ES2308808T3 - Genes de proteinas de membrana aislados de celulas dendriticas. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido recombinante, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Description

Genes de proteínas de membrana aislados de células dendríticas.

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. Nº de serie 60/053,080, presentada el 9 de julio de 1997.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones relacionadas con genes presentes en linfocitos, por ejemplo, células que funcionan en el sistema inmune. Estos genes son marcadores útiles, y pueden funcionar en el control del desarrollo, diferenciación y/o fisiología del sistema inmune de los mamíferos. En particular, la solicitud proporciona ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, y métodos de uso de dichos compuestos.

Antecedentes de la invención

El componente circulante del sistema circulatorio de los mamíferos comprende varios tipos de células, que incluyen glóbulos rojos y glóbulos blancos de los linajes de células eritroides y mieloides. Véase, por ejemplo, Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2nd. ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA; y Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology (3a. ed.) Raven Press, N.Y.

Las células dendríticas (abreviadamente DC por la expresión inglesa dendritic cells) son células que presentan o que procesan antígenos, y se encuentran en todos los tejidos del cuerpo. Véase Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9: 271-296; y Banchereau y Schmitt (eds. 1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY. Estas DC pueden clasificarse en varias categorías, que incluyen: células dendríticas intersticiales del corazón, riñón, intestino y pulmón; células de Langerhans en la piel y membranas mucosas; células dendríticas interdigitantes en la médula tímica y tejido linfoide secundario; y células dendríticas de sangre y linfa. Aunque las células dendríticas en cada uno de estos compartimentos son leucocitos CD45+ que surgen aparentemente de la médula ósea, pueden exhibir diferencias que se relacionan con el estado de maduración y el microambiente.

Estas células dendríticas procesan eficientemente y presentan antígenos, por ejemplo, a células T. Estimulan respuestas de células T no afectadas y de memoria.

Los folículos de células B primarios y secundarios contienen células dendríticas foliculares que atrapan y retienen al antígeno intacto como complejos inmunes durante largos períodos. Estas células dendríticas presentan antígenos naturales a células B, y es probable que intervengan en la maduración de los anticuerpos por afinidad, la generación de memoria inmune y el mantenimiento de las respuestas inmunes humorales.

Los monocitos son células fagocíticas que pertenecen al sistema de fagocitos mononucleares, y residen en la circulación. Véase Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego. Estas células se originan en la médula ósea, y permanecen sólo un corto tiempo en el compartimento de la médula una vez que se diferencian. Entran entonces a la circulación, y pueden permanecer allí durante un tiempo relativamente largo, por ejemplo, unos cuantos días. Los monocitos pueden entrar a los tejidos y las cavidades del cuerpo mediante el proceso denominado diapédesis, en donde se diferencian en macrófagos y posiblemente en células dendríticas. En una respuesta inflamatoria, el número de monocitos en la circulación puede duplicarse, y muchos de estos monocitos experimentan diapédesis hacia el sitio de inflamación.

La presentación del antígeno se refiere a los eventos celulares en los cuales un antígeno proteico es captado, procesado por células presentadoras de antígenos (abreviadamente en lo sucesivo APC por la expresión inglesa antigen presenting cells), y reconocido entonces para iniciar una respuesta inmune. Las células presentadoras de antígenos más activos han sido caracterizadas como los macrófagos, los cuales son productos del desarrollo directo de monocitos; células dendríticas; y ciertas células B.

Los macrófagos se encuentran en la mayoría de los tejidos, y son altamente activos en la incorporación de una amplia variedad de antígenos proteicos y microorganismos. Tienen una actividad endocítica altamente desarrollada, y secretan muchos productos importantes en el inicio de una respuesta inmune. Por esta razón, se piensa que es probable que muchos genes expresados por monocitos o inducidos por activación de monocitos, son importantes en la captación, procesamiento, presentación o regulación del antígeno de la respuesta inmune resultante.

Sin embargo, las células dendríticas y los monocitos están poco caracterizados, ambos en términos de las proteínas que expresan, y en muchas de sus funciones y mecanismos de acción que incluyen sus estados activados. En particular, los procesos y mecanismos relacionados con el inicio de una respuesta inmune, que incluyen procesamiento y presentación del antígeno, continúan no estando claros. La falta de conocimiento acerca de las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de estas células, limita su comprensión. De esta manera, los estados médicos en donde la regulación, el desarrollo o la fisiología de las células presentadoras de antígenos es inusual, continúan siendo difíciles de manejar.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de varios genes de proteínas de membrana de células dendríticas (abreviadamente DCMP por la expresión inglesa Dendritic Cell Membrane Protein) de mamífero, ejemplificados por las realizaciones de DCMP1 y DCMP2 específicas. Los datos de distribución indican una distribución celular más amplia, y los datos estructurales sugieren cierta función. Las DCMP1 exhiben similitud con una clase de receptores de lectinas y asialoglucoproteínas. Las realizaciones de DCMP2 descritas exhiben similitud de secuencias significativa con un receptor de asialoglucoproteína de macrófagos. La invención abarca agonistas y antagonistas de los productos génicos, por ejemplo, mutaciones (muteínas) de las secuencias naturales, proteínas de fusión, miméticos químicos, anticuerpos y otros análogos estructurales o funcionales. Está también dirigida a genes aislados que codifican proteínas de la invención. Se proporcionan también varios usos de estas composiciones de ácidos nucleicos o proteínas diferentes.

En realizaciones particulares, la invención proporciona un compuesto de unión que comprende un sitio de unión a anticuerpo que se une específicamente a una proteína DCMP1; o un polipéptido seleccionado de Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro (residuos 118-144 de SEQ ID NO: 4); Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys (residuos 166-181 de SEQ ID NO: 4); o Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Gly Leu Gly (residuos 263-277 de SEQ ID NO: 4). En realizaciones preferidas, en el compuesto de unión, el sitio de unión a anticuerpo es: específicamente inmunorreactivo con una proteína de SEQ ID NO: 2 u 8; específicamente inmunorreactivo con una proteína de los residuos 118 a 144 de SEQ ID NO: 4; producido contra una proteína DCMP1 humana purificada o producida en forma recombinante; producido contra una proteína humana purificada o producida en forma recombinante que comprende la secuencia de los residuos 118 a 144 de SEQ ID NO: 4; en un anticuerpo monoclonal, Fab o F(ab)2; o el compuesto de unión es: uno marcado detectablemente; estéril; o está en una composición tampón.

La invención abarca métodos de uso de aquellos compuestos de unión, que comprenden poner en contacto el compuesto de unión con una muestra biológica que comprende un antígeno, para formar un complejo de compuesto de unión:antígeno. En ciertas realizaciones, la muestra biológica es humana, y el compuesto de unión es un anticuerpo. La invención proporciona también un kit de detección que comprende dicho compuesto de unión, y: material de instrucciones para el uso de dicho compuesto de unión para la detección; o un compartimento que proporciona segregación del compuesto de unión.

La invención proporciona también un polipéptido sustancialmente puro o aislado, el cual se une específicamente a dichos compuestos de unión. En varias realizaciones, el polipéptido: comprende por lo menos un fragmento de por lo menos 14 residuos de aminoácido de una proteína DCMP1 de primate; comprende por lo menos 14 aminoácidos de los residuos 118 a 144 de SEQ ID NO: 4; es un polipéptido soluble; está marcado detectablemente; es una composición estéril; está en una composición tampón; se une a un residuo de ácido siálico; es producido en forma recombinante, o tiene una secuencia de polipéptidos de origen natural.

Se proporcionan realizaciones de ácidos nucleicos, que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido definido anteriormente, cuando está purificado. Con frecuencia, el ácido nucleico: comprende por lo menos 30 nucleótidos de la porción codificante de SEQ ID NO: 1 ó 7; comprende por lo menos 30 nucleótidos de los nucleótidos 608-688 de SEQ ID NO: 3; o comprende por lo menos 30 nucleótidos de los nucleótidos 752-799 de SEQ ID NO: 3; o puede comprender una inserción, la cual se hibrida selectivamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido definido anteriormente. La invención proporciona también una célula transfectada con dicho ácido nucleico, por ejemplo, el cual consiste de las porciones codificantes de proteínas de SEQ ID NO: 1, 7, o las porciones adecuadas de SEQ ID NO: 3.

La invención proporciona métodos que usa por lo menos una cadena de los ácidos nucleicos citados para formar un ácido nucleico dúplex, que comprenden una etapa de poner en contacto dicha cadena de una muestra con una cadena complementaria capaz de hibridarse específicamente. En realizaciones preferidas, el método permite la detección del dúplex; o permite la localización histológica del dúplex.

Alternativamente, la invención proporciona métodos de usar una composición de unión descrita, que comprenden una etapa de poner en contacto la composición de unión con una muestra para formar un complejo de composición de unión:antígeno. En realizaciones preferidas, la muestra es una muestra biológica, que incluye un fluido corporal; el antígeno está sobre una célula; o el antígeno es purificado adicionalmente.

La invención abarca además métodos de uso de los polipéptidos, que comprenden poner en contacto el polipéptido con una muestra para formar un complejo de composición de unión:polipéptido. En realizaciones preferidas, el polipéptido es purificado adicionalmente.

Otro método provisto es modular la fisiología o función de las células dendríticas, que comprende una etapa de poner en contacto la célula con: una composición de unión como se describe; una proteína DCMP1 como se describe; o un polipéptido como se describe. La función puede también dar como resultado el inicio o progresión de una respuesta inmune. Típicamente, la puesta en contacto es en combinación con un antígeno, que incluye un antígeno de la superficie celular, antígeno de clase I del MHC (complejo de histocompatibilidad principal) o antígeno de clase II del MHC.

Descripción detallada I. Generalidades

La presente invención proporciona secuencias de DNA que codifican proteínas de mamífero expresadas en células dendríticas (DC). Para una revisión de células dendríticas, véase Steinman (1991) Annual Reviews of Immunology 9: 271-296; y Banchereau y Schmitt (eds. 1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY. Estas proteínas se denomina proteínas de células dendríticas debido a que se encuentran en estas células, y parecen exhibir cierta especificidad en su expresión.

Se proporcionan más adelante realizaciones específicas de estas proteínas de primate, por ejemplo, humano. Existen también proteínas correspondientes de roedor, por ejemplo, ratón. Las descripciones siguientes están dirigidas, con fines ilustrativos, a los genes de DC de ser humano, pero son asimismo aplicables a realizaciones estructuralmente relacionadas, por ejemplo, de secuencias, de otras fuentes o especies de mamífero, incluyendo variantes polimórficas o individuales. Estas incluirán, por ejemplo, proteínas que exhiben relativamente pocos cambios en secuencia, por ejemplo, menos de aproximadamente 5%, y número, por ejemplo, menos de 20 sustituciones de residuos, típicamente menos de 15, de preferencia menos de 10, y más preferiblemente menos de 5 sustituciones, incluyendo 4, 3, 2 ó 1. Estas incluirán también versiones truncadas a partir de la versión completa como se describe, y proteínas de fusión que contienen segmentos sustanciales de estas secuencias.

II. Definiciones

El término "composición de unión", se refiere a moléculas que se unen con especificidad a estas proteínas DC, por ejemplo, en una interacción antígeno-anticuerpo. Otros compuestos, por ejemplo, proteínas, pueden asociarse también específicamente con la proteína respectiva. Típicamente, la asociación específica será una interacción relevante fisiológicamente natural proteína-proteína, ya sea covalente o no covalente, y puede incluir miembros de un complejo de proteínas múltiples, incluyendo compuestos vehículos o miembros de dimerización. La molécula puede ser un polímero, o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula totalmente no relacionada, por ejemplo, la cual tenga una forma molecular que interactúe con los determinantes de interacción adecuados. Las variantes pueden servir como agonistas o antagonistas de la proteína; véase, por ejemplo, Goodman, et al. (eds.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8a. ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.

El término "agente de unión:complejo de proteína DC", como se usa en la presente memoria, se refiere a un complejo de un agente de unión y proteína DC. La unión específica del agente de unión significa que el agente de unión tiene un sitio de unión específico que reconoce un sitio en la proteína DC respectiva. Por ejemplo, anticuerpos producidos contra la proteína DC y que reconocen un epítopo de la proteína DC, son capaces de formar un complejo de anticuerpo:proteína DC mediante unión específica. Típicamente, la formación de un complejo de agente de unión:proteína DC, permite la medición de esa proteína DC en una mezcla de otras proteínas y componentes biológicos. El término "anticuerpo:complejo de proteína DC", se refiere a un complejo de agente de unión: proteína DC en el cual el agente de unión es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, o incluso un fragmento de un anticuerpo de unión al antígeno, por ejemplo, incluyendo fragmentos Fv, Fab o Fab2.

Las secuencias de ácido nucleico "homólogas", cuando se comparan, exhiben similitud significativa. Los patrones para homología en ácidos nucleicos, son medidas para homología que se usan en general en la técnica a través de la comparación de secuencias y/o la relación filogenética, o que se basan en condiciones de hibridación. Ambos algoritmos para comparación de secuencias y condiciones de hibridación, se describen en detalle más adelante.

Un ácido nucleico "aislado", es un ácido nucleico, por ejemplo, un RNA, DNA, o un polímero mixto, el cual está separado sustancialmente de otros componentes que lo acompañan naturalmente, por ejemplo, proteínas y secuencias genómicas de flanqueo de la especie de origen. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido separada de su ambiente en donde se presenta de modo natural, e incluye aislados de DNA recombinantes o clonados y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado será en general una composición de moléculas homogénea, pero en algunas realizaciones, contendrá heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero, o porciones no críticas para una función o actividad biológica deseada.

Como se usa en la presente memoria, el término "proteína DCMP1" abarcará, cuando se usa en el contexto de una proteína, una proteína que tiene secuencias de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2 u 8, o un fragmento significativo de dicha proteína. Se refiere a un polipéptido que interactúa con los componentes de unión específicos de la proteína DCMP1 respectiva. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, se unen típicamente a la proteína DCMP1 con alta afinidad, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 100 nM, usualmente mejor de aproximadamente 30 nM, de preferencia mejor de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente mejor de aproximadamente 3 nM.

El término "formas de DCMP2", se refiere a las secuencias provistas en las SEQ ID NO: 4 y 10. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente de la proteína de primate, por ejemplo, ser humano, relacionada con los miembros de la familia de lectina/asialoglucoproteína, denominada DCMP2, aislada de una colección de células dendríticas, se proporciona en las SEQ ID NO: 3 y 4. La forma larga es como se muestra, mientras que la forma corta carece de la secuencia que corresponde a los residuos 118-144. La forma corta puede diferir también en el nucleótido 1064. Esta se relaciona con una forma de monocitos de un ASGPR, que difiere por una inserción entre los residuos 173 y 174, y en el residuo 270, véase Tabla 1, y la inserción de la secuencia que codifica GEE entre los nucleótidos 775-776. Otra forma variante se describe en la SEQ ID NO: 9 y 10.

El término "polipéptido" o "proteína", como se usa en la presente memoria, incluye un fragmento o segmento significativo de dicha proteína, y abarca un tramo de residuos de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos, en general por lo menos 10 aminoácidos, más generalmente por lo menos 12 aminoácidos, con frecuencia por lo menos 14 aminoácidos, más con frecuencia por lo menos 16 aminoácidos, típicamente por lo menos 18 aminoácidos, más típicamente por lo menos 20 aminoácidos, usualmente por lo menos 22 aminoácidos, más usualmente por lo menos 24 aminoácidos, de preferencia por lo menos 26 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 28 aminoácidos y, en realizaciones particularmente preferidas, por lo menos aproximadamente 30 o más aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, 60, 70, etc.

Las realizaciones preferidas exhiben una pluralidad de segmentos distintos, por ejemplo, no solapantes, de la longitud especificada. Típicamente, la pluralidad será por lo menos dos, más usualmente por lo menos tres, y de preferencia 5, 7 o incluso más. Aunque se proporcionan los mínimos de longitud, pueden ser adecuadas longitudes mayores, de varios tamaños, por ejemplo, una de longitud 7, y dos de longitud 12. Los segmentos pueden referirse a péptidos u oligonucleótidos.

Un ácido nucleico "recombinante" se define típicamente por su estructura. Puede ser un ácido nucleico que se obtiene generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos, los cuales no son naturalmente contiguos entre sí, pero significa que excluye productos de naturaleza, por ejemplo, formas mutantes que se presentan de modo natural.

Ciertas formas se definen mediante un método de producción. Con respecto a tales, por ejemplo, un producto obtenido mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que incluyen intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente selección o producción.

Por tanto, la invención abarca, por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden secuencias derivadas usando un procedimiento de oligonucleótidos sintéticos, y productos obtenidos transformando células con un vector que existe de forma no natural que codifica estas proteínas. Esto se hace con frecuencia para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, mientras que típicamente introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencias, por ejemplo, para una enzima de restricción. Alternativamente, se lleva a cabo para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas, para generar una entidad genética individual que comprende una combinación deseada de funciones no presentes en las formas naturales disponibles comúnmente. Sitios de reconocimiento por enzimas de restricción son con frecuencia el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de DNA, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles, por ejemplo, segmentos de cebador, pueden incorporarse por diseño. Un concepto similar se usa para un polipéptido recombinante, por ejemplo, polipéptido de fusión. Incluidos específicamente son ácidos nucleicos sintéticos los cuales, por la redundancia del código genético, codifican polipéptido similares a fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de varias variantes de especies diferentes.

La "solubilidad" es reflejada por la sedimentación medida en unidades Svedberg, las cuales son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se llevó a cabo clásicamente en una ultracentrífuga analítica, pero típicamente se lleva a cabo ahora en una ultracentrífuga estándar. Véase, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2d. ed.) W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry parts 1-3, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Como una determinación en bruto, una muestra que contiene un polipéptido supuestamente soluble se centrifuga en una ultracentrífuga estándar de tamaño natural a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el líquido sobrenadante. Un polipéptido o partícula soluble será típicamente menor de aproximadamente 30S, más típicamente menor de aproximadamente 15S, usualmente menor de aproximadamente 10S, más usualmente menor de aproximadamente 6S y, en realizaciones particulares, de preferencia menor de aproximadamente 4S, y más preferiblemente menor de aproximadamente 3S. La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del ambiente y el polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluyendo temperatura, ambiente de electrólitos, tamaño y características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la cual se usa el polipéptido varía de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Usualmente, la temperatura de uso es mayor de aproximadamente 18ºC, y más usualmente mayor de aproximadamente 22ºC. Para propósitos de diagnóstico, la temperatura será usualmente casi la temperatura ambiente o mayor, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes en la valoración o prueba. Para propósitos terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura corporal, típicamente aproximadamente 37ºC para seres humanos, aunque bajo ciertas situaciones la temperatura puede elevarse o disminuirse in situ o in vitro.

El tamaño y la estructura del polipéptido deben estar por lo general en un estado sustancialmente estable y fisiológicamente activo, y usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede asociarse con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o puede asociarse con lípidos o detergentes en una forma que se aproxime a las interacciones naturales de la bicapa lipídica.

El disolvente será usualmente un tampón (amortiguador del pH) biológicamente compatible, de un tipo usado para la conservación de actividades biológicas, y se aproximará usualmente a un disolvente fisiológico. Usualmente, el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10, y de preferencia aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirá un detergente, típicamente un detergente no desnaturalizante suave, por ejemplo, CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (3-([3-colamidopropil]dimetil-amonio)-1-propano-sulfonato), o en una concentración de detergente bastante baja para evitar la disolución significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

La expresión "sustancialmente pura" significa típicamente que la proteína se aísla de otras proteínas, ácidos nucleicos u otros componentes biológicos contaminantes, derivados del organismo fuente original. La pureza o el "aislamiento" puede analizarse mediante métodos estándar, típicamente en peso, y será a menudo por lo menos aproximadamente 50% puro, más a menudo por lo menos aproximadamente 60% puro, en general por lo menos aproximadamente 70% puro, más generalmente por lo menos aproximadamente 80% puro, con frecuencia por lo menos aproximadamente 85% puro, más con frecuencia por lo menos aproximadamente 90% puro, de preferencia por lo menos aproximadamente 95% puro, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 98% puro, y en realizaciones muy preferidas, por lo menos 99% puro. Se añadirán con frecuencia vehículos o excipientes, o la formulación puede ser estéril o puede comprender componentes de tampones.

La expresión "similitud sustancial" en el contexto de comparación de secuencias de ácido nucleico, significa que los segmentos, o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando se alinean óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en por lo menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, en general por lo menos 56%, más generalmente por lo menos 59%, a menudo por lo menos 62%, más a menudo por lo menos 65%, con frecuencia por lo menos 68%, más con frecuencia por lo menos 71%, típicamente por lo menos 74%, más típicamente por lo menos 77%, usualmente por lo menos 80%, más usualmente por lo menos aproximadamente 85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95 a 98% o más, y en realizaciones particulares, tan alto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe similitud sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas, con una cadena, o su complemento, usando típicamente una secuencia derivada de las SEQ ID NO: 1 ó 7, o partes adecuadas de 3 y 9. Típicamente, ocurrirá hibridación selectiva cuando exista por lo menos aproximadamente 55% de similitud en un tramo de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 65% en un tramo de por lo menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% en un tramo de aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids. Res. 12: 203-213. La longitud de comparación de similitud, como se describe, puede ser sobre tramos más largos, y en ciertas realizaciones, será en un tramo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos. Las medidas de comparación para la DCMP1 no se reflejan en las medidas de comparación para las realizaciones de DCMP2.

"Condiciones rigurosas", con relación a homología o similitud sustancial en el contexto de hibridación, serán condiciones rigurosas (estrictas) combinadas de salinidad, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, típicamente los controlados en reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370. Una sonda de ácido nucleico que se une a un ácido nucleico diana bajo condiciones rigurosas, es específico para dicho ácido nucleico diana. Dicha sonda tiene típicamente más de 11 nucleótidos de longitud, y es suficientemente idéntica o complementaria con un ácido nucleico diana en la región especificada por la secuencia de la sonda para unirse a la diana bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Proteínas DCMP correspondientes de otras especies de mamífero, pueden clonarse y aislarse mediante hibridación de especies cruzadas de especies estrechamente emparentadas. Véase, por ejemplo, más adelante. La similitud puede ser relativamente baja entre especies distantemente emparentadas, y por tanto se aconseja la hibridación de especies relativa y estrechamente emparentadas. Alternativamente, la preparación de una preparación de anticuerpos que exhiba menos especificidad por la especie, puede ser útil en procedimientos de clonación con expresión.

La frase "se une específicamente a un anticuerpo" o "específicamente inmunorreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Por tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular, y no se unen significativamente a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo dichas condiciones, puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos producidos para el inmunógeno de proteína DCMP1 de humano con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 u 8, para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con la proteína DCMP, y no con otras proteínas. Estos anticuerpos reconocen proteínas altamente similares a la proteína DCMP1 homóloga de ser humano.

III. Ácidos nucleicos

Estos genes de DCMP se expresan selectivamente en células dendríticas. Las realizaciones preferidas, como se describe, serán útiles en procedimientos estándares para aislar genes de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de proteínas relacionadas de individuos, cepas o especies. Muchos procedimientos diferentes están disponibles exitosamente para aislar un clon de ácido nucleico adecuado basado en la información proporcionada en la presente memoria. Los estudios de hibridación con transferencia Southern deben identificar genes homólogos en otras especies bajo condiciones de hibridación adecuadas.

La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos estándares, como se describe a continuación. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada pueden ser presentados a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales y policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY. Alternativamente, una composición de unión a antígeno de DCMP puede ser útil como un reactivo de unión específico, y aprovecharse su especificidad de unión, por ejemplo, para la purificación de una proteína DCMP.

La composición de unión específica puede usarse para escrutar una colección de expresión obtenida de una línea de células que exprese la proteína DCMP respectiva. Están disponibles muchos métodos de escrutinio, por ejemplo, tinción estándar de ligando con superficie expresada, o el método de adherencia sobre plástico. Puede llevarse a cabo también un escrutinio de la expresión intracelular mediante diversos procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían usarse para purificar por afinidad o clasificar células que expresen el antígeno.

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TABLA 1 Alineación de miembros de la familia de lectina/ASGPR de primate, por ejemplo, ser humano

ASGPRh1 y ASGPRh2 son receptores de asialoglucoproteína hepática (véanse las SEQ ID NO: 5 y 6); ASGPRm es un ASGPR derivado de macrófagos; DCMP2 tiene formas corta y larga y una forma variante, SEQ ID NO: 4 y 10; DCMP1 se presenta en SEQ ID NO: 2 y 8).

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El análisis de secuencias sugiere que estas DCMP son miembros de la superfamilia de receptores de lectina/asialo-
glucoproteína. Los segmentos peptídicos pueden usarse también para diseñar y producir oligonucleótidos adecuados para escrutar una colección para determinar la presencia de un gen similar, por ejemplo, una variante idéntica o polimórfica, o para identificar una DC. El código genético puede usarse para seleccionar oligonucleótidos adecuados útiles como sondas para escrutinio. En combinación con técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), serán útiles oligonucleótidos sintéticos para seleccionar clones deseados de una colección.

Se usarán también secuencias complementarias como sondas o cebadores (también llamados iniciadores). Basándose en la identificación del extremo amino terminal probable, otros péptidos deben ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con técnicas de PCR complementaria de poli-A o vector anclado, o con DNA complementario de otros péptidos.

Técnicas para la manipulación del ácido nucleico de genes que codifican estas proteínas de DC, por ejemplo, subclonando secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos en vectores de expresión, sondas de marcado, hibridación de DNA, y similares, se describen en general en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2d. ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, citada más adelante como "Sambrook et al". Véase también, Coligan et al. (1987 and periodic Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York, NY, citada en lo sucesivo como "Coligan, et al".

Existen varios métodos para aislar las secuencias de DNA que codifican estas proteínas de DC. Por ejemplo, se aísla DNA de una genoteca genómica o de cDNA usando sondas de oligonucleótidos marcadas que tengan secuencias idénticas o complementarias a las secuencias descritas en la presente memoria. Pueden usarse sondas de longitud completa, o pueden generarse sondas de oligonucleótidos comparando las secuencias descritas con otras proteínas, y seleccionando iniciadores específicos. Dichas sondas pueden usarse directamente en sondas de hibridación para aislar DNA que codifique proteínas de DC, o pueden diseñarse sondas para su uso en técnicas de amplificación, tales como PCR, para el aislamiento de cDNA que codifique proteínas de DC.

Para preparar una genoteca de cDNA, se aísla mRNA de células que expresen la proteína de DC. Se prepara cDNA a partir del mRNA, y se liga en un vector recombinante. El vector es transfectado en un hospedante recombinante para propagación, escrutinio y clonación. Métodos para obtener y escrutar genotecas de cDNA, son bien conocidos. Véase Gubler y Hoffman (1983) Gene 25: 263-269; Sambrook, et al.; o Coligan, et al.

Para una genoteca genómica, el DNA puede extraerse de tejido, y puede separarse mecánicamente por cizallamiento o puede digerirse enzimáticamente para dar fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Los fragmentos se separan entonces mediante centrifugación en gradiente, y se clonan en vectores de bacteriófago lambda. Estos vectores y fagos son empaquetan in vitro como se describe, por ejemplo, en Sambrook, et al. o Coligan, et al. Los fagos recombinantes se analizan mediante hibridación en placas como se describe en Benton y Davis (1977) Science 196: 180-182. Se lleva a cabo hibridación de las colonias como se describe en general en, por ejemplo, Grunstein, et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965.

Puede identificarse DNA que codifica una proteína de DC en colecciones genómicas o de cDNA por su capacidad para hibridarse con las sondas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, por ejemplo, en experimentos de hibridación de colonias o en placas. Las regiones de DNA correspondientes se aíslan mediante métodos estándares bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase Sambrook, et al.

Pueden usarse también varios métodos para amplificar secuencias dianas, tales como la reacción en cadena de polimerasa, para preparar DNA que codifica proteínas de DC. Se usa la tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar dichas secuencias de ácido nucleico directamente de mRNA, a partir de cDNA, y de colecciones genómicas o colecciones de cDNA. Las secuencias aisladas que codifican proteínas de DC pueden usarse también como moldes para la amplificación por PCR.

En técnicas de PRC, se sintetizan oligonucleótidos cebadores complementarios a dos regiones 5' en la región de DNA que se va a amplificar. La reacción en cadena de polimerasa se lleva a cabo entonces usando los dos cebadores. Véase Innis, et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA. Pueden seleccionarse cebadores que amplifiquen las regiones completas que codifican una proteína de DC de longitud completa seleccionada, o para amplificar segmentos de DNA más pequeños, según se desee. Una vez que dichas regiones se amplifican mediante PCR pueden secuenciarse, y pueden prepararse sondas de oligonucleótidos a partir de la secuencia obtenida usando técnicas estándares. Estas sondas pueden usarse entonces para aislar moléculas de DNA que codifiquen otras formas de las proteínas de DC.

Los oligonucléotidos par uso como sondas, se sintetizan químicamente de acuerdo con el método del triéster de fosforamidita en fase sólida, descrito primero por Beaucage y Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20): 1859-1862, o usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168. La purificación de los oligonucleótidos se lleva a cabo, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de acrilamida natural, o mediante HPLC de intercambio aniónico, como se describe en Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137-149. La secuencia del oligonucleótido sintético puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert en Grossman y Moldave (eds. 1980) Methods in Enzymology 65: 499-560 Academic Press, New York.

Esta invención proporciona DNA aislado o fragmentos que codifican una proteína de DC, según se describe. Además, esta invención proporciona DNA aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo que es capaz de hibridarse bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, alta rigurosidad, con las secuencias de DNA descritas en la presente memoria. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una forma de que se presenta de modo natural, o una proteína o fragmento recombinante, y tiene una secuencia de aminoácidos que se describe en las SEQ ID NO: 2, 4, 8 ó 10. Realizaciones preferidas serán aislados naturales de longitud completa, por ejemplo, de un primate. En la forma glucosilada, las proteínas deben exhibir tamaños más grandes. Además, esta invención abarca el uso de DNA aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifican proteínas que son homólogas a cada proteína de DC respectiva. El DNA aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición de poli-A, y otros.

IV. Producción de productos génicos de DC

Pueden obtenerse moléculas de DNA que codifiquen estas proteínas de DC o sus fragmentos, mediante síntesis química, selección de colecciones de cDNA, o mediante selección de colecciones genómicas preparadas de una amplia variedad de líneas de células o muestras de tejidos.

Estas moléculas de DNA pueden expresarse en una amplia variedad de células hospedantes para la síntesis de una proteína de longitud completa o sus fragmentos que pueden usarse, por ejemplo, para generar anticuerpos monoclonales o policlonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada una de estas proteínas de DC o sus fragmentos pueden expresarse en células hospedantes que son transformadas o transfectadas con vectores de expresión adecuados. Estas moléculas pueden purificarse sustancialmente para que estén libres de contaminantes proteicos o celulares, diferentes de los derivados del hospedante recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, o sus porciones, puede expresarse como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión son típicamente construcciones de RNA o DNA autoreplicantes que contienen al gen de DC deseado o sus fragmentos, usualmente enlazados operativamente a elementos adecuados de control genético, que son reconocidos en una célula hospedante adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un hospedante adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión, dependerá de la célula hospedante final usada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotor procariótico o un sistema de control de la expresión de promotor eucariótico, e incluyen típicamente un promotor de la transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción que elevan el nivel de expresión del mRNA, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosomas adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión contienen también usualmente un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedante.

Los vectores de esta invención contienen moléculas de DNA que codifican las varias proteínas de DC, o un fragmento de las mismas, codificando típicamente, por ejemplo, un polipéptido o proteína biológicamente activo. El DNA puede estar bajo el control de un promotor viral, y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla además el uso de dichos vectores de expresión que son capaces de expresar cDNA eucariótico que codifica una proteína de DC en un hospedante procariótico o eucariótico, en donde el vector es compatible con el hospedante y en donde el DNA eucariótico que codifica la proteína está insertado en el vector, de modo que el crecimiento del hospedante que contiene al vector, expresa el DNA en cuestión. Usualmente, se diseñan vectores de expresión para replicación estable en sus células hospedantes, o para amplificación para aumentar ampliamente el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula hospedante, por ejemplo, es posible efectuar expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en varios hospedantes usando vectores que no contengan un origen de replicación que sea reconocido por la célula hospedante. También es posible usar vectores que causen la integración de un gen de DC o sus fragmentos en el DNA del hospedante mediante recombinación, o que integren un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, como se usan en la presente invención, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de DNA integrables, y otros vehículos que permitan la integración de fragmentos de DNA en el genoma del hospedante. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes enlazados operativamente. Los plásmidos son la forma de vector que se usa más comúnmente, pero otras formas de vectores que realizan una función equivalente, son adecuadas para su uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodriquez, et al. (eds.) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Las procariotas incluyen organismos gram-negativos y gram-positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Las eucariotas superiores incluyen líneas de células de cultivo de tejidos establecidas de células animales, de origen diferente de mamíferos, por ejemplo, células de insecto y aves, y de origen de mamíferos, por ejemplo, seres humanos, primates y roedores.

Los sistemas de vector-hospedante procarióticos incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Como se usa en la presente invención, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar DNA es pBR322 o sus derivados. Vectores que pueden usarse para expresar proteínas de DC o fragmentos incluyen, pero sin limitación, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (la serie pIN); promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and lpp-derived Promoters", en Rodriquez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 10: 205-236 Buttersworth, Boston, MA.

Pueden transformarse eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, con vectores que contengan secuencias génicas de DC. Para los propósitos de esta invención, el hospedante eucariótico inferior más común es la levadura de panificación, Saccharomyces cerevisiae. Se usará genéricamente para representar eucariotas inferiores, aunque muchas otras cepas y especies están también disponibles. Los vectores de levadura consisten típicamente de un origen de replicación (salvo el tipo de integración), un gen de selección, un promotor, DNA que codifica la proteína deseada o sus fragmentos, y secuencias para terminación de la traducción, poliadenilación y terminación de la transcripción. Vectores de expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos tales como 3-fosfoglicerato-quinasa y varios otros promotores génicos de enzimas glucolíticas, o promotores inducibles, tales como el promotor de alcohol-deshidrogenasa 2 o promotor de metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: autorreplicante de bajo número de copias (tal como la serie YRp), autorreplicante de alto número de copias (tal como la serie YEp); tipos de integración (tales como la serie Yip), o minicromosomas (tales como la serie YCp).

Las células de cultivo de tejidos eucarióticas superiores, son las células hospedantes preferidas para la expresión de la proteína de DC. En principio, puede usarse la mayoría de cualquier línea de células de cultivo de tejidos eucarióticas superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insecto, ya sea de una fuente de vertebrados o invertebrados. Sin embargo, se prefieren células de mamífero para lograr procesamiento adecuado, a nivel de co-traducción y post-traducción. La transformación o transfección y propagación de dichas células, es la habitual. Líneas de células útiles incluyen células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), líneas de células de riñón de cría de rata (BRK), líneas de células de insectos, líneas de células de ave y líneas de células de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas de células incluyen usualmente un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la traducción, sitios de empalme de RNA (por ejemplo, si se usa DNA genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores pueden contener también un gen de selección o gen de amplificación. Vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retrovirus que posean promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como de adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia o citomegalovirus. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama et al. (1985) Mol. Cell. Biol.5: 1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase Thomas, et al. (1987) Cell 51: 503-512; y un vector de baculovirus, tal como pAC 373 o pAC 610.

En ciertos casos, las proteínas de DC no necesitan estar glucosiladas para inducir respuestas biológicas en ciertas valoraciones. Sin embargo, con frecuencia será deseable expresar un polipéptido de DC en un sistema que proporcione un patrón de glucosilación específico o definido. En este caso, el patrón usual será el provisto naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, por ejemplo, en forma no glucosilada, a proteínas glucosilantes adecuadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, un gen de DC puede ser co-transformado con uno o más genes que codifiquen enzimas de mamífero u otras enzimas glucosilantes. Se entiende además que la glucosilación excesiva puede ser perjudicial para la actividad biológica de la proteína de DC, y que el experto en la técnica puede llevar a cabo pruebas de rutina para optimizar el grado de glucosilación que confiera actividad biológica óptima.

Puede diseñarse una proteína de DC, o un fragmento de la misma, para que sea enlazada mediante fosfatidilinositol (PI) a una membrana celular, pero que pueda separarse de membranas mediante tratamiento con una enzima que degrade el fosfatidilinositol, por ejemplo, fosfatidil-inositol-fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos estándares de química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochem. Biophys. Acta, 988: 427-454; Tse, et al. (1985) Science, 230: 1003-1008; Brunner, et al. (1991) J. Cell. Biol. 114: 1275-1283; y Coligan, et al. (eds.) (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, NY.

Ahora que estas proteínas de DC han sido caracterizadas, pueden prepararse fragmentos o derivados de las mismas mediante procedimientos convencionales para la síntesis de péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los que se describen en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY. Véase también Merrified (1986) Science, 232: 341-347; y Dawson, et al. (1984) Science, 266: 776-779. Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de azida, un procedimiento de cloruro de ácido, un procedimiento de anhídrido de ácido, un procedimiento de anhídrido mixto, un procedimiento de éster activo (por ejemplo, éster de p-nitrofenilo, éster de N-hidroxisuccinimida o éster de cianometilo), un procedimiento de carbodiimidazol, un procedimiento oxidante-reductor, o un procedimiento de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Síntesis de fase sólida y de fase en solución, son aplicables a los procedimientos anteriores.

La proteína preparada y sus fragmentos pueden aislarse y purificarse de una mezcla de reacción mediante separación de péptidos, por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis y varias formas de cromatografía, y similares. Las proteínas de DC de esta invención pueden obtenerse en grados variables de pureza, dependiendo del uso deseado. Puede lograrse la purificación mediante el uso de técnicas conocidas de purificación de proteínas, o mediante el uso de los anticuerpos o miembros de unión descritos en la presente invención, por ejemplo, en cromatografía de afinidad por el inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad por el inmunoabsorbente se lleva a cabo enlazando primero los anticuerpos a un soporte sólido, y poniendo en contacto los anticuerpos enlazados con lisados solubilizados de células de origen adecuadas, lisados de otras células que expresen la proteína, o lisados o líquidos sobrenadantes de células que produzcan las proteínas como resultado de técnicas de DNA; véase más adelante.

Pueden seleccionarse líneas de células múltiples para una que exprese dicha proteína a un alto nivel en comparación con otras células. Varias líneas de células, por ejemplo, una línea de células estromales tímicas de ratón, TA4, se seleccionan por sus propiedades de manejo favorables. Pueden aislarse proteínas de células de DC naturales de fuentes naturales, o mediante expresión a partir de una célula transformada usando un vector de expresión adecuado. La purificación de la proteína expresada se logra mediante procedimientos estándares, o puede combinarse con medios diseñados para purificación efectiva a alta eficacia a partir de lisados de células o líquidos sobrenadantes. Pueden usarse segmentos FLAG o His_{6} para dichos aspectos de purificación.

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V. Anticuerpos

Pueden producirse anticuerpos para las varias proteínas de DC, incluyendo variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepa o de especie, y sus fragmentos, en sus formas que se presentan de modo natural (longitud completa) y en sus formas recombinantes. Además, pueden producirse anticuerpos para proteínas de DC en sus formas activas o en sus formas inactivas. Pueden usarse también anticuerpos anti-idiotípicos.

a. Producción de anticuerpos

Pueden usarse muchos inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con estas proteínas de DC. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Pueden usarse también proteínas que se presentan de modo natural en forma pura o impura. Los péptidos sintéticos obtenidos usando las secuencias de proteína de DC de ser humano descritas en la presente invención, pueden usarse también como un inmunógeno para la producción de anticuerpos para la proteína de DC. La proteína recombinante puede expresarse en células eucarióticas o procarióticas como se describe en la presente invención, y pueden purificarse según se describe. El producto se inyecta luego en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales para uso subsecuente en inmunoensayos, para medir la proteína.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, se mezcla un inmunógeno, de preferencia una proteína purificada, con un adyuvante, y se inmunizan animales con la mezcla. La respuesta inmune del animal a la preparación de inmunógeno se monitoriza haciendo sangrías de ensayo, y determinando el título de reactividad a la proteína de DC de interés. Cuando se obtienen títulos adecuadamente altos de anticuerpo para el inmunógeno, se recoge sangre del animal, y se preparan antisueros. Si se desea, puede realizarse más fraccionamiento de los antisueros para enriquecer los anticuerpos reactivos a la proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante varios métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente mediante fusión con una célula de mieloma. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511-519. Métodos de inmortalización alternativos incluyen transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de las células inmortalizadas individuales se seleccionan para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede mejorarse mediante varias técnicas que incluyen inyección en la cavidad peritoneal de un vertebrado hospedante. De forma alternativa, pueden aislarse secuencias de DNA que codifiquen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo, seleccionando una genoteca de DNA de células B humanas, de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse, et al. (1989) Science, 246: 1275-1281.

Pueden producirse anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones de monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de estas proteínas de DC, mediante la inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas portadoras como se describió anteriormente. Se preparan anticuerpos monoclonales de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden seleccionarse para unión a proteínas de DC normales o defectuosas, o pueden seleccionarse para actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales se unirán usualmente con por lo menos una K_{D} de aproximadamente 1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente 300 \muM, típicamente por lo menos aproximadamente 10 \muM, más típicamente por lo menos aproximadamente 30 \muM, de preferencia por lo menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 \muM, o mejor.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios mamíferos hospedantes, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de técnicas para la preparación de dichos anticuerpos monoclonales puede encontrarse, por ejemplo, en Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th. ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en la misma; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (2nd ed.) Academic Press, New York, NY; y en particular en Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-497, que describen un método para la generación de anticuerpos monoclonales. Resumido en forma breve, este método implica inyectar a un animal un inmunógeno para iniciar una respuesta inmune humoral. El animal se sacrifica luego, y se toman células de su bazo, las cuales se fusionan luego con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma", que es capaz de reproducción in vitro. La población de hibridomas se selecciona luego para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de anticuerpo individual para el inmunógeno. De esta forma, las especies de anticuerpo individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas del animal inmune generados en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunógena.

Otras técnicas adecuadas, incluyen la selección de colecciones de anticuerpos en vectores de fagos o vectores similares. Véase, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature, 341: 544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporcione una señal detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación se conocen y se describen extensivamente en la literatura científica y de patentes. Marcadores adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Patentes que describen el uso de dichos marcadores, incluyen las patentes de EE.UU. Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Asimismo, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes. Véase, Cabilly, patente de EE.UU. Nº 4.816.567; y Queen, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención pueden usarse también para cromatografía de afinidad en el aislamiento de cada proteína de DC. Pueden prepararse columnas en donde los anticuerpos son enlazados a un soporte sólido, por ejemplo, partículas tales como agarosa, SEPHADEX, o similares, en donde un lisado de células puede hacerse pasar a través de la columna, y la columna se lava, seguido de aumento de las concentraciones de un desnaturalizante suave, con lo cual será liberada la proteína de DC purificada.

Los anticuerpos pueden usarse también para seleccionar colecciones de expresión para productos de expresión particulares. Usualmente, los anticuerpos usados en dicho procedimiento serán marcados con una porción que permita la fácil detección de la presencia del antígeno mediante la unión al anticuerpo.

Pueden usarse anticuerpos para las proteínas de DC para el análisis o la identificación de componentes específicos de la población de células que expresan la proteína respectiva. Mediante la valoración de productos de expresión de células que expresan proteínas de DC, es posible diagnosticar enfermedades, por ejemplo, estados inmunocomprometidos, estados de DC agotadas, o sobreproducción de DC.

Los anticuerpos producidos contra cada DC, serán también útiles para producir anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles en la detección o el diagnóstico de varios estados inmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos respectivos.

b. Inmunoensayos

Puede medirse una proteína particular mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase Stites y Terr (eds.) 1991 Basic and Clinical Immunology, (7th. ed.). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden llevarse a cabo en cualquiera de varias configuraciones, las cuales se revisan extensivamente en Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; y Harlow y Lane Antibodies, A Laboratory Manual, citado anteriormente, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Véase también Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, NY.

Los inmunoensayos para la medición de estas proteínas de DC pueden llevarse a cabo mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, los inmunoensayos para medir la proteína, pueden ser valoraciones de unión competitiva o no competitiva. En las valoraciones de unión competitiva, la muestra que se va a analizar compite con un analito marcado para sitios de unión específicos sobre un agente de captura unido a una superficie sólida. De preferencia, el agente de captura es un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de DC producida como se describió anteriormente. La concentración de analito marcado unido al agente de captura, es inversamente proporcional a la cantidad de analito libre presente en la muestra.

En un inmunoensayo de unión competitiva, la proteína de DC presente en la muestra compite con la proteína marcada por la unión a un agente de unión específico, por ejemplo, un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de DC. El agente de unión puede estar unido a una superficie sólida para efectuar la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. De forma alternativa, la valoración de unión competitiva puede llevarse a cabo en fase líquida, y cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica puede usarse para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Después de la separación, se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra, es inversamente proporcional a la cantidad de unión a la proteína marcada.

De forma alternativa, puede llevarse a cabo un inmunoensayo homogéneo en el cual no se requiere una etapa de separación. En estos inmunoensayos, el marcador sobre la proteína está alterado por la unión de la proteína a su agente de unión específico. Esta alteración en la proteína marcada da como resultado una disminución o aumento en la señal emitida por el marcador, de modo que la medición del marcador al final del inmunoensayo, permite la detección o cuantificación de la proteína.

Estas proteínas de DC pueden determinarse también cuantitativamente mediante una variedad de métodos de inmunoensayo no competitivos. Por ejemplo, puede usarse un inmunoensayo en sándwich en fase sólida de dos sitios. En este tipo de valoración, un agente de unión para la proteína, por ejemplo, un anticuerpo, es unido a un soporte sólido. Un segundo agente de unión a la proteína, el cual puede ser también un anticuerpo, y el cual une la proteína en un sitio diferente, está marcado. Después de que ha ocurrido la unión en ambos sitios en la proteína, el agente de unión marcado no unido es separado, y se mide la cantidad de agente de unión marcado unido a la fase sólida. La cantidad de agente de unión marcado unido, es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.

Puede usarse análisis de transferencia Western para determinar la presencia de proteínas de DC en una muestra. Se lleva a cabo electroforesis, por ejemplo, en una muestra de tejido que se sospecha contiene la proteína. Después de electroforesis para separar las proteínas, y después de transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado tal como un filtro de nitrocelulosa, el soporte sólido es incubado con un anticuerpo reactivo con la proteína desnaturalizada. Este anticuerpo puede estar marcado o, de forma alternativa, puede ser detectado mediante incubación subsecuente con un segundo anticuerpo marcado que se une al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoensayo descritos anteriormente usan componentes de ensayo o valoración marcados. El marcador puede estar en una variedad de formas. El marcador puede estar acoplado directamente o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse una amplia variedad de marcadores. Los componentes pueden ser marcados mediante cualquiera de uno de varios métodos. Tradicionalmente, se usa un marcador radiactivo que incorpora ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P. Los marcadores no radiactivos incluyen ligandos que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas, y anticuerpos que pueden servir como miembros pares de unión específicos para una proteína marcada. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, requisitos de estabilidad e instrumentación disponible. Para una revisión de varios sistemas de marcado o que producen señales que pueden usarse, véase la patente de EE.UU. Nº 4.391.904.

Los anticuerpos reactivos con una proteína particular pueden medirse también mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para revisiones de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo aplicables a la medición de anticuerpos mediante técnicas de inmunoensayo véase, por ejemplo, Stites y Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology, (7th. ed.), citado anteriormente; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, citado anteriormente; y Harlow y Lane Antibodies, A Laboratory Manual, citado anteriormente.

Puede usarse también una variedad de formatos de inmunoensayo, técnicas de separación y marcadores diferentes, similares a los descritos anteriormente para la medición de proteínas específicas.

VI. Proteínas de DC purificadas

Se proporcionan secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de DCMP1 de primate, por ejemplo, humano, en las SEQ ID NO: 1 y 2. Se proporcionan secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de DCMP1 de roedor, por ejemplo, ratón, en las SEQ ID NO: 7 y 8. Se proporcionan secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de DCMP2 de primate, por ejemplo, humano, en las SEQ ID NO: 3 y 4. Otra variante se describe en las SEQ ID NO: 9 y 10. Secuencias similares de asialoglucoproteína hepática de primate se proporcionan en las SEQ ID NO: 5 y 6. Las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos que generan anticuerpos que reconocen dichos segmentos, y permiten la preparación de oligonucleótidos que codifican dichas secuencias.

VII. Variantes físicas

Esta invención abarca también proteínas o péptidos que tienen similitud de secuencias de aminoácidos sustancial con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 u 8 o porciones seleccionadas de las SEQ ID NO: 4 ó 10. Se permiten también variantes que exhiben sustituciones, por ejemplo, 20 o menos, de preferencia 10 o menos, y más preferiblemente 5 o menos sustituciones. Donde las sustituciones son sustituciones conservativas, las variantes compartirán similitud inmunógena o antigénica o reactividad cruzada con una proteína de secuencia natural correspondiente. Las variantes naturales incluyen variantes individuales, alélicas, polimórficas, de cepa o de especie.

La similitud de secuencias de aminoácidos, o identidad de secuencias, se determina optimizando apareamientos de residuos, si es necesario, introduciendo huecos, según se requiera. Esto cambia cuando se consideran sustituciones conservativas como apareamientos. Sustituciones conservativas incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Secuencias de aminoácidos homólogas incluyen variaciones interespecíficas y alélicas naturales en cada secuencia de proteína respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán de 50 a 100% de similitud (si pueden introducirse huecos), hasta 75 a 100% de similitud (si se incluyen sustituciones conservativas), con la secuencia de aminoácidos de la proteína de DC relevante. Medidas de identidad serán por lo menos aproximadamente 50%, en general por lo menos 60%, más generalmente por lo menos 65%, usualmente por lo menos 70%, más usualmente por lo menos 75%, de preferencia por lo menos 80%, y más preferiblemente por lo menos 80%, y en realizaciones particularmente preferidas, por lo menos 85% o más. Véase también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String, Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de software de
IntelliGenetics, Mountain View, CA; y The University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias se introducen en un ordenador, secuencias de referencia y de ensayo, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa designados.

Puede llevarse a cabo alineación óptica de secuencias para comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needlman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al., citado anteriormente).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones en pares progresivas que muestran la relación y el porcentaje de identidad de secuencias. También representa gráficamente un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación en pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación es alineada luego con la siguiente secuencia o agrupación de secuencias alineadas más relacionadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación en pares de dos secuencias individuales. Se logra la alineación final mediante una serie de alineaciones progresivas en pares. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias, o designando los parámetros del programa. Por ejemplo, puede compararse una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencias, usando los siguientes parámetros: peso del hueco predeterminado (3.00), peso de la longitud del hueco predeterminado (0.10) y huecos en extremos ponderados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias, es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El software para llevar a cabo análisis BLAST, está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo incluye identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (abreviadamente HSP por la expresión inglesa High Scoring sequence Pairs), identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, la cual iguala o satisface alguna puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (véase Altschul, et al. citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como simientes para iniciar búsquedas para encontrar los HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se interrumpe cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en la cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa va hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST realiza también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualdad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos ocurriría por azar. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia, si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia, es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico de polipéptidos son sustancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente en forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. De esta manera, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren sólo por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas, es que las dos moléculas hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, como se describe más adelante.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de DC de mamífero correspondientes, se hibridarán típicamente con las SEQ ID NO: 1 ó 7, o porción adecuada de 3, bajo condiciones rigurosas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de DC respectivas se hibridarán típicamente con el ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1, 7, 3 ó 9 bajo condiciones de hibridación rigurosas, mientras que proporcionan pocas señales de hibridación positiva falsa. En general, se seleccionan condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 10ºC menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia que está siendo hibridada a un pH y concentración iónica definidos. Tm es la temperatura (bajo pH y concentración iónica definidos) a la cual 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente apareada. Típicamente, condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sales en el lavado es de aproximadamente 0.02 molar a pH 7, y la temperatura es por lo menos aproximadamente 50ºC. Otros factores pueden afectar de forma significativa a la rigurosidad de la hibridación incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de disolventes orgánicos, tales como formamida, y el grado de no apareamiento de bases. Una realización preferida incluirá ácidos nucleicos que se unirán a secuencias descritas en formamida al 50% y NaCl a 20-50 mM a 42ºC. La hibridación bajo condiciones rigurosas debe dar una señal de fondo de por lo menos dos veces mayor que la señal de fondo sin hibridación, de preferencia por lo menos 3 a 5, o más.

Un DNA de gen de DC aislado puede modificarse fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de DNA que codifican estos antígenos de DC, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunógena o antigénica altamente similar.

Pueden usarse secuencias modificadas para producir antígenos mutantes o para intensificar la expresión. La expresión intensificada puede incluir amplificación de genes, transcripción aumentada, traducción aumentada, y otros mecanismos. Dichos derivados de proteínas de DC mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la proteína respectiva o sus fragmentos. La "proteína de DC mutante", abarca un polipéptido que de otra manera está dentro de la definición de homología de la proteína de DC como se expuso anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en que tiene la proteína de DC como se encuentra en la naturaleza, ya sea por medio de deleción, sustitución o inserción. En particular, la "proteína de DC mutante específica de sitio", incluye en general proteínas que tienen similitud significativa con una proteína que tiene una secuencia de las SEQ ID NO: 2 u 8. En general, la variante compartirá muchas actividades fisicoquímicas y biológicas, por ejemplo, antigénicas o inmunógenas con aquellas secuencias, y en realizaciones preferidas, contienen la secuencia descrita completa, o la mayor parte de la misma. Conceptos similares se aplican a estas varias proteínas de DC, en particular las presentes en varios animales de sangre caliente, por ejemplo, primates y mamíferos.

Aunque los sitios de mutación específicos de sitio están predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos de sitio. Puede llevarse a cabo mutagénesis de proteínas de DC, haciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones, deleciones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas, para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxilo-terminales. Puede llevarse a cabo mutagénesis aleatoria en un codón diana, y los mutantes expresados pueden escrutarse entonces para la actividad deseada. Métodos para obtener mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el DNA que tienen una secuencia conocida, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante mutagénesis del cebador M13 o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Véase también, Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 and Supplements). Las mutaciones en el DNA normalmente no pondrían a las secuencias codificantes fuera de los marcos de lectura, y de preferencia no crearán regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir estructuras de mRNA secundarias, tales como bucles u horquillas.

La presente invención proporciona también proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas usando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos los cuales naturalmente no son normalmente fusionados de la misma forma. De esta manera, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de DC respectivo, es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, típicamente obtenido como un producto de traducción individual y que exhibe propiedades derivadas de cada péptido de origen. Un concepto similar se aplica a secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, pueden obtenerse nuevas construcciones combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, pueden "intercambiarse" dominios u otros segmentos entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión diferentes, típicamente con proteínas relacionadas, por ejemplo, dentro de las familias de lectina o asialoglucoproteína. De preferencia, se usarán dominios estructurales intactos, por ejemplo, porciones de Ig intactas. Véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. De esta manera, nuevos polipéptidos quiméricos que exhiben nuevas combinaciones de especificidad, resultarán de la unión funcional basada en la especificidad de unión a la proteína, y otros dominios funcionales. Asimismo, puede aplicarse mutagénesis por exploración de alanina, de preferencia a residuos que estructuralmente están fuera de la estructura secundaria, lo cual evitará la mayor parte de los residuos críticos que en general desorganizan la estructura terciaria.

Los "derivados" de estos antígenos de DC incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glucosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Pueden prepararse derivados covalentes mediante el enlace de funcionalidades con grupos que se encuentren en estas cadenas laterales de aminoácidos de la proteína de DC o en los extremos amino o carboxilo, mediante medios que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres alifáticos o amidas del carboxilo terminal, o de residuos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados de O-acilo de residuos que contienen grupo hidroxilo, y derivados de N-acilo de los residuos que contienen grupo amino o aminoácido amino-terminal, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo que incluyen alquilo normal de C3 a C18, formando de esta manera especies de alcanoil-aroilo. La unión covalente a proteínas portadoras puede ser importante cuando los restos inmunógenos son haptenos.

En particular, se incluyen alteraciones de glucosilación, por ejemplo, obtenidas modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en otras etapas del procesamiento. Medios particularmente preferidos para lograr esto, son exponer el polipéptido a enzimas glucosilantes derivadas de células que proporcionan normalmente dicho procesamiento, por ejemplo, enzimas de glucosilación de mamífero. Se contemplan también enzimas de desglucosilación. También está incluidas versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones menores, incluyendo residuos de aminoácido fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, u otros restos, incluyendo grupos ribosilo o reactivos de reticulación. Asimismo, se contemplan proteínas que comprenden sustituciones, las cuales deben retener inmunogenicidad sustancial, para producir anticuerpos que reconocen una proteína de las SEQ ID NO: 2, 4, 8 ó 10. Típicamente, estas proteínas contendrán menos de 20 sustituciones de residuos de la secuencia descrita, más típicamente menos de 10 sustituciones, de preferencia menos de 5, y más preferiblemente menos de 3. De forma alternativa, las proteínas que comienzan y terminan en dominios estructurales retendrán usualmente antigenicidad e inmunogenicidad cruzada.

Un grupo principal de derivados son conjugados covalentes de las proteínas de DC o fragmentos de las mismas con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden sintetizarse en cultivo recombinante, tal como fusiones N- o C-terminales, o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en la reticulación de proteínas a través de grupos laterales reactivos. Sitios de derivatización de proteínas preferidos con agentes de reticulación, están en grupos amino libres, restos de carbohidratos y residuos de cisteína.

Se proporcionan también polipéptidos de fusión entre estas proteínas de DC y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos heterólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie dando como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida. Asimismo, pueden construirse fusiones heterólogas que exhibirían una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivatizadas. Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de unión a receptor, de modo que la presencia o ubicación de la proteína fusionada pueda determinarse fácilmente. Véase, por ejemplo, Dull, et al., patente de EE.UU. Nº 4.859.609. Otros miembros de fusión de genes incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol- deshidrogenasa, y el factor de acoplamiento alfa de levaduras. Véase, por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science, 241: 812-816.

Dichos polipéptidos pueden tener también residuos de aminoácidos que hayan sido modificados químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o eliminación de otros restos, en particular los que tengan formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones las modificaciones serán con reactivos de marcado útiles, o servirán como dianas de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Esta invención contempla también el uso de derivados de estas proteínas de DC, más que variaciones en la secuencia de aminoácidos o glucosilación. Dichos derivados pueden incluir asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos derivados pertenecen en general a tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de residuos terminales y cadenas laterales, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Dichos derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de unión. Por ejemplo, un antígeno de proteína de DC puede inmovilizarse mediante unión covalente en un soporte sólido, tal como Sepharose activado con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, o puede adsorberse sobre superficies de poliolefina, con o sin reticulación con glutaraldehído, para su uso en la valoración o purificación de anticuerpos de proteína anti-DC. Las proteínas de DC pueden marcarse también con un grupo detectable, por ejemplo, radioyodado mediante el procedimiento de cloramina T, unido covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugados con otro resto fluorescente para su uso en valoraciones de diagnóstico. La purificación de estas proteínas de DC puede efectuarse mediante el uso de anticuerpos inmovilizados.

Los genes de proteína de DC aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una proteína de DC correspondiente, por ejemplo, tipos de especies o células que carecen de proteínas correspondientes y que exhiben actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de líneas de células antigénicamente puras, con variantes de especie individuales o definidas. Este procedimiento permitirá una detección y discriminación más sensible de los efectos fisiológicos de estas proteínas de DC. Pueden aislarse y usarse fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de membrana.

VIII. Complejos de proteína de DC: agente de unión

Una proteína de DC que se une específicamente a un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, o que es específicamente inmunorreactiva con el mismo, tal como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 8 ó 10, se determina en un inmunoensayo. El inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se produjo contra la proteína de las SEQ ID NO: 2, 4, 8 ó 10. Este antisuero se selecciona para que tenga baja reactividad cruzada contra otros miembros de las familias relacionadas, y cualquier reactividad cruzada es eliminada mediante inmunoabsorción antes de su uso en el inmunoensayo.

Para producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, la proteína de las SEQ ID NO: 2, 4, 8 ó 10, es aislada como se describe en la presente invención. Por ejemplo, puede producirse una proteína recombinante en una línea de células de mamífero. Una cepa endogámica de ratones, tales como balb/c, es inmunizada con la proteína adecuada usando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo estándar de inmunización del ratón (véase Harlow y Lane, citado anteriormente). De forma alternativa, puede usarse como un inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria, y conjugado con una proteína portadora. Se recogen sueros policlonales, y se titulan contra la proteína inmunógena en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor, se seleccionan y se someten a ensayo en cuanto a su reactividad cruzada contra otras proteínas relacionadas, usando un inmunoensayo de unión competitiva, tal como el que se describe en Harlow y Lane, citado anteriormente, en las páginas 570-573. De preferencia, se usan dos proteínas relacionadas diferentes en esta determinación junto con una proteína de DC determinada. Por ejemplo, con la proteína lectina, se usan por lo menos otros dos miembros de la familia para absorber epítopos compartidos. Junto con el miembro de la familia de DCMP1, se usan otros dos miembros de la familia. Estos otros miembros de la familia pueden producirse como proteínas recombinantes, y pueden aislarse usando técnicas estándares de química de proteínas y biología molecular como se describe en la presente memoria.

Pueden usarse inmunoensayos en el formato de unión competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, puede inmovilizarse la proteína de la SEQ ID NO: 2 u 8 en un soporte sólido. Las proteínas añadidas a la valoración compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada, se compara con la proteína de la SEQ ID NO: 2 u 8. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores, usando cálculos estándares. Se seleccionan y se reúnen los antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas listadas anteriormente. Los anticuerpos de reacción cruzada se separan entonces de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con las proteínas listadas anteriormente.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se usan entonces en un inmunoensayo de unión competitiva como se describió anteriormente, para comparar una segunda proteína con la proteína inmunógena (por ejemplo, la proteína de DC de la SEQ ID NO: 2 u 8). Para hacer esta comparación, cada una de las dos proteínas se valoran en una amplia gama de concentraciones, y se determina la cantidad de cada proteína que se requiere para inhibir 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menor que el doble de la cantidad de la proteína de la SEQ ID NO: 2 u 8 que se requiere, entonces se dice que la segunda proteína, se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

Ha de entenderse que las proteínas de DC son probablemente una familia de proteínas homólogas que comprenden dos o más genes. Para un producto génico particular, tal como la proteína de los miembros de la familia de Ig humana, la invención abarca no sólo las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, sino también otras proteínas que son variantes alélicas, polimórficas, no alélicas o de especie. Ha de entenderse también que el término "proteína de DC de humano" incluye mutaciones no naturales introducidas mediante mutación deliberada, usando tecnología recombinante convencional, tal como mutación de un solo sitio, o escindiendo secciones cortas de DNA que codifican estas proteínas o variantes de empalme del gen, o sustituyendo o añadiendo pequeños números de nuevos aminoácidos. Dichas alteraciones menores deben mantener sustancialmente la inmunogenicidad de la molécula original y/o su actividad biológica. De esta manera, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína de DC respectiva que existe de modo natural designada, por ejemplo, la proteína de DC humana que exhibe la SEQ ID NO: 4. Las modificaciones de proteína particulares consideradas como menores, incluirían sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describió anteriormente para cada familia de proteínas como un todo. Mediante la alineación de una proteína óptimamente con la proteína de la SEQ ID NO: 2 u 8, y usando los inmunoensayos convencionales descritos en la presente memoria para determinar la inmunoidentidad, es posible determinar las composiciones de proteína de la invención.

IX. Usos

La presente invención proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico como se describe en otras partes en la presente memoria, por ejemplo, en la descripción general para anormalidades del desarrollo, o más adelante en la descripción de kits para diagnóstico. En particular, los genes serán útiles como marcadores para distinguir tipos de células, incluyendo aspectos genómicos de células, así como patrones de expresión de mRNA y proteína.

Pueden usarse genes de DC, por ejemplo, DNA o RNA como un componente en una prueba forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos proporcionadas pueden marcarse usando, por ejemplo, ^{32}P o biotina, y pueden usarse para sondar materiales de transferencia estándar de polimorfismos del fragmento de restricción, proporcionando un carácter medible que permite distinguir entre individuos. Dichas sondas pueden usarse en técnicas forenses bien conocidas, tales como dactiloscopía genética. Además, pueden usarse sondas de nucleótidos obtenidas de secuencias de DC en ensayos in situ para detectar anormalidades cromosómicas.

Anticuerpos y otros agentes de unión dirigidos hacia ácidos nucleicos o proteínas de DC, pueden usarse para purificar la molécula de proteína de DC correspondiente. Como se describe en los ejemplos más adelante, la purificación de proteínas de DC usando anticuerpos es posible y practicable. Pueden usarse también anticuerpos y otros agentes de unión en una forma de diagnóstico, para determinar si están presentes componentes de DC en una muestra de tejido o población de células usando técnicas bien conocidas descritas en la presente memoria. La capacidad para unir un agente de unión a una proteína de DC, proporciona medios para diagnosticar trastornos asociados con la regulación defectuosa de la expresión. Anticuerpos y otros agentes de unión a proteínas de DC pueden ser también útiles como marcadores histológicos o forenses. Como se describe en los ejemplos más adelante, la expresión de cada una de estas proteínas está limitada a tipos de tejido específicos. Al dirigir una sonda, tal como un anticuerpo o ácido nucleico hacia la proteína de DC respectiva, es posible usar la sonda para distinguir tipos de tejidos o células in situ o in vitro.

Esta invención proporciona también reactivos que pueden exhibir valor terapéutico significativo. Las proteínas de DC (bien sea naturales o recombinantes), fragmentos de las mismas, y anticuerpos para las mismas, junto con compuestos que se ha identificado tienen afinidad de unión a la proteína de DC, pueden ser útiles en el tratamiento de estados asociados con la fisiología o el desarrollo anormal, incluyendo proliferación anormal, por ejemplo, estados cancerosos o estados degenerativos. Pueden modularse proliferación anormal, regeneración, degeneración y atrofia mediante el tratamiento terapéutico adecuado, usando las composiciones proporcionadas en la presente invención. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con expresión anormal o señalización anormal por una DC, por ejemplo, como una célula presentadora de antígenos, es una diana para un agonista o antagonista de la proteína. Las proteínas desempeñan probablemente una función en la regulación o el desarrollo de células hematopoyéticas, por ejemplo, células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas, por ejemplo, presentación de antígenos y a las funciones efectoras resultantes.

Se conocen otros estados anormales del desarrollo en tipos de células que se ha mostrado poseen mRNA de proteínas de DC mediante análisis de transferencia Northern. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; y Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY. Las anormalidades funcionales o del desarrollo, por ejemplo, del sistema inmune, causan estados y anormalidades médicas significativas, que pueden ser susceptibles para la prevención o tratamiento usando las composiciones proporcionadas en la presente.

Anticuerpos o proteínas de DC recombinantes podrían purificarse, y administrarse luego a un paciente. Estos reactivos pueden combinarse para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunógenos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. En particular, éstos pueden ser útiles en un contexto de vacunas, en donde el antígeno se combina con una de estas versiones terapéuticas de agonistas o antagonistas. Estas combinaciones pueden filtrarse en condiciones estériles, y pueden colocarse en formas de dosificación, tal como mediante liofilización en viales de dosificación o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, incluyendo formas que no son de unión al complemento.

El escrutinio de fármacos, que usa anticuerpos o receptores o fragmentos de los mismos, puede identificar compuestos que tienen afinidad de unión a estas proteínas de DC, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Pueden usarse entonces pruebas biológicas subsecuentes para determinar si el compuesto tiene actividad de estimulación intrínseca, y es por lo tanto un bloqueador o antagonista porque bloquea la actividad de la proteína. Asimismo, un compuesto que tenga actividad de estimulación intrínseca podría activar la célula a través de la proteína, y de esta manera es un agonista porque estimula a la célula. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos para las proteínas como antagonistas.

Las cantidades de los reactivos necesarios para la terapia eficaz, dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. De esta manera, deben titularse las dosificaciones de tratamiento para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. La realización de pruebas o ensayos en animales respecto a las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares, proporcionará otra indicación predictiva de la dosificación en seres humanos. Varias consideraciones se describen, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; y (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Métodos de administración se describen en la presente y más adelante, por ejemplo, para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica, y otras. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. Se esperaría a menudo que los intervalos de dosificación estén en cantidades menores que concentraciones de 1 mM, típicamente menores que concentraciones de aproximadamente 10 \muM, usualmente menores que aproximadamente 100 nM, de preferencia menores que aproximadamente 10 pM (picomolar), y más preferiblemente menores que aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo adecuado. Se usarán con frecuencia formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, para la administración continua.

Las proteínas de DC, fragmentos de las mismas, y anticuerpos para las mismas o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, podrían administrarse directamente al hospedante que se ha de tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlas con proteínas portadoras tales como ovoalbúmina o seroalbúmina antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo se administre solo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente por lo menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser farmacéuticamente y fisiológicamente aceptable en el sentido de que sea compatible con los otros ingredientes, y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo administración subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; y (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. La terapia de esta invención puede combinarse con otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos.

Tanto la forma que se presenta de modo natural como la forma recombinante de las proteínas de DC de esta invención, son particularmente útiles en kits y métodos de valoración que son capaces de escrutar compuestos para actividad de unión a las proteínas. Se han desarrollado varios métodos de valoraciones automatizados en años recientes, que permiten el escrutinio de decenas de miles de compuestos en un corto período. Véase, por ejemplo, Fodor, et al. (1991) Science 251: 767-773, y otras descripciones de colecciones de diversidad química, las cuales describen medios para poner analizar la afinidad de unión por una pluralidad de compuestos. El desarrollo de valoraciones adecuadas puede ser facilitado ampliamente por la disponibilidad de grandes cantidades de versiones purificadas, por ejemplo, versiones solubles, de proteínas de DC como se proporciona mediante esta invención.

Por ejemplo, pueden encontrarse con frecuencia antagonistas una vez que la proteína haya sido definida estructuralmente. La realización de ensayos de análogos de proteína potenciales, es ahora posible tras el desarrollo de métodos de valoración altamente automatizados que usan una proteína de superficie purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas usando técnicas de escrutinio descritas en la presente memoria. De importancia particular, son compuestos que se ha encontrado tienen una afinidad de unión combinada para antígenos de superficie celular relacionados múltiples, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de una proteína de DC.

Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos usando proteínas de DC recombinantes en una variedad de técnicas de escrutinio de fármacos. Las ventajas del uso de una proteína recombinante en el escrutinio de ligandos específicos, incluyen: (a) fuente renovable mejorada de la proteína de una fuente específica; (b) número potencialmente mayor de antígenos por célula, que da una mejor relación de señal a ruido en las valoraciones; y (c) especificidad de las variantes de especie (que da teóricamente mayor especificidad biológica y de enfermedad).

Un método de escrutinio de fármacos usa células hospedantes eucarióticas o procarióticas que son transformadas establemente con moléculas de DNA recombinantes que expresan una proteína de DC. Pueden aislarse células que expresan esa proteína en aislamiento de cualquier otra. Dichas células, en forma viable o fijada, pueden usarse para valoraciones de unión estándares a proteínas de superficie. Véase también, Parce, et al. (1989) Science 246: 243-247; y Owicki, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Son particularmente útiles las valoraciones competitivas, en donde las células (fuente de proteínas de DC) se ponen en contacto y se incuban con un anticuerpo que tiene afinidad de unión conocida al antígeno, tal como ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión esté siendo medida. Las composiciones de unión marcadas libres y unidas se separan luego para evaluar el grado de unión a la proteína. La cantidad de compuesto de ensayo unido, es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo marcado que se une a la fuente conocida. Pueden usarse muchas técnicas para separar reactivos unidos de reactivos libres para evaluar el grado de unión. Esta etapa de separación podría incluir típicamente un procedimiento, tal como adhesión a filtros, seguida de lavado, adhesión a plástico seguida de lavado, o centrifugación de las membranas celulares. Podrían usarse también células viables para escrutar los efectos de los fármacos sobre estas funciones mediadas por proteínas de DC, por ejemplo, presentación del antígeno o función auxiliar.

Otro método usa membranas de células hospedantes procarióticas o eucarióticas transformadas como la fuente de una proteína de DC. Estas células son transformadas establemente con vectores de DNA que dirigen la expresión de la proteína adecuada, por ejemplo, una forma unida a membrana manipulada por ingeniería genética. Esencialmente, las membranas se prepararían de células, y se usarían en valoraciones de unión tales como la valoración competitiva expuesta anteriormente.

Otro procedimiento es usar proteínas de DC purificadas solubilizadas, no purificadas o solubilizadas, de células hospedantes procarióticas o eucarióticas transformadas. Esto permite una valoración de unión "molecular" con las ventajas de especificidad aumentada, la capacidad para automatizar, y alto rendimiento del ensayo de fármacos.

Otra técnica para el escrutinio de fármacos, implica un procedimiento que proporciona escrutinio de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a la proteína de DC respectiva, y se describe en detalle en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 septiembre de 1984. Primeramente grandes números de diferentes compuestos de ensayo constituidos por péptidos pequeños se sintetizan sobre un sustrato sólido, por ejemplo, varillas de plástico o alguna otra superficie adecuada; véase Fodor, et al., citado anteriormente. Luego, todos los soportes se hacen reaccionar con la proteína de DC purificada solubilizada, no purificada o solubilizada, y se lavan. El siguiente etapa implica la detección del reactivo unido, por ejemplo, anticuerpo.

Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas, es una determinación de estructura física, por ejemplo, técnicas de cristalografía de rayos X o RMN bidimensional. Estas proporcionarán una guía de qué residuos de aminoácidos forman regiones de contacto moleculares. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, NY.

X. Kits

Esta invención contempla también el uso de estas proteínas de DC, fragmentos de las mismas, péptidos, y sus productos de fusión, en una variedad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de un mensaje o proteína de DC. Típicamente el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido de DC definido, o segmento de gen o un reactivo que reconoce uno o el otro, por ejemplo, anticuerpos.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a la proteína de DC respectiva, comprendería típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo, un anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida por la proteína; una fuente de la proteína de DC (presente de modo natural o recombinante); y medios para separar el compuesto unido del compuesto marcado libre, tal como una fase sólida para la inmovilización de la proteína de DC. Una vez que los compuestos se seleccionan, los que tengan afinidad de unión adecuada a la proteína, pueden evaluarse en pruebas biológicas adecuadas, como es bien sabido en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas que regulan la función de DC. La disponibilidad de polipéptidos de DC recombinantes, proporciona también patrones bien definidos para la calibración de dichas pruebas.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una proteína de DC en una muestra, comprendería típicamente un compuesto marcado, por ejemplo, anticuerpo, que tenga afinidad de unión conocida por la proteína de DC, una fuente de proteínas de DC (presente de modo natural o recombinante), y medios para la separación del compuesto unido del compuesto marcado libre, por ejemplo, una fase sólida para la inmovilización de la proteína de DC. Normalmente se proporcionarán compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión a antígeno, específicos para la DC respectiva o sus fragmentos, son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de la proteína y/o sus fragmentos. Dichas pruebas de diagnóstico pueden usar lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos de células y fluidos corporales, y pueden incluir además la detección de antígenos en suero o similares. Las pruebas de diagnóstico pueden ser homogéneas (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno-proteína de DC) o heterogéneas (con una etapa de separación). Existen varios ensayos o pruebas comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), inmunoensayo de fluorescencia marcado con sustratos (SLFIA), y similares. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos no marcados usando un segundo anticuerpo que esté marcado y que reconozca al anticuerpo para la proteína de DC o a un fragmento particular de la misma. Pruebas similares se han estudiado también extensivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando; FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY. En particular, los reactivos pueden ser útiles para el diagnóstico de poblaciones de DC en muestras biológicas, ya sea para detectar un exceso o deficiencia de DC en una muestra. La prueba puede ser dirigida al análisis histológico de una biopsia, o la evaluación de números de DC en una muestra de sangre o tejido.

Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una proteína de DC, y como tales pueden servir de diagnóstico de varios estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de la proteína de DC puede dar como resultado varias reacciones inmunológicas que pueden servir de diagnóstico de estados fisiológicos anormales, en particular en condiciones de células proliferativas, tales como cáncer o diferenciación anormal.

Con frecuencia, los reactivos para las valoraciones de diagnóstico se proporcionan en kits para optimizar la sensibilidad de la prueba. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza de la prueba, se proporciona el protocolo, y el marcador, ya sea anticuerpo o receptor marcado o no marcado, o proteína de DC marcada. Esto es usualmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales tales como substratos para enzimas, y similares. De preferencia, el kit contendrá también instrucciones para el uso adecuado y el desecho de los contenidos después del uso. Típicamente, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan como un polvo liofilizado seco, en donde los reactivos pueden reconstituirse en un medio acuoso que proporciona concentraciones adecuadas de reactivos para llevar a cabo la prueba.

Muchos de los constituyentes mencionados anteriormente de los escrutinios de fármacos y las pruebas de diagnóstico pueden usarse sin modificación, o pueden modificarse de varias formas. Por ejemplo, puede lograrse el marcado uniendo covalentemente o no covalentemente un resto que proporcione directamente o indirectamente una señal detectable. En muchas de estas pruebas, la proteína, compuesto de prueba, proteína de DC, o anticuerpos para la misma, pueden marcarse directamente o indirectamente. Las posibilidades para marcado directo incluyen grupos de marcadores: marcadores radiactivas tales como ^{125}I, enzimas (véase la patente de EE.UU. Nº 3.645.090), tales como fosfatasa alcalina y peroxidasa, y marcas fluorescentes (véase la patente de EE.UU. Nº 3.940.475), capaces de monitorizar el cambio en intensidad de fluorescencia, desplazamiento de longitud de onda o la polarización de fluorescencia. Las posibilidades para marcado indirecto incluyen biotinilación de un constituyente, seguida de unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcadores anteriores.

Existen también numerosos métodos de separación de la proteína unida de la proteína libre, o de forma alternativa, el compuesto unido del compuesto de prueba libre. La proteína de DC puede ser inmovilizada sobre varias matrices, seguida de lavado. Matrices adecuadas incluyen plástico, tal como una placa de ELISA, filtros y perlas. Los métodos para la inmovilización de la proteína de DC a una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa a plástico, el uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. La última etapa en este procedimiento incluye la precipitación del complejo de proteína/anticuerpo mediante uno de varios métodos que incluyen los que usan, por ejemplo, un disolvente orgánico, tal como polietilenglicol o una sal, tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables de anticuerpos marcados con fluoresceína que se describe en Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30: 1457-1461, y la separación de partículas magnéticas de anticuerpos dobles, como se describe en la patente de EE.UU. Nº 4.659.678.

Métodos para enlazar proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores se han descrito extensivamente en la literatura, y no requieren una descripción detallada en la presente memoria. Muchas de las técnicas incluyen el uso de grupos carboxilo activados a través del uso de carbodiimida o ésteres activos que forman enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo, o una olefina activada, tal como maleimida, para enlace, o similares. Las proteínas de fusión encontrarán también uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención incluye el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de una proteína de DC respectiva. Estas secuencias pueden usarse como sondas para la detección de los niveles del mensaje en las muestras de pacientes que se sospecha tienen un estado anormal, por ejemplo, cáncer o problema inmune. La preparación de secuencias de nucleótidos de RNA y DNA, el marcado de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias, han recibido amplia descripción y análisis en la literatura. Normalmente, una sonda de oligonucleótidos debe tener por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas de polinucleótidos pueden ser de hasta varias kilobases. Pueden usarse varios marcadores, más comúnmente radionúclidos, en particular ^{32}P. Sin embargo, pueden usarse también otras técnicas, tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio de unión a avidina o anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, fluoróforos, enzimas, o similares. En forma alternativa, pueden usarse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos pueden marcarse a su vez, y la prueba puede llevarse a cabo en donde el dúplex se une en una superficie, de modo que tras la formación del dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas para el nuevo RNA antisentido puede llevarse a cabo por cualquier técnica convencional, tal como hibridación de ácidos nucleicos, escrutinio positivo y negativo, sondeo recombinacional, traducción liberada por híbridos (abreviadamente HRT por la expresión inglesa hybrid released translation) y traducción interrumpida por el híbrido (abreviadamente HART por la expresión inglesa hybrid arrested translation). Esto incluye también técnicas de amplificación, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Se contemplan también kits de diagnóstico que analizan también la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Por tanto, los kits pueden analizar las combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res, 1: 89-97.

XI. Aislamiento de la pareja de unión

Habiendo aislado un miembro de una pareja de unión de una interacción específica, existen métodos para el aislamiento del miembro contrario. Véase, Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8: 3667-3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para marcar una proteína de superficie de DC sin que interfieran con la unión a su receptor. Por ejemplo, puede fusionarse un marcador de afinidad al extremo amino o carboxilo del ligando. Puede escrutarse una colección de expresión para unión específica a la proteína de DC, por ejemplo, mediante clasificación de células, u otro escrutinio para detectar subpoblaciones que expresen dicho componente de unión. Véase, por ejemplo, Ho, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11267-11271. De forma alternativa, puede usarse un método de adhesión a una superficie de plástico. Véase, por ejemplo, Seed y Aruffo (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369. Puede aplicarse también un sistema de selección de dos híbridos, produciendo construcciones adecuadas con las secuencias de proteína de DC disponibles. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature, 340: 245-246.

Pueden aplicarse técnicas de reticulación de la proteína con el marcador para aislar miembros de unión de una proteína de DC. Esto permitiría la identificación de proteínas que interactúan específicamente con la proteína de DC adecuada.

El amplio alcance de esta invención se entiende mejor con relación a los siguientes ejemplos, los cuales no se pretende que limiten la invención a las realizaciones específicas.

Ejemplos I. Métodos generales

Muchos de los métodos estándares siguientes se describen, o se hace referencia a los mismos, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd. ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley/Greene, NY; e Innis, et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY.

Métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización, y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 and periodic Supplements); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology. vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan et al. (1996 and periodic Supplements), Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY; y la literatura del fabricante sobre el uso de productos para la purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que pueda fusionarse mediante una secuencia separable por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie, 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent", en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY; y Crowe et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Métodos para la determinación de la función inmunológica se describen, por ejemplo, en Coligan, et al. (1992 and periodic supplements) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY. Véase también, por ejemplo, Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology, (3rd. ed.) Raven Press, N.Y.

Análisis de FACS se describen en Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry, Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, NY.

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II. Generación de células dendríticas

Se obtuvieron células CD34+ de ser humano, de la manera siguiente. Véase, por ejemplo, Caux, et al. (1995) pp. 1-5 en Banchereau y Schmitt, Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plenum Press, NY. Se cultivaron células de sangre periférica o del cordón umbilical, a veces seleccionadas para CD34+, en presencia de factor de células madre (SCF), GM-CSF y FNT-\alpha, en medio del RPMI 1640 libre de endotoxina (GIBCO, Gran Island, NY) suplementado con suero de bovino fetal inactivado con calor al 10% (v/v) (FBS; Flow Laboratories, Irvine, CA), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 5 X 10^{-5} M y penicilina (100 mg/ml). Este medio se denomina medio completo.

Se sembraron células CD34+ para expansión en matraces de 25 a 75 cm^{2} (Corning, NY) a 2 x 10^{4} células/ml. Se mantuvieron condiciones óptimas dividiendo estos cultivos en el día 5 y 10 con medio que contenía GM-CSF y FNT-\alpha recientes (concentración de células: 1-3 x 10^{5} células/ml). En ciertos casos, las células se distribuyeron mediante FACS para la expresión de CD1a en alrededor del día 6.

En ciertas situaciones, se recolectaron de la forma habitual células después de 12 días de cultivo, y finalmente se recuperaron las células adherentes usando solución de EDTA 5 mM. En otras situaciones, se activaron células CD1a+ mediante resuspensión en medio completo a 5 x 10^{6} células/ml, y se activaron para el tiempo adecuado (por ejemplo, 1 ó 6 horas) con 1 mg/ml de 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA, Sigma) y 100 ng/ml de ionomicina (Calbiochem, La Jolla, CA). Estas células se expandieron durante otros 6 días, y se aisló RNA para la preparación de la colección de cDNA.

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III. Aislamiento de RNA y construcción de la colección

Se aísla RNA total usando, por ejemplo, el procedimiento del gradiente de tiocianato de guanidina/CsCl como se describe por Chirgwin et al. (1987) Biochem. 18: 5294-5299.

De forma alternativa, se aísla RNA poli(A)+ usando el kit de aislamiento de mRNA OLIGOTEX (QIAGEN). Se genera cDNA de doble cadena usando, por ejemplo, el sistema de plásmidos SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para la síntesis de cDNA y clonación de plásmidos. El cDNA de doble cadena resultante se clona unidireccionalmente, por ejemplo, en pSport1, y se transfecta mediante electroporación en células ELECTROMAX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

IV. Secuenciación

Se sometió DNA aislado de clones escogidos aleatoriamente, o después de hibridación sustractiva usando células no activadas, a análisis de secuencias de nucleótidos usando técnicas estándares. Puede usarse un kit de secuenciación cíclica Taq DiDeoxy Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los fragmentos de DNA marcados se separan usando un gel de secuenciación de DNA de un secuenciador automatizado adecuado. De forma alternativa, el clon aislado se secuencia como se describe, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd. ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Métodos de secuenciación química están también disponibles, por ejemplo, usando las técnicas de secuenciación de Maxam y Gilbert.

V. Construcción del gen de DC recombinante

Se aísla RNA poli(A)^{+} de poblaciones de células adecuadas, por ejemplo, usando el kit de mRNA FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA). Las muestras se someten a electroforesis, por ejemplo, en un gel de agarosa al 1% que contiene formaldehído, y se transfieren a una membrana GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA). Se lleva a cabo hibridación, por ejemplo, a 65ºC en NaHPO_{4} 0,5M, pH 7,2, SDS al 7%, EDTA 1 mM y BSA al 1% (fracción V) con cDNA del gen de DC marcado con ^{32}P-dCTP a 10^{7} cpm/ml. Después de hibridación, los filtros se lavan tres veces a 50ºC en 0,2XSSC, SDS al 0,1%, y se exponen a película durante 24 horas.

La construcción génica recombinante puede usarse para generar una sonda para la detección del mensaje. La inserción puede separarse y usarse en los métodos de detección descritos anteriormente.

VI. Expresión de la proteína del gen de DC en E. coli

Se usa PCR para obtener una construcción que comprende el marco de lectura abierto, de preferencia en asociación operable con secuencias de promotor, selección y reguladoras adecuadas. El plásmido de expresión resultante es transformado en una cepa de E. coli adecuada, por ejemplo, la cepa Topp5 de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Se desarrollan transformantes resistentes a ampicilina (50 \mug/ml) en caldo de Luria (Gibco) a 37ºC, hasta que la densidad óptica a 550 mM sea de 0,7. Se induce proteína recombinante con isopropil-\betaD-tiogalacto-piranósido 0,4 mM (Sigma, St. Louis, MO), y la incubación de las células se continúa a 20ºC durante otras 18 horas. Las células del cultivo de 1 litro se cosechan mediante centrifugación y se resuspenden, por ejemplo, en 200 ml de sacarosa al 30% enfriada en hielo, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM. Después de 10 minutos sobre hielo, se añade agua enfriada en hielo hasta un volumen total de 2 litros. Después de 20 minutos sobre hielo, las células se separan mediante centrifugación, y el líquido sobrenadante se clarifica mediante filtración mediante un Millipak 60 de 5 \muM (Millipore Corp., Bedford, MA).

La proteína recombinante se purifica mediante métodos de purificación estándares, por ejemplo, varios métodos de cromatografía de intercambio iónico. Pueden usarse también métodos de inmunoafinidad que usan anticuerpos descritos más adelante. Pueden usarse métodos de afinidad en donde una cola de epítopo es introducida por técnicas de ingeniería genética en una construcción de expresión.

VII. Cartografiado de genes de DC humanas

Se llevan a cabo técnicas de aislamiento de DNA, digestión por enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, transferencia Southern e hibridación de acuerdo con técnicas estándares. Véase Jenkins, et al. (1982) J. Virol. 43: 26-36. Pueden prepararse transferencias con membrana de nilón Hybond-N (Amersham). La sonda se marca con ^{32}P-dCTP; se lleva a cabo lavado hasta una rigurosidad final, por ejemplo, de SSC 0,1X, SDS al 0,1%, 65ºC.

De forma alternativa, puede combinarse un panel de híbridos de células somáticas de ratón de BIOS Laboratories (New Haven, CT) con métodos de PCR. Véase Fan, et al. (1996) Immunogenetics, 44: 97-103.

La localización cromosómica con un panel de Stanford G3, dio como más cercano el marcador SHGC-12041, con una carga de 7,7. Este marcador, que es el gen que codifica el antígeno M130, se localiza hacia el cromosoma 12p13. Esta localización es común para muchos genes que codifican receptores de la familia de lectinas tipo C, notablemente CD69, y la familia de receptores NK.

VIII. Análisis de la variación individual

A partir de los datos de distribución, se selecciona un tipo de células abundante fácilmente accesible para el muestreo de individuos. Mediante el uso de técnicas de PCR, se analiza una gran población de individuos para este gen. Se usa cDNA u otros métodos de PCR para secuenciar el gen correspondiente en los diferentes individuos, y se comparan sus secuencias. Esto indica el grado de divergencia entre poblaciones raciales u otras poblaciones, así como la determinación de qué residuos es probable que sean modificables sin efectos acusados sobre la función.

IX. Preparación de anticuerpos

Se generan proteínas de DC recombinantes mediante expresión en E. coli como se mostró anteriormente, y se ensayan para actividad biológica. De forma alternativa, pueden usarse fuentes de proteína naturales con métodos de purificación hechos disponibles. Pueden usarse reactivos de anticuerpos en inmunopurificación, o para seguir el curso de métodos de separación. Pueden usarse proteínas activas o desnaturalizadas para la inmunización de mamíferos adecuados para la producción de suero policlonal, o para la producción de anticuerpos monoclonales.

X. Aislamiento de genes DC de roedor o de sus correspondientes en primates

Se usan clones de cDNA humano que codifican estos genes como sondas, o para diseñar cebadores de PCR para encontrar correspondientes en varias especies de primates, por ejemplo, chimpancés.

Las búsquedas por técnicas bioinformáticas de las bases de datos de EST (dbEST del GenBank), que usan la secuencia de polipéptidos predicha de DCMP1 (algoritmo TBLASTN), revelaron clones de ratón que codifican una proteína homóloga a la DCMP1 de primate. Se observaron cuatro clones que corresponden a esta secuencia: embrión de ratón 115dpc AA387662 Ko; bazo de ratón AA170532; glándula mamaria de ratón AA475012; y glándula mamaria de ratón AA423158. Se seleccionó uno de estos, AA170532, que se estimó es un clon de longitud completa mediante análisis de secuencias, y se secuenció su DNA. Este clon contenía características similares a DCMP1. El clon de longitud completa tiene 1418 pares de bases, excluyendo la secuencia de poli-A, y contiene una 5'-UTR de 278 pares de bases. Como para hDCMP1, el codón de iniciación supuesto (putativo) no está contenido dentro de una región de consenso de Kozak, pero este codón va precedido por un codón de detención hacia el extremo 5'. La 5'-UTR contiene secuencias similares a señales de degradación rápida, incluyendo tres sitios de ATTTA de consenso. Se observa una secuencia de poliadenilación potencial. El polipéptido predicho tiene aproximadamente 238 residuos de longitud, y codifica una proteína de membrana tipo II con un ITIM y un dominio de lectina tipo C. Se observan tres sitios de N-glucosilación potenciales. Las alineaciones de éste y la proteína humana, muestran aproximadamente 54% de identidad y 65% de homología sobre la secuencia completa. Notablemente, los dominios ITIM están altamente conservados (13 de 15 residuos son idénticos). De interés es el residuo de glutamina conservado proximal a la membrana (FQKYSQLLE), y el residuo de cisteína implicado potencialmente en la formación del puente disulfuro. Igualmente, los dominios de lectina tipo C muestran bloques de conservación, incluyendo el resto de EPS. Diferencias vistas entre hDCMP1 y las lectinas hepáticas humanas son retenidas en la secuencia del ratón, notablemente el reemplazamiento de triptófano en las posiciones 119 y 163; una glutamina en la posición 177; y serina en lugar de triptófano en la posición 228. De esta manera, parece que este clon es el homólogo de la hDCMP1 de ratón.

XI. Uso de reactivos para analizar poblaciones de células

La detección del nivel de células dendríticas presentes en una muestra, es importante para el diagnóstico de estados morbosos aberrantes. Por ejemplo, un aumento en el número de células dendríticas en un tejido o el sistema linfático, puede ser indicativo de la presencia de una hiperplasia de DC o de rechazo de tejidos o injertos. Una baja población de DC puede indicar una reacción anormal a, por ejemplo, una infección bacteriana o viral, que puede requerir el tratamiento adecuado para normalizar la respuesta de DC.

El análisis de FACS que usa un agente de unión marcado específico para una proteína de DC de superficie celular (véase, por ejemplo, Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry, Wiley-Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, NY), se usa en la determinación del número de células dendríticas presentes en una mezcla de células, por ejemplo, las PBMC, células adherentes, etc. El agente de unión se usa también para el análisis histológico de muestras de tejido, ya sea reciente o fijado, para analizar la infiltración de DC. Pueden evaluarse también poblaciones de células diversas, ya sea en una prueba o valoración destructiva de células o en ciertas pruebas en donde las células retienen su viabilidad.

El análisis de la presencia de moléculas intracelulares solubles se lleva a cabo, por ejemplo, con un agente de unión fluorescente específico para una DC, como se describe en Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367. De forma alternativa, pueden usarse métodos de fijación de tejidos o células.

Los niveles de transcritos de DC se cuantifican, por ejemplo, usando PCR semicuantitativa como se describe en Murphy, et al. (1993) J. Immunol. Methods, 162: 211-223. Se diseñan cebadores de modo que el DNA genómico no sea detectado.

XII. Distribución de la expresión

El análisis de la secuencia de cDNA completa de DCMP1 en una base de datos de secuencias, reveló un patrón de expresión restringido a un número limitado de colecciones. Se detectaron el número más grande de secuencias (diez) en colecciones de células dendríticas, cuatro secuencias en una colección de células de osteoclastoma, y secuencias individuales de colecciones de macrófagos generados in vitro a partir de monocitos, neutrófilos activados por LPS, condrosarcoma, cáncer de colon, linfoma de células T, tumor de piel y sinovitis crónica. En el dbEST del GenBank, se detectaron cuatro clones: AA418441, colección sustraída; AA446401, feto total; AA677149, bazo e hígado fetal; C01555, Human Gene Signature; y AA380065, tumor de piel.

El análisis de la expresión de DCMP1 mediante RT-PCR sobre muchas líneas de células diferentes y células recién aisladas, mostró que la expresión de DCMP1 no se detecta en TF1 (precursor mieloide), Jurkat (una línea de células T), CHA (carcinoma de riñón), MRC5 (fibroblastos de pulmón fetal), JY (línea de células B) o U937 (línea de células de linfoma mielomonocítico), pero se restringe a células hematopoyéticas. En células recién aisladas, se observa expresión en DC, no activadas y activadas; granulocitos activados; PBL, no activados y activados; y se observa un bajo nivel de expresión en monocitos activados; y células B activadas. Todas las muestras activadas fueron grupos de células tratadas con PMA/ionomicina durante 1 y 6 horas.

Otro análisis mostró que la expresión de DCMP1 varió con el estado de activación de la célula. Se usó también RT-PCR para detectar la expresión de DCMP1 bajo diferentes estados de activación. Se trataron células B aisladas de tejido tonsilar con PMA/ionomicina durante 1 ó 6 horas o mediante co-cultivo con células L que expresan CD40L durante 3, 12 y 24 horas. Se detectó mRNA en células no activadas. Esta expresión podría perderse dentro de 1 hora para el tratamiento con PMA/ionomicina y después de 3 horas de tratamiento con CD40L. En contraste, no pudo detectarse expresión en células T, aún después de incubación con anti-CD3/anti-CD28.

En células derivadas de CD34+, la expresión de DCMP1 fue fuerte en macrófagos derivados de células progenitoras CD34+ en presencia del M-CSF. Esta expresión no pareció alterarse en la respuesta PMA/ionomicina. En DC derivadas de células progenitoras CD34+ en presencia de GM-CSF y FNT\alpha, se observó que varía el nivel de mRNA durante el curso de tiempo del cultivo, con mayores cantidades de mRNA detectadas en el día 12 de cultivo. Después de 48 horas de co-cultivo con células L que poseen CD40L, la expresión de DCMP1 se pierde. En FACS de DC in vitro clasificada en el día 6 para la presencia de marcadores CD1a/CD14 y continuados en cultivo durante 6 días más, se detectó más mRNA en la subpoblación de CD14 que en la subpoblación de CD1a. Esta expresión fue subregulada mediante el tratamiento con PMA/ionomicina.

En monocitos aislados de sangre, no se detectó mRNA en células no activadas. Sin embargo, se detectó expresión de DCMP1 después de 6 horas de tratamiento con PMA/ionomicina. En DC derivadas de monocitos mediante tratamiento con GM-CSF e IL-4, la expresión de DCMP1 fue sobrerregulada. Esta expresión no pudo alterarse mediante tratamiento con PMA/ionomicina, pero pudo subregularse mediante co-cultivo con células L que expresan CD40L. En este caso, la expresión del mRNA de DCMP1 se perdió totalmente en 24 horas de cultivo. La expresión de la proteína humana se confirmó usando métodos de detección de anticuerpos.

Se expresó DCMP1 en subconjuntos de DC aislados ex vivo. Los subconjuntos de DC aislados de sangre o de tejido tonsilar, se caracterizaron por la presencia o ausencia de la integrina CD11c. Véase Larson y Springer (1990) Immunol. Rev., 114: 181-217. El subconjunto CD11c+ de DC aisladas de sangre (conocido también como GCDC) expresa DCMP1. Sin embargo, no se detectó mRNA después de la activación mediante un tratamiento con anti-CD40L o PMA/ionomicina. En contraste, el mismo subconjunto de células aisladas de tejido tonsilar, ya no expresa DCMP1. En el caso del subconjunto de DC CD11c-, se observa un bajo nivel de expresión en células aisladas de sangre. Esta expresión es mayor en células aisladas de tejido tonsilar, pero de nuevo es subregulada en la activación mediante un anticuerpo anti-CD40 o con tratamiento con PMA/ionomicina. Las células de Langerhans aisladas de piel expresan DCMP1, mientras que las células basales circundantes no muestran expresión alguna.

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XIII. DCMP1 de primate

El análisis de secuencias sugiere que estas DCMP son miembros de la superfamilia de receptores de lectina/asialo-
glucoproteína. En particular, se ha asociado a las lectinas hepáticas y de macrófagos con la internalización de proteínas y péptidos los cuales, por ejemplo, podrían ser importantes en la captación y presentación del antígeno por células dendríticas. La DCMP1 contiene un resto de internalización (YxxV) o un resto tipo ITIM (IxYxxV; residuos 5-10 de SEQ ID NO: 2; un resto más extendido va dese los residuos 1 a 24). Esto sugiere que la proteína puede ser una versión de proteínas de células dendríticas de la familia de receptores inhibidores (KIR; LIR, etc.), los cuales envían una señal negativa que inhibe la función celular.

El marco de lectura abierto supuesto comienza alrededor del nucleótido 242. Este codón de inicio potencial no está en una secuencia de consenso de Kozak, pero puesto que no va precedido por un codón de ATG alternativo y existe un codón de detención en la posición 200 hacia el extremo 5', se predice que éste es el comienzo de la proteína codificada. A partir de esta secuencia, se predijo un polipéptido de aproximadamente 237 aminoácidos. No se detectó péptido de señal alguno, pero una secuencia transmembranal putativa se extiende desde alrededor de las posiciones 386 a 443. Este clon codifica una proteína de membrana tipo II con un dominio de lectina tipo C. La 3'-UTR contiene muchas señales de degradación rápida potenciales, incluyendo tres repeticiones de la secuencia consenso ATTTA. No se detectó péptido de señal, pero las secuencias de transmembrana supuestas se extienden desde las posiciones 45 a 62 o, en forma alternativa, 386 a 443. Este clon codifica una proteína de membrana tipo II con un dominio de lectina tipo C.

El polipéptido predicho a partir del análisis de secuencias, tiene un dominio intracelular de 49 aminoácidos que incluye un resto basado en tirosina centrado en el residuo 7. Se ha mostrado que los restos YXX (L/V) de esta naturaleza, actúan como restos de incorporación en el caso de las lectinas hepáticas y CD23 (Fce RIIa). Se ha mostrado que este tipo de dominio actúa como resto de activación (ITAM) o resto inhibidor (ITIM) en moléculas tales como Ly49, NKG2A, y la familia de moléculas tipo inmunoglobulina KIR. La inhibición es mediada por el reclutamiento de SHP2/SHIP fosfatasas hacia el dominio de consenso (I/V)XYXX(L/V). Los primeros 15 aminoácidos de DCMP1 muestran conservación hacia el dominio ITIM extendido, y parece probable que la inhibición de la función celular sea uno de los atributos de DCMP1. Un sitio de N-glucosilación potencial individual está presente en alrededor de la posición 185.

La comparación de las secuencias de aminoácidos del dominio de lectina tipo C de DCMP1 con otras proteínas que contienen dominios de lectina tipo C, mostró que DCMP1 tiene la homología más grande con las lectinas hepáticas y la lectina de macrófagos (véase Tabla 1). Los residuos de cisteína conservados del pliegue de lectina tipo C, están claramente conservados a través de los miembros de esta familia; sin embargo, pueden verse muchas características distinguibles. Al igual que las lectinas hepáticas, DCMP1 tiene un doble resto de cisteína al comienzo del dominio de lectina. La función de esta cisteína complementaria se desconoce, ya que no existe aparentemente otra cisteína en el dominio de lectina que pueda formar un puente disulfuro con este residuo. Es posible que este residuo pueda intervenir en la formación del puente disulfuro intermolecular, aunque existe otra cisteína en DCMP1 en la posición 91, la cual probablemente cumple esta función. La porción N-terminal del dominio de lectina de DCMP1 muestra la más grande conservación con las lectinas hepáticas y la lectina de macrófagos. El dominio de unión a calcio está conservado en DCMP1, y muestra homología más grande con CD23, incluyendo el resto EPS (residuos 195-197), glutamato (E) en la posición 201 y asparagina y aspartato (ND) en la posición 218-219. Estos restos faltan notablemente en los receptores NK (NKGE mostrados aquí) y CD94.

La DCMP1 es una proteína de membrana tipo II con el segmento de transmembrana predicho de aproximadamente los residuos 45 a 62. Está relacionada con la familia de proteínas que incluye receptores de asialoglucoproteína, lectinas hepáticas, CD69, CD72, CD23 y receptores NK. Esta proteína contiene un dominio de lectina tipo C dependiente de calcio extracelular en el carboxi terminal (desde aproximadamente los residuos 104 a 237), que exhibe los restos característicos de la especificidad de los residuos de azúcar. Véase Tabla 1. Estas proteínas se unen típicamente a los residuos de azúcar en las glucoproteínas, y están implicadas en la respuesta inmune primaria. Se ha mostrado que varios miembros de esta familia, notablemente CD69, los receptores NK y CD72, transmiten una señal durante eventos de activación celular que incluyen proliferación y la inducción de genes específicos.

DCMP1, al igual que el receptor KIR de lectina tipo C de ratón, Ly 49, contiene un resto de incorporación con homología extendida hacia el grupo de receptores inhibidores (dominio ITIM, véase las revisiones recientes por Vivier y Daeron (1997) Immunology Today, 18: 286-291; y Katz y Austen (1997) J. Immunol. 158: 5065-5070). Estos receptores, miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) o lectinas tipo C, transmiten una señal negativa mediante fosfatasas que contiene al dominio SH2, por ejemplo, SHIP, SHP-1 y SHP-2. La evidencia sugiere que estos receptores se asocian con otros receptores de activación para bloquear señales de activación. La evidencia sugiere también que el ligando para este tipo de molécula, es una molécula de IgSF. Ejemplos de ésta son las moléculas clase I del MHC (reconocidas por los receptores CD94/NK y Ly-49) y FcgR (CD23; que reconoce a IgG).

Es probable que el residuo de cisteína 91 esté implicado en el enlace disulfuro con otro polipéptido, quizá un homodímero o heterodímero.

El análisis por PCR indica que el gen se expresa en células dendríticas activadas y células dendríticas no activadas. No se encontraron señales detectables en células TF1 (líneas de células hematopoyéticas), Jurkat (línea de células T), MRC5 (línea de células de sarcoma de fibroblastos de pulmón), JY (línea de células B), U937 (línea de células pre-monocíticas) o CHA (línea de células de carcinoma). Se detectaron señales positivas en los PBL no activados o activados recién aislados, y granulocitos, pero sólo señales débiles de células T recién aisladas, células B, células NK o monocitos.

El análisis de secuencias indica la expresión del gen en muestras caracterizadas como células dendríticas, neutrófilos activados, macrófagos (activados con GM-CSF), osteoclastoma, tumor de piel, linfoma de células T, cáncer de colon, sinovitis crónica y condrosarcoma.

XIV. DCMP1 correspondiente de ratón

La Tabla 2 muestra la secuencia de las secuencias correspondientes de roedor.

En la Tabla 2, la secuencia muestra homología con dos EST de ratón, W33446 (véase la SEQ ID NO: 11) y AA170532 (véase la SEQ ID NO: 8), que codifican la correspondiente de DCMP1 de ratón (véase la SEQ ID NO: 8).

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XV. DCMP2 de primate

DCMP2, un receptor de asialoglucoproteína supuesto, es una proteína de transmembrana tipo II. En su región extracelular, DCMP2 posee un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) individual, característico de la familia de lectinas tipo C (dependiente de Ca++) (véase Drickamer y Taylor (1993) Ann. Rev. Cell Biol. 9: 237-264. DCMP2 muestra homología considerable con los dos genes (H1 y H2) que codifican las subunidades del receptor de asialoglucoproteína hepática humana. Véase Stockert (1995) Physiol Revs. 75: 591-609. Estos receptores hepáticos representan el prototipo de los miembros de la familia de lectinas tipo C tipo II. ASGPR del hígado tiene especificidad de unión por glucoproteínas desialiladas que exhiben residuos de galactosilo terminales, y media su endocitosis en hepatocitos mediante la vía de la cavidad recubierta de clatrina. Notablemente, las características asociadas con estas funciones están conservadas entre los ASGPR y DCMP2 hepáticos. Así, DCMP2 contiene un resto intracelular que incluye un residuo de tirosina en la posición 5 y que se asocia con la capacidad de endocitosis de ligandos. Véase Fuhrer, et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 423-431. Además, DCMP2 exhibe una secuencia QPD de tipo de reconocimiento de galactosa (Gln-Pro-Asp) (Drickamer (1992) Nature, 360: 183-186) en su dominio de reconocimiento de azúcar.

Se han aislado varios clones de cDNA variantes que codifican DCMP2, más probablemente como una consecuencia de empalme alternativo. Tres variantes se describen a continuación: una forma corta, una forma larga y una tercera forma denominada DCMP2v. Véase SEQ ID NO: 4 y 10; Tabla 1. Las formas larga y corta difieren por la presencia de una inserción única de 27 aminoácidos en la región extracelular del clon de forma corta. La forma corta de DCMP2 exhibe 4 diferencias en residuos en la región extracelular con un ASGPR recién clonado obtenido de macrófagos de humano (M-ASGPR). Véase Suzuki, et al. (1996) J. Immunol. 156: 128-135.

Respecto a DCMP2l, el ASGPRm carece del segmento que corresponde a GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSV
CVP (residuos 118-144 de SEQ ID NO: 4), y AGRPRm contiene una inserción de GEE (entre los residuos 173 y 174 de SEQ ID NO: 4). DCMP2s es idéntico a DCMP2l, salvo por la ausencia de GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP (residuos 118-144 de SEQ ID NO: 4), y una diferencia en la secuencia en el nucleótido 1064 de G a A, que codifica de esta manera Asn en lugar de Asp. DCMPv es similar a DCMPs, pero carece de la secuencia LLQRLRSGPCHLLLSL
GLG (residuos 30-48 de SEQ ID NO: 4), que corresponde a una porción significativa del segmento de transmembrana; y contiene la inserción de GEE (entre los residuos 173 y 174 de SEQ ID NO: 4), como se encuentra en ASGPRm. Las regiones en torno a estas diferencias, por ejemplo, dentro de una longitud del epítopo, por ejemplo, 12 a 17 aminoácidos, son de interés.

Está disponible la proteína de forma larga de DCMP2 recombinante, y se han generado anticuerpos monoclonales. Además, una línea de células murinas ha sido transfectada para la expresión estable de las formas larga y corta.

El gen se aisló originalmente de DC CD1a^{+} 70% puro, derivado de células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} cultivadas en GM-CSF y FNT\alpha (Caux, et al. (1992) Nature, 360: 258-261. El clon se ha insertado en un vector pSport1 (sitios de restricción NotI/SalI).

El análisis por PCR sugiere la expresión de genes de DCMP2 en células dendríticas, y quizá muy débilmente en células TF1 (línea de células hematopoyéticas). No hubo señal detectable de células de Jurkat (línea de células T), CHA (línea de células de carcinoma), MRC5 (línea de células de sarcoma de fibroblastos de pulmón) o JY (línea de células B). Se detectó la señal en células dendríticas activadas o no activadas recién aisladas (PMA e ionomicina), granulocitos y PBLS activados o no activados. No se detectó la señal en monocitos, células T activadas o no activadas o células B activadas o no activadas.

DC-ASPGR exhibe homología considerable con la correspondiente murina del ASGPR (M-ASGPR) de monocitos humanos. La homología es notable (\sim60%) dentro del dominio de reconocimiento de carbohidratos que confiere especificidad a ASGPR de monocitos murinos para galactosa y N-acetilgalactosamina (GalNAc). Véase Sato, et al. (1992) J. Biochem. 111: 331-336. Esto incluye el resto QPD, encontrado también en las subunidades H1 y H2 del ASGPR hepático. Además, el ASGPR de monocitos murinos tiene una señal de internalización YENL en su dominio citosólico.

M-ASGPR murino funciona como un receptor para la endocitosis de glucoproteínas glucosiladas (Ozaki, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 9229-9235), y permite el reconocimiento de células malignas por macrófagos tumoricidas (Kawakami, et al. (1994) Jpn. J. Cancer Res. 85: 744-749). En este contexto, se encontró que M-ASGPR de murino se expresa dentro de nódulos metastásicos de pulmón de ratones que poseen células tumorales ováricas metastásicas OV2944-HM-1 (Imai, et al. (1995) Immunol. 86: 591-598). De interés, M-ASGPR humano demuestra un especificidad notable por el antígeno Tn (Suzuki, et al. (1996) J. Immunol. 156: 128-135), que posee una agrupación de GalNAc terminal enlazada a serina o treonina, y se asocia con carcinomas humanos (Springer (1989) Mol. Immunol. 26: 1-5; y \diameterrntoft, et al. (1990) Int. J. Cancer, 45: 666-672).

Con base en la homología de secuencias, puede predecirse que las DCMPs funcionan también como un receptor endocítico para glucoproteínas galactosiladas. Además, la internalización del ligando mediante el receptor de manosa, otra lectina endocítica transmembranal tipo C, da como resultado la presentación del antígeno altamente eficiente por DC a través de la vía de la clase II del MHC. Véase Cella, et al. (1997) Current Opinion Immunol. 9: 10-16. Por analogía, es posible que las DCMPs desempeñen una función similar en la asignación de ruta de ligandos internalizados en una vía de presentación del antígeno.

De esta manera, DCMP2 podría ser una diana potencial de alta eficacia para la carga de antígenos en las células dendríticas para intensificar la presentación a células T en la terapia adyuvante basada en la respuesta inmune. Esto podría abordarse pulsando DC in vitro con una forma de antígeno galactosilada, o con anticuerpos monoclonales anti-DCMP2 acoplados al antígeno. La eficiencia de presentación in vitro podría valorarse mediante la activación de células T específicas del antígeno. Esto se enfocaría en la presentación de antígenos asociados a tumores (TAA), debido a las perspectivas terapéuticas inherentes de dicha alternativa. De particular interés, son TAA asociados con melanoma maligno.

Además, la especificidad del M-ASGPR humano por el antígeno Tn, hace que los TAA de carcinoma sean un candidato de elección para la elección de DCMP2 como diana.

Se ha mostrado recientemente que el antígeno exógeno puede ser procesado y presentado en la vía de la clase I del MHC. Véase Porgador y Gilboa (1995) J. Exp. Med. 182: 255-260; Paglia, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 317-322. Es probable que receptores especializados realicen dicha función en DC.

Estos receptores en DC pueden elegirse como dianas para ayudar a producir células T citotóxicas específicas de TAA (CTL) con potencial terapéutico significativo, ya que las CTL parecen estar implicadas en la inducción del rechazo de tumores.

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XVI. Internalización de DCMP

DC obtenidas de progenitores CD34+ cultivados en GM-CSF y FNT\alpha, fueron teñidas a 4ºC con anticuerpo monoclonal anti-DCMP2 o anti-CD13 como control. Después de incubación subsecuente a 37ºC durante un período de hasta aproximadamente 20 minutos, se analizaron anticuerpos monoclonales unidos a la superficie celular. Se observó internalización por disminución en la fluorescencia de la superficie celular.

La DCMP2l se internaliza rápidamente a 37ºC, pero no a 4ºC. Aproximadamente 60% del marcador de superficie desapareció dentro de aproximadamente 15 minutos. Esto demuestra que la DCMP2 puede funcionar como un receptor endocítico, consistente con la presencia de un resto de internalización (YENF) en su dominio intracitoplásmico.

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XVII. Aislamiento de una pareja correspondiente de unión

Puede usarse una proteína de DC como un reactivo de unión específico, aprovechando su especificidad de unión, pero de forma muy similar a como se usaría un anticuerpo. Un reactivo de unión es marcado como se describió anteriormente, por ejemplo, mediante fluorescencia o de otra forma, o inmovilizado en un sustrato por métodos de adhesión a plástico.

La proteína de DC se usa para escrutar una línea de células que exhiba unión. Se usan técnicas de tinción estándares para detectar o clasificar ligandos intracelulares o de superficie expresada, o se seleccionan mediante adhesión a plástico células transformadas que se expresan en su superficie. El escrutinio de la expresión intracelular se lleva a cabo mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase también McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832.

Por ejemplo, en el día 0, recubrir previamente portaobjetos Permanox de 2 cámaras con 1 ml de fibronectina por cámara, 10 ng/ml en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS. Luego, sembrar células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Incubar durante la noche a 37ºC.

En el día 1 para cada muestra, preparar 0,5 ml de una solución de 66 mg/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 66 mM y 4 mg de DNA en DME libre de suero. Para cada conjunto, se prepara un control positivo, por ejemplo, de cDNA de receptor-FLAG humano a una dilución de 1 y 1/200, y un falso negativo. Lavar las células con DME libre de suero. Añadir la solución de DNA, e incubar durante 5 horas a 37ºC. Eliminar el medio, y añadir 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 minutos. Eliminar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento, e incubar durante la noche.

En el día 2, cambiar el medio. En los días 3 ó 4, las células son fijadas y teñidas. Lavar las células dos veces con solución salina tamponada de Hank (HBSS), y fijar en paraformaldehído (PFA)/glucosa 4% durante 5 minutos. Lavar 3X con HBSS. Los portaobjetos pueden almacenarse a -80ºC después de que se elimina todo el líquido. Para cada cámara, se realizan incubaciones de 0,5 ml de la manera siguiente. Añadir HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de NaN_{3} 1M durante 20 minutos. Las células se lavan luego con HBSS/1X saponina. Añadir a las células proteína o complejo de proteína/anticuerpo, e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Si es adecuado, añadir primero el anticuerpo durante 30 minutos. Añadir el segundo anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo anti-ratón Vector, a una dilución 1/200, e incubar durante 30 minutos. Preparar solución de ELISA, por ejemplo, solución de peroxidasa de rábano picante Vector Elite ABC, y preincubar durante 30 minutos. Usar, por ejemplo, 1 gota de solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir solución de ABC HRP e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS, segundo lavado durante 2 minutos, lo cual cierra las células. Añadir luego ácido diaminobenzoico Vector (DAB) durante 5 a 10 minutos. Usar 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada. Retirar cuidadosamente la cámara y enjuagar el portaobjetos en agua. Secar al aire durante unos cuantos minutos, y añadir entonces 1 gota de Crystal Mount y usar un cubreobjetos. Hornear durante 5 minutos a 85-90ºC.

De forma alternativa, se usan otros reactivos de unión específicos de proteínas de monocitos, para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. o Ausubel, et al.

Otra estrategia es escrutar un receptor unido a membrana mediante adhesión a plástico. El cDNA del receptor se construye como se describió anteriormente. El ligando puede ser inmovilizado y usado para inmovilizar células de expresión. La inmovilización puede lograrse mediante el uso de anticuerpos adecuados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de proteínas de monocitos, o mediante el uso de anticuerpos producidos contra los primeros anticuerpos. Ciclos recurrentes de selección y amplificación llevan al enriquecimiento de clones adecuados y el aislamiento final de clones que expresan el ligando.

Pueden seleccionarse colecciones de expresión de fagos usando proteínas de monocitos. Técnicas de marcado adecuadas, por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcado específico de clones adecuados.

Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden hacerse sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen únicamente a modo de ejemplo, y la invención no será limitada sólo por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de equivalentes para los cuales se benefician dichas reivindicaciones.

Presentación de secuencias

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia C-lectina DCMP-1 de primate.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia del polipéptido del gen de la familia C-lectina DCMP-1 de primate.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia C-lectina DCMP-2 de primate.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia del polipéptido del gen de la familia C-lectina DCMP-2 de primate.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia del polipéptido ASGPRh1 hepático de primate.

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia del polipéptido ASGPRh2 hepático de primate.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia C-lectina DCMP-1 de roedor.

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia del polipéptido del gen de la familia C-lectina DCMP-1 de roedor.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos de la variante DCMP2 de primate.

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia del polipéptido de la variante DCMP2 de primate.

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia peptídica de EST W33446 de roedor.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A):

NOMBRE: Schering Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B):

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C):

CIUDAD: Kenilworth

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

ESTADO: New Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E):

PAÍS: EE.UU. de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F):

CÓDIGO POSTAL: 07033

\vskip0.500000\baselineskip

(G):

TELÉFONO: (908) 298-5056

\vskip0.500000\baselineskip

(H):

TELEFAX: (908) 298-5388

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Genes y proteínas de membranas de mamíferos; Secuencias relacionadas.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Power Macintosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: 8.1.0.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Microsoft Word 6.0.1.

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS USUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 60/053,080

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE LA SOLICITUD: 9 DE JULIO DE 1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1104 pares de bases.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA; cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 242...952

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 237 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1458 pares de bases.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA; cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 257...1204

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 608

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "forma corta carece de nucleótidos 608-673"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 775

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= *ASGPRm (Tabla 2) tiene un inserto de secuencia que codifica{}\hskip3,6cm GEE entre los nucleótidos 775-776*

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1064

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``*el nucleótido 1064 de DCMP2s puede ser A, que podría co-{}\hskip3,6cm dificar asn en lugar de asp en el residuo de número 270*

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 316 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\newpage

10

11

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 291 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: No relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 287 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: No relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1418 pares de bases.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA; cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 279...992

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1348

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "resto de adición de poli-A"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 238 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1370 pares de bases.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA; cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 273...1091

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 273 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: No relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

26

Claims (8)

1. Un polipéptido recombinante, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

2. Un polipéptido DCMP1 recombinante, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

3. Una proteína de fusión, que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que se une específicamente a un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

5. Un ácido nucleico recombinante, que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

6. Un vector de expresión, que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula hospedante, que comprende un vector de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para producir de modo recombinante un polipéptido, que comprende cultivar una célula hospedante de la reivindicación 7, bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido.