SK252000A3 - PURIFIED PROTEIN OR RECOMBINANT POLYPEPTIDE DCMP1 AND DCMP2,ì (54) FUSED PROTEIN, BIND COMPOUND, DCMP1 OR DCMP2 ENCODING NU - Google Patents

Description

Takmer čistý alebo rekombinantný polypeptid DCMP1 a DCMP2, fúzny proteín, väzbová zlúčenina, nukleová kyselina, kódujúca DCMP1 alebo DCMP2, expresný vektor, hostiteľská bunka pre expresný vektor a spôsob rekombinantnej prípravy polypeptidu

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa zaoberá prostriedkami, ktoré sa týkajú génov, nájdených napríklad v lymfocytoch, t. j. bunkách, ktoré majú určitú funkciu v imunitnom systéme. Tieto gény sú užitočnými ukazovateľmi a môžu mať určitú funkciu pri regulácii vývoja, pri diferenciácii a/alebo vo fyziológii cicavčieho imunitného systému. Prihláška konkrétne poskytuje nukleové kyseliny, proteíny, protilátky a spôsoby ich použitia.

Doterajší stav techniky

Cirkulujúca zložka cicavčieho obehového systému zahŕňa rôzne typy buniek vrátane červených a bielych krviniek erytroidných a myeloidných bunkových linií. Viď. napríklad Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2. vydanie) Lippincott, Philadelphia, PA.; Jandl (1987) Blood; Textbook of Hematology, Little, Brown a Co., Boston, MA a Paul (1993) Fundamental Immunology (3. vydanie) Raven Press, N. Y.

Dendritické bunky (DC) sú antigén-spracovávajúce alebo antigén-prezentujúce bunky a našli sa vo všetkých tkanivách tela. Viď. Steinman (1991) Annual Review of Inununology 9: 271 až 296 a Banchereau a Schmitt (1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plénum Press, NY. Tieto DC sa môžu klasifikovať do rôznych kategórií vrátane: intersticiálnych dendritických buniek srdca, obličky, čreva a pľúc; Langerhansových buniek v koži a mukóznych membránach; zapadajúcich dendritických buniek v dreni týmusu a sekundárnom lymfoidnom tkanive a dendritických buniek krvi a lymfy. Aj keď dendritické bunky v každej z týchto častí sú CD45+ leukocyty, ktoré zjavne vznikajú v kostnej dreni, môžu vykazovať rozdiely, ktoré súvisia so štádiom zrelosti a mikroprostredím.

Tieto dendritické bunky účinne spracovávajú a prezentujú antigény napríklad T bunkám. Stimulujú odozvy naivných a pamäťových T buniek.

Primárne a sekundárne folikulárne dendritické bunky, folikuly B-buniek obsahujú ktoré zachytávajú a dlhý čas udržiavajú neporušený antigén vo forme imunitných komplexov.

Tieto dendritické bunky prezentujú natívny antigén B bunkám a sú pravdepodobne zahrnuté do afinitného zrenia protilátok, do vytvárania imunitnej pamäti a do udržiavania humorálnych imunitných odpovedí.

Monocyty sú fagocyty, ktoré patria do mononukleárneho fagocytového systému a zúčastňujú sa cirkulácie. Viď. Roitt Encyklopédia of Immunology, Academic Press, San Diego. Tieto bunky vznikajú v kostnej dreni a akonáhle sa diferencujú, zostávajú v dreni len krátky čas. Potom vstupujú do cirkulácie a môžu tu zostať relatívne dlho, napríklad niekoľko dní. Monocyty môžu vstupovať do tkaniva a telesných dutín procesom, označovaným ako diapedéza, kde sa diferencujú na makrofágy a eventuálne dendritické bunky. Ako odozva na zápal sa môže počet monocytov v obehu zdvojnásobiť a veľa z týchto zvýšených monocytov prechádza diapedézou qlo miesta zápalu.

Ako prezentácia antigénu sa označujú prípady, keď je proteínový antigén bunkou zachytený, spracovaný antigénprezentujúcimi bunkami (APC) a potom rozpoznaný, čím sa zaháji imunitná odpoveď. Ako najaktívnejšie antigén-prezentujúce bunky boli charakterizované makrofágy, ktoré sú priamymi vývojovými produktami monocytov, dendritické bunky a určité B bunky.

Makrofágy boli zistené vo väčšine tkanív a sú vysoko aktívne pri internalizácii rôznych proteínových antigénov a mikroorganizmov. Majú vysoko vyvinutú endocytovú aktivitu a vylučujú veľa produktov, dôležitých pri zahájení imunitnej odpovede. Z tohto dôvodu sa predpokladá, že veľa génov, exprimovaných monocytmi alebo indukovaných v dôsledku aktivácie monocytov, je pravdepodobne dôležitých pri porozumení, spracovaní a prezentácii antigénu alebo pri regulácii vznikajúcej imunitnou odpoveďou.

Dendritické bunky a monocyty sú však pokiaľ ide o proteiny, ktoré exprimujú, ale aj z hľadiska množstva ich funkcií a mechanizmov pôsobenia vrátane ich aktivovaných stavov, málo charakterizované. Konkrétne procesy a mechanizmy, ktoré sa týkajú zahájenia imunitnej odpovede, vrátane spracovania a prezentácie antigénu, zostávajú nejasné. Neznalosť štrukturálnych, biologických a fyziologických vlastností týchto buniek obmedzuje ich pochopenie. Stavy, keď dochádza k neobvyklým reguláciám, vývoju alebo fyziológii antigén-prezentujúcich buniek, zostávajú teda nekontrolovateľné.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je čiatočne založený na objave rôznych génov pre membránové proteiny cicavčích dendritických buniek (Dendritic Celí Membráne Protein, DCMP), čo je preukázané špecifickými DCMP1 a DCMP2 uskutočneniami.

Údaje, ktoré sa týkajú distribúcie, naznačujú širšiu bunkovú distribúciu a údaje, ktoré sa týkajú štruktúry, naznačujú niektorú funkciu. DCMP1 vykazuje podobnosť s triedou lektínov a azialoglykoproteínoVými receptormi. Opísané DCMP2 uskutočnenia vykazujú významnú sekvenčnú podobnosť s azialoglykoproteínovým receptorom makrofágovej bunky. Predkladaný vynález zahŕňa agonisty a antagonisty génových produktov napríklad mutácie (muteíny) prirodzených sekvencií, fúzne proteiny, chemické mimetiky a ďalšie štrukturálne a funkčné analógy. Predkladaný vynález je tiež zameraný na izolované gény, ktoré kódujú proteiny podľa predkladaného vynálezu. Tiež sú poskytované rôzne použitia týchto odlišných proteínových prostriedkov alebo prostriedkov, ktoré obsahujú nukleové kyseliny.

V konkrétnych uskutočneniach poskytuje predkladaný vynález väzbovú zlúčeninu, ktorá obsahuje väzbové miesto pre protilátku, ktorá sa špecificky viaže na proteín DCMP1 alebo na polypeptid vybraný z: Gly Val Ser Glu Leu Gin Glu His Thr

Thr Gin Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val

Cys Val Pro (zvyšky 118 až 144 SEQ ID č.: 4); Gin Val Ala Thr

Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys (zvyšky 166 až 181 SEQ ID č.: 4) alebo Trp Lys Pro Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gin Gly His Gly Leu Gly (zvyšky 263 až 277 SEQ ID č. : 4). V uprednostňovaných uskutočneniach je vo väzbovej zlúčenine väzbové miesto pre protilátku; špecificky imunoreaktivne s proteinom so SEQ ID č.: 2 alebo 8, špecificky imonoreaktivne s proteínom, ktorý sa skladá zo zvyškov 118 až 144 SEQ ID č.: 4, vytvorenej proti purifikovanému alebo rekombinantne pripravenému ľudskému proteínu DCMP1, vytvorenej proti purifikovanému alebo rekombinantne pripravenému ľudskému proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, zloženú zo zvyškov 118 až 144 zo SEQ ID č.: 4, v monoklonálnej protilátke, Fab alebo F(ab)2 alebo väzbová zlúčenina je: detegovatelne označená, sterilná alebo v pufrovanom prostriedku.

Predkladaný vynález zahŕňa spôsoby, ktoré používajú tieto väzbové zlúčeniny. Tieto spôsoby zahŕňajú kontakt väzbovej zlúčeniny s biologickou vzorkou, ktorá obsahuje antigén s cielom vytvoriť komplex väzbová zlúčenina : antigén. V určitých uskutočneniach je biologická vzorka ľudská a väzbovou zlúčeninou je protilátka. Predkladaný vynález tiež poskytuje súpravu na detekciu, ktorá obsahuje túto väzbovú zlúčeninu a inštruktážny materiál, ktorý sa týka použitia tejto väzbovej zlúčeniny na detekciu alebo zložku, ktorá poskytuje separáciu väzbovej zlúčeniny.

Predkladaný vynález tiež poskytuje takmer čistý alebo izolovaný polypeptid, ktorý sa špecificky viaže na tieto väzbové zlúčeniny. V rôznych uskutočneniach polypeptid: obsahuje aspoň fragment, ktorý obsahuje minimálne 14 aminokyselinových zvyškov proteínu DCMP1 z primáta; obsahuje aspoň 14 aminokyselinových zvyškov z reťazca aminokyselín 118 až 144 v SEQ ID č.: 4; je rozpustný polypeptid; je detegovatelne označený; je vo forme sterilného prostriedku; je pufrovaný prostriedok; viaže sa na zvyšok kyseliny sialovej; je rekombinantne vyrobený alebo má prirodzene sa vyskytujúcu polypeptidovú sekvenciu.

Sú poskytnutované uskutočnenia nukleových kyselín vrátane nukleovej kyseliny, kódujúcej vyššie uvedený polypeptid a to vtedy, ak je purifikovaná. Nukleová kyselina často: obsahuje aspoň 30 nukleotidov kódujúceho podielu SEQ ID č. : 1 alebo 7; obsahuje aspoň 30 nukleotidov z nukleotidov 608 až 688 SEQ ID č.: 3 alebo obsahuje aspoň 30 nukleotidov z nukleotidov 752 až 799 SEQ ID č.: 3 alebo môže obsahovať inzert, ktorý selektívne •t hybridizuje s nukleovou kyselinou, kódujúcou vyššie definovaný polypeptid. Predkladaný vynález tiež transfektovanú touto nukleovou kyselinou, častí SEQ ID č.: 1, 7, ktoré kódujú zodpovedajúcich častí SEQ ID č.: 3.

poskytuje ktorá sa proteín <

i bunku, skladá z alebo zo

Predkladaný vynález poskytuje spôsoby, ktoré aspoň jedno vlákno týchto nukleových kyselín na duplexnej nukleovej kyseliny, tohto vlákna s komplementárnym reťazcom, hybridizovania, uprednostňovaných detekciu duplexu duplexu.

používajú vytvorenie Tieto spôsoby zahŕňajú kontakt schopným špecifického nachádza vo vzorke. V umožňuje tento spôsob histologickú lokalizáciu ktorý sa uskutočneniach alebo umožňuje

Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby použitia opísaných väzbových prostriedkov, kde je zahrnutý krok, počas ktorého dochádza ku kontaktu väzbového prostriedku so vzorkou, s cieľom vytvoriť komplex väzbový prostriedok : antigén. V uprednostňovaných uskutočneniach je vzorkou ^biologická vzorka vrátane telesnej tekutiny; antigén je na bunke alebo antigén je ďalej purifikovaný.

Predkladaný vynález ďalej zahŕňa spôsoby použitia týchto polypeptidov, ktoré zahŕňajú kontakt polypeptidu so vzorkou na vytvorenie komplexu väzbový prostriedok : polypeptid. V uprednostňovaných uskutočneniach je polypeptid ďalej purifikovaný.

Iný poskytovaný spôsob je modulácia fyziológie alebo funkcie dendritickej bunky, ktorá zahŕňa krok, keď dochádza ku kontaktu bunky s opísaným väzbovým prostriedkom, s opísaným proteínom DCMP1 alebo s opísaným polypeptidom. Výsledkom funkcie môže byť zahájenie alebo pokračovanie imunitnej odpovede. Kontakt je väčšinou v kombinácii s antigénom, vrátane bunkového povrchu, s MHC antigénom triedy I alebo MHC antigénom triedy II.

Podrobný opis

Všetky tu citované odkazy sú zahrnuté ako odkazy a to v rovnakom rozsahu ako keby to bolo u každej individuálnej publikácie alebo patentovej prihlášky špecificky a individuálne označené, aby bola zahrnutá ako odkaz.

I. Všeobecne

Predkladaný vynález poskytuje DNA sekvencie, kódujúce cicavčie proteíny, exprimované na dendritických bunkách (DC) . Súhrnný článok, ktorý sa týka dendritických buniek, viď. Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9: 271 až 296 a Banchereau a Schmitt (1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plénum Press, NY. Tieto proteíny sú označené ako proteíny dendritických buniek (DC proteíny), pretože sú nájdené na týchto bunkách a zdá sa, že existuje určitá špecifita v ich expresii.

Špecifické primátové, napríklad ľudské uskutočnenia týchto proteínov sú poskytnuté nižšie. Tiež existujú náprotivky u hlodavcov, napríklad myší. Nižšie uvedené opisy sú na účely príkladov zamerané na ľudské DC gény, ale okrem toho sa môžu aplikovať na štrukturálne, napríklad sekvenčne podobné uskutočnenia z iných zdrojov alebo cicavčích druhov vrátane polymorfných alebo individuálnych variantov. Tieto budú zahŕňať napríklad proteíny, ktoré vykazujú relatívne málo zmien v sekvencií, napríklad menej ako 5 % a počet substitúcií napríklad menej ako 20, väčšinou menej ako 15, výhodnejšie menej ako 10 a najvýhodnejšie menej ako 5 substitúcií vrátane 4, 3, 2 alebo 1. Tieto tiež zahŕňajú verzie, ktorých celá dĺžka je skrátená, ako je opísané, a fúzne proteíny, ktoré obsahujú podstatné úseky týchto sekvencií.

II. Definície

Termín väzbový prostriedok označuje molekuly, ktoré sa špecificky viažu na tieto DC proteíny, napríklad prostredníctvom interakcie antigén-protilátka. Iné zlúčeniny, napríklad proteíny, sa môžu tiež špecificky spájať s príslušným proteínom. Väčšinou bude špecifické spojenie v podobe prirodzenej fyziologicky významnej kovalentnej alebo nekovalentnej interakcie proteín-proteín a môže zahŕňať členy multiproteínového komplexu vrátane nosičových zlúčenín alebo dimerizačných partnerov. Molekula môže byť polymér alebo chemické činidlo. Funkčný analóg môže byť proteín so štrukturálnymi modifikáciami alebo to môže byť úplne nepodobná molekula, napríklad taká, ktorá má taký tvar molekuly, ktorý interaguje so zodpovedajúcimi interakčnými determinantami. Varianty môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty proteínu, viď napríklad Goodman a kol. (1990) Goodman and Gilman's: The i Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydanie) Pergamon

Press, Tarrytown, N. Y.

Termín komplex väzbové činidlo : DC proteín, ako sa tu používa, označuje komplex väzbového činidla a DC proteínu. Špecifická väzba väzbového činidla znamená to, že väzbové činidlo má špecifické väzbové miesto, ktoré rozpozná miesto na príslušnom DC proteíne. Napríklad protilátky, vyrobené proti DC proteínu, ktoré rozpoznávajú epitop na DC proteíne, sú schopné špecifickým naviazaním vytvoriť komplex protilátka : DC proteín. Tvorba komplexu väzbové činidlo : DC proteín väčšinou umožňuje meranie tohto DC proteínu v zmesi ďalších proteínov a biologických látok. Termín komplex protilátka : DC proteín označuje komplex väzbové činidló : DC proteín, v ktorom je väzbovým činidlom protilátka. Protilátka môže byť ' monoklonálna, polyklonálna alebo dokonca fragment protilátky, ktorý viaže antigén, napríklad vrátane fragmentov Fv, Fab alebo Fab2.

Homológne sekvencie nukleových kyselín, ak sa porovnávajú, vykazujú významnú podobnosť. Štandardné postupy na zisťovanie homológie nukleových kyselín zahŕňajú buď stanovenie homológie pomocou poronávania sekvencií a/alebo fylogenetických súvislostí, čo sa vo všeobecnosti používa v tejto oblasti techniky alebo sú založené na hybridizácii. Obidva postupy porovnávania sekvencií a hybridizácie sú detailne opísané nižšie.

Izolovaná nukleová kyselina je nukleová kyselina, napríklad RNA, DNA alebo zmesný polymér, ktorá je takmer separovaná od ostatných zložiek, ktoré ju bežne sprevádzajú, napríklad proteíny a postranné genómové sekvencie z pôvodných druhov. Termín zahŕňa sekvenciu nukleovej odstránená z rekombinantné syntetizované heterológnymi kyseliny, ktorá bola prirodzene a zahŕňa izoláty, chemicky prostredia, kde sa vyskytuje alebo klonované DNA analógy alebo analógy biologicky syntetizované systémami. Takmer čistá molekula zahŕňa izolované formy molekuly. Vo všeobecnosti bude izolovaná nukleovaná kyselina homogénny prostriedok molekúl, ale v niektorých uskutočneniach bude obsahovať minoritnú heterogenitu. Táto heterogenita je väčšinou zistená na koncoch polyméru alebo v podieloch, ktoré nie sú podstatné pre žiadúcu biologickú funkciu alebo aktivitu.

Tu používaný termín DCMP1 protein by mal, v prípade, že je použitý v súvislosti s proteínom, zahŕňať protein, ktorý má také aminokyselinová sekvencie ako sú ukázané v SEQ ID č. : 2 alebo 8, alebo ktoré obsahujú významný fragment tohto proteínu. To znamená polypeptid, ktorý interaguje s príslušnými špecifickými väzbovými komponentami DCMP1 proteínu. Tieto väzbové komponenty, napríklad protilátky, sa väčšinou viažu na DCMP1 protein s vysokou afinitou, napríklad aspoň 100 nM, obvykle lepšou ako asi 30 nM, výhodnejšie lepšou ako asi 10 nM a najvýhodnejšie lepšou ako asi 3 nM.

Termín DCMP2 formy označuje sekvencie, poskytované v SEQ ID č.: 4a 10. V SEQ ID č. 3 a 4 boli poskytnuté nukleotid a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia proteínu primáta, napríklad ľudského, ktorý je príbuzný s členmi lektin/azialoglykoproteinovej rodiny, je označený DCMP2 a je izolovaný z knižnice dendritických buniek. Dlhá forma je rovnaká ako tá forma, ktorá je uvedená, zatiaľ čo krátkej forme chýba sekvencia, zodpovedájúca zvyškom 118 až 144. Krátka forma sa tiež môže líšiť v nukleotide 1064. To je podobné ako u monocytovej formy ASGPR, ktorá sa líši inzerciou medzi zvyškami 173 a 174 a zvyškom 270, viď. tab. 1 a inzertom sekvencie, kódujúcej GEE, medzi nukleotidmi 775 až 776. Iná variantná forma je opísaná v SEQ ID č.: 9a 10.

Tu používaný termín polypeptid alebo proteín zahŕňa významný fragment alebo úsek uvedeného proteinu a zahŕňa reťazec aminokyselinových zvyškov, ktorý sa skladá aspoň z 8 aminokyselín, všeobecnejšie aminokyselín, aspoň z 18 i z 10 aminokyselín, často aspoň zo 14 aminokyselín, typicky aspoň z 20 aminokyselín, vo všeobecnosti aspoň > aspoň z 12 aminokyselín, častejšie aspoň zo aminokyselín, väčšinou rf obvykle aspoň z 22 aminokyselín, obvyklejšie aspoň z 24 aminokyselín, výhodnejšie aspoň z 26 aminokyselín, najvýhodnejšie aspoň z 28 aminokyselín a v konkrétnych uprednostňovaných uskutočneniach aspoň z 30 alebo viacerých aminokyselín, napríklad 35, 40, 45, 50, 60, 70 atď.

Uprednostňované uskutočnenia vykazujú pluralitu vzdialených, napríklad neprekrývajúcich sa, úsekov s danou dĺžkou. Pluralita bude väčšinou aspoň dve, obvykle aspoň tri a výhodnejšie 5, 7 alebo ešte väčšia. Zatiaľ čo sú poskytované minimálne dĺžky, môžu existovať dlhšie úseky s rôznymi veľkosťami, napríklad jeden s dĺžkou 7 a dva s dĺžkou 12. Úseky sa môžu vzťahovať buď k peptidom alebo k oligonukleotidom.

Rekombinantná nukleová kyselina je väčšinou definovaná svojou štruktúrou. Môže to byť nukleová kyselina, pripravená vytvorením sekvencie, ktorá obsahuje fúziu dvoch fragmentov, ktoré jeden s druhým prirodzene nesusedia. Táto nukleová kyselina má slúžiť ako možnosť ako vylúčiť produkty prírody, napríklad prirodzene sa vyskytujúce mutantné formy.

Určité formy sú definované spôsobom výroby. Napríklad v súvislosti s produktom, vyrobeným určitým spôsobom, zahŕňa tento spôsob použitie rekombinantných techník pre nukleové kyseliny, napríklad ľudský zásah do nukleotidovej sekvencie, väčšinou výber alebo výrobu.

Predkladaný vynález kyseliny, ktoré obsahujú tických oligonukleotidov movaním buniek vektorom, teda obsahuje napríklad nukleové sekvencie, odvodené pomocou syntea produkty, pripravené transforktorý sa prirodzene nevyskytuje a ktorý kóduje tieto proteíny. Toto sa často robí preto, aby sa nahradil kodón u redundantného kodónu, ktorý kóduje rovnakú alebo konzervatívnu aminokyselinu, zatiaľ čo typicky sa to zabezpečuje začlenením alebo odstránením sekvenčného rozpoznávacieho miesta, napríklad pre reštrikčné enzýmy. Prípadne sa toto uskutočňuje preto, aby sa spojili úseky nukleových kyselín požadovaných funkcií s cieľom vytvoriť jediný genetický celok, ktorý obsahuje žiadúcu kombináciu funkcií, ktorú nie je možné nájsť v bežne dostupných prirodzených formách. Cieľom týchto doplnkových manipulácií sú často rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy, ale úpravou sa môžu začleniť ďalšie miestne špecifické ciele, napríklad promótory, replikačné miesta pre DNA, regulačné sekvencie, kontrolné sekvencie alebo ďalšie užitočné časti, napríklad segmenty priméru. Podobný prístup je určený pre rekombinantný, napríklad fúzny polypeptid. Špecificky sú zahrnuté syntetické nukleové kyseliny, ktoré v dôsledku redundancie genetického kódu, kódujú polypeptidy, podobné fragmentom týchto antigénov a fúzie sekvencii, ktoré pochádzajú z rôznych variantov rôznych druhov.

Rozpustnosť je vyjadrená sedimentáciou, meranou v jednotkách Svedberg, ktoré sú mierkou rýchlosti sedimentácie molekuly za konkrétnych podmienok. Stanovenie rýchlosti sedimentácie sa klasicky uskutočňuje v analytickej ultracentrifúge, ale teraz sa väčšinou uskutočňuje v

I štandardnej ultracentrifúge. Viď. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. vydanie) W. H. Freeman a Co., San Francisco, CA a Cantor a Schimmel (1980) Biophysical Chemistry časti 1 až 3, W. H. Freeman a Co., San Francisco, CA. Ako hrubé stanovenie je použitý postup, keď sa vzorka, ktorá obsahuje rozpustný polypeptid, odstredí v štandardnej ultracentrifúge pri asi 50000 rpm počas asi 10 min., pričom rozpustné molekuly budú zostávať v supernatante. Pre rozpustnú časticu alebo polypeptid budú hodnoty typicky menšie ako 30 S, väčšinou menšie ako asi 15 S, obvykle menšie ako asi 10 S, obvyklejšie menšie ako asi 6 S a v konkrétnych uskutočneniach výhodnejšie menšie ako asi 4 S a najvýhodnejšie menšie ako asi 3 S. Rozpustnosť polypeptidu alebo fragmentu závisí na prostredí a na polypeptide. Rozpustnosť polypeptidu zhoršuje veľa parametrov vrátane teploty, elektrolytického prostredia, veľkosti a molekulových charakteristík polypeptidu a povahy rozpúšťadla. Teplota, pri ktorej sa polypeptid používa, sa väčšinou pohybuje v rozsahu od 4 °C do 65 °C. Obvykle sa používa teplota vyššia ako asi 18 °C a obvyklejšie vyššia ako asi 22 °C. Na diagnostické účely bude teplota obvykle okolo teploty miestnosti alebo vyššia, ale bude nižšia ako denaturačná teplota jednotlivých súčastí stanovenia. Na terapeutické účely bude teplota obvykle rovnaká ako teplota tela, väčšinou okolo 37 °C pre ľudí, ale v určitých situáciách sa môže teplota zvýšiť alebo znížiť in situ alebo in vitro.

Veľkosť a štruktúra polypeptidu by vo všeobecnosti mala byť rovnaká ako štruktúra v takmer stabilnom fyziologicky aktívnom stave a obvykle nie v denaturovanom stave. Polypeptid sa môže spojiť napríklad z dôvodu rozpustnosti s ďalšími polypeptidmi za vzniku kvartérnej štruktúry alebo sa môže spojiť s lipidmi alebo detergentami, čim sa priblíži charakter interakcií, ktoré existujú v prirodzenej lipidovej dvojvrstve.

Rozpúšťadlo bude obvykle biologicky prijateľný pufor takého typu, ktorý sa používa na ochranu biologických aktivít a bude obvykle podobný fyziologickému roztoku. Rozpúšťadlo bude mať obvykle neutrálne pH, väčšinou medzi 5 až 10 a f výhodnejšie asi 7,5. V niektorých prípadoch sa pridá detergent, väčšinou buď slabý nedenatuijujúci detergent, napríklad CHS (cholesterylhemisukcinát) alebo CHAPS (3—([3— cholamidopropyl]dimetylamónio)-1-propánsulfonát) alebo v dostatočne nízkej koncentrácii detergentu. Toto je nevyhnutné preto, aby sa zabránilo významnému narušeniu štrukturálnych alebo fyziologických vlastností proteínu.

Takmer čistý väčšinou znamená to, že proteín je izolovaný od ostatných kontaminujúcich proteínov, nukleových kyselín alebo ďalších biologických materiálov, ktoré pochádzajú z organizmu, ktorý bol pôvodným zdrojom. Čistota alebo izolácia sa môže stanoviť štandardnými spôsobmi, väčšinou na základe veľkosti a bežne sa bude pohybovať okolo aspoň 50 %, bežnejšie aspoň asi 60 %, vo všeobecnosti aspoň asi 70 %, všeobecnejšie aspoň asi 80 %, často aspoň asi 85 %, častejšie aspoň asi 90 %, výhodnejšie aspoň asi 95 %, najvýhodnejšie aspoň asi 98 % a vo väčšine uprednostňovaných uskutočnení bude čistota aspoň 99 %. Často sa pridávajú nosiče alebo pomocné látky alebo formulácia môže byť sterilná alebo môže obsahovať zložky pufra.

Podstatná podobnosť sekvencii nukleových kyselín v súvislosti s ich porovnávaním znamená, že buď úseky alebo ich komplementárne vlákna, ak sa porovnávajú a v prípade, že sú optimálne porovnané, so zodpovedajúcimi nukleotidovými inzerciami a deléciami, majú identických aspoň asi 50 % nukleotidov, , vo všeobecnosti aspoň 56 %, všeobecnejšie aspoň 59 %, bežne aspoň 62 %, bežnejšie aspoň 65 %, často aspoň 68 %, častejšie aspoň 71 %, typicky aspoň 74 %, väčšinou aspoň 77 %, obvykle aspoň 80 %, obvyklejšie aspoň asi 85 %, výhodnejšie aspoň asi 90 %, najvýhodnejšie aspoň asi 95 až 98 % alebo viac a v konkrétnych uskutočneneniach viac ako asi 99 % nukleotidov.

Podstatná podobnosť existuje tiež selektívnych hybridizačných podmienok reťazcom alebo jeho sekvencie, odvodenej zodpovedajúcich častí za väčšinou

ID č.: 1

Selektívna ak je tu s použitím 7 alebo kômplementom, od väčšinou bude vyskytovať podobnosť v reťazci aspoň asi 65 % podobnosť v reťazci aspoň výhodnejšie aspoň asi 75 % podobnosť a asi 90 % podobnosť v reťazci asi 20 nukleotidov.

(1984) Nuc. Acids Res. 12: 203 až 213. porovnáva podobnosť, ako je určitých uskutočneniach bude nukleotidov, obvykle aspoň aspoň asi 24 nukleotidov, väčšinou aspoň asi 40 nukleotidov, výhodnejšie aspoň asi nukleotidov a najvýhodnejšie aspoň asi nukleotidov. Mierka na porovnanie DCMP1 DCMP2 uskutočnenie.

SEQ a 9·.

vtedy, asi 30 nukleotidpv, reťazci v prípade, že budú hybridizovať úseky s alebo hybridizácia sa aspoň asi 55 % výhodne aspoň asi 25 nukleotidov, najvýhodnejšie aspoň Viď. Kanehisa

Dĺžka reťazca, kde môže byť dlhšia a reťazca aspoň asi nukleotidov, sa v

opísané, v rámci asi 20 nukleotidov, obvyklejšie typicky aspoň asi 28 nukleotidov, 50 alebo viac mierke pre až 100 nezodpovedá podmienky, v

Prísne regulované (stringentné) sa k homológii alebo podstatnej podobnosti vzťahujúce súvislosti s hybridizáciou, budú prísne regulované kombinované podmienky, ktoré zahŕňajú soľ, teplotu, organické rozpúšťadlá a ostatné parametre, väčšinou tie, ktoré sú v hybridizačných reakciách kontrolované. Kombinácia parametrov je dôležitejšia ako akýkoľvek jednotlivý parameter. Viď. napríklad Wetmur a Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349 až 370. Próba nukleovej kyseliny, ktorá sa za prísne regulovaných podmienok viaže na cieľovú nukleovú kyselinu, je pre uvedenú cieľovú nukleovú kyselinu špecifická. Táto próba je väčšinou dlhšia ako 11 nukleotidov a je v oblasti, špecifikovanej sekvenciou próby, dostatočne komplementárna k cieľovej nukleovej kyseline alebo je s ňou identická, čo je potrebné preto, aby sa cieľ za presných hybridizačných podmienok naviazal.

Náprotivkové DCMP proteíny z iných cicavčích druhov sa môžu klonovať a izolovať medzidruhovou hybridizáciou veľmi podobných druhov. Viď. napríklad nižšie. Pretože podobnosť medzi vzdialene príbuznými druhmi môže byť relatívne nízka, je hybridizácia relatívne veľmi blízkych druhov účelná. Príprava preparátu protilátky, ktorý vykazuje nižšiu špecifitu voči druhu, môže byť užitočná pri expresii pri klonovaní.

Fráza špecificky sa .viaže na protilátku alebo špecificky imunoreaktívny s znamená, v prípade, že ide o proteín alebo peptid, väzbovú reakciu, ktojľá bližšie určuje prítomnosť proteínu v prítomnosti heterogénnej populácie proteínov a ďalších biologických látok. Za podmienok, ktoré sú dané pre určité imunostanovenia, sa teda špecifikované protilátky viažu na konkrétny proteín, zatiaľ čo na iné proteíny vo vzorke sa žiadnym spôsobom podstatne neviažu. Špecifická väzba na protilátku za týchto podmienok vyžaduje takú protilátku, ktorá vykazuje špecifitu voči konkrétnemu proteínu. Napríklad sa môžu vybrať protilátky, pripravené proti imunogénu, ktorým je ľudský DCMP1 proteín s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID č.: 2 alebo 8 preto, aby sa získali protilátky, špecificky imunoreaktívne s týmto DCMP proteínom a nie s inými proteinmi. Tieto protilátky rozpoznajú proteíny, ktoré vykazujú vysokú podobnosť s homológnym ľudským DCMP1 proteínom.

III. Nukleové kyseliny

Tieto gény pre DCMP sa selektívne exprimujú na dendritických bunkách. Uprednostňované uskutočnenia, ako sú odhalené, budú užitočné v štandardných postupoch na izoláciu génov z ďalších druhov, napríklad teplokrvných zvierat ako sú vtáci a cicavce. Krížová hybridizácia umožňuje izoláciu podobných proteínov z rôznych jedincov, kmeňov alebo druhov. Je dostupný rad rôznych prístupov, ako úspešne izolovať vhodný kloň nukleovej kyseliny, ktoré sú založené na tu poskytnutých informáciách. Štúdie, ktoré vychádzajú z hybridizácie pomocou Southern blotu, by za vhodných hybridizačných podmienok mali identifikovať homológne gény v ďalších druhoch.

Purifikovaný proteín alebo definované peptidy sú užitočné na vytvorenie protilátok štandardnými opísané nižšie. Aby boli vytvorené monoklonálne protilátky, môžu sa spôsobmi, ktoré sú polyklonálne alebo imunitnému systému prezentovať syntetické peptidy alebo purifikovaný proteín.

Viď. napríklad Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY a Harlow a Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, ktoré sú tu začlenené ako odkaz. DCMP antigénový väzbový prostriedok môže byť tiež užitočný ako špecifické väzbové činidlo a výhodou môže byť špecifita jeho väzby napríklad pri^ purifikácii DCMP proteinu.

Špecifický väzbový testovanie expresnej ktorá exprimuje spôsobov povrchovo techniky prostriedok knižnice, príslušný DCMP testovania, napríklad exprimovaného ligandu (panning). Tiež sa expresie postupov.

môže použiť na línie buniek, dostupný rad detegovanie afinitnej testovanie alebo môžu ktoré

Je sa vytvorenej proteín.

štandardné alebo pomocou môže uskutočniť intracelulárnej expresie pomocou rôznych detekčných imunofluorescenčných postupov. Väzbové prostriedky sa použiť na afinitnú purifikáciu alebo vytriedenie buniek, exprimujú antigén.

Zoradenie primátových, napríklad ľudských členov lektín/ASGPR

Tabuľka 1 rodiny. ASGPRhl a ASGPRh2 sú pečeňové azialoglykoproteínové receptory (viď. SEQ ID č.: 5a 6); ASGPRm je ASGPR, odvodený z makrofágu; DCMP2 má krátku, dlhú a variantnú formu, SEQ ID č.:

a 10; DCMP1 je uvedený v SEQ ID č.: 2 a 8.

ASGPRhl ΜΓΚΕ. . YQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGP................RLLLLSLG

ASGPRh2 MAKD. . FQDIQQLSSEENDHP. FHQGPPPAQPLAQRLCSMV................CFSLLALS

ASGPRm MTRT.. YENFQYLENKVKVQG. FKNGPLPLQSLLQRLRSGP................ηττ.τ.τ^τζΐ

DCMP2 6 MTRT. . YENFQYLENKVKVQG. FKNGPLPLQSLLQRLRSGP................CWT.T.T.SLG

DCMP21 MTRT. . YENFQYLENKVKVQG. FKNGPLPLQSLLQRLRSGP................CHLLLSLG

DCMP2 v MTRT. . YENFQYLENKVKVQG . FKNGPLPLQS.................................

DCMP1 MTSEITYAEVR...........FKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFF feature +++++

ASGPRhl LSLLLLVWCVIGS. QNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLE. ASGPRh2 FNTLLLWTCVTGS. QSAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLE. ASGPRm LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG DCMP2S LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG DCMP21 LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDĽVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG DCMP2v . . LLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG

DCMP1 LLLAISFFIAFVIFFQKYS . Q. . LLEKKTT. KELVHTTLE.... CVKKNMPVEETAWS.......

feature ++++++++

ASGPRhl ASGPRh2 ASGPRm DCMP2s DCMP21 DCMP2V DCMP1 feature . KQQK.........................DLSEDHSSĽLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGS . KQQQ.........................DLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGS FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGE FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKJCLTCQVATLNNN. . FKQERQAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN. . FKQERQA........................ . . VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGE

ASGPRhl ER. . . .TCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVWTSWEEQKFVQHHIGPVNT

ASGPRh2 QR. . . .TCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLWINSWEEQKFIVQHTNPFNT ASGPRm EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT DCMP2 s . ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT DCMP21 . ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNF'VQKYLGSAYT

DCMP2v EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHĽWINSREEQNFVQKYLGSAYT DCMP1 .......CCPKNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVTNTQEEQDFIFQNLQEESA feature

ASGPRhl

ASGPRh2 ASGPRm DCMP26 DCMP21 DCMP2v

DCMP1 feature

W.MGLHDQNGP. .WKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCA. .HFTDDGR. . .WNDD W. IGLTDSDGS . . WKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCV. .EVQPDGR. . .WNDD W.MGLSDPEGA. . WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD W.MGLSDPEGA. . WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDNWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD W . MGLSDPEGA. . WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. . HFHPDGR. . . WNDD YFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSD.......PNERCWLNFRKSPKRWGWNDV ................................XXX..............................

ASGPRhl VCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

ASGPRh2 FCLQVYRWVCEKRRNATGE . . . VA ASGPRm VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH

DCMP26 VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH

DCMP21 VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH

DCMP2v VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH

DCMP1 NCLGPQRSVCEMMKIH.......L feature ......................

Znaky: *** internalizačná doména (doména EITYAEV je videná v

NK receptore NKA) ; +++ transmembránová doména; ...lektínová doména C-typu; XXX doména, špecifická pre sacharid. DCMP1 receptor je čo sa týka homológie najpodobnejší makrofágovému lektínu v lektinovej doméne.

Sekvenčné analýzy naznačujú, že tieto DCMP sú členmi lektin/azialoglykoproteinovej superrodiny receptorov. Peptidové úseky sa tiež môžu použiť na navrhovanie a prípravu prítomnosť polymorfného Genetický kód zodpovedajúcich oligonukleotidov cielom stanoviť identického alebo identifikovať DC.

zodpovedajúcich oligonukleotidov, próby pri testovaní. V kombinácii reťazovej reakcie (PCR) sa môžu využiť pri výbere požadovaných klonov z knižnice.

knižnice s napríklad s cielom na výber ako génu, alebo použiť môžu použiť na testovanie podobného variantu sa môže ktoré sa s technikami polymerázovej syntetické oligonukleotidy

Ako próby alebo priméry sa tiež použijú komplementárne sekvencie. Na základe identifikácie pravdepodobného aminokonca by mali byť konkrétne užitočné ďalšie peptidy, napríklad spojené so zakotveným vektorom alebo komplementárne PCR techniky s poly-A alebo spolu s komplementárnou DNA iných peptidov.

Techniky na manipuláciu nukleových kyselín v génoch, kódujúcich tieto DC proteiny, napríklad subklonovanie sekvencií nukleových kyselín, kódujúcich polypeptidy, do expresných vektorov, značenie prób, DNA hybridizácia a pod., sú vo všeobecnosti opísané v Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2. vydanie) zv. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, ktorý je tu začlenený ako odkaz a ďalej je uvádzaný ako Sambrook a kol.. Viď. tiež Coligan a kol. (1987 a periodické doplnky) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York, NY, ďalej uvádzané ako Coligan a kol..

Existujú rôzne spôsoby izolácie DNA sekvencií, kódujúcich · tieto DC proteiny. Napríklad DNA je z genómovej alebo cDNA knižnice izolovaná pomocou značených oligonukleotidových prób, ktoré majú sekvencie identické so sekvenciami, ktoré sú tu uvedené alebo sú k nim komplementárne. Môžu sa použiť celé próby alebo sa môžu oligonukleotidové próby vytvoriť na základe porovnania opísaných sekvencií s inými proteínmi a pomocou výberu špecifických primérov.

Tieto próby sa môžu použiť priamo v hybridizačných stanoveniach pri izolácii DNA, kódujúcej DC proteíny alebo sa môžu navrhnúť próby na použitie v amplifikačných technikách ako je PCR.

Na prípravu cDNA knižnice sa z buniek, ktoré exprimujú DC proteín, izoluje mRNA. cDNA sa pripraví z mRNA a liguje sa do rekombinantného vektora. Vektor je transfektovaný do rekombinantného hostiteľa, aby mohlo prebehnúť rozmnoženie, výber a klonovanie. Spôsoby prípravy a testovanie cDNA knižníc sú veľmi dobre známe. Viď. Gubler a Hoffman (1983) Gene 25: 263 až 269; Sambrook a kol. alebo Coligan a kol.

Pre genomickú knižnicu sa môže DNA extrahovať z tkaniva a buď mechanicky nastrihať alebo enzýmovo naštiepiť na fragmenty s veľkosťou 12 až 20 kb. Fragmenty sa potom separujú gradientovým odstredenim a klonujú sa v bakteriofágu λ. Tieto vektory a fágy sa zbalia in vitro, ako je opísané napríklad v Sambrook a kol. alebo Coligan,’ a kol. Rekombinantné fágy sa analyzujú hybridizáciou plakov ako je opísané v Benton a Davis (1977) Science 196: 180 až 182. Hybridizácia kolónii sa uskutočňuje vo všeobecnosti opísaným postupom podľa napríklad Grunstein a kol. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961 až 3965.

DNA, kódujúca DC proteín, sa môže identifikovať buď v knižniciach cDNA alebo v genómových knižniciach a to vďaka svojej schopnosti hybridizovať s próbami nukleových kyselín, ktoré sú tu opísané, napríklad pri hybridizácii kolónií alebo plakov. Zodpovedajúce oblasti DNA sa izolujú štandardnými postupmi, ktoré sú dôverne známe odborníkom v danej oblasti techniky. Viď. Sambrook a kol.

Na prípravu DNA, kódujúcej DC proteíny, sa môžu tiež použiť rôzne spôsoby amplifikácie cieľových sekvencií ako je polymerázová reťazová reakcia. Technológia polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sa používa na amplifikáciu sekvencií nukleových kyselín priamo z mRNA, z cDNA a z genomických alebo cDNA knižníc. Izolované sekvencie, kódujúce DC proteíny, sa môžu tiež použiť ako templáty na amplifikáciu PCR.

Pri PCR sa syntetizujú oligonukleotidové priméry, komplementárne k dvom 5' oblastiam v oblasti DNA, ktorá sa má amplifikovať. Polymerázová reťazová reakcia sa potom uskutoční pomocou dvoch primérov. Viď. Innis a kol (1990) PCR Protokols: Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA. Priméry sa môžu vybrať buď na amplifikáciu celých oblastí, kódujúcich celý vybraný DC proteín alebo na amplifikáciu menších požadovaných úsekov DNA. Akonáhle sa tieto oblasti amplifikujú, môžu sa sekvencovať a zo sekvencii, získaných štandardnými technikami, sa môžu pripraviť oligonukleotidové próby. Tieto próby sa môžu použiť na izoláciu DNA, kódujúcich iné formy DC proteínov.

Oligonukleotidy, určené na používanie ako próby, sú chemicky syntetizované na tuhej fáze, pomocou triesteru fosforamiditu. Tento postup bol prvý krát opísaný autormi Beaucage a Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22 (20) : 1859 až 1862. Syntéza môže prebiehať pomocou automatického zariadenia, ako je opísané v Needham-VanDevanter a kol. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159 až 6168. Oligonukleotidy sa purifikujú napríklad natívnou elektroforézoy v akrylamidovom géli alebo aniónovou HPLC chromatografiou, opísanou v Pearson a Regnier (1983) J. Chróm. 255: 137 až 149. Sekvencia syntetického oligonukleotidu sa môže overiť chemickým degradačným spôsobom podľa Maxama a Gilberta, uvedeným v Grossman a Moldave (1980) Methods in Enzymology 65: 499 až 560 Academic Press, New York.

Tento vynález poskytuje izolovanú DNA alebo fragmenty, kódujúce DC proteín. Ďalej vynález poskytuje izolovanú alebo rekombinantnú DNA, ktorá kóduje biologicky aktívny proteín alebo polypeptid, ktorý je schopný za zodpovedajúcich podmienok, napríklad prísne regulovaných, hybridizovať s tu opísanými sekvenciami DNA. Uvedený biologicky aktívny proteín alebo polypeptid môže byť prirodzene sa vyskytujúca forma alebo rekombinantný proteín alebo fragment a má takú aminokyselinovú sekvenciu ako je odhalená v SEQ ID č. : 2, 4, 8 alebo 10. Uprednostňované uskutočnenia môžu byť celé prirodzené izoláty, napríklad z primáta. V glykozylovanej forme by mali mať proteíny väčšiu veľkosť. Ďalej tento vynález zahŕňa použitie izolovanej alebo rekombinantnej DNA alebo ich fragmentov, ktoré kódujú proteíny, ktoré sú homológne s každým príslušným DC proteínom. Izolovaná DNA môže mať príslušné regulačné sekvencie na 5' a 3' presahujúcich koncoch, napríklad promótory, zosilňujúce sekvencie, poly-A prídavné signály a ďalšie.

IV. Príprava produktov génov DC

DNA, ktoré kódujú tieto DC proteíny alebo ich fragmenty, sa môžu získať chemickou syntézou, testovaním cDNA knižníc alebo testovaním genomických knižníc, pripravených z rôznych línií buniek alebo vzoriek tkanív.

Tieto DNA sa môžu exprimovať v rade rôznych hostiteľských buniek, keď dochádza k syntéze celého proteínu alebo fragmentov, ktoré sa môžu použiť napríklad na vytvorenie polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok, na väzbové štúdie, na konštrukciu a expresiu modifikovaných molekúl a na štúdie štruktúry/funkcie. Každý z týchto DC proteínov alebo ich fragmentov sa môže exprimovať v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované alebo transfektované zodpovedajúcimi expresnými vektormi. Tieto molekuly sa môžu purifikovať tak, že neobsahujú takmer žiadne iné proteíny alebo bunkové kontaminanty, ako ktoré pochádzajú z rekombinantného hostiteľa a preto sú, v prípade, že sú kombinované s farmaceutický prijateľným nosičom a/alebo riedidlom, konkrétne užitočné vo farmaceutických prostriedkoch. Antigén alebo jeho časti sa môžu exprimovať ako fúzie s inými proteínmi.

Expresné vektory sú väčšinou samoreplikujúce DNA alebo

RNA konštrukty, ktoré obsahujú žiadúci DC gén alebo jeho fragmenty, obvykle vhodne napojené na vhodné genetické kontrolné prvky, ktoré sú rozpoznávané vo vhodnej hostiteľskej bunke. Tieto kontrolné prvky sú schopné ovplyvňovať expresiu v hostiteľskej bunke. Špecifický typ kontrolných prvkov, nevyhnutný na ovplyvnenie expresie, bude závisieť na prípadnej použitej hostiteľskej bunke. Vo všeobecnosti môžu genetické kontrolné prvky zahŕňať prokaryotický promótorový systém alebo eukaryotický promótorový expresný regulačný systém a väčšinou zahŕňajú transkripčný promótor, príležitostný operátor na reguláciu zahájenia transkripcie, prvky zvyšujúce transkriciu s cieľom zvýšenia expresie mRNA, sekvencie, kódujúce vhodné ribozomálne väzbové miesto a sekvencie, ktoré ukončujú transkripciu a transláciu. Obvyklé expresné vektory tiež obsahujú počiatok replikácie, čo umožňuje replikáciu vektora nezávisle na hostiteľskej bunke.

Vektory podľa predkladaného vynálezu obsahujú DNA, ktoré kódujú rôzne DC proteiny alebo ich fragmenty, väčšinou kódujúce napríklad biologicky aktívny polypeptid alebo proteín. DNA môže byť kontrolovaná vírusovým promótorom a môže kódovať selekčnú značku. Predkladaný vynález sa ďalej zaoberá použitím tých expresných vektorov, ktoré sú schopné exprimovať eukaryotickú cDNA, kódujúcu DC proteín, v prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke, kde je vektor zlučiteľný s hostiteľom a kde je eukaryotická cDNA, kódujúca proteín, inzerovaná do vektora tak, že počas rastu hostiteľa, ktorý obsahuje vektor, dochádza k expresii uvedenej cDNA. Expresné vektory sú obvykle určené na stabilnú replikáciu vo svojich hostiteľských bunkách alebo na amplifikáciu, aby bol zvýšený j celkový počet kópií žiadúceho génu, pripadajúci na jednu bunku. Vždy nie je nevyhnutné požadovať, aby sa expresný vektor replikoval v hostiteľskej bunke, napríklad je možné pomocou vektorov, ktoré neobsahujú počiatok replikácie, ktorý je rozpoznaný hostiteľskou bunkou, ovplyvniť prechodnú expresiu proteínu alebo jeho fragmentov v rôznych hostiteľoch. Je tiež možné použiť vektory, ktoré rekombináciou spôsobujú intergráciu DC génu alebo jeho fragmentov do hostiteľskej DNA alebo je možné integrovať promótor, ktorý kontroluje expresiu endogénneho génu.

Vektory, ktoré sú tu použité, zahŕňajú plazmidy, vírusy, bakteriofágy, začleniteľné DNA fragmenty a iné pomocné látky, ktoré umožňujú integráciu DNA fragmentov do genómu hostiteľa. Expresné vektory sú špecializované vektory, ktoré obsahujú genetické kontrolné prvky, ktoré ovplyvňujú expresiu pripojených génov. Plazmidy sú najbežnejšie používanou formou vektora, ale je možné použiť všetky ostatné formy vektorov, ktoré majú ekvivalentnú funkciu. Viď. napríklad Pouwels a kol. (1985 a doplnky) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, NY a Rodriquez a kol. (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Medzi vhodné hostiteľské bunky patria prokaryotá, nižšie eukaryotá a vyššie eukaryotá. Prokaryotá zahŕňajú gramnegativne aj grampozitívne organizmy, napríklad E. coli a B. subtilis. Nižšie eukaryotá zahŕňajú kvasinky, napríklad S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyššie eukaryotá zahŕňajú určité línie buniek tkanivových kultúr, ktoré pochádzajú zo zvieracích buniek a to iných ako cicavčích, napríklad hmyzích a vtáčích, a cicavčích buniek, napríklad ľudských, primátových a buniek hlodavcov.

Prokaryotické systémy hostiteľ-vektor zahŕňajú široké spektrum vektorov pre veľa rôznych druhov. Na začlenenie ekvivalentných vektorov, použitých v iných prokaryotách, sa vo všeobecnosti používajú E. coli a jej vektory. Reprezentatívny vektor na amplifikáciu DNA je. pBR322 alebo vektory od neho odvodené. Medzi vektory, ktoré sa môžu použiť, ale nie je to obmedzené len na ne, na expresiu DC proteínoy alebo fragmentov patria také vektory, ktoré obsahujú lac promótor (pUC-série); trp promótor (pBR322-trp); Ipp promótor (pIN-série); lambda-pP alebo pR promótory (pOTS) alebo hybridné promótory ako je ptac (pDR540). Viď. Brosius a kol. (1988) Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac- a Ipp-derived Promoters v Rodriquez a Denhardt Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10: 205 až 236 Buttersworth, Boston, MA.

Nižšie eukaryotá, napríklad kvasinky a Dictyostelium môžu byť transformované vektormi, ktoré obsahujú sekvenciu DC génu.

Na účely predkladaného vynálezu je najbežnejším nižším eukaryotickým hostiteľom pekárska kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Tá sa môže vo všeobecnosti použiť ako reprezentant nižších eukaryot, aj keď je dostupný rad ďalších druhov a kmeňov. Kvasinkové vektory sa väčšinou skladajú z počiatku replikácie (okrem integračného typu), selekčného génu, promótora, DNA, kódujúcej žiadúci proteín alebo jeho fragmenty a sekvencie na ukončenie translácie, na polyadenyláciu a na ukončenie transkripcie. Medzi expresné vektory, vhodné pre kvasinky, patria také konštitutívne promótory ako je 3-fosfoglycerátkináza a rôzne ďalšie promótory génu pre glykolytické enzýmy alebo také indukovateľné promótory ako je promótor alkoholdehydrogenázy 2 alebo metalotionínový promótor. Vhodné vektory zahŕňajú deriváty nasledujúcich typov: samoreplikujúce, ktoré poskytujú nízky počet kópií (ako je Yrp-séria), samoreplikujúce, ktoré poskytujú vysoký počet kópií (ako je Yep-séria), integračné typy (ako je Ylp-séria) alebo mini-chromozómy (ako je YCp-séria).

Bunky tkanivových kultúr vyšších eukaryot sú uprednostňované hostiteľské bunky na expresiu DC proteínu. V podstate je možné povedať, že sa môže použiť väčšina buniek tkanivových kultúr vyšších eukaryot, či už pochádzajú zo stavovcov alebo bezstavovcov, napríklad expresný systém hmyzieho bakulovírusu. Avšak na dosiahnutie vlastného kotranslačného aj posttranslačného spracovania sa uprednostňujú cicavčie bunky. Transformácia alebo transfekcia a rozmnožovanie týchto buniek je rutinná záležitosť. Medzi i

užitočné línie buniek patria HeLa bunky, línie ovariálnych buniek čínskeho škrečka (CHO), línie buniek obličiek mladého potkana (BRK), línie hmyzích buniek, línie vtáčích buniek a línie opičích buniek (COS). Expresné vektory pre tieto bunkové línie obvykle zahŕňajú počiatok replikácie, promótor, miesto na zahájenie translácie, miesta na zostrih RNA (napríklad keď sa použije genomická DNA), polyadenylačné miesto a miesto na ukončenie transkripcie. Tieto vektory môžu tiež obsahovať selekčný alebo amplifikačný gén. Vhodnými expresnými vektormi môžu byť plazmidy, vírusy alebo retrovírusy, ktoré nesú promótory, pochádzajúce zo zdrojov ako je adenovírus, SV40, parvovírus, vírus kravských kiahní alebo cytomegalovírus.

Reprezentatívne príklady vhodných expresných vektorov sú pCDNAl, pCD viď. Okayama a kol. (1985) Mol. Celí Biol. 5: 1136 až 1142, pMClneo alebo Poly-A, viď. Thomas a kol. (1987) Celí

51: 503 až 512 a bakulovírusový vektor ako je pAC373 alebo pAC610.

V určitých prípadoch nie je potrebné, aby boli DC proteíny glykozylované, aby bola počas určitých meraní vyvolaná biologická odozva. Avšak často je žiadúce exprimovať DC polypeptid v systéme, ktorý poskytuje špecifický alebo definovaný profil glykozylácie. V tomto prípade bude obvyklý profil taký, ako je prirodzene poskytovaný expresným systémom. Profil je však možné modifikovať prostredníctvom vystavenia polypeptidu, napríklad v neglykozylovanej forme, zodpovedajúcim glykozylačným proteínom, ktoré sú súčasťou heterológneho expresného systému. Napríklad DC gén sa môže transformovať spoločne s jedným alebo viacerými génmi, ktoré kódujú cicavčie alebo iné glykozylačné enzýmy. Ďalej je známe, že veľký stupeň glykozylácie môže byť škodlivý pre biologickú aktivitu DC proteínu a je možné uskutočniť rutinné testovanie a tým optimalizovať taký stupeň glykozylácie, ktorý udeľuje proteínu optimálnu biologickú aktivitu.

DC proteín alebo jeho fragment môže byť skonštruovaný tak, že fosfatidylinozitol (PI) je viazaný na bunkovú membránu, ale je možné ho z membrán odstrániť pôsobením enzýmu, ktorý štiepi fosfatidylinozitol, napríklad fosfatidylinozitolfosfolipáza C. Tá uvoľňuje antigén v biologicky t aktívnej forme a umožňuje purifikáciu postupmi, ktoré sú v proteínovej chémii štandardne používané. Viď. napríklad Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988: 427 až 454; Tse a kol.

(1985) Science 230: 1003 až 1008; Brunner a kol. (1991) J.

Celí Biol. 114: 1275 až 1283 a Coligan a kol. (1996 a periodické doplnky) Current Protocols in Proteín Science John Wiley & Sons, New York, NY.

Teraz, keď boli tieto DC proteíny charakterizované, môžu sa bežnými postupmi na syntézu peptidov pripraviť ich fragmenty alebo deriváty. Toto zahŕňa postupy, opísané v Stewart a Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, IL; Bodanszky a Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY a Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer

Verlag, New York, NY. Viď. tiež Merrifield (1986) Science 232: 341 až 347 a Dawson a kol. (1994) Science 266: 776 až 779. Môže sa použiť napríklad azidový postup, postup, ktorý používa kyslý chlorid, postup, ktorý používa kyslý anhydrid, kombinovaný anhydridový postup, postup, ktorý používa aktívny ester (napríklad p-nitrofenylester, ester N-hydroxysukcínimidu alebo kyanometylester), karbodiimidazolový postup, oxidačnoredukčný postup alebo postup, ktorý používa systém dicyklohexylkarbodiimid (DCCD)/aditívum. Vyššie uvedené postupy sa môžu aplikovať na báze tuhej aj kvapalnej. Pripravený proteín a jeho fragmenty sa môžu z reakčnej zmesi izolovať a purifikovať spôsobmi, používanými na separáciu peptidov, napríklad extrakciou, precipitáciou, elektroforézou a rôznymi formami chromatografií a podobne. Získané DC proteíny podlá predkladaného vynálezu môžu mať rôzny stupeň čistoty, ktorý je daný požadovaným použitím. Purifikácia sa môže doplniť známymi technikami na purifikáciu proteínov alebo použitím tu opísaných protilátok alebo väzbových partnerov, napríklad v imunoabsorbčnej afinitnej chromatografii. Pri imunoabsorbčnej afinitnej chromatografii je najskôr naviazaná protilátka na tuhý nosič, nasleduje kontakt naviazaných protilátok s rozpusteným lyzáťom vhodných buniek, s lyzátmi iných buniek, ktoré exprimujú proteín alebo s lyzátmi alebo supernatantami buniek, ktoré produkujú áko výsledok DNA techník proteín, viď. nižšie.

U mnohopočetných bunkových línii sa testovalo, ktorá z nich v porovnaní s ostatnými bunkami exprimuje uvedený proteín vo vysokých hladinách. Testujú sa rôzne bunkové línie, napríklad línie stromatických buniek myšieho týmusu TA4, a vyberie sa taká, ktorá je najvhodnejšia z dôvodu dobrých manipulačných vlastností. Prirodzené proteíny DC buniek sa môžu izolovať z prirodzených zdrojov alebo sa môžu získať expresiou z bunky, transformovanej vhodným expresným vektorom. Exprimovaný proteín sa purifikuje štandardnými postupmi alebo tieto postupy sa môžu kombinovať s upravenými postupmi a to preto, aby bola purifikácia z bunkových lyzátov alebo supernatantov účinnejšia. Na túto purifikáciu sa môžu použiť FLAG alebo HiS6 úseky.

V. Protilátky

Protilátky sa môžu pripraviť proti rôznym DC proteínom vrátane individuálnych, polymorfných, alelických, kmeňových alebo druhových variantov a proti ich fragmentom, ktoré sú vo svojich prirodzene sa vyskytujúcich formách (celá dĺžka) alebo v rekombinantných formách. Protilátky sa môžu tiež pripraviť proti aktívnej alebo inaktivnej forme DC proteínu. Tiež sa môžu použiť anti-idiotypické protilátky.

a. Výroba protilátok

Na výrobu protilátok, špecificky reagujúcich s týmito DC proteinmi, sa môže použiť rad imunogénov. Na výrobu monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok je uprednostňovaným imunogénom rekombinantný proteín. Tiež sa môže použiť prirodzene sa vyskytujúci proteín v čistej alebo nie úplne čistej forme. Na výrobu protilátok proti DC proteínom sa môžu ako imunogén použiť syntetické peptidy, pripravené pomocou tu opísaných sekvencii ludského DC proteínu. Rekombinantný proteín sa môže exprimovať v tu opísaných eukaryotických alebo prokaryotických bunkách a môže sa purifikovať tu opísaným postupom. Produkt sa potom injekčné aplikuje zvieraťu, ktoré je schopné produkovať protilátky. Môžu sa vytvoriť buď monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, ktoré sa následne používajú pri imunochemickom meraní proteínu.

Spôsoby výroby polyklonálnych protilátok sú odborníkom v danej oblasti techniky známe. V stručnosti je možné povedať, že imunogén, výhodnejšie purifikovaný proteín, je zmiešaný s adjuvans a touto zmesou sú imunizované zvieratá. Imunitná odpoveď zvieraťa na preparát imunogénu je monitorovaná v odobratých vzorkách krvi a stanovuje sa titer reaktivity voči sledovanému DC proteínu. V okamihu, keď sa získajú vhodne vysoké protilátky proti imunogénu, zviera sa nechá vykrvácať a pripravia sa antiséra. Ak je to potrebné, uskutoční sa ďalšia frakcionalizácia antiséra s cieľom zvýšiť koncentráciu protilátok, reaktívnych s proteínom. Viď. napríklad Harlow a Lane.

Monoklonálne protilátky sa môžu získať rôznymi technikami, ktoré odborníci v danej oblasti poznajú. Stručne, bunky zo sleziny zvierat, imunizovaných žiadúcim antigénom, sa urobia nesmrteľné, čo sa bežne uskutočňuje fúziou s myelomovými bunkami. Viď. napríklad Kohler a Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511 až 519, ktorý je začlenený ako odkaz. Metódy, ktoré sa môžu použiť namiesto fúzie s myelomovými bunkami, zahŕňajú transformáciu onkogénmi alebo retrovírusmi alebo oblasti buniek, afinity

Epstein iné spôsoby, vznikajú len z techniky. U kolónií, ktoré testuje prítomnosť protilátok žiadúcej antigénu. Výťažok monoklonálnych proti týmto bunkám sa sa k vyrobených vrátane aplikácie do perinoteálnej patria k stavovcom, ešte zvýšiť, monoklonálnu protilátku alebo jej tiež izolovať testovaním knižnice podľa všeobecného protokolu, ktorý (1989) Science 246: 1275 až 1281.

Barr vírusom, známe v danej nesmrteľných špecifity a protilátok, technikami ktoré kódujúca , sa môže B buniek

Huse a kol.

i môže rôznymi dutiny hostiteľov, Sekvencia DNA, väzbový fragment DNA z ľudských je načrtnutý v

Ak sú zvieratá imunizované konjugátmi, ktoré sú zložené z fragmentov a nosičových proteínov, ako je opísané vyššie, môžu sa vytvoriť protilátky, vrátane väzbových fragmentov a jednoreťazcových verzií, proti vopred stanoveným fragmentom i

týchto DC proteínov. Monoklonálne protilátky sú pripravené z buniek, ktoré vylučujú žiadúcu protilátku. U týchto protilátok sa môže testovať schopnosť viazať normálne alebo poškodené DC proteíny alebo sa môže testovať agonistická alebo antagonistická aktivita. Tieto monoklonálne protilátky sa obvykle viažu s K_D, ktorého hodnota je aspoň 1 mM, obvyklejšie aspoň asi 300 μΜ, typicky aspoň 10 μΜ, väčšinou aspoň asi 30 μΜ, výhodnejšie aspoň 10 μΜ a najvýhodnejšie aspoň asi 3 μΜ alebo lepšia.

V niektorých prípadoch je žiadúce pripraviť monoklonálne protilátky z rôznych cicavčích hostiteľov, ako sú myš, hlodavci, primáty, ľudia a pod. Opis techník prípravy týchto monoklonálnych protilátok je možné nájsť napríklad v Stites a kol. Basic and Clinical Immunology (4. vydanie) Lange Medical

Publications, Los Altos, CA a odkazoch, tam citovaných: Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2 vydanie) Academic Press, New York, NY a konkrétne v Kohler a Milstein (1975) Náture 256: 495 až 497, kde je diskutovaný jeden spôsob prípravy monoklonálnych protilátok. Stručne zhrnuté, tento spôsob spočíva v tom, že sa zvieraťu aplikuje imunogén, aby sa zahájila humorálna imunitná odpoveď. Potom ako sa zviera usmrtí, sa bunky, odobrané z jeho sleziny, fúzujú s myelomovými bunkami. Výsledkom je hybridná bunka alebo hybridom, ktorá je schopná sa reprodukovať in vitro. Z hybridómovej populácie sa potom izolujú jednotlivé klony, z ktorých každý vylučuje jediný typ protilátok proti imunogénu. V tomto prípade sú jednotlivé druhy získaných protilátok produkty nesmrteľných a klonovaných jednotlivých B buniek z imunizovaného zvieraťa, vytvorené ako odozva na špecifické miesto, rozpoznané imunitnou látkou.

Medzi ostatné vhodné techniky patria selekcia knižníc protilátok vo fágu alebo podobných vektoroch. Viď. napríklad Huse a kol. (1989) Generation of a Large Combinatiorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 1275 až 1281 a Ward a kol. (1989) Náture 341: 544 až 546. Polypeptidy a protilátky podľa predkladaného vynálezu, vrátane chimerických a poľudštených protilátok sa môžu použiť po predchádzajúcej modifikácii alebo bez nej. Polypeptidy a protilátky budú často značené a to tým, že budú kovalentne alebo nekovalentne spojené s látkou, ktorá poskytuje detegovateľný signál. Existuje veľa rôznych techník značenia a konjugácie a sú uvádzané vo vedeckej alebo patentovej literatúre. Medzi vhodné značky patria rádionukleotidy, enzýmy, substráty, kofaktory, inhibítory, fluorescenčné skupiny, chemiluminiscenčné skupiny, magnetické častice a pod. Patenty, ktoré slúžia ako návod ako tieto značky použiť, sú U. S. patent č. 381 837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 a 4366241. Môžu sa vyrábať tiež rekombinantné imunoglobulíny. Viď. Cabilly, U. S. Patent č. 4716567 a Queen a kol. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 až 10033.

Protilátky podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež použiť pri izolácii každého DC proteinu afinitnou chromatografiou. Môžu sa pripraviť kolóny, kde sú protilátky naviazané na tuhý nosič, napríklad častice ako sú agaróza, SEPHADEX a iné. Lyzát buniek prechádza kolónou, kolóna sa premyje a nasleduje aplikácia rastúcich koncentrácií slabého denaturačného činidla, v dôsledku čoho príde k uvoľneniu purifikovaného DC proteínu.

Protilátky sa môžu tiež použiť pri testovaní expresných knižníc na konkrétne produkty expresie. Protilátky, používané v tomto postupe, budú obvykle označené skupinou, ktorá umožňuje ľahkú detekciu väzby antigénu a protilátky.

Protilátky proti DC proteínom sa môžu použiť pri analýze alebo identifikácii špecifických súčastí bunkovej populácie, ktoré exprimujú príslušný protein. Na základe stanovenia produktov expresie buniek, ktoré exprimujú DC proteíny, je možné diagnostikovať ochorenia, napríklad stavy, keď je ohrozená imunita, keď sú vyčerpané DC alebo keď dochádza k nadmernej produkcii DC.

Protilátky, vytvorené proti každej DC, budú tiež užitočné pri príprave antiidiotypických protilátok. Tie budú užitočné pri detekcii alebo diagnostikovaní rôznych imunologických stavov, ktoré súvisia s expresióu príslušných antigénov.

b. Imunostanovenie

Konkrétny protein sa môže merať pomocou rôznych imunometód. Súhrn imunologických postupov a imunostanovenie je vo všeobecnosti uvedené v Stites a

Clinical Immunology (7. predkladaného vynálezu ktoromkoľvek usporiadaní, Enzýme Immunoassay CRC vydanie). sa môže

Terr (1991) Basic and

Imunostanovenie podľa realizovať v navyše zhrnuté

Maggio (1980) Florida; Tijan (1985) Practice and Theory of Enzýme Immunoassays Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Harlow a Lane

Science Publishers

B.

ktoré sú

Press, Boca Raton,

Amsterdam a publikácia je tu Immunoassay: A

Price a Newman

Stockton Press,

V-,

Antibodies, A Laboratory Manual, pričom každá začlenená ako odkaz. Viď. tiež Chán (1987)

Practical Guide Academic Press, Orlando, FL;

(1991) Principles and Practice of Immunoassays

NY a Ngo (1988) Non-isotopic Immunoassays Plénum Press, NY.

Imunostanovenie na meranie týchto DC proteínov sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi, ktoré sú odborníkom v danej oblasti techni'ky známe. V stručnosti, imunostanovenie, keď sa meria proteín, môže vychádzať zo stanovenia kompetitívnej alebo nekompetitivnej väzby. Pri stanovení kompetitívnej väzby súťaží analyzovaná vzorka so značeným analytom o špecifické väzbové miesta na zachytávačom činidle, ktoré je viazané na tuhom povrchu. Výhodnejšie je zachytávacie činidlo protilátka, ktorá špecificky reaguje s DC proteínom a ktorá je produkovaná vyššie opísaným postupom. Koncentrácia značeného analytu, viazaného na zachytávacie činidlo, je nepriamo úmerná množstvu voľného analytu vo vzorke.

Pri stanovení kompetitívnej väzby, súťaží DC proteín, prítomný vo vzorke, so značeným proteínom o väzbu na špecifické väzbové činidlo, napríklad protilátku, ktorá špecificky reaguje s DC proteínom. Väzbové činidlo môže byť viazané na tuhý povrch, aby sa zlepšila separácia viazaného značeného proteínu od nenaviazaného značeného proteínu. Stanovenie kompetitívnej väzby sa môže uskutočniť aj v kvapalnej fáze a na separáciu naviazaného a nenaviazaného značeného proteínu sa môže použiť akákoľvek technika, známa v danej oblasti techniky. Po separácii sa stanoví množstvo naviazaného značeného proteínu. Množstvo proteínu, prítomného vo vzorke, je nepriamo úmerné množstvu značeného naviazaného proteínu.

Príležitostne sa môže uskutočniť imunostanovenie,

V týchto imunostanoveniach naviazaním proteínu na Výsledkom tejto ktorý vysiela imunostanovenia homogénne keď nie je potrebné začleniť separačný krok.

nahradená zmeny je značka, umožňuje je značka na jeho špecifické zníženie alebo takže meranie detekciu proteíne väzbové činidlo.

signálu, i konci zvýšenie : značky na alebo kvantifikáciu proteínu.

Tieto DC proteíny sa môžu tiež kvantitatívne stanoviť .

rôznymi nekompetitívnymi imunometódami. Napríklad sa môže použiť obojstranné, sendvičové imunostanovenie, ktoré využíva tuhú fázu. V tomto type stanovenia je väzbové činidlo, ktoré viaže proteín, napríklad protilátka, zachytené na tuhý nosič. Druhé väzbové činidlo pre proteín, čo môže byť tiež protilátka, a ktoré sa viaže na proteín na inom mieste, je označené. Potom, ako príde k väzbe na obidve miesta proteínu, sa nenaviazané značené väzbové činidlo odstráni a meria sa množstvo značeného väzbového činidla, viazaného na tuhú fázu. Množstvo naviazaného značeného väzbového činidla je priamo úmerné množstvu proteínu vo vzorke.

Na stanovenie prítomnosti DC proteínu vo vzorke sa môže použiť Western blot. Uskutoční sa elektroforéza, napríklad vo vzorke tkaniva, kde je možné očakávať proteín. Po elektroforéze, keď príde k separácii proteínov a po prenose proteínov na vhodný tuhý nosič ako je nitrocelulózová membrána, sa tuhý nosič inkubuje s protilátkou, ktorá reaguje s denaturovaným proteínom. Táto protilátka sa môže označiť alebo môže byť taká, že sa môže detegovať následnou inkubáciou so sekundárnou značenou protilátkou, ktorá sa viaže na primárnu protilátku.

Imunostanovenia, opísané vyššie, využívajú stanovenie značených zložiek. Značka môže byť v rôznych formách. Značka môže byť priamo alebo nepriamp naviazaná na žiadúcu zložku stanovenia a to spôsobmi, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Môže sa použiť rad rôznych značiejc. Zložka sa môže označiť akýmkoľvek z niekoľkých spôsobov. Medzi tradične používané rádioaktívne značky patria ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C alebo ³²P. Medzi nerádioaktivne značky patria ligandy, ktoré sa viažu na značené protilátky, fluorofóry, chemiluminiscenčné činidlá, enzýmy a protilátky, ktoré môžu slúžiť ako člen špecifického väzbového páru pre značený proteín. Výber značky závisí na požadovanej citlivosti, jednoduchosti napojenia na zlúčeninu, na požiadavkách, ktoré sa týkajú stability a na dostupnom zariadení. Súhrn rôznych systémov na značenie alebo na vytváranie signálu, ktoré sa môžu použiť, je uvedený v U. S. patente č. 4391904, ktorý je tu začlenený ako odkaz.

Protilátky, ktoré reagujú s konkrétnym proteínom, sa môžu tiež merať rôznymi imunometódami. Súhrn imunologických postupov a imunostanovení, ktoré sa môžu aplikovať pri meraní protilátok pomocou imunostanovenia, je uvedený v Stites a Terr

Basic and Clinical Immunology (7. vydanie); Maggio Enzýme

Immunoassay a Harlow a Lane Antibodies, A Laboratory Manual.

Na meranie špecifických proteínov sa môže použiť tiež rad rôznych usporiadaní imunostanovení, separačných technik a značiek, ktoré sa podobajú na tie, ktoré sú uvedené vyššie.

VI. Purifikované DC proteíny

Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia pre DCMP1 z primáta, napríklad pre ľudský DCMP1, sú poskytované v SEQ ID č.: 1 a 2. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia pre DCMP1 z hlodavca, napríklad myši sú poskytované v SEQ ID č.: 7 a 8. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia pre DCMP2 z primáta, napríklad pre ľudský DCMP2, sú poskytované v SEQ ID č.: 3 a 4. Iný variant je opísaný v SEQ ID č. : 9 a 10. Podobné sekvencie pečeňového azialoglykoproteinu primáta sú poskytované v SEQ ID č.: 5 a 6. Peptidové sekvencie umožňujú prípravu peptidov na vytvorenie protilátok, ktoré by rozpoznávali tieto úseky a umožňujú prípravu oligonukleotidov, ktoré kódujú tieto sekvencie.

VII. Fyzikálne varianty

Tento vynález sa tiež zaoberá proteinmi alebo peptidmi, ktorých aminokyselinové sekvencie vykazujú podstatnú podobnosť s aminokyselinovými sekvenciami SEQ ID č.: 2 alebo 8 alebo s vybranými podielmi SEQ ID č. 4 alebo 10. Varianty, ktoré vykazujú napríklad 20 alebo menej, výhodnejšie 10 alebo menej a najvýhodnejšie 5 alebo menej substitúcií, sú tiež možné. V prípadoch, keď sú substitúcie konzervatívne, budú mať varianty rovnakú imunogénnu alebo antigénnu podobnosť alebo krížovú reaktivitu ako príslušný proteín s prirodzenou sekvenciou. Prirodzené varianty zahŕňajú individuálne, alelické, polymorfné, kmeňové alebo druhové varianty.

Podobnosť aminokyselinových sekvencií alebo ich identita je stanovená optimalizovaním zhôd vo zvyškoch a ak je to nevyhnutné, zahrnutím medzier. To sa zmení vtedy, ak sa za tieto zhody považujú konzervatívne substitúcie. Konzervatívne substitúcie väčšinou zahŕňajú substitúcie v nasledujúcich skupinách: glycín, alanín, valín, izoleucín, leucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutamín; serin, treonín, lyzín, arginín a fenylalanín, tyrozín. Homológne aminokyselinové sekvencie zahŕňajú prirodzené alelické a medzidruhové variácie v každej príslušnej proteínovej sekvencii. Typické homológne proteíny alebo peptidy budú s aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúceho DC proteínu vykazovať 50 až 100 % podobnosť (ak sa môžu začleniť medzery) a 75 až 100 % podobnosť (ak sú zahrnuté konzervatívne substitúcie) . Mierou totožnosti bude totožnosť aspoň asi 50 %, vo všeobecnosti aspoň 60 %, všeobecnejšie aspoň 65 %, obvykle aspoň 70 %, obvyklejšie aspoň 75 %, výhodnejšie aspoň 80 % a najvýhodnejšie aspoň 80 % a v konkrétne uprednostňovaných uskutočneniach aspoň 85 % a viac. Viď. tiež Needleham a kol. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 až 453; Sankoff a kol. (1983) Tíme Warps, String Edits a Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Kapitola 1, Addison-Wesley, Reading, MA a software od IntelliGenetics, Mountain View, CA od genetickej počítačovej skupiny University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI.

Pri porovnaní sekvencii väčšinou jedna vystupuje ako referenčná sekvencia, s ktorou sa sekvencia testované sekvencie porovnávajú, porovnávanie sekvencii,

Ak sa použije algoritmus testovaná a referenčná sekvencia na sa zadajú do počítača, ak je to potrebné označia sa súradnice subsekvencií, a označia sa parametre programu sekvenčného algoritmu. Algoritmus na porovnávanie základe označených parametrov spočíta sekvencii potom na percentá totožnosti testovaných(ej) sekvencii(e) voči referenčnej sekvencii.

Na porovnanie sa môže uskutočniť optické porovnanie sekvencii, napríklad pomocou algoritmu, založeného na miestnej homológii podľa Smith a Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, pomocou algoritmu na zoradenie homológii podľa Needman a Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, výberom podľa podobnosti spôsobom podľa Pearson a Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, počítačovými spracovaniami týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA vo Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,

WI) alebo vizuálnym . porovnávaním (viď. všeobecne Ausubel a kol.) .

Jedným príkladom užitočného algoritmu je PILEUP. PILEUP vytvára mnohonásobné porovnanie podobných sekvencii pomocou postupného porovnávania na základe dvojíc s cielom ukázať vzťah a percentuálne vyjadrenú totožnosť sekvencii. Je tiež vytvorený strom alebo dendogram, ktorý ukazuje vzťahy, použité na vytvorenie tohto usporiadania. PILEUP používa zjednodušený spôsob postupného porovnávania podlá Feng a Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351 až 360. Použitý spôsob sa podobá spôsobu, ktorý opísali Higgins a Sharp (1989) CABIOS 5: 151 až 153. Program môže porovnať až 300 sekvencii, z ktorých každá má dĺžku maximálne 5000 nukleotidov alebo aminokyselín. Postup mnohonásobného porovnávania začína porovnaním páru dvoch najpodobnejších sekvencii a vzniká zoskupenie dvoch porovnávaných sekvencii. Toto zoskupenie sa potom porovnáva s ďalšou najpodobnejšou sekvenciou alebo zoskupením porovnaných sekvencii. Dve zoskupenia sekvencii sa porovnajú jednoduchým predĺžením párového porovnania dvoch jednotlivých sekvencii. Konečné porovnanie sa dosiahne sériou postupných párových porovnávaní. Program sa spustí označením špecifických sekvencii a ich aminokyselinových alebo nukleotidových súradníc oblastí, kde sa sekvencia porovnáva a označením parametrov programu. Napríklad referenčná sekvencia sa môže porovnať s ďalšími testovanými sekvenciami preto, aby sa stanovilo percento totožnosti sekvencii pomocou nasledujúcich nastavených parametrov: veľkosť medzery (3,00), dĺžka medzery (0,1) a koncové medzery.

Iným príkladom algoritmu, ktorý je vhodný na stanovenie percenta identity sekvencii a na stanovenie podobnosti sekvencii je algoritmus BLAST, ktorý opísali Altschul a kol. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 až 410. Software na analýzu pomocou algoritmu BLAST je verejne dostupný v National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Tento algoritmus uskutočňuje najskôr identifikáciu sekvenčných párov s vysokou mierou podobnosti (HSP) tým, že identifikuje krátke slová s dĺžkou W v zisťovanej sekvencii, ktoré ak sa porovnávajú so slovom s rovnakou dĺžkou, ktorá sa nachádza v databáze, sa buď zhodujú alebo vyhovujú istej pozitívnej prahovej hodnote T. Ako T sa označuje prahová hodnota blízkeho slova (Altschul a kol.). Tieto počiatočné slová slúžia na zahájenie hľadania s cieľom nájsť dlhšie HSP, ktoré ich obsahujú. Slová sa potom predĺžia v obidvoch smeroch pozdĺž každej sekvencie a to tak dlho, až sa môže zvýšiť celková miera porovnania. Predĺženia slov v obidvoch smeroch sa zastavia, keď: celková miera porovnania poklesne kvantitou X zo svojej maximálnej dosiahnutej hodnoty; celková miera sa vzhľadom k akumulácii jedného alebo viacerých negatívne skórujúcich porovnaní blíži k nule alebo nižšie alebo ak sa dosiahne koniec jednej alebo druhej sekvencie. Parametre W, T a X algoritmu BLAST určujú citlivosť a rýchlosť porovnania. Program BLAST používa ako vopred danú dĺžku slova (W) 11,

BLOSUM62 skórovaciu maticu (viď. Henikoff a Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) porovnania (B) 50, pravdepodobnosť (E) 10, M = 5, N = 4 a porovnanie obidvoch reťazcov.

Okrem výpočtu percent totožnosti sekvencií uskutočňuje tiež algoritmus BLAST štatistickú analýzu podobnosti medzi dvomi sekvenciami (viď. Karlin a Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 až 5787) . Jedným meradlom podobnosti, ktoré poskytuje algoritmus BLAST, je najmenšia celková pravdepodobnosť (P(N)), ktorá naznačuje pravdepodobnosť, s ktorou sa medzi dvomi nukleotidmi alebo aminokyselinovými sekvenciami vyskytne náhodná zhoda. Napríklad nukleová kyselina sa považuje za podobnú referenčnej sekvencií vtedy, ak najmenšia celková pravdepodobnosť je pri porovnaní testovanej nukleovej kyseliny a referenčnej nukleovej kyseliny menšia ako asi 0,1, výhodnejšie menšia ako asi 0,01 a najvýhodnejšie menšia ako asi 0,001.

Ďalším náznakom toho, že sú dve sekvencie nukleových kyselín polypeptidov takmer identické je to, že polypeptid, kódovaný prvou nukleovou kyselinou, vykazuje krížovú imunoreaktivitu s polypeptidom, kódovaným druhou nukleovou kyselinou, ako je opísané nižšie. Polypeptid je tak väčšinou takmer identický s druhým polypeptidom napríklad vtedy, keď sa dva peptidy líšia len konzervatívnymi substitúciami. Iným náznakom toho, že sú dve nukleové kyseliny takmer identické je to, že dve molekuly hybridizujú jedna s druhou za prísne regulovaných podmienok, ako je opísané nižšie.

Nukleové kyseliny, kódujúce cicavčie DC proteiny, budú za prísne regulovaných podmienok väčšinou hybridizovať so SEQ ID č.: 1 alebo 7 alebo so zodpovedajúcimi podielmi SEQ 3.

Napríklad nukleové kyseliny, kódujúce príslušné DC proteiny, budú väčšinou hybridizovať s nukleovou kyselinou so SEQ ID č. : 1, 7, 3 alebo 9 za prísne regulovaných hybridizačných podmienok, ale aj napriek tomu poskytujú falošné pozitívne hybridizačné signály. Vo všeobecnosti sú prísne regulované podmienky vyberané tak, aby teplota bola asi o 10 °C nižšia ako teplota topenia (Tm) sekvencie, ktorá je hybridizovaná, definovaná je iónová sila a pH. Tm je teplota (pri definovanej iónovej sile a pH), pri ktorej 50 % cieľovej sekvencie hydridizuje s úplne zhodnou pripravenou próbou. Prísne regulované podmienky budú väčšinou také podmienky, pri ktorých je koncentrácia soli v premývacom roztoku asi 0,02 M pri pH 7 a teplota je aspoň 50 °C. Ostatné faktory vrátane okrem iného tiež zloženia bázy a veľkosti komplementárnych vlákien, prítomnosti organických rozpúšťadiel ako je formamid a rozsahu nesúhlasných báz, môžu hybridizáciu podstatne zhoršovať. Uprednostňované uskutočnenie bude zhŕňať nukleové kyseliny, ktoré sa budú na uvedené sekvencie viazať v ⁴50 % formamide, v 20 až 50 mM NaCl a pri 42 °C. Hybridizácia za prísne regulovaných podmienok bude dávať aspoň 2 násobne rozdielne pozadie v porovnaní s pozadím, prísne regulovaných rozdielne.

Izolovaná substitúciami nukleotidovými reťazcov.

podmienok,

DNA DC génu nukleotidov, inzerciami a

Výsledkom týchto modifikácií ktoré sa poskytuje bez použitia výhodnejšie aspoň 3 až 5 x sa môže ľahko modifikovať nukleotidovými deléciami, prevracaním nukleotidových sú nové sekvencie DNA, ktoré kódujú tieto DC antigény, ich deriváty alebo proteiny, ktoré vykazujú vysoko podobnú fyziologickú, imunogénnu alebo antigénnu aktivitu.

Modifikované sekvencie sa môžu použiť na prípravu mutantných antigénov alebo na zvýšenie expresie. Zvýšená expresia môže zahŕňať amplifikáciu génu, zvýšenú transkripciu, zvýšenú transláciu a iné mechanizmy. Tieto mutantné deriváty DC proteínov zahŕňajú vopred určené alebo miestne špecifické mutácie príslušného proteínu alebo jeho fragmentov. Mutantný DC proteín obsahuje polypeptid, ktorý inak spĺňa definíciu homológneho DC proteínu, ktorá je uvedená vyššie, ale ktorý, má či už v dôsledku delécie, substitúcie alebo inzercie, odlišnú aminokyselinovú sekvenciu v porovnaní so sekvenciou DC proteínu, nájdeného v prírode. Konkrétne miestne špecifický mutantný DC proteín vo všeobecnosti zahŕňa proteíny, ktoré vykazujú významnú podobnosť s proteínom, ktorý má sekvenciu SEQ ID č.: 2 alebo 8.

Vo všeobecnosti bude mat variant vela fyziochemických a biologických aktivít, napríklad antigénne alebo imunogénne, rovnakých ako uvedené sekvencie a v uskutočneniach bude obsahovať podstatnú uprednostňovaných časť alebo celú odhalenú sekvenciu.

Podobné postupy sa môžu aplikovať na rôzne DC proteíny, konkrétne na tie, nájdené v rôznych teplokrvných zvieratách, napríklad primátoch a cicavcoch.

Aj keď sú miesta pre miestne špecifickú mutáciu vopred určené, mutanty nemusia byť miestne špecifické. Mutagenézia DC proteínu sa môže uskutočniť inzerciami alebo deléciami aminokyselín. Aby sa dospelo ku konečnému konštruktu, môže sa použiť substitúcia, delécia, inzercia alebo akákoľvek ich kombinácia. Inzercie zahŕňajú fúzie amino alebo karboxykoncov. Ľubovoľná mutagenézia sa môže uskutočniť na cieľovom kodóne a u exprimovaných mutantov sa môže potom testovať žiadúca aktivita. Spôsoby uskutočnenia substitučných mutácií na vopred určených miestach DNA, ktorá má známu sekvenciu, napríklad mutagenézia pomocou M13 priméru alebo polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) sú veľmi dobre známe v danej oblasti techniky. Viď. tiež Sambrook a kol. (1989) a Ausubel a kol. (1987 a doplnky). Dôsledkom mutácií v DNA by nemalo byť umiestnenie kódujúcej sekvencie mimo čítacieho rámca a výhodnejšie nebude dochádzať k tvorbe takých komplementárnych oblastí, ktoré by mohli hybridizovať a produkovať sekundárne štruktúry mRNA ako sú slučky alebo ostré ohyby.

Predkladaný vynález tiež poskytuje rekombinantné proteiny, napríklad heterológne fúzne proteiny použitím úsekov týchto proteínov. Heterológny fúzny proteín je fúziou proteínov alebo úsekov, ktoré nie sú prirodzene bežne fúzované rovnakým spôsobom. Produktom fúzie imunoglobulínu a príslušného DC polypeptidu je spojitá proteínová molekula, ktorá má sekvencie fúzované v typickom peptidovom spojení, je väčšinou vytvorená ako jediný produkt translácie a vykazuje vlastnosti, ktoré pochádzajú od každého zdroja peptidu. Podobný spôsob je aplikovaný na heterológne sekvencie nukleových kyselín.

Ďalej sa môžu nové konštrukty pripraviť kombináciou podobných funkčných domén z iných proteínov. Napríklad domény alebo iné úseky sa môžu vymeniť medzi odlišnými novými fúznymi polypeptidmi alebo fragmentárni, väčšinou u podobných proteínov, napríklad u lektínu alebo azialoglykoproteínových rodín. Výhodnejšie sa použijú neporušené štruktúrne domény, napríklad neporušené časti Ig. Viď. napríklad Cunnigham a kol. (1989) Science 243: 1330 až 1336 a O'Dowd a kol. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985 až 15992. Z funkčného spojenia špecifít, ktoré viažu proteín a ostatných funkčných domén, budú teda vznikať nové chimerické polypeptidy, ktoré vykazujú nové kombinácie špecifít. Tiež sa môžu aplikovať mutagenézie alanínu, výhodnejšie u zvyškov, ktoré sú z hľadiska štruktúry mimo sekundárnej štruktúry, čím sa vylúči väčšina kritických zvyškov, ktoré vo všeobecnosti rozrušujú terciárnu štruktúru.

Deriváty týchto DC antigénov zahŕňajú mutanty aminokyselinových sekvencií, glykozylačné varianty a kovalentné alebo agregované konjugáty s inými chemickými skupinami. Kovalentné deriváty sa môžu pripraviť pripojením funkčných častí k skupinám, ktoré sa nachádzajú v postranných aminokyselinových reťazcoch týchto DC proteínov alebo na Nalebo C-konci, a to spôsobmi, ktoré sú v danej oblasti techniky známe. Medzi tieto deriváty sa môžu zaradiť bez toho, ze by sa tym toto -zaradenie obmedzovalo, alifatické estery alebo amidy karboxylových koncov alebo zvyškov, ktoré obsahujú karboxylové postranné reťazce, obsahujú hydroxylové skupiny aminokyseliny alebo zvyškov, napríklad lyzín alebo arginín.

O-acyl deriváty zvyškov, ktoré a N-acyl deriváty N-koncovej ktoré obsahujú aminoskupinu, Acylové skupiny sa vyberajú zo skupiny alkylových skupín vrátane bežných C₃ až Cie alkylov, čím sa tvoria alkanoyl aroylové skupiny. Kovalentné pripojenie k nosičovým proteínom môže byť dôležité vtedy, keď sú imunogénnymi zložkami haptény.

Konkrétne sú zahrnuté glykozylačné alternatívy, napríklad vytvorené modifikovaním priebehu glykozylácie polypeptidu počas jeho syntézy a spracovania alebo počas ďalších krokov, keď sa spracováva. Konkrétne uprednostňované spôsoby, ako toto uskutočniť, používajú vystavenie polypeptidu pôsobeniu glykozylačných enzýmov, ktoré pochádzajú z buniek, ktoré bežne tieto spracovania realizujú, napríklad cicavčie glykozylačné enzýmy. Deglykozylačné enzýmy sa tiež sledujú. Tiež sú zahrnuté verzie s rovnakou primárnou aminokyselinovou sekvenciou, ktoré majú ďalšie minoritné modifikácie vrátane fosforylovaných aminokyseliných zvyškov, napríklad fosfotyrozín, fosfoserín alebo ' fosfotreonín alebo iné skupiny vrátane ribozylových skupín alebo zosieťovacích činidiel. Sú tiež zahrnuté proteíny, ktoré obsahujú substitúcie, ktoré by si mali udržiavať významnú imunogenicitu na prípravu protilátok, ktoré rozpoznávajú proteín so SEQ ID č.: 2, 4, 8 alebo 10. Tieto proteíny budú v porovnaní s odhalenou sekvenciou obsahovať typicky substitúcie menej ako 20 zvyškov, väčšinou menej ako 10 substitúcií, výhodnejšie menej ako 5 a najvýhodnejšie menej ako 3. Inak proteíny, ktoré začínajú a končia v štruktúrnych doménach si obvykle budú zachovávať antigenicitu a krížovú imunogenicitu.

Hlavnú skupinu derivátov tvoria kovalentné konjugáty DC proteínov alebo ich fragmentov s inými proteínmi alebo polypeptidmi. Tieto deriváty sa môžu syntetizovať v rekombinantnej kultúre ako sú N- alebo C-koncové fúzie alebo použitím činidiel, ktoré sú v danej oblasti techniky známe kvôli svojej použiteľnosti v prekrížení proteínov, keď sa využívajú ich vedľajšie reaktívne skupiny. Uprednostňované derivatizačné miesta proteínu pre zosieťovacie činidlá sa nachádzajú na voľných aminoskupinách, sacharidových častiach a cysteínových zvyškoch.

Tiež sú poskytované fúzne polypeptidy týchto DC proteínov a iných homológnych alebo heterológnych proteínov. Heterológne polypeptidy môžu byť fúziami medzi rôznymi povrchovými značkami, za vzniku napríklad hybridného proteínu. Okrem toho môžu byť heterológne fúzie konštruované tak, aby vykazovali kombináciu vlastností alebo aktivít derivatizovaných proteínov. Typickými príkladmi sú fúzie oznamovateľského polypeptidu, napríklad luciferázy s časťami alebo doménou proteínu, napríklad časť pre väzbu receptora, tak, že prítomnosť alebo umiestnenie fúzovaného proteínu sa môže ľahko určiť. Viď. napríklad Duli a kol., U. S. patent č. 4859609. Iní fúzni partneri sú bakteriálna β-galaktozidáza, trpE, proteín A, β-laktamáza, alfa amyláza, alkoholdehydrogenáza a α-feromón kvasiniek. Viď. napríklad Godowski a kol. (1988) Science 241: 812 až 816.

Tieto polypeptidy môžu mať tiež aminokyselinové zvyšky, ktoré boli chemicky modifikované fosforyláciou, sulfonáciou, biotinyláciou alebo pridaním alebo odstránením ďalších skupín, konkrétne tých, ktoré majú molekulárny tvar podobný fosfátovým skupinám. V niektorých uskutočneniach budú modifikácie slúžiť ako užitočné značkovacie činidlá alebo budú slúžiť ako purifikačné ciele, napríklad afinitne ligandy.

Predkladaný vynález sa tiež zaoberá použitím iných derivátov týchto DC proteínov ako tých, ktoré vznikli v dôsledku zmeny v aminokyselinovej sekvencii alebo pri glykozylácii. Tieto deriváty môžu obsahovať kovalentné spojenia s chemickými skupinami alebo ich spojenia za vzniku agregátu. Vo všeobecnosti tieto deriváty patria do 3 tried:

(1) soli, (2) kovalentné modifikácie postranných reťazcov alebo koncových zvyškov a (3) adsorpčné komplexy, napríklad s bunkovými membránami. Tieto kovalentné alebo agregované deriváty sú užitočné ako imunogény, ako činidlá pri imunostanoveniach alebo pri purifikáciách ako je afinitná purifikácia ligandov alebo iných väzbových ligandov. Napríklad na použitie pri stanovení alebo purifikácii protilátok proti

DC proteínu sa môže DC proteínový antigén známymi spôsobmi imobilizovať kovalentnou väzbou na tuhý nosič ako je

Sepharosa, aktivovaná brómkyánom alebo adsorbovať na polyolefínové povrchy, pričom sa môže, ale prekríženie glutaraldehydom. Na použitie v stanoveniach sa môžu tiež DC proteíny označiť skupinou, napríklad rádiojodáciou s chlóramínom viazaným na cheláty kovov vzácnych zemín alebo konjugovaním na nemusí použiť diagnostických detegovatelnou

T, kovalentne inú fluorescenčnú skupinu. Purifikácia týchto proteínov sa môže zlepšiť použitím imobilizovaných látok.

Izolované gény pre DC proteín umožňujú transformáciu buniek, kde nedochádza k expresii zodpovedajúceho DC proteínu, napríklad druhové typy alebo bunky, ktorým chýbajú zodpovedajúce proteíny a vykazujú negatívnu spätnú aktivitu. U definovaných variantov alebo u variantov jediného druhu umožňuje expresia transformovaných génov izoláciu antigénne čistých bunkových línií. Tento prístup umožňuje oveľa citlivejšiu detekciu a rozpoznanie fyziologických účinkov týchto DC proteínov. Subcelulárne časti, napríklad cytoplasty, alebo časti membrán sa môžu izolovať a použiť.

VIII. Komplexy väzbové činidlo : DC proteín _t

DC proteín, ktorý sa špecificky viaže alebo je špecificky imunoreaktívny s protilátkou, vytvorenou proti definovanému imunogénu ako je imunogén, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č.: 2, 4, 8 alebo 10, je imunochemicky stanovený. Imunostanovenie používa polyklonálne antisérum, ktoré je vytvorené proti proteínu so sekvenciou SEQ ID č.: 2, 4, 8 alebo 10. Toto antisérum je vybrané tak, aby vykazovalo malú krížovú reaktivitu s inými členmi príbuzných rodín a skôr ako sa uskutoční imunostanovenie, akákoľvek krížová aktivita sa odstráni imunoabsorbciou.

Aby sa pripravili antiséra na použitie v imunochemickom stanovení, proteín so SEQ ID č.: 2, 4, 8 alebo 10 sa izoluje postupom, ktorý je tu opísaný. Napríklad rekombinantný proteín sa môže pripraviť v línii cicavčích buniek. Inbredný kmeň myši ako je balb/c sa s použitím štandardného adjuvans, ako je Freudovo adjuvans, imunizuje príslušným proteínom. Pri imunizácii sa postupuje podľa štandardného protokolu na imunizáciu myši (viď. Harlow a Lane). Ako imunogén sa môže tiež použiť syntetický peptid, odvodený od tu odhalených sekvencii a konjugovaný na nosičový proteín. Pri imunostanovení, napríklad imunostanovení na tuhej fáze s imunogénom, imobilizovaným na tuhý nosč, sa spojené polyklonálne séra titrujú proti imunogénnemu proteínu. Vyberú j sa polyklonálne antiséra s titrom 10⁴ a testuje sa u nich pomocou imunostanovenia, ktoré využíva kompetitívnu väzbu ako je napríklad postup, opísaný v Harlow a Lane na str. 570 až 573, ich krížová reaktivita s inými príbuznými proteinmi. Výhodnejšie sa pri tomto stanovení súčasne s daným DC proteínom použijú dva odlišné príbuzné proteíny, napríklad u lektínového proteínu sú použitý aspoň dvaja ďalší členovia rodiny preto, aby sa adsorbovali zdieľané epitopy. Súčasne s DCMP1 sú použitý ďalší dvaja členovia tejto rodiny. Títo ďalší členovia sa môžu pripraviť ako rekombinantné proteíny a môžu sa izolovať pomocou štandardných techník, používaných v molekulárnej biológii a proteínovej chémii, ktoré sú tu opísané.

Na stanovenie krížovej reaktivity sa môže použiť imunostanovenie na základe kompetitívnej väzby. Napríklad

proteín so SEQ ID č.: 2 alebo 8 sa môže imobilizovať na tuhý nosič. Proteíny, pridané do stanovenia, súťažia s antisérom o väzbu na proteínov porovnáva krížovej pomocou štandardných výpočtov.

antigén. Schopnosť vyššie uvedených väzbu na imobilizovaný proteín sa so SEQ ID č.: 2 alebo 8.

imobilizovaný súťažiť o s proteínom reaktivity pre vyššie uvedené proteíny sa

Tie antiséra, ktorých

Percento vypočíta krížová reaktivita s každým z vyššie uvedených proteínov je nižšia ako 10 %, sú vybrané a zhromaždené. Protilátky, ktoré krížovo reagujú, sa z antiséra odstránia imunoabsorbciou vyššie uvedenými proteinmi.

Imunoabsorbované a spojené antiséra sa potom použijú pri imunostanovení, ktoré využíva kompetitívnu väzbu, ako je opísané vyššie, na porovnanie druhého proteínu s imunogénnym proteínom (napríklad DC proteín so SEQ ID č. : 2 alebo 8) . Aby bolo možné proteíny porovnať, každý proteín sa meria v širokom rozsahu koncentrácií a stanoví sa množstvo každého proteínu, ktoré je potrebné na 50 % inhibíciu väzby antiséra na imobilizovaný proteín. Ak je množstvo druhého požadovaného proteínu nižšie ako dvojnásobok požadovaného množstva proteínu so SEQ ID č. : 2 alebo 8, potom sa druhý proteín označí za špecificky sa viažúci na protilátku, vytvorenú proti imunogénu.

Je známe, že DC proteíny pravdepodobne tvoria rodinu homológnych proteínov, ktoré obsahujú dva alebo viacero génov. Predkladaný vynález neobsahuje tu odhalené aminokyselinové sekvencie len pre konkrétny produkt génu ako je proteín, ktorý patrí do rodiny ľudských Ig, ale tiež pre ďalšie proteíny, ako sú alelické, polymorfné, nealelické alebo druhové varianty. Je tiež známe, že termín ludský DC proteín zahŕňa neprirodzené mutácie, spôsobené zámernou mutáciou bežnými rekombinantnými technológiami, ako sú jednobodová mutácia alebo vystrihnutie krátkych úsekov DNA, strihové varianty z nových aminokyselín.

kódujúcich tieto proteíny alebo ako sú génu alebo substitúcia alebo pridanie Tieto minoritné zmeny musia zachovávať podstatnú imunoidentitu pôvodnej molekuly a/alebo jej biologickú aktivitu. Tieto zmeny preto zahŕňajú proteíny, ktoré sú špecificky imunoreaktívne s označeným prirodzene sa vyskytujúcim príslušným DC proteínom so SEQ ID č. : 4.

považované za minoritné, substitúcie aminokyselín s ako je opísané vyššie pre proteínom, napríklad ľudským DC Konkrétne proteínové modifikácie, by mali zahŕňať konzervatívne podobnými chemickými vlastnosťami.

každú rodinu proteínov ako celok.

Optimálnym usporiadaním proteínu s proteínom so SEQ ID č.: 2 alebo 8 a použitím obvyklých imunostanovení, tu opísaných na stanovenie imunoidentity, sa môžu určiť proteínové prostriedky vynálezu.

IX. Použitie

Predkladaný vynález poskytuje činidlá, ktoré budú nachádzať použitie v diagnostických aplikáciách, čo je tu opísané, napríklad pri všeobecnom opise vývojových abnormalít alebo nižšie pri opise diagnostických súprav. Konkrétne budú gény užitočné ako ukazovatele na rozlíšenie bunkových typov vrátane genomických bunkových aspektov, mRNA aj priebehov expresie proteínu.

DC gény, napríklad DNA alebo RNA sa môžu použiť ako súčasť foréznych stanovení. Napríklad poskytované nukleotidové sekvencie sa môžu označiť napríklad ³²P alebo biotínom a použiť pre bloty na zistenie polymorfie štandardných reštrikčných fragmentov, čím sa získa meratelný charakter, čo pomáha pri rozlíšení jednotlivcov. Tieto próby sa môžu použiť v dobre známych foréznych technikách, ako napríklad u otlačkoch prstov. Nukleotidové próby, vytvorené zo sekvencií DC, sa môžu ďalej použiť pri stanoveniach, určených na detekciu chromozomálnych abnormalít in situ.

Protilátky a ďalšie väzbové činidlá zamerané na DC proteíny alebo nukleové kyseliny sa môžu použiť na purifikáciu zodpovedajúcej molekuly DC proteínu. Ako je opísané nižšie v príkladoch, purifikácia DC proteínov pomocou protilátky je možná. Protilátky a ďalšie väzbové činidlá sa môžu tiež použiť v diagnostike na určenie, či sú zložky DC prítomné vo vzorke tkaniva alebo bunkovej populácie. Na to sa používajú tu opísané dobre známe techniky. Možnosť naviazať väzbové činidlo na DC proteín poskytuje spôsoby ako diagnostikovať ochorenia, ktoré súvisia so zlou reguláciou expresie. Protilátky a ďalšie väzbové činidlá môžu byť užitočné ako histologické alebo forézne ukazovatele. Ako je opísané v nižšie uvedených príkladoch, je expresia každého z týchto proteínov obmedzená na špecifické typy tkanív. Použitím próby, ako je protilátka alebo nukleová kyselina, ktorá presne zodpovedá príslušnému DC proteínu, je možné rozlíšiť tkanivá alebo typ bunky in situ alebo in vitro.

Predkladaný vynález tiež poskytuje činidlá, ktoré môžu mať významnú terapeutickú hodnotu. DC proteíny (prirodzene sa vyskytujúce alebo rekombinantné), ich fragmenty a protilátky proti nim súčasne so zlúčeninami, ktoré boli identifikované ako zlúčeniny, vykazujúce väzbovú afinitu k DC proteínu, sa môžu použiť pri liečbe stavov, spojených s abnormálnou fyziológiou alebo vývojom vrátane abnormálneho rozmnožovania, napríklad kancerózne stavy alebo degeneratívne stavy. Abnormálne rozmnožovanie, regenerácia, degenerácia a atrofia sa môžu zodpovedajúcou terapeutickou liečbou pomocou tu poskytovaných prostriedkov zmierniť. Napríklad ochorenie alebo porucha, ktorá súvisí s abnormálnou expresiou alebo abnormálnym prejavom DC, napríklad ako antigén prezentujúce bunky, je cieľom pre agonisty alebo antagonisty proteínu. Proteíny pravdepodobne hrajú úlohu v regulácii alebo vývoji krvotvorných buniek, napríklad lymfoidných buniek, ktoré zhoršujú imunologické odozvy, napríklad prezentáciu antigénu a vznikajúce funkcie efektora.

Ďalšie stavy, spojené s abnormálnym vývojom, sú známe v takých typoch buniek, u ktorých sa pomocou Nothern blotu zistilo, že majú mRNA pre DC proteín. Viď. Berkow The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co. Rahway, NJ a Thorn a kol. Harrison's Principles of Internal Medicíne, McGraw-Hill, NY. Vývojové a funkčné abnormality, napríklad imunitného systému, spôsobujú abnormality, významné z pohľadu medicíny a stavy, ktoré je možné ovplyvniť a tým je možné zahájiť prevenciu alebo liečbu pomocou prostriedkov, ktoré sa tu poskytujú.

Rekombinantné DC proteíny alebo protilátky by sa mohli purifikovať a potom podávať pacientovi. Na terapeutické použitie sa môžu tieto činidlá kombinovať s ďalšími aktívnymi alebo inertnými prísadami, napríklad vo vhodných farmaceutický prijateľných nosičoch alebo riedidlách, napríklad adjuvans na imunizáciu, spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a pomocnými látkami. Konkrétne sa môžu použiť v súvislosti s očkovacou látkou, kde je antigén kombinovaný s jednou z týchto terapeutických verzií agonistov alebo antagonistov. Tieto kombinácie sa môžu sterilné dávkovacích flaštičkách foriem, napríklad (vialkách) alebo filtrovať a umiestniť do lyofilizáciou v dávkovacích sa môžu skladovať vo forme stabilizovaných vodných preparátov. Tento vynález tiež obsahuje použitie protilátok alebo ich väzbových fragmentov vrátane foriem, ktoré nie sú komplementne väzbové.

Testovanie liekov pomocou protilátok alebo receptora alebo ich fragmentov môže identifikovať zlúčeniny, ktoré majú väzbovú afinitu k týmto DC proteínom, vrátane izolácie s nimi spojených zložiek. Nasledujúce biologické stanovenia sa môžu potom využiť na stanovenie, či má zlúčenina vlastnú stimulačnú aktivitu a teda je blokátorom alebo antagonistom v tom zmysle, že blokuje aktivitu proteínu. Zlúčenina, ktorá disponuje vlastnou stimulačnou aktivitou by mala cez proteín aktivovať bunku a tým je vlastne agonista v tom, že stimuluje bunku. Predkladaný vynález ďalej obsahuje terapeutické použitie protilátok proti proteínom ako antagonistov.

Množstvo látok, nevyhnutné na účinnú terapiu, bude závisieť na mnohých rôznych faktoroch, vrátane spôsobu podávania, cieľového miesta, fyziologického stavu pacienta a na ďalších podávaných liekoch. Dávky by teda mali byť titrované, aby sa optimalizovala bezpečnosť a účinnosť. Dávky, používané in vitro, môžu väčšinou poskytovať užitočný návod, čo sa týka množstva na podávanie týchto látok in situ. Na základe testovania dávok, účinných na liečbu konkrétnych ochorení u zvierat, bude možné ďalej predpokladať dávkovanie u ľudí. Rôzne úvahy sú opísané napríklad v Gilman a kol. (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydanie) Pergamon Press a (1990) Remington¹ s Pharmaceutical Sciences (17. vydanie) Mack' Publishing Co., Easton, PA. V týchto odkazoch aj ďalej v texte sú diskutované spôsoby podávania, napríklad orálne, intravenózne, intraperitoneálne alebo intrámuskulárne podávanie, transdermálne difúzie a ďalšie. Medzi farmaceutický prijateľné nosiče je možné zaradiť vodu, fyziologický roztok, pufre a ďalšie zlúčeniny, opísané napríklad v Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. U zodpovedajúce nosiča je možné rozsah dávok očakávať v množstvách nižších ako je koncentrácia 1 mM, väčšinou bude koncentrácia nižšia ako asi 10 μΜ, obvykle nižšia ako asi 100 nM, výhodnejšie nižšia ako asi 10 pM (pikomolárna) a najvýhodnejšie nižšia ako asi 1 fM (fentomolárna). Na kontinuálne podávanie sa budú často využívať formulácie alebo aparáty, keď dochádza k pomalému uvoľňovaniu.

DC proteíny, ich fragmenty a protilátky proti nim alebo ich fragmentom, antagonisty a agonisty sa môžu podávať priamo liečenému hostiteľovi alebo v závislosti na veľkosti zlúčenín môže byť žiadúce naviazať ich pred ich aplikáciou na nosičové proteíny ako je ovalbumín alebo sérový albumín. Terapeutické formulácie sa môžu podávať v mnohých vhodných dávkovacích formuláciách. Zatiaľ čo účinné prísady sa môžu podávať samostatne, uprednostňuje sa, aby boli prezentované ako farmaceutické formulácie. Formulácie väčšinou obsahujú aspoň jednu účinnú zložku, ako je definovaná vyššie, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi. Každý nosič by mal byť prijateľný ako farmaceutický tak aj fyziologicky v tom zmysle, že je zlučiteľný s ostatnými zložkami a nie je pre pacientov škodlivý. Formulácie zahŕňajú také, ktoré sú vhodné na orálne, rektálne, nazálne alebo parenterálne (vrátane podkožného, intramuskulárneho, intravenózneho a intradermálneho) podávanie. Formulácie môžu byť vo všeobecnosti prezentované v jednotkových dávkovacích formách a môžu sa pripraviť akýmkoľvek spôsobom, ktorý je dobre známy vo farmaceutickej oblasti. Viď. napríklad Gilman a kol. (1990) Goodman and Gilman*s: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydanie) Pergamon Press a (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydanie) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis a kol. (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman a kol. (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY a Lieberman a kol. (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Terapia podľa predkladaného vynálezu sa môže kombinovať s ďalšími chemoterapeutickými alebo chemopreventívnymi činidlami a môže sa použiť v spojení s nimi.

Prirodzene sa vyskytujúca aj rekombinantné forma DC proteinov podľa predkladaného vynálezu sú konkrétne užitočné ako súčasť súprav a stanovení, pomocou ktorých je možné u zlúčenín testovať väzbovú aktivitu k proteínom. V poslednom čase bolo vyvinutých niekoľko spôsobov automatického stanovenia, ktoré umožňujú testovanie desiatok tisíc zlúčenín počas krátkeho času. Viď. napríklad Fodor a kol. (1991) Science 251: 767 až 773. Tiež boli vyvinuté chemické rozmanité knižnice, ktoré pomocou mnohých velmi uľahčiť purifikovaných, je poskytovaných v predkladanom vynáleze.

opisujú spôsoby zlúčenín. Vývoj tým, že bude testovania väzbovej vhodných stanovení dostupné veľké afinity sa môže množstvo napríklad rozpustných verzií DC proteínu, ako

Akonáhle je proteín štruktúrne definovaný, môžu sa často nájsť antagonisty. Testovanie prípadných proteínových analógov je teraz možné vďaka vývoju vysoko automatizovaných stanovení, ktoré využívajú purifikované povrchové proteiny. Konkrétne budú pomocou tu opísaných testovacích techník objavené nové antagonisty a agonisty. Predmetom konkrétneho záujmy sú zlúčeniny, u ktorých sa našla kombinovaná väzbová afinita pre mnohopočetné podobné bunkové povrchové antigény, napríklad zlúčeniny, ktoré môžu slúžiť ako antagonisty pre druhové varianty DC proteínu.

Tento vynález je konkrétne užitočný na testovanie zlúčenín pomocou rekombinantného DC proteínu v rade techník na testovanie liekov. Medzi výhody použitia rekombinantného proteínu pri testovaní špecifických ligandov patria: (a) zlepšený obnoviteľný zdroj proteínu zo špecifického zdroja; (b) potenciálne vyšší počet antigénov, ktoré pripadajú na jednu bunku a ktoré poskytujú lepší signál, aby sa zvýšil pomer v stanoveniach a (c) špecifita druhového variantu (teoreticky poskytujúca lepšiu biologickú špecifitu a špecifitu voči ochoreniu).

Jeden spôsob testovania lieku využíva eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú stabilne transformované rekombinantnými molekulami DNA, exprimujúcimi DC proteín. Bunky, ktoré exprimujú tento proteín, sa môžu izolovať od akýchkoľvek iných buniek. Tieto bunky, buď živé alebo vo fixovanej forme, sa môžu použiť na štandardné stanovenie väzby povrchového proteínu. Viď. tiež Parce a kol. (1989) Science 246: 243 až 247 a Owicki a kol. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4007 až 4011, kde sú opisované citlivé spôsoby detekcie bunkových odoziev. Kompetitívne stanovenie je užitočné konkrétne v prípade, keď sa bunky (zdroj DC proteínu) inkubujú s protilátkou, ktorá má známu väzbovú afinitu k .antigénu, ako je ¹²⁵I-protilátka a s testovanou vzorkou, ktorej väzbová afinita k väzbovému prostriedku je meraná. Naviazané a voľné značené väzbové prostriedky sa potom oddelia a zistí sa stupeň naviazania proteínu. Množstvo testovanej naviazanej zlúčeniny je nepriamo úmerné množstvu značenej protilátky, ktorá sa viaže na známy zdroj. Na separáciu naviazanej a voľnej látky, aby sa stanovil stupeň naviazania, sa môže použiť veľa techník. Tento separačný krok väčšinou môže zahŕňať postup ako je adhézia na filtre, nasledovaná premytím, adhézia na plasty, nasledovaná premytím alebo odstredenie bunkových membrán. Na testovanie účinkov lieku na funkcie, sprostredkované týmto DC proteínom, napríklad prezentáciu antigénu alebo na funkcie pomocných látok, sa môžu tiež použiť živé bunky.

Iný spôsob využíva ako zdroj DC proteínu membrány z transformovaných eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských buniek. Tieto bunky sú stabilne transformované DNA vektormi, ktoré riadia expresiu príslušného proteínu, napríklad upravené membránovo viazané formy. Membrány by sa mali v podstate pripraviť z buniek a použiť pri stanovení naviazania ako je kompetitívne stanovenie, ktoré je uvedené vyššie.

Ešte iný prístup je použiť rozpustený nepurifikovaný alebo rozpustený purifikovaný DC proteín z transformovaných eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských buniek. Tento postup počíta pri stanovení molekulárneho naviazania s výhodami, ako je zvýšená špecifita, možnosť automatizácie, vysoká kapacita testovania liekov.

Iná technika testovania liekov zahŕňa prístup, ktorý poskytuje vysokú kapacitu testovania zlúčenín, ktoré majú vhodnú väzbovú afinitu k príslušnému DC proteínu a je detailne opísaný v patentovej prihláške Geysen, European patent Application 84/03564, zverejnenej 13. septembra 1984. Najskôr sa na tuhom substráte, napríklad plastové ihličky alebo nejaké iné vhodné povrchy, syntetizuje veľký počet odlišných malých peptidových testovaných zlúčenín, viď. napríklad Fodor a kol. Potom všetky ihličky reagujú s rozpusteným nepurifikovaným alebo rozpusteným purifikovaným DC proteínom a premyjú sa.

Nasledujúcim krokom je detekcia naviazanej látky, napríklad protilátky.

Jednou z možností ako stanoviť, ktoré miesta interagujú s inými špecifickými proteínmi, je stanovenie fyzikálnej štruktúry, napríklad rôntgenovou kryštalografiou alebo dvojrozmerným NMR. Tieto budú poskytovať návod, ktoré aminokyselinové zvyšky tvoria molekulové kontaktné oblasti. Podrobný opis stanovenia proteínovej štruktúry je uvedený napríklad v Blundell a Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY.

X. Súpravy

Tento vynález sa tiež zaoberá použitím DC proteínov, ich fragmentov, peptidov a ich fúznych produktov v rôznych diagnostických súpravách a pri detekcii prítomnosti DC proteínu alebo správy o ňom. Väčšinou bude súprava obsahovať zložku, ktorá obsahuje buď definovaný DC peptid alebo úsek génu alebo látku, napríklad protilátku, ktorá rozpozná jeden alebo druhý.

Súprava, pomocou ktorej sa stanoví väzbová afinita testovanej zlúčeniny k príslušnému DC proteínu, by mala väčšinou obsahovať testovanú zlúčeninu, značenú zlúčeninu, napríklad protilátku so známou väzbovou afinitou pre proteín, zdroj DC proteínu (prirodzene sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedky, ktoré slúžia na separáciu naviazanej a voľne značenej zlúčeniny ako je napríklad tuhá fáza na imobilizáciu DC proteínu. Akonáhle sú zlúčeniny otestované, môžu sa tie, ktoré vykazujú vhodnú väzbovú afinitu k proteínu, zhodnotiť vo vhodných biologických stanoveniach, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Toto sa uskutočňuje preto, aby sa určilo, či pri regulácii funkcie DC pracujú ako agonisty alebo antagonisty. Dostupné rekombinantné DC polypeptidy tiež poskytujú dobre definované štandardy na kalibráciu týchto stanovení.

Uprednostňovaná súprava na stanovenie koncentrácie, napríklad DC proteínu vo vzorke, by mala väčšinou obsahovať značenú zlúčeninu so známou väzbovou afinitou k DC proteínu, napríklad protilátku, zdroj DC proteínu (prirodzene sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedok na separáciu naviazanej formy od volnej značenej zlúčeniny, napríklad tuhú fázu na imobilizáciu DC proteínu. Bežne sa v súprave poskytujú súčasti, ktoré obsahujú látky a návody.

Protilátky vrátane fragmentov, ktoré viažu antigén, špecifické pre príslušný DC proteín alebo jeho fragmenty, sú užitočné v diagnostických aplikáciách a to na detekciu prítomnosti zvýšených hladín proteínu a/alebo jeho fragmentov. Tieto diagnostické stanovenia môžu používať lyzáty, živé bunky, fixované bunky, imunofluorescenciu, bunkové kultúry, telesné tekutiny a ďalej môžu zahŕňať detekciu antigénov v sére a pod. Diagnostické stanovenia môžu byť homogénne (bez separačného kroku, keď sú oddelené volná látka a komplex antigén : DC proteín) alebo heterogénne (s týmto separačným krokom). Existujú rôzne komerčné stanovenia ako je rádioimunoanalýza (RIA), heterogénna kompetitívna EIA s použitím imunosorbentu (ELISA), enzýmová imunoanalýza (EIA), homogénna enzýmová imunoanalýza (EMIT) , imunoanalýza s fluorescenčné značeným substrátom (SLFIA) a pod. Napríklad sa môžu použiť neznačené protilátky a to vtedy, keď sa použije sekundárna protilátka, ktorá je označená a ktorá rozpoznáva protilátku proti DC proteínu alebo jeho konkrétnemu fragmentu. Podobné analýzy boli podrobne diskutované v literatúre. Viď. napríklad Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chán (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price a Newman (1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY a Ngo (1988) Nonisotopic Imunoassay Plénum Press, NY. Látky môžu byť konkrétne užitočné na diagnostikovanie populácií DC v biologických vzorkách s cieľom detegovať prebytok alebo nedostatok DC vo vzorke. Stanovenie môže byť zamerané na histologickú analýzu biopsie alebo na stanovenie DC v krvi alebo vo vzorke tkaniva.

Antiidiotypické protilátky sa môžu podobne využiť pri diagnostikovaní prítomnosti protilátok proti DC proteínu a tak sa môžu používať ako diagnostické prostriedky rôznych abnormálnych stavov. Napríklad v dôsledku nadmernej produkcie

DC proteínu môže prísť k rôznym imunologickým reakciám, ktoré môžu byť diagnostickým prostriedkom abnormálnych fyziologických stavov, konkrétne stavov, ktoré súvisia s rozmnožovaním buniek, ako je malígny nádor alebo abnormálna diferenciácia.

Často sa látky na diagnostické stanovenia dodávajú v súpravách, čím sa môže optimalizovať citlivosť stanovenia. Pre predkladaný vynález sa v závislosti na povahe stanovenia poskytuje protokol a značka, značená alebo neznačená protilátka alebo receptor alebo značený DC proteín. Tieto súčasti sa obvykle dodávajú spolu s ostatnými prídavnými látkami ako sú pufre, stabilizátory, materiály, nevyhnutné na vytvorenie signálu ako sú substráty pre enzýmy a pod. Výhodnejšie budú súpravy tiež obsahovať návody na použitie a inštrukcie, ktoré sa týkajú likvidácie použitého materiálu. Súprava väčšinou obsahuje zložky pre každú užitočnú látku. Látky sa poskytujú ako suchý lyofilizovaný prášok, ktorý sa môže rozpustiť vo vodnom médiu tak, aby sa získali koncentrácie látok, vhodné na stanovenie.

Množstvo z vyššie uvedených súčastí testovania liekov a diagnostických stanovení sa môže použiť bez modifikácie alebo sa môže modifikovať v rôznych smeroch. Napríklad značenie sa môže uskutočniť kovalentným alebo nekovalentným pripojením skupiny, ktorá priamo alebo nepriamo poskytuje detegovatelný signál. V rade týchto stanovení môžu byť značené proteín, testovaná zlúčenina, DC proteín alebo protilátka proti nemu a to buď priamo alebo nepriamo. Medzi skupiny, ktoré sa môžu použiť na priame značenie patria: rádioznačky ako je ¹²⁵I, enzýmy (U. S. patent č. 3645090) ako je peroxidáza a alkalická fosfatáza a fluorescenčné značky (U. S. patent č. 3940475), ktoré sú schopné monitorovať zmenu intenzity fluorescencie, zmenu vlnovej dĺžky alebo fluorescenčnú polarizáciu. Medzi možnosti nepriameho značenia patria biotinylácia jednej zložky, nasledovaná naviazaním na avidín, ktorý je viazaný na jednu z vyššie uvedených skupín značiek.

Existuje tiež rad spôsobov separácie naviazaného a voľného proteínu alebo tiež naviazanej a voľnej testovanej zlúčeniny. DC protein môže byť imobilizovaný na rôzne matrice a po imobilizácii nasleduje premytie. Vhodné matrice zahŕňajú plasty ako sú mikrotitračné doštičky pre ELISA, filtre a guľôčky. Spôsoby imobilizácie DC proteínu na matrici zahŕňajú bez toho, že by tým boli obmedzené, priamu adhéziu na plast, použitie zachytávajúcej protilátky, chemické spájanie a systém biotín-avidín. Posledným krokom v tomto prístupe je zrážanie komplexu proteín/protilátka jedným z niekoľkých spôsobov vrátane tých, ktoré využívajú napríklad organické rozpúšťadlá ako je polyetylénglykol alebo soli ako je síran amónny. Ďalšie vhodné separačné techniky zahŕňajú bez toho, že by tým boli obmedzené, spôsob, ktorý využíva magnetické častice s protilátkou, značenou fluóresceinom, viď. Rattle a kol. (1984) Clin. Chem. 30: 1457 až 14 61 a separáciu pomocou magnetických častíc, ktorá je opísaná v U. S. patente č. 4659678.

Spôsoby spojenia proteinov alebo ich fragmentov s rôznymi značkami sú podrobne opísané v literatúre a teda tu nevyžadujú podrobnejšiu diskusiu. Veľa techník používa na spojenie na vznik peptidových väzieb aktivované karboxylové skupiny, buď prostrednítvom použitia karbodiimidu alebo aktívnych esterov, na tvorbu tioesterov reakciou merkaptoskupiny s aktivovaným halogénom ako je chlóracetyl alebo aktivovaný olefín ako je maleimid a pod. V týchto aplikáciách nachádzajú použitie tiež fúzne proteíny.

Iným diagnostickým aspektom predkladaného vynálezu je použitie oligonukleotidových alebo polynukleotidových sekvencií, vybraných zo sekvencie príslušného DC proteínu.

Tieto sekvencie sa môžu použiť ako próby na detegovanie hladiny správy vo vzorke od pacientov, u ktorých je podozrenie na výskyt abnormálnych stavov, napríklad malígny nádor alebo imunitné problémy. V literatúre boli podrobne diskutované príprava RNA aj DNA nukleotidových opísané a sekvencií, značenie sekvencií aj uprednostňované veľkosti sekvencií.

Oligonukleotidová próba by mala bežne mať nukleotidov, obvykle aspoň asi 18 nukleotidov aspoň 14 a veľkosť polynukleotidovej próby by mala by do niekoľkých kilobáz. Môžu sa použiť rôzne značky, najbežnejšie rádionukleotidy, konkrétne ³²P. Avšak sa môžu použiť tiež iné techniky ako je technika, ktorá používa na začlenenie do polynukleotidu biotínom modifikované nukleotidy. Biotín potom slúži ako miesto na naviazanie na avidín alebo protilátok, ktoré môžu byť značené rôznymi značkami ako sú rádionukleotidy, fluórfóry, enzýmy a pod. Tiež sa môžu použiť protilátky, ktoré môžu rozpoznať špecifické duplexy vrátane duplexov DNA, RNA, hybridov DNA-RNA alebo duplexov DNA-proteín. Protilátky sa môžu označiť a môže sa uskutočniť stanovenie, keď je duplex viazaný na povrch, takže podlá tvorby duplexu na povrchu sa môže detegovať prítomnosť protilátky, naviazanej na duplex. Próby k novej protismernej (anti-sense) RNA sa môžu použiť v akejkoľvek zodpovedajúcej technike, ako je hybridizácia nukleových kyselín, testovanie plus a mínus reťazcov, rekombinačné detegovanie a translácie, ovplyvňované hybridom (HRT a HART). Toto tiež zahŕňa amplifikačné techniky ako je polymerázová reťazová reakcia (PCR).

Diagnostické súpravy, pomocou ktorých sa alebo kvantitatívne testuje prítomnosť ďalších tiež obsiahnuté. Diagnóza alebo prognóza môžu mnohopočetných indikácii, použitých ukazovateľov. Preto sa súpravy môžu použiť na testovanie kvalitatívne značiek, závisieť sú na kombinácii ako kombinácií týchto ukazovateľov.' Viď. napríklad Viallet a kol. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89 až 97.

XI. Izolácia väzbového partnera

Ak sa izoluje jeden člen väzbového partnera špecifickej interakcie, existujú spôsoby, ako izolovať druhého partnera. Viď. Gearing a kol. (1989) EMBO J. 8: 3667 až 3676. Napríklad sa môžu určiť spôsoby značenia povrchu DC proteínu bez toho, aby došlo k interferencii s naviazaním na receptor. Napríklad afinitná značka môže byť fúzovaná s amino alebo karboxykoncom ligandu. U expresnej knižnice sa môže testovať špecifické naviazanie na DC proteín, napríklad výberom buniek alebo inými testovaniami, ktorých cieľom je detegovať subpopulácie, ktoré exprimujú túto väzbovú zložku. Viď. napríklad Ho a kol. (1993) Proc. hati. Acad. Sci. USA 90: 11267 až 11271. Tiež sa môže použiť afinitný spôsob. Viď. napríklad Seed a Aruffo (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365 až 3369. Môže sa tiež aplikovať dvojhybridový selekčný systém, ktorý vytvára s dostupnými sekvenciami DC proteinu zodpovedajúce konštrukty.

Viď. napríklad Fields a Song (1989) Náture 340: 245 až 246.

Pri izolácii väzbových partnetov DC proteínu sa môžu aplikovať techniky prekríženia proteínov s použitím značky. Toto by malo umožniť identifikáciu proteínov, ktoré špecificky interagujú so zodpovedajúcim DC proteínom.

Široký rozsah tohto vynálezu bude najlepšie pochopený pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré však vynález žiadnym spôsobom neobmedzujú len na špecifické uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

I. Všeobecné metódy

Rad z nižšie uvedených štandardných metód je opísaný alebo sa na ne odkazuje napríklad v Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydanie) zv. 1 až 3, CSH Press, NY; Ausubel a kol., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn; NY alebo Ausubel a kol. (1987 a doplnky) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Green, NY; Innis a kol. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY.

Medzi spôsoby purifikácie proteínov patria napríklad zrážanie síranom amónnym, chromatografia na kolónach, elektroforéza, odstreďovanie, kryštalizácia a iné. Viď. napríklad Ausubel a kol. (1987 a periodické doplnky); Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology zv. 182 a ďalšie zväzky tejto série; Coligan a kol. (1996 a periodické doplnky) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY a firemná literatúra, ktorá sa týka použitia produktov purifikácie proteínov, napríklad Pharmacia, Piscataway, NJ alebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinácia s rekombinantnými technikami umožňuje fúziu so zodpovedajúcimi úsekmi, napríklad FLAG sekvenciou alebo ekvivalentami, ktoré sa môžu fúzovať cez sekvenciu, ktorá sa môže odstrániť proteázou. Viď. napríklad Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69 až 70; Hochuli (1990) Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent v Setlow Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87 až 98, Plénum Press, NY a Crowe a kol. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification Systém QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Metódy stanovenia imunologickej funkcie sú opísané napríklad v Coligan a kol. (1992 a periodické doplnky) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY. Viď. tiež napríklad Paul (1993) Fundamental Immunology (3. vydanie) Raven Press, NY.

Analýzy pomocou prietokovej cytometrie (FACS) sú opísané v Melamed a kol. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY a Robinson a kol. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II. Vytvorenie dendritických buniek

Ľudské CD34 + bunky sa získali nasledujúcim spôsobom. Viď. napríklad Caux a kol. (1995) str. 1 až 5 v Banchereau a Schmi 11 Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology

I

Plénum Press, NY. Periférne alebo krvné bunky chordy, niekedy vybrané CD34+, sa kultivovali v prítomnosti kmeňového bunkového faktora (SCF), GM-SCF a TNF-a v médiu RPMI 1640 bez endotoxínu (GIBCO, Grand Island, NY), ktoré sa doplnilo nasledujúcimi látkami: 10 % obj. tepelne inaktivované zárodočné hovädzie sérum (FBS; Flow Laboratories, Irvine, CA), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamín, 5 x 10⁵ M 2-merkaptoetanol, penicilín (100 mg/ml). Toto médium je označené ako kompletné médium.

CD34+ bunky sa namnožili v bankách s plochou 25 až 75 cm² (Corning, NY) , kde sa dali v koncentráciách 2 x 10⁴ buniek/ml. Optimálne podmienky sa udržiavali tým, že tieto kultúry sa v 5. a 10. dni pasážovali do média s obsahom čerstvého GM-CSF a TNF-a (koncentrácia buniek 1 až 3 x 10⁵ buniek/ml). V určitých prípadoch sa bunky asi v 6. dni rozdelili pomocou prietokovej cytometrie (FACS) na expresiu CDla.

V určitých prípadoch sa bunky bežne zbierali po 12 dňoch kultivácie, pričom prípadné prichytené bunky sa získali späť pomocou roztoku 5 mM EDTA. V iných prípadoch sa CDla+ bunky aktivovali pomocou resuspendovania v kompletnom médiu 5 x 10⁶ buniek/ml. Aktivácia roztokom phorbol 12-myristát 13-octanu s koncentráciou 1 mg/ml (PMA, Sigma) a ionomycínom s koncentráciou 100 ng/ml (Calbiochem, La Jolla, CA) prebiehala zodpovedajúci čas (napríklad 1 alebo 6 h) . Tieto bunky sa ďalej množili počas 6 dní a potom sa na prípravu cDNA knižnice izolovala RNA.

III. Izolácia RNA a zostavovanie knižnice

Celková RNA sa izoluje napríklad postupom, ktorý využíva gradient guanidín tiokyanát/CsCl, ktorý je opísaný v Chirgwin a kol. (1978) Biochem. 18: 5294 až 5299.

Poly(A)+ RNA sa tiež môže izolovať pomocou súpravy na izoláciu mRNA OLIGOTEX (QIAGEN). Dvojvláknová cDNA je vytvorená pomocou napríklad plazmidového systému na syntézu cDNA SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) a klonovaním plazmidu. Vznikajúca dvojvláknová cDNA sa jednosmerne klonuje napríklad v pSportl a transfektuje elektroporáciou do buniek ELECTROMAX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

IV. Sekvencovanie i

DNA, izolovaná z náhodne vybraných klonov alebo po subtraktivnej hybridizácii pomocou neaktivovaných buniek, sa podrobila štandardnej sekvenčnej analýze nukleotidov. Môže sa použiť sekvenčná súprava Taq Dideoxy Terminátor (Applied

Biosystems, separujú v sekvenátora.

Foster City, CA) . Značené DNA fragmenty sa sekvenačnom géli zodpovedajúceho automatického

Inak sa môže izolovaný kloň sekvencovať postupom, opísaným napríklad v Maniatis a kol. A Laboratory Manual, Cold Spring Spring Harbor Press; Sambrook a kol. A Laboratory Manual (2. vydanie) zv Ausubel a kol., Biology Greene Brooklyn, NY alebo Ausubel a kol.

(1982) Molecular Cloning, Harbor Laboratory, Cold (1989) Molecular Cloning:

až 3, CSH Press, NY; Publishing Associates, (1987 a doplnky) Current

Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York.

Dostupné sú tiež chemické sekvenačné metódy, napríklad sekvencovanie podlá Maxama a Gilberta.

V. Rekombinantný gén DC

Poly(A)⁺ RNA sa izoluje z vhodnej bunkovej populácie, napríklad pomocou súpravy FastTrack mRNA (Invitrogen, San Diego, CA) . Vzorky sa podrobia elektroforéze, napríklad v 1 % agarózovom géli, s obsahom formaldehydu a prenesú sa na membránu GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA) . Uskutoční sa hybridizácia napríklad pri 65 °C v 0,5 M NaHPO₄, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA a 1 % BSA (frakcia V) s génovou cDNA DC, značenou ³²P-dCTP, s koncentráciou 10⁷ cpm/ml. Po hybridizácii sa filtre premyjú 3 krát pri 50 °C v roztoku 0,2 x SSC, 0,1 % SDS a exponujú sa na film počas 24 h.

Rekombinantný gén sa môže použiť na vytvorenie próby na detegovanie správy. Inzert sa môže vyrezať a použiť pri detekciách, opísaných vyššie.

VI. Expresia proteínu, kódovaného génom DC, v E. coli

Na prípravu konštruktu, ktorý obsahuje otvorený čítací rámec, výhodnejšie v spojení s patričným promótorom, selekciou a regulátorovými sekvenciami,. sa používa PCR. Vznikajúci t

expresný plazmid sa transformuje do zodpovedajúceho kmeňa E. coli, napríklad Topp5 (Stratagene, La Jolla, CA) . Transformanty, rezistentné k ampicilinu (50 pg/ml), sa pestujú v médiu Luria Broth (Gibco) pri 37 °C až dovtedy, keď dosiahne absorbancia pri 550 nm hodnotu 0,7. Rekombinantný proteín je indukovaný 0,4 mM izopropyl-bD-tiogalaktopyranozidom (Sigma, St. Louis, MO) a inkubácia buniek pokračuje pri 20 °C ďalších 18 h. Bunky z 1 1 kultúry sa odstredia a resuspendujú napríklad v 200 ml ľadom chladeného roztoku 30 % sacharózy, 50 mM Tris HCI pH 8,0, 1 mM kyseliny etyldiamíntetraoctovej. Po 10 min. v ľade sa pridá také množstvo ľadom chladenej vody, že konečný objem je 2 1. Po 20 min. v ľade sa bunky odstredia a supernatant sa vyčíri pomocou filtrácie cez 5 μΜ Millipak 60 (Millipore Corp., Bedford, MA).

Rekombinantný proteín sa purifikuje štandardnými purifikačnými technikami, napríklad rôznymi iónovo výmennými chromatografiami.

Tiež sa môžu použiť imunoafinitné techniky s použitím protilátok, ktoré sú opísané nižšie. Afinitné metódy sa môžu použiť tam, kde je epitop zapojený do expresného konštruktu.

VII. Mapovanie ludských génov DC

Izolácia DNA, štiepenie reštrikčnými enzýmami, elektroforéza v agarózovom géli, prenos Southern blotom a hybridizácia sa uskutočnia podlá štandardných techník. Viď. Jenkins a kol. (1982) J. Virol. 43: 26 až 36. Bloty sa môžu uskutočniť na nylonovú membránu Hybond-N (Amersham) . Próba sa označí ³²P-dCTP, premytie sa uskutoční až do dosiahnutia konečných hodnôt, napríklad 0,1 X SSC, 0,1 % SDS, 65 ’C.

S PCR sa môže tiež kombinovať panel hybridných myších somatických buniek BIOS Laboratories (New Haven, CT) . Viď. Fan a kol. (1996) Immunogenetics 44: 97 až 103.

Chromozomálna lokalizácia u Stanford G3 panelu dávala ako najbližšiu značku SHGC-12041 s hodnotou pre väzbu (lod) 7,7. Táto značka, čo je gén, kódujúci antigén M130, je umiestnená na chromozóme 12pl3. Toto miesto je hostiteľom radu génov, kódujúcich receptory rodiny lektínov C-typu, najmä CD69 a rodiny receptorov NK.

VIII. Analýza jednotlivých variácií

Na vzorkovanie od jednotlivcov sa podľa údajov, ktoré sa týkajú distribúcie, vyberie vo veľkom množstve sa vyskytujúci, ľahko dostupný typ buniek. Pomocou PCR techník sa analyzuje obsah tohto génu u širokej populácie jednotlivcov. cDNA alebo iné spôsoby PCR sa používajú na sekvencovanie zodpovedajúceho génu v rôznych jednotlivcoch a ich sekvencie sa porovnávajú. To naznačuje mieru rozdielnosti medzi rasovo rozdielnými alebo inými populáciami, aj stanovenie toho, ktoré zvyšky sa môžu modifikovať bez toho, aby došlo k významnejšiemu ovplyvneniu ich funkcie.

IX. Príprava protilátok

Rekombinantné DC proteíny sa vyrábajú expresiou v E. coli, čo je ukázané vyššie, a testujú sa ich biologické aktivity. Prirodzené zdroje proteínov sa môžu tiež použiť pri vhodných purifikačných postupoch. Protilátky sa môžu použiť pri imunopurifikácii alebo pri sledovaní separačných postupov. Na imunizáciu vhodných cicavcov sa môžu použiť aktívne alebo denaturované proteíny s cieľom pripraviť polyklonálne sérum alebo monoklonálne protilátky.

X. Izolácia náprotivkov génov DC z primáta alebo hlodavca

Klony ľudskej cDNA, kódujúce tieto gény, sa použijú ako próby alebo na navrhnutie PCR primérov preto, aby sa našli náprotivky vo rôznych druhoch primáta, napríklad šimpanza.

Bioinformatika vyberá pomocou predpovedanej polypeptidovej sekvencie DCMP1 (tblastn algoritmus) z EST databáz (GenBank dbEST) zodpovedajúce myšie klony, kódujúce proteín, ktorý je homológny s DCMP1 primáta. Našli sa 4 klony, ktoré zodpovedajú tejto sekvencii: AA387662 Ko myšieho embrya 115dpc; AA170532 z myšej sleziny; AA475012 z myšej mliečnej žľazy a AA423158 z myšej mliečnej žľazy. Jeden z nich, AA170532, ktorý bol na základe sekvenčnej analýzy definovaný ako celý kloň, sa vybral a sekvencovala sa u neho DNA. Tento kloň obsahuje charakteristické znaky, podobné ako má DCMP1. Celý kloň má veľkosť 1418 bp, okrem poly-A sekvencie a obsahuje 5'UTR s veľkosťou 278 bp. Rovnako ako pre hDCMPl nenachádza sa predpokladaný štartovací kodón pred konsezuálnou Kozák oblasťou, ale tento kodón sa nachádza za stop kodónom, ktorý je v upstream oblasti. 5'UTR obsahuje sekvencie, podobné signálom pre rýchlu degradáciu vrátane troch konsezuálnych miest ATTTA. Je pozorovaná významná polyadenylačná sekvencia. Predpovedaný polypeptid je dlhý asi 238 zvyškov a kóduje membránový proteín typu II s ITIM doménou a s lektínovou doménou C-typu. Boli zistené 3 silné N-glykozylačné miesta. Porovnanie tohto a ľudského proteínu ukazuje asi 54 % identitu, 65 % homológiu celej sekvencie. Najmä ITIM domény sú vysoko konzervatívne (13 z 15 zvyškov je identických). Predmetom záujmu je konzervatívny glutamínový motív v blízkosti membrány (FQKYSQLLE) a cysteínový zvyšok, ktorý sa môže príležitostne začleniť do tvorby disulfidového mostíka. Rovnako tiež lektínové domény C-typu ukazujú konzervatívne bloty vrátane EPS motívu. Rozdiely, pozorované medzi hDCMPl a ľudskými pečeňovými lektínmi, sú pozorované aj v myšej sekvencii, najmä nahradenie tryptofánu v pozícii 119 a 163; glutamínu v pozícii 177 a serínu namiesto tryptofánu v pozícii 228. Tento kloň sa teda ukazuje ako myší homológ hDCMPl.

XI. Použitie činidiel na analýzu bunkových populácii

Detekcia hladiny dendritických buniek, prítomných vo vzorke, je dôležitá na diagnostikovanie neobvyklých stavov ochorenia. Napríklad zvýšenie počtu dendritických buniek v tkanive alebo lymfatickom systéme môže naznačovať prítomnosť hyperlazie DC alebo odhojenie tkaniva alebo štepu. Populácia s malým počtom DC môže naznačovať abnormálnu reakciu napríklad na bakteriálnu alebo vírusovú infekciu, čo môže vyžadovať zodpovedajúcu liečbu, ktorá vedie k normalizácii odozvy DC.

Na stanovenie počtu DC, prítomných v zmesi buniek, napríklad PBMC, adherentných buniek a pod. je použitá prietoková cytometria pomocou značených väzbových činidiel, špecifických pre povrchové DC proteíny, viď. napríklad Melamed a kol. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY a Robinson a kol. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY. Väzbové činidlo sa tiež používa na histologickú analýzu tkanivových vzoriek, čerstvých alebo fixovaných, s cieľom analyzovať infiltráciu DC. Môžu sa stanoviť tiež odlišné bunkové populácie a to pri stanovení, počas ktorého dochádza k zničeniu bunky alebo v určitých stanoveniach, keď si bunky zachovávajú životaschopnosť.

Analýza prítomnosti rozpustných intracelulárnych molekúl sa uskutoční napríklad s fluorescenčným väzbovým činidlom, špecifickým pre DC ako opisuje Openshaw a kol. (1995) J. Exp. Med. 182: 1357 až 1367. Môžu sa tiež použiť spôsoby, ktoré fixujú tkanivo alebo bunky.

Hladiny transkriptov sú kvantifikované napríklad pomocou semikvantitatívnej PCR, opísanej v Murphy a kol. (1993) J.

Immunol. Methods 162:.211 až 223. Priméry sú navrhnuté tak, že genómová DNA nie je detegovaná.

XII. Rozloženie expresie

Analýza celej sekvencie cDNA DCMP1 v databáze sekvencií odhalila profil expresie, obmedzený na určitý počet knižníc. Najvyšší počet sekvencií (desať) bol zistený v knižniciach dendritických buniek, štyri sekvencie v knižnici osteoklastomických buniek a po jedinej sekvencií v knižniciach makrofágov, vytvorených in vitro z monocytov, neurofilov aktivovaných LPS, chondrosarkómu, malígneho nádoru hrubého čreva, T-buniek lymfómy, kožného nádoru a chronickej synovitídy. V GenBank dbEST boli zistené štyri klony: AA418441, odčítaný z knižnice; AA446401, celý plod; AA677149, slezina pečene plodu; CO1555, povahy ľudského génu; AA380065, kožný nádor.

Analýza expresie DCMP1 pomocou RT-PCR u radu rôznych bunkových línií a čerstvo izolovaných buniek ukazovala, že expresia DCMP1 nie je detegovaná v TF1 (myeloidný prekuzor), Jurkat (línia T buniek), CHA (malígny nádor obličiek), MRC5 (fibroplasty pľúc zárodku), JY (línia B buniek), U937 (línia buniek myelo-monocytického lymfómu), ale je obmedzená na krvotvorné bunky. U čerstvo izolovaných buniek sa expresia pozorovala v aktivovaných aj neaktivovaných DC; v aktivovaných granulocytoch; aktivovanej aj neaktivovanej PBL a v nízkych hladinách sa pozorovala v aktivovaných monocytoch a aktivovaných B bunkách. Všetky aktivované vzorky boli bunky, ošetrené PMA/ionomycínom počas 1 a 6 h.

Ďalšia analýza ukazovala, že expresia DCMP1 závisí na aktivačnom stave bunky. Na detekciu expresie DCMP1 v rôznych štádiách aktivácie sa tiež použila RT-PCR. B bunky, izolované z tenzilárneho tkaniva, sa ošetrovali PMA/ionomycínom počas 1 alebo 6 h alebo sa 3, 12 a 24 h spoločne kultivovali s L bunkami, exprimujúcimi CD40L. mRNA sa detegovala v neaktivovaných bunkách. K strate tejto expresie môže prísť po 1 h pôsobenia systému PMA/ionomycín a po 3 h pôsobenia CD40L. Naopak žiadna expresia sa v T bunkách nezistila ani po inkubácii s anti-CD3/anti-CD28.

V bunkách, odvodených od CD34+, sa v prítomnosti M-CSF zistila veľmi silná expresia DCMP1 v makrofágoch, ktoré pochádzajú z CD34+ progenitorových buniek. Nezdalo sa, že by táto expresia mala byť v dôsledku pôsobenia PMA/ionomycín zmenená. V DC, odvodených od CD34+ progenitorových buniek v prítomnosti GM-CSF a TNFa, sa pozorovalo, že sa hladina mRNA líši podľa časového priebehu kultúry, pričom vyššie množstvá mRNA sa detegovali 12. deň kultúry. Po 48 h spoločnej kultivácie s L bunkami, ktoré nesú CD40L, sa expresia DCMP1 stratila. U DC, in vitro vybraných 6. deň pomocou FACS pre prítomnosť značiek CDla/CD14 a kultivovaných ďalej počas 6 dní, sa detegovalo viac mRNA v subpopulácii CD14 ako v CDla. Táto expresia bola znížená pôsobením PMA/ionomycínu.

V monocytoch, izolovaných z krvi, nebola v neaktivovaných bunkách detegovaná žiadna mRNA. Avšak expresia DCMP1 bola detegovaná po 6 h pôsobenia PMA/ionomycínu. V DC, získaných z monocytov pomocou GM-CSF a IL-4, bola zvýšená expresia DCMP1. Táto expresia by sa nemala pôsobením PMA/ionomycín zmeniť, ale mohla by sa znížiť spoločnou kultiváciou s L bunkami, exprimujúcimi CD40L. V prípade DCMP1 sa expresia mRNA úplne stratila počas 24 h. Expresia ľudského proteínu sa potvrdila pomocou detekcie protilátkou.

DCMP1 bol exprimovaný v podskupinách DC, izolovaných ex vivo. Podskupiny DC, izolované z krvi alebo tonzilárneho tkaniva, boli charakterizované na základe prítomnosti alebo neprítomnosti integrínu CDllc. Larson a Springer (1990) Immunol. Rev. 114: 181 až 217. CDllc+ podskupina DC, izolovaná z krvi (tiež známa ako GCDC) exprimuje DCMP1. Avšak po aktivácii prostredníctvom protilátky anti-CD40L alebo pôsobením PMA/ionomycín nebola detegovaná žiadna mRNA. Naopak rovnaká podskupina buniek, izolovaných z tonzilárneho tkaniva dlhšie neexprimuje DCMP1. V prípade CDllc-DC podskupiny je v bunkách, izolovaných z krvi, zistená nízka hladina expresie. Táto expresia je vyššia v bunkách, izolovaných z tonzilárneho tkaniva, ale opäť je pri aktivácii prostredníctvom anti-CD40 protilátky alebo pôsobením PMA/ionomycín znížená. Langerhansove bunky, izolované z kože, exprimujú DCMP1, zatiaľ čo okolité bazálne bunky nie.

XIII. DCMP1 z primáta.

Sekvenčná analýza naznačuje, že DCMP sú členmi lektin/azialoglykoproteínovej superrodiny receptorov. Konkrétne pečeňové a makrofágové lektíny sú spojené s internalizáciou proteínov a peptidov, ktoré môžu byť dôležité napríklad pri prijatí a prezentácii antigénu dendritickými bunkami. DCMP1 obsahuje internalizačný motív (YxxV) alebo motív podobný ITIM (IxYxxV; zvyšky 5 až 10 v SEQ ID č. : 2 a predĺženejší motív, ktorý začína od zvyšku 1 do zvyšku 24) . Toto naznačuje, že proteín môže byť verzia dendritickej bunky z rodiny inhibičných receptorov (KIR, LIR a pod.), ktoré vysielajú negatívny signál pre inhibíciu bunkovej funkcie.

Predpokladaný otvorený čítací rámec začína okolo nukleotidu 242. Tento eventuálny štartovací kodón nie je v zhodnej Kozák sekvencií, ale pretože nie uvedený alternatívnym ATG a pretože stop kodón existuje v upstream pozícii 200, predpokladá sa, že toto je štart kódovaného proteínu. Z tejto sekvencie bol predpovedaný polypeptid, ktorý sa skladá z asi 237 aminokyselín. Nebol detegovaný žiadny peptidový signál, ale predpokladaná transmembránová sekvencia siaha od pozícií asi 386 do pozície 443. Tento kloň kóduje membránový proteín typu II s lektínovou doménou C-typu. 3'UTR obsahuje rad potenciálnych signálov na rýchlu degradáciu vrátane troch opakovaní zhodnej sekvencie ATTTA. Nebol detegovaný žiadny polypeptidový signál, ale pravdepodobné transmembránové sekvencie sa nachádzajú od pozícií 45 do 62 alebo tiež 386 až 443. Tento kloň kóduje membránový proteín typu II s lektínovou doménou C-typu.

Polypeptid, predpovedaný na základe sekvenčnej analýzy, má 49 aminokyselinových intracelulárnych domén, ktoré zahŕňajú motív na báze tyrozínu, umiestnený v strede zvyšku 7. YXX(L/V) motívy tohto pôvodu boli ukázané ako také, ktoré v prípade pečeňových lektínov a DC23 (Fce Rlla) pracujú ako internalizačné motívy. Tento typ domény bol ukázaný ako typ, ktorý pracuje ako aktivačný (ITAM) alebo inhibičný (ITIM) motív v molekulách ako je Ly49, NKG2A a rodina molekúl KIR, podobných imunoglubolínom. Inhibícia je sprostredkovaná doplnením SHP2/SHIP fosfatáz do zhodnej domény (I/VJXYXX(L/V).

Prvých 15 aminokyselín DCMP1 vykazuje nemennosť voči predĺženej ITIM doméne a zdá sa, že inhibícia bunkovej funkcie je jednou z vlastností DCMP1. Jediné potenciálne Nglykozylačné miesto je prítomné v pozícii asi 185.

Porovnanie aminokyselinovej sekvencie lektínovej domény C-typu u DCMP1 a ostatných proteínov, ktoré obsahujú lektínové domény C-typu ukázalo, že DCMP1 vykazuje najväčšiu homológiu s pečeňovými lektínmi a makrofágovými lektínmi (viď. tab. 1) . Nemenné cysteínové zvyšky zvinutého lektínu C-typu sú nemenné medzi členmi tejto rodiny, avšak sa môže pozorovať rad odlišných znakov. Rovnako ako pečeňové lektíny má DCMP1 na začiatku lektínovej domény dvojitý cysteínový motív. Funkcia tohto doplnkového cysteínu je neznáma, aj keď v lektínovej doméne zjavne nie je žiadny ďalší cysteín, ktorý môže s týmto zvyškom tvoriť disulfidový mostík. Je možné, že sa tento zvyšok môže zahrnúť do tvorby intermolekulárnych disulfidových mostíkov, aj keď v DCMP1 je v pozícii 91 ďalší cysteín, ktorý pravdepodobne vykonáva túto funkciu. N-koncová časť lektínovej domény DCMP1 ukazuje najvyššiu nemennosť u pečeňových lektínov a makrofágových lektínov. Doména, ktorá viaže vápnik, je v DCMP1 konzervatívna a vykazuje najvyššiu homológiu s CD23 vrátane EPS motívu (zvyšky 195 a 197), glutamátu (E) v pozícii 201 a asparagínaspartátu (ND) v pozícii 2Ϊ8 až 219. Tieto motívy preukázateľne neexistujú v NK receptoroch (NKGE tu ukázané) a CD94.

DCMP1 je membránový proteín typu II s predpovedaným transmembránovým úsekom, ktorý sa nachádza asi od zvyšku 45 do 62. To sa týka rodiny proteínov, ktorá zahŕňa azialoglykoproteínové receptory, pečeňové lektíny, CD69, CD72, CD23 a NK receptory. Tento proteín obsahuje na karboxylovom konci (od zvyškov 104 do 237) extracelulárnu Ca-dependentnú lektínovú doménu C-typu, ktorá vykazuje motívy, charakteristické pre špecifitu cukrových zvyškov. Viď. tab. 1. Tieto proteíny sa väčšinou viažu na sacharidové zvyšky glykoproteínov a sú zahrnuté v primárnej imunitnej odozve. U niekoľkých členov tejto rodiny, najmä CD69, u NK receptorov a

CD72 sa preukázalo,. že prenášajú signál počas bunkovej aktivácie vrátane rozmnožovania a indukcie špecifických génov.

DCMP1, rovnako ako myší KIR receptor lektinov C-typu, Ly49, obsahuje internalizačný motív so zvýšenou homológiou so skupinou inhibičných receptorov (ITIM doména, viď. súčasné súhrnné publikácie Vivier a Daeron (1977) Immunology Today 18: 286 až 291 a Katz a Austen (1977) J. Immunol. 458: 5065 až 5070). Tieto receptory, buď patriace do superrodiny imunoglobulínov (IgSF) alebo lektíny C-typu, prenášajú negatívny signál cez SH2-doménu, s obsahom fosfatázy, napríklad SHIP, SHP-1 a SHP-2. Dôkazy svedčia o tom, že tieto receptory sa spájajú s ďalšími aktivačnými receptormi s cielom blokovať aktivačné signály. Dôkazy tiež svedčia o tom, že ligandom pre tento typ molekuly je molekula IgSF. Ako príklady sa môžu uviesť molekuly MHC triedy I (rozpoznávané CD94/NK receptormi a Ly-49) a FcgR (CD23; ktorý rozpoznáva IgG) .

Cysteínový zvyšok 91 je pravdepodobne začlenený v disulfidovom spojení s ďalším polypeptidom, asi homo alebo heterodimérom.

PCR naznačuje, že gén je exprimovaný v aktivovaných dendritických bunkách a neaktiyovaných dendritických bunkách. Detegovateľné signály neboli zistené v žiadnych TF1 (línia krvotvorných buniek), Jurkat (línia T buniek), MRC5 (línia fibroplastových buniek sarkómu pľúc), JY (línia B buniek), U937 (línia pre-monocytových buniek) alebo CHA (bunková línia karcinómu) bunkách. Pozitívne signály boli detegované v čerstvo izolovaných aktivovaných alebo neaktivovaných PBL a granulocytoch a len slabé signály v čerstvo izolovaných T bunkách, B bunkách, NK bunkách alebo monocytoch.

Sekvenčná analýza naznačuje expresiu génu vo vzorkách, charakterizovaných ako dendritické bunky, aktivované neutrofily, makrofágy (aktivované GM-CSF), osteoklastóm, kožný nádor, lymfóm T-buniek, malígny nádor hrubého čreva, chronická synovitída a chrondrosarkóm.

XIV. Náprotivok DCMP1 u hlodavca

Tab. 2 ukazuje sekvenciu náprotivkových sekvencií u hlodavca

Tab.2: Sekvencia ukazuje homológiu s dvomi EST myši, W33446 (viď. SEQ ID č.: 11) a AA170532 (viď. SEQ ID č.:8), ktoré kódujú náprotivok DCMP1 u myši (viď. SEQ ID č.: 8).

hDCMPl MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTÄSSAASKERTÄPLKSNTGFPKLLCÄSL W33446 ..................................................

170532 MÄSEITYAEVKFKNESNSIJÍTYSESPAAPREKPIRDLRKPGSPSLLLTSL mDCMPl MASEITYAEVKFKNESNSLHTYSESPAAPREKPIRDLRKPGSPSLLLTSL hDCMPl LIFFLLIAISFFIAFVIFFQKYSQLLB - KKľTTKELVHTTIjECVKKNMPVE W33446 ..........................E-KMIIKELNYTELECTKWASLLE

170532 MUXIXIAXTFLVAFXIYFQKYSQLLEEKKAAKNXM mDCMPl MLLLLLIAITFLVAFIIYFQICYSQLLEEKKAAXNIMHNEtNCTKSVSPME hDCMPl ETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTE - -SASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQ W3 3 4 4 6 DKVWSCCPKDWKPFGS YCYFTSTD - LVASWNESKENCFHMGAHLWIHSQ mDCMPl DKVWSCCPKDWRLFGSHCYLVPTVSSSASWNKSEENCSRMGAHLWXQSQ hDCMPl EEQDFX FQNLQEESAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPS

W3344G EEQ mDCMPl EEQDFITGILDTHAAYFIGLWD -TGHRQWQWVDQTPYEESXTFWHNGEPS hDCMPl DPNERCWLNFR-KSPKRWGWNDVNCLZJPQRSVCEMMKIHL mDCMPl SGNKKCATIIYRWKT- -GWGHNDISCSLKQKSVCPMKKINL

XV. DCMP2 z primáta

DCMP2, predpokladaný azialoglykoproteínový receptor, je transmembránový proteín typu II. Vo svojej extracelulárnej oblasti má DCMP2 jednu doménu, ktorá rozpoznáva sacharid (CRD), ktorá je charakterizovaná pre rodinu lektínov C-typu (Ca++ dependentná) (viď. Drickamer a Taylor (1993) Ann. Rev.

Celí. Biol. 9: 237 až 264). DCMP2 vykazuje značnú homológiu s dvomi génmi (Hl a H2), ktoré kódujú podjednotky ľudského pečeňového azialoglykoproteínového receptora. Stockert (1995)

Physiol. Revs. 75: 591 až 609. Tieto pečeňové receptory reprezentujú prototyp II typu Pečeňový ASGPR má väzbovú glykoproteíny s koncovými členov rodiny lektínov C-typu. špecifitu pre dezialylované galaktozylovými zvyškami a sprostredkováva ich endocytózu do hepatocytov cez jamky, potiahnuté klatrínom. Najmä znaky, spojené s obidvomi týmito funkciami, sú medzi pečeňovými ASGPR a DCMP2 nezameniteľné.

DCMP2 teda obsahuje intracelulárny motív vrátane tyrozínového

- 67 zvyšku v pozícii 5,- ktorý súvisí s kapacitou ligandu pre endocytózu. Viď. Furher a kol. (1991) J. Celí. Biol. 114: 423 až 431. Ďalej má DCMP2 vo svojej doméne na rozpoznanie sacharidov sekvenciu QPD (Gln-Pro-Asp), rozpoznávajúcu galaktózu (Drickamer (1992) Náture 360: 183 až 186).

Izolovalo sa niekolko variantov klonov cDNA, kódujúcej DCMP2, najpravdepodobnejšie ako následok alternatívneho zostrihu. Podľa toho sú opísané tri varianty: krátka forma, dlhá forma a tretia forma, označená ako DCMP2v. Viď. SEQ ID č. : 4 a 10, tab. 1. Krátka a dlhá forma sa líšia prítomnosťou zvláštneho inzertu 27 a v extracelulárnej oblasti krátkej formy klonu. Krátka forma DCMP2 vykazuje v extracelulárnej oblasti, v porovnaní s nedávno klonovaným ASGPR, ktorý bol získaný z ľudských makrofágov (M-ASGPR), rozdiely v 4 zvyškoch. Suzuki a kol. (1996) J. Immunol. 156: 128 až 135.

V prípade DCMP21 neobsahuje ASGPRm úsek, ktorý zodpovedá GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP (zvyšky 118 až 144 v SEQ ID č.: 4) a obsahuje inzert GEE (medzi zvyškami 173 a 174 v SEQ ID č.:

4) . DCMP2s je totožný s DCMP21, až na neprítomnosť

GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP (zvyšky 118 až 144 v SEQ ID č.: 4) a až na rozdiel v sekvencií . a to v nukleotide 1064, kde f namiesto G je A, čím je kódovaný skôr asn ako asp. DCMPv je podobný DCMPs, ale nemá sekvenciu LLQRLRSGP(£HLLLSLGLG (zvyšky 30 až 48 v SEQ ID č.: 4), ktorá zodpovedá významnému podielu transmembránového segmentu a obsahuje inzert GEE (medzi zvyškami 173 a 174 v SEQ ID č.: 4), ktorý bol zistený aj v

ASGPRm. Predmetom záujmu sú tiež oblasti, ktoré sa nachádzajú okolo týchto rozdielov, napríklad v rámci častí epitopu, napríklad 12. až 17. aminokyselina.

Je dostupná rekombinantná dlhá forma proteínu DCMP2 a boli pripravené mABs (monoklonálne protilátky). Z dôvodu stabilnej expresie dlhej aj krátkej formy bola ďalej transfektovaná línia myších buniek.

Gén bol pôvodne izolovaný z CDla⁺DC (čistota asi 70 %), odvodených od CD34+ krvotvorných progenitorových buniek, kultivovaných v GM-CSF a TNFa (Caux a kol. (1992) Náture 360:

258 až 261) . Kloň, bol inzertovaný do vektora pSportl (Notl/Sall reštričkné miesta).

PCR analýza naznačuje expresiu dendritických bunkách a možno velmi bunkách (línia krvotvorných buniek). signál nebol zistený v prípade Jurkat génov pre DCMP2 v malú expresiu v TF1

Žiadny detegovatelný (línia T buniek), CHA (línia karcinómových buniek), MRC5 (línia buniek fibroplastového sarkómu plúc) alebo JY (línia B buniek). Signál bol detegovatelný v čerstvo izolovaných neaktivovaných alebo aktivovaných (PMA a ionomycín) dendritických bunkách, granulocytoch a neaktivovaných alebo aktivovaných PBL. Signál nebol zistený v monocytoch, neaktivovaných alebo aktivovaných T bunkách alebo v neaktivovaných alebo aktivovaných B bunkách.

DC-ASPGR vykazuje významnú homológiu s myším náprotivkom ľudského monocytového ASGPR (M-ASGPR). Homológia je výrazná (približne 60 %) u domény, rozpoznávajúcej sacharid, ktorá udeľuje špecifitu myšiemu monocytovému ASGPR pre galaktózu a N-acetylqalaktozamín (GalNAc). Sato a kol. (1992) J. Biochem.

i 111: 331 až 336. Je tu zahrnutý QPD motív, tiež nájdený v Hl a H2 podjednotkách pečeňového ASGPR. Ďalej myši monocytový ASGPR má vo svojej cytozolickej doméne internalizačný signál YENL.

Myší M-ASGPR funguje ako receptor pre endocytózu galaktozylovaných glykoproteinov (Ozaki a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267: 9229 až 9235) a umožňuje rozpoznávanie malignych buniek tumoricídnymi makrofágmi (Kawakami a kol. (1994) Jpn. J. Cancer Res. 85: 744 až 749). V tejto súvislosti sa zistilo, že myší M-ASGPR je exprimovaný v pľúcnych metastatických uzloch myší, ktoré nesú metastatické ovariálne nádorové bunky OV2944-HM-1 (Imai a kol. (1995) Immunol. 86: 591 až 598). Sledovaný ludský M-ASGPR vykazuje významnú špecifitu pre Tn antigén (Suzuki a kol. (1996) J. Immunol. 156: 128 až 135), ktorý nesie zväzok serínom alebo treonínom pripojených koncových GalNAc a je spojený s ľudskými karcinómami (Springer (1989) Mol. Immunol. 26: 1 až 5 a Firntoft a kol. (1990) Int. J. Cancer 45: 666 až 672).

Na základe homológie sekvencií sa môže predpovedať, že DCMPs tiež hrá úlohu ako endocytový receptor pre galaktozylované glykoproteiny. Ďalej, internalizácia ligandu cez manózový receptor, ďalší transmembránový endocytový lektín C-typu, spôsobuje vysoko účinnú prezentáciu antigénu DC prostredníctvom cesty, ktorá zahŕňa MHC triedy II. Celia a kol. (1997) Current Opinion Immunol. 9: 10 až 16. Analogicky je možné, že DCMPs hrá podobnú úlohu pri smerovaní internalizovaných ligandov do prezentácie antigénu.

DCMP2 tak môže byť potenciálnym, vysoko účinným cieľom na zavádzanie antigénov do DC, aby sa v terapii, fungujúcej na báze imunity, zvýšila prezentácia T bunkám. K tomuto je možné sa priblížiť pulzáciou DC in vitro galaktozylovanou formou antigénu alebo monoklonálnymi protilátkami proti DCMP2, naviazanými na antigén. Účinnosť prezentácie in vitro sa môže stanoviť prostredníctvom aktivácie T-buniek, špecifických pre antigén. Toto by sa malo vzhľadom na podstatné terapeutické perspektívy tohto prístupu zamerať na prezentáciu antigénov, ktoré súvisia s nádorom (TAA). Predmetom záujmu sú konkrétne TAA spojené s malígnym melanómom.

Ďalej špecifita ľudského M-ASGPR pre Tn antigén robí tento karcinómový TAA kanditátom voľby na zacielenie DCMP2.

Nedávno bolo ukázané, že exogénny antigén sa môže spracovať a prezentovať počas cesty cez MHC triedy I. Viď. Porgador a Gilboa (1995) J. Exp. Med. 182: 255 až 260; Paglia a kol. (1996) J. Exp. Med. 183: 317 až 322. V DC pravdepodobne vykonávajú túto funkciu špecializované receptory.

Tieto receptory v DC sa môžu zamerať na pomoc pri produkcii TAA-špecifických cytotoxických T buniek (CTL), čo má veľký terapeutický význam, pretože ako sa zdá, sú CTL začlenené v indukcii rejekcie tumoru.

XVI. Internalizácia DCMP

DC, získané z CD34+ progenitorov, kultivovaných v GM-CSF a TNFa, sa nechali pri 4 °C s monoklonálnou protilátkou proti

DCMP2 mAB alebo s protilátkou proti CD13 ako kontrolou. Po následnej inkubácii pri 37 °C počas až asi do 20 min., sa analyzovali povrchovo viazané protilátky. Internalizácia sa pozorovala ako pokles fluorescencie bunkového povrchu.

ΊΟ

DCMP21 je rýchlo internalizovaný pri 37 °C, ale nie pri °C. Približne 60 % povrchovej značky zmizne počas asi 15 min. To ukazuje, že DCMP2 môže hrať úlohu ako endocytový receptor, čo je v súlade s prítomnosťou internalizačného motívu (YENF) v jeho intraplazmatickej doméne.

XVII. Izolácia väzbového náprotivka

DC proteín sa môže, vzhladom k špecifite jeho väzby, používať ako špecifické väzbové činidlo, takmer rovnako ako bola použitá protilátka. Väzbové činidlo je buď značené, ako je opísané vyššie, napríklad fluorescenciou alebo inak, alebo môže byť imobilizované na substrát afinitnými spôsobmi.

DC proteín je použitý na testovanie bunkovej vykazuje uvedenú väzbu. Na detekciu alebo intracelulárneho alebo povrchového exprimovaného použijú štandardné afinitných techník transformované bunky, uskutočňuje rôznymi postupmi. Viď. tiež Mc. až 2832.

detekčné 1 testujú Testovanie detekčnými Mahan a techniky alebo povrchy, ktoré ‘ intracelulárnej alebo línie, ktorá vytriedenie ligandu sa sa pomocou exprimujú expresie sa imunofluorescenčnými kol. (1991) EMBO J. 10: 2821 f

Napríklad: 0. deň najskôr potiahnuť 2-komorové permanoxové sklíčka 1 ml fibronektínu na komoru s koncentráciou 10 ng/ml v PBS, proces prebieha počas 30 min. pri teplote miestnosti. Jedenkrát prepláchnuť PBS. Potom dať COS bunky s koncentráciou 2 až 3 x 10⁵ buniek na komoru do 1,5 ml rastového média. Inkubovať cez noc pri 37 °C.

1. deň každej vzorky pripraviť 0,5 ml roztoku, s obsahom 66 mg/ml DEAE-dextránu, 66 mM chlorochinónu a 4 mg DNA v sére bez DME. Pre každú sadu je pripravená kontrola, napríklad ľudské receptor-FLAG cDNA v riedeniach 1 a 1/200 a negatívna imitácia. Premyť bunky sérom bez DME. Pridať roztok DNA a inkubovať 5 h pri 37 °C. Odstrániť médium a pridať na 2,5 min. 0,5 ml 10 % DMSO v DME. Odstrániť a jedenkrát premyť DME. Pridať 1,5 ml rastového média a inkubovať cez noc.

2. deň vymeniť médium. 3. alebo 4. deň sú bunky fixované a detegované. Premyť bunky dvakrát Hankovým pufrovaným fyziologickým rotokom (HBSS) a fixovať 5 min. v 4 % roztoku paraformaldehyd (PFA)/glukóza. Premyť 3 x HBSS. Potom, ako sa všetka kvapalina odstránila, sa môžu sklíčka skladovať pri -80 °C. Pre každú komoru sa nasledujúcim postupom uskutočnili inkubácie v 0,5 ml. Pridať roztok HBSS/saponin (0,1 %) s 32 ml/ml 1 M NaN3 na 20 min. HBSS/saponin. k bunkám a

HBSS/saponin. protilátku, protilátke,

Potom sa bunky 1 x premyjú roztokom Pridať proteín alebo komplex proteín/protilátka inkubovať

Ak je Pridať napríklad min. Premyť bunky to vhodné, pridať na sekundárnu protilátku Vector anti-mouse, v x roztokom min. prvú proti myšej riedení 1/200 a inkubovať počas 30 min. Pripraviť roztok pre ELISA, napríklad roztok chrenovej peroxidázy Vector Elite ABC horsereadish peroxidase a preinkubovať 30 min. Použiť napríklad 1 kvapku roztoku A (avidín) a 1 kvapku roztoku B (biotín) na 2,5 ml roztoku HBSS/saponin. Premyť bunky dvakrát roztokom HBSS/saponin. Pridať ABC HRP roztok a inkubovať 30 min. Premyť dvakrát bunky HBSS, druhé premytie počas 2 min., keď príde k uzavretiu bunky. Potom pridať kyselinu diaminobenzoovú (DAB) na obdobie 5 až 10 min. Použiť 2 kvapky pufra plus 4 kvapky DAB plus 2 kvapky H2O2 na 5 ml destilovanej vody. Opatrne odstrániť komoru a premyť sklíčko vo vode. Vysušiť na vzduchu niekoľko minút, potom pridať 1 kvapku Crystal Mount. Piecť 5 min. pri 85 až 90 °C. '

Na afinitnú purifikáciu alebo oddelenie buniek, ktoré exprimujú receptor, sa používajú tiež ďalšie monocytové proteínové väzbové činidlá. Viď. napríklad Sambrook a kol. alebo Ausubel a kol.

Inou stratégiou je testovanie membránovo viazaných receptorov afinitnou technikou. Receptorová cDNA je konštruovaná postupom, opísaným vyššie. Ligand sa môže imobilizovať a použiť na imobilizáciu buniek. Imobilizácia sa môže uskutočniť použitím zodpovedajúcich protilátok, ktoré rozpoznajú napríklad FLAG sekvenciu monocytového proteínového fúzneho konštruktu alebo použitím protilátok, vytvorených proti prvým protilátkam. Opakovateľné cykly selekcie a amplifikácie vedú k získaniu zodpovedajúcich klonov a k prípadnej izolácii klonov, ktoré exprimujú ligand.

Expresné fágové· knižnice sa môžu testovať monocytovým proteínom. Zodpovedajúce protilátky proti FLAG, zodpovedajúcich klonov.

techniky umožňujú značenia, špecifické napríklad značenie

Môže sa vytvoriť veľa modifikácii a variácií predkladaného vynálezu bez toho, že by došlo k odchýleniu od jeho podstaty a rozsahu, čo bude zrejmé odborníkom v danej oblasti techniky. Špecifické uskutočnenia, tu opísané, budú ponúkané len formou príkladov a vynález je limitovaný len termínmi v priložených nárokoch spolu s celým rozsahom ekvivalentov, ku ktorým sa tieto nároku vzťahujú.

Výklad sekvencii

SEQ ID č.: 1 je nukleotidová sekvencia génu pre DCMP1 z rodiny C-lektinov u primáta.

SEQ ID č.: 2 je polypeptidová sekvencia génu pre DCMP1 z rodiny C-lektinov u primáta.

SEQ ID č.: 3 je nukleotidová sekvencia génu pre DCMP2 z rodiny C-lektínov u primáta.

SEQ ID č.: 4 je polypeptidová sekvencia génu pre DCMP2 z rodiny C-lektínov u primáta.

SEQ ID č.: 5 je polypeptidová sekvencia pečeňového ASGPRhl u primáta.

SEQ ID č.: 6 je polypeptidová sekvencia pečeňového ASGPRh2 u primáta.

SEQ ID č.: 7	je nukleotidová sekvencia génu	pre DCMP1	z rodiny
C-lektínov u	hlodavca.
SEQ ID č.:	8 je	polypeptidová sekvencia	génu pre	DCMP1	z
rodiny C-lektínov u	hlodavca.
SEQ ID č.:	9 je	variant nukleotidovej	sekvencie	DCMP2	u
primáta.
SEQ ID č.:	10 je	variant polypeptidovej	^ekvencie	DCMP2	u

primáta.

SEQ ID č.: 11 je peptidová sekvencia z W33446 EST hlodavca.

Zoznam sekvencií (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ

(A)	MENO:	Schering Corporation
(B)	ULICA:	2000 Galloping Hill Road
(C)	MESTO:	Kenilworth
(D)	ŠTÁT:	New Jersey
(E)	KRAJINA:	USA
(F)	SMEROVACIE ČÍSLO: 07033
(G)	TELEFÓN:	(908) 298-5056
(H)	TELEFAX:	(908) 5388

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU:

Takmer čistý alebo rekombinantný polypeptid DCMP1 a DCMP2, fúzny proteín, väzbová zlúčenina, nukleová kyselina, kódujúca DCMP1 alebo DCMP2, expresný vektor, hostiteľská bunka pre expresný vektor a spôsob rekombinantnej prípravy polypeptidu (iii) POČET SEKVENCIÍ: 11 (iv) POČÍTAČOVÉ ÚDAJE: i (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: Power Macintosh (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: 8.1.0 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0.1 (v) SÚČASNÉ DÁTA PRIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA:

(vi) SKORŠIE DÁTA PRIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 60/053080 (B) DÁTUM PODANIA: 9. júla 1997 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 1:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍiŽKA: 1104 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) LOKALIZÁCIA: 242..952 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 1:

TTCTCACTAT ACTGGTCCTG AGGAAAGGGC TTCTGTGAAC TGCGGTTTTT	AGTTTTTATT	60
GTGGTTCTTA GTTCTCATGA GACCCCTCTT GAGGATATGT GCCTATCTGG	TGCCTCTGCT	120
CTCCACTAGT TGAGTGAAAG GAAGGAGGTA ATTTACCACC ATGTTTGGTT	CCTGTTTATA	180
AGATGTTTTA AGAAAGATTT GAAACAGATT TTCTGAAGAA AGCAGAAGCT	CTCTTCCCAT	240

286

T ATG ACT TCG GAA ATC ACT TAT GCT GAA GTG AGG TTC AAA AAT GAA Met Thr Ser Glu íle Thr Tyr Ala Glu Val Arg Phe Lys Asn Glu 15 10 15

TTC AAG TCC

TCA GGC ATC AAC ACA GCC TCT TCT GCA GCT TCC AAG GAG

334

Phe

Lys

Ser

Ser

Gly 20

íle Asn

Thr

Ala

Ser 25

Ser Ala

Ala f

Ser

Lys Glu 30

AGG

ACT

GCC

CCT

CTC

AAA

AGT

AAT

ACC

GGA

TTC

CCC

AAG

CTG

CTT

TGT

382

Arg

Thr

Ala

Pro

Leu

Lys

Ser

Asn

Thr

Gly

Phe

Pro

Lys

Leu

Leu

cys

35

40

45

GCC

TCA

CTG

TTG

ATA

TTT

TTC

CTG

CTA

TTG

GCA

ATC

TCA

TTC

TTT

ATT

430

Ala

Ser

Leu

Leu

íle

Phe

Phe

Leu

Leu

Leu

Ala

íle

Ser

Phe

Phe

íle

50

55

60

GCT

TTT

GTC

ATT

TTC

TTT

CAA

AAA

TAT

TCT

CAG

CTT

CTT

GAA

AAA

AAG

478

Ala

Phe

Val

íle

Phe

Phe

Gin

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu

Leu

Glu

Lys

Lys

65

70

75

ACT

ACA

AAA

GAG

CTG

GTT

CAT

ACA

ACA

TTG

GAG

TGT

GTG

AAA

AAA

AAT

526

Thr

Thr

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Thr

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

Lys

Asn

80

85

90

95

ATG

CCC

GTG

GAA

GAG

ACA

GCC

TGG

AGC

TGT

TGC

CCA

AAG

AAT

TGG

AAG

574

Met

Pro

Val

Glu

Glu

Thr

Ala

Trp

Ser

Cys

Cys

Pro

Lys

Asn

Trp

Lys

100

105

110

TCA

TTT

AGT

TCC

AAC

TGC

TAC

TTT

ATT

TCT

ACT

GAA

TCA

GCA

TCT

TGG

622

Ser

Phe

Ser

Ser

Asn

cys

Tyr

Phe

íle

Ser

Thr

Glu

Ser

Ala

Ser

Trp

115

120

125

CAA GAC AGT

GAG AAG GAC TGT GCT AGA ATG GAG GCT CAC CTG CTG GTG

670

Gin Asp

Ser 130

Glu

Lys Asp Cys

Ala Arg 135

Met

Glu

Ala

His 140

Leu

Leu Val

ATA

AAC

ACT

CAA

GAA

GAG

CAG

GAT

TTC

ATC

TTC

CAG

AAT

CTG

CAA

GAA

718

íle

Asn

Thr

Gin

Glu

Glu

Gin

Asp

Phe

íle

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Glu

145

150

155

GAA

TCT

GCT

TAT

TTT

GTG

GGG

CTC

TCA

GAT

CCA

GAA

GGT

CAG

CGA

CAT

766

Glu

Ser

Ala

Tyr

Phe

Val

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Gin

Arg

His

160

165

170

175

TGG

CAA

TGG

GTT

GAT

CAG

ACA

CCA

TAC

AAT

GAA

AGT

TCC

ACA

TTC

TGG

614

Trp

Gin

Trp

Val

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Asn

Glu

Ser

Ser

Thr

Phe

Trp

180

185

190

CAT

CCA

CGT

GAG

CCC

AGT

GAT

CCC

AAT

GAG

CGC

TGC

GTT

GTG

CTA

AAT

862

His

Pro

Arg

Glu

Pro

Ser

Asp

Pro

Asn

Glu

Arg

Cys

Val

Val

Leu

Asn

195

200

205

TTT

CGT

AAA

TCA

CCC

AAA

AGA

TGG

GGC

TGG

AAT

GAT

GTT

AAT

TGT

CTT

910

Phe

Arg

Lys

Ser

Pro

Lys

Arg

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

Val

Asn

Cys

Leu

210

215

220

GGT

CCT

CAA

AGG

TCA

GTT

TGT

GAG

ATG

ATG

AAG

ATC

CAC

TTA

952

Gly

Pro

Gin

Arg

Ser

Val

cys

Glu

Met

Met

Lys

íle

His

Leu

225

230

235

TGAACTGAAC

ATTCTCCATG AACAGGTGGT TGGATTCGTA

TCTGTCATTG TAGGGATAGA

1012

TAATAAGCTC

TTCTTATTCA TGTGTAAGGG AGGTCCATAG AATTTAGGTG GTCTGTCAAC

1072

TATTCTACTT ATGAGAGAAT TGGTCTGTAC AT

1104 (2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID č.: 2:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 237 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 2:

Met Thr Ser Glu 1

Lys Ser Ser Gly íle Thr Tyr Ala S íle Asn Thr Ala

Glu Val Arg Phe

Ser Ser Ala Ala

Lys Asn Glu Phe

Ser Lys Glu Arg

Thr Ala Pro 35

Leu Lys Ser Asn Thr Gly Phe Pro Lys 40

: Leu Leu Cys Ala 45

Ser

Leu

i Leu

íle

i Phe

! Phe

: Leu

Leu Leu

i Ala

i íle Ser Phe Phe íle

í Ala

50

55

60

Phe

Val

íle

Phe

Phe

Gin

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu

Leu

Glu

Lys

Lys

Thr

65

70

75

80

Thr

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Thr

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

Lys

Asn

Met

85

90

95

Pro

Val

Glu

Glu

Thr

Ala

Trp

Ser

Cys

Cys

Pro

Lys

Asn

Trp

Lys

Ser

100

105

110

Phe

Ser

Ser

Asn

Cys

Tyr

Phe

íle

Ser

Thr

Glu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

115

120

125

Asp

Ser

Glu

Lys

Asp

Cys

Ala

Arg

Met

Glu

Ala

His

Leu

Leu

Val

íle

130

135

140

Asn

Thr

Gin

Glu

Glu

Gin

Asp

Phe

íle

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Glu

Glu

145

150

155

160

Ser

Ala

Tyr

Phe

Val

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Gin

Arg

His

Trp

165

170

175

Gin

Trp

Val

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Asn

Glu

Ser

Ser

Thr

Phe

Trp

His

180

185

190

Pro

Arg

Glu

Pro

Ser

Asp

Pro

Asn

Glu

Arg

Cys

Val

Val

Leu

Asn

Phe

195

200

205

Arg

Lys

Ser

Pro

Lys

Arg

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

Val

Asn

Cys

Leu

Gly

210

215

220

j

Pro

Gin

Arg

Ser

Val

Cys

Glu

Met

Met

Lys

íle

His

Leu

225 230 235 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 3:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍŽKA: 1458 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) LOKALIZÁCIA: 257..1204 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: misc-znak (B) LOKALIZÁCIA: 608 (D) OSTATNÉ INFORMÁCIE: /pozn. = krátka forma nemá nukleotidy 608 až 673 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: misc-znak (B) LOKALIZÁCIA: 775 (D) OSTATNÉ INFORMÁCIE: /pozn. = ASGPRm (tab. 2) má inzert sekvencie, kódujúcej

GEE, medzi nukleotidmi 775 až 776 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: misc-znak (B) LOKALIZÁCIA: 1064 (D) OSTATNÉ INFORMÁCIE: /pozn. = nukleotid 1064

DCMP2s môže byť A, ktorý by mal vo zvyšku č. 270 kódovať asn skôr ako asp (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 3:

GTTGAGGAGA TGGGATGTCC CAGATGATAG GGCTCCTGGG ATTTCAGACC CAAGACCAGC' 60

AGGACTCCAG TCACCTCTAC CCCAGCTCTC CAGGACACAG CGCTCCCAAC TCTGAGTGAC120

GTCCCACCTC TGGTCCTTGC AGCACAACCA ACGTGGGAAT CACACCCTCC AGACCTCCCA180

CAGCTCCACC CCAGACTGGG CGCCGGCCCT GCCTCCATTT CAGCTGTGAC AACCTCAGAG '240 CCGTGTTGGC CCAAGC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC TTC CAG TAC TTG289

Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gin Tyr Leu

1510

GAG AAT Glu Asn

AAG GTG Lys Val 15

AAA Lys

GTC Val

CAG GGG TTT AAA AAT GGG CCA CTT

CCT CTC Pro Leu

337

Gin

Gly

Phe 20

Lys

Asn

Gly

Pro

Leu 25

CAG

TCC

CTC

CTG

CAG

CGT

CTC

CGC

TCT

GGG

CCC

TGC

CAT

CTC

CTG

CTG

385

Gin

Ser

Leu

Leu

Gin

Arg

Leu

Arg

Ser

Gly

Pro

Cys

His

Leu

Leu

Leu

30

35

40

TCT Ser 140

GTG Val

TGT GTC CCA GTT

CAT His

TCT Ser

GAA ATG CTC CTG CGA GTC CAG CAG

721

Cys Val

Pro Val 145

Glu

Met Leu Leu Arg Val Gin Gin

150

155

CTG

GTG

CAA

GAC

CTG

AAG

AAA

CTG

ACC

TGC

CAG

GTG

GCT

ACT

CTC

AAC

769

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Lys

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

160

165

170

AAC

AAT

GCC

TCC

ACT

GAA

GGG

ACC

TGC

TGC

CCC

GTC

AAC

TGG

GTG

GAG

817

Asn

Asn

Ala

Ser

Thr

Glu

Gly

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

175

180

185

CAC

CAA

GAC

AGC

TGC

TAC

TGG

TTC

TCT

CAC

TCT

GGG

ATG

TCC

TGG

GCC

865

His

Gin

Asp

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

190

195

200

GAG

GCT

GAG

AAG

TAC

TGC

CAG

CTG

AAG

AAC

GCC

CAC

CTG

GTG

GTC

ATC

913

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Val

íle

205

210

215

AAC

TCC

AGG

GAG

GAG

CAG

AAT

TTT

GTC

CAG

AAA

TAT

CTA

GGC

TCC

GCA

961

Asn

Ser

Arg

Glu

Glu

Gin

Asn

Phe

Val

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Ala

220

225

230

235

TAC

ACC

TGG

ATG

GGC

CTC

AGT

GAC

CCT

GAA

GGA

GCC

TGG

AAG

TGG

GTG

1009

Tyr

Thr

Trp

Met

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp

Lys

Trp

Val

240

245

250

GAT

GGA

ACA

GAC

TAT

GCG

ACC

GGC

TTC

CAG

AAC

TGG

AAG

CCA

GGC

CAG

1057

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp

Lys

Pro

Gly

Gin

255

260

265

CCA

GAC

GAC

TGG

CAG

GGG

CAC

GGG

CTG

GGT

GGA

GGC

GAG

GAC

TGT

GCT

1105

Pro

Asp

Asp

Trp

Gin

Gly

His

Gly

Leu

Gly

Gly

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala

270

275

28Ó

CAC

TTC

CAT

CCA

GAC

GGC

AGG

TGG

AAT

GAC

GAC

GTC

TGC

CAG

AGG

CCC

1153

His

Phe

His

Pro

Asp

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

Asp

Val

Cys

Gin

Arg

Pro

285

-

290

295

TAC

CAC

TGG

GTC

TGC

GAG

GCT

GGC

CTG

GGT

CAG

ACC

AGC

CAG

GAG

AGT

1201

Tyr

His

Trp

Val

Cys

Glu

Ala

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Ser

Gin

Glu

Ser

300

305

310

315

CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC CACCCGGCCA CAGAAATGGC GGTGGGAGGA 1254

His

GGACTCTTCT CACGACCTCC TCGCAAGACC GCTCTGGGAG AGAAATAAGC

ACTGGGAGAT

1314

TGGAAGCACT GCTAACATTT TGAATTTTTT TCTCTTTAAT TTTAAAAAGA

TGGTATAGTG

1374

TTCTTAAGCT TTTATTTTTT

TTCCAACTTT TGAAAGTCAA CTTCATGAAG GTATAATTTT

1434

TACATAATAA AAATGCACTC ATTT

1458

TCC CTG

GGC CTC

GGC CTG CTG CTG

CTG GTC

ATC íle

ATC TGT GTG íle Cys Val 55

GTT Val

GGA Gly

433

Ser

Leu 45

Gly

Leu

Gly

Leu

Leu 50

Leu

Leu

Val

TTC

CAA

AAT

TCC

AAA

TTT

CAG

AGG

GAC

CTG

GTG

ACC

CTG

AGA

ACA

GAT

481

Phe

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Gin

Arg

Asp

Leu

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Asp

60

65

70

75

TTT

AGC

AAC

TTC

ACC

TCA

AAC

ACT

GTG

GCG

GAG

ATC

CAG

GCA

CTG

ACT

529

Phe

Ser

Asn

Phe

Thr

Ser

Asn

Thr

Val

Ala

Glu

íle

Gin

Ala

Leu

Thr

80

85

90

TCC

CAG

GGC

AGC

AGC

TTG

GAA

GAA

ACG

ATA

GCA

TCT

CTG

AAA

GCT

GAG

577

Ser

Gin

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Glu

Thr

íle

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

95

100

105

GTG

GAG

GGT

TTC

AAG

CAG

GAA

CGG

CAG

GCA

GGG

GTA

TCT

GAG

CTC

CAG

625

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

Gin

Glu

Arg

Gin

Ala

Gly

Val

Ser

Glu

Leu

Gin

110

115

120

GAA

CAC

ACT

ACG

CAG

AAG

GCA

CAC

CTA

GGC

CAC

TGT

CCC

CAC

TGC

CCA

673

Glu

His

Thr

Thr

Gin

Lys

Ala

His

Leu

Gly

His

Cys

Pro

His

Cys

Pro

125

130

13S

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 4:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 316 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín , (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 4:

Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gin Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys

5 10 ' 15

Val

Gin

Gly

Phe 20

Lys

Asn

Gly Pro Leu 25

Pro

Leu

Gin Ser Leu 30

Leu

Gin

Arg

Leu

Arg

Ser

Gly

Pro

Cys

His

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Gly

Leu

Gly

35

40

45

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

íle

íle

Cys

Val

Val

Gly

Phe

Gin

Asn

Ser

Lys

50

55

60

Phe

Gin

Arg

Asp

Leu

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Asp

Phe

Ser

Asn

Phe

Thr

65

70

75

80

Ser

Asn

Thr

Val

Ala

Glu

íle

Gin

Ala

Leu

Thr

Ser

Gin

Gly

Ser

Ser

85

90

95

Leu

Glu

Glu

Thr

íle

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

100

105

110

Gin

Glu Arg 115

Gin

Ala

Gly

Val

Ser Glu Leu Gin Glu His

Thr

Thr

Gin

120

125

Lys

Ala

His

Leu

Gly

His

Cys

Pro

His

Cys

Pro

Ser

Val

Cys

Val

Pro

130

135

140

Val

His

Ser

Glu

Met

Leu

Leu

Arg

Val

Gin

Gin

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

145

150

155

f

160

Lys

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

Asn

Asn

Ala

Ser

Thr

165

170

175

Glu

Gly

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

His

Gin

Asp

Ser

Cys

180

185

190

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

195

200

205

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Val

íle

Asn

Ser

Arg

Glu

Glu

210

215

220

Gin

Asn

Phe

Val

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

Trp

Met

Gly

225

230

235

240

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp

Lys

Trp

Val

Asp

Gly

Thr.

Asp

Tyr

245

250

255

Ala

Thr

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Asp

Asp

Trp

Gin

260 265 270

Gly

His

Gly 275

Leu

Gly

Gly

Gly

Glu 280

Asp

Cys

Ala

His

Phe 285

His

Pro

Asp

Gly

Arg 290

Trp

Asn

Asp

Asp

Val 295

Cys

Gin

Arg

Pro

Tyr 300

His 1

Trp

Val

Cys

Glu 305

Ala

Gly

Leu

Gly

Gin 310

Thr

Ser

Gin

Glu

Ser 315

His

INFORMÁCIE

0

SEQ

ID

č. :

5:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍŽKA: 291 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantné (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 5:

Met 1

Thr Lys Glu

Tyr Gin 5

Asp Leu

Gin

His Leu Asp Asn Glu Glu

Ser

10

15

Asp

His

His

Gin

Leu

Arg

Lys

Gly

Pro

Pro

Pro

Pro

Gin

Pro

Leu

Leu

20

25

30

Gin

Arg

Leu

Cys

Ser

Gly

Pro

Arg

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Gly

Leu

35

40

45

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

Val

Val

Cys

Val

íle

Gly

Ser

Gin

Asn

Ser

50

55

60

Gin

Leu

Gin

Glu

Glu

Leu

Arg

Gly

Leu

Arg

Glu

Thr

Phe

Ser

Asn

Phe

65

70

75

80

Thr

Ala

Ser

Thr

Glu

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

Leu

Ser

Thr

Gin

Gly

Gly

85

90

95

Asn

Val

Gly

Arg

Lys

Met

Lys

Ser

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu

Glu

Lys

Gin

100

105

110

Gin

Lys

Asp

Leu

Ser

Glu

Asp

His

Ser

Ser

Leu

Leu

Leu

His

Val

Lys

115

120

125

Gin

Phe

Val

Ser

Asp

Leu

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Gin

Met

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gin

Gly

Asn

Gly

Ser

Glu

Arg

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

145

150

t

155

160

His

Glu

Arg

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

Arg

Ser

Gly

Lys

Ala

Trp

Ala

165

170

i

175

Asp

Ala

Asp

Asn

Tyr

Cys

Arg

Leu

Glu

Asp

Ala

His

Leu

Val

Val

Val

180

185

190

Thr

Ser Trp 195

Glu Glu

Gin

Lys

Phe 200

Val

Gin

His His

íle 205

Gly Pro

Val

Asn

Thr

Trp

Met

Gly

Leu

His

Asp

Gin

Asn

Gly

Pro

Trp

Lys

Trp

Val

210

215

220

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Glu

Thr

Gly

Phe

Lys

Asn

Trp

Arg

Pro

Glu

Gin

225

230

235

240

Pro

Asp

Asp

Trp

Tyr

Gly

His

Gly

Leu

Gly

Gly

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala

245

250

255

His

Phe

Thr

Asp

Asp

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

Asp

Val

Cys

Gin

Arg

Pro

260

265

270

Tyr

Arg

Trp

Val

Cys

Glu

Thr

Glu

Leu

Asp

Lys

Ala

Ser

Gin

Glu

Pro

275 280 285

Pro Leu Leu

290 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 6:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 287 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantné (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 6:

Met 1

Ala

Lys

Asp

Phe 5

Gin

Asp

íle Gin

Gin Leu Ser Ser Glu Glu

Asn

10

15

Asp

His

Pro

Phe

His

Gin

Gly

Pro

Pro

Pro

Ala

Gin

Pro

Leu

Ala

Gin

20

25

30

Arg

Leu

Cys

Ser

Met

Val

Cys

Phe

Ser

Leu

Leu

Ala

Leu

Ser

Phe

Asn

35

40

45

íle

Leu

Leu

Leu

Val

Val

íle

Cys

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Ser

Ala

Gin

50

55

60 ,

Leu

Gin

Ala

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Lys

Glu

Ala

Phe

Ser

Asn

Phe

Ser

65

70

75

80

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Glu

Val

Gin

Ala

íle

Ser

Thr

His

Gly Gly

Ser

85

90

95

Val

Gly

Asp

Lys

íle

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

Lys

Léu

Glu

Lys

Gin

Gin

100

105

110

Gin

Asp

Leu

Lys

Ala

Asp

His

Asp

Ala

Leu

Leu

Phe

His

Leu

Lys

His

115

120

125

Phe

Pro

Val

Asp

Leu

Arg

Phe

Val

Ala

Cys

Gin

Met

Glu

Leu

Leu

His

130

135

140

Ser

Asn

Gly

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

His

145 150 155 160

Gin

Gly

Ser

Cys

Tyr 165

Trp

Phe

Ser

His

Ser 170

Gly

Lys

Ala

Trp

Ala 175

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr 180

Cys

Gin

Leu

Glu

Asn 185

Ala

His

Leu

Val

Val 190

íle

Asn

Ser

Trp

Glu 195

Glu

Gin

Lys

Phe

íle 200

Val

Gin

His

Thr

Asn 205

Pro

Phe

Asn

Thr

Trp 210

Íle

Gly

Leu

Thr

Asp 215

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp 220

Lys

Trp

Val

Asp

Gly 225

Thr

Asp

Tyr

Arg

His 230

Asn

Tyr

Lys

Asn

Trp 235

Ala

Val

Thr

Gin

Pro 240

Asp

Asn

Trp

His

Gly 245

His

Glu

Leu

Gly

Gly 250

Ser

Glu

Asp

Cys

Val '255

Glu

Val

Gin

Pro

Asp 260

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp 265

Asp

Phe

Cys

Leu

Gin Val 270

Tyr

Arg

Trp

Val 275

Cys

Glu

Lys

Arg

Arg 280

Asn

Ala

Thr

Gly

Glu 285

Val

Ala

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 7:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍiŽKA: 1418 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) LOKALIZÁCIA: 279..992 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: mise-znak (B) LOKALIZÁCIA: 1348 (D) OSTATNÉ INFORMÁCIE: /pozn. = poly-A doplnkový motív (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 7:

CTATCCCCCA CTTTGCAGTA CTTGCATATC TTGCTGAGTG GGTTTGAGGG	CTACAATTCT	60
TATTTTCTTA TGTTAAGAGG TTGCATTTCC CTTATCTCGC CCTGGTGATT	CTATGCTGTG	120
GTTTCTTGTT CTCATCTCGT TTATCCTAGT GAGACATGTC TCTTCTTTCA	TACAACTGTG	180
CAATATGACA ACTTATCACA GTGATTGGTT CTCATATACT ATAGAGCCTT	AGAGAAGGAA	240

CAAGGCTCTC TTCTGACGGA GGAAGATTTT TTCTTGAT ATG GCT TCA GAA ATC

293

Met Ala Ser Glu íle

5

ACT TAT Thr Tyr

GCA Ala

GAA GTG AAG TTC AAG AAT GAA TCC AAC TCC TTG CAC ACC

341

Glu Val 10

Lys

Phe

Lys

Asn

Glu 15

Ser

Asn

Ser

Leu

His 20

Thr

TAC

TCA

GAA

TCT

CCT

GCA

GCT

CCČ

AGA

GAG

AAA

CCT

ATC

CGT

GAT

CTA

389

Tyr

Ser

Glu

Ser

Pro

Ala

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

Pro

íle

Arg

Asp

Leu

25

30

35

AGA

AAG

CCT

GGT

TCC

CCC

TCA

CTG

CTT

CTT

ACA

TCC

CTG

ATG

CTA

CTT

437

Arg

Lys

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Leu

Leu

Leu

Thr

Ser

Leu

Met

Leu

Leu

40

45

50

CTC

CTG

CTG

CTG

GCA

ATC

ACA

TTC

TTA

GTT

GCT

TTT

ATC

ATT

TAT

TTT

485

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

íle

Thr

Phe

Leu

Val

Ala

Phe

íle

íle

Tyr

Phe

55

60

65

CAA

AAG

TAC

TCT

CAA

CTT

CTT

GAA

GAA

AAA

AAA

GCT

GCA

AAA

AAT

ATA

533

Gin

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Lys

Lys

Ala

Ala

Lys

Asn

íle

70

75

80

85

ATG

CAC

AAT

GAA

TTG

AAC

TGC

ACA

AAA

AGT

GTT

TCA

CCC

ATG

GAA

GAC

581

Met

His

Asn

Glu

Leu

Asn

Cys

Thr

Lys

Ser

Val

Ser

Pro

Met

Glu

Asp

90

95

100

AAA

GTC

TGG

AGC

TGT

TGC

CCA

AAG

GAT

TGG

AGG

CTA

TTT

GGT

TCC

CAC

629

Lys

Val

Trp

Ser

Cys

Cys

Pro

Lys

Asp

Trp

Arg

Leu

Phe

Gly

Ser

His

105

110

115

TGC

TAC

TTG

GTT

CCC

ACA

GTT

TCT

TCA

TCA

GCA

TCT

TGG

AAC

AAG

AGT

677

Cys

Tyr

Leu

Val

Pro

Thr

Val

Ser

Ser

Ser

Ala

Ser

Trp

Asn

Lys

Ser

120

125

130

GAG

GAG

AAC

TGC

TCC

CGC

ATG

GGT

GCT

CAT

CTA

GTG

1 GTG

ATC

CAA

AGC

725

Glu

Glu

Asn

Cys

Ser

Arg

Met

Gly

Ala

His

Leu

Val

Val

íle

Gin

Ser

135

140

145

•

CAG

GAA

GAG

CAG

GAT

TTC

ATC

ACT

GGG

ATC

TTG

GAC

ACT

CAT

GCT

GCT

773

Gin

Glu

Glu

Gin

Asp

Phe

íle

Thr

Gly

íle

Leu

Asp

Thr

His

Ala

Ala

150

155

160

165

TAT

TTT

ATA

GGG

TTG

TGG

GAT

ACA

GGC

CAT

CGG

CAA

TGG

CAA

TGG

GTT

821

Tyr

Phe

íle

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Gly

His

Arg

Gin

Trp

Gin

Trp

Val

-

170

175

180

GAT

CAG

ACA

CCA

TAT

GAA

GAA

AGT

ATC

ACA

TTC

TGG

CAC

AAT

GGT

GAG

869

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ser

íle

Thr

Phe

Trp

His

Asn

Gly

Glu

185

190

195

CCC

AGC

AGT

GGC

AAT

GAA

AAA

TGT

GCT

ACA

ATA

ATT

TAC

CGT

TGG

AAG

917

Pro

Ser

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

Cys

Ala

Thr

íle

íle

Tyr

Arg

Trp

Lys

200

205

210

ACT

GGA

TGG

GGC

TGG

AAC

GAT

ATC

TCT

TGC

AGT

CTT

AAA

CAG

AAG

TCA

965

Thr

Gly

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

íle

Ser

Cys

Ser

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

215

220

225

GTT TGT CAG ATG AAG AAA ATA AAC TTA TGAATCACTC ATTCTTCATG1012

Val Cys Gin Met Lys Lys íle Asn Leu

230235

GGCATTCGAT TCATTGTTAT CCAACCATTA CACAGACACC TGGGAAATTC TACAGGTTCA1072

CAGAATTTAA GTGGGCAGCA AATGGTTATG CATACACTGG CCCACATATA TCCTTGTGCA113 2

TTTACCCACC TACTCTGTCA TAAAATGAAC TTTCATTGAG AATTTTCTAT ATACCACAGA1192

GTATACAGAG TCCCTTATGG ACACACATGG AACTTTTTGC CATCTTGTTT ACTCATGCCA1252

TTGTATGATA GGTTCTCTTG ACCTATCTGT TTCTGTTTCT CTGTTGTTTT TTTAATGTCT1312

TTGGATTTAT TGACATTAAA TTGAGAAGTA AAATTATAAA TATTTAAGTG TCTGGATTGA1372

TACACACAGA TATGTACTAT GAAATATAAT TAAATATTTA CTGTCC1418 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 8:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍŽKA: 238 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 8:

Met Ala 1

Ser

Glu

íle Thr Tyr Ala Glu Val

Lys

Phe

Lys l

Asn

Glu 15

Ser

5

10

Asn

Ser

Leu

His

Thr

Tyr

Ser

Glu

Ser

Pro

Ala

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

20

25

30

Pro

íle

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Leu

Leu

Leu

Thr

35

40

45

Ser

Leu

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

íle

Thr

Phe

Leu

Val

Ala

50

55

60

Phe

Íle

íle

Tyr

Phe

Gin

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Lys

Lys

65

70

75

80

Ala

Ala

Lys

Asn

íle

Met

His

Asn

Glu

Leu

Asn

Cys

Thr

Lys

Ser

Val

85

90

95

Ser

Pro

Met

Glu

Asp

Lys

Val

Trp

Ser

Cys

Cys

Pro

Lys

Asp

Trp

Arg

100

105

110

Leu

Phe

Gly

Ser

His

Cys

Tyr

Leu

Val

Pro

Thr

Val

Ser

Ser

Ser

Ala

115

120

125

Ser

Trp

Asn

Lys

Ser

Glu

Glu

Asn

Cys

Ser

Arg

Met

Gly

Ala

His

Leu

130

135

140

Val 145

Val

íle

Gin

Ser

Gin 150

Glu

Glu

Gin

Asp

Phe 155

íle

Thr

Gly

íle

Leu 160

Asp

Thr

His

Ala

Ala 165

Tyr

Phe

íle

Gly

Leu 170

Trp

Asp

Thr

Gly

His 175

Arg

Gin

Trp

Gin

Trp 180

Val

Asp

Gin

Thr

Pro 185

Tyr

Glu

Glu

Ser

íle 190

Thr

Phe

Trp

His

Asn 195

Gly

Glu

Pro

Ser

Ser 200

Gly

Asn

Glu

Lys

Cys 205

Ala

Thr

íle

íle

Tyr 210

Arg

Trp

Lys

Thr

Gly 215

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp 220

íle

Ser

Cys

Ser

Leu 225

Lys

Gin

Lys

Ser

Val 230

Cys

Gin

Met

Lys

Lys, 235

íle

Asn

Leu 1

B

(2) INFORMÁCIE

o ;

SEQ

ID

č. :

9:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1370 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) LOKALIZÁCIA: 273..1091 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 9:

AAAGCATGGT CTCTGTGTGT TCTAATCCCT GTTCATTCTC ATTTACTGTC CCTGGGATTT	60
CAGATCCAAG ACCAGCAGGA CTCCAGTCAC CTCTACCCCA GCTCTCCAGG ACACAGCGCT	120
CCCAACTCTG AGTGACGTCC CACCTCTGGT CCTTGCAGCA CAACCAACGT GGGAATCACA	180
CCCTCCAGAC CTCCCACAGC TCCACCCCAG ACTGGGCGCC GGCCCTGCCT CCATTTCAGC	240
TGTGACAACC TCAGAGCCGT GTTGGCCCAA GC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC	293

Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn

1

5

TTC

CAG

TAC

TTG

GAG

AAT

AAG

GTG

AAA

GTC

CAG

GGG

TTT

AAA

AAT

GGG

341

Phe

Gin

Tyr

Leu

Glu

Asn

Lys

Val

Lys

Val

Gin

Gly

Phe

Lys

Asn

Gly

10

15

20

CCA

CTT

CCT

CTC

CAG

TCC

CTC

CTG

CTG

CTG

GTC

ATC

ATC

TGT

GTG

GTT

389

Pro

Leu

Pro

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

íle

íle

Cys

Val

Val

30 35

GGA TTC CAA AAT TCC AAA TTT CAG AGG GAC CTG GTG ACC CTG AGA ACA Gly Phe Gin Asn Ser Lys Phe Gin Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr

45 50 55

GAT TTT AGC AAC TTC ACC TCA AAC ACT GTG GCG GAG ATC CAG GCA CTG Asp Phe Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu íle Gin Ala Leu

485

60

65

70

ACT

TCC

CAG

: GGC

AGC

AGC

TTG

GAA

GAA

ACG

ATA

GCA

TCT

CTG

AAA

GCT

533

Thr

Ser

Gin

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Glu

Thr

íle

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

75

80

85

GAG

GTG

GAG

GGT

TTC

AAG

CAG

GAA

CGG

CAG

GCA

GTT

CAT

TCT

GAA

ATG

581

Glu

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

Gin

Glu

Arg

Gin

Ala

Val

His

Ser

Glu

Met

90

95

100

CTC

CTG

CGA

GTC

CAG

CAG

CTG

GTG

CAA

GAC

CTG

AAG

AAA

CTG

ACC

TGC

629

Leu

Leu

Arg

Val

Gin

Gin

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Lys

Lys

Leu

Thr

cys

105

110

115

CAG

GTG

GCT

ACT

CTC

AAC

AAC

AAT

GGT

GAG

GAA

GCC

TCC

ACT

GAA

GGG

677

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

Asn

Asn

Gly

Glu

Glu

Ala

Ser

Thr

Glu

Gly

120

125

130

135

ACC

TGC

TGC

CCC

GTC

AAC

TGG

GTG

GAG

CAC

CAA

GAC

AGC

TGC

TAC

TGG

725

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

His

Gin

Asp

Ser

Cys

Tyr

Trp

140

145

150

TTC

TCT

CAC

TCT

GGG

ATG

TCC

TGG

GCC

GAG

GCT

GAG

AAG

TAC

TGC

CAG

773

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

Cys

Gin

15S

160

165

CTG

AAG

AAC

GCC

CAC

CTG

GTG

GTC

ATC

AAC

TCC

AGG

GAG

GAG

CAG

AAT

821

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Val

íle

Asn

Ser

Arg

Glu

Glu

Gin

Asn

170

175

180

TTT

GTC

CAG

AAA

TAT

CTA

GGC

TCC

GCA

TAC

ACC

TGG

ATG

GGC

CTC

AGT

869

Phe

Val

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

Trp

Met

Gly

Leu

Ser

185

190

195

GAC

CCT

GAA

GGA

GCC

TGG

AAG

TGG

GTG

GAT

GGA

ACA

GAC

TAT

GCG

ACC

917

Asp

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp

Lys

Trp

Val

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr

200

205

210

215

GGC

TTC

CAG

AAC

TGG

AAG

CCA

GGC

CAG

CCA

GAC

GAC

TGG

CAG

GGG

CAC

965

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Asp

Asp

Trp

Gin

Gly

His

220

225

230

GGG

CTG

GGT

GGA

GGC

GAG

GAC

TGT

GCT

CAC

TTC

CAT

CCA

GAC

GGC

AGG

1013

Gly

Leu

Gly

Gly

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala

His

Phe

His

Pro

Asp

Gly

Arg

235

240

245

TGG

AAT

GAC

GAC

GTC

TGC

CAG

AGG

CCC

TAC

CAC

TGG

GTC

TGC

GAG

GCT

1061

Trp

Asn

Asp

Asp

Val

Cys

Gin

Arg

Pro

Tyr

His

Trp

Val

Cys

Glu

Ala

250

255

260

GGC CTG GGT CAG ACC AGC CAG GAG

Gly Leu Gly Gin Thr Ser Gin Glu ²⁶⁵ 270

AGT CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC Ser His

1111

CACCCGGCCA CAGAAATGGC GGTGGGAGGA GCTCTGGGAG AGAAATAAGC ACTGGGAGAT TCTCTTTAAT TTTAAAAAGA TGGTATAGTG TGAAAGTCAA CTTCATGAAG GTATAATTTT

GGACTCTTCT CACGACCTCC TCGCAAGACC 1171 TGGAAGCACT GCTAACATTT TGAATTTTTT 1231 TTCTTAAGCT TTTATTTTTT TTCCAACTTT 1291 TACATAATAA AAATGCACTC ATTTAAAGAG 1351

TAAAAAAAAA AAAAAAAAA

1370 (2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID č.: 10:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÍŽKA: 273 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 10:

Met Thr 1

Arg

Thr Tyr 5

Glu Asn Phe Gin Tyr Leu 10

Glu

Asn

Lys

Val 15

Lys

Val

Gin

Gly

Phe

Lys

Asn

Glý

Pro

Leu

Pro

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

20

25

30

Leu

Val

íle

íle

Cys

Val

Val

Gly

Phe

Gin

Asrť

Ser

Lys

Phe

Gin

Arg

35

40

45

f

Asp

Leu

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Asp

Phe

Ser

Asn

Phe

Thr

Ser

Asn

Thr

50

55

60

v •

Val

Ala

Glu

íle

Gin

Ala

Leu

Thr

Ser

Gin

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Glu

65

70

75

80

Thr

íle

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

Gin

Glu

Arg

85

90

95

Gin

Ala

Val

His

Ser

Glu

Met

Leu

Leu

Arg

Val

Gin

Gin

Leu

Val

Gin

100

105

110

Asp

Leu

Lys

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

Asn

Asn

Gly

115

120

125

Glu

Glu

Ala

Ser

Thr

Glu

Gly

Thr

Cys

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

130

135

140

His

Gin

Asp

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

145

150

155

160

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr 165

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn 170

Ala

His

Leu

Val

Val 175

íle

Asn

Ser

Arg

Glu 180

Glu

Gin

Asn

Phe

Val 185

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly 190

Ser

Ala

Tyr

Thr

Trp 195

Met

Gly

Leu

Ser

Asp 200

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp 205

Lys

Trp

Val

Asp

Gly 210

Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr 215

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp 220

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro 225

Asp

Asp

Trp

Gin

Gly 230

His

Gly

Leu

Gly

Gly 235

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala 240

His

Phe

His

Pro

Asp 245

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp 250

Asp

Val

Cys

Gin

Arg 255

Pro

Tyr

His

Trp

Val

Cys

Glu

Ala

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Ser

Gin

Glu

Ser

260 265 270

His (2) INFORMÁCIE O SEQ ID č.: 11:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉŽKA: 75 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantné (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.: 11:

Glu 1

Lys

Met

íle

íle 5

Lys

Glu

Leu

Asn

Tyr 10

Thr

Glu

Leu

Glu

Cys 15

Thr

Lys

Trp

Ala

Ser 20

Leu

Leu

Glu

Asp

Lys 25

Val

Trp

Ser

Cys

Cys 30

Pro

Lys

Asp

Trp

Lys 35

Pro

Phe

Gly

Ser

Tyr 40

Cys

Tyr

Phe

Thr

Ser 45

Thr

Asp

Leu

Val

Ala 50

Ser

Trp

Asn

Glu

Ser 55

Lys

Glu

Asn

Cys

Phe 60

His

Met

Gly

Ala

His 65

Leu

Val

Val

íle

His 70

Ser

Gin

Glu

Glu

Gin 75

f lf £<T-£jdoo

Claims (9)

PATENTOVÉ NÁROKY

1) reťazec aspoň 17 aminokyselín z DCMP2v, ako je opísané v SEQ ID č. : 10 a

1. Takmer čistý alebo rekombinantný polypeptid DCMP1, vyznačujúci sa tým, že vykazuje aspoň 85 % identitu so sekvenciou SEQ ID č.: 2 alebo 8.

2) nemá úsek aspoň 12 aminokyselín z FKNGPLPLQS LLQRLRWGPC HLLLWLGLGL LLLVIIC (zvyšky 20 až 56 v SEQ ID č.: 4).

2. Takmer čistý alebo rekombinantný polypeptid DCMP2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) polypeptid, vybraný z:

D Gly Val S er Glu Leu G !ln Glu His Thr Thr Gin Lys Ala His Leu Gly His Cys His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro (zv; yšky 118 až 144 v SEQ ID č. : 4) ; 2) Gin Val A la Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys (zvyšky 166 až 181 v SEQ ID i č. : 4)

alebo

3. Fúzny proteín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.

3) Trp Lys Pro Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gin Gly His Gly Leu Gly (zvyšky 263 až 277 v SEQ ID č.: 4) alebo

b) sekvenciu, ktorá vykazuje:

4. Väzbová zlúčenina, vyznačujúca sa tým, že sa špecificky viaže na polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.

5. Väzbová zlúčenina podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že to je protilátka alebo fragment protilátky.

6. Nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že kóduje polypetid podľa nároku 1 alebo 2.

7. Expresný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 6.

8. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vektor podľa nároku 7.

9. Spôsob rekombinantnej prípravy polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 8 za takých podmienok, keď je polypeptid exprimovaný.