ES2327126T3 - Agentes que modulan la actividad de ccrl2 y metodos de utilizar los mismos. - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para detectar un agente que module la actividad de CCRL2, método que comprende: (a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2; y (b) determinar si el agente candidato es capaz de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho polipéptido MIP-4.

Description

Agentes que modulan la actividad de CCRL2 y métodos de utilizar los mismos.
Campo del invento
El presente invento se refiere a un ligando endógeno para un receptor huérfano acoplado a proteínas G, y a métodos, usos, agentes, composiciones y kits asociados.
Fundamento del invento
Las quimiocinas que actúan a través de sus receptores afines son críticas para el reclutamiento de células inmunes efectoras a tejidos inflamados y, por lo tanto, tienen un considerable interés como posibles dianas para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. El CCRL2 (también conocido como HCR, CRAM-A y CRAM-B) codifica una proteína huérfana de tipo receptor quimiocínico, que es supuestamente una proteína con siete dominios transmembranales. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs; del inglés, G protein coupled receptors) son una familia de aproximadamente 500 proteínas con una estructura de 7 dominios transmembranales, que transducen señales celulares de una diversidad de mediadores biológicos. La interacción de un GPCR con su ligando causa un cambio conformacional en la proteína y facilita la unión de proteínas G heterotrímeras asociadas pequeñas a los dominios intracelulares del receptor, que inician una cascada de señalización. Los GPCRs son receptores de la superficie celular y, por lo tanto, son dianas atractivas para una intervención farmacológica. El CCRL2 se expresa con niveles elevados en neutrófilos primarios y monocitos primarios y, además, está suprarregulado tras la activación de neutrófilos y cuando los monocitos se diferencian en macrófagos. Sin embargo, no se ha investigado la importancia de CCRL2 en la enfermedad inflamatoria humana.
Sumario del invento
Los presentes inventores han identificado la proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4; del inglés, macrophage inflammatory protein-4; también conocida como DC-CKI, CCL18 y PARC) como un ligando endógeno para CCRL2.
En consecuencia, el presente invento proporciona un método in vitroitro para detectar un agente que module la actividad de CCRL2, método que comprende:
(a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2; y
(b) determinar si el agente candidato es capaz de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho polipéptido MIP-4.
El presente invento proporciona además:
- Un método para modular la actividad de un polipéptido CCRL2 en una célula, método que comprende suministrar a la célula un anticuerpo específico para MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 a CCRL2;
- Uso de un anticuerpo específico para CCRL2, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 a MIP-4, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD; del inglés, chronic obstructive pulmonary disease), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer;
- Uso de un anticuerpo específico para MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 a CCRL2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo, la enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad;
- Un método para activar una ruta de señalización de CCL2 en una célula, método que comprende suministrar a la célula un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b) una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
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- Uso de un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b) una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
un polinucleótido que codifica cualquiera de dichos polipéptidos o dichos fragmentos, o un anticuerpo específico para cualquiera de dichos polipéptidos o dichos fragmentos; para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, seleccionado entre la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis y un trastorno inflamatorio cerebral;
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- Uso de un polipéptido que comprende:
(a) la secuencia de CCRL2 mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4; o
(b) una secuencia que es al menos 80% idéntica a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente equivalente a CCRL2; o
(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es funcionalmente equivalente a CCRL2;
un polinucleótido que codifica cualquiera de dichos polipéptidos, o un anticuerpo que se une a cualquiera de dichos polipéptidos; para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4;
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- Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a) llevar a cabo una reacción de multiplicación sobre una muestra aislada del individuo utilizando cebadores específicos para un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4; y
(b) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4 en la muestra y determinar por ello la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral;
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- Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a) multiplicar un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4, usando un ácido nucleico aislado del individuo; y
(b) determinar si el polinucleótido comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2; y
(c) determinar, basándose en dicha comparación, si el polinucleótido comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral;
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- Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a) poner una muestra aislada del individuo, que comprende un polipéptido CCRL2, en contacto con un polipéptido MIP-4 bajo unas condiciones que permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2;
(b) medir la actividad del polipéptido CCRL2; y
(c) comparar la actividad del polipéptido CCRL2 con la de un patrón, en que una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral;
- Un kit para detectar un agente que modula la actividad de CCRL2, kit que comprende: (i) un polipéptido CCRL2 o (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2;
- Un anticuerpo específico para MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 con CCRL2, para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo, la enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad; y
- Un anticuerpo específico para CCRL2, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con MIP-4, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer.
Descripción de las secuencias aquí mencionadas
La ID. SEC. nº 1 muestra el polinucleótido que codifica la forma larga del CCRL2 humano (CRAM-A).
La ID. SEC. nº 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma larga del CCRL2 humano (CRAM-A).
La ID. SEC. nº 3 muestra el polinucleótido que codifica la forma corta del CCRL2 humano (CRAM-B).
La ID. SEC. nº 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma corta del CCRL2 humano (CRAM-B).
La ID. SEC. nº 5 muestra el polinucleótido que codifica la MIP-4 humana.
La ID. SEC. nº 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la MIP-4 humana.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la actividad LacZ en células de levadura con transplante de proteína G, en presencia y ausencia de MIP-4. La actividad LacZ se expresa por 10^{6} células.
La Figura 2 muestra la actividad LacZ en células de levadura con transplante de Gi3, en concentraciones variables de MIP-4. La actividad LacZ se expresa por 10^{6} células.
La Figura 3 muestra la actividad LacZ en las células de levadura con transplante de proteína G que expresan el receptor del factor liberador de corticotropina (CRFR; del inglés, corticotrophin releasing factor receptor). La actividad LacZ se expresa por 10^{6} células.
La Figura 4 es un diagrama de flujo que expone las operaciones de un método, implementado por ordenador, para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo.
La Figura 5 es un diagrama de flujo que expone las operaciones de un método, implementado por ordenador, para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en un individuo.
La Figura 6 es un gráfico de barras que ilustra la quimiotaxis de células CHO transfectadas con CCRL2, en presencia de diversas quimiocinas.
La Figura 7 es un gráfico de barras que ilustra el efecto bloqueador de 100 \mug/ml y 500 \mug/ml de un anticuerpo anti-CCRL2 sobre la quimiotaxis provocada con MIP-4.
La Figura 8 es un gráfico de barras que ilustra el efecto de anticuerpos anti-CCRL2 sobre la quimiotaxis provocada con líquido sinovial (SF; del inglés, synovial fluid) de pacientes aquejados de artritis reumatoide (AR).
La Figura 9 es un gráfico de barras que ilustra el aumento de quimiotaxis, en comparación con un testigo, observado en respuesta a 250 \mug/ml de MIP-4, líquido sinovial de pacientes con AR (SF3 1:100) y líquido sinovial de pacientes con AR desprovisto de MIP-4 (SF3 1:100 agotado).
Descripción detallada del invento
Ha de entenderse que las diferentes aplicaciones de los métodos descritos pueden ajustarse a las necesidades específicas de la técnica. Ha de entenderse también que la terminología aquí utilizada sólo tiene el fin de describir realizaciones particulares del invento y no debe ser considerada restrictiva.
Además, como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más de dichos polipéptidos, la referencia a "una célula" incluye dos o más de dichas células, etc.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas, sean supra o sean infra, se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
Exploración de agentes que modulan la actividad de CCRL2
El invento proporciona un método para detectar un agente candidato que module la actividad de CCRL2. El término "modular" incluye cualquiera de los modos aquí mencionados en que el agente del invento es capaz de modular el CCRL2. Esto incluye la suprarregulación o infrarregulación de la expresión de CCRL2, la suprarregulación o infrarregulación de la degradación de CCRL2, y la estimulación o inhibición de la actividad del receptor CCRL2, incluyendo la potenciación de la actividad de CCRL2 en respuesta a un polipéptido MIP-4. La capacidad de un agente candidato para modular la actividad o expresión de CCRL2 puede ser determinada poniendo un polipéptido CCRL2 en contacto con el agente bajo unas condiciones que, en ausencia del agente candidato, permitan la actividad o expresión de CCRL2, por ejemplo, en presencia de un polipéptido MIP-4, y comparando la actividad de CCRL2 en presencia y ausencia del agente candidato. Preferiblemente, la modulación es una corrección de una actividad o expresión aberrante de CCRL2. La actividad de CCRL2 es típicamente la activación de una vía de señalización mediada por proteínas G. La proteína G puede ser cualquier proteína G que esté acoplada al polipéptido CCRL2. Preferiblemente, la proteína G es Gi3.
Los métodos para detectar un agente que module la actividad de un polipéptido CCRL2 pueden ser llevados a cabo in vitro (dentro o fuera de una célula). En una realización, los métodos se llevan a cabo en o sobre una célula, un cultivo celular o un extracto celular que comprende un polipéptido CCRL2 o expresa un polinucleótido CCRL2. La célula puede ser una en que se expresa naturalmente el polipéptido CCRL2, tal como una célula endotelial. Alternativamente, la célula puede ser una célula que está transformada con un polinucleótido CCRL2 y expresa un polipéptido CCRL2. Las células adecuadas incluyen líneas celulares eucarióticas superiores transitorias, o preferiblemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tales como levaduras, o células procarióticas tales como células bacterianas. Los ejemplos particulares de líneas celulares incluyen las células HEK293T, CHO, HeLa y COS de mamífero. Preferiblemente, la línea celular seleccionada será una que no es únicamente estable sino que permite además la glicosilación madura de un polipéptido. La expresión de un polipéptido CCRL2 puede ser también llevada a cabo en ovocitos transformados.
En otra realización, los métodos se llevan a cabo en o sobre un liposoma que comprende un polipéptido CCRL2. Los métodos para la preparación de liposomas son bien conocidos en la técnica (Woodle y Papahadjopoulos, Methods Enzymol. 171: 193-217, 1989).
En otra realización, los métodos se llevan a cabo en o sobre membranas en gemación provocada por virus, que comprenden un polipéptido CCRL2. Los métodos para la preparación de membranas en gemación provocada por virus son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Luan et al., Biochemistry 34 (31): 9874-9883, 1995). Se pueden utilizar virus para provocar la gemación en células que expresan naturalmente un polipéptido CCRL2 o en células transformadas (transfectadas) con un polinucleótido CCRL2.
En otra realización, los métodos se llevan a cabo en o sobre bicapas lipídicas artificiales. Los métodos para la preparación de bicapas lipídicas artificiales son bien conocidos en la técnica (Sackmann y Tanaka, Trends Biotechnol. 18: 58-64, 2000; y Karlsson y Lofas, Anal. Biochem. 300: 132-138, 2002). Se puede integrar un polipéptido CCRL2 en la membrana artificial cuando se fabrica la membrana.
En aún otra realización, los métodos se llevan a cabo en o sobre una fracción de membrana que comprende el polipéptido CCRL2. Una fracción de membrana es una preparación de membranas lipídicas celulares en que se han eliminado algunos, por ejemplo, al menos el 5% o el 10%, de los elementos no asociados con la membrana. Los elementos asociados con la membrana son componentes celulares que están integrados en la membrana lipídica o componentes celulares físicamente asociados con un componente integrado en la membrana lipídica. Los métodos para la preparación de fracciones de membrana celular son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Hubbard y Cohn, 1975, J. Cell. Biol. 64: 461-479). Se puede preparar una fracción de membrana que comprenda el polipéptido CCRL2 a partir de células que expresan naturalmente un polipéptido CCRL2 o de células transformadas (transfectadas) con un polinucleótido CCRL2. Alternativamente, se puede integrar un polipéptido CCRL2 en una preparación de membrana por dilución de una disolución del polipéptido CCRL2 en un detergente (por ejemplo, Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71: 283-294).
Los métodos para identificar un agente que module la actividad de un polipéptido CCRL2 se llevan a cabo usando un agente candidato. El método comprende típicamente el uso de uno o más agentes candidatos; por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 o más agentes candidatos. Un agente candidato es un compuesto candidato que se evalúa mediante los métodos del invento en cuanto a su capacidad para modular la actividad de CCRL2. Los agentes candidatos pueden ser compuestos naturales o sintéticos e incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas, compuestos contenidos en extractos de células animales, vegetales, bacterianas o fúngicas, y también medios acondicionados procedentes de dichas células. Los agentes candidatos adecuados que pueden ser examinados con los anteriores métodos de exploración incluyen agentes anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena única, anticuerpos quiméricos y anticuerpos con CDR injertada) y agentes aptámeros. El agente anticuerpo puede presentar afinidad ligante por el receptor CCRL2 o por un polipéptido MIP-4. Además, también se pueden examinar bancos combinatorios, y bancos de identidades químicas definidas, péptidos y compuestos miméticos de péptidos, oligonucleótidos y agentes naturales, tales como bancos de presentación (por ejemplo, bancos de presentación en fagos). Se pueden examinar bancos de oligonucleótidos, tales como bancos de aptámeros.
Los agentes candidatos pueden ser compuestos químicos, los cuales se obtienen típicamente por una síntesis alrededor de moléculas pequeñas que pueden tener cualesquiera de las propiedades del polipéptido MIP-4.
El agente candidato puede proceder de, o estar contenido en, una muestra ambiental, un extracto natural de células o tejidos de animales, insectos, organismos marinos, vegetales, levaduras o bacterias, una muestra clínica, una muestra sintética, o un medio acondicionado procedente de células recombinantes o de un proceso de fermentación. El agente candidato puede también proceder de, o estar contenido en, una muestra tisular que comprenda un fluido corporal y/o células de un individuo y puede ser obtenido, por ejemplo, utilizando una torunda, tal como una torunda bucal. El agente candidato puede proceder de, o estar contenido en, una muestra de sangre, orina, saliva, piel, células de carrillo o raíces capilares.
En una exploración inicial, se pueden usar partidas de los agentes candidatos de, por ejemplo, diez agentes candidatos por reacción, y se pueden examinar individualmente los agentes candidatos de las partidas que muestran modulación. Cuando una partida de agentes muestra actividad moduladora de CCRL2, los agentes de ensayo pueden ser examinados individualmente o en partidas más pequeñas para identificar el agente que presenta actividad moduladora.
Los agentes candidatos preferidos son polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a antígenos, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos y compuestos químicos.
Los métodos del invento permiten detectar agentes que modulan la actividad de un polipéptido CCRL2 al determinar o examinar el efecto de un agente candidato sobre una actividad del polipéptido CCRL2, tal como la unión a ligandos, la actividad de señalización o la actividad quimiotáctica. Los métodos del invento se llevan a cabo bajo unas condiciones que, en ausencia del agente candidato, permiten la unión de un polipéptido MIP-4 a un polipéptido CCRL2. Estas condiciones son, por ejemplo, la temperatura, la concentración de sales, el pH y la concentración de proteínas, bajo las cuales se une un polipéptido MIP-4 a un polipéptido CCRL2. Las condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, tal como, por ejemplo, si en el ensayo se utilizan células viables o sólo la fracción de membrana de las células. Sin embargo, puesto que CCRL2 es un receptor de la superficie celular y los polipéptidos MIP-4 son polipéptidos secretados que interaccionan con el dominio extracelular de CCRL2, las condiciones preferidas incluirán generalmente una concentración salina (aproximadamente 90 mM) y un pH (aproximadamente de 7,0 a 8,0) fisiológicos. La temperatura para la unión puede variar de 4ºC a 37ºC, pero es preferiblemente 4ºC. También variará la concentración de los reaccionantes en el ensayo de unión, pero será preferiblemente de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 \muM.
En una realización del invento, se determina el efecto de la muestra de ensayo sobre la unión del polipéptido CCRL2 a un polipéptido MIP-4. Para determinar la unión y detectar cualquier efecto, se puede utilizar cualquier formato de ensayo de unión adecuado. El efecto puede ser medido como una disminución de la unión entre un polipéptido MIP-4 y un polipéptido CCRL2. Una disminución de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80% en la unión entre un polipéptido MIP-4 y un polipéptido CCRL2, medida en cualquier ensayo dado, indica que el agente candidato modula la actividad de CCRL2.
Los ensayos preferidos para determinar cualquier cambio provocado por el agente candidato en la unión entre un polipéptido MIP-4 y un polipéptido CCRL2 incluyen los ensayos de desplazamiento de marcadores, resonancia de plasmones superficiales, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, sofocamiento de fluorescencia, polarización de fluorescencia y unión de radioligandos.
El desplazamiento de marcadores implica poner un polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido MIP-4 detectablemente marcado, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de un agente candidato. Para calibrar el ensayo, se pueden llevar a cabo reacciones testigo de competición utilizando concentraciones crecientes de un polipéptido MIP-4 no marcado. Después del contacto, se mide el polipéptido MIP-4 marcado y unido utilizando un método apropiado para el marcador dado (por ejemplo, cuenta de centelleo, ensayo enzimático o fluorescencia). Los marcadores preferidos incluyen radioisótopos tales como tritio y yodo y cualquier otro radionucleótido adecuado. Se considera que los agentes candidatos se unen específicamente a un polipéptido CCRL2 si, en una concentración de 10 \muM o menor (la EC_{50} es 10 \muM o menor), desplazan el 50% del polipéptido MIP-4 marcado.
La resonancia de plasmones superficiales permite medir la unión entre las dos moléculas por el cambio de masa cerca de un sensor inmovilizado, causada por la unión o la pérdida de unión de un polipéptido MIP-4 a un polipéptido CCRL2 inmovilizado en una membrana situada sobre el sensor. El cambio de masa se mide como unidades de resonancia frente al tiempo después de la inyección o eliminación del ligando o el agente candidato, y se mide utilizando un biosensor Biacore (Biacore AB). Se puede inmovilizar un polipéptido CCRL2 sobre un chip sensor en una membrana lipídica de película delgada de acuerdo con métodos descritos (Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71: 283-294). Generalmente, se puede administrar un agente candidato a un polipéptido MIP-4 preunido a un polipéptido CCRL2 inmovilizado y se puede medir el desplazamiento del ligando. Alternativamente, se puede administrar un polipéptido MIP-4 a un agente candidato preunido a un polipéptido CCRL2 inmovilizado.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET; del inglés, fluorescence resonance energy transfer) es un fenómeno mecánico cuántico que tiene lugar entre un dador (D) de fluorescencia y un aceptor (A) de fluorescencia en estrecha proximidad entre sí, si el espectro de emisión de D se solapa con el espectro de excitación de A. Generalmente, el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2 son marcados con una pareja complementaria de fluoróforos dador y aceptor. La fluorescencia emitida tras la excitación del fluoróforo dador tendrá una longitud de onda distinta cuando el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2 están unidos que cuando no lo están. La cuantificación de polipéptidos unidos frente a polipéptidos no unidos puede ser llevada a cabo por medición de la intensidad de emisión a cada longitud de onda. Las parejas de fluoróforos dador:aceptor con que se marcan los polipéptidos son bien conocidas en la técnica. Los fluoróforos preferidos son la proteína fluorescente cian (CFP; del inglés, cyan fluorescent protein; dador) y la proteína fluorescente amarilla (YFP; del inglés, yellow fluorescent protein; aceptor).
El sofocamiento de fluorescencia implica marcar una molécula de la pareja de unión (el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2) con un fluoróforo mientras se marca la otra con una molécula que sofoca la fluorescencia del fluoróforo cuando se unen los miembros de la pareja. Se puede utilizar un cambio de fluorescencia tras la excitación para medir un cambio en la unión entre los polipéptidos MIP-4 y CCRL2. Un aumento de fluorescencia sugiere que está disminuida la unión entre el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2.
La polarización de fluorescencia mide la polarización de un polipéptido MIP-4 fluorescentemente marcado. El valor de polarización de fluorescencia para un polipéptido MIP-4 fluorescentemente marcado cambiará y, generalmente, aumentará cuando el ligando se una a un polipéptido CCRL2. Una disminución del valor de polarización es típicamente indicativa de una disminución de la unión entre el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2. La polarización de fluorescencia es preferible cuando el agente candidato es una molécula pequeña.
La exploración de alto rendimiento y a gran escala de pequeños agentes candidatos o de bancos de dichos agentes puede ser llevada a cabo utilizando ensayos con biosensores. El Australian Membrane Biotechnology Research Institute (AMBRI; http://www.ambri.com.au/) ha descrito biosensores ICS. La unión de CCRL2 a un ligando de CCRL2 está asociada al cierre de canales iónicos facilitados por gramicidina en una bicapa membranosa de los biosensores. Como resultado, el biosensor permite medir la unión entre el polipéptido MIP-4 y el polipéptido CCRL2 y, por lo tanto, cualquier cambio en la unión tras la introducción de un agente candidato.
Los agentes que interfieren en, o desplazan, la unión de un polipéptido MIP-4 con un polipéptido CCRL2 pueden ser agonistas, agonistas parciales, antagonistas o agonistas inversos de la actividad de CCRL2. Se puede llevar a cabo un análisis funcional sobre los agentes identificados de acuerdo con el invento, para determinar si son agonistas, agonistas parciales, antagonistas o agonistas inversos. Para la exploración de agonistas, se pone un polipéptido CCRL2 en contacto con el agente y se mide la actividad de señalización de CCRL2 del modo descrito más adelante. Un agonista o agonista parcial tendrá una actividad máxima que corresponderá a al menos el 10% de la actividad máxima de un polipéptido MIP-4. El agonista o agonista parcial tendrá preferiblemente el 50%, el 75% o el 100% de la actividad del polipéptido MIP-4, o una actividad 2 veces mayor, 5 veces mayor, 10 veces mayor o más que la de un polipéptido MIP-4. Para la exploración de antagonistas o agonistas inversos, se examinan los polipéptidos CCRL2 en cuanto a la actividad de señalización en presencia de un polipéptido MIP-4, con o sin un compuesto candidato. Los antagonistas o agonistas inversos reducirán el nivel de actividad del receptor estimulado por el ligando en al menos un 10% en comparación con las reacciones en que no está el antagonista o agonista inverso. Para la exploración de agonistas inversos, se examina la actividad constitutiva de CCRL2 en presencia y ausencia de un compuesto candidato. Los agonistas inversos son compuestos que reducen la actividad constitutiva del receptor en al menos un 10%. Se puede alcanzar la actividad constitutiva de un polipéptido CCRL2 por sobreexpresión colocándolo, por ejemplo, bajo el control de un promotor constitutivo potente, tal como el promotor precoz de CMV. Alternativamente, se puede alcanzar la actividad constitutiva mediante ciertas mutaciones de aminoácidos o dominios de aminoácidos conservados del receptor acoplado a proteínas G (por ejemplo, Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 1430-1433; Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 16.483-16.487; y Samama et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 4625-4636).
En otra realización del invento, se determina el efecto de una muestra de ensayo sobre la actividad de señalización de un polipéptido CCRL2. La actividad de señalización de CCRL2 es provocada por un polipéptido MIP-4. Para determinar la actividad de señalización y detectar cualquier efecto se puede utilizar cualquier formato de ensayo de señalización adecuado. El efecto puede ser medido como un cambio en la actividad de señalización de CCRL2 provocada por el polipéptido MIP-4. Un cambio se refiere a un aumento o una disminución de la actividad de señalización. Un cambio de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80% de la actividad de señalización de un polipéptido CCRL2, medida en cualquier ensayo dado, indica que el agente candidato modula la actividad de CCRL2.
La actividad de señalización de un polipéptido CCRL2 puede ser determinada midiendo el nivel de activación de una proteína G por el polipéptido CCRL2. El nivel de activación de una proteína G por CCRL2 puede ser determinado midiendo la renovación de derivados de guanosina, la actividad de la guanosina trifosfatasa (GTPasa) o el nivel de moléculas de segundo mensajero corriente abajo. En la reacción cíclica de activación e inactivación de proteínas G están implicados derivados de guanosina, derivados que incluyen la guanosina difosfato (GDP) y la guanosina trifosfato (GTP). La activación de una proteína G genera o causa moléculas de segundo mensajero para alterar su concentración. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, adenina monofosfato cíclica (cAMP), guanosina monofosfato cíclica (cGMP), diacilglicerol (DAG), inositol trifosfato (IP_{3}) y calcio intracelular.
Los métodos preferidos para determinar la actividad de señalización incluyen la medición de la unión de nucleótidos de guanosina, la actividad GTPasa, la actividad adenilato ciclasa, cAMP, la actividad proteína cinasa C, la descomposición del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, la actividad MAP cinasa y la expresión de genes informadores. En todos los ensayos, los posibles efectos inespecíficos del agente candidato pueden ser excluidos llevando a cabo ensayos de control en que se utilizan células o membranas que no comprenden un polipéptido CCRL2.
Preferiblemente, la actividad de señalización del polipéptido CCRL2 se determina midiendo la actividad de Gi3.
Tras la activación por un receptor tal como un polipéptido CCRL2, la GTP se une a proteínas G asociadas a la membrana. Por lo tanto, la actividad de señalización de CCRL2 puede ser examinada midiendo la unión de GTP a membranas celulares que contienen receptores (Traynor y Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854). Generalmente, se marca la GTP con un grupo detectable adecuado y se mide mediante un sistema de detección apropiado.
Las proteínas G comprenden una GTPasa que hidroliza la GTP para formar GDP e inactiva la proteína G. Por lo tanto, la actividad GTPasa es una medida de la proteína G y, por consiguiente, de la actividad de CCRL2. La actividad GTPasa puede ser medida mediante métodos comunes en la técnica. Generalmente, el método implica incubar con \gammaP-GTP las membranas que contienen un polipéptido CCRL2. La GTPasa activa liberará el marcador como fosfato inorgánico, el cual puede ser detectado mediante cuenta de centelleo.
Otro método preferido para determinar la actividad de señalización es medir la actividad adenilato ciclasa (Salomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548; y Kenimer y Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585.591). El ensayo puede implicar el uso de cAMP marcado para estimar la actividad de la enzima adenilato ciclasa en productos de homogeneización proteicos procedentes de células o membranas que comprenden un polipéptido CCRL2.
Aún otro método preferido para determinar la actividad de señalización es la medición de la cAMP intracelular. Esto se puede realizar utilizando un radioinmunoensayo (RIA) para cAMP o proteínas ligantes de cAMP de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Horton y Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105). Se puede medir la cAMP intracelular utilizando diversos kits comercialmente asequibles, incluyendo el ensayo homogéneo basado en polarización de fluorescencia de alta eficacia (LJL Biosystems y NEN Life Science Products).
En aún otros métodos preferidos para determinar la actividad de señalización se mide la descomposición de fosfolípidos (especialmente de fosfatidilinositol) provocada por el receptor para generar los segundos mensajeros DAG y/o IP_{3}. Los métodos para medir cada uno de estos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Phospholipid Signaling Protocols, redactado por Ian M. Bird, Totowa, New Jersey, EE.UU., Humana Press, 1998; y Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11.824-11.831).
En aún otro método preferido para determinar la actividad de señalización se mide la actividad proteína cinasa C (PKC; del inglés, protein kinase C) provocada por el receptor. El DAG activa la PKC, que fosforila muchas dianas proteicas y da finalmente lugar a la transcripción de un conjunto de genes que codifican factores de transcripción protooncogénicos, incluyendo c-fos, c-myc y c-jun; proteasas; inhibidores de proteasas, incluyendo los inhibidores de la colagenasa de tipo I y del activador de plasminógeno; y moléculas de adhesión, incluyendo la molécula I de adhesión intracelular (ICAM I; del inglés, intracellular adhesion molecule I). La actividad de la PKC puede ser medida directamente midiendo la fosforilación de un sustrato peptídico, Ac-FKKSFKL-NH_{2}, que procede del sustrato proteico de la proteína cinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS; del inglés, myristoylated alanine-rich C kinase substrate) (Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13.341-13.348). Los ensayos diseñados para detectar aumentos de productos génicos provocados por la PKC pueden ser utilizados para determinar la activación de la PKC y, por ello, la actividad del receptor. Además, la actividad de un receptor que activa la PKC puede ser determinada por medio del uso de construcciones génicas informadoras conducidas por las secuencias de control de genes activados por la activación de la PKC (véase más adelante).
En otro método preferido para determinar la actividad de señalización se mide la actividad MAP cinasa. Se dispone comercialmente de varios kits, incluyendo el kit de ensayo para la MAP cinasa p38 [New England Biolabs (nº 9820 del catálogo)] y el ensayo FlashPlate^{TM} para MAP cinasa (Perkin-Elmer Life Sciences).
Otro método preferido para determinar la actividad de señalización es la medición del calcio intracelular. En la técnica se conocen bien diversos métodos para medir el calcio intracelular (Demaurex et al., Meth. Cell. Biol. 70: 453-474, 2002). Se dispone comercialmente de diversos kits para medir el calcio intracelular, incluyendo los kits de ensayo FILPR (Biocompare, Inc.). Un método preferido para medir el calcio intracelular es el ensayo de la aequorina. La apoaequorina mitocondrial es una proteína bioluminiscente que es sensible a la liberación de iones calcio intracelulares como resultado de la activación de GPCRs, tal como el CCRL2 (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252: 115-126; y Detheux et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 1501-1508). Generalmente, se transfectan células que expresan un polipéptido CCRL2, para que se coexpresen apoaequorina mitocondrial y G\alpha16. Cualquier compuesto que active el polipéptido CCRL2, tal como un polipéptido MIP-4, causará la liberación de calcio intracelular y dará lugar a una emisión lumínica que podrá ser medida. Un segundo método preferido para medir el calcio intracelular es el ensayo Fura-2 (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.).
En otros métodos preferidos para determinar la actividad de señalización se miden cambios en la transcripción o traducción de uno o más genes, Generalmente, en los ensayos se mide la expresión de un gen informador conducido por secuencias de control, tales como promotores y sitios ligantes de factores de transcripción, sensibles a la activación del receptor. Las células que comprenden un polipéptido CCRL2 pueden ser establemente transfectadas con una construcción génica informadora que contenga unas secuencias de control apropiadas. Los ensayos tienden a implicar la medición de la respuesta de genes "inmediatos precoces" que pueden ser rápidamente inducidos, posiblemente en minutos, tras la activación del receptor. Los genes informadores adecuados incluyen, pero no se limitan a los de luciferasa, CAT, GFP, \beta-lactamasa y \beta-galactosidasa. Un ejemplo de unas secuencias de control que pueden ser utilizadas en un ensayo con genes informadores son las del gen c-fos. La inducción de la expresión de c-fos es sumamente rápida, a menudo en minutos, tras la activación del receptor. Los elementos reguladores de c-fos son bien conocidos en la técnica (Verma et al., 1987, Cell 51: 513-514). Otro ejemplo de unas secuencias de control que pueden ser utilizadas en un ensayo con genes informadores son las reconocidas por la proteína ligante del elemento sensible a AMP cíclico (CREB; del inglés, cAMP responsive element binding). Otros ejemplos de secuencias de control que pueden ser utilizadas en un ensayo con genes informadores incluyen, pero no se limitan a, el promotor del gen del péptido intestinal vasoactivo (VIP; del inglés, vasoactive intestinal peptide) (Fink et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6662-6666), el promotor del gen de la somatostatina (Montminy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6682-6686); el promotor de la proencefalina (Comb et al., 1986, Nature 323: 353-356), el promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK; del inglés, phosphoenolpyruvate carboxy-kinase) (Short et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 9721-9726), y elementos de control transcripcional sensibles a la actividad del factor de transcripción AP-1 (Lee et al., 1987, Nature 325: 368-372; y Lee et al., 1987, Cell 49: 741-752) o de NF-\kappaB (Hiscott et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 6231-6240). Aunque, en otros ensayos sobre actividad de señalización, un cambio de al menos 10% en presencia de un agente candidato indica que éste modula CCRL2, en el ensayo del informador transcripcional se requiere al menos un aumento de señal del doble para que indique la presencia de un agente positivo. En el ensayo sobre expresión de genes informadores, como en otros ensayos, un agente negativo viene indicado por una disminución de señal del 10%.
La capacidad de un agente candidato, identificado mediante un método del invento, para modular la actividad de señalización de un polipéptido CCRL2 puede ser adicionalmente confirmada o analizada. Este análisis funcional se describió anteriormente con detalle. Este análisis implica típicamente la determinación del efecto de un agente candidato solo sobre la actividad de señalización de un polipéptido CCRL2, y su comparación con el efecto de un polipéptido MIP-4 sobre la actividad de señalización del polipéptido CCRL2. Para determinar la actividad de señalización y detectar el efecto, se puede usar cualquier formato de ensayo de señalización adecuado. El efecto puede ser medido como un cambio en la actividad de señalización de CCRL2. El agente puede ser un agonista, agonista parcial, antagonista o agonista inverso de la actividad de CCRL2.
Las comparaciones se realizan con un polipéptido MIP-4 en su EC_{50}. La EC_{50} se refiere a la concentración de ligando a la que la actividad de señalización es el 50% del valor máximo para la actividad del receptor mensurable al usar el mismo ensayo. En otras palabras, la EC_{50} es la concentración de ligando que proporciona una activación del 50% cuando se fija la activación del 100% en la cantidad de actividad que no aumenta con la adición de más ligando. Ha de advertirse que la EC_{50} de un ligando variará con la identidad del ligando; por ejemplo, variantes de la ID. SEC. nº 6 (es decir, aquéllas que contienen inserciones, deleciones, sustituciones, etc.) pueden tener valores de EC_{50} mayores, menores o iguales que los de la molécula originaria. Cuando una secuencia difiere de una secuencia originaria, quien tiene experiencia en la técnica puede determinar la EC_{50} para esa variante de acuerdo con métodos convencionales. La EC_{50} de un ligando dado se mide llevando a cabo un ensayo para una actividad de una cantidad fija de un polipéptido CCRL2 en presencia de dosis del ligando que aumentan al menos hasta que la respuesta de CCRL2 se satura o se hace máxima, y representando gráficamente luego la actividad medida de CCRL2 frente a la concentración del
ligando.
El agente candidato es considerado un agente que modula la actividad de CCRL2 si induce al menos un 50% de la actividad de señalización inducida por un polipéptido MIP-4 en su EC_{50}.
En otra realización del invento, se determina el efecto de un agente candidato o una muestra sobre la actividad quimiotáctica de un polipéptido CCRL2. La actividad quimiotáctica de CCRL2 es inducida por un polipéptido MIP-4. Para determinar la actividad quimiotáctica y detectar cualquier efecto, se puede utilizar cualquier formato de ensayo quimiotáctico adecuado. Un ensayo quimiotáctico es una medida de la migración celular frente a un estímulo. El efecto puede ser medido como un cambio en la actividad quimiotáctica de CCRL2 inducida por un polipéptido MIP-4. El cambio se refiere a un aumento o una disminución de la actividad de señalización. Un cambio de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80% en la actividad quimiotáctica de un polipéptido CCRL2, medida en cualquier ensayo dado, indica que el agente candidato modula la actividad de CCRL2.
La célula para uso en un ensayo quimiotáctico puede ser cualquier célula adecuada que exprese CCRL2. La célula puede ser transformada con un polinucleótido CCRL2 para que exprese un polipéptido CCRL2. Preferiblemente, la célula es una célula primaria tal como una célula endotelial que expresa el polipéptido CCRL2. Las células huésped adecuadas incluyen líneas celulares eucarióticas superiores transitorias, o preferiblemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tales como levaduras, o células procarióticas tales como células bacterianas. Los ejemplos particulares de líneas celulares incluyen las células HEK293T, CHO, HeLa y COS de mamífero. Preferiblemente, la línea celular seleccionada será una que no sólo sea estable sino que permita además la glicosilación madura de un polipéptido. La actividad quimiotáctica de un polipéptido CCRL2 puede ser también medida en ovocitos transformados.
Los métodos para determinar la actividad quimiotáctica están bien documentados en la técnica, y se dispone de kits. Los kits adecuados incluyen aquellos en que se utilizan placas ChemoTx (Neuroprobe Inc.) y el sistema BD Falcon HTS Fluoroblok con inserciones de 96 pocillos (BD Biosciences Discovery Labware). En la bibliografía se describen ejemplos de ensayos quimiotácticos (por ejemplo, Biber et al., Journal of Leukocyte Biology 74: 243-251, 2003; y Zuurman et al., informe anual del BCN 1999-2001). El efecto de un polipéptido MIP-4 que actúa sobre un polipéptido CCRL2 puede ser también detectado al cambiar la forma de las células descritas en la bibliografía (por ejemplo, Heineman et al., The Journal of Immunology 170: 4752-4758, 2003; y Stubbs et al., Journal of Biological Chemistry 277: 26.012-26.020, 2002).
El invento proporciona además un agente detectado mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos, y el uso de dicho agente en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. El agente puede ser un agonista, agonista parcial, antagonista o agonista inverso de la actividad de CCRL2. El invento proporciona además el uso de un agente detectado mediante cualquiera de los métodos del invento, en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una activación aumentada de macrófagos, o en el tratamiento de una infección. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente del invento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El invento proporciona un método para modular la actividad de un polipéptido CCRL2 en una célula, método que comprende suministrar a la célula un agente detectado de acuerdo con el invento para que se module la actividad de CCRL2. La célula puede estar in vitro. El suministro del agente se discute más adelante con mayor detalle.
El invento también proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio, un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad aumentada de macrófagos y un método para tratar una infección, métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de acuerdo con el invento a un individuo que lo necesita.
Un método para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio del invento comprende típicamente:
(i) identificar un agente para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, mediante un método de acuerdo con el invento; y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente detectado en el punto (i) a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio.
Cuando la actividad o expresión de CCRL2 está reducida en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente para uso en el tratamiento de la enfermedad o trastorno inflamatorio es preferiblemente un agonista o potenciador de la actividad de CCRL2 o un agente que aumenta la expresión de CCRL2. Cuando la actividad o expresión de CCRL2 está aumentada en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente terapéutico es típicamente un antagonista de la actividad de CCRL2 o un inhibidor de su expresión. El agente puede unirse a un polipéptido MIP-4 que interacciona con el receptor CCRL2, para evitar la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido MIP-4.
Cuando la actividad o expresión de MIP-4 está reducida en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente para uso en el tratamiento de la enfermedad o trastorno inflamatorio es preferiblemente un agonista o potenciador de la actividad de MIP-4 o un agente que aumenta la expresión de MIP-4. Cuando la actividad o expresión de MIP-4 está aumentada en un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inflamatorio, un agente terapéutico es típicamente un antagonista de la actividad de MIP-4 o un inhibidor de su expresión. El agente puede unirse a un polipéptido CCRL2 que interacciona con MIP-4 y evita la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido CCRL2.
En todas las realizaciones anteriores, la enfermedad o trastorno inflamatorio es preferiblemente la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica. El trastorno inflamatorio cerebral puede ser esclerosis múltiple, un accidente cerebrovascular o una hemorragia. La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. El trastorno inflamatorio óseo puede ser artritis, incluyendo las artritis reumatoide, autoinmune e infecciosa. La inflamación alérgica puede ser, por ejemplo, asma o dermatitis de contacto. La enfermedad o trastorno inflamatorio puede ser una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o relacionado con MIP-4. En el individuo que se trata puede estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno inflamatorio. El individuo se discute más adelante con mayor detalle.
Un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad aumentada de macrófagos comprende típicamente:
(i) identificar un agente que module la actividad de CCRL2, mediante un método de acuerdo con el invento; y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente identificado en el punto (i) a un individuo que tiene la enfermedad o el trastorno.
Unos niveles aumentados de expresión de MIP-4 dan lugar a un reclutamiento aumentado de macrófagos que expresan CCRL2. El CCRL2 está además suprarregulado en los macrófagos activados. Un agente para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una activación macrofágica aumentada es preferiblemente un antagonista de la actividad de MIP-4/CCRL2 o un agente que inhibe la expresión de MIP-4 o CCRL2. El agente se puede unir a un polipéptido CCRL2 que interacciona con MIP-4 y evitar la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido CCRL2. El agente se puede unir a un polipéptido MIP-4 que interacciona con el receptor CCRL2 y evitar la activación del receptor; por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo hacia un polipéptido MIP-4.
La enfermedad o trastorno asociado con una actividad aumentada de macrófagos puede ser una en que se hallen niveles aumentados de expresión de MIP-4 en el tejido enfermo, lo que da lugar a un reclutamiento inapropiado de macrófagos hacia el tejido. Dichas enfermedades o trastornos incluyen la enfermedad autoinmune y la hipersensibilidad de contacto, tal como la dermatitis alérgica.
La enfermedad o trastorno asociado con una actividad aumentada de macrófagos puede ser una en que la actividad anormal de los macrófagos contribuya a la enfermedad o el trastorno o dé lugar a síntomas o complicaciones asociadas con la enfermedad o el trastorno. El CCRL2 está suprarregulado en los macrófagos activados y, por ello, la inhibición de la activación de CCRL2 por MIP-4 puede evitar o mejorar los síntomas de la enfermedad o el trastorno. Por ejemplo, los macrófagos de la grasa contribuyen significativamente a la obesidad y a la resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, a través de una inflamación crónica. Por lo tanto, la obesidad y la resistencia a la insulina relacionada con la obesidad son dos ejemplos de dichos trastornos.
Unos niveles aumentados de MIP-4 se asocian con el cáncer gástrico, la leucemia linfoblástica aguda infantil y el carcinoma ovárico, concomitantes en todos los casos con la acumulación de células de tipo macrófago. La expresión tisularmente específica de quimiocinas particulares influye también en el crecimiento y la metástasis tumorales. De esta manera, el bloqueo de la interacción entre MIP-4 y CCRL2 puede evitar la inflamación adicional de células de tipo macrófago y reducir la expansión tumoral. De este modo, el cáncer puede ser considerado como una enfermedad asociada con una actividad aumentada de los macrófagos. Un agente del invento que inhiba la interacción entre MIP-4 y CCRL2 o que actúe como un antagonista de CCRL2 es útil en el tratamiento del cáncer, en particular del cáncer gástrico, la leucemia linfoblástica aguda infantil y el carcinoma ovárico.
El líquido sinovial de los individuos aquejados de artritis reumatoide (AR) contiene niveles aumentados de muchas citocinas. El presente inventor ha mostrado por vez primera que los niveles de MIP-4 en el líquido sinovial de los pacientes con AR afectan significativamente a la quimiotaxis de los monocitos. El inventor ha demostrado que tanto la quimiotaxis inducida por MIP-4 como la quimiotaxis inducida por el líquido sinovial de los pacientes con AR pueden ser bloqueadas mediante un anticuerpo contra CCRL2 y que la eliminación de MIP-4 del líquido sinovial de los pacientes con AR reduce la quimiotaxis de los monocitos. En consecuencia, los inhibidores de la activación de CCRL2 por MIP-4 pueden ser utilizados en los métodos para tratar la artritis reumatoide. Los inhibidores adecuados incluyen agonistas parciales y antagonistas de CCRL2 así como anticuerpos anti-MIP-4 y anti-CCRL2.
El individuo que tiene una enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada se discute más adelante con mayor detalle.
Un método para tratar una infección comprende típicamente:
(i) identificar un agente que module la actividad de CCRL2, mediante un método de acuerdo con el invento; y
(ii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente identificado en el punto (i) a un individuo que tiene la infección.
El agente identificado en el punto (i) es generalmente un agente que estimula la actividad de CCRL2 para que se recluten macrófagos al sitio de infección; es decir, el agente es preferiblemente un agonista o potenciador de la actividad de CCRL2. El agente se administra preferiblemente en el sitio de la infección. El agente se puede administrarse sistémicamente para estimular más generalmente la activación de los macrófagos.
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La infección puede ser una infección causada por cualquier organismo patógeno, tal como un virus, un hongo o una bacteria. Preferiblemente, la infección es una infección bacteriana. El individuo que tiene una infección se discute más adelante con mayor detalle.
Polipéptidos y polinucleótidos útiles en el invento
Los polipéptidos CCRL2 útiles en el invento incluyen tanto la forma larga (CRAM-A) como la forma corta (CRAM-B) del receptor. Por lo tanto, los polipéptidos CCRL2 útiles en el invento incluyen los que tienen la secuencia de ID. SEC. nº 2 ó 4. Los polipéptidos CCRL2 útiles en el invento también incluyen polipéptidos variantes que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idénticas a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y son funcionalmente equivalentes a CCRL2. Los polipéptidos variantes preferidos incluyen compuestos homólogos de CCRL2 procedentes de otra especie, tal como mono, perro, ratón, rata, cobaya o pez cebra. También se pueden utilizar fragmentos de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que sean funcionalmente equivalentes a CCRL2. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 250 a 355 aminoácidos y tienen preferiblemente una longitud de al menos 275, 300, 310, 320, 330 ó 340 aminoácidos. "Funcionalmente equivalente" significa que el polipéptido CCRL2 se une a un polipéptido MIP-4 y es capaz de activar una ruta de señalización ligada a CCRL2. Generalmente, la unión de MIP-4 con el polipéptido CCRL2 estimula una ruta de señalización ligada a CCRL2. Típicamente, la ruta de señalización ligada a CCRL2 implica la activación de Gi3. Típicamente, el polipéptido CCRL2 "se une específicamente" a un polipéptido MIP-4. Un polipéptido CCRL2 "se une específicamente" a un polipéptido MIP-4 cuando se une con afinidad preferente al polipéptido MIP-4 en comparación con otros polipéptidos. En la técnica se conocen diversos protocolos para unión competitiva (adicionalmente discutidos más adelante).
Los polinucleótidos CCRL2 útiles en el invento incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido CCRL2. Los polinucleótidos CCRL2 útiles en el invento incluyen polinucleótidos que codifican tanto la forma larga (CRAM-A) como la forma corta (CRAM-B) del receptor. El polinucleótido puede comprender la secuencia de ID. SEC. nº 1 ó 3 o una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 1 ó 3 en toda su longitud.
Los polipéptidos MIP-4 útiles en el invento incluyen polipéptidos que tienen la secuencia de ID. SEC. nº 6. Los polipéptidos MIP-4 útiles en el invento también incluyen secuencias al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% idénticas a la ID. SEC. nº 6 en toda su longitud, que se unen a un polipéptido CCRL2 y activan una actividad de señalización de un polipéptido CCRL2. Los polipéptidos MIP-4 también incluyen fragmentos de cualesquiera de los polipéptidos MIP-4 anteriormente mencionados, que se unen a un polipéptido CCRL2 y activan una actividad de señalización de un polipéptido CCRL2. Los fragmentos conservan preferiblemente al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de la actividad ligante y del nivel de activación de señalización de la ID. SEC. nº 8. Los polipéptidos MIP-4 pueden comprender adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a la ID. SEC. nº 6 con tal de que el polipéptido resultante se una específicamente a un polipéptido CCRL2 y active una actividad de señalización de un polipéptido CCRL2, y conserve preferiblemente al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de la actividad ligante y del nivel de activación de señalización de la ID. SEC. nº 6.
Típicamente, el polipéptido MIP-4 "se une específicamente" a un polipéptido CCRL2. Un polipéptido MIP-4 "se une específicamente" a un polipéptido CCRL2 cuando se une con afinidad preferente al polipéptido CCRL2 en comparación con otros polipéptidos receptores. En la técnica se conocen diversos protocolos para unión competitiva.
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido MIP-4 son también útiles en el invento. Los polinucleótidos útiles en el invento incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido MIP-4. El polinucleótido puede comprender la secuencia de ID. SEC. nº 5 o una secuencia al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 5 en toda su longitud.
La identidad anteriormente mencionada puede ser calculada basándose en la identidad de nucleótidos o de aminoácidos (a la que a veces se hace referencia como "homología rigurosa").
Por ejemplo, el conjunto informático UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que puede ser usado para calcular la homología (por ejemplo, usando los ajustes por omisión) (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, páginas 387-395). Se pueden usar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o las secuencias de alineamiento, tal como para identificar secuencias equivalentes o correspondientes (típicamente con sus ajustes por omisión), como describen, por ejemplo, S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300, y S. F. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10.
Se usa preferiblemente un análisis BLAST para calcular la identidad. El software para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo permite identificar primero parejas de secuencias con alta puntuación (HSPs; del inglés, high scoring pairs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia en cuestión que correspondan a, o satisfagan, cierta puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia de la base de datos. A "T" se hace referencia como umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para el inicio de búsquedas para hallar HSPs que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que se pueda aumentar la puntuación acumulada de alineamientos. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación acumulada de alineamientos se reduce en la cantidad X con respecto a su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos a causa de la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. En el programa BLAST se usan como valores por omisión una longitud (W) de palabra de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915-10.919), alineaciones (B) de 50, previsión (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad suma más pequeña en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
Las secuencias homólogas difieren típicamente en al menos 1, 2, 5, 10, 20 o más mutaciones (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos o aminoácidos). Estas mutaciones se pueden medir a través de cualquiera de las regiones anteriormente mencionadas en relación con el cálculo de identidades. En el caso de proteínas, las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas. Éstas se definen de acuerdo con la tabla siguiente. Los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna, y preferiblemente de la misma línea de la tercera columna, pueden ser sustituidos unos por otros.
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Cualquiera de los polipéptidos útiles en el invento puede estar en forma de un dímero. Cualquiera de los polipéptidos útiles en el invento puede estar además químicamente modificado para formar un derivado. Los derivados incluyen polipéptidos que tienen extensiones lipídicas o han sido glicosilados. Los derivados también incluyen polipéptidos que han sido detectablemente marcados. Los polipéptidos detectablemente marcados han sido marcados con un grupo marcador que puede ser fácilmente detectado. Los ejemplos de grupos marcadores incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos o radionucleótidos, fluoróforos tales como la proteína fluorescente verde (GFP; del inglés, green fluorescent protein), reactivos electrónicamente densos, agentes sofocadores de la fluorescencia, enzimas, etiquetas de afinidad y etiquetas de epítopos. Los radioisótopos preferidos incluyen tritio y yodo. Las etiquetas de afinidad son marcadores que confieren la capacidad para unir específicamente un reactivo a la molécula marcada. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, biotina, etiquetas de histidina, y glutatión S-transferasa (GST). Los marcadores pueden ser detectados, por ejemplo, mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, radioquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos que son conocidos en la técnica.
Cualquiera de los polipéptidos útiles en el invento puede comprender también aminoácidos o secuencias polipeptídicas adicionales. Un polipéptido preferido útil en el invento es un polipéptido MIP-4 con un resto de metionina adicional fijado al extremo amínico (Met-MIP-4) o al extremo carboxílico. Cualquiera de los polipéptidos útiles en el invento puede comprender secuencias polipeptídicas adicionales para que formen proteínas de fusión. Las secuencias polipeptídicas adicionales pueden estar fusionadas en el extremo amínico, el extremo carboxílico o en ambos extremos, el amínico y el carboxílico, de MIP-4. Los ejemplos de parejas de fusión incluyen, pero no se limitan a, GST, proteína ligante de maltosa, fosfatasas alcalinas, tiorredoxina, GFP, etiquetas de histidina y etiquetas epitópicas (por ejemplo, Myc o FLAG). Se pueden fusionar polipéptidos CCRL2 con una proteína ligante de GTP (proteína G).
Anticuerpos útiles en el invento
El invento también proporciona el uso de un anticuerpo específico para un polipéptido MIP-4, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. El invento también proporciona el uso de un anticuerpo específico para un polipéptido CCRL2, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
Se pueden generar anticuerpos que se unan a un polipéptido MIP-4 o a un polipéptido CCRL2. Se pueden generar anticuerpos que se unan tanto a un polipéptido MIP-4 como a un polipéptido CCRL2. Se pueden generar anticuerpos contra proteínas de fusión de MIP-4, tal como Met-MIP-4. Típicamente, el anticuerpo "se une específicamente" o "es específico para" un polipéptido MIP-4 o un polipéptido CCRL2. El anticuerpo se puede unir a un sitio de glicosilación de CCRL2. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une específicamente" a un polipéptido o es "específico para" un polipéptido cuando se une con afinidad preferente a la proteína para la que es específico en comparación con otros polipéptidos, tal como un receptor de quimiocinas o de proteínas G. En la técnica se conocen bien diversos protocolos para ensayos inmunorradiométricos o de unión competitiva, para determinar la capacidad ligante específica de un anticuerpo (véase, por ejemplo, Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1226, 1993). Dichos inmunoensayos implican típicamente la formación de complejos entre la proteína específica y su anticuerpo, y la medición de la formación de los complejos.
Para los fines de este invento, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos que se unen a un polipéptido. Dichos fragmentos incluyen los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como anticuerpos de cadena única. Además, los anticuerpos y sus fragmentos pueden ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR injertada o anticuerpos humanizados.
Se pueden producir anticuerpos mediante cualquier método adecuado. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo generando en un animal huésped un anticuerpo contra el polipéptido completo o contra un fragmento del mismo, por ejemplo, un epítopo antigénico del mismo, en lo sucesivo "el inmunógeno". El fragmento puede ser cualquiera de los fragmentos aquí mencionados (típicamente de al menos 10 o al menos 15 aminoácidos de longitud) y comprender un polimorfismo (tal como cualquiera de los polimorfismos aquí mencionados).
Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal huésped adecuado, por ejemplo, un animal experimental, con el inmunógeno y aislar las inmunoglobulinas del suero del animal. Por lo tanto, se puede inocular el inmunógeno en el animal, extraer posteriormente sangre del animal y purificar la fracción de IgG.
Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado. Se pueden producir hibridomas fusionando células tumorales con células esplénicas procedentes de un animal experimental que ha recibido el inóculo (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495-497).
Mediante un procedimiento convencional, se puede seleccionar una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado. Los hibridomas pueden ser desarrollados en cultivo o ser inyectados intraperitonealmente, para la formación del fluido ascítico, o en la corriente sanguínea de un huésped alogénico o un huésped inmunocomprometido. El anticuerpo humano puede ser preparado mediante inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguida de la transformación de los linfocitos con el virus de Epstein-Barr.
Para la producción de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, el animal experimental es adecuadamente una cabra, un conejo, una rata, un ratón, una cobaya, una gallina, una oveja o un caballo. Si se desea, el inmunógeno puede ser administrado como un producto de conjugación en que el inmunógeno está copulado, por ejemplo, por medio de una cadena lateral de uno de los restos de aminoácido, con un vehículo adecuado. La molécula vehicular es típicamente un vehículo fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede ser aislado y, si se desea, purificado.
Los anticuerpos que se unen a MIP-4 son conocidos en la técnica y comercialmente asequibles (por ejemplo, de Novus Biologicals® y R&D Systems).
Uso de anticuerpos, polinucleótidos y polipéptidos MIP-4
El invento proporciona un método para activar una ruta de señalización de CCRL2 en una célula, método que comprende introducir un polipéptido MIP-4 en una célula. La célula puede estar in vitro. El suministro del agente se discute más adelante con mayor detalle.
El invento proporciona además el uso de:
(i) un polipéptido MIP-4;
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4; o
(iii) un anticuerpo específico para un polipéptido MIP-4;
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. La enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es preferiblemente una enfermedad inflamatoria mediada por CCRL2, tal como la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral. El trastorno inflamatorio cerebral puede ser esclerosis múltiple, un accidente cerebrovascular o una hemorragia. La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En el individuo que se trata puede estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. El individuo puede presentar una predisposición genética a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, tal como un polimorfismo.
El individuo se discute más adelante con mayor detalle.
Uso de anticuerpos, polinucleótidos y polipéptidos CCRL2
El invento proporciona el uso de:
(i) un polipéptido CCRL2;
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2; o
(iii) un anticuerpo específico para un polipéptido CCRL2;
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. La enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 es preferiblemente una inflamación alérgica, tal como asma o dermatitis de contacto. La enfermedad relacionada con MIP-4 puede ser un cáncer, ya que unos niveles aumentados de MIP-4 se asocian con el cáncer gástrico, la leucemia linfoblástica aguda infantil y el carcinoma ovárico.
En el individuo que se trata puede estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. El individuo puede presentar una predisposición genética a una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4, tal como un polimorfismo. El individuo se discute más adelante con mayor detalle.
Métodos de diagnóstico
El invento proporciona además métodos para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en un individuo. Una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es típicamente una enfermedad o trastorno que se asocia con el gen CCRL2. Por ejemplo, se puede asociar un polimorfismo en la región del gen CCRL2 con la enfermedad o el trastorno. Una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 es una que se asocia con el gen MIP-4. Por ejemplo, se puede asociar un polimorfismo en la región del gen MIP-4 con la enfermedad o el trastorno.
La enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es preferiblemente una enfermedad inflamatoria mediada por CCRL2, tal como la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral. El trastorno inflamatorio cerebral puede ser esclerosis múltiple, un accidente cerebrovascular o una hemorragia. La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En el individuo que se diagnostica puede estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. La enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 es preferiblemente una inflamación alérgica, tal como asma o dermatitis de contacto. En el individuo que se diagnostica puede estar presente, o se puede sospechar que esté presente, una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. El individuo se discute más adelante con mayor detalle.
En una primera realización diagnóstica del invento, el método de diagnóstico comprende llevar a cabo una reacción de multiplicación sobre una muestra aislada de un individuo usando cebadores específicos para MIP-4. Luego se determina en la muestra la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifique un polipéptido MIP-4. La ausencia de un polinucleótido que codifique un polipéptido MIP-4 es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. Si el polinucleótido está presente, se compara con un patrón la cantidad del polinucleótido multiplicado, y una diferencia en la cantidad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo. El patrón se refiere a la medición equivalente en un individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
Los métodos de la primera realización diagnóstica también comprenden llevar a cabo una reacción de multiplicación sobre una muestra aislada de un individuo usando cebadores específicos para CCRL2. Luego se determina en la muestra la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifique un polipéptido CCRL2. La ausencia de un polinucleótido que codifique un polipéptido CCRL2 es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. Si el polinucleótido está presente, se compara con un patrón la cantidad del polinucleótido multiplicado, y una diferencia en la cantidad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en el individuo. El patrón se refiere a la medición equivalente en un individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
La cantidad de polinucleótido puede ser medida mediante cualquier método adecuado, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) cuantitativa o semicuantitativa. En estos métodos, se copia (o multiplica) parte del polinucleótido de la muestra antes de determinar la cantidad. Los métodos de multiplicación "cuantitativa" son bien conocidos en la técnica (PCR Protocols, "A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Academic Press, Inc., New York, 1990).
En una segunda realización diagnóstica, el método de diagnóstico comprende multiplicar un polinucleótido que codifica MIP-4 a partir de una muestra aislada de un individuo. Luego se determina la presencia de una mutación o un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2. En una realización, la secuencia de un polinucleótido multiplicado es comparada con una información secuencial relativa a secuencias asociadas con enfermedades o trastornos relacionados con CCRL2 (Figura 4). Dicha información indica típicamente polimorfismos secuenciales asociados con dichas enfermedades o trastornos.
Los métodos de la segunda realización diagnóstica también comprenden multiplicar un polinucleótido que codifica CCRL2 a partir de una muestra aislada de un individuo. Luego se determina la presencia de una mutación o un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. En una realización, la secuencia de un polinucleótido multiplicado es comparada con una información secuencial relativa a secuencias asociadas con enfermedades o trastornos relacionados con MIP-4 (Figura 5). Dicha información indica típicamente polimorfismos secuenciales asociados con dichas enfermedades o trastornos.
La mutación o el polimorfismo se detecta típicamente determinando directamente la presencia de la secuencia de mutación o polimorfismo en un polinucleótido del individuo. Dicho polinucleótido es típicamente DNA genómico, mRNA o cDNA. El polimorfismo puede ser detectado mediante cualquier método adecuado, tal como uno de los mencionados más adelante.
El método diagnóstico puede comprender detectar la presencia o ausencia de una mutación o polimorfismo usando un agente ligante específico. Un agente ligante específico es un agente que se une con afinidad preferente o elevada a la proteína o polinucleótido que tiene el polimorfismo pero no se une, o se une sólo con baja afinidad, a otros polipéptidos o proteínas (tal como un polinucleótido MIP-4 o polinucleótido CCRL2 que no comprende la mutación ni el polimorfismo).
El agente ligante específico puede ser una sonda o un cebador. La sonda puede ser una proteína (tal como un anticuerpo) o un oligonucleótido. Las sondas o cebadores también se unirán típicamente a nucleótidos y aminoácidos flanqueadores de una o ambas caras del polimorfismo, tal como, por ejemplo, al menos 2, 5, 10,15 o más nucleótidos o aminoácidos flanqueadores en total o en cada cara. De esta manera, una sonda o cebador puede ser total o parcialmente complementario de todas, o parte de, las secuencias flanqueadoras 5' y/o 3' de la mutación o el polimorfismo. La sonda puede estar marcada o puede ser posible su marcación indirecta. La unión de la sonda al polinucleótido o la proteína puede ser utilizada para inmovilizar o bien la sonda la sonda o bien el polinucleótido o la proteína.
Generalmente, la determinación de la unión específica del agente a la mutación o el polimorfismo puede realizarse determinando la unión del agente al polinucleótido del individuo. Sin embargo, puede que el agente también sea capaz de unirse a la correspondiente secuencia de tipo silvestre, por ejemplo, uniéndose a los nucleótidos que flanquean la posición de la mutación o el polimorfismo. En tal caso, el modo de unión a la secuencia de tipo silvestre será detectablemente distinto al modo de unión a un polinucleótido o proteína que contenga el polimorfismo.
Los ensayos de ligación de oligonucleótidos implican el uso de dos sondas oligonucleotídicas. Estas sondas se unen a zonas adyacentes del polinucleótido que contiene la mutación o el polimorfismo, lo que permite que (después de la unión) las dos sondas resulten ligadas entre sí por una enzima ligasa apropiada. Sin embargo, la presencia de un solo apareamiento erróneo en una de las sondas puede alterar la unión y la ligación. Las sondas así ligadas sólo se producirán con un polinucleótido que contenga la mutación o el polimorfismo, y, por lo tanto, la detección del producto ligado puede ser usada para determinar la presencia de la mutación o el polimorfismo.
También se pueden utilizar sondas en un sistema basado en el análisis de heterodúplex. En dicho sistema, la sonda, cuando se une a una secuencia polinucleotídica que contiene la mutación o el polimorfismo, forma un heterodúplex en el sitio en que aparece el polimorfismo (es decir, no forma una estructura de doble cadena). Dicha estructura heterodúplex puede ser detectada mediante el uso de una enzima específica de cadenas sencillas o dobles. Típicamente, la sonda es una sonda de RNA, la región heterodúplex es escindida utilizando RNasa H, y el polimorfismo es detectado detectando los productos de escisión.
También se pueden detectar mutaciones o polimorfismos utilizando el análisis de apareamientos erróneos por escisión química fluorescente, que se describe, por ejemplo, en PCR Methods and Applications 3, 268-71 (1994) y en Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4397-4401 (1998).
Alternativamente, se utiliza un cebador de PCR que sólo ceba una reacción PCR si se une a un polinucleótido que contiene la mutación o el polimorfismo (es decir, un sistema de PCR específico de secuencias o alelos), y se puede determinar la presencia de la mutación o el polimorfismo detectando el producto de PCR. Preferiblemente, la región del cebador que es complementaria de la mutación o el polimorfismo está en, o cerca de, el extremo 3' del cebador. La presencia del polimorfismo puede ser determinada usando un ensayo de PCR basado en un colorante fluorescente y un agente sofocante, tal como el sistema de detección Taqman para PCR.
Un agente ligante específico puede ser capaz de unirse específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia mutada o polimórfica. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método de detección se puede basar en un sistema ELISA.
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El método puede ser un sistema basado en RFLP. Éste se puede utilizar si la presencia del polimorfismo en el polinucleótido crea o destruye un sitio de restricción que es reconocido por una enzima de restricción.
La presencia de la mutación o el polimorfismo puede ser determinada basándose en el cambio que la presencia de la mutación o el polimorfismo ejerce sobre la movilidad del polinucleótido durante una electroforesis en gel. En el caso de un polinucleótido, se puede utilizar un análisis por polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP; del inglés, single-stranded conformational polymorpohism) o mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE; del inglés, denaturing gradient gel electrophoresis).
En otro método para detectar la mutación o el polimorfismo, un polinucleótido que comprende la región polimórfica es secuenciado a través de la región que contiene el polimorfismo para determinar la presencia del polimorfismo. Los métodos de la segunda realización diagnóstica pueden ser llevados a cabo utilizando una matriz, tal como un chip de DNA. Por ejemplo, se puede inmovilizar una sonda sobre un chip de DNA.
En una tercera realización diagnóstica del invento, el método de diagnóstico comprende poner una muestra aislada de un individuo, que comprende un polipéptido CCRL2, en contacto con un polipéptido MIP-4 bajo unas condiciones que permiten la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2. Luego se mide la actividad del polipéptido CCRL2. Luego se compara la actividad de este polipéptido CCRL2 con la de un patrón, y una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo. Este patrón se refiere a la medición equivalente en un individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
Los métodos de la tercera realización diagnóstica también comprenden poner una muestra aislada de un individuo, que comprende un polipéptido MIP-4, en contacto con un polipéptido CCRL2 bajo unas condiciones que permiten la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2. Luego se mide la actividad del polipéptido CCRL2. Luego se compara la actividad de este polipéptido CCRL2 con la de un patrón, y una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en el individuo. Este patrón se refiere a la medición equivalente en un individuo no afectado por la enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
Las condiciones que permiten la unión de un polipéptido MIP-4 con un polipéptido CCRL2 son, por ejemplo, la temperatura, la concentración de sales, el pH y la concentración de proteínas, bajo las cuales se une un polipéptido MIP-4 con un polipéptido CCRL2. Las condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, tal como, por ejemplo, si en el ensayo se utilizan células viables o sólo una fracción de membrana de las células. Sin embargo, puesto que CCRL2 es un receptor de la superficie celular y los polipéptidos MIP-4 son polipéptidos secretados que interaccionan con el dominio extracelular de CCRL2, las condiciones preferidas incluirán generalmente una concentración salina (aproximadamente 90 mM) y un pH (aproximadamente de 7,0 a 8,0) fisiológicos. La temperatura para la unión puede variar de 4ºC a 37ºC, pero es preferiblemente 4ºC. También variará la concentración del polipéptido MIP-4, pero será preferiblemente de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 \muM.
Los métodos de todas las realizaciones diagnósticas se llevan a cabo in vitro sobre una muestra del individuo. La muestra comprende típicamente un fluido corporal y/o células del individuo y se puede obtener, por ejemplo, utilizando una aguja y una jeringa o utilizando una torunda, tal como una torunda bucal. La muestra puede ser una muestra de sangre, orina, saliva, piel, células del carrillo o raíces capilares. La muestra es preferiblemente una muestra sanguínea que comprende monocitos. La muestra es típicamente procesada antes de que se lleve el método a cabo; por ejemplo, se puede llevar a cabo una extracción de DNA, se pueden cultivar las células o se puede preparar una fracción de membrana a partir de las células. Se puede escindir física o químicamente (por ejemplo, utilizando una enzima adecuada) el polinucleótido o la proteína de la muestra. En una realización, la parte de polinucleótido de la muestra es copiada (o multiplicada) mediante, por ejemplo, clonación o utilizando un método basado en PCR, antes de determinar la presencia de mutaciones o polimorfismos.
Bioinformática
El invento proporciona un método para determinar la presencia de una mutación o polimorfismo de MIP-4 asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, o una mutación o polimorfismo de CCRL2 asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4. La secuencia de un polinucleótido o polipéptido MIP-4 asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 puede ser almacenada en un formato electrónico, tal como, por ejemplo, en una base informática de datos. La secuencia de un polinucleótido o polipéptido CCRL2 asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 puede ser almacenada en un formato electrónico, tal como, por ejemplo, en una base informática de datos. La base de datos puede incluir información adicional acerca de los polinucleótidos o polipéptidos. Por ejemplo, la base de datos puede proporcionar uno o más aspectos de los siguientes tipos de información: el nivel de asociación del polinucleótido o el polipéptido con una enfermedad o un trastorno, la frecuencia del polinucleótido o el polipéptido en pacientes aquejados del trastorno, la probabilidad de que un paciente que tiene ese polinucleótido o polipéptido desarrolle una enfermedad o un trastorno, y la interacción del polinucleótido o el polipéptido con un agente terapéutico.
Los métodos diagnósticos del invento pueden ser llevados a cabo por medios electrónicos utilizando, por ejemplo, un sistema informático. En consecuencia, el presente invento proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o para determinar la susceptibilidad de un individuo a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, método que comprende determinar si el individuo tiene un polinucleótido o polipéptido MIP-4 que comprende una mutación asociada con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2:
(i) obteniendo opcionalmente datos de la secuencia de MIP-4 de una muestra obtenida de un individuo;
(ii) introduciendo los datos de la secuencia de MIP-4 de dicho individuo en un ordenador;
(iii) comparando dichos datos con datos de la secuencia de MIP-4 almacenados en una base informática de datos, base de datos que comprende información relativa a datos de la secuencia de MIP-4 con respecto a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2; y
(iv) determinando, basándose en dicha comparación, la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en dicho individuo o si dicho individuo es susceptible de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
En consecuencia, el presente invento también proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 o para determinar la susceptibilidad de un individuo a una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4, método que comprende determinar si el individuo tiene un polinucleótido o polipéptido que comprende una mutación asociada con una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4:
(i) obteniendo opcionalmente datos de la secuencia de CCRL2 de una muestra obtenida de un individuo;
(ii) introduciendo los datos de la secuencia de CCRL2 de dicho individuo en un ordenador;
(iii) comparando dichos datos con datos de la secuencia de CCRL2 almacenados en una base informática de datos, base de datos que comprende información relativa a datos de la secuencia de CCRL2 con respecto a una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4; y
(iv) determinando, basándose en dicha comparación, la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4 en dicho individuo o si dicho individuo es susceptible de una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4.
Los datos de la secuencia de MIP-4 o CCRL2 se pueden obtener de dicha muestra mediante cualquier medio adecuado, tal como uno de los aquí discutidos. Se puede obtener la secuencia de todo el gen MIP-4 o CCRL2 o de parte de él. Para obtener los datos de las secuencias, se pueden utilizar protocolos de secuenciación estándares conocidos en la técnica.
Los datos de la secuencia de MIP-4 o los datos de la secuencia de CCRL2 pueden ser guardados en una base de datos que comprenda información relativa a dos o más mutaciones o polimorfismos que están asociados con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 o una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4, incluyendo polimorfismos en los genes MIP-4 y/o CCRL2 y mutaciones o polimorfismos en genes distintos de los genes MIP-4 y CCRL2.
El invento también proporciona un aparato que comprende medios para determinar la susceptibilidad de un individuo a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, o a una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4, basándose en la presencia de mutaciones o polimorfismos presentes en el gen MIP-4 y/o el gen CCRL2 de dicho individuo.
El invento proporciona además un programa informático que comprende un medio de códigos de programa que, cuando se ejecuta en un sistema informático, instruye al sistema informático para que lleve a cabo un método de diagnóstico de acuerdo con el invento. También se proporciona un producto de programa informático que comprende o bien un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene grabado en él un programa informático, o bien un medio de códigos de programa sobre una onda portadora, que, cuando se ejecuta en un sistema informático, instruye al sistema informático para que lleve a cabo un método del invento.
Individuo
En todas las realizaciones terapéuticas y diagnósticas anteriormente discutidas, el individuo es típicamente un individuo mamífero, tal como, por ejemplo, un mamífero mantenido como un animal de compañía o por razones agrícolas o deportivas. En una realización, el mamífero es uno en que aparece naturalmente una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 (sin intervención del hombre). El mamífero puede ser un animal bovino, porcino, canino, felino, roedor (tal como un ratón, una rata o un hámster) o primate. En una realización preferida, el individuo es un individuo humano.
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Kits
El presente invento proporciona diversos kits para detectar agentes que modulan la actividad de CCRL2. Estos kits comprenden:
- (i) un polipéptido MIP-4 y (ii) un polipéptido CCRL2 o un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido CCRL2;
- un polipéptido MIP-4 y una célula transformada con un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2: o
- un polipéptido MIP-4 y una fracción de membrana celular que comprende un polipéptido CCRL2.
El kit puede comprender además uno o más reactivos o instrumentos diferentes que permitan que se lleve a cabo cualquiera de las realizaciones de los métodos anteriormente mencionados. Dichos reactivos o instrumentos incluyen uno o más de los siguientes: un medio para detectar la unión del agente al polipéptido CCRL2, un marcador detectable (tal como un marcador fluorescente), una enzima capaz de actuar sobre un polinucleótido (típicamente una polimerasa, enzima de restricción, ligasa, RNasa H o una enzima que pueda fijar un marcador a un polinucleótido), un(os)
tampón(es) adecuado(s) (disoluciones acusas) para reactivos enzimáticos, cebadores de PCR, un testigo positivo y/o negativo, un aparato para electroforesis en gel, un medio para aislar DNA de una muestra, un medio para obtener una muestra del individuo (tal como un instrumento que comprenda una aguja) y un soporte que comprenda pocillos sobre los cuales se puedan realizar reacciones de detección.
Células de levadura
El invento proporciona además el uso de células de levadura transformadas (o transfectadas) con un polinucleótido CCRL2 en un método del invento. Los métodos para la transformación (o transfección) de células de levadura son bien conocidos en la técnica (Davey et al., "Pheromone procedures in fission yeast", 1995, en Microbial Gene Techniques: Methods in Molecular Genetics 6B, K. W. Adolph, San Diego, Academic Press: 247-263; y Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003).
El polinucleótido CCRL2 comprende preferiblemente la secuencia de ID. SEC. nº 1 ó 3 o una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la ID. SEC. nº 1 ó 3 en toda su longitud. Se pueden introducir polinucleótidos CCRL2 en las células utilizando acetato de litio, electroporación o transformación de esferoplastos (Davey et al., "Pheromone procedures in fission yeast", 1995, en Microbial Gene Techniques: Methods in Molecular Genetics 6B, K. W. Adolph, San Diego, Academic Press: 247-263; y Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003). También se pueden incorporar polinucleótidos CCRL2 a un vector recombinante. Preferiblemente, se une operativamente un polinucleótido CCRL2, en un vector, con una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación por la célula huésped de levadura; es decir, el vector es un vector de expresión. Dichos vectores de expresión pueden ser utilizados para que se exprese el polipéptido CCRL2.
La expresión "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en que los componentes descritos están en una relación que les permite actuar del modo previsto. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia de codificación está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia de codificación se lleva a cabo bajo unas condiciones compatibles con las secuencias de control. Se pueden introducir múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido CCRL2 en el vector.
Con dichos vectores se puede transformar una célula de levadura huésped adecuada para que proporcione la expresión de un polipéptido CCRL2. De esta manera, se puede obtener un polipéptido CCRL2 cultivando una célula de levadura huésped transformada o transfectada con un vector de expresión como el anteriormente descrito bajo unas condiciones que conduzcan a la expresión del polipéptido, y recuperando el polipéptido expresado. Más preferiblemente, dichas células huésped pueden ser utilizadas en los métodos de exploración del invento.
Para que se exprese un polipéptido CCRL2 en la célula de levadura, se puede utilizar cualquier vector adecuado. Los lectores pueden ser, por ejemplo, un vector plasmídico provisto de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del citado polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tal como, por ejemplo, URA3, HIS3, LEU2, TRP1, LYS2 o un gen de resistencia a la tetraciclina. Los promotores y demás señales para la regulación de la expresión pueden ser seleccionados para que sean compatibles con la célula huésped para la cual se diseña el vector de expresión. Se puede transformar la célula huésped con múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido CCRL2 en un solo vector de expresión, o con más de un vector de expresión cada uno de los cuales incluya un polinucleótido CCRL2 que puede ser igual o diferente.
La secuencia promotora es preferiblemente una secuencia promotora procedente de una célula de levadura y, en particular, de Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Los promotores adecuados para la expresión del polinucleótido CCRL2 en células de levadura incluyen GAL, GAL10, PHO5, ADHI, PGK y GPDI (Schneider y Guarente, Methods Enzymol. 194: 373-388, 1991) y el promotor nmt-1 reprimible por tiamina (Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003). Los vectores de expresión adecuados para la expresión del polinucleótido CCRL2 en células de levadura incluyen pBM150, pYEp51, pLGSD5, YEp51, pAM82, pYE4, pAAh5, pMA56, pAH9/10/21, pMA230, pMA91 y pG-1/2 (Schneider y Guarente, Methods Enzymol. 194: 373-388, 1991). El promotor o el vector se escogerán para que sean compatibles con la célula de levadura huésped que se va a transformar.
Preferiblemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe.
En una realización, las células de levadura pueden ser trasplantes de proteína G en que al menos 5, al menos 10, al menos 15 o al menos 20 aminoácidos del extremo carboxílico de la subunidad G\alpha de la levadura han sido sustituidos por los correspondientes restos de una proteína G que no es de levadura, preferiblemente una proteína G humana. Preferiblemente, los 5 aminoácidos C-terminales son sustituidos por los correspondientes restos de una proteína G humana. Preferiblemente, la proteína G humana corresponde a la proteína G con la que interacciona naturalmente el polipéptido CCRL2, por lo que la expresión del polipéptido CCRL2 en la célula de levadura da lugar a una asociación funcional con la proteína G trasplantada. La asociación funcional permite que el polipéptido CCRL2 active la maquinaria de señalización de la célula de levadura. En la célula de levadura se puede introducir un gen informador bajo el control de un promotor que es activado por la maquinaria de la célula de levadura. Luego se puede usar la expresión del gen informador para determinar la actividad del CCRL2. Los genes informadores adecuados incluyen LacZ y GFP. El gen informador se puede integrar en el cromosoma de la célula de levadura. La célula de levadura puede proceder de una cepa con la construcción informadora sxa2>lacZ (Didmon et al., Curr. Genet. 41: 241-253, 2002; y Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003).
Las células de levadura con trasplante de proteína G del invento pueden ser utilizadas en los métodos de exploración del invento. Las proteínas G adecuadas que no son de levadura incluyen Gpa1, Gs, Gi, Go, Gq, Gz, G12, G13, G14 y G16. La proteína G es preferiblemente Gi y, más preferiblemente, Gi3.
Las células con trasplante de proteína G pueden ser generadas del modo descrito por Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003.
En consecuencia, una célula de levadura preferida proporcionada por el invento comprende un polipéptido CCRL2, una proteína Gi3 y, opcionalmente, una construcción informadora. El polipéptido CCRL2 comprende preferiblemente la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4. La proteína Gi3 comprende preferiblemente 5 restos carboxi-terminales de Gi3 humana fusionados con una proteína G de levadura en la que se han suprimido los 5 restos carboxi-terminales correspondientes.
Administración o suministro
Cuando la administración tiene la finalidad de tratamiento, la administración puede tener una finalidad profiláctica o terapéutica. Cuando se proporciona profilácticamente, el agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo se proporciona antes de cualquier síntoma. Puede que en el individuo se haya identificado una predisposición genética a una enfermedad o trastorno inflamatorio. Por ejemplo, cuando la enfermedad o trastorno inflamatorio es una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, tal como enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis o una enfermedad inflamatoria cerebral, el individuo puede tener en el gen CCRL2 un polimorfismo que esté asociado con la enfermedad o el trastorno. La administración profiláctica del agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo sirve para evitar o atenuar cualquier síntoma subsiguiente. Cuando se proporciona terapéuticamente, el agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo se proporciona al inicio de un síntoma o después, preferiblemente poco después, del inicio de un síntoma. La administración terapéutica del agente o polipéptido, el polinucleótido o el anticuerpo sirve para atenuar cualquier síntoma presente. La administración y, por lo tanto, los métodos del invento se pueden llevar a cabo in vivo o in vitro.
La formulación de cualquiera de los agentes terapéuticos aquí mencionados, incluyendo polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos, dependerá de factores tales como la naturaleza del agente y el estado que se va a tratar. Cualquiera de dichos agentes se puede administrar o suministrar en una diversidad de formas de dosificación. Se puede administrar o suministrar oral (por ejemplo, en forma de tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos), parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal o transdérmicamente, o mediante técnicas de infusión o inhalación. El agente puede ser también administrado o suministrado en forma de supositorio. Un médico podrá determinar la vía de administración o suministro requerida para cada paciente concreto.
Típicamente, el agente se formula para uso con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una disolución isotónica. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener, junto con el compuesto activo, diluyentes tales como, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz o almidón de patata; lubricantes tales como, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicoles; agentes aglutinantes tales como, por ejemplo, almidones, gomas arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilpirrolidona; agentes disgregantes tales como, por ejemplo, almidón, ácido algínico, alginatos o almidón-glicolato sódico; mezclas efervescentes; colorantes; agentes edulcorantes; agentes humectantes tales como lecitina, polisorbatos y laurilsulfatos; y, en general, sustancias atóxicas y farmacológicamente inactivas utilizadas en formulaciones farmacéuticas. Dichas preparaciones farmacéuticas pueden ser fabricadas de un modo conocido por medio de, por ejemplo, procedimientos de mezclamiento, granulación, formación de tabletas, revestimiento con azúcar o revestimiento con película.
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Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser jarabes, emulsiones y suspensiones. Como vehículos, los jarabes pueden contener, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerol y/o manitol y/o sorbitol.
Como vehículo, las suspensiones y emulsiones pueden contener, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato sódico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o poli(alcohol vinílico). Las suspensiones o disoluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el compuesto activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo o glicoles, tal como, por ejemplo, propilenglicol, y, si se desea, una cantidad adecuada de hidrocloruro de lidocaína.
Como vehículo, las disoluciones para infusiones o inyecciones intravenosas pueden contener, por ejemplo, agua estéril, o, preferiblemente, pueden estar en forma de disoluciones salinas acuosas, isotónicas y estériles.
Se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente es una cantidad que alivia los síntomas o que evita o retrasa el inicio de los síntomas de una enfermedad o trastorno inflamatorio.
La dosis puede ser determinada de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la sustancia utilizada; la edad, el peso y el estado del paciente que se va a tratar; la vía de administración; y el régimen requerido. De nuevo, un médico podrá determinar la vía de administración y la dosificación requeridas para cualquier paciente concreto. Una dosis diaria típica es de aproximadamente 0,1 a 50 mg por kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, de acuerdo con la actividad del inhibidor específico, la edad, el peso y el estado del sujeto que se va a tratar, el tipo y la gravedad de la enfermedad, y la frecuencia y la vía de administración. Preferiblemente, los niveles de dosificación diarios son de 5 mg a 2 g.
El presente invento se describe con referencia a los siguientes ejemplos no restrictivos.
Ejemplo 1 Ensayos de señalización de CCRL2 Cepas de levadura
Se generaron cepas de levadura de la manera descrita por Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003.
Ensayos con levaduras
Todos los ensayos se llevaron a cabo mediante protocolos estándares de Septegen (Ladds et al., Molecular Microbiology 47 (3): 781-792, 2003). Las cepas de levadura se incubaron con el ligando durante 16 horas antes de examinar la actividad LacZ.
Actividad de CCRL2 en presencia de MIP-4
Se recibió MIP-4 de R&D Systems y se guardó a -20ºC hasta su uso. Se disolvió MIP-4 en medio de crecimiento que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% para obtener una disolución de reserva de 11,1 \muM (50 \mug de quimiocina en un volumen final de 577 \mul). Para la exploración inicial de las cepas con trasplante de proteína G, se diluyeron 210 \mul de la reserva 11,1 \muM hasta un volumen final de 2,1 ml para obtener una concentración de trabajo de 1,11 \muM.
Para cada una de las cepas con trasplante de G, se añadieron 180 \mul de la disolución 1,11 \muM a 20 \mul de células. El volumen de ensayo final fue 200 \mul y la concentración final de MIP-4 fue 1 \muM. La MIP-4 activaba la forma corta de CCRL2 (CRAM-B) en las cepas con trasplante de Gi3 (Figura 1).
Basándose en la exploración inicial frente a todos los trasplantes de G, se examinó la MIP-4 frente al trasplante de Gi3 en un intervalo de concentraciones. A partir de la reserva 11,1 \muM, se realizó una serie de diluciones por un factor de 10 (30 \mul más 270 \mul). Para cada muestra, se añadieron 180 \mul de la reserva apropiadamente diluida a 20 \mul de células (concentraciones finales de 10 \muM, 1 \muM, etc.). La respuesta de las células con trasplante de Gi3 aumentaba exponencialmente con las concentraciones crecientes de MIP-4 (Figura 2).
Experimentos de control
Para confirmar que las respuestas presentadas por las diversas quimiocinas dependen del receptor CCRL2, se examinaron las tres quimiocinas frente a una cepa de levadura apropiada que expresa el receptor del factor liberador de corticotropina (CRFR). Ésta se escogió como cepa testigo ya que tiene agonistas peptídicos e interacciona con los trasplantes de Gq, Gi2 y Gi3, y la interacción depende de la identidad del ligando. La MIP-4 era activa frente a la forma corta de CCRL2 (CRAM-B) en el transplante de Gi3 (10^{-6} M daba lugar a \sim 6,5 unidades de LacZ) (Figura 3). La proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1; del inglés, monocyte chemotactic protein-1) era activa frente a la forma corta de CCRL2 (CRAM-B) en el transplante de Gq (10^{-6} M daba lugar a \sim 5,7 unidades de LacZ) (Figura 3). La proteína 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3) era activa frente a la forma corta de CCRL2 (CRAM-B) en el transplante de Gi2 (10^{-6} M daba lugar a \sim 2,2 unidades de LacZ) (Figura 3).
El factor liberador de corticotropina (CRF) era activo frente a CRF-R1 en el transplante de Gi2 (10^{-6} M daba lugar a \sim 6,4 unidades de LacZ) y el transplante de Gi3 (10^{-6} M daba lugar a \sim 17,2 unidades de LacZ) (Figura 3). La urocortina era activa frente a CRF-R1 en el transplante de Gq (10^{-6} M daba lugar a \sim 6,9 unidades de LacZ).
Ejemplo 2 Ensayos de quimiotaxis con CCRL2 Ensayo de quimiotaxis
Se revistió previamente con 10 \mug/ml de fibronectina una placa ChemoTx (Neuroprobe) de 96 pocillos y un tamaño de poro de 8 \mum. Células transfectadas fueron fluorescentemente marcadas con 5 \mug/ml de calceína (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37ºC. A las cámaras superior e inferior de la placa ChemoTx se aplicaron 25 \mul de células en una densidad de 3 x 10^{6} células/ml y muestras de ensayo (29 \mul) preparadas en medios apropiados. Después de una incubación a 37ºC durante 5 horas, se eliminaron las células que quedaban en la parte superior del filtro mediante tratamiento con EDTA y, en un lector de placas fluorescentes (Perkin Elmer), se cuantificaron las células migradas de la cara inferior del filtro y de los pocillos. Los resultados se muestran en la Figura 6.
MIP-4 estimulaba la quimiotaxis de las células transfectadas con la forma corta de CCRL2 (CRAM-B). MIP-4 no ejercía efecto alguno sobre las células que no habían sido transfectadas con la forma corta de CCRL2 (CRAM-B).
MCP-1 y MCP-3, que activaban la forma corta de CCRL2 en el ensayo con levaduras, también mostraban actividad en el ensayo de quimiotaxis. Como quimiocina testigo, RANTES, que fallaba a la hora de mostrar activación de CCRL2 en el ensayo con levaduras, no provocaba la quimiotaxis de las células transfectadas con CCRL2. MIP-4 y MCP-3, ambas en una concentración 10 nM, provocaban una actividad quimiotáctica similar, atravesando la membrana aproximadamente un 35% más de células que en el caso de las células no tratadas. Las células sólo mostraban una débil respuesta quimiotáctica en presencia de MCP-1 10 nM.
Ejemplo 3 Bloqueo de la quimiotaxis de monocitos provocada por MIP-4, mediante un anticuerpo anti-CCRL2 Aislamiento y cultivo de monocitos
Se purificaron (> 85%) monocitos humanos de la capa linfocítica (centrifugación en gradiente de densidades) utilizando una estrategia de marcación indirecta (kit II para aislamiento de monocitos, Miltenyi Biotech) y se cultivaron durante 5 días en medio RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%.
Ensayo de quimiotaxis
Se examinó la competencia quimiotáctica de monocitos cultivados, utilizando cámaras para quimiotaxis de 96 pocillos (HTS Fluroblok^{TM}, BD Falcon). Los monocitos cultivados fueron previamente marcados con 5 ng/ml de calceína AM (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37ºC y fueron lavados en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline), y luego se añadieron 3 x 10^{4} células (6 x 10^{5} células/ml) a la cámara superior. Se añadió la quimiocina de ensayo (R&D Systems) en una concentración 10 nM a la cámara inferior y se incubó la placa para quimiotaxis a temperatura ambiental durante 10 minutos antes de la recogida de datos utilizando un fluorómetro Victor^{2} (Perkin Elmer). Todas las muestras se analizaron por triplicado.
Bloqueo de la quimiotaxis con un anticuerpo anti-CCRL2
Se obtuvieron anticuerpos anti-CCRL2 de R&D Systems. Para los experimentos de bloqueo con anticuerpos, los monocitos marcados con calceína AM fueron previamente incubados con concentraciones variables de anticuerpos anti-CCRL2 durante 30 minutos a temperatura ambiental. El anticuerpo no unido fue separado mediante lavado con PBS antes de la adición a la placa para quimiotaxis. La quimiotaxis se llevó a cabo del modo anteriormente descrito. Los resultados se muestran en la Figura 7.
El efecto del tratamiento previo, con anticuerpos contra CCRL2, de los monocitos cultivados demuestra que la quimiotaxis de estas células tratadas, provocada por MIP-4, se reduce en aproximadamente un 75%. Como control, el tratamiento previo de las células con un anticuerpo contra un receptor quimiocínico que no genera señales a través de MIP-4 no muestra efecto alguno sobre la quimiotaxis (no mostrado).
Estos datos muestran que el anticuerpo anti-CCRL2 es capaz de reducir el efecto quimiotáctico de MIP-4 sobre monocitos cultivados. Esto confirma que MIP-4 es un ligando de CCRL2 en células inmunes humanas primarias.
Ejemplo 4 Bloqueo de la quimiotaxis de monocitos provocada por líquido sinovial, mediante un anticuerpo anti-CCRL2
Se cultivaron y aislaron monocitos de la manera anteriormente descrita. La placa para quimiotaxis fue dispuesta con monocitos no tratados o tratados con anticuerpo anti-CCRL2, de nuevo del modo anteriormente descrito. El líquido sinovial fue extraído mediante aspiración articular, centrifugado para separar las células y los fragmentos celulares, y luego fraccionado en partes alícuotas y congelado hasta ser necesario. Se pusieron diluciones de líquido sinovial en la cámara inferior de la placa y se analizaron de la manera anteriormente descrita.
Los resultados (mostrados en la Figura 8) demuestran que el tratamiento previo, con un anticuerpo anti-CCRL2, de los monocitos cultivados permite bloquear la quimiotaxis provocada por líquido sinovial diluido (1/100) de pacientes con artritis reumatoide (AR). La máxima concentración de anticuerpo examinada (250 \mug/ml) reducía la quimiotaxis de los monocitos en aproximadamente un 50%. Esto demuestra que los antagonistas de CCRL2 podrían reducir la quimiotaxis de células inmunes a sitios inflamatorios tales como los de pacientes con artritis reumatoide y otros trastornos inflamatorios.
Ejemplo 5 Bloqueo de la quimiotaxis de monocitos provocada por líquido sinovial de pacientes con AR, mediante un anticuerpo anti-MIP-4
Se agotó la MIP-4 de líquido sinovial de pacientes con AR (RASF; del inglés, rheumatoid arthritis synovial fluid) usando un método de RASF diluido por lavado (SF3 1:100) sobre placas revestidas con anti-MIP-4. El anticuerpo anti-MIP-4 unido a las placas fue adquirido a R&D Systems (Nº MAB394 del Catálogo). Estas muestras agotadas fueron luego usadas para examinar los efectos que este agotamiento ejercía sobre la quimiotaxis de monocitos cultivados provocada por el RASF.
Se cultivaron y aislaron monocitos y se llevó la quimiotaxis a cabo de la manera anteriormente descrita.
El procedimiento para separar MIP-4 no agotó completamente la MIP-4. Sin embargo, la reducción de los niveles de MIP-4 fue acompañada de una reducción de la quimiotaxis (SF3 1:100 agotado). Una reducción del 97% (de 5 ng/ml hasta 170 pg/ml) en el nivel de MIP-4 del RASF diluido reducía la quimiotaxis de monocitos en aproximadamente un 30%. Esto se representa más adelante en la Figura 9.
El nivel de MIP-4 (170 pg/ml) que quedaba en el RASF después del agotamiento era aún capaz de provocar una respuesta quimiotáctica. Esto se muestra en la Figura 9, que demuestra que 250 pg/ml de rMIP-4 en PBS aún dan lugar a un aumento de 0,5x en la quimiotaxis de los monocitos.
Estos datos demuestran que MIP-4 es un mediador importante de la quimiotaxis provocada por monocitos, hallada en el líquido sinovial de pacientes con AR. Por lo tanto, los anticuerpos específicos para MIP-4 son útiles en la artritis reumatoide y en otros trastornos inflamatorios al reducir la cantidad de células inmunes que se infiltran, tanto monocitos/macrófagos como neutrófilos en el caso de la AR, lo que posiblemente reduciría los síntomas de la enfermedad.
<110> OXAGEN LIMITED
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<120> Ligando
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<130> N.89652C GCW
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, versión 3.2
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<210> 1
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<211> 1531
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (48)..(1118)
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<400> 1
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2
3
4 
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<210> 2
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<211> 356
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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5
6 
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<210> 3
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<211> 1771
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (328)..(1362)
\newpage
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<400> 3
7
8 
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<210> 4
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<211> 344
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
9
10 
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<210> 5
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<211> 793
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (61)..(330)
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<400> 5
11
12 
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<210> 6
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<211> 89
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
13

Claims (25)

1. Un método in vitro para detectar un agente que module la actividad de CCRL2, método que comprende:
(a) poner un polipéptido CCRL2 en contacto con un polipéptido de proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4) en presencia de un agente candidato bajo unas condiciones que, en ausencia del agente de ensayo, permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2; y
(b) determinar si el agente candidato es capaz de modular la interacción entre dicho polipéptido CCRL2 y dicho polipéptido MIP-4.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que:
(a) el polipéptido MIP-4 es un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(ii)
una secuencia que es al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2;
o es un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; y/o
\vskip1.000000\baselineskip
(b) el polipéptido CCRL2 es un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4; o
(ii)
una secuencia que es al menos 80% idéntica a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente equivalente a CCRL2; o
(iii)
un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es funcionalmente equivalente a CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el agente candidato es un polipéptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al antígeno, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico o un compuesto químico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la operación (b) comprende:
(i)
determinar la unión del polipéptido CCRL2 con el polipéptido MIP-4;
(ii)
determinar la actividad de señalización del polipéptido CCRL2; o
(iii)
determinar la actividad quimiotáctica del polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 4, en que:
(i)
la unión del polipéptido CCRL2 con el polipéptido MIP-4 se determina usando desplazamiento de marcadores, resonancia de plasmones superficiales, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, sofocamiento de fluorescencia o polarización de fluorescencia; o
(ii)
la actividad de señalización se determina mediante la medición de la unión de nucleótidos de guanosina, la actividad GTPasa, la actividad adenilato ciclasa, adenina monofosfato cíclica (cAMP), la actividad proteína cinasa C, la descomposición del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, la actividad MAP cinasa, la expresión de genes informadores o la actividad de Gi3.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el polipéptido MIP-4 es detectablemente marcado con, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo, un agente sofocador de la fluorescencia, una enzima, una etiqueta de afinidad o una etiqueta epitópica.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el polipéptido CCRL2 se expresa sobre una célula.
8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 7, en que la célula es una célula de levadura.
9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, en que la célula de levadura comprende una proteína G en que al menos 5 aminoácidos del extremo carboxílico de una subunidad G de levadura han sido sustituidos por los correspondientes restos de una proteína G que no es de levadura, tal como Gi3.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en que el polipéptido CCRL2 está presente:
(a)
en o sobre liposomas sintéticos;
(b)
en o sobre membranas en gemación provocada por virus;
(c)
en o sobre una bicapa lipídica artificial; o
(d)
en una fracción de membrana de células que expresan el polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un método para modular in vitro la actividad de un polipéptido CCRL2 en una célula, método que comprende suministrar un anticuerpo específico para MIP-4 a la célula, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 con CCRL2, por lo que se modula la actividad de CCRL2.
12. Uso de un anticuerpo específico para CCRL2, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con MIP-4, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer.
13. Uso de un anticuerpo específico para MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 con CCRL2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo, enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad.
14. Un método para activar in vitro una ruta de señalización de CCRL2 en una célula, método que comprende suministrar a la célula un polipéptido que comprende:
(a)
la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b)
una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
(c)
un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Uso de un polipéptido que comprende:
(a)
la secuencia de MIP-4 mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b)
una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
(c)
un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido,
para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, seleccionado entre enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis y un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Uso de un polipéptido que comprende:
(a)
la secuencia de CCRL2 mostrada en la ID. SEC. nº 2 ó 4;
(b)
una secuencia que es al menos 80% idéntica a la ID. SEC. nº 2 ó 4 en toda su longitud y es funcionalmente equivalente a CCRL2; o
(c)
un fragmento de la ID. SEC. nº 2 ó 4 que es funcionalmente equivalente a CCRL2, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido,
para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con MIP-4, seleccionado entre inflamación alérgica y cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a)
llevar a cabo una reacción de multiplicación sobre una muestra aislada del individuo, utilizando cebadores específicos para un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4;
(b)
determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4 en la muestra; y
(c)
comparar la cantidad del polinucleótido multiplicado que codifica un polipéptido MIP-4, producido en la operación (a), con la de un patrón, en que una diferencia de cantidad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, determinándose de este modo la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a)
multiplicar un polinucleótido que codifica un polipéptido MIP-4, usando como molde un ácido nucleico aislado del individuo; y
(b)
determinar si el polinucleótido comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un método de acuerdo con la Reivindicación 18, en que la operación (b) comprende:
(a)
introducir datos de la secuencia de MIP-4 del individuo en un sistema informático;
(b)
comparar dichos datos secuenciales con una base informática de datos, base de datos que comprende información relativa a datos de la secuencia de MIP-4 con respecto a una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2; y
(c)
determinar, basándose en dicha comparación, si el polinucleótido MIP-4 comprende un polimorfismo asociado con una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en un individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral, método que comprende:
(a)
poner una muestra aislada del individuo, que comprende un polipéptido CCRL2, en contacto con un polipéptido MIP-4 bajo unas condiciones que permitan la unión del polipéptido MIP-4 con el polipéptido CCRL2;
(b)
medir la actividad del polipéptido CCRL2; y
(c)
comparar la actividad del polipéptido CCRL2 con la de un patrón, en que una diferencia de actividad con respecto a la del patrón es indicativa de la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 en el individuo, en que la enfermedad o trastorno relacionado con CCRL2 es la enfermedad inflamatoria intestinal, endometriosis, aterosclerosis o un trastorno inflamatorio cerebral.
\newpage
21. Un kit para detectar un agente que modula la actividad de CCRL2, kit que comprende:
(i)
un polipéptido MIP-4; y
(ii)
un polipéptido CCRL2 o un polinucleótido que codifica un polipéptido CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un kit de acuerdo con la Reivindicación 21, en que el polipéptido CCRL2 se expresa en una célula transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido CCRL2 o está presente en una fracción de membrana celular, un liposoma sintético o una membrana en gemación provocada por virus.
23. Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 17 a 20 o un kit de acuerdo con la Reivindicación 21 ó 22, en que el polipéptido MIP-4 es un polipéptido que comprende:
(a)
la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 6; o
(b)
una secuencia al menos 50% idéntica a la ID. SEC. nº 6 y que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2; o
(c)
un fragmento de la ID. SEC. nº 6 que se une a CCRL2 y activa una actividad de señalización de CCRL2.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Un anticuerpo específico para MIP-4, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de MIP-4 con CCRL2, para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio óseo, enfermedad inflamatoria intestinal, un trastorno inflamatorio cerebral, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos u obesidad.
25. Un anticuerpo específico para CCRL2, anticuerpo que es capaz de inhibir la unión de CCRL2 con MIP-4, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada o una infección, en que la enfermedad o trastorno inflamatorio es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquitis, enfisema, un trastorno inflamatorio óseo, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, endometriosis, síndrome de deficiencia autoinmune (sida), lupus eritematoso, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide o inflamación alérgica, o en que la enfermedad o trastorno asociado con una actividad macrofágica aumentada es obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, enfermedad autoinmune, hipersensibilidad de contacto o cáncer.
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