러리 제조를 위해서 RNA를 분리시킨다.

III. RNA 분리 및 라이브러리 작제

전체 RNA를 예를 들면, 문헌[Chirgwin, et al.(1978) Biochem. 18:5294-5299]에 기술된 바와 같이 구아니딘/티오시아네이트/CsCl 구배 방법을 사용하여 분리한다.

대안으로, 폴리(A)+ RNA를 OLIGOTEX mRNA 분리 키트(QIAGEN)를 사용하여 분리한다. 이본쇄 cDNA를 예를 들면, cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 SUPERSCRIPT 플라스미드 시스템(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 생성시킨다. 수득되는 이본쇄 cDNA를 예를 들면, pSport1내로 한방향으로 클로닝시키고, 전기천공법으로 ELECTROMAX DH10BTM 세포(Gibco BRL, Gaitherburg, MD)내로 형질감염시킨다.

IV. 서열 분석

무작위로 뽑은 클론으로부터 분리된 DNA, 또는 불활성화된 세포를 사용하는 감소 하이브리드화 이후에, 표준 기술을 사용하는 뉴클레오타이드 서열분석을 수행한다. Taq DiDeoxy Terminator cycle 서열 분석 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용할 수 있다. 표지된 DNA 단편을 적합한 자동화된 서열분석기의 DNA 서열 분석 겔을 사용하여 분리한다. 대안으로, 분리된 클론을 문헌[Maniatis, et al.(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et a.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(2d ed.) vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al. Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausbel, et al.,(1987 and Supplement) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York]에 기술된 바와 같이 서열 분석한다. 예를 들면, 막삼 및 길버트 서열 분석 기술을 사용하는, 화학적 서열 분석 방법도 이용 가능하다.

V. 재조합 DC 유전자 작제물

폴리(A)⁺RNA를 예를 들면, FastTrack mRNA 키트(Invtrogen, San Diego, CA)를 사용하여 적합한 세포 집단으로부터 분리한다. 샘플을 예를 들면, 포름알데하이드를 함유하는 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 GeneScreen 막(NEN Rearch Products, Boston, MA)에 전이시킨다. 하이브리드화를 예를 들면,³²P-dCTP 표지된 DC 유전자 cDNA(10⁷cpm/㎖)를 사용하여, 65℃에서 0.5M NaHPO₄, pH 7.2, 7% SDS, 1mM EDTA, 및 1% BSA(분획 V)에서 수행한다. 하이브리드화 이후, 필터를 50℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 3회 세척하고 24시간 동안 필름에 노출시킨다.

재조합 유전자 작제물을 사용하여 메시지를 검출하기 위한 프로브를 생성시킬 수 있다. 삽입체를 절단하여 상기 기술된 검출 방법에 사용할 수 있다.

VI. 이. 콜라이에서 DC 유전자 단백질의 발현

PCR을 사용하여 바람직하게는 적합한 프로모터, 선택 및 조절 서열에 작동적으로 결합된 개방 판독 프레임을 포함하는 작제물을 작제한다. 수득되는 발현 플라스미드를 적합한, 예를 들면, Topp5 이. 콜라이 균주(Stratagene, La Jolla, CA)내로 형질전환시킨다. 암피실린 내성(50㎍/㎖) 형질전환체를 550㎚에서의 흡광도가 0.7이 될 때까지 37℃에서 루리아 브로스(Gibco)에서 배양시킨다. 재조합 단백질을 0.4mM 이소프로필-bD-티오갈락토-피라노사이드(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 유도시키고 세포의 배양을 추가의 18시간 동안 20℃에서 계속한다. 1리터 배양물로부터의 세포를 원심분리시켜 회수하고, 예를 들면, 빙냉시킨 30% 슈크로오스, 50mM 트리스 HCl pH 8.0, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산에 재현탁시킨다. 얼음에서 10분 후, 빙냉시킨 물을 전체 용적 2리터까지 부가한다. 얼음에서 20분 후, 세포를 원심분리시켜 제거하고 상등액을 5μM Milipak 50(millipore Corp. Bedford, MA)을 통해 여과시켜 청정화시킨다.

재조합 단백질을 표준 정제 방법, 예를 들면, 다양한 이온 교환 크로마토그래피 방법들을 통해 정제한다. 하기 기술되는 항체를 사용하는 면역 친화도 방법이 또한 사용될 수 있다. 친화도 방법은 에피토프 태그가 발현 작제물내로 유전자 조작되어 들어가는 경우 사용할 수 있다.

VII. 사람 DC 유전자의 맵핑

DNA 분리, 제한 효소 절단, 아가로오스 겔 전기영동, 서던 블롯 전이 및 하이브리드화를 표준 방법에 따라 수행한다. 문헌 참조[Jenkins, et al.(1982) J. Virol. 43:26-36]. 블롯은 Hybond-N 나일론 막(Amersham)을 사용하여 제조할 수 있다. 프로브는³²P-dCTP로 표지시키며; 세척은 최종 엄격함, 예를 들면 0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65℃의 엄격함으로 수행된다.

대안으로, BIOS Laboratories(New Haven, CT) 마우스 체세포 하이브리드 패널을 PCR 방법과 혼용할 수 있다. 문헌 참조[Fan, et al.(1996) Immunogenetics 44:97-103].

스탠포드 G3 패널을 사용한 염색체 위치화는 가장 근접한 마커 SHGC-12041로서 7.7의 로드(lod)를 제공한다. 상기 마커는 M130 항원을 암호화하는 유전자로서 염색체 12p13에 위치한다. 이러한 위치는 C-형 렉틴 패밀, 특히 CD69 및 NK 수용체 패밀의 수용체들을 암호화하는 수 많은 유전자들에게 중요한 부위이다.

VIII. 개체 변이의 분석

분포 데이터로부터, 풍부한 용이하게 이용 가능한 세포 유형이 개체로부터 샘플링하기 위해서 선택된다. PCR 기술을 이용하여, 개체의 대집단을 상기 유전자에 대해 분석한다. cDNA 또는 기타 PCR 방법을 사용하여 상이한 개체에서 상응하는 유전자를 서열 분석하며, 이의 서열을 비교한다. 이는 인종 집단 또는 기타 집단 모두에서 광범위한 다양성을 나타내며, 기능상에 극적인 영향을 주지 않고 어떠한 잔기가 변형될 수 있는지를 결정하게 한다.

IX. 항체의 제조

재조합 DC 단백질을 상기 나타낸 바와 같은 이. 콜라이에서 발현시킴으로써 생성시키고, 생물학적 활성에 대해 시험한다. 대안으로, 천연 단백질 공급원을 정제 방법을 사용하여 이용 가능하게 만들 수 있다. 항체 시약은 면역 정제에서, 또는 분리 방법을 찾아내기 위해서 사용할 수 있다. 활성 또는 변성 단백질을 폴리클로날 혈청 생산 또는 모노클로날 항체 생산을 위한 적합한 포유동물의 면역화에 사용할 수 있다.

X. 상응하는 영장류 또는 설치류 DC 유전자의 분리

이러한 유전자를 암호화하는 사람 cDNA를 프로브로 사용하거나, 다양한 영장류 종, 예를 들면, 침팬지에서 DC 유전자를 찾기 위한 PCR 프라이머를 디자인하는데 사용한다.

DCMP1의 예견된 폴리펩타이드 서열(tblastn 알고리듬)을 사용한 EST 데이터베이스의 생물정보학 연구(GenBank dbEST)는 영장류 DCMP1과 상동성인 단백질을 암호화하는 마우스 클론을 밝혀냈다. 상기 서열에 상응하는 4개의 클론이 나타난다: AA387662 Ko 마우스 배 11 5dpc; AA170532 마우스 췌장; AA3475012 마우스 유선; 및 AA423158 마우스 유선. 이 중 하나인, AA170532는 서열 분석에 의해 전장 클론이 선택되어 DNA 서열 분석되었다. 이러한 클론은 DCMP1과 유사한 특성을 갖는다. 상기 전장 클론은 1418bp로 폴리-A 서열이 제외되며 278bp의 5' UTR을 함유한다. hDCMP1에 있어서와 같이, 추정 개시 코돈은 컨센서스 Kozak 영역내에 포함되지 않지만, 상기 코돈은 상류 종결 코돈의 뒤에 위치한다. 5' UTR은 3개의 컨센서스 ATTTA 부위를 포함하는, 신속한 분해 신호와 유사한 서열들을 함유한다. 잠재적인 폴리아데닐화 서열이 나타난다. 예견되는 폴리펩타이드는 약 238개 길이의 잔기이며 ITIM 및 C-형 렉틴 도메인을 갖는 II형 막 단백질을 암호화한다. 이러한 잠재적인 N-글리코실화 부위가 나타난다. 상기 단백질 및 사람 단백질의 정렬은 전체 서열에 대해 약 54% 동일성, 65% 상동성을 나타낸다. 특히, ITIM 도메인은 매우 보존(15개 잔기 중 13개가 동일하다)된다. 흥미로운 것은 보존된 막-인접 글루타민 모티프(FQKYSQLLE) 및 디설파이드 가교 형성에 관련될 가능성이 있는 시스테인 잔기이다. 마찬가지로 C-형 렉틴 도메인은 EPS 모티프를 포함하는 보존된 구획을 나타낸다. hDCMP1 및 사람 간(hepatic) 렉틴 사이에 나타나는 차이점은 마우스 서열에서, 특히 119 및 163 위치에서 트립토판의 교체; 177 위치에서 글루타민; 및 228 위치에서 트립토판 대신 세린을 보유하는 것이다. 따라서, 이러한 클론은 hDCMP1의 마우스 동족체인 것으로 보인다.

XI. 세포 집단을 분석하기 위한 시약의 용도

샘플 중에 존재하는 덴드라이틱 세포의 수준을 검출하는 것은 비정상적인 질병 상태의 진단에 중요하다. 예를 들면, 조직 또는 림프계에서 덴드라이틱 세포 수의 증가는 DC 과형성증, 또는 조직 또는 이식 거부의 존재에 대한 지표일 수 있다. 낮은 DC 개체수는 예를 들면, 세균 또는 바이러스 감염에 대한 비정상적인 반응을 나타낼 수 있으며, 이는 DC 반응을 정상화시키기 위한 적절한 치료를 필요로 할 수 있다.

세포 표면 DC 단배질에 특이적인 표지된 결합제를 사용하는 FACS 분석법[예를 들면, Melamed, et al.(1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro(1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; and Robinson, et al.(1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY]을 사용하여 세포 혼합물, 예를 들면, PBMC, 점착성 세포 등에 존재하는 DC의 수를 측정한다. 결합제는 또한 DC의 침윤을 분석하기 위한 신선한 또는 고정된 조직 샘플의 조직학적 분석에 사용된다. 다양한 세포 집단을 세포 파괴 분석에서 또는 세포가 생존을 유지하는 특정 분석에서 또한 평가할 수 있다.

가용성 세포내 분자의 존재에 대한 분석을 예를 들면, 문헌[Openshaw, et al.(1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367]에 기술된 바와 같이 DC에 특이적인 형광 결합제를 사용하여 수행한다. 대안으로, 조직 또는 세포 고정 방법을 사용할 수 있다.

DC 전사체의 수준을 예를 들면, 문헌[Murphy, et al.(1993) J. Immunol. Methods 162:211-223]에 기술된 바와 같은 반정량적 PCR을 사용하여 정량화한다. 게놈 DNA는 검출되지 않는 방식으로 프라이머를 디자인한다.

XII. 발현 분포

서열 데이터베이스 중 전체 DCMP1 cDNA의 분석은 발현 패턴이 제한된 수의 라이브러리에 한정됨을 보여준다. 가장 많은 수의 서열(10개)이 덴드라이틱 세포 라이브러리에서 검출되며, 파골세포종 세포 라이브러리에서 4개 서열, 단핵 세포 로부터 시험관내에서 생성된 대식 세포, LPS 활성화된 호중구, 연골육종, 결장암, T-세포 임파종, 피부암 및 만성적인 활막염의 라이브러리로부터 1개 서열이 검출된다. GenBank dbEST에서 4개의 클론이 검출된다: AA418441, 감소된 라이브러리; AA446401, 전체 태아; AA677149, 태아 간 췌장; C01555, 사람 유전자 서명; 및 AA380065, 피부암.

수 많은 상이한 세포주 및 신선하게 분리된 세포에 대한 RT-PCR에 의한 DCMP1 발현 분석은 DCMP1의 발현이 TF1(골수 전구체), Jurkat(T 세포주), CHA(신장암), MRC5(태아 폐 섬유아세포), JY(B 세포주), U937(미엘로-단핵성 임파종 세포주)에서는 검출되지 않고 조혈 세포에 제한됨을 나타난다. 신선하게 분리된 세포에서, 비-활성화된 및 활성화된 세포 모두에서 DC가 나타나며; 활성화된 과립구에서 나타나고; 불활성화된 및 활성화된 PBL에서 나타나며; 활성화된 단핵 세포에서는 낮은 수준으로 나타나고; 활성화된 B 세포에서 나타난다. 모든 활성화된 샘플은 PMA/이오노마이신으로 1 및 6시간 동안 처리한 세포의 풀(pool)이다.

부가적인 분석은 DCMP1 발현은 세포의 활성화 상태에 따라 다양함을 나타낸다. RT-PCR을 또한 사용하여 상이한 활성화 상태에서 DCMP1의 발현을 검출할 수 있다. 편도선 조직으로부터 분리시킨 B 세포를 PMA/이오노마이신으로 1 또는 6시간 동안 처리하거나 CD40L-발현 L 세포와 함께 3, 12 및 24시간 동안 공-배양시킨다. 불활성화된 세포에서는 mRNA가 검출된다. 상기 발현은 PMA/이오노마이신 처리 1시간 후 및 CD40L 처리 3시간 후 상실된다. 반대로, T 세포에서는 어떠한 발현도 검출되지 않으며, 항-CD3/항-CD28 배양 후에도 검출되지 않는다.

CD34+ 유도된 세포에서 DCMP1의 발현은 M-CSF의 존재하에서 CD34+ 전구체 세포로부터 유도된 대식 세포에서 강력하다. 이러한 발현은 PMA/이오노마이신에 대한 반응에서도 변하지 않는 것으로 보인다. GM-CSF 및 TNFa의 존재하에서 CD34+ 전구체 세포로부터 유도된 DC에서, mRNA의 수준은 배양 시간 경과에 따라 다양해지며, 배양 12일째에 보다 대량의 mRNA가 검출된다. CD40L 생성 L 세포와의 공-배양 48시간 후, DCMP1의 발현이 상실된다. 시험관내에서 DC FACS로 CD1a/CD14 마커의존재에 대해 6일째에 분류하고 추가의 6일 동안 배양을 계속하면, CD1a 아집단에서 보다 CD14에서 보다 많은 mRNA가 검출된다. 이러한 발현은 PMA/이오노마이신 처리에 의해 감소-조절된다.

혈액으로부터 분리된 단핵 세포에서, 불활성화된 세포의 경우 어떠한 mRNA도 검출되지 않는다. 그러나, DCMP1의 발현은 PMA/이오노마이신 처리 6시간 후 검출된다. GM-CSF 및 IL-4로 처리하여 단핵 세포로부터 유도된 DC에서, DCMP1 발현은 상승-조절된다. 이러한 발현은 PMA/이오노마이신 처리에 의해서 변화되지 않지만, CD40L을 발현하는 L 세포와의 공-배양에 의해 감소-조절된다. 이러한 경우, DCMP1 mRNA 발현은 배양 24시간 후에 완전히 상실된다. 사람 단백질의 발현은 항체 검출 방법으로 확인한다.

DCMP1은 생체외 분리된 DC의 서브 세트에서 발현된다. 혈액 또는 편도선 조직으로부터 분리된 DC 서브 세트는 인테그린 CD11c의 존재 또는 부재에 의해 특성화된다. 문헌 참조[Larson and Springer (1990) Immunol. Rev. 114:181-217]. 혈액으로부터 분리된 DC의 CD11c+ 서브 세트(또한, GCDC로 공지됨)는 DCMP1을 발현한다. 그러나, 항-CD40L 또는 PMA/이오노마이신 처리를 통해 활성화된 후에는 어떠한 mRNA도 검출되지 않는다. 반대로, 편도선 조직으로부터 분리된 세포의 동일한 서브 세트는 더 이상 DCMP1을 발현하지 않는다. CD11c- DC 서브 세트의 경우, 혈액으로부터 분리된 세포에서 낮은 수준의 발현이 관찰된다. 이러한 발현은 편도선으로부터 분리된 세포에서 보다 높지만, 항-CD40 항체 또는 PMA/이오노마이신 처리를 통한 활성화 후 다시 감소-조절된다. 피부로부터 분리된 랑게르한스 세포는 DCMP1을 발현하는 반면, 주변 기저 세포들은 어떠한 발현도 나타내지 않는다.

XIII. 영장류 DCMP1

서열 분석은 이러한 DCMP들이 렉틴/무시알로당단백질 수용체의 슈퍼패밀리의 구성원임을 제시한다. 특히, 간 렉틴 및 대식 세포 렉틴은 예를 들면, 덴드라이틱 세포에 의한 항원 흡수 및 항원 제시에 중요할 수 있는 단백질 및 펩타이드의 내재화와 관계가 있다. DCMP1은 내재화 모티프(YxxV) 또는 ITIM-형 모티프(IxYxxV; 서열 2의 5 내지 10번 잔기; 보다 확장된 모티프는 1 내지 24번 잔기이다)를 함유한다. 이는 상기 단백질이 억제성 수용체(KIR; LIR 등) 패밀리의 덴드라이틱 세포 변형일 수 있음을 제시하며, 이러한 억제성 수용체는 세포 기능을 억제시키는 네가티브 신호를 보낸다.

추정 개방 판독 프레임은 약 242번 뉴클레오타이드에서 개시된다. 이러한 잠재적인 개시 코돈은 컨센서스 Kozak 서열이 아니지만, 또 다른 ATG의 뒤에 위치하며 종결 코돈은 상류의 200번 위치에 존재하기 때문에, 이것이 암호화된 단백질의 출발점임을 예시한다. 약 237개 아미노산의 폴리펩타이드가 상기 서열로부터 예견된다. 어떠한 신호 펩타이드도 검출되지 않지만, 추정 트랜스막 서열은 약 386 내지 443번 위치에 존재한다. 상기 클론은 C-형 렉틴 도메인과 함께 II형 막 단백질을 암호화한다. 3'UTR은 수 많은 잠재적인 신속한 분해 신호를 함유하며, 3개의 컨센서스 서열 ATTTA의 반복체를 포함한다. 어떠한 신호 펩타이드도 검출되지 않지만, 추정 트랜스막 서열은 45 내지 62번 위치에 존재하거나, 대안적으로, 386 내지 443번 위치에 존재한다. 이러한 클론은 C-형 렉틴 도메인과 함께 II형 막 단백질을 암호화한다.

서열 분석으로부터 예견되는 폴리펩타이드는 7번 잔기에 중심을 둔 티로신-기초 모티프를 포함하는 49개 아미노산 세포내 도메인을 갖는다. 상기 특성의 YXX(L/V) 모티프는 간 렉틴 및 CD23(Fce RIIa)의 경우에 내재화 모티프로서 작용하는 것으로 보인다. 상기 유형의 도메인은 면역글로불린-형 분자의 Ly49, NKG2A, 및 KIR 패밀리와 같은 분자내에서 활성화(ITAM) 또는 억제성(ITIM) 모티프로서 작용하는 것으로 보인다. 억제는 컨센서스 도메인 (I/V)XYXX(L/V)에 SHP2/SHP1 포스파타제를 사용함으로써 매개된다. DCMP1의 첫 번째 15개 아미노산은 확장된 ITIM 도메인에 대해 보존되며, 세포 기능의 억제가 DCMP1의 특성 중 하나일 수도 있다. 단일 잠재적인 N-글리코실화 부위가 약 185번 위치에 존재한다.

DCMP1의 C-형 렉틴 도메인과 C-형 렉틴 도메인을 함유하는 다른 단백질과의 아미노산 서열의 비교는 DCMP1이 간 렉틴 및 대식 세포 렉틴과 가장 높은 상동성을 갖는다는 것을 나타낸다(표 1 참조). C-형 렉틴 부분의 보존된 시스테인 잔기는 패밀리의 구성원들 간에 명확히 보존되지만, 수 많은 식별 가능한 특성들이 나타날 수 있다. 간 렉틴과 마찬가지로, DCMP1은 렉틴 도메인의 개시부에서 이중 시스테인 모티프를 갖는다. 이러한 추가의 시스테인의 기능은, 이러한 잔기와 디설파이드 가교를 형성할 수 있는 어떠한 다른 시스테인이 렉틴 도메인내에 존재하지 않기 때문에, 불명확하다. 상기 기능을 충족시켜 줄 가능성이 있는 91번 위치에서 DCMP1 중 또 다른 시스테인이 존재하기는 하지만, 상기 잔기가 분자내 디설파이드 가교 형성에 관계될 수 있다는 가능성이 있다. DCMP1 렉틴 도메인의 N-말단 부분은 간 렉틴 및 대식 세포 렉틴과 가장 보존되어 있다. 갈슘-결합 도메인은 DCMP1에서 보존되며 EPS 모티프(195 내지 197번 잔기), 201번 위치에서 글루타메이트(E) 및 218 내지 219번 위치에서 아스파라긴 아스파르테이트(ND)를 포함하여, CD23과 가장 상동성이 높다. 상기 모티프들은 NK 수용체(본원에서는 NKGE로 나타냄) 및 CD94로부터는 독특하게도 존재하지 않는다.

DCMP1은 45 내지 62번 잔기로부터 예견되는 트랜스막 분절을 갖는 II형 막 단백질이다. 이는 무시알로당단백질 수용체, 간 렉틴, CD69, CD 72, CD23, 및 NK 수용체를 포함하는 단백질 패밀리와 관련이 있다. 상기 단백질은 카복실 말단(약 104 내지 237번 잔기)에서 세포외 Ca 의존성 C-형 렉틴 도메인을 함유하며, 이는 당 잔기 특이성의 모티프 특성을 나타낸다. 표 1을 참조한다. 이러한 단백질들은 전형적으로 당단백질 상의 당 잔기에 결합하며 1차 면역 반응에 관계한다. 상기 패밀리의 수 개의 구성원, 특히 CD69, NK 수용체 및 CD72는 증식 및 특정 유전자의 유도를 포함하는 세포 활성화 사건 동안 신호를 전달하는 것으로 보인다.

마우스 C-형 렉틴 KIR 수용체, Ly49와 마찬가지로, DCMP1은 억제성 수용체의 그룹에 확장된 상동성을 갖는 내재화 모티프를 함유한다[ITIM 도메인, 최근 개략은 다음을 참조: Vivier and Daeron(1997) Immunology Today 18:286-291; and Katz and Austen (1997) J. Immunol. 158:5065-5070]. 이러한 수용체들, 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF) 구성원 또는 C-형 렉틴은 예를 들면, 포스파타제, SHIP, SHP-1, 및 SHP-2를 함유하는 SH-2 도메인을 통해 네가티브 신호를 전달한다. 증거는 이러한 수용체들이 활성화 신호를 차단하기 위해서 기타 활성화 수용체와 결합한다는 것을 제안한다. 증거는 또한 이러한 유형의 분자에 대한 리간드는 IgSF 분자임을 제안한다. 이러한 예는 MHC I형 분자(CD49/NK 수용체 및 Ly49에 의해 인식됨) 및 FcgR(CD23; 이는 IgG를 인식한다)이다.

91번 시스테인 잔기는 또 다른 폴리펩타이드, 아마도 호모 이량체 또는 헤테로 이량체에 대한 디설파이드 결합에 관계하는 것으로 보인다.

PCR 분석은 상기 유전자가 활성화된 덴드라이틱 세포 및 비-활성화된 덴드라이틱 세포에서 발현된다는 것을 나타낸다. 검출 가능한 신호가 TF1(조혈 세포주), Jurkat(T 세포주), MRC5(폐 섬유아세포 육종 세포주), JY(B 세포주), U937(전-단핵 세포주), 또는 CHA(선암 세포주)세포 중 어느 것에서도 발견되지 않는다. 포지티브 신호는 신선하게 분리된 활성화된 또는 불활성화된 PBL, 및 과립구에서 검출되지만, 매우 약한 신호가 신선하게 분리된 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵 세포에서 검출된다.

서열 분석은 덴드라이틱 세포, 활성화된 호중구, 대식 세포(GM-CSF로 활성화된), 파골세포종, 피부암, T-세포 임파종, 결장암, 만성 활막염, 및 연골육종으로 특성화된 샘플 중의 상기 유전자의 발현을 나타낸다.

XIV. 설치류 DCMP1 상응물

표 2는 설치류의 상응하는 서열들의 서열을 나타낸다.

서열은 DCMP1(서열 8)의 마우스 상응물을 암호화하는 마우스의 2개의 EST, W33446(서열 11) 및 AA170532(서열 8)와 상동성을 나타낸다.

XV. 영장류 DCMP2

추정 무시알로당단백질 수용체인 DCMP2는 II형 트랜스막 단백질이다. 이의 새포외 영역에서, DCMP2는 렉틴의 C-형(Ca++ 의존성) 패밀리[Drickaner and Taylor(1993) Ann. Rev. Cell Biol. 9:237-264]의 특성을 나타내는, 단일 탄수화물 인식 도메인(CRD)이 특징적이다. DCMP2는 사람 간 무시알로당단백질 수용체의 서브 유니트를 암호화하는 두 개의 유전자(H1 및 H2)와 상당한 상동성을 나타낸다. 문헌 참조[Stockert (1995) Physiol. Revs. 75: 591-609]. 이러한 간 수용체는 II형 C-형 렉틴 패밀리 구성원의 원형을 나타낸다. 간 ASGPR은 말단 갈락토실 잔기를 나타내는 탈시알화된 당단백질에 결합 특이성을 가지며 클라트린-피복된 피트 경로를 통해 간세포로의 이의 식균 작용을 매개한다. 특히, 이러한 기능 둘 모두와 관련된 특성은 간 ASGPR 및 DCMP2 사이에서 보존되어 있다. 따라서, DCMP2는 5번 위치에서 티로신 잔기를 함유하는 세포내 모티프를 함유하며 이는 리간드 식균 작용 수용 능력과 관계된다. 문헌 참조[Fuhrer, et al.(1991) J. Cell Biol. 114:423-431]. 또한, DCMP2는 이의 당 인식 도메인내에 QPD(Gln-Pro-Asp) 갈락토오스-인식 유형 서열[Drickamer(1992) Nature 360: 183-186]을 나타낸다.

DCMP2를 암호화하는 수 개의 변이체 cDNA 클론이 분리되었으며, 대부분 또 다른 스플라이싱의 결과물인 것 같다. 3개의 변이체가 이후 기술된다: 짧은 형태, 긴 형태, 및 DCMP2v라고 명명된 세 번째 형태. 서열 4 및 10과 표 1을 참조한다. 짧은 형태 및 긴 형태는 짧은 형태 클론의 세포외 영역에서 독특한 27개 아미노산의 존재로 인해 서로 상이하다. DCMP2의 짧은 형태는 사람 대식 세포(M-ASGPR)로부터 수득되는 최근에 클로닝된 ASGPR과는 세포외 영역에서 4개 잔기의 상이점을 나타낸다. 문헌 참조[Suzuki, et al.(1996) J. Immunol. 156:128-135].

DCMP21과 관련하여, ASGPRm은 GVSELQEHTTQKALGHCPHCPSVCVP(서열 4의 118 내지 144번 잔기)에 상응하는 분절이 결핍되어 있고 GEE(서열 4의 173 및 174번 잔기 사이)의 삽입체를 함유한다. DCMP2s는 DCMP21과 동일하지만, 단 GVSELQEHTTQKALGHCPHCPSVCVP(서열 4의 173 및 174번 잔기)가 결핍되어 있으며, 1064번 뉴클레오타이드에서 서열의 차이로 인해 asp 대신 asn을 암호화하게 된다. DCMPv는 DCMPs와 유사하지만, 서열 LLQRLRSGPCHLLLSLGLG(서열 4의 30 내지 48번 잔기)이 결핍되어 있고, 이는 트랜스막 분절의 유의한 부분에 상응하는 것이며; asgprM에서 발견되는 바와 같은 GEE(서열 4의 173 및 174번 잔기 사이)의 삽입체를 함유한다. 예를 들면, 에피토프 길이내의, 예를 들면 12 내지 17개 아미노산에서의 이러한 차이점의 주변 영역이 관심의 대상이다.

재조합 DCMP2 긴 형태 단백질은 이용 가능하며, mAB가 생성되었다. 부가적으로, 쥐 세포주에 긴 형태 및 짧은 형태 모두를 안정하게 발현하도록 형질전환시켰다.

상기 유전자는 GM-CSF 및 TNFa에서 배양시킨 CD34⁺조혈세포의 전구체 세포로부터 유도된 70% 순수한 CD1aA⁺DC로부터 최초로 분리되었다[Caux, et al.(1992) Nature 360:258-261]. 상기 클론을 pSport1 벡터(NotI/SalI 제한 부위)내로 삽입한다.

PCR 분석은 덴드라이틱 세포에서 DCMP2의 발현 및 TF1(조혈 세포주) 세포에서 아마도 매우 약한 발현을 나타낸다. Jurkat(T 세포주), CHA(선암 세포주), MRC5(폐 섬유아세포 육종 세포주), 또는 JY(B 세포주)에서는 어떠한 검출 가능한 신호도 존재하지 않는다. 신호는 신선하게 분리된 불활성화된 또는 활성화된(PMA 및 이오노마이신) 덴드라이틱 세포, 과립구, 및 불활성화된 또는 활성화된 PBL에서 검출된다. 신호는 단핵 세포, 불활성화된 또는 활성화된 T 세포, 또는 불활성화된 또는 활성화된 B 세포에서는 검출되지 않는다.

DC-ASGPR은 사람 단핵 세포 ASGPR(M-ASGPR)의 쥐 대응물과 상당한 상동성을 나타낸다. 상동성은 쥐 단핵 세포 ASGPR에 갈락토오스 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 대한 특이성을 부여하는 탄수화물-인식 도메인내에서 현저하다(~60%). 문헌 참조[Sato, et al. (1992) J. Biochem. 111:331-336]. 이는 QPD 모티프를 포함하며, 또한 간의 ASGPR의 H1 및 H2 서브 유니트에서도 발견된다. 부가적으로, 쥐 단핵 세포 ASGPR은 이의 세포질 도메인내에서 YENL 내재화 신호를 갖는다.

쥐 M-ASGPR은 갈락토실화된 당단백질의 식균 작용을 위한 수용체로서 기능하며[Ozaki, et al.(1992) J. Biol. Chem. 267:9229-9235], 종양 살상 대식 세포에 의한 악성 종양 세포의 인식을 가능하게 한다[Kawakami, et al.(1994) Jpn. J. Cancer Res. 85:744-749]. 이와 관련하여, 쥐 M-ASGPR은 OV2944-HM-1 전이성 난소암 세포를 갖는 쥐의 폐 전이성 혹내에서 발현되는 것으로 확인되었다[Imai, et al. (1995) Immunol. 86:591-598]. 흥미로운 것은, 사람 ASGPR이 Tn 항원에 대한 현저한 특이성을 나타내는 것으로[Suzuki, et al.(1996) J. Immunol. 156:128-135], 이는 세린 또는 트레오닌-결합된 말단 GalNAc의 집단을 가지며, 사람 암종과 결합한다[Springer(1989) Mol. Immunol. 26:1-5; and Ørntoft, et al.(1990) INt. J. Cancer 45:666-672].

사열 상동성에 근거하여, DCMP는 또한 갈락토실화된 당단백질에 대한 식균 작용성 수용체로서 기능한다는 것을 예견할 수 있다. 부가적으로, 또 다른 C-형 트랜스막 식균 작용성 렉틴인 만노오스-수용체를 통한 리간드 내재화는 MHC II형 경로를 통해 DC에 의한 매우 효과적인 항원-제시를 야기한다. 문헌 참조[Cella, et al.(1997) Current Opinion Immunol. 9:10-16]. 유사성에 의해, DCMP는 항원-제시 경로내로 내재화된 리간드를 수송하는데 있어서 유사한 역할을 수행하는 것이 가능하다.

따라서, DCMP2는 면역-기초한 어쥬번트 치료에서 T 세포에 대한 항원-제시를 강화시키기 위해서 DC내로 항원을 수송하기 위한 잠재적인 매우 효과적인 표적이 될 수 있다. 이는 시험관내에서 갈락토실화된 항원 형태 또는 항원에 결합된 DCMP2 mAb를 사용하여 DC를 펄싱(pulsing)함으로써 접근할 수 있다. 항원 제시의 시험관내 효율을 항원-특이적인 T 세포의 활성화에 의해 분석할 수 있다. 이는 상기 접근법의 고유한 치료학적 전망으로 인해, 종양-관련된 항원(TAA)의 제시에 관심이 모아진다. 특히 흥미로운 것은 악성 흑색소 세포종과 관련된 TAA이다.

부가적으로, 사람 M-ASGPR의 Tn 항원에 대한 특이성은 상기 선암 TAA를 DCMP2를 표적화하기 위한 선택 후보가 되게 한다.

또한, 최근에는 외인성 항원이 MHC I형 경로내에서 가공되어 제시될 수 있는 것으로 보인다. 문헌 참조[Porgador and Gilboa (1995) J. Exp. Med. 182:255-260; Paglia, et al.(1996) J. Exp. Med. 183:317-322]. 특성화된 수용체들이 DC에서 상기의 기능을 수행하는 것으로 보인다.

DC내의 이러한 수용체들은, 세포 독성 T 세포(CTL)가 종양 거부 유도에 관여하는 것으로 보이기 때문에, 현저한 치료학적 잠재력과 함께 TAA-특이적인 CTL을 생산하는 것을 돕기 위해서 표적화될 수 있다.

XVI. DCMP 내재화

GM-CSF 및 TNFa에서 배양된 CD34+ 전구체로부터 수득된 DC를 항-DCMP2 mAb 또는 대조군으로서 항-CD13을 사용하여 4℃에서 염색한다. 약 20분 미만의 기간 동안 37℃에서 후속 배양한 후, 세포 표면 결합된 mAb를 분석한다. 내재화는 세포 표면 형광의 감소로 관찰된다.

DCMP21은 37℃에서는 신속하게 내재화되지만, 4℃에서는 그렇지 않다. 표면 표지의 약 60%가 약 15분내에 사라진다. 이는, 세포질내 도메인에 내재화 모티프(YENF)의 존재와 일치하며, DCMP2가 식균 작용성 수용체로서 작용할 수 있음을 입증해 준다.

XVII. 결합 대응물의 분리

DC 단백질은 항체가 사용되는 바와 마찬가지로, 이의 결합 특이성의 장점을 사용함으로써, 특이적인 결합제로서 사용할 수 있다. 결합제는 상기된 바와 같이, 예를 들면, 형광 또는 그밖의 것으로 표지하거나 패닝 방법에 의해 기질에 부동화된다.

DC 단백질을 사용하여 결합을 나타내는 세포주를 스크리닝할 수 있다. 표준염색법을 사용하여 세포내 또는 표면 발현된 리간드를 검출하거나 분류하거나, 패닝에 의해 표면 발현하는 형질전환된 세포를 스크리닝한다. 세포내 발현의 스크리닝은 다양한 염색 또는 면역 형광 방법으로 수행한다. 문헌 참조[McMahan, et al.(1991) EMBO J. 10:2821-2832].

예를 들면, 0일째, 실온에서 30분 동안 챔버 당 피브로넥틴 1㎖, PBS 10ng/㎖을 사용하여 2-챔버 퍼마녹스 슬라이드를 예비 피복시킨다. PBS로 한번 린스한다. 이후 챔버 당 성장 배지 1.5㎖ 중 2 내지 3 x 10⁵세포로 COS 세포를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한다.

1일째, 각각의 샘플에 대해서, 혈청 비함유 DME 중 DEAE-덱스트란 66㎎/㎖, 66mM 클로로퀸, 및 4㎎ DNA의 0.5㎖ 용액을 제조한다. 각각의 세트에 대해서, 포지티브 대조군, 예를 들면, 1 및 1/200 희석액으로 사람 수용체-FLAG cDNA 및 네가티브 대조군을 제조한다. 세포를 혈청 비함유 DME로 린스한다. DNA 용액을 부가하고 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 배지를 제거하고 2.5분 동안 DME 중 10% DMSO 0.5㎖를 부가한다. 제거하고 DME로 1회 세척한다. 성장 배지 1.5㎖를 부가하고 밤새 배양한다.

2일째, 배지를 교체한다. 3 또는 4일째, 세포를 고정하고 염색한다. 세포를 행크스 완충된 염수 용액(HBSS)로 2회 린스하고 4% 파라포름알데하이드(PFA)/글루코오스로 5분 동안 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 모든 액체를 제거한 후 상기 슬라이드를 -80℃에서 저장할 수 있다. 각각의 챔버에 대해서, 0.5㎖ 배양을 하기와 같이 수행한다. 1M NaN₃의 32㎖/㎖과 함께 HBSS/사포닌(0.1%)를 20분 동안 부가한다. 이후 세포를 HBSS/ 사포닌로 1회 세척한다. 단백질 또는 단백질/항체 복합체를 세포에 부가하고 30분 동안 배양한다. 세포를 HBSS/.사포닌으로 2회 세척한다. 바람직한 경우, 제1 항체를 30분 동안 부가한다. 제2 항체, 예를 들면, Vector 항-마우스 항체를 1/200 희석액으로 부가하고 30분 동안 항온 처리한다. ELISA 용액, 예를 들면, Vector Elite ABC 서양고추냉이 퍼옥시다제 용액을 제조하고 30분 동안 예비 항온 처리한다. 예를 들면, 2.5㎖ HBSS/사포린 당 용액 A(아비딘) 1 방울 및 용액 B(바이오틴) 1 방울을 사용한다. 세포를 HBSS/사포린으로 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 부가하고 30분 동안 항온 처리한다. 세포를 HBSS로 2회 세척하고 2분 동안 제2 세척하고, 세포를 부착시킨다. 이후, Vector 디아미노벤조산(DAB)을 5 내지 10분 동안 부가한다. 유리 희석된 물 5㎖ 당 완충액 2 방울 및 DAB 4 방울 및 H₂O₂2 방울을 사용한다. 챔버를 조심스럽게 제거하고 물로 슬라이드를 린스한다. 수 분 동안 공기 건조시킨 후, 크리스탈 마운트 1 방울을 부가하고 커버를 덮는다. 85 내지 90℃에서 5분 동안 베이킹한다.

대안으로, 다른 단핵 세포 단백질 특이적인 결합제를 사용하여 친화도 정제하거나 수용체를 발현하는 세포를 분류한다. 예를 들면, 문헌 참조[Sambrook, et al. or Ausubel, et al.].

또 다른 전략은 패닝에 의해 막 결합 수용체를 스크리닝하는 것이다. 수용체 cDNA를 상기 기술된 바와 같이 작제한다. 리간드를 부동화시키고 발현 세포를 부동화시키는데 사용한다. 부동화는 예를 들면, 단핵 세포 단백질 융합 작제물의 FLAG 서열을 인식하는 적합한 항체, 또는 제1 항체에 대해 생성된 항체를 사용함으로써 달성할 수 있다. 반복적인 선택 및 증폭 사이클을 통해 적합한 클론을 농축시키고 최종적으로 리간드 발현 클론을 분리한다.

파아지 발현 라이브러리를 단핵 세포 단백질로 스크리닝할 수 있다. 적합한 표지 기술, 예를 들면, 항-FLAG 항체는 적합한 클론의 특이적인 표지를 가능하게 한다.

당해 분야의 숙련자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 본 발명의 많은 변형 및 변화가 있을 수 있다. 본원에 기술된 특정 양태는 단지 예로서 제공되며, 본 발명은 청구의 범위에 의해 권한이 부여되는 모든 범위의 등가물과 함께, 오로지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

Claims (9)

1. 서열 2 또는 8과 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DCMP1 폴리펩타이드.
2. a) 1) Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro(서열 4의 118 내지 144번 잔기들); 2) Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys(서열 4의 166 내지 181번 잔기들); 또는 3) Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Gly Leu Gly(서열 4의 263 내지 277번 잔기들)로부터 선택되는 폴리펩타이드, 또는

   b) 1) 서열 10에서 기술된 바와 같은 DCMP2v로부터의 17개 이상의 연속되는아미노산을 나타내고; 및 2) FKNGPLPLQS LLQRLRWGPC HLLLWLGLGL LLLVIIC(서열 4의 20 내지 56번 잔기들)로부터의 12개 이상의 연속되는 아미노산 분절이 결핍된 서열을 포함하는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DCMP2 폴리펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
4. 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물.
5. 제4항에 있어서, 항체 또는 항체 단편인 결합 화합물.
6. 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
7. 제6항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
8. 제7항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
9. 폴리펩타이드를 발현하는 조건하에서 제8항의 숙주 세포를 배양함을 포함하여 재조합적으로 폴리펩타이드를 생산하는 방법.