ES2327126T3 - Agentes que modulan la actividad de ccrl2 y metodos de utilizar los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para detectar un agente que module la actividad de CCRL2, método que comprende: (a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2; y (b) determinar si el agente candidato es capaz de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho polipéptido MIP-4.
Description
Agentes que modulan la actividad de CCRL2 y
métodos de utilizar los mismos.
El presente invento se refiere a un ligando
endógeno para un receptor huérfano acoplado a proteínas G, y a
métodos, usos, agentes, composiciones y kits asociados.
Las quimiocinas que actúan a través de sus
receptores afines son críticas para el reclutamiento de células
inmunes efectoras a tejidos inflamados y, por lo tanto, tienen un
considerable interés como posibles dianas para el tratamiento de la
enfermedad inflamatoria. El CCRL2 (también conocido como HCR,
CRAM-A y CRAM-B) codifica una
proteína huérfana de tipo receptor quimiocínico, que es
supuestamente una proteína con siete dominios transmembranales. Los
receptores acoplados a proteínas G (GPCRs; del inglés, G
protein coupled receptors) son una familia de
aproximadamente 500 proteínas con una estructura de 7 dominios
transmembranales, que transducen señales celulares de una
diversidad de mediadores biológicos. La interacción de un GPCR con
su ligando causa un cambio conformacional en la proteína y facilita
la unión de proteínas G heterotrímeras asociadas pequeñas a los
dominios intracelulares del receptor, que inician una cascada de
señalización. Los GPCRs son receptores de la superficie celular y,
por lo tanto, son dianas atractivas para una intervención
farmacológica. El CCRL2 se expresa con niveles elevados en
neutrófilos primarios y monocitos primarios y, además, está
suprarregulado tras la activación de neutrófilos y cuando los
monocitos se diferencian en macrófagos. Sin embargo, no se ha
investigado la importancia de CCRL2 en la enfermedad inflamatoria
humana.
Los presentes inventores han identificado la
proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4; del
inglés, macrophage inflammatory
protein-4; también conocida como
DC-CKI, CCL18 y PARC) como un ligando endógeno para
CCRL2.
En consecuencia, el presente invento proporciona
un método in vitroitro para detectar un agente que module la
actividad de CCRL2, método que comprende:
(a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con
un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos
(MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo
unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la
unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido
CCRL2; y
(b) determinar si el agente candidato es capaz
de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho
polipéptido MIP-4.
El presente invento proporciona además:
- Un método para modular la actividad de un
polipéptido CCRL2 en una célula, método que comprende suministrar a
la célula un anticuerpo específico para MIP-4,
anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4
a CCRL2;
- Uso de un anticuerpo específico para CCRL2,
anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 a
MIP-4, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una
enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica
aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno
inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD;
del inglés, chronic obstructive pulmonary
disease), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio
óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal,
aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune
(sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis
reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o
trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es
obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad,
enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer;
- Uso de un anticuerpo específico para
MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión
de MIP-4 a CCRL2, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo,
la enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio
cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida),
lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad;
- Un método para activar una ruta de
señalización de CCL2 en una célula, método que comprende suministrar
a la célula un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de MIP-4
mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b) una secuencia al menos 50% idéntica a la ID.
SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de
señalización de CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une
a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
\vskip1.000000\baselineskip
- Uso de un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de MIP-4
mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b) una secuencia al menos 50% idéntica a la ID.
SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de
señalización de CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une
a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
un polinucleótido que codifica cualquiera de
dichos polipéptidos o dichos fragmentos, o un anticuerpo específico
para cualquiera de dichos polipéptidos o dichos fragmentos; para la
fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2, seleccionado entre la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis y un trastorno inflamatorio
cerebral;
\vskip1.000000\baselineskip
- Uso de un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de CCRL2 mostrada en la ID.
SEC. nº 2 ó 4; o
(b) una secuencia que es al menos 80% idéntica a
la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente
equivalente a CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es
funcionalmente equivalente a CCRL2;
un polinucleótido que codifica cualquiera de
dichos polipéptidos, o un anticuerpo que se une a cualquiera de
dichos polipéptidos; para la fabricación de un medicamento para
tratar una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4;
\vskip1.000000\baselineskip
- Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio
cerebral, método que comprende:
(a) llevar a cabo una reacción de multiplicación
sobre una muestra aislada del individuo utilizando cebadores
específicos para un polinucleótido que codifica un polipéptido
MIP-4; y
(b) determinar la presencia o ausencia de un
polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4 en
la muestra y determinar por ello la presencia de una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio
cerebral;
\vskip1.000000\baselineskip
- Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio
cerebral, método que comprende:
(a) multiplicar un polinucleótido que codifica
un polipéptido MIP-4, usando un ácido nucleico
aislado del individuo; y
(b) determinar si el polinucleótido comprende un
polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado
con CCRL2; y
(c) determinar, basándose en dicha comparación,
si el polinucleótido comprende un polimorfismo asociado con una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, en que la enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria
intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral;
\vskip1.000000\baselineskip
- Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un
trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a) poner una muestra aislada del individuo, que
comprende un polipéptido CCRL2, en contacto con un polipéptido
MIP-4 bajo unas condiciones que permitan la unión
del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2;
(b) medir la actividad del polipéptido CCRL2;
y
(c) comparar la actividad del polipéptido CCRL2
con la de un patrón, en que una diferencia de actividad con
respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en
que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un
trastorno inflamatorio cerebral;
- Un kit para detectar un agente que modula la
actividad de CCRL2, kit que comprende: (i) un polipéptido CCRL2 o
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2;
- Un anticuerpo específico para
MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión
de MIP-4 con CCRL2, para uso en el tratamiento de
un trastorno inflamatorio óseo, la enfermedad inflamatoria
intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis,
síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso,
rechazo de aloinjertos u obesidad; y
- Un anticuerpo específico para CCRL2,
anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con
MIP-4, para uso en el tratamiento de una enfermedad
o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con
una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la
enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar
obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno
inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal,
aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune
(sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis
reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o
trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es
obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad,
enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer.
La ID. SEC. nº 1 muestra el polinucleótido que
codifica la forma larga del CCRL2 humano
(CRAM-A).
La ID. SEC. nº 2 muestra la secuencia de
aminoácidos de la forma larga del CCRL2 humano
(CRAM-A).
La ID. SEC. nº 3 muestra el polinucleótido que
codifica la forma corta del CCRL2 humano
(CRAM-B).
La ID. SEC. nº 4 muestra la secuencia de
aminoácidos de la forma corta del CCRL2 humano
(CRAM-B).
La ID. SEC. nº 5 muestra el polinucleótido que
codifica la MIP-4 humana.
La ID. SEC. nº 6 muestra la secuencia de
aminoácidos de la MIP-4 humana.
La Figura 1 muestra la actividad LacZ en células
de levadura con transplante de proteína G, en presencia y ausencia
de MIP-4. La actividad LacZ se expresa por 10^{6}
células.
La Figura 2 muestra la actividad LacZ en células
de levadura con transplante de Gi3, en concentraciones variables de
MIP-4. La actividad LacZ se expresa por 10^{6}
células.
La Figura 3 muestra la actividad LacZ en las
células de levadura con transplante de proteína G que expresan el
receptor del factor liberador de corticotropina (CRFR; del inglés,
corticotrophin releasing factor
receptor). La actividad LacZ se expresa por 10^{6}
células.
La Figura 4 es un diagrama de flujo que expone
las operaciones de un método, implementado por ordenador, para
diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un
individuo.
La Figura 5 es un diagrama de flujo que expone
las operaciones de un método, implementado por ordenador, para
diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4 en un individuo.
La Figura 6 es un gráfico de barras que ilustra
la quimiotaxis de células CHO transfectadas con CCRL2, en presencia
de diversas quimiocinas.
La Figura 7 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto bloqueador de 100 \mug/ml y 500 \mug/ml de un
anticuerpo anti-CCRL2 sobre la quimiotaxis provocada
con MIP-4.
La Figura 8 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto de anticuerpos anti-CCRL2 sobre la
quimiotaxis provocada con líquido sinovial (SF; del inglés,
synovial fluid) de pacientes aquejados de artritis
reumatoide (AR).
La Figura 9 es un gráfico de barras que ilustra
el aumento de quimiotaxis, en comparación con un testigo, observado
en respuesta a 250 \mug/ml de MIP-4, líquido
sinovial de pacientes con AR (SF3 1:100) y líquido sinovial de
pacientes con AR desprovisto de MIP-4 (SF3 1:100
agotado).
Ha de entenderse que las diferentes aplicaciones
de los métodos descritos pueden ajustarse a las necesidades
específicas de la técnica. Ha de entenderse también que la
terminología aquí utilizada sólo tiene el fin de describir
realizaciones particulares del invento y no debe ser considerada
restrictiva.
Además, como se utilizan en esta memoria
descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas
singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen
los referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente
otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un
polipéptido" incluye una mezcla de dos o más de dichos
polipéptidos, la referencia a "una célula" incluye dos o más
de dichas células, etc.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patente aquí citadas, sean supra o sean infra, se
incorporan aquí por referencia en su totalidad.
El invento proporciona un método para detectar
un agente candidato que module la actividad de CCRL2. El término
"modular" incluye cualquiera de los modos aquí mencionados en
que el agente del invento es capaz de modular el CCRL2. Esto
incluye la suprarregulación o infrarregulación de la expresión de
CCRL2, la suprarregulación o infrarregulación de la degradación de
CCRL2, y la estimulación o inhibición de la actividad del receptor
CCRL2, incluyendo la potenciación de la actividad de CCRL2 en
respuesta a un polipéptido MIP-4. La capacidad de
un agente candidato para modular la actividad o expresión de CCRL2
puede ser determinada poniendo un polipéptido CCRL2 en contacto con
el agente bajo unas condiciones que, en ausencia del agente
candidato, permitan la actividad o expresión de CCRL2, por ejemplo,
en presencia de un polipéptido MIP-4, y comparando
la actividad de CCRL2 en presencia y ausencia del agente candidato.
Preferiblemente, la modulación es una corrección de una actividad o
expresión aberrante de CCRL2. La actividad de CCRL2 es típicamente
la activación de una vía de señalización mediada por proteínas G.
La proteína G puede ser cualquier proteína G que esté acoplada al
polipéptido CCRL2. Preferiblemente, la proteína G es Gi3.
Los métodos para detectar un agente que module
la actividad de un polipéptido CCRL2 pueden ser llevados a cabo
in vitro (dentro o fuera de una célula). En una realización,
los métodos se llevan a cabo en o sobre una célula, un cultivo
celular o un extracto celular que comprende un polipéptido CCRL2 o
expresa un polinucleótido CCRL2. La célula puede ser una en que se
expresa naturalmente el polipéptido CCRL2, tal como una célula
endotelial. Alternativamente, la célula puede ser una célula que
está transformada con un polinucleótido CCRL2 y expresa un
polipéptido CCRL2. Las células adecuadas incluyen líneas celulares
eucarióticas superiores transitorias, o preferiblemente estables,
tales como células de mamífero o células de insecto, células
eucarióticas inferiores, tales como levaduras, o células
procarióticas tales como células bacterianas. Los ejemplos
particulares de líneas celulares incluyen las células HEK293T, CHO,
HeLa y COS de mamífero. Preferiblemente, la línea celular
seleccionada será una que no es únicamente estable sino que permite
además la glicosilación madura de un polipéptido. La expresión de
un polipéptido CCRL2 puede ser también llevada a cabo en ovocitos
transformados.
En otra realización, los métodos se llevan a
cabo en o sobre un liposoma que comprende un polipéptido CCRL2. Los
métodos para la preparación de liposomas son bien conocidos en la
técnica (Woodle y Papahadjopoulos, Methods Enzymol. 171:
193-217, 1989).
En otra realización, los métodos se llevan a
cabo en o sobre membranas en gemación provocada por virus, que
comprenden un polipéptido CCRL2. Los métodos para la preparación de
membranas en gemación provocada por virus son bien conocidos en la
técnica (por ejemplo, Luan et al., Biochemistry 34 (31):
9874-9883, 1995). Se pueden utilizar virus para
provocar la gemación en células que expresan naturalmente un
polipéptido CCRL2 o en células transformadas (transfectadas) con un
polinucleótido CCRL2.
En otra realización, los métodos se llevan a
cabo en o sobre bicapas lipídicas artificiales. Los métodos para la
preparación de bicapas lipídicas artificiales son bien conocidos en
la técnica (Sackmann y Tanaka, Trends Biotechnol. 18:
58-64, 2000; y Karlsson y Lofas, Anal. Biochem. 300:
132-138, 2002). Se puede integrar un polipéptido
CCRL2 en la membrana artificial cuando se fabrica la membrana.
En aún otra realización, los métodos se llevan a
cabo en o sobre una fracción de membrana que comprende el
polipéptido CCRL2. Una fracción de membrana es una preparación de
membranas lipídicas celulares en que se han eliminado algunos, por
ejemplo, al menos el 5% o el 10%, de los elementos no asociados con
la membrana. Los elementos asociados con la membrana son
componentes celulares que están integrados en la membrana lipídica
o componentes celulares físicamente asociados con un componente
integrado en la membrana lipídica. Los métodos para la preparación
de fracciones de membrana celular son bien conocidos en la técnica
(por ejemplo, Hubbard y Cohn, 1975, J. Cell. Biol. 64:
461-479). Se puede preparar una fracción de membrana
que comprenda el polipéptido CCRL2 a partir de células que expresan
naturalmente un polipéptido CCRL2 o de células transformadas
(transfectadas) con un polinucleótido CCRL2. Alternativamente, se
puede integrar un polipéptido CCRL2 en una preparación de membrana
por dilución de una disolución del polipéptido CCRL2 en un
detergente (por ejemplo, Salamon et al., 1996, Biophys. J.
71: 283-294).
Los métodos para identificar un agente que
module la actividad de un polipéptido CCRL2 se llevan a cabo usando
un agente candidato. El método comprende típicamente el uso de uno o
más agentes candidatos; por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30
o más agentes candidatos. Un agente candidato es un compuesto
candidato que se evalúa mediante los métodos del invento en cuanto
a su capacidad para modular la actividad de CCRL2. Los agentes
candidatos pueden ser compuestos naturales o sintéticos e incluyen,
por ejemplo, moléculas pequeñas, compuestos contenidos en extractos
de células animales, vegetales, bacterianas o fúngicas, y también
medios acondicionados procedentes de dichas células. Los agentes
candidatos adecuados que pueden ser examinados con los anteriores
métodos de exploración incluyen agentes anticuerpos (por ejemplo,
anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos quiméricos y anticuerpos con CDR injertada) y
agentes aptámeros. El agente anticuerpo puede presentar afinidad
ligante por el receptor CCRL2 o por un polipéptido
MIP-4. Además, también se pueden examinar bancos
combinatorios, y bancos de identidades químicas definidas, péptidos
y compuestos miméticos de péptidos, oligonucleótidos y agentes
naturales, tales como bancos de presentación (por ejemplo, bancos
de presentación en fagos). Se pueden examinar bancos de
oligonucleótidos, tales como bancos de aptámeros.
Los agentes candidatos pueden ser compuestos
químicos, los cuales se obtienen típicamente por una síntesis
alrededor de moléculas pequeñas que pueden tener cualesquiera de las
propiedades del polipéptido MIP-4.
El agente candidato puede proceder de, o estar
contenido en, una muestra ambiental, un extracto natural de células
o tejidos de animales, insectos, organismos marinos, vegetales,
levaduras o bacterias, una muestra clínica, una muestra sintética,
o un medio acondicionado procedente de células recombinantes o de un
proceso de fermentación. El agente candidato puede también proceder
de, o estar contenido en, una muestra tisular que comprenda un
fluido corporal y/o células de un individuo y puede ser obtenido,
por ejemplo, utilizando una torunda, tal como una torunda bucal. El
agente candidato puede proceder de, o estar contenido en, una
muestra de sangre, orina, saliva, piel, células de carrillo o raíces
capilares.
En una exploración inicial, se pueden usar
partidas de los agentes candidatos de, por ejemplo, diez agentes
candidatos por reacción, y se pueden examinar individualmente los
agentes candidatos de las partidas que muestran modulación. Cuando
una partida de agentes muestra actividad moduladora de CCRL2, los
agentes de ensayo pueden ser examinados individualmente o en
partidas más pequeñas para identificar el agente que presenta
actividad moduladora.
Los agentes candidatos preferidos son
polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a
antígenos, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos y
compuestos químicos.
Los métodos del invento permiten detectar
agentes que modulan la actividad de un polipéptido CCRL2 al
determinar o examinar el efecto de un agente candidato sobre una
actividad del polipéptido CCRL2, tal como la unión a ligandos, la
actividad de señalización o la actividad quimiotáctica. Los métodos
del invento se llevan a cabo bajo unas condiciones que, en ausencia
del agente candidato, permiten la unión de un polipéptido
MIP-4 a un polipéptido CCRL2. Estas condiciones
son, por ejemplo, la temperatura, la concentración de sales, el pH y
la concentración de proteínas, bajo las cuales se une un
polipéptido MIP-4 a un polipéptido CCRL2. Las
condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza
del ensayo, tal como, por ejemplo, si en el ensayo se utilizan
células viables o sólo la fracción de membrana de las células. Sin
embargo, puesto que CCRL2 es un receptor de la superficie celular y
los polipéptidos MIP-4 son polipéptidos secretados
que interaccionan con el dominio extracelular de CCRL2, las
condiciones preferidas incluirán generalmente una concentración
salina (aproximadamente 90 mM) y un pH (aproximadamente de 7,0 a
8,0) fisiológicos. La temperatura para la unión puede variar de 4ºC
a 37ºC, pero es preferiblemente 4ºC. También variará la
concentración de los reaccionantes en el ensayo de unión, pero será
preferiblemente de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10
\muM.
En una realización del invento, se determina el
efecto de la muestra de ensayo sobre la unión del polipéptido CCRL2
a un polipéptido MIP-4. Para determinar la unión y
detectar cualquier efecto, se puede utilizar cualquier formato de
ensayo de unión adecuado. El efecto puede ser medido como una
disminución de la unión entre un polipéptido MIP-4
y un polipéptido CCRL2. Una disminución de al menos 10%, al menos
20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al
menos 70% o al menos 80% en la unión entre un polipéptido
MIP-4 y un polipéptido CCRL2, medida en cualquier
ensayo dado, indica que el agente candidato modula la actividad de
CCRL2.
Los ensayos preferidos para determinar cualquier
cambio provocado por el agente candidato en la unión entre un
polipéptido MIP-4 y un polipéptido CCRL2 incluyen
los ensayos de desplazamiento de marcadores, resonancia de
plasmones superficiales, transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia, sofocamiento de fluorescencia, polarización de
fluorescencia y unión de radioligandos.
El desplazamiento de marcadores implica poner un
polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido
MIP-4 detectablemente marcado, en presencia o
ausencia de concentraciones crecientes de un agente candidato. Para
calibrar el ensayo, se pueden llevar a cabo reacciones testigo de
competición utilizando concentraciones crecientes de un polipéptido
MIP-4 no marcado. Después del contacto, se mide el
polipéptido MIP-4 marcado y unido utilizando un
método apropiado para el marcador dado (por ejemplo, cuenta de
centelleo, ensayo enzimático o fluorescencia). Los marcadores
preferidos incluyen radioisótopos tales como tritio y yodo y
cualquier otro radionucleótido adecuado. Se considera que los
agentes candidatos se unen específicamente a un polipéptido CCRL2
si, en una concentración de 10 \muM o menor (la EC_{50} es 10
\muM o menor), desplazan el 50% del polipéptido
MIP-4 marcado.
La resonancia de plasmones superficiales permite
medir la unión entre las dos moléculas por el cambio de masa cerca
de un sensor inmovilizado, causada por la unión o la pérdida de
unión de un polipéptido MIP-4 a un polipéptido
CCRL2 inmovilizado en una membrana situada sobre el sensor. El
cambio de masa se mide como unidades de resonancia frente al tiempo
después de la inyección o eliminación del ligando o el agente
candidato, y se mide utilizando un biosensor Biacore (Biacore AB).
Se puede inmovilizar un polipéptido CCRL2 sobre un chip sensor en
una membrana lipídica de película delgada de acuerdo con métodos
descritos (Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:
283-294). Generalmente, se puede administrar un
agente candidato a un polipéptido MIP-4 preunido a
un polipéptido CCRL2 inmovilizado y se puede medir el
desplazamiento del ligando. Alternativamente, se puede administrar
un polipéptido MIP-4 a un agente candidato preunido
a un polipéptido CCRL2 inmovilizado.
La transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET; del inglés, fluorescence
resonance energy transfer) es un fenómeno
mecánico cuántico que tiene lugar entre un dador (D) de
fluorescencia y un aceptor (A) de fluorescencia en estrecha
proximidad entre sí, si el espectro de emisión de D se solapa con el
espectro de excitación de A. Generalmente, el polipéptido
MIP-4 y el polipéptido CCRL2 son marcados con una
pareja complementaria de fluoróforos dador y aceptor. La
fluorescencia emitida tras la excitación del fluoróforo dador
tendrá una longitud de onda distinta cuando el polipéptido
MIP-4 y el polipéptido CCRL2 están unidos que
cuando no lo están. La cuantificación de polipéptidos unidos frente
a polipéptidos no unidos puede ser llevada a cabo por medición de
la intensidad de emisión a cada longitud de onda. Las parejas de
fluoróforos dador:aceptor con que se marcan los polipéptidos son
bien conocidas en la técnica. Los fluoróforos preferidos son la
proteína fluorescente cian (CFP; del inglés, cyan
fluorescent protein; dador) y la proteína fluorescente
amarilla (YFP; del inglés, yellow fluorescent
protein; aceptor).
El sofocamiento de fluorescencia implica marcar
una molécula de la pareja de unión (el polipéptido
MIP-4 y el polipéptido CCRL2) con un fluoróforo
mientras se marca la otra con una molécula que sofoca la
fluorescencia del fluoróforo cuando se unen los miembros de la
pareja. Se puede utilizar un cambio de fluorescencia tras la
excitación para medir un cambio en la unión entre los polipéptidos
MIP-4 y CCRL2. Un aumento de fluorescencia sugiere
que está disminuida la unión entre el polipéptido
MIP-4 y el polipéptido CCRL2.
La polarización de fluorescencia mide la
polarización de un polipéptido MIP-4
fluorescentemente marcado. El valor de polarización de
fluorescencia para un polipéptido MIP-4
fluorescentemente marcado cambiará y, generalmente, aumentará
cuando el ligando se una a un polipéptido CCRL2. Una disminución del
valor de polarización es típicamente indicativa de una disminución
de la unión entre el polipéptido MIP-4 y el
polipéptido CCRL2. La polarización de fluorescencia es preferible
cuando el agente candidato es una molécula pequeña.
La exploración de alto rendimiento y a gran
escala de pequeños agentes candidatos o de bancos de dichos agentes
puede ser llevada a cabo utilizando ensayos con biosensores. El
Australian Membrane Biotechnology Research Institute (AMBRI;
http://www.ambri.com.au/) ha descrito biosensores ICS. La unión de
CCRL2 a un ligando de CCRL2 está asociada al cierre de canales
iónicos facilitados por gramicidina en una bicapa membranosa de los
biosensores. Como resultado, el biosensor permite medir la unión
entre el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2
y, por lo tanto, cualquier cambio en la unión tras la introducción
de un agente candidato.
Los agentes que interfieren en, o desplazan, la
unión de un polipéptido MIP-4 con un polipéptido
CCRL2 pueden ser agonistas, agonistas parciales, antagonistas o
agonistas inversos de la actividad de CCRL2. Se puede llevar a cabo
un análisis funcional sobre los agentes identificados de acuerdo con
el invento, para determinar si son agonistas, agonistas parciales,
antagonistas o agonistas inversos. Para la exploración de agonistas,
se pone un polipéptido CCRL2 en contacto con el agente y se mide la
actividad de señalización de CCRL2 del modo descrito más adelante.
Un agonista o agonista parcial tendrá una actividad máxima que
corresponderá a al menos el 10% de la actividad máxima de un
polipéptido MIP-4. El agonista o agonista parcial
tendrá preferiblemente el 50%, el 75% o el 100% de la actividad del
polipéptido MIP-4, o una actividad 2 veces mayor, 5
veces mayor, 10 veces mayor o más que la de un polipéptido
MIP-4. Para la exploración de antagonistas o
agonistas inversos, se examinan los polipéptidos CCRL2 en cuanto a
la actividad de señalización en presencia de un polipéptido
MIP-4, con o sin un compuesto candidato. Los
antagonistas o agonistas inversos reducirán el nivel de actividad
del receptor estimulado por el ligando en al menos un 10% en
comparación con las reacciones en que no está el antagonista o
agonista inverso. Para la exploración de agonistas inversos, se
examina la actividad constitutiva de CCRL2 en presencia y ausencia
de un compuesto candidato. Los agonistas inversos son compuestos que
reducen la actividad constitutiva del receptor en al menos un 10%.
Se puede alcanzar la actividad constitutiva de un polipéptido CCRL2
por sobreexpresión colocándolo, por ejemplo, bajo el control de un
promotor constitutivo potente, tal como el promotor precoz de CMV.
Alternativamente, se puede alcanzar la actividad constitutiva
mediante ciertas mutaciones de aminoácidos o dominios de aminoácidos
conservados del receptor acoplado a proteínas G (por ejemplo,
Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:
1430-1433; Ren et al., 1993, J. Biol. Chem.
268: 16.483-16.487; y Samama et al., 1993,
J. Biol. Chem. 268: 4625-4636).
En otra realización del invento, se determina el
efecto de una muestra de ensayo sobre la actividad de señalización
de un polipéptido CCRL2. La actividad de señalización de CCRL2 es
provocada por un polipéptido MIP-4. Para determinar
la actividad de señalización y detectar cualquier efecto se puede
utilizar cualquier formato de ensayo de señalización adecuado. El
efecto puede ser medido como un cambio en la actividad de
señalización de CCRL2 provocada por el polipéptido
MIP-4. Un cambio se refiere a un aumento o una
disminución de la actividad de señalización. Un cambio de al menos
10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al
menos 60%, al menos 70% o al menos 80% de la actividad de
señalización de un polipéptido CCRL2, medida en cualquier ensayo
dado, indica que el agente candidato modula la actividad de
CCRL2.
La actividad de señalización de un polipéptido
CCRL2 puede ser determinada midiendo el nivel de activación de una
proteína G por el polipéptido CCRL2. El nivel de activación de una
proteína G por CCRL2 puede ser determinado midiendo la renovación
de derivados de guanosina, la actividad de la guanosina trifosfatasa
(GTPasa) o el nivel de moléculas de segundo mensajero corriente
abajo. En la reacción cíclica de activación e inactivación de
proteínas G están implicados derivados de guanosina, derivados que
incluyen la guanosina difosfato (GDP) y la guanosina trifosfato
(GTP). La activación de una proteína G genera o causa moléculas de
segundo mensajero para alterar su concentración. Los ejemplos
incluyen, pero no se limitan a, adenina monofosfato cíclica (cAMP),
guanosina monofosfato cíclica (cGMP), diacilglicerol (DAG), inositol
trifosfato (IP_{3}) y calcio intracelular.
Los métodos preferidos para determinar la
actividad de señalización incluyen la medición de la unión de
nucleótidos de guanosina, la actividad GTPasa, la actividad
adenilato ciclasa, cAMP, la actividad proteína cinasa C, la
descomposición del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol
trifosfato, calcio intracelular, la actividad MAP cinasa y la
expresión de genes informadores. En todos los ensayos, los posibles
efectos inespecíficos del agente candidato pueden ser excluidos
llevando a cabo ensayos de control en que se utilizan células o
membranas que no comprenden un polipéptido CCRL2.
Preferiblemente, la actividad de señalización
del polipéptido CCRL2 se determina midiendo la actividad de
Gi3.
Tras la activación por un receptor tal como un
polipéptido CCRL2, la GTP se une a proteínas G asociadas a la
membrana. Por lo tanto, la actividad de señalización de CCRL2 puede
ser examinada midiendo la unión de GTP a membranas celulares que
contienen receptores (Traynor y Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47:
848-854). Generalmente, se marca la GTP con un
grupo detectable adecuado y se mide mediante un sistema de detección
apropiado.
Las proteínas G comprenden una GTPasa que
hidroliza la GTP para formar GDP e inactiva la proteína G. Por lo
tanto, la actividad GTPasa es una medida de la proteína G y, por
consiguiente, de la actividad de CCRL2. La actividad GTPasa puede
ser medida mediante métodos comunes en la técnica. Generalmente, el
método implica incubar con \gammaP-GTP las
membranas que contienen un polipéptido CCRL2. La GTPasa activa
liberará el marcador como fosfato inorgánico, el cual puede ser
detectado mediante cuenta de centelleo.
Otro método preferido para determinar la
actividad de señalización es medir la actividad adenilato ciclasa
(Salomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58:
541-548; y Kenimer y Nirenberg, 1981, Mol.
Pharmacol. 20: 585.591). El ensayo puede implicar el uso de cAMP
marcado para estimar la actividad de la enzima adenilato ciclasa en
productos de homogeneización proteicos procedentes de células o
membranas que comprenden un polipéptido CCRL2.
Aún otro método preferido para determinar la
actividad de señalización es la medición de la cAMP intracelular.
Esto se puede realizar utilizando un radioinmunoensayo (RIA) para
cAMP o proteínas ligantes de cAMP de acuerdo con métodos conocidos
en la técnica (Horton y Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41:
91-105). Se puede medir la cAMP intracelular
utilizando diversos kits comercialmente asequibles, incluyendo el
ensayo homogéneo basado en polarización de fluorescencia de alta
eficacia (LJL Biosystems y NEN Life Science Products).
En aún otros métodos preferidos para determinar
la actividad de señalización se mide la descomposición de
fosfolípidos (especialmente de fosfatidilinositol) provocada por el
receptor para generar los segundos mensajeros DAG y/o IP_{3}. Los
métodos para medir cada uno de estos son bien conocidos en la
técnica (por ejemplo, Phospholipid Signaling Protocols, redactado
por Ian M. Bird, Totowa, New Jersey, EE.UU., Humana Press, 1998; y
Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:
11.824-11.831).
En aún otro método preferido para determinar la
actividad de señalización se mide la actividad proteína cinasa C
(PKC; del inglés, protein kinase C) provocada
por el receptor. El DAG activa la PKC, que fosforila muchas dianas
proteicas y da finalmente lugar a la transcripción de un conjunto de
genes que codifican factores de transcripción protooncogénicos,
incluyendo c-fos, c-myc y
c-jun; proteasas; inhibidores de proteasas,
incluyendo los inhibidores de la colagenasa de tipo I y del
activador de plasminógeno; y moléculas de adhesión, incluyendo la
molécula I de adhesión intracelular (ICAM I; del inglés,
intracellular adhesion molecule I). La
actividad de la PKC puede ser medida directamente midiendo la
fosforilación de un sustrato peptídico,
Ac-FKKSFKL-NH_{2}, que procede
del sustrato proteico de la proteína cinasa C rico en alanina
miristoilada (MARCKS; del inglés, myristoylated
alanine-rich C kinase substrate)
(Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:
13.341-13.348). Los ensayos diseñados para detectar
aumentos de productos génicos provocados por la PKC pueden ser
utilizados para determinar la activación de la PKC y, por ello, la
actividad del receptor. Además, la actividad de un receptor que
activa la PKC puede ser determinada por medio del uso de
construcciones génicas informadoras conducidas por las secuencias
de control de genes activados por la activación de la PKC (véase más
adelante).
En otro método preferido para determinar la
actividad de señalización se mide la actividad MAP cinasa. Se
dispone comercialmente de varios kits, incluyendo el kit de ensayo
para la MAP cinasa p38 [New England Biolabs (nº 9820 del catálogo)]
y el ensayo FlashPlate^{TM} para MAP cinasa
(Perkin-Elmer Life Sciences).
Otro método preferido para determinar la
actividad de señalización es la medición del calcio intracelular.
En la técnica se conocen bien diversos métodos para medir el calcio
intracelular (Demaurex et al., Meth. Cell. Biol. 70:
453-474, 2002). Se dispone comercialmente de
diversos kits para medir el calcio intracelular, incluyendo los
kits de ensayo FILPR (Biocompare, Inc.). Un método preferido para
medir el calcio intracelular es el ensayo de la aequorina. La
apoaequorina mitocondrial es una proteína bioluminiscente que es
sensible a la liberación de iones calcio intracelulares como
resultado de la activación de GPCRs, tal como el CCRL2 (Stables
et al., 1997, Anal. Biochem. 252: 115-126; y
Detheux et al., 2000, J. Exp. Med. 192:
1501-1508). Generalmente, se transfectan células
que expresan un polipéptido CCRL2, para que se coexpresen
apoaequorina mitocondrial y G\alpha16. Cualquier compuesto que
active el polipéptido CCRL2, tal como un polipéptido
MIP-4, causará la liberación de calcio intracelular
y dará lugar a una emisión lumínica que podrá ser medida. Un segundo
método preferido para medir el calcio intracelular es el ensayo
Fura-2 (Molecular Probes, Eugene, Oregón,
EE.UU.).
En otros métodos preferidos para determinar la
actividad de señalización se miden cambios en la transcripción o
traducción de uno o más genes, Generalmente, en los ensayos se mide
la expresión de un gen informador conducido por secuencias de
control, tales como promotores y sitios ligantes de factores de
transcripción, sensibles a la activación del receptor. Las células
que comprenden un polipéptido CCRL2 pueden ser establemente
transfectadas con una construcción génica informadora que contenga
unas secuencias de control apropiadas. Los ensayos tienden a
implicar la medición de la respuesta de genes "inmediatos
precoces" que pueden ser rápidamente inducidos, posiblemente en
minutos, tras la activación del receptor. Los genes informadores
adecuados incluyen, pero no se limitan a los de luciferasa, CAT,
GFP, \beta-lactamasa y
\beta-galactosidasa. Un ejemplo de unas
secuencias de control que pueden ser utilizadas en un ensayo con
genes informadores son las del gen c-fos. La
inducción de la expresión de c-fos es sumamente
rápida, a menudo en minutos, tras la activación del receptor. Los
elementos reguladores de c-fos son bien conocidos en
la técnica (Verma et al., 1987, Cell 51:
513-514). Otro ejemplo de unas secuencias de
control que pueden ser utilizadas en un ensayo con genes
informadores son las reconocidas por la proteína ligante del
elemento sensible a AMP cíclico (CREB; del inglés, cAMP
responsive element binding). Otros ejemplos de
secuencias de control que pueden ser utilizadas en un ensayo con
genes informadores incluyen, pero no se limitan a, el promotor del
gen del péptido intestinal vasoactivo (VIP; del inglés,
vasoactive intestinal peptide) (Fink et
al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:
6662-6666), el promotor del gen de la somatostatina
(Montminy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:
6682-6686); el promotor de la proencefalina (Comb
et al., 1986, Nature 323: 353-356), el
promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK; del
inglés, phosphoenolpyruvate
carboxy-kinase) (Short et al., 1986, J. Biol.
Chem. 261: 9721-9726), y elementos de control
transcripcional sensibles a la actividad del factor de transcripción
AP-1 (Lee et al., 1987, Nature 325:
368-372; y Lee et al., 1987, Cell 49:
741-752) o de NF-\kappaB (Hiscott
et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:
6231-6240). Aunque, en otros ensayos sobre actividad
de señalización, un cambio de al menos 10% en presencia de un
agente candidato indica que éste modula CCRL2, en el ensayo del
informador transcripcional se requiere al menos un aumento de señal
del doble para que indique la presencia de un agente positivo. En
el ensayo sobre expresión de genes informadores, como en otros
ensayos, un agente negativo viene indicado por una disminución de
señal del 10%.
La capacidad de un agente candidato,
identificado mediante un método del invento, para modular la
actividad de señalización de un polipéptido CCRL2 puede ser
adicionalmente confirmada o analizada. Este análisis funcional se
describió anteriormente con detalle. Este análisis implica
típicamente la determinación del efecto de un agente candidato solo
sobre la actividad de señalización de un polipéptido CCRL2, y su
comparación con el efecto de un polipéptido MIP-4
sobre la actividad de señalización del polipéptido CCRL2. Para
determinar la actividad de señalización y detectar el efecto, se
puede usar cualquier formato de ensayo de señalización adecuado. El
efecto puede ser medido como un cambio en la actividad de
señalización de CCRL2. El agente puede ser un agonista, agonista
parcial, antagonista o agonista inverso de la actividad de
CCRL2.
Las comparaciones se realizan con un polipéptido
MIP-4 en su EC_{50}. La EC_{50} se refiere a la
concentración de ligando a la que la actividad de señalización es
el 50% del valor máximo para la actividad del receptor mensurable
al usar el mismo ensayo. En otras palabras, la EC_{50} es la
concentración de ligando que proporciona una activación del 50%
cuando se fija la activación del 100% en la cantidad de actividad
que no aumenta con la adición de más ligando. Ha de advertirse que
la EC_{50} de un ligando variará con la identidad del ligando;
por ejemplo, variantes de la ID. SEC. nº 6 (es decir, aquéllas que
contienen inserciones, deleciones, sustituciones, etc.) pueden
tener valores de EC_{50} mayores, menores o iguales que los de la
molécula originaria. Cuando una secuencia difiere de una secuencia
originaria, quien tiene experiencia en la técnica puede determinar
la EC_{50} para esa variante de acuerdo con métodos
convencionales. La EC_{50} de un ligando dado se mide llevando a
cabo un ensayo para una actividad de una cantidad fija de un
polipéptido CCRL2 en presencia de dosis del ligando que aumentan al
menos hasta que la respuesta de CCRL2 se satura o se hace máxima, y
representando gráficamente luego la actividad medida de CCRL2
frente a la concentración del
ligando.
ligando.
El agente candidato es considerado un agente que
modula la actividad de CCRL2 si induce al menos un 50% de la
actividad de señalización inducida por un polipéptido
MIP-4 en su EC_{50}.
En otra realización del invento, se determina el
efecto de un agente candidato o una muestra sobre la actividad
quimiotáctica de un polipéptido CCRL2. La actividad quimiotáctica de
CCRL2 es inducida por un polipéptido MIP-4. Para
determinar la actividad quimiotáctica y detectar cualquier efecto,
se puede utilizar cualquier formato de ensayo quimiotáctico
adecuado. Un ensayo quimiotáctico es una medida de la migración
celular frente a un estímulo. El efecto puede ser medido como un
cambio en la actividad quimiotáctica de CCRL2 inducida por un
polipéptido MIP-4. El cambio se refiere a un aumento
o una disminución de la actividad de señalización. Un cambio de al
menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%,
al menos 60%, al menos 70% o al menos 80% en la actividad
quimiotáctica de un polipéptido CCRL2, medida en cualquier ensayo
dado, indica que el agente candidato modula la actividad de
CCRL2.
La célula para uso en un ensayo quimiotáctico
puede ser cualquier célula adecuada que exprese CCRL2. La célula
puede ser transformada con un polinucleótido CCRL2 para que exprese
un polipéptido CCRL2. Preferiblemente, la célula es una célula
primaria tal como una célula endotelial que expresa el polipéptido
CCRL2. Las células huésped adecuadas incluyen líneas celulares
eucarióticas superiores transitorias, o preferiblemente estables,
tales como células de mamífero o células de insecto, células
eucarióticas inferiores, tales como levaduras, o células
procarióticas tales como células bacterianas. Los ejemplos
particulares de líneas celulares incluyen las células HEK293T, CHO,
HeLa y COS de mamífero. Preferiblemente, la línea celular
seleccionada será una que no sólo sea estable sino que permita
además la glicosilación madura de un polipéptido. La actividad
quimiotáctica de un polipéptido CCRL2 puede ser también medida en
ovocitos transformados.
Los métodos para determinar la actividad
quimiotáctica están bien documentados en la técnica, y se dispone
de kits. Los kits adecuados incluyen aquellos en que se utilizan
placas ChemoTx (Neuroprobe Inc.) y el sistema BD Falcon HTS
Fluoroblok con inserciones de 96 pocillos (BD Biosciences Discovery
Labware). En la bibliografía se describen ejemplos de ensayos
quimiotácticos (por ejemplo, Biber et al., Journal of
Leukocyte Biology 74: 243-251, 2003; y Zuurman
et al., informe anual del BCN 1999-2001). El
efecto de un polipéptido MIP-4 que actúa sobre un
polipéptido CCRL2 puede ser también detectado al cambiar la forma de
las células descritas en la bibliografía (por ejemplo, Heineman
et al., The Journal of Immunology 170:
4752-4758, 2003; y Stubbs et al., Journal of
Biological Chemistry 277: 26.012-26.020, 2002).
El invento proporciona además un agente
detectado mediante cualquiera de los métodos anteriormente
descritos, y el uso de dicho agente en un método para el
tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. El agente puede
ser un agonista, agonista parcial, antagonista o agonista inverso de
la actividad de CCRL2. El invento proporciona además el uso de un
agente detectado mediante cualquiera de los métodos del invento, en
la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una
enfermedad o trastorno inflamatorio, en el tratamiento de una
enfermedad o trastorno asociado con una activación aumentada de
macrófagos, o en el tratamiento de una infección. También se
proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente del
invento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El invento proporciona un método para modular la
actividad de un polipéptido CCRL2 en una célula, método que
comprende suministrar a la célula un agente detectado de acuerdo con
el invento para que se module la actividad de CCRL2. La célula
puede estar in vitro. El suministro del agente se discute más
adelante con mayor detalle.
El invento también proporciona un método para
tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio, un método para
tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad
aumentada de macrófagos y un método para tratar una infección,
métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente de acuerdo con el invento a un individuo que lo
necesita.
Un método para tratar una enfermedad o trastorno
inflamatorio del invento comprende típicamente:
(i) identificar un agente para la prevención o
el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, mediante
un método de acuerdo con el invento; y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente detectado en el punto (i) a un individuo que
tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio.
Cuando la actividad o expresión de CCRL2 está
reducida en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno
inflamatorio, un agente para uso en el tratamiento de la enfermedad
o trastorno inflamatorio es preferiblemente un agonista o
potenciador de la actividad de CCRL2 o un agente que aumenta la
expresión de CCRL2. Cuando la actividad o expresión de CCRL2 está
aumentada en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno
inflamatorio, un agente terapéutico es típicamente un antagonista
de la actividad de CCRL2 o un inhibidor de su expresión. El agente
puede unirse a un polipéptido MIP-4 que interacciona
con el receptor CCRL2, para evitar la activación del receptor; por
ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido
MIP-4.
Cuando la actividad o expresión de
MIP-4 está reducida en un sujeto que tiene una
enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente para uso en el
tratamiento de la enfermedad o trastorno inflamatorio es
preferiblemente un agonista o potenciador de la actividad de
MIP-4 o un agente que aumenta la expresión de
MIP-4. Cuando la actividad o expresión de
MIP-4 está aumentada en un sujeto que tiene una
enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente terapéutico es
típicamente un antagonista de la actividad de MIP-4
o un inhibidor de su expresión. El agente puede unirse a un
polipéptido CCRL2 que interacciona con MIP-4 y evita
la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser un
anticuerpo hacia un polipéptido CCRL2.
En todas las realizaciones anteriores, la
enfermedad o trastorno inflamatorio es preferiblemente la enfermedad
pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un
trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria
intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, aterosclerosis,
endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus
eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o
inflamación alérgica. El trastorno inflamatorio cerebral puede ser
esclerosis múltiple, un accidente cerebrovascular o una hemorragia.
La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser colitis ulcerosa o
enfermedad de Crohn. El trastorno inflamatorio óseo puede ser
artritis, incluyendo las artritis reumatoide, autoinmune e
infecciosa. La inflamación alérgica puede ser, por ejemplo, asma o
dermatitis de contacto. La enfermedad o trastorno inflamatorio puede
ser una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o relacionado
con MIP-4. En el individuo que se trata puede estar
presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o
trastorno inflamatorio. El individuo se discute más adelante con
mayor detalle.
Un método para tratar una enfermedad o trastorno
asociado con una actividad aumentada de macrófagos comprende
típicamente:
(i) identificar un agente que module la
actividad de CCRL2, mediante un método de acuerdo con el invento;
y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente identificado en el punto (i) a un individuo que
tiene la enfermedad o el trastorno.
Unos niveles aumentados de expresión de
MIP-4 dan lugar a un reclutamiento aumentado de
macrófagos que expresan CCRL2. El CCRL2 está además suprarregulado
en los macrófagos activados. Un agente para uso en el tratamiento
de una enfermedad o trastorno asociado con una activación
macrofágica aumentada es preferiblemente un antagonista de la
actividad de MIP-4/CCRL2 o un agente que inhibe la
expresión de MIP-4 o CCRL2. El agente se puede unir
a un polipéptido CCRL2 que interacciona con MIP-4 y
evitar la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser
un anticuerpo hacia un polipéptido CCRL2. El agente se puede unir a
un polipéptido MIP-4 que interacciona con el
receptor CCRL2 y evitar la activación del receptor; por ejemplo, el
agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido
MIP-4.
La enfermedad o trastorno asociado con una
actividad aumentada de macrófagos puede ser una en que se hallen
niveles aumentados de expresión de MIP-4 en el
tejido enfermo, lo que da lugar a un reclutamiento inapropiado de
macrófagos hacia el tejido. Dichas enfermedades o trastornos
incluyen la enfermedad autoinmune y la hipersensibilidad de
contacto, tal como la dermatitis alérgica.
La enfermedad o trastorno asociado con una
actividad aumentada de macrófagos puede ser una en que la actividad
anormal de los macrófagos contribuya a la enfermedad o el trastorno
o dé lugar a síntomas o complicaciones asociadas con la enfermedad
o el trastorno. El CCRL2 está suprarregulado en los macrófagos
activados y, por ello, la inhibición de la activación de CCRL2 por
MIP-4 puede evitar o mejorar los síntomas de la
enfermedad o el trastorno. Por ejemplo, los macrófagos de la grasa
contribuyen significativamente a la obesidad y a la resistencia a
la insulina relacionada con la obesidad, a través de una inflamación
crónica. Por lo tanto, la obesidad y la resistencia a la insulina
relacionada con la obesidad son dos ejemplos de dichos
trastornos.
Unos niveles aumentados de MIP-4
se asocian con el cáncer gástrico, la leucemia linfoblástica aguda
infantil y el carcinoma ovárico, concomitantes en todos los casos
con la acumulación de células de tipo macrófago. La expresión
tisularmente específica de quimiocinas particulares influye también
en el crecimiento y la metástasis tumorales. De esta manera, el
bloqueo de la interacción entre MIP-4 y CCRL2 puede
evitar la inflamación adicional de células de tipo macrófago y
reducir la expansión tumoral. De este modo, el cáncer puede ser
considerado como una enfermedad asociada con una actividad
aumentada de los macrófagos. Un agente del invento que inhiba la
interacción entre MIP-4 y CCRL2 o que actúe como un
antagonista de CCRL2 es útil en el tratamiento del cáncer, en
particular del cáncer gástrico, la leucemia linfoblástica aguda
infantil y el carcinoma ovárico.
El líquido sinovial de los individuos aquejados
de artritis reumatoide (AR) contiene niveles aumentados de muchas
citocinas. El presente inventor ha mostrado por vez primera que los
niveles de MIP-4 en el líquido sinovial de los
pacientes con AR afectan significativamente a la quimiotaxis de los
monocitos. El inventor ha demostrado que tanto la quimiotaxis
inducida por MIP-4 como la quimiotaxis inducida por
el líquido sinovial de los pacientes con AR pueden ser bloqueadas
mediante un anticuerpo contra CCRL2 y que la eliminación de
MIP-4 del líquido sinovial de los pacientes con AR
reduce la quimiotaxis de los monocitos. En consecuencia, los
inhibidores de la activación de CCRL2 por MIP-4
pueden ser utilizados en los métodos para tratar la artritis
reumatoide. Los inhibidores adecuados incluyen agonistas parciales y
antagonistas de CCRL2 así como anticuerpos
anti-MIP-4 y
anti-CCRL2.
El individuo que tiene una enfermedad o
trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada se
discute más adelante con mayor detalle.
Un método para tratar una infección comprende
típicamente:
(i) identificar un agente que module la
actividad de CCRL2, mediante un método de acuerdo con el invento;
y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente identificado en el punto (i) a un individuo que
tiene la infección.
El agente identificado en el punto (i) es
generalmente un agente que estimula la actividad de CCRL2 para que
se recluten macrófagos al sitio de infección; es decir, el agente es
preferiblemente un agonista o potenciador de la actividad de CCRL2.
El agente se administra preferiblemente en el sitio de la infección.
El agente se puede administrarse sistémicamente para estimular más
generalmente la activación de los macrófagos.
\newpage
La infección puede ser una infección causada por
cualquier organismo patógeno, tal como un virus, un hongo o una
bacteria. Preferiblemente, la infección es una infección bacteriana.
El individuo que tiene una infección se discute más adelante con
mayor detalle.
Los polipéptidos CCRL2 útiles en el invento
incluyen tanto la forma larga (CRAM-A) como la forma
corta (CRAM-B) del receptor. Por lo tanto, los
polipéptidos CCRL2 útiles en el invento incluyen los que tienen la
secuencia de ID. SEC. nº 2 ó 4. Los polipéptidos CCRL2 útiles en el
invento también incluyen polipéptidos variantes que tienen
secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, al menos 90% o al
menos 95% idénticas a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y
son funcionalmente equivalentes a CCRL2. Los polipéptidos variantes
preferidos incluyen compuestos homólogos de CCRL2 procedentes de
otra especie, tal como mono, perro, ratón, rata, cobaya o pez
cebra. También se pueden utilizar fragmentos de la ID. SEC. nº 2 ó 4
que sean funcionalmente equivalentes a CCRL2. Dichos fragmentos
pueden tener una longitud de 250 a 355 aminoácidos y tienen
preferiblemente una longitud de al menos 275, 300, 310, 320, 330 ó
340 aminoácidos. "Funcionalmente equivalente" significa que el
polipéptido CCRL2 se une a un polipéptido MIP-4 y es
capaz de activar una ruta de señalización ligada a CCRL2.
Generalmente, la unión de MIP-4 con el polipéptido
CCRL2 estimula una ruta de señalización ligada a CCRL2.
Típicamente, la ruta de señalización ligada a CCRL2 implica la
activación de Gi3. Típicamente, el polipéptido CCRL2 "se une
específicamente" a un polipéptido MIP-4. Un
polipéptido CCRL2 "se une específicamente" a un polipéptido
MIP-4 cuando se une con afinidad preferente al
polipéptido MIP-4 en comparación con otros
polipéptidos. En la técnica se conocen diversos protocolos para
unión competitiva (adicionalmente discutidos más adelante).
Los polinucleótidos CCRL2 útiles en el invento
incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido CCRL2. Los
polinucleótidos CCRL2 útiles en el invento incluyen polinucleótidos
que codifican tanto la forma larga (CRAM-A) como la
forma corta (CRAM-B) del receptor. El polinucleótido
puede comprender la secuencia de ID. SEC. nº 1 ó 3 o una secuencia
al menos 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 1 ó 3 en toda su
longitud.
Los polipéptidos MIP-4 útiles en
el invento incluyen polipéptidos que tienen la secuencia de ID. SEC.
nº 6. Los polipéptidos MIP-4 útiles en el invento
también incluyen secuencias al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%
idénticas a la ID. SEC. nº 6 en toda su longitud, que se unen a un
polipéptido CCRL2 y activan una actividad de señalización de un
polipéptido CCRL2. Los polipéptidos MIP-4 también
incluyen fragmentos de cualesquiera de los polipéptidos
MIP-4 anteriormente mencionados, que se unen a un
polipéptido CCRL2 y activan una actividad de señalización de un
polipéptido CCRL2. Los fragmentos conservan preferiblemente al menos
el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al
menos el 90% de la actividad ligante y del nivel de activación de
señalización de la ID. SEC. nº 8. Los polipéptidos
MIP-4 pueden comprender adiciones, inserciones,
deleciones o sustituciones con respecto a la ID. SEC. nº 6 con tal
de que el polipéptido resultante se una específicamente a un
polipéptido CCRL2 y active una actividad de señalización de un
polipéptido CCRL2, y conserve preferiblemente al menos el 50%, al
menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de
la actividad ligante y del nivel de activación de señalización de
la ID. SEC. nº 6.
Típicamente, el polipéptido
MIP-4 "se une específicamente" a un polipéptido
CCRL2. Un polipéptido MIP-4 "se une
específicamente" a un polipéptido CCRL2 cuando se une con
afinidad preferente al polipéptido CCRL2 en comparación con otros
polipéptidos receptores. En la técnica se conocen diversos
protocolos para unión competitiva.
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido
MIP-4 son también útiles en el invento. Los
polinucleótidos útiles en el invento incluyen polinucleótidos que
codifican un polipéptido MIP-4. El polinucleótido
puede comprender la secuencia de ID. SEC. nº 5 o una secuencia al
menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 5 en
toda su longitud.
La identidad anteriormente mencionada puede ser
calculada basándose en la identidad de nucleótidos o de aminoácidos
(a la que a veces se hace referencia como "homología
rigurosa").
Por ejemplo, el conjunto informático UWGCG
proporciona el programa BESTFIT, que puede ser usado para calcular
la homología (por ejemplo, usando los ajustes por omisión) (Devereux
et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, páginas
387-395). Se pueden usar los algoritmos PILEUP y
BLAST para calcular la homología o las secuencias de alineamiento,
tal como para identificar secuencias equivalentes o correspondientes
(típicamente con sus ajustes por omisión), como describen, por
ejemplo, S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Evol. 36:
290-300, y S. F. Altschul et al., 1990, J.
Mol. Biol. 215: 403-10.
Se usa preferiblemente un análisis BLAST para
calcular la identidad. El software para realizar análisis BLAST
está públicamente disponible a través del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este
algoritmo permite identificar primero parejas de secuencias con alta
puntuación (HSPs; del inglés, high scoring
pairs) al identificar palabras cortas de longitud W en la
secuencia en cuestión que correspondan a, o satisfagan, cierta
puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una
palabra de la misma longitud de una secuencia de la base de datos.
A "T" se hace referencia como umbral de puntuación de palabras
vecinas (Altschul et al., supra). Estos aciertos
iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para el inicio
de búsquedas para hallar HSPs que las contengan. Los aciertos de
palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada
secuencia en la medida en que se pueda aumentar la puntuación
acumulada de alineamientos. Las extensiones para los aciertos de
palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación
acumulada de alineamientos se reduce en la cantidad X con respecto
a su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o
menos a causa de la acumulación de una o más alineaciones de restos
con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia.
Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la
sensibilidad y la velocidad de la alineación. En el programa BLAST
se usan como valores por omisión una longitud (W) de palabra de 11,
la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915-10.919),
alineaciones (B) de 50, previsión (E) de 10, M = 5, N = 4, y una
comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
5873-5877). Una medida de similitud proporcionada
por el algoritmo BLAST es la probabilidad suma más pequeña
(P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de
que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias
de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se
considera similar a otra secuencia si la probabilidad suma más
pequeña en la comparación de la primera secuencia con la segunda
secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de
aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente
0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
Las secuencias homólogas difieren típicamente en
al menos 1, 2, 5, 10, 20 o más mutaciones (que pueden ser
sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos o
aminoácidos). Estas mutaciones se pueden medir a través de
cualquiera de las regiones anteriormente mencionadas en relación con
el cálculo de identidades. En el caso de proteínas, las
sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas. Éstas
se definen de acuerdo con la tabla siguiente. Los aminoácidos del
mismo bloque de la segunda columna, y preferiblemente de la misma
línea de la tercera columna, pueden ser sustituidos unos por
otros.
Cualquiera de los polipéptidos útiles en el
invento puede estar en forma de un dímero. Cualquiera de los
polipéptidos útiles en el invento puede estar además químicamente
modificado para formar un derivado. Los derivados incluyen
polipéptidos que tienen extensiones lipídicas o han sido
glicosilados. Los derivados también incluyen polipéptidos que han
sido detectablemente marcados. Los polipéptidos detectablemente
marcados han sido marcados con un grupo marcador que puede ser
fácilmente detectado. Los ejemplos de grupos marcadores incluyen,
pero no se limitan a, radioisótopos o radionucleótidos, fluoróforos
tales como la proteína fluorescente verde (GFP; del inglés, green
fluorescent protein), reactivos electrónicamente densos, agentes
sofocadores de la fluorescencia, enzimas, etiquetas de afinidad y
etiquetas de epítopos. Los radioisótopos preferidos incluyen tritio
y yodo. Las etiquetas de afinidad son marcadores que confieren la
capacidad para unir específicamente un reactivo a la molécula
marcada. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, biotina,
etiquetas de histidina, y glutatión S-transferasa
(GST). Los marcadores pueden ser detectados, por ejemplo, mediante
métodos espectroscópicos, fotoquímicos, radioquímicos, bioquímicos,
inmunoquímicos o químicos que son conocidos en la técnica.
Cualquiera de los polipéptidos útiles en el
invento puede comprender también aminoácidos o secuencias
polipeptídicas adicionales. Un polipéptido preferido útil en el
invento es un polipéptido MIP-4 con un resto de
metionina adicional fijado al extremo amínico
(Met-MIP-4) o al extremo
carboxílico. Cualquiera de los polipéptidos útiles en el invento
puede comprender secuencias polipeptídicas adicionales para que
formen proteínas de fusión. Las secuencias polipeptídicas
adicionales pueden estar fusionadas en el extremo amínico, el
extremo carboxílico o en ambos extremos, el amínico y el
carboxílico, de MIP-4. Los ejemplos de parejas de
fusión incluyen, pero no se limitan a, GST, proteína ligante de
maltosa, fosfatasas alcalinas, tiorredoxina, GFP, etiquetas de
histidina y etiquetas epitópicas (por ejemplo, Myc o FLAG). Se
pueden fusionar polipéptidos CCRL2 con una proteína ligante de GTP
(proteína G).
El invento también proporciona el uso de un
anticuerpo específico para un polipéptido MIP-4,
para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con
CCRL2. El invento también proporciona el uso de un anticuerpo
específico para un polipéptido CCRL2, para el tratamiento de una
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
Se pueden generar anticuerpos que se unan a un
polipéptido MIP-4 o a un polipéptido CCRL2. Se
pueden generar anticuerpos que se unan tanto a un polipéptido
MIP-4 como a un polipéptido CCRL2. Se pueden generar
anticuerpos contra proteínas de fusión de MIP-4,
tal como Met-MIP-4. Típicamente, el
anticuerpo "se une específicamente" o "es específico
para" un polipéptido MIP-4 o un polipéptido
CCRL2. El anticuerpo se puede unir a un sitio de glicosilación de
CCRL2. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une
específicamente" a un polipéptido o es "específico para" un
polipéptido cuando se une con afinidad preferente a la proteína para
la que es específico en comparación con otros polipéptidos, tal
como un receptor de quimiocinas o de proteínas G. En la técnica se
conocen bien diversos protocolos para ensayos inmunorradiométricos o
de unión competitiva, para determinar la capacidad ligante
específica de un anticuerpo (véase, por ejemplo, Maddox et
al., J. Exp. Med. 158: 1211-1226, 1993). Dichos
inmunoensayos implican típicamente la formación de complejos entre
la proteína específica y su anticuerpo, y la medición de la
formación de los complejos.
Para los fines de este invento, el término
"anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye
fragmentos que se unen a un polipéptido. Dichos fragmentos incluyen
los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como
anticuerpos de cadena única. Además, los anticuerpos y sus
fragmentos pueden ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR
injertada o anticuerpos humanizados.
Se pueden producir anticuerpos mediante
cualquier método adecuado. Los medios para preparar y caracterizar
anticuerpos son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo,
Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Por
ejemplo, se puede producir un anticuerpo generando en un animal
huésped un anticuerpo contra el polipéptido completo o contra un
fragmento del mismo, por ejemplo, un epítopo antigénico del mismo,
en lo sucesivo "el inmunógeno". El fragmento puede ser
cualquiera de los fragmentos aquí mencionados (típicamente de al
menos 10 o al menos 15 aminoácidos de longitud) y comprender un
polimorfismo (tal como cualquiera de los polimorfismos aquí
mencionados).
Un método para producir un anticuerpo policlonal
comprende inmunizar un animal huésped adecuado, por ejemplo, un
animal experimental, con el inmunógeno y aislar las inmunoglobulinas
del suero del animal. Por lo tanto, se puede inocular el inmunógeno
en el animal, extraer posteriormente sangre del animal y purificar
la fracción de IgG.
Un método para producir un anticuerpo monoclonal
comprende inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado.
Se pueden producir hibridomas fusionando células tumorales con
células esplénicas procedentes de un animal experimental que ha
recibido el inóculo (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:
495-497).
Mediante un procedimiento convencional, se puede
seleccionar una célula inmortalizada que produce el anticuerpo
deseado. Los hibridomas pueden ser desarrollados en cultivo o ser
inyectados intraperitonealmente, para la formación del fluido
ascítico, o en la corriente sanguínea de un huésped alogénico o un
huésped inmunocomprometido. El anticuerpo humano puede ser
preparado mediante inmunización in vitro de linfocitos
humanos, seguida de la transformación de los linfocitos con el
virus de Epstein-Barr.
Para la producción de anticuerpos tanto
monoclonales como policlonales, el animal experimental es
adecuadamente una cabra, un conejo, una rata, un ratón, una cobaya,
una gallina, una oveja o un caballo. Si se desea, el inmunógeno
puede ser administrado como un producto de conjugación en que el
inmunógeno está copulado, por ejemplo, por medio de una cadena
lateral de uno de los restos de aminoácido, con un vehículo
adecuado. La molécula vehicular es típicamente un vehículo
fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede ser
aislado y, si se desea, purificado.
Los anticuerpos que se unen a
MIP-4 son conocidos en la técnica y comercialmente
asequibles (por ejemplo, de Novus Biologicals® y R&D
Systems).
El invento proporciona un método para activar
una ruta de señalización de CCRL2 en una célula, método que
comprende introducir un polipéptido MIP-4 en una
célula. La célula puede estar in vitro. El suministro del
agente se discute más adelante con mayor detalle.
El invento proporciona además el uso de:
(i) un polipéptido MIP-4;
(ii) un polinucleótido que codifica un
polipéptido MIP-4; o
(iii) un anticuerpo específico para un
polipéptido MIP-4;
en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. La
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es preferiblemente una
enfermedad inflamatoria mediada por CCRL2, tal como la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un
trastorno inflamatorio cerebral. El trastorno inflamatorio cerebral
puede ser esclerosis múltiple, un accidente cerebrovascular o una
hemorragia. La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser colitis
ulcerosa o enfermedad de Crohn. En el individuo que se trata puede
estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. El individuo puede
presentar una predisposición genética a una enfermedad o trastorno
relacionado con CCRL2, tal como un polimorfismo.
El individuo se discute más adelante con mayor
detalle.
El invento proporciona el uso de:
(i) un polipéptido CCRL2;
(ii) un polinucleótido que codifica un
polipéptido CCRL2; o
(iii) un anticuerpo específico para un
polipéptido CCRL2;
en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4. La enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4 es preferiblemente una inflamación alérgica,
tal como asma o dermatitis de contacto. La enfermedad relacionada
con MIP-4 puede ser un cáncer, ya que unos niveles
aumentados de MIP-4 se asocian con el cáncer
gástrico, la leucemia linfoblástica aguda infantil y el carcinoma
ovárico.
En el individuo que se trata puede estar
presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o
trastorno relacionado con MIP-4. El individuo puede
presentar una predisposición genética a una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4, tal como un polimorfismo. El
individuo se discute más adelante con mayor detalle.
El invento proporciona además métodos para
diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o una
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en un
individuo. Una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es
típicamente una enfermedad o trastorno que se asocia con el gen
CCRL2. Por ejemplo, se puede asociar un polimorfismo en la región
del gen CCRL2 con la enfermedad o el trastorno. Una enfermedad o
trastorno relacionado con MIP-4 es una que se
asocia con el gen MIP-4. Por ejemplo, se puede
asociar un polimorfismo en la región del gen MIP-4
con la enfermedad o el trastorno.
La enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2
es preferiblemente una enfermedad inflamatoria mediada por CCRL2,
tal como la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis,
aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral. El trastorno
inflamatorio cerebral puede ser esclerosis múltiple, un accidente
cerebrovascular o una hemorragia. La enfermedad inflamatoria
intestinal puede ser colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En el
individuo que se diagnostica puede estar presente, o se puede
sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno relacionado
con CCRL2. La enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4 es preferiblemente una inflamación alérgica,
tal como asma o dermatitis de contacto. En el individuo que se
diagnostica puede estar presente, o se puede sospechar que esté
presente, una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4. El individuo se discute más adelante con
mayor detalle.
En una primera realización diagnóstica del
invento, el método de diagnóstico comprende llevar a cabo una
reacción de multiplicación sobre una muestra aislada de un
individuo usando cebadores específicos para MIP-4.
Luego se determina en la muestra la presencia o ausencia de un
polinucleótido que codifique un polipéptido MIP-4.
La ausencia de un polinucleótido que codifique un polipéptido
MIP-4 es indicativa de la presencia de una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. Si el polinucleótido
está presente, se compara con un patrón la cantidad del
polinucleótido multiplicado, y una diferencia en la cantidad con
respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo. El
patrón se refiere a la medición equivalente en un individuo no
afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
Los métodos de la primera realización
diagnóstica también comprenden llevar a cabo una reacción de
multiplicación sobre una muestra aislada de un individuo usando
cebadores específicos para CCRL2. Luego se determina en la muestra
la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifique un
polipéptido CCRL2. La ausencia de un polinucleótido que codifique
un polipéptido CCRL2 es indicativa de la presencia de una enfermedad
o trastorno relacionado con MIP-4. Si el
polinucleótido está presente, se compara con un patrón la cantidad
del polinucleótido multiplicado, y una diferencia en la cantidad
con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en el
individuo. El patrón se refiere a la medición equivalente en un
individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4.
La cantidad de polinucleótido puede ser medida
mediante cualquier método adecuado, tal como la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction)
cuantitativa o semicuantitativa. En estos métodos, se copia (o
multiplica) parte del polinucleótido de la muestra antes de
determinar la cantidad. Los métodos de multiplicación
"cuantitativa" son bien conocidos en la técnica (PCR Protocols,
"A Guide to Methods and Applications", Innis et al.,
Academic Press, Inc., New York, 1990).
En una segunda realización diagnóstica, el
método de diagnóstico comprende multiplicar un polinucleótido que
codifica MIP-4 a partir de una muestra aislada de un
individuo. Luego se determina la presencia de una mutación o un
polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con
CCRL2. En una realización, la secuencia de un polinucleótido
multiplicado es comparada con una información secuencial relativa a
secuencias asociadas con enfermedades o trastornos relacionados con
CCRL2 (Figura 4). Dicha información indica típicamente polimorfismos
secuenciales asociados con dichas enfermedades o trastornos.
Los métodos de la segunda realización
diagnóstica también comprenden multiplicar un polinucleótido que
codifica CCRL2 a partir de una muestra aislada de un individuo.
Luego se determina la presencia de una mutación o un polimorfismo
asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4. En una realización, la secuencia de un
polinucleótido multiplicado es comparada con una información
secuencial relativa a secuencias asociadas con enfermedades o
trastornos relacionados con MIP-4 (Figura 5). Dicha
información indica típicamente polimorfismos secuenciales asociados
con dichas enfermedades o trastornos.
La mutación o el polimorfismo se detecta
típicamente determinando directamente la presencia de la secuencia
de mutación o polimorfismo en un polinucleótido del individuo. Dicho
polinucleótido es típicamente DNA genómico, mRNA o cDNA. El
polimorfismo puede ser detectado mediante cualquier método adecuado,
tal como uno de los mencionados más adelante.
El método diagnóstico puede comprender detectar
la presencia o ausencia de una mutación o polimorfismo usando un
agente ligante específico. Un agente ligante específico es un agente
que se une con afinidad preferente o elevada a la proteína o
polinucleótido que tiene el polimorfismo pero no se une, o se une
sólo con baja afinidad, a otros polipéptidos o proteínas (tal como
un polinucleótido MIP-4 o polinucleótido CCRL2 que
no comprende la mutación ni el polimorfismo).
El agente ligante específico puede ser una sonda
o un cebador. La sonda puede ser una proteína (tal como un
anticuerpo) o un oligonucleótido. Las sondas o cebadores también se
unirán típicamente a nucleótidos y aminoácidos flanqueadores de una
o ambas caras del polimorfismo, tal como, por ejemplo, al menos 2,
5, 10,15 o más nucleótidos o aminoácidos flanqueadores en total o
en cada cara. De esta manera, una sonda o cebador puede ser total o
parcialmente complementario de todas, o parte de, las secuencias
flanqueadoras 5' y/o 3' de la mutación o el polimorfismo. La sonda
puede estar marcada o puede ser posible su marcación indirecta. La
unión de la sonda al polinucleótido o la proteína puede ser
utilizada para inmovilizar o bien la sonda la sonda o bien el
polinucleótido o la proteína.
Generalmente, la determinación de la unión
específica del agente a la mutación o el polimorfismo puede
realizarse determinando la unión del agente al polinucleótido del
individuo. Sin embargo, puede que el agente también sea capaz de
unirse a la correspondiente secuencia de tipo silvestre, por
ejemplo, uniéndose a los nucleótidos que flanquean la posición de
la mutación o el polimorfismo. En tal caso, el modo de unión a la
secuencia de tipo silvestre será detectablemente distinto al modo
de unión a un polinucleótido o proteína que contenga el
polimorfismo.
Los ensayos de ligación de oligonucleótidos
implican el uso de dos sondas oligonucleotídicas. Estas sondas se
unen a zonas adyacentes del polinucleótido que contiene la mutación
o el polimorfismo, lo que permite que (después de la unión) las dos
sondas resulten ligadas entre sí por una enzima ligasa apropiada.
Sin embargo, la presencia de un solo apareamiento erróneo en una de
las sondas puede alterar la unión y la ligación. Las sondas así
ligadas sólo se producirán con un polinucleótido que contenga la
mutación o el polimorfismo, y, por lo tanto, la detección del
producto ligado puede ser usada para determinar la presencia de la
mutación o el polimorfismo.
También se pueden utilizar sondas en un sistema
basado en el análisis de heterodúplex. En dicho sistema, la sonda,
cuando se une a una secuencia polinucleotídica que contiene la
mutación o el polimorfismo, forma un heterodúplex en el sitio en
que aparece el polimorfismo (es decir, no forma una estructura de
doble cadena). Dicha estructura heterodúplex puede ser detectada
mediante el uso de una enzima específica de cadenas sencillas o
dobles. Típicamente, la sonda es una sonda de RNA, la región
heterodúplex es escindida utilizando RNasa H, y el polimorfismo es
detectado detectando los productos de escisión.
También se pueden detectar mutaciones o
polimorfismos utilizando el análisis de apareamientos erróneos por
escisión química fluorescente, que se describe, por ejemplo, en PCR
Methods and Applications 3, 268-71 (1994) y en
Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4397-4401 (1998).
Alternativamente, se utiliza un cebador de PCR
que sólo ceba una reacción PCR si se une a un polinucleótido que
contiene la mutación o el polimorfismo (es decir, un sistema de PCR
específico de secuencias o alelos), y se puede determinar la
presencia de la mutación o el polimorfismo detectando el producto de
PCR. Preferiblemente, la región del cebador que es complementaria
de la mutación o el polimorfismo está en, o cerca de, el extremo 3'
del cebador. La presencia del polimorfismo puede ser determinada
usando un ensayo de PCR basado en un colorante fluorescente y un
agente sofocante, tal como el sistema de detección Taqman para
PCR.
Un agente ligante específico puede ser capaz de
unirse específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por
una secuencia mutada o polimórfica. Por ejemplo, el agente puede ser
un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método de detección
se puede basar en un sistema ELISA.
\newpage
El método puede ser un sistema basado en RFLP.
Éste se puede utilizar si la presencia del polimorfismo en el
polinucleótido crea o destruye un sitio de restricción que es
reconocido por una enzima de restricción.
La presencia de la mutación o el polimorfismo
puede ser determinada basándose en el cambio que la presencia de la
mutación o el polimorfismo ejerce sobre la movilidad del
polinucleótido durante una electroforesis en gel. En el caso de un
polinucleótido, se puede utilizar un análisis por polimorfismos
conformacionales de cadena sencilla (SSCP; del inglés,
single-stranded conformational
polymorpohism) o mediante electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante (DGGE; del inglés, denaturing
gradient gel electrophoresis).
En otro método para detectar la mutación o el
polimorfismo, un polinucleótido que comprende la región polimórfica
es secuenciado a través de la región que contiene el polimorfismo
para determinar la presencia del polimorfismo. Los métodos de la
segunda realización diagnóstica pueden ser llevados a cabo
utilizando una matriz, tal como un chip de DNA. Por ejemplo, se
puede inmovilizar una sonda sobre un chip de DNA.
En una tercera realización diagnóstica del
invento, el método de diagnóstico comprende poner una muestra
aislada de un individuo, que comprende un polipéptido CCRL2, en
contacto con un polipéptido MIP-4 bajo unas
condiciones que permiten la unión del polipéptido
MIP-4 con el polipéptido CCRL2. Luego se mide la
actividad del polipéptido CCRL2. Luego se compara la actividad de
este polipéptido CCRL2 con la de un patrón, y una diferencia de
actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la
presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el
individuo. Este patrón se refiere a la medición equivalente en un
individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con
CCRL2.
Los métodos de la tercera realización
diagnóstica también comprenden poner una muestra aislada de un
individuo, que comprende un polipéptido MIP-4, en
contacto con un polipéptido CCRL2 bajo unas condiciones que permiten
la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido
CCRL2. Luego se mide la actividad del polipéptido CCRL2. Luego se
compara la actividad de este polipéptido CCRL2 con la de un patrón,
y una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es
indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado
con MIP-4 en el individuo. Este patrón se refiere a
la medición equivalente en un individuo no afectado por la
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
Las condiciones que permiten la unión de un
polipéptido MIP-4 con un polipéptido CCRL2 son, por
ejemplo, la temperatura, la concentración de sales, el pH y la
concentración de proteínas, bajo las cuales se une un polipéptido
MIP-4 con un polipéptido CCRL2. Las condiciones de
unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, tal
como, por ejemplo, si en el ensayo se utilizan células viables o
sólo una fracción de membrana de las células. Sin embargo, puesto
que CCRL2 es un receptor de la superficie celular y los polipéptidos
MIP-4 son polipéptidos secretados que interaccionan
con el dominio extracelular de CCRL2, las condiciones preferidas
incluirán generalmente una concentración salina (aproximadamente 90
mM) y un pH (aproximadamente de 7,0 a 8,0) fisiológicos. La
temperatura para la unión puede variar de 4ºC a 37ºC, pero es
preferiblemente 4ºC. También variará la concentración del
polipéptido MIP-4, pero será preferiblemente de
aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 \muM.
Los métodos de todas las realizaciones
diagnósticas se llevan a cabo in vitro sobre una muestra del
individuo. La muestra comprende típicamente un fluido corporal y/o
células del individuo y se puede obtener, por ejemplo, utilizando
una aguja y una jeringa o utilizando una torunda, tal como una
torunda bucal. La muestra puede ser una muestra de sangre, orina,
saliva, piel, células del carrillo o raíces capilares. La muestra es
preferiblemente una muestra sanguínea que comprende monocitos. La
muestra es típicamente procesada antes de que se lleve el método a
cabo; por ejemplo, se puede llevar a cabo una extracción de DNA, se
pueden cultivar las células o se puede preparar una fracción de
membrana a partir de las células. Se puede escindir física o
químicamente (por ejemplo, utilizando una enzima adecuada) el
polinucleótido o la proteína de la muestra. En una realización, la
parte de polinucleótido de la muestra es copiada (o multiplicada)
mediante, por ejemplo, clonación o utilizando un método basado en
PCR, antes de determinar la presencia de mutaciones o
polimorfismos.
El invento proporciona un método para determinar
la presencia de una mutación o polimorfismo de MIP-4
asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, o
una mutación o polimorfismo de CCRL2 asociado con una enfermedad o
trastorno relacionado con MIP-4. La secuencia de un
polinucleótido o polipéptido MIP-4 asociado con una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 puede ser almacenada en
un formato electrónico, tal como, por ejemplo, en una base
informática de datos. La secuencia de un polinucleótido o
polipéptido CCRL2 asociado con una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4 puede ser almacenada en un
formato electrónico, tal como, por ejemplo, en una base informática
de datos. La base de datos puede incluir información adicional
acerca de los polinucleótidos o polipéptidos. Por ejemplo, la base
de datos puede proporcionar uno o más aspectos de los siguientes
tipos de información: el nivel de asociación del polinucleótido o el
polipéptido con una enfermedad o un trastorno, la frecuencia del
polinucleótido o el polipéptido en pacientes aquejados del
trastorno, la probabilidad de que un paciente que tiene ese
polinucleótido o polipéptido desarrolle una enfermedad o un
trastorno, y la interacción del polinucleótido o el polipéptido con
un agente terapéutico.
Los métodos diagnósticos del invento pueden ser
llevados a cabo por medios electrónicos utilizando, por ejemplo, un
sistema informático. En consecuencia, el presente invento
proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno
relacionado con CCRL2 o para determinar la susceptibilidad de un
individuo a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2,
método que comprende determinar si el individuo tiene un
polinucleótido o polipéptido MIP-4 que comprende
una mutación asociada con una enfermedad o trastorno relacionado con
CCRL2:
(i) obteniendo opcionalmente datos de la
secuencia de MIP-4 de una muestra obtenida de un
individuo;
(ii) introduciendo los datos de la secuencia de
MIP-4 de dicho individuo en un ordenador;
(iii) comparando dichos datos con datos de la
secuencia de MIP-4 almacenados en una base
informática de datos, base de datos que comprende información
relativa a datos de la secuencia de MIP-4 con
respecto a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2; y
(iv) determinando, basándose en dicha
comparación, la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno
relacionado con CCRL2 en dicho individuo o si dicho individuo es
susceptible de una enfermedad o trastorno relacionado con
CCRL2.
En consecuencia, el presente invento también
proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4 o para determinar la
susceptibilidad de un individuo a una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4, método que comprende
determinar si el individuo tiene un polinucleótido o polipéptido que
comprende una mutación asociada con una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4:
(i) obteniendo opcionalmente datos de la
secuencia de CCRL2 de una muestra obtenida de un individuo;
(ii) introduciendo los datos de la secuencia de
CCRL2 de dicho individuo en un ordenador;
(iii) comparando dichos datos con datos de la
secuencia de CCRL2 almacenados en una base informática de datos,
base de datos que comprende información relativa a datos de la
secuencia de CCRL2 con respecto a una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4; y
(iv) determinando, basándose en dicha
comparación, la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno
relacionado con MIP-4 en dicho individuo o si dicho
individuo es susceptible de una enfermedad o trastorno relacionado
con MIP-4.
Los datos de la secuencia de
MIP-4 o CCRL2 se pueden obtener de dicha muestra
mediante cualquier medio adecuado, tal como uno de los aquí
discutidos. Se puede obtener la secuencia de todo el gen
MIP-4 o CCRL2 o de parte de él. Para obtener los
datos de las secuencias, se pueden utilizar protocolos de
secuenciación estándares conocidos en la técnica.
Los datos de la secuencia de
MIP-4 o los datos de la secuencia de CCRL2 pueden
ser guardados en una base de datos que comprenda información
relativa a dos o más mutaciones o polimorfismos que están asociados
con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o una
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4,
incluyendo polimorfismos en los genes MIP-4 y/o
CCRL2 y mutaciones o polimorfismos en genes distintos de los genes
MIP-4 y CCRL2.
El invento también proporciona un aparato que
comprende medios para determinar la susceptibilidad de un individuo
a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, o a una
enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4,
basándose en la presencia de mutaciones o polimorfismos presentes en
el gen MIP-4 y/o el gen CCRL2 de dicho
individuo.
El invento proporciona además un programa
informático que comprende un medio de códigos de programa que,
cuando se ejecuta en un sistema informático, instruye al sistema
informático para que lleve a cabo un método de diagnóstico de
acuerdo con el invento. También se proporciona un producto de
programa informático que comprende o bien un medio de
almacenamiento legible por ordenador que tiene grabado en él un
programa informático, o bien un medio de códigos de programa sobre
una onda portadora, que, cuando se ejecuta en un sistema
informático, instruye al sistema informático para que lleve a cabo
un método del invento.
En todas las realizaciones terapéuticas y
diagnósticas anteriormente discutidas, el individuo es típicamente
un individuo mamífero, tal como, por ejemplo, un mamífero mantenido
como un animal de compañía o por razones agrícolas o deportivas. En
una realización, el mamífero es uno en que aparece naturalmente una
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 (sin intervención del
hombre). El mamífero puede ser un animal bovino, porcino, canino,
felino, roedor (tal como un ratón, una rata o un hámster) o primate.
En una realización preferida, el individuo es un individuo
humano.
\newpage
El presente invento proporciona diversos kits
para detectar agentes que modulan la actividad de CCRL2. Estos kits
comprenden:
- (i) un polipéptido MIP-4 y
(ii) un polipéptido CCRL2 o un polinucleótido aislado que codifica
un polipéptido CCRL2;
- un polipéptido MIP-4 y una
célula transformada con un polinucleótido que codifica un
polipéptido CCRL2: o
- un polipéptido MIP-4 y una
fracción de membrana celular que comprende un polipéptido CCRL2.
El kit puede comprender además uno o más
reactivos o instrumentos diferentes que permitan que se lleve a cabo
cualquiera de las realizaciones de los métodos anteriormente
mencionados. Dichos reactivos o instrumentos incluyen uno o más de
los siguientes: un medio para detectar la unión del agente al
polipéptido CCRL2, un marcador detectable (tal como un marcador
fluorescente), una enzima capaz de actuar sobre un polinucleótido
(típicamente una polimerasa, enzima de restricción, ligasa, RNasa H
o una enzima que pueda fijar un marcador a un polinucleótido),
un(os)
tampón(es) adecuado(s) (disoluciones acusas) para reactivos enzimáticos, cebadores de PCR, un testigo positivo y/o negativo, un aparato para electroforesis en gel, un medio para aislar DNA de una muestra, un medio para obtener una muestra del individuo (tal como un instrumento que comprenda una aguja) y un soporte que comprenda pocillos sobre los cuales se puedan realizar reacciones de detección.
tampón(es) adecuado(s) (disoluciones acusas) para reactivos enzimáticos, cebadores de PCR, un testigo positivo y/o negativo, un aparato para electroforesis en gel, un medio para aislar DNA de una muestra, un medio para obtener una muestra del individuo (tal como un instrumento que comprenda una aguja) y un soporte que comprenda pocillos sobre los cuales se puedan realizar reacciones de detección.
El invento proporciona además el uso de células
de levadura transformadas (o transfectadas) con un polinucleótido
CCRL2 en un método del invento. Los métodos para la transformación
(o transfección) de células de levadura son bien conocidos en la
técnica (Davey et al., "Pheromone procedures in fission
yeast", 1995, en Microbial Gene Techniques: Methods in Molecular
Genetics 6B, K. W. Adolph, San Diego, Academic Press:
247-263; y Ladds et al., Molecular
Microbiology 47 (3): 781-792, 2003).
El polinucleótido CCRL2 comprende
preferiblemente la secuencia de ID. SEC. nº 1 ó 3 o una secuencia al
menos 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 1 ó 3 en toda su
longitud. Se pueden introducir polinucleótidos CCRL2 en las células
utilizando acetato de litio, electroporación o transformación de
esferoplastos (Davey et al., "Pheromone procedures in
fission yeast", 1995, en Microbial Gene Techniques: Methods in
Molecular Genetics 6B, K. W. Adolph, San Diego, Academic Press:
247-263; y Ladds et al., Molecular
Microbiology 47 (3): 781-792, 2003). También se
pueden incorporar polinucleótidos CCRL2 a un vector recombinante.
Preferiblemente, se une operativamente un polinucleótido CCRL2, en
un vector, con una secuencia de control que es capaz de proporcionar
la expresión de la secuencia de codificación por la célula huésped
de levadura; es decir, el vector es un vector de expresión. Dichos
vectores de expresión pueden ser utilizados para que se exprese el
polipéptido CCRL2.
La expresión "operativamente unido" se
refiere a una yuxtaposición en que los componentes descritos están
en una relación que les permite actuar del modo previsto. Una
secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia de
codificación está ligada de tal modo que la expresión de la
secuencia de codificación se lleva a cabo bajo unas condiciones
compatibles con las secuencias de control. Se pueden introducir
múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido CCRL2 en el
vector.
Con dichos vectores se puede transformar una
célula de levadura huésped adecuada para que proporcione la
expresión de un polipéptido CCRL2. De esta manera, se puede obtener
un polipéptido CCRL2 cultivando una célula de levadura huésped
transformada o transfectada con un vector de expresión como el
anteriormente descrito bajo unas condiciones que conduzcan a la
expresión del polipéptido, y recuperando el polipéptido expresado.
Más preferiblemente, dichas células huésped pueden ser utilizadas
en los métodos de exploración del invento.
Para que se exprese un polipéptido CCRL2 en la
célula de levadura, se puede utilizar cualquier vector adecuado.
Los lectores pueden ser, por ejemplo, un vector plasmídico provisto
de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la
expresión del citado polinucleótido y opcionalmente un regulador del
promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores
seleccionables, tal como, por ejemplo, URA3, HIS3, LEU2, TRP1,
LYS2 o un gen de resistencia a la tetraciclina. Los promotores y
demás señales para la regulación de la expresión pueden ser
seleccionados para que sean compatibles con la célula huésped para
la cual se diseña el vector de expresión. Se puede transformar la
célula huésped con múltiples copias del mismo o diferente
polinucleótido CCRL2 en un solo vector de expresión, o con más de un
vector de expresión cada uno de los cuales incluya un
polinucleótido CCRL2 que puede ser igual o diferente.
La secuencia promotora es preferiblemente una
secuencia promotora procedente de una célula de levadura y, en
particular, de Saccharomyces cerevisiae o
Schizosaccharomyces pombe. Los promotores adecuados para la
expresión del polinucleótido CCRL2 en células de levadura incluyen
GAL, GAL10, PHO5, ADHI, PGK y GPDI (Schneider y
Guarente, Methods Enzymol. 194: 373-388, 1991) y el
promotor nmt-1 reprimible por tiamina (Ladds et
al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792,
2003). Los vectores de expresión adecuados para la expresión del
polinucleótido CCRL2 en células de levadura incluyen pBM150, pYEp51,
pLGSD5, YEp51, pAM82, pYE4, pAAh5, pMA56, pAH9/10/21, pMA230, pMA91
y pG-1/2 (Schneider y Guarente, Methods Enzymol.
194: 373-388, 1991). El promotor o el vector se
escogerán para que sean compatibles con la célula de levadura
huésped que se va a transformar.
Preferiblemente, la levadura es Saccharomyces
cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe.
En una realización, las células de levadura
pueden ser trasplantes de proteína G en que al menos 5, al menos
10, al menos 15 o al menos 20 aminoácidos del extremo carboxílico de
la subunidad G\alpha de la levadura han sido sustituidos por los
correspondientes restos de una proteína G que no es de levadura,
preferiblemente una proteína G humana. Preferiblemente, los 5
aminoácidos C-terminales son sustituidos por los
correspondientes restos de una proteína G humana. Preferiblemente,
la proteína G humana corresponde a la proteína G con la que
interacciona naturalmente el polipéptido CCRL2, por lo que la
expresión del polipéptido CCRL2 en la célula de levadura da lugar a
una asociación funcional con la proteína G trasplantada. La
asociación funcional permite que el polipéptido CCRL2 active la
maquinaria de señalización de la célula de levadura. En la célula de
levadura se puede introducir un gen informador bajo el control de
un promotor que es activado por la maquinaria de la célula de
levadura. Luego se puede usar la expresión del gen informador para
determinar la actividad del CCRL2. Los genes informadores adecuados
incluyen LacZ y GFP. El gen informador se puede integrar en el
cromosoma de la célula de levadura. La célula de levadura puede
proceder de una cepa con la construcción informadora sxa2>lacZ
(Didmon et al., Curr. Genet. 41: 241-253,
2002; y Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3):
781-792, 2003).
Las células de levadura con trasplante de
proteína G del invento pueden ser utilizadas en los métodos de
exploración del invento. Las proteínas G adecuadas que no son de
levadura incluyen Gpa1, Gs, Gi, Go, Gq, Gz, G12, G13, G14 y G16. La
proteína G es preferiblemente Gi y, más preferiblemente, Gi3.
Las células con trasplante de proteína G pueden
ser generadas del modo descrito por Ladds et al., Molecular
Microbiology 47 (3): 781-792, 2003.
En consecuencia, una célula de levadura
preferida proporcionada por el invento comprende un polipéptido
CCRL2, una proteína Gi3 y, opcionalmente, una construcción
informadora. El polipéptido CCRL2 comprende preferiblemente la
secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4. La proteína Gi3
comprende preferiblemente 5 restos
carboxi-terminales de Gi3 humana fusionados con una
proteína G de levadura en la que se han suprimido los 5 restos
carboxi-terminales correspondientes.
Cuando la administración tiene la finalidad de
tratamiento, la administración puede tener una finalidad
profiláctica o terapéutica. Cuando se proporciona
profilácticamente, el agente o polipéptido, el polinucleótido o el
anticuerpo se proporciona antes de cualquier síntoma. Puede que en
el individuo se haya identificado una predisposición genética a una
enfermedad o trastorno inflamatorio. Por ejemplo, cuando la
enfermedad o trastorno inflamatorio es una enfermedad o trastorno
relacionado con CCRL2, tal como enfermedad inflamatoria intestinal,
aterosclerosis, endometriosis o una enfermedad inflamatoria
cerebral, el individuo puede tener en el gen CCRL2 un polimorfismo
que esté asociado con la enfermedad o el trastorno. La
administración profiláctica del agente o polipéptido, el
polinucleótido o el anticuerpo sirve para evitar o atenuar cualquier
síntoma subsiguiente. Cuando se proporciona terapéuticamente, el
agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo se
proporciona al inicio de un síntoma o después, preferiblemente poco
después, del inicio de un síntoma. La administración terapéutica del
agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo sirve para
atenuar cualquier síntoma presente. La administración y, por lo
tanto, los métodos del invento se pueden llevar a cabo in
vivo o in vitro.
La formulación de cualquiera de los agentes
terapéuticos aquí mencionados, incluyendo polipéptidos,
polinucleótidos y anticuerpos, dependerá de factores tales como la
naturaleza del agente y el estado que se va a tratar. Cualquiera de
dichos agentes se puede administrar o suministrar en una diversidad
de formas de dosificación. Se puede administrar o suministrar oral
(por ejemplo, en forma de tabletas, trociscos, pastillas,
suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos),
parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal o
transdérmicamente, o mediante técnicas de infusión o inhalación. El
agente puede ser también administrado o suministrado en forma de
supositorio. Un médico podrá determinar la vía de administración o
suministro requerida para cada paciente concreto.
Típicamente, el agente se formula para uso con
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o
diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una disolución
isotónica. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener,
junto con el compuesto activo, diluyentes tales como, por ejemplo,
lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz o almidón de
patata; lubricantes tales como, por ejemplo, sílice, talco, ácido
esteárico, estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicoles;
agentes aglutinantes tales como, por ejemplo, almidones, gomas
arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o
polivinilpirrolidona; agentes disgregantes tales como, por ejemplo,
almidón, ácido algínico, alginatos o
almidón-glicolato sódico; mezclas efervescentes;
colorantes; agentes edulcorantes; agentes humectantes tales como
lecitina, polisorbatos y laurilsulfatos; y, en general, sustancias
atóxicas y farmacológicamente inactivas utilizadas en formulaciones
farmacéuticas. Dichas preparaciones farmacéuticas pueden ser
fabricadas de un modo conocido por medio de, por ejemplo,
procedimientos de mezclamiento, granulación, formación de tabletas,
revestimiento con azúcar o revestimiento con película.
\newpage
Las dispersiones líquidas para administración
oral pueden ser jarabes, emulsiones y suspensiones. Como vehículos,
los jarabes pueden contener, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con
glicerol y/o manitol y/o sorbitol.
Como vehículo, las suspensiones y emulsiones
pueden contener, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato
sódico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o
poli(alcohol vinílico). Las suspensiones o disoluciones para
inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el compuesto
activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como, por
ejemplo, agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo o glicoles,
tal como, por ejemplo, propilenglicol, y, si se desea, una cantidad
adecuada de hidrocloruro de lidocaína.
Como vehículo, las disoluciones para infusiones
o inyecciones intravenosas pueden contener, por ejemplo, agua
estéril, o, preferiblemente, pueden estar en forma de disoluciones
salinas acuosas, isotónicas y estériles.
Se administra una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
agente es una cantidad que alivia los síntomas o que evita o retrasa
el inicio de los síntomas de una enfermedad o trastorno
inflamatorio.
La dosis puede ser determinada de acuerdo con
diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la sustancia
utilizada; la edad, el peso y el estado del paciente que se va a
tratar; la vía de administración; y el régimen requerido. De nuevo,
un médico podrá determinar la vía de administración y la
dosificación requeridas para cualquier paciente concreto. Una dosis
diaria típica es de aproximadamente 0,1 a 50 mg por kg,
preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso
corporal, de acuerdo con la actividad del inhibidor específico, la
edad, el peso y el estado del sujeto que se va a tratar, el tipo y
la gravedad de la enfermedad, y la frecuencia y la vía de
administración. Preferiblemente, los niveles de dosificación diarios
son de 5 mg a 2 g.
El presente invento se describe con referencia a
los siguientes ejemplos no restrictivos.
Se generaron cepas de levadura de la manera
descrita por Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3):
781-792, 2003.
Todos los ensayos se llevaron a cabo mediante
protocolos estándares de Septegen (Ladds et al., Molecular
Microbiology 47 (3): 781-792, 2003). Las cepas de
levadura se incubaron con el ligando durante 16 horas antes de
examinar la actividad LacZ.
Se recibió MIP-4 de R&D
Systems y se guardó a -20ºC hasta su uso. Se disolvió
MIP-4 en medio de crecimiento que contenía albúmina
sérica bovina (BSA) al 0,1% para obtener una disolución de reserva
de 11,1 \muM (50 \mug de quimiocina en un volumen final de 577
\mul). Para la exploración inicial de las cepas con trasplante de
proteína G, se diluyeron 210 \mul de la reserva 11,1 \muM hasta
un volumen final de 2,1 ml para obtener una concentración de
trabajo de 1,11 \muM.
Para cada una de las cepas con trasplante de G,
se añadieron 180 \mul de la disolución 1,11 \muM a 20 \mul de
células. El volumen de ensayo final fue 200 \mul y la
concentración final de MIP-4 fue 1 \muM. La
MIP-4 activaba la forma corta de CCRL2
(CRAM-B) en las cepas con trasplante de Gi3 (Figura
1).
Basándose en la exploración inicial frente a
todos los trasplantes de G, se examinó la MIP-4
frente al trasplante de Gi3 en un intervalo de concentraciones. A
partir de la reserva 11,1 \muM, se realizó una serie de diluciones
por un factor de 10 (30 \mul más 270 \mul). Para cada muestra,
se añadieron 180 \mul de la reserva apropiadamente diluida a 20
\mul de células (concentraciones finales de 10 \muM, 1 \muM,
etc.). La respuesta de las células con trasplante de Gi3 aumentaba
exponencialmente con las concentraciones crecientes de
MIP-4 (Figura 2).
Para confirmar que las respuestas presentadas
por las diversas quimiocinas dependen del receptor CCRL2, se
examinaron las tres quimiocinas frente a una cepa de levadura
apropiada que expresa el receptor del factor liberador de
corticotropina (CRFR). Ésta se escogió como cepa testigo ya que
tiene agonistas peptídicos e interacciona con los trasplantes de
Gq, Gi2 y Gi3, y la interacción depende de la identidad del ligando.
La MIP-4 era activa frente a la forma corta de
CCRL2 (CRAM-B) en el transplante de Gi3 (10^{-6} M
daba lugar a \sim 6,5 unidades de LacZ) (Figura 3). La proteína 1
quimiotáctica de monocitos (MCP-1; del inglés,
monocyte chemotactic
protein-1) era activa frente a la forma corta
de CCRL2 (CRAM-B) en el transplante de Gq (10^{-6}
M daba lugar a \sim 5,7 unidades de LacZ) (Figura 3). La proteína
3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3) era activa
frente a la forma corta de CCRL2 (CRAM-B) en el
transplante de Gi2 (10^{-6} M daba lugar a \sim 2,2 unidades de
LacZ) (Figura 3).
El factor liberador de corticotropina (CRF) era
activo frente a CRF-R1 en el transplante de Gi2
(10^{-6} M daba lugar a \sim 6,4 unidades de LacZ) y el
transplante de Gi3 (10^{-6} M daba lugar a \sim 17,2 unidades de
LacZ) (Figura 3). La urocortina era activa frente a
CRF-R1 en el transplante de Gq (10^{-6} M daba
lugar a \sim 6,9 unidades de LacZ).
Se revistió previamente con 10 \mug/ml de
fibronectina una placa ChemoTx (Neuroprobe) de 96 pocillos y un
tamaño de poro de 8 \mum. Células transfectadas fueron
fluorescentemente marcadas con 5 \mug/ml de calceína (Molecular
Probes) durante 30 minutos a 37ºC. A las cámaras superior e inferior
de la placa ChemoTx se aplicaron 25 \mul de células en una
densidad de 3 x 10^{6} células/ml y muestras de ensayo (29 \mul)
preparadas en medios apropiados. Después de una incubación a 37ºC
durante 5 horas, se eliminaron las células que quedaban en la parte
superior del filtro mediante tratamiento con EDTA y, en un lector de
placas fluorescentes (Perkin Elmer), se cuantificaron las células
migradas de la cara inferior del filtro y de los pocillos. Los
resultados se muestran en la Figura 6.
MIP-4 estimulaba la quimiotaxis
de las células transfectadas con la forma corta de CCRL2
(CRAM-B). MIP-4 no ejercía efecto
alguno sobre las células que no habían sido transfectadas con la
forma corta de CCRL2 (CRAM-B).
MCP-1 y MCP-3,
que activaban la forma corta de CCRL2 en el ensayo con levaduras,
también mostraban actividad en el ensayo de quimiotaxis. Como
quimiocina testigo, RANTES, que fallaba a la hora de mostrar
activación de CCRL2 en el ensayo con levaduras, no provocaba la
quimiotaxis de las células transfectadas con CCRL2.
MIP-4 y MCP-3, ambas en una
concentración 10 nM, provocaban una actividad quimiotáctica similar,
atravesando la membrana aproximadamente un 35% más de células que
en el caso de las células no tratadas. Las células sólo mostraban
una débil respuesta quimiotáctica en presencia de
MCP-1 10 nM.
Se purificaron (> 85%) monocitos humanos de
la capa linfocítica (centrifugación en gradiente de densidades)
utilizando una estrategia de marcación indirecta (kit II para
aislamiento de monocitos, Miltenyi Biotech) y se cultivaron durante
5 días en medio RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal
(FCS) al 10%.
Se examinó la competencia quimiotáctica de
monocitos cultivados, utilizando cámaras para quimiotaxis de 96
pocillos (HTS Fluroblok^{TM}, BD Falcon). Los monocitos cultivados
fueron previamente marcados con 5 ng/ml de calceína AM (Molecular
Probes) durante 30 minutos a 37ºC y fueron lavados en disolución
salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate
buffered saline), y luego se añadieron 3 x 10^{4}
células (6 x 10^{5} células/ml) a la cámara superior. Se añadió
la quimiocina de ensayo (R&D Systems) en una concentración 10
nM a la cámara inferior y se incubó la placa para quimiotaxis a
temperatura ambiental durante 10 minutos antes de la recogida de
datos utilizando un fluorómetro Victor^{2} (Perkin Elmer). Todas
las muestras se analizaron por triplicado.
Se obtuvieron anticuerpos
anti-CCRL2 de R&D Systems. Para los experimentos
de bloqueo con anticuerpos, los monocitos marcados con calceína AM
fueron previamente incubados con concentraciones variables de
anticuerpos anti-CCRL2 durante 30 minutos a
temperatura ambiental. El anticuerpo no unido fue separado mediante
lavado con PBS antes de la adición a la placa para quimiotaxis. La
quimiotaxis se llevó a cabo del modo anteriormente descrito. Los
resultados se muestran en la Figura 7.
El efecto del tratamiento previo, con
anticuerpos contra CCRL2, de los monocitos cultivados demuestra que
la quimiotaxis de estas células tratadas, provocada por
MIP-4, se reduce en aproximadamente un 75%. Como
control, el tratamiento previo de las células con un anticuerpo
contra un receptor quimiocínico que no genera señales a través de
MIP-4 no muestra efecto alguno sobre la quimiotaxis
(no mostrado).
Estos datos muestran que el anticuerpo
anti-CCRL2 es capaz de reducir el efecto
quimiotáctico de MIP-4 sobre monocitos cultivados.
Esto confirma que MIP-4 es un ligando de CCRL2 en
células inmunes humanas primarias.
Se cultivaron y aislaron monocitos de la manera
anteriormente descrita. La placa para quimiotaxis fue dispuesta con
monocitos no tratados o tratados con anticuerpo
anti-CCRL2, de nuevo del modo anteriormente
descrito. El líquido sinovial fue extraído mediante aspiración
articular, centrifugado para separar las células y los fragmentos
celulares, y luego fraccionado en partes alícuotas y congelado hasta
ser necesario. Se pusieron diluciones de líquido sinovial en la
cámara inferior de la placa y se analizaron de la manera
anteriormente descrita.
Los resultados (mostrados en la Figura 8)
demuestran que el tratamiento previo, con un anticuerpo
anti-CCRL2, de los monocitos cultivados permite
bloquear la quimiotaxis provocada por líquido sinovial diluido
(1/100) de pacientes con artritis reumatoide (AR). La máxima
concentración de anticuerpo examinada (250 \mug/ml) reducía la
quimiotaxis de los monocitos en aproximadamente un 50%. Esto
demuestra que los antagonistas de CCRL2 podrían reducir la
quimiotaxis de células inmunes a sitios inflamatorios tales como los
de pacientes con artritis reumatoide y otros trastornos
inflamatorios.
Se agotó la MIP-4 de líquido
sinovial de pacientes con AR (RASF; del inglés, rheumatoid
arthritis synovial fluid) usando un método de
RASF diluido por lavado (SF3 1:100) sobre placas revestidas con
anti-MIP-4. El anticuerpo
anti-MIP-4 unido a las placas fue
adquirido a R&D Systems (Nº MAB394 del Catálogo). Estas muestras
agotadas fueron luego usadas para examinar los efectos que este
agotamiento ejercía sobre la quimiotaxis de monocitos cultivados
provocada por el RASF.
Se cultivaron y aislaron monocitos y se llevó la
quimiotaxis a cabo de la manera anteriormente descrita.
El procedimiento para separar
MIP-4 no agotó completamente la
MIP-4. Sin embargo, la reducción de los niveles de
MIP-4 fue acompañada de una reducción de la
quimiotaxis (SF3 1:100 agotado). Una reducción del 97% (de 5 ng/ml
hasta 170 pg/ml) en el nivel de MIP-4 del RASF
diluido reducía la quimiotaxis de monocitos en aproximadamente un
30%. Esto se representa más adelante en la Figura 9.
El nivel de MIP-4 (170 pg/ml)
que quedaba en el RASF después del agotamiento era aún capaz de
provocar una respuesta quimiotáctica. Esto se muestra en la Figura
9, que demuestra que 250 pg/ml de rMIP-4 en PBS aún
dan lugar a un aumento de 0,5x en la quimiotaxis de los
monocitos.
Estos datos demuestran que MIP-4
es un mediador importante de la quimiotaxis provocada por monocitos,
hallada en el líquido sinovial de pacientes con AR. Por lo tanto,
los anticuerpos específicos para MIP-4 son útiles
en la artritis reumatoide y en otros trastornos inflamatorios al
reducir la cantidad de células inmunes que se infiltran, tanto
monocitos/macrófagos como neutrófilos en el caso de la AR, lo que
posiblemente reduciría los síntomas de la enfermedad.
<110> OXAGEN LIMITED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ligando
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N.89652C GCW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0328275.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0403014.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0418568.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-08-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(1118)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (328)..(1362)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(330)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
Claims (25)
1. Un método in vitro para detectar un
agente que module la actividad de CCRL2, método que comprende:
(a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con
un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos
(MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo
unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la
unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido
CCRL2; y
(b) determinar si el agente candidato es capaz
de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho
polipéptido MIP-4.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que:
(a) el polipéptido MIP-4 es un
polipéptido que comprende:
- (i)
- la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
- (ii)
- una secuencia que es al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
o es un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une
a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; y/o
\vskip1.000000\baselineskip
(b) el polipéptido CCRL2 es un polipéptido que
comprende:
- (i)
- la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4; o
- (ii)
- una secuencia que es al menos 80% idéntica a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente equivalente a CCRL2; o
- (iii)
- un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es funcionalmente equivalente a CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en que el agente candidato es un
polipéptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al
antígeno, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico o un
compuesto químico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en que la operación (b) comprende:
- (i)
- determinar la unión del polipéptido CCRL2 con el polipéptido MIP-4;
- (ii)
- determinar la actividad de señalización del polipéptido CCRL2; o
- (iii)
- determinar la actividad quimiotáctica del polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 4,
en que:
- (i)
- la unión del polipéptido CCRL2 con el polipéptido MIP-4 se determina usando desplazamiento de marcadores, resonancia de plasmones superficiales, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, sofocamiento de fluorescencia o polarización de fluorescencia; o
- (ii)
- la actividad de señalización se determina mediante la medición de la unión de nucleótidos de guanosina, la actividad GTPasa, la actividad adenilato ciclasa, adenina monofosfato cíclica (cAMP), la actividad proteína cinasa C, la descomposición del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, la actividad MAP cinasa, la expresión de genes informadores o la actividad de Gi3.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en que el polipéptido
MIP-4 es detectablemente marcado con, por ejemplo,
un radioisótopo, un fluoróforo, un agente sofocador de la
fluorescencia, una enzima, una etiqueta de afinidad o una etiqueta
epitópica.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en que el polipéptido CCRL2 se
expresa sobre una célula.
8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 7,
en que la célula es una célula de levadura.
9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8,
en que la célula de levadura comprende una proteína G en que al
menos 5 aminoácidos del extremo carboxílico de una subunidad G de
levadura han sido sustituidos por los correspondientes restos de
una proteína G que no es de levadura, tal como Gi3.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 6, en que el polipéptido CCRL2 está
presente:
- (a)
- en o sobre liposomas sintéticos;
- (b)
- en o sobre membranas en gemación provocada por virus;
- (c)
- en o sobre una bicapa lipídica artificial; o
- (d)
- en una fracción de membrana de células que expresan el polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un método para modular in vitro la
actividad de un polipéptido CCRL2 en una célula, método que
comprende suministrar un anticuerpo específico para
MIP-4 a la célula, anticuerpo que es capaz de
inhibir la unión de MIP-4 con CCRL2, por lo que se
modula la actividad de CCRL2.
12. Uso de un anticuerpo específico para CCRL2,
anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con
MIP-4, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una
enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica
aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno
inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD),
bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis,
enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis,
síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso,
rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica,
o en que la enfermedad o trastorno asociado con una actividad
macrofágica aumentada es obesidad, resistencia a la insulina
relacionada con la obesidad, enfermedad autoinmune,
hipersensibilidad de contacto o cáncer.
13. Uso de un anticuerpo específico para
MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión
de MIP-4 con CCRL2, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo,
enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio
cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida),
lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad.
14. Un método para activar in vitro una
ruta de señalización de CCRL2 en una célula, método que comprende
suministrar a la célula un polipéptido que comprende:
- (a)
- la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
- (b)
- una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
- (c)
- un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Uso de un polipéptido que comprende:
- (a)
- la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
- (b)
- una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
- (c)
- un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido,
para la fabricación de un medicamento para
tratar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2,
seleccionado entre enfermedad inflamatoria intestinal,
endometriosis y un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Uso de un polipéptido que comprende:
- (a)
- la secuencia de CCRL2 mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4;
- (b)
- una secuencia que es al menos 80% idéntica a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente equivalente a CCRL2; o
- (c)
- un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es funcionalmente equivalente a CCRL2, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido,
para la fabricación de un medicamento para
tratar una enfermedad o trastorno relacionado con
MIP-4, seleccionado entre inflamación alérgica y
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio
cerebral, método que comprende:
- (a)
- llevar a cabo una reacción de multiplicación sobre una muestra aislada del individuo, utilizando cebadores específicos para un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4;
- (b)
- determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4 en la muestra; y
- (c)
- comparar la cantidad del polinucleótido multiplicado que codifica un polipéptido MIP-4, producido en la operación (a), con la de un patrón, en que una diferencia de cantidad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, determinándose de este modo la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio
cerebral, método que comprende:
- (a)
- multiplicar un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4, usando como molde un ácido nucleico aislado del individuo; y
- (b)
- determinar si el polinucleótido comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un método de acuerdo con la Reivindicación
18, en que la operación (b) comprende:
- (a)
- introducir datos de la secuencia de MIP-4 del individuo en un sistema informático;
- (b)
- comparar dichos datos secuenciales con una base informática de datos, base de datos que comprende información relativa a datos de la secuencia de MIP-4 con respecto a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2; y
- (c)
- determinar, basándose en dicha comparación, si el polinucleótido MIP-4 comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un método para diagnosticar una enfermedad o
trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la
enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad
inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un
trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
- (a)
- poner una muestra aislada del individuo, que comprende un polipéptido CCRL2, en contacto con un polipéptido MIP-4 bajo unas condiciones que permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2;
- (b)
- medir la actividad del polipéptido CCRL2; y
- (c)
- comparar la actividad del polipéptido CCRL2 con la de un patrón, en que una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\newpage
21. Un kit para detectar un agente que modula la
actividad de CCRL2, kit que comprende:
- (i)
- un polipéptido MIP-4; y
- (ii)
- un polipéptido CCRL2 o un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un kit de acuerdo con la Reivindicación 21,
en que el polipéptido CCRL2 se expresa en una célula transformada
con un polinucleótido que codifica el polipéptido CCRL2 o está
presente en una fracción de membrana celular, un liposoma sintético
o una membrana en gemación provocada por virus.
23. Un método de acuerdo con las
Reivindicaciones 17 a 20 o un kit de acuerdo con la Reivindicación
21 ó 22, en que el polipéptido MIP-4 es un
polipéptido que comprende:
- (a)
- la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
- (b)
- una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
- (c)
- un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Un anticuerpo específico para
MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión
de MIP-4 con CCRL2, para uso en el tratamiento de
un trastorno inflamatorio óseo, enfermedad inflamatoria intestinal,
un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis, síndrome de
deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de
aloinjertos u obesidad.
25. Un anticuerpo específico para CCRL2,
anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con
MIP-4, para uso en el tratamiento de una enfermedad
o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con
una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la
enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar
obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno
inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal,
aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune
(sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis
reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o
trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es
obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad,
enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer.
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