CN105308460A - 个性化药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂和/或B细胞抑制剂的效力的方法,以及用所述抑制剂治疗所述受试者的方法,条件是所述抑制剂的效力已被确定为足够的。
Description
技术领域
本发明涉及诊断和治疗领域。其提供了用于评价促炎细胞因子的抑制剂和/或B细胞的抑制剂的效力并由此选择用于怀疑患有自身免疫和/或炎症性疾病和/或病症的受试者的最好的可能治疗的方法。
背景技术
克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是炎症性肠病(IBD),其中在发病机理中肠道粘膜中的失调性炎症性反应起主要作用。在生理条件下促炎细胞因子(例如TNFα或IL-1β)和抗炎细胞因子(例如IL-10或TGFβ)之间存在平衡。白细胞介素-1β是先天免疫系统的最重要的促炎介体(mediator)中的一种,并且它在IBD发病机理中的作用已经广泛证实(1)。
自噬是调节IL-1β分泌的主要过程中的一种(2),并且已经显示自噬基因多态性(例如ATG16L1、IRGM)与克罗恩氏病相关联(3)。近来,我们已证实了T300AATG16L1多态性强调节IL-1β生产,并且风险变量(riskvariant)与细胞因子增加的合成和释放相关联(4)。IL-1β的产生受到称为炎症小体(炎性小体,inflammasomes)的细胞内蛋白平台的高度控制(5,6)。与IL-1β产生关联的炎症小体包含前-半胱天冬酶-1(pro-caspase-1),关键酶,当被激活时用于细胞内前-IL-1β(pro-IL-1β)的切割(7)。我们评价了特定的半胱天冬酶-1抑制剂是否能够阻断IL-1β的加工和释放,并因此可以对在IBD中的炎症性过程产生有利的影响。此外,我们已经研究了半胱天冬酶-1抑制剂是否在一方面具有高IL-1β生产能力的个体,以及在另一方面具有T300AATG16L1多态性的那些个体中更有效。
令人惊奇的是,我们注意到,在所筛选的受试者中产生细胞因子的固有能力是不同的,而抗炎剂的效果依赖于细胞因子产生。其揭示了我们可以区分所述细胞因子的高、中和低产生者。所述细胞因子的高产生者可以是另一种细胞因子的高、中或低产生者。这些结果导致下述观点:识别细胞因子产生的个体分布(情形,profile)并由此基于患者在高和低细胞因子产生者中的分级(stratification),将患有(自身)炎症性疾病的个体患者差响应者分级(分配)为特定的抗炎生物治疗以及将较好的响应者分级为另一种生物治疗成为可能。这种分级预期适用于所有基于当前使用的生物疗法的治疗。患者的分级,对于不太可能成功的限制性治疗(sparedtreatment)以及具有潜在重要副作用的患者而言,以及由于这样的个性化(personalised)方法显著的成本节省方面而对于卫生保健系统而言,可能是非常有意义的。
具体实施方式
评价方法
第一方法:评价促炎细胞因子抑制剂的效力
在第一方面,本发明涉及用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的化合物接触所述样品以及
(b2)用所述样品中所述促炎细胞因子的所述抑制剂与所述样品接触,
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时确定所述促炎细胞因子在所述样品中的表达水平分布(表达水平谱,profileofexpressionlevel)以及
(d)当在步骤(b1)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的分布或表达水平,或者分布或表达水平的增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的分布或表达水平降低时,评价所述抑制剂的效力为足够的。
促炎细胞因子是能够促进系统性炎症(systemicinflammation)的细胞因子。促炎细胞因子优选参与如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症,或者与如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症相关联,或者是如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症的结果。促炎细胞因子优选选自由IL-1β、TNFα或IFNγ、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、IL-5所组成的组。IL-1β是优选的促炎细胞因子。已知IL-1β参与克罗恩氏病。
这种促炎细胞因子抑制剂可以是能够抑制所述促炎细胞因子产生和/或能够降低所述促炎细胞因子的表达水平和/或能够降低所述促炎细胞因子的活性和/或能够抑制所述细胞因子的受体和/或能够竞争所述细胞因子与其受体结合的化合物。此类抑制剂可抑制所述细胞因子受体的链,和/或可通过靶向其受体的一条链竞争所述细胞因子与其受体的结合。这种抑制剂可在受试者中或在所述受试者的样品中表现出这种抑制和/或减少,如本文中稍后所定义的。IL-6的抑制剂可以是IL-6R的抑制剂。IL-6R的抑制剂优选为IL-6R的一条链的抑制剂,更优选IL-6R的α链的抑制剂。IL-17的抑制剂可以是IL-17A或IL-17F的抑制剂。IL-12的抑制剂可以是IL-12P40的抑制剂。优选的促炎细胞因子的抑制剂鉴别在表2中。
已知并已开发了若干促炎细胞因子的抑制剂,并且一些仍在开发用于治疗、延缓、治愈、预防炎症性和/或自身免疫性疾病或病症。优选的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症的实例包括炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)、其他RA样疾病(RA-likediseases)、克罗恩氏病(Crohndisease)、多发性硬化(MS)、银屑病、化脓性汗腺炎(HidradenitisSuppurativa)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肉状瘤病(Sarcoidosis)、痛风、韦格内氏疾病(WegenerDisease)、2型糖尿病、动脉粥样硬化、莱姆病(Lymedisease)、败血症、哮喘、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)。其他RA样疾病包括银屑病关节炎(Sporiaticarthritis)、强直性脊柱炎或幼年型关节炎(juvenilearthritis)。优选的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症鉴别在表1中。
促炎细胞因子的抑制剂的实例包括,抗这些促炎细胞因子产生的抑制抗体,如来自Novartis的Ilaris(即,卡那单抗(canakinumab)),其是抗IL-1β产生的人单克隆抗体,来自Abbott的修美乐(Humira)(即,阿达木单抗(Adalimumab))或来自Wyeth/Pfizer的另一种TNFα抑制剂恩利(Enbrel)(即,依那西普(Etanercept)),或来自Roche的IL-6R的抑制剂托珠单抗(Tocilizumab)。抑制这种促炎细胞因子的小分子(或肽模拟物(拟肽))为半胱天冬酶1抑制剂VRT(Vertex)。在稍后的部分中,提供了更多关于如何产生抑制抗体或肽模拟物的信息。已知半胱天冬酶1抑制剂VRT抑制IL-1β的产生,且所述半胱天冬酶1抑制剂已经用于治疗克罗恩氏病,如在实验部分所解释的。托珠单抗已经用于治疗克罗恩氏病和RA。恩利已经用于治疗RA、强直性脊柱炎和银屑病关节炎(psoriaticanthritis)。
第二方法:评价B细胞的抑制剂的效力
在另一方面,本发明涉及用于在受试者中评价B细胞抑制剂的效力的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导B细胞产生的化合物接触所述样品以及
(b2)用所述样品中所述B细胞的所述抑制剂与所述样品接触,
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时确定所述B细胞在所述样品中的数量以及
(d)当在步骤(b1)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量或数量增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量减少时,评价所述抑制剂的效力为足够的。
作为促炎细胞因子的B细胞能够促进系统性炎症。B细胞可参与如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症,或与如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症相关联,或是如本文所定义的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症的结果。可以通过利用本领域技术人员已知的技术评价B细胞特异性标记的存在而在样品中识别B细胞。如果标记物是在细胞表面表达,优选的技术为利用识别所述标记物的(部分)细胞外结构域的特异性抗体的FACS(荧光激活细胞分选术)分析。优选的B细胞特异性标记物为CD20或CD19。在这种FACS分析中使用的优选市售抗CD20抗体为来自Millipore的抗-CD20,克隆2H7。本领域的技术人员清楚B细胞标记物可以用于本发明,以评价存在于样品中的B细胞的数量。其还可以作为本文所鉴别的B细胞的抑制剂的靶标。
B细胞的这种抑制剂可以是能够抑制所述B细胞产生和/或能够减小所述B细胞的数量和/或能够减小所述B细胞的活性的化合物。B细胞的抑制剂也可以称为能够耗尽/捕获/灭活B细胞和/或耗尽/捕获/灭活由这样的B细胞产生的抗体的化合物。B细胞的活性可以是产生促炎细胞因子如IL-6或IL-10,或者可以是促进通过其它细胞产生促炎细胞因子,例如T辅助细胞(Thl7)。已知Thl7能够产生IL-17作为促炎细胞因子。
已知并已开发了若干B细胞的抑制剂,并且一些仍在开发用于治疗、延缓、治愈、预防炎症性和/或自身免疫性疾病或病症。优选的B细胞抑制剂为CD20的抑制剂,更优选如表2中所鉴别的:利妥昔单抗(Roche,CH)、奥法木单抗(GSK,UK)、维妥珠单抗(Takeda,JP)或奥瑞珠单抗(RocheCH)。B细胞的另一种优选的抑制剂为CD19的抑制剂。优选的CD19抑制剂为GBR401(GlenmarkPharmaceuticals,CH)。
本文中已经定义了优选的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症的实例。更优选的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症(B细胞可能参与这样的疾病或病症,或与这样的疾病或病症关联,或是这样的疾病或病症的结果)包括类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化症(MS)。优选的炎症性和/或自身免疫性疾病或病症鉴别在表1中。
在优选实施方式中,将第一方法(即评价促炎细胞因子的抑制剂的效力的方法)和第二方法(即评价B细胞的抑制剂的效力的方法)应用在同一受试者上。以下进一步定义了第一方法中的各种特征。除非另有说明,第一方法的各特征可以应用在第二方法上。
因此,本发明涉及一种用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力和/或评价B细胞抑制剂的效力的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的化合物接触所述样品,和/或用能够在所述样品中诱导B细胞产生的化合物接触所述样品以及
(b2)用所述样品中的所述促炎细胞因子的所述抑制剂与所述样品接触,和/或用所述样品中的所述B细胞的所述抑制剂与所述样品接触
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时在所述样品中确定所述促炎细胞因子的分布或表达水平和/或确定所述B细胞的数量以及
步骤(d):
(d1)当在步骤(b1)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的分布或表达水平,或者分布或表达水平的增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的分布或表达水平减少时,评价所述促炎细胞因子抑制剂的效力为足够的,和/或
(d2)当在步骤(b1)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量或数量增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量减少时,评估所述B细胞的所述抑制剂的效力为足够的。
可以在受试者正治疗给定的自身免疫性和/或炎症性疾病和/或病症之前,执行本发明的方法(即,第一和/或第二方法)。本发明也包括:一旦这样的治疗已经开始,执行本发明的方法。在这种情况下,当前治疗(即,在第一方法中的促炎细胞因子抑制剂和在第二方法中的B细胞抑制剂)的效力可与其他可能的一种治疗(即,在第一种方法中的促炎细胞因子的其它抑制剂和在第二种方法中的B细胞的抑制剂)相比较。如果本发明的方法指示预期其它治疗的效力优于当前治疗中的一种,可以修改给予所述受试者的治疗类型,并可选择具有最佳效力的抑制剂。
在本发明的上下文中,受试者可以是人类或动物。该方法(即,第一和/或第二方法)在受试者可以按照需要的频率(asoftenasnecessary)应用。如果受试者是人类,该受试者可以是怀疑具有患有或发展自身免疫性和/或炎症性疾病或病症的高风险的个人,例如由于其遗传背景。
因此在优选的实施方式中,本发明提供了在怀疑患有自身免疫和/或炎症性疾病或病症的受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力的方法,其中所述促炎细胞因子选自由IL-1-β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和IFNγ所组成的组,并且所述方法包括下列步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的化合物接触所述样品以及
(b2)用所述样品中的所述促炎细胞因子的所述抑制剂与所述样品接触,
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时确定所述促炎细胞因子在所述样品中的分布或表达水平以及
(d)当在步骤(b1)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平或表达水平的增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平减少时,评估所述促炎细胞因子的所述抑制剂的效力为足够的。
表1提供了几种自身免疫性和/或炎症性疾病和/或病症以及已知参与到所述疾病和/或病症中的主要的促炎细胞因子的概述。表1还提供了几种其中怀疑B细胞参与或发挥作用的自身免疫性和/或炎症性疾病和/或病症的概述。表2给出一些促炎细胞因子的一些已知的抑制剂的概述。表2还提供了一些已知的B细胞抑制剂的概述。
在一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力和/或评价B细胞抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为:RA(类风湿性关节炎)和/或
-促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组和/或
-由B细胞抑制剂靶向的B细胞标记物是CD20或CD19。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-12,IL-12的抑制剂是IL-12P40的抑制剂。这种优选的抑制剂是优特克单抗(Ustekinumab)(Janssen-Cilag,BE)。优选地,如果促炎细胞因子是IL-17,IL-17的抑制剂是IL-17A的抑制剂。IL-17A的优选的抑制剂为Brodalumab(Amgen,USA);Ixekizumab(Lilly(Eli),USA)或Secukinumab(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-23,IL-23的抑制剂是优特克单抗(Janssen-Cilag,BE)。
优选地,如果促炎细胞因子是CD20,CD20的抑制剂是利妥昔单抗(Roche,CH)
优选地,如果促炎细胞因子是IL-6,IL-6的抑制剂是托珠单抗(Roche,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(Anakinra)(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Embrel)(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(Infliximab)(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(Golimumab)(MSD)。
优选的CD20抑制剂是利妥昔单抗(Roche,CH)、奥法木单抗(GSK,UK)、维妥珠单抗(Takeda,JP)或奥瑞珠单抗(RocheCH)。另一种优选的B细胞抑制剂为CD19的抑制剂。优选的CD19抑制剂是GBR401(GlenmarkPharmaceuticals,CH)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为:另一种RA样疾病和/或
-促炎细胞因子为TNFα。
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(MSD)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症是溃疡性结肠炎和/或
-促炎细胞因子是TNFα
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(MSD)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症是克罗恩氏病和/或
-促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-12,IL-12的抑制剂是IL-12p40的抑制剂。IL-12p40的优选的抑制剂是优特克单抗(Janssen-Cilag,BE)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-17,IL-17的优选的抑制剂是IL-17A的抑制剂。IL-17A的优选的抑制剂为Brodalumab(Amgen,USA);Ixekizumab(Lilly(Eli),USA)或Secukinumab(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-23,IL-23的抑制剂是优特克单抗(Janssen-Cilag,BE)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(MSD)。
在一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为银屑病和/或
-促炎细胞因子选自由TNFα、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-12,IL-12的抑制剂是IL-12p40的抑制剂。IL-12p40的优选的抑制剂是优特克单抗(Janssen-Cilag,BE)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-17,IL-17的抑制剂是IL-17A的抑制剂。IL-17A的优选的抑制剂为Brodalumab(Amgen,USA);Ixekizumab(Lilly(Eli),USA)或Secukinumab(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-23,IL-23的抑制剂是优特克单抗(Janssen-Cilag,BE)。
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(MSD)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力和/或评价B细胞抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为:MS(多发性硬化症)和/或
-促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组和/或
-由B细胞抑制剂靶向的B细胞标记物是CD20或CD19。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-17,IL-17的优选的抑制剂是IL-17A的抑制剂或IL-17F的抑制剂。IL-17A的优选的抑制剂为Brodalumab(Amgen,USA);Ixekizumab(Lilly(Eli),USA)或Secukinumab(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是CD20,CD20的抑制剂是利妥昔单抗(Roche,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
优选的CD20抑制剂是利妥昔单抗(Roche,CH)、奥法木单抗(GSK,UK)、维妥珠单抗(Takeda,JP)或奥瑞珠单抗(RocheCH)。另一种优选的B细胞抑制剂为CD19的抑制剂。优选的抑制剂或CD19是GBR401(GlenmarkPharmaceuticals,CH)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为哮喘和/或
-促炎细胞因子选自由IL-5和IFNγ所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-5,IL-5的抑制剂是美泊利单抗(Mepolizumab)(GSK,UK)。
优选地,如果促炎细胞因子是IFNγ,IFNγ的抑制剂是Immukine(BoehringerIngelheim,DE)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为败血症和/或
-促炎细胞因子选自由IL-1β和IFNγ所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IFNγ,IFNγ的抑制剂是Immukine(BoehringerIngelheim,DE)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为通风和/或
-促炎细胞因子是IL-1β。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为莱姆病和/或
-促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-17,IL-17的优选的抑制剂是IL-17A的抑制剂。IL-17A的优选的抑制剂为Brodalumab(Amgen,USA);Ixekizumab(Lilly(Eli),USA)或Secukinumab(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
在另一实施方式中,如本文中较早定义的本发明的方法(即用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力,优选其中所述受试者怀疑患有自身免疫性和/或炎症性疾病或病症)是这样的:
-自身免疫性和/或炎症性疾病或病症为II型糖尿病和/或
-促炎细胞因子选自由TNFα和IL-1β所组成的组。
优选地,如果促炎细胞因子是IL-1β,IL-1β的抑制剂是阿那白滞素(IL-IRα)(Sobi,SE);Ilaris(抗-IL-1b)(Novartis,CH)。
优选地,如果促炎细胞因子是TNFα,TNFα的抑制剂是恩利(Amgen和Whyett,USA);修美乐(Abbott,USA);英夫利昔单抗(CentocorPharmaceuticals(Johnson&Johnson),USA);高利单抗(MSD)。
因此,优选的方法应用于以下自身免疫性和/或炎症性疾病或病症和/或应用于以下促炎细胞因子和/或B细胞标记物:
i.RA和/或促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组和/或B细胞标记物是CD20和/或CD19
ii.另一RA样疾病和/或促炎细胞因子是TNFα,
iii.溃疡性结肠炎和/或促炎细胞因子是TNFα,
iv.克罗恩氏病和/或促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组,
v.银屑病和/或促炎细胞因子选自由TNFα、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组,
vi.MS和/或促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组和/或B细胞标记物是CD20和/或CD19。
vii.哮喘和/或促炎细胞因子选自由IL-5和IFNγ所组成的组,
viii.败血症和/或促炎细胞因子选自IL-1β和IFNγ所组成的组,
ix.痛风和/或促炎细胞因子是IL-1β,
x.莱姆病和/或促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组,
xi.II型糖尿病和/或促炎细胞因子选自由TNFα和IL-1β所组成的组。
在第一和第二方法(即评价促炎细胞因子的抑制剂的效力和评价B细胞的抑制剂的效力)的步骤(a)中,从所述受试者获得样品。因此,本发明的方法为体外或离体(离体回输,ex-vivo)方法和/或非侵入性方法。样品优选包括从受试者获得的流体或由从受试者获得的流体组成。更优选地,流体包括以下或由以下组成或衍生自或选自以下:尿液、血液、脊髓液、唾液、精液或支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage)。优选的流体是血液,包括血液,由血液组成或衍生自血液。血液可以用作全血或在进一步使用前被稀释或纯化。稀释液可以是在培养基或缓冲液中以1∶4,1:5或1:6进行稀释。样品可以包括细胞。优选的样品包括血细胞(即B细胞和/或T细胞和/或B细胞前体和/或T细胞前体)。优选细胞包括PBMC(外周血单核细胞)。优选的样品包括流体,更优选地包括血液和甚至更优选包括PBMC。根据样品的特性(identity),可培养样品。例如,如果样品包含PBMC,可以将其在合适的培养基中培养,该培养基中补充本领域技术人员已知的合适的化合物。优选地,将PBMC按照在实验部分所解释的进行培养。
第一方法(即用于评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的步骤a)的或在步骤a)中获得的优选样品不包含促炎细胞因子或不含其按照本文后面解释的评价(即RTPCR或ELISA)的可检测的量。
第二方法(即用于评价B细胞抑制剂的效力)的步骤a)的或步骤a)中获得的优选样品不包含B细胞或不含其按照本文解释的评价(利用B细胞标记物的FACS分析)的可检测的数量。本文中已经鉴别特异性B细胞标记物(CD19或CD20)。在这样的FACS分析中使用的优选的市售抗CD20的抗体为来自Millipore的抗-CD20,克隆2H7。
第一和第二方法各使用本文中鉴别的不同类型的样品涵盖在本发明中。然而,在各方法中可以使用相同类型的样品。
在第一方法(即评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的步骤(bl)中,在步骤(a)中获得的所述样品与能够诱导在所述样品中促炎细胞因子产生的化合物接触。在本发明的上下文中,能够诱导促炎细胞因子产生的化合物可以由能增加所述细胞因子产生的化合物替换。可以使用能够诱导促炎细胞因子产生的任何已知的化合物。例如,已知LPS、MDP、LPS/MDP、Pam3cys/MDP、聚I:C、鞭毛蛋白或HK大肠杆菌(E.Coli)诱导或增加IL-1β的产生(8)。
在优选实施方式中,用于诱导促炎细胞因子产生的化合物针对给定自身免疫性和/或炎症性疾病或病症是特异性的。优选地,所述化合物能够结合存在于患病细胞上或患病受试者的细胞上的受体。现已证明,与使用不是特异性用于疾病的化合物的方法相比,使用这种化合物提高了本发明方法的灵敏度和/或特异性和/或可预测性(除了其他,参见图5,实施例7)。
对于炎症性肠病(IBD)或克罗恩氏病,这种优选的化合物是MDP(胞壁酰基二肽(Muramyldipeptide)(InvivogenUSA))。优选地使用8-12μg/ml的MDP。更优选10μg/ml。MDP是众所周知的NOD2配体并认为是疾病特异性的(见实施例3)。
对于MS,这类优选的化合物是与抗-CD3/CD28结合的髓磷脂碱性蛋白(MyelinBasicProtein)或MOG肽(参见实施例7)。优选的抗-CD3和优选的抗-CD28是来自MACS美天旎(miltenyibiotec)(德国)。抗-CD3和抗CD28各可以以至少0.8、0.9、1、1.1、1.2μg/ml的浓度使用。对于这些抗体中的每种,优选浓度为1μg/ml。MOG肽具有如下氨基酸序列:Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys。它们可以购自TocrisBiosciences,CatNo.2568)。
对于痛风,这类优选的化合物为单钠尿酸盐(MSU)晶体和脂肪酸(C16.0)(参见实施例6)。优选地,MSU/C16.0以(280μg/ml、180μMC16.0)(290μg/ml、190μMC16.0)(300μg/ml、200μMC16.0)(310μg/ml、210μMC16.0)的浓度范围来使用。C16.0可购自SigmaAldrich(USA)。MSU可以利用本领域技术人员已知的技术来制备。
对于莱姆病,这类化合物可以是或者可以包含包柔氏螺旋体(Borreliaantigen)抗原或包柔氏螺旋体全细胞(wholeBorreliacell)或其部分或其裂解物。
对于败血症,这类化合物可以是或者可以包含细菌和/或真菌抗原或细菌和/或真菌全细胞或其部分或其裂解物。
对于哮喘,这类化合物可以是甲壳素(几丁质,Chitin)和/或曲霉菌抗原。对于哮喘,这类化合物可以包括曲霉菌抗原和/或曲霉菌全细胞或其部分或其裂解物。
在第二方法(即评价B细胞抑制剂的效力)的步骤(bl)中,在步骤(a)中获得的所述样品与能够诱导在所述样品中的B细胞产生的化合物接触。在本发明的上下文中,能够诱导B细胞产生的化合物可以由能增加B细胞的数量的化合物和/或由能够增加或激活此类B细胞的活性的化合物替换。可以使用能够诱导或增加B细胞产生的任何已知的化合物。例如,已知诱导或增加B细胞产生的化合物包括IL-5、IL-6或IL-7。
在优选实施方式中,用于诱导B细胞产生的化合物是针对给定自身免疫性和/或炎症性疾病或病症特异性的。优选地,所述化合物能够结合存在于患病细胞上或患病的受试者的细胞上的受体。
第一和第二方法(即评价促炎细胞因子的抑制剂的效力和评价B细胞的抑制剂的效力)中的(b1)接触步骤可具有1、2、3、4、5、6、7、8、12、24、30、48、60、70、80、90、93、96、100、110小时,或更长的持续时间。优选地,该接触具有4-96小时,或20-50小时,或24小时,或48小时的持续时间。该接触步骤可以是在培养基如RPMI1640中的培养步骤。
在第一和第二方法(即评价促炎细胞因子的抑制剂的效力和评价B细胞的抑制剂的效力)的步骤(b2)中,在步骤(a)中获得的所述样品与所述促炎细胞因子的抑制剂(和/或与B细胞的抑制剂,用于第二方法)接触。本文中已经定义了所述促炎细胞因子抑制剂的特性(identity)。本文中已经定义了所述B细胞抑制剂的特性(identity)。如在步骤(b1)中,该接触可具有1、2、3、4、5、6、7、8、12、24、30、48、60、70、80、90、93、96、100、110小时,或更长的持续时间。优选地,该接触具有4-96小时,或20-50小时,或24小时,或48小时的持续时间。该接触步骤可以是在培养基如RPMI1640中的培养步骤。通常将步骤(a)的样品分为至少两份、三份、四份,并在这些份的每一份上执行步骤(b1)和(b2)。步骤(b1)和(b2)可以依次或同时进行,优选依次进行。当第一和第二方法依次或同时进行时,可将样品(a)分成四份:在这些份的两份中应用第一方法,剩余的两份中应用第二方法。本发明还包括,如果不同类型的样品用于第一与第二种方法,各样品都可以仅分成两份,用于执行每种方法的步骤(bl)和(b2)。
在第一方法(即评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的步骤c)中,所述促炎细胞因子的分布或表达水平在步骤(bl)和(b2)结束时在所述样品中确定。
在本发明的上下文中,表述“分布”、“表达分布”,或“表达的分布”可由“表达水平”或“产生水平”或“活性水平”替换。促炎细胞因子的分布可以因此表示其产生(编码核酸和/或蛋白质水平)水平和/或其活性水平。评价所述促炎细胞因子的分布或表达水平可直接在蛋白质表达水平(量化所述蛋白的量)和/或在活性水平(量化所述蛋白的活性)和/或间接地通过定量编码所述促炎细胞因子的核苷酸序列的量而实现。技术人员将理解,依赖于待测的受试者或物种,分离促炎细胞因子的多亚型是可能的。
在第二方法(即评价B细胞的抑制剂的效力)的步骤(c)中,在步骤(bl)和(b2)结束时在所述样品中确定所述B细胞的数量。B细胞的数量还可以指所述细胞的活性。
可在细胞水平(量化所述细胞的量)和/或在活性水平(量化所述蛋白的活性)直接评价B细胞的数量。本领域技术人员知晓用以评价B细胞的数量或活性的方法。可以利用本文较早所解释的FACS技术评价B细胞的数量。B细胞活性可以是产生促炎细胞因子(例如IL-6)或促进由其它细胞,如T辅助细胞(Th17)产生促炎细胞因子。产生促炎细胞因子如IL-6的评价已在本文中在第一方法的上下文中予以解释。因此,在第二方法的实施方式中,在步骤(bl)和(b2)结束时在所述样品中确定促炎细胞因子的分布或表达水平。以与本文中用于第一方法所描述的相同的方式评价该分布或表达水平。可如同B细胞利用FACS分析或通过细胞因子流表型分型(Cytokineflowphenotyping)评价T辅助细胞17的数量。细胞因子流表型分型允许评价所述细胞的标记物的细胞内表达。Thl7细胞的标记物的实例包括IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、CD4。用于评价这些标记物的存在的化合物的实例包括:
对于IL-17A:eBio64DEC17FITC
对于IL-17F:SHLR17PE
对于IL-21:eBio3A3-N2Alexa647
对于IL-22:22URTIPerCP-710
对于CD4:RPA-T4450
所有这些都来自e-Biosciences,USA
编码IL-1β的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1所组成。优选的相应的IL-1β氨基酸序列包括SEQIDNO:2或由SEQIDNO:2所组成。
编码IL-6的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:3或由SEQIDNO:3所组成。优选的相应的IL-6氨基酸序列包括SEQIDNO:4或由SEQIDNO:4所组成。
编码IL-17的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:5或由SEQIDNO:5所组成。优选的相应的IL-17氨基酸序列包括SEQIDNO:6或由SEQIDNO:6所组成。
编码IL-23的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:7或由SEQIDNO:7所组成。优选的相应的IL-23氨基酸序列包括SEQIDNO:8或由SEQIDNO:8所组成。
编码TNFα的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:9或由SEQIDNO:9所组成。优选的相应的TNFα氨基酸序列包括SEQIDNO:10或由SEQIDNO:10所组成。
编码IFNγ的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:11或由SEQIDNO:11所组成。优选的相应的IFNγ氨基酸序列包括SEQIDNO:12或由SEQIDNO:12所组成。
编码IL-12的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:25或由SEQIDNO:25所组成。优选的相应的IL-12氨基酸序列包括SEQIDNO:26或由SEQIDNO:26所组成。
编码IL-5的优选的核苷酸序列包括SEQIDNO:29或由SEQIDNO:29所组成。优选的相应的IL-5氨基酸序列包括SEQIDNO:30或由SEQIDNO:30所组成。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-1β或由IL-1β组成。更优选地,IL-1β:
-由包括与SEQIDNO:2至少60%、70%、80%、90%、95%、或100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:1至少60%、70%、80%、90%、95%、或100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-1β的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:1至少60%、70%、80%、90%、95%、或100%的同一性和/或
-编码IL-1β的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:2编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-6或由IL-6组成。更优选地,IL-6:
-由包括与SEQIDNO:4至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:3至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-6的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:3至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IL-6的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:4编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-17或由IL-17组成。更优选地,IL-17:
-由包括与SEQIDNO:6至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:5至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-17的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:5至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IL-17的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:6编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-23或由IL-23组成。更优选地,IL-23:
-由包括与SEQIDNO:8至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:7至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-23的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:7至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IL-23的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:8编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括TNFα或由TNFα组成。更优选地,TNFα:
-由包括与SEQIDNO:10至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:9至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码TNFα的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:9至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码TNFα的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:10编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IFNγ或由IFNγ组成。更优选地,IFNγ:
-由包括与SEQIDNO:12至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:11至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IFNγ的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:11至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IFNγ的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:12编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-12或由IL-12组成。更优选地,IL-12:
-由包括与SEQIDNO:26至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:25至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-12的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:25至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IL-12的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:26编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在优选实施方式中,促炎细胞因子包括IL-5或由IL-5组成。更优选地,IL-5:
-由包括与SEQIDNO:30至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的氨基酸序列所表示和/或
-由具有与SEQIDNO:29至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性的核苷酸序列所编码。
在另一优选的实施方式中,编码IL-12的核苷酸序列具有:
-与SEQIDNO:29至少60%、70%、80%、90%、95%、100%的同一性和/或
-编码IL-12的氨基酸序列,其具有与由SEQIDNO:30编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%,或100%的同一性。
在本文中同一性在后面进行定义。编码促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的核苷酸序列的量的定量优选利用经典分子生物学技术如(实时)PCR、阵列或RNA印迹分析(northernanalysis)来进行。在该实施方式中,编码如本文所描述的所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的核苷酸序列意指信使RNA(mRNA)。可替换地,根据另一优选的实施方式,在该方法中所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平直接通过定量所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的量来确定。可通过任何已知的技术来定量多肽量。优选地,利用与所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)特异性结合的分子来定量多肽量。优选的结合分子选自:已特异性产生(raise)用于识别所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的抗体、已知特异性地结合所述所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的任何其它分子。可以在任何技术人员已知的免疫测定如免疫印迹(westernblotting),或ELISA(酶联免疫吸附试验)或利用乳胶珠粒(latexbead)的FACS(荧光激活细胞分选术)中使用这类抗体。制备抗体对于本领域技术人员来说是已知的。优选地,如在实验数据中进行的,评价促炎细胞因子如IL-1β的存在。可以用于制备抗体的方法的简短解释在本文中后面给出。在本发明的上下文中,已知与所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)结合的任何其它分子可以是核酸,例如DNA调控区,多肽,代谢产物,底物,调控元件,结构组分,伴侣(chaperone)(转运)分子,肽模拟物,非肽模拟物,或任何其它类型的配体。肽模拟物在本文后面定义。已知与所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)结合的分子的实例,包括所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的受体如IL-1β受体、IL-6受体、IL-17受体、IL-23受体、TNFα受体和/或IFN-γ受体,针对所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的抗体。所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)与第二结合分子的结合可通过本领域技术人员已知的任何标准方法来检测。合适的方法包括亲和层析共电泳(ACE)分析和ELISA。技术人员将会理解,替代地或结合定量编码所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)和/或相应多肽的核酸序列,利用特异性试验定量相应多肽的底物、或已知与相应多肽的功能或活性相关联的任何化合物、或定量相应多肽的功能或活性包括在本发明的方法的范围内。例如,可以确定和量化通过所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)或能够结合所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的分子对目的基因的反式激活(trans-activation),例如,在瞬时转染测定中,靶基因的启动子与报告基因,例如,P-半乳糖苷酶或荧光素酶连接。这样的评估可以在体外或体内或离体地完成。
用于检测编码促炎细胞因子的核苷酸序列的优选的引物在下面给出。
用于IL-1βPCR的优选的引物被鉴别为
正向引物CAGCTACGAATCTCCGACCAC(SEQIDNO:13);以及
反向引物GGCAGGGAACCAGCATCTTC(SEQIDNO:14)。
用于IL-6PCR的优选的引物被鉴别为
正向引物AATTCGGTACATCCTCGACGG(SEQIDNO:15);以及
反向引物GGTTGTTTTCTGCCAGTGCCT(SEQIDNO:16)。
用于IL-17PCR的优选的引物被鉴别为
正向引物TCCCACGAAATCCAGGATGC(SEQIDNO:17);以及
反向引物GGATGTTCAGGTTGACCATCAC(SEQIDNO:18)。
用于IL-23PCR的优选的引物被鉴别为
正向引物CTCAGGGACAACAGTCAGTTC(SEQIDNO:19);以及
反向引物ACAGGGCTATCAGGGAGCA-(SEQIDNO:20)。
用于TNFαPCR的优选的引物被鉴别为
正向引物TGGCCCAGGCAGTCAGA(SEQIDNO:21);以及
反向引物GGTTTGCTACAACATGGGCTACA(SEQIDNO:22)。
用于IFNγPCR的优选的引物被鉴别为
正向引物TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA(SEQIDNO:23);以及
反向引物TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT(SEQIDNO:24)。
用于IL-12PCR的优选的引物被鉴别为
正向引物CCTTGCACTTCTGAAGAGATTGA(SEQIDNO:27);以及
反向引物ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT(SEQIDNO:28)。
用于IL-5PCR的优选的引物被鉴别为
正向引物CCTTGCACTTCTGAAGAGATTGA(SEQIDNO:31);以及
反向引物ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT(SEQIDNO:32)。
可选地,在本发明的第一方法中,可以将在步骤(c)中确定的促炎细胞因子的分布或表达水平与用于所述表达水平或分布的参考值比较,参考值优选为在对照样品中的所述表达水平或分布的平均值。
在本发明的上下文中,用于所述促炎细胞因子的分布或表达水平的“参考值”优选为对照样品中的所述表达水平或分布的平均值。
同样适用于第二方法,其中B细胞的数量与用于参考的,优选对照样品的B细胞数量进行比较。在本发明的上下文中,用于B细胞的数量的“参考值”优选为对照样品中的B细胞的平均数量。
两种类型的优选对照样品在本文中后面定义:一种用于步骤(bl),一种用于步骤(b2)。
在第一方法(即用于评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的优选实施方式中,在接触步骤(b1)和/或(b2)结束时,将上清液通过离心分离并由本领域技术人员利用已知方法确定所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-12、IL-23、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的蛋白。离心可以在1200rpm,在4℃。可替换地,可以在步骤(bl)和/或(b2)结束时将去污剂(detergent)加入到样品中。可以使用几种去污剂,例如TritonX0.1%。加入去污剂是有吸引力的,因为可以预期的是不会需要离心步骤。可以确定所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-12、IL-23、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)在包括所述去污剂的样品(也称为细胞裂解物)中的表达水平。
在第二方法(即用于评价B细胞抑制剂的效力)的优选实施方式中,在接触步骤(b1)和/或(b2)结束时,通过利用本文中较早定义的特异性B细胞标记物分离B细胞。
在第一或者第二方法的步骤(d)中,评价所述抑制剂的效力。
在第一方法中,当在步骤(b1)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平或表达水平的增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平减少时,所述促炎细胞因子抑制剂的效力优选地称为是足够的。
在第二方法中,当在步骤(b1)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量或数量的增加时,和当在步骤(b2)结束时,检测到所述B细胞的可检测的数量减少时,所述B细胞的所述抑制剂的效力优选地称为是足够的。
在第一方法(即用于评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的步骤(b1)后的步骤(d)中,利用较早定义的方法并与对照中的所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)和/或相应核苷酸序列的表达分布(或相应编码的促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的稳态水平)相比较,评价所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)和/或其相应的核苷酸序列的可检测的表达水平或分布或表达水平的增加(或所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的稳态水平),或其任何可检测的活性或其生物活性的可检测变化。优选的对照是来自同一受试者的相似样品,所述对照样品不与能够诱导促炎细胞因子产生的化合物接触。通常在所述对照中,促炎细胞因子的表达水平是较低的或不可检测的。根据优选的实施方式,利用用于编码所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的基因/核苷酸序列的特异性mRNA分析,量化所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的检测或增加或活性改变。
优选地,编码所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的核苷酸序列的表达水平的增加意为利用PCR所述核苷酸序列的表达水平增加至少5%。
更优选地,核苷酸序列的表达水平的增加意为至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多的增加。
促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的低的或不可检测的分布或表达水平优选是指利用PCR,编码所述T淋巴细胞生长因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的核苷酸序列的表达水平是不可检测的,或Ct值为35或更高。
优选地,所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平增加意为所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平增加至少5%,其是利用免疫印迹和/或利用ELISA或合适的分析。更优选地,所述多肽的表达水平的增加是指增加了至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。
优选地,所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的活性的增加意为利用适合的分析多肽活性增加至少5%。更优选地,多肽活性的增加意为增加至少10%,更优选地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。
在第一方法(即用于评价促炎细胞因子抑制剂的效力)的步骤(b2)后的步骤(d)中,利用较早定义的方法并与对照中的所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)和/或相应核苷酸序列的表达分布或水平(或相应编码的促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的稳态水平)相比较,评价所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)和/或其相应的核苷酸序列的表达水平可检测的减少(或所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的稳态水平),或任何其可检测的活性或其生物活性的可检测变化。优选的对照是来自同一受试者的相似样品,所述对照样品不与所述促炎细胞因子抑制剂接触。根据优选的实施方式,利用用于编码所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的基因/核苷酸序列的特异性mRNA分析,量化所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平的减少或活性改变。
优选地,编码所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的核苷酸序列的表达水平的减少意为利用PCR所述核苷酸序列的表达水平减少至少5%。
更优选地,核苷酸序列的表达水平的减少意为减少至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。
优选地,所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平减少意为所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的表达水平减少至少5%,其实利用免疫印迹和/或利用ELISA或合适的分析。更优选地,所述多肽的表达水平的减少是指减少了至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。
优选地,所述促炎细胞因子(优选IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、IL-5、TNFα和/或IFN-γ)的活性的减少意为利用适合的分析多肽活性减少至少5%。更优选地,多肽活性的减少意为减少至少10%,更优选地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。
在优选的方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平增加,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平减少时,促炎细胞因子抑制剂的效力称为是足够的。在更优选的方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平已增加至少20%、30%、40%、50%,而在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平已减小至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%时,促炎细胞因子抑制剂的效力是所谓足够的。这种增加和减少优选使用本文中较早描述的ELISA来评价。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少30%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少30%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少40%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少40%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少50%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少50%。
在第二方法(即用于评价B细胞抑制剂的效力)的步骤(b1)后的步骤(d)中,利用较早定义的方法并与对照中的B细胞相比较,评价已检测到的所述B细胞的可检测的数量或数量的增加(或任何其可检测的活性或其生物活性的可检测变化)。优选的对照是来自同一受试者的相似样品,所述对照样品不与能够诱导B细胞产生的化合物接触。通常在所述对照中,B细胞的数量是较低的或不可检测的。根据优选的实施方式,利用本文中较早解释的FACS或PCR检测B细胞。替换地B细胞活性的增加或改变可以是促炎细胞因子如IL-6或IL-10的产生或可以是促进由其它细胞,如T辅助细胞(Th17)产生促炎细胞因子。已知Th17能够产生作为促炎细胞因子的IL-17。
优选地,B细胞的数量的增加意为B细胞数量至少5%的增加,更优选地利用FACS或PCR。
更优选地,B细胞的数量的增加意为至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多的增加。
B细胞的低的或不可检测的数量优选地是指利用PCR,没有检测到B细胞,或Ct值为35或更高。
优选地,B细胞的活性增加意为利用合适的分析活性增加至少5%。更优选地,所述活性的增加是指增加了至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。在该上下文中更优选的活性是产生IL-6、IL-10或经T辅助17细胞产生IL-17。
替换地,B细胞的活性的增加意为Th17细胞的数量至少5%的增加,更优选地利用FACS或PCR。
更优选地,Th17细胞的数量增加意为增加至少10%,更优选地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。
在第二方法(即用于评价B细胞抑制剂的效力)的步骤(b2)后的步骤(d)中,利用较早定义的方法并与对照中的B细胞的数量和/相应活性相比较,评价已检测到的所述B细胞的可检测的数量减少或任何其可检测的活性或其生物活性的可检测变化。优选的对照是来自同一受试者的相似样品,所述对照样品不与所述B细胞的抑制剂接触。根据优选的实施方式,按照本文中较早鉴别的量化B细胞数量的减少或所述B细胞活性的改变。
优选地,B细胞的数量的减少意为利用FACS所述核苷酸序列的表达水平的至少5%的减少。
更优选地,B细胞的数量的减少意为减少至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。
优选地,所述B细胞的活性减少意为利用合适的分析所述活性减少至少5%。更优选地,所述活性的减少是指减少了至少10%,更优选至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%,或更多。
在该上下文中更优选的活性是产生IL-6、IL-10或经T辅助17细胞产生IL-17。
替换地,B细胞的活性的减少意为Th17细胞的数量至少5%的减少,更优选地利用FACS或PCR。
更优选地,Th17细胞的数量减少意为减少至少10%,更优选地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。
在优选的第二方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的B细胞的数量增加,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的B细胞的数量减少时,B细胞抑制剂的效力是所谓足够的。
在更优选的第二方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的B细胞的数量已增加至少20%、30%、40%、50%,而在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的B细胞的数量已减小至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%时,B细胞抑制剂的效力是所谓足够的。这种增加和减少优选使用本文中较早描述的FACS或PCR来评价。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少30%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少30%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少40%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少40%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少50%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少50%。
在另一优选的第二方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的B细胞的活性增加,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的B细胞的活性减少时,B细胞抑制剂的效力是所谓足够的。
在更优选的第二方法中,当在步骤(b1)后的步骤(d)中评价的B细胞的活性已增加至少20%、30%、40%、50%,而在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的B细胞的活性已减小至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%时,B细胞抑制剂的效力称为是足够的。这种增加和减少优选使用本文中较早描述的FACS或PCR或ELISA来评价。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少30%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少30%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少40%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少40%。
甚至更优选地,在步骤(bl)后的步骤(d)中评价的增加为至少50%,以及在步骤(b2)后的步骤(d)中评价的减少为至少50%。
用以在怀疑患有炎症性和/或自身免疫性病症或疾病的受试者中评价促炎细胞因子抑制剂的效力和/或评价B细胞抑制剂的效力的这种方法可适用于所有基于当前使用的生物疗法的治疗。该方法对于不太可能成功的限制性治疗(sparedtreatment)和有潜在重要副作用的患者而言,以及由于这种个性化方法的显著成本节省方面而对于卫生保健系统而言,都可能是非常有意义的。
用于治疗的方法
在进一步的方面,本发明涉及用于治疗怀疑患有自身免疫和/或炎症性病症和/或疾病的受试者的方法,包括以下步骤:按照本文中较早定义在受试者中评价促炎细胞因子的抑制剂的效力和/或评价B细胞的抑制剂的效力,然后如果所述抑制剂的效力是令人满意的,用所述抑制剂治疗所述受试者。
评价促炎细胞因子抑制剂的效力和/或评价B细胞抑制剂的效力的方法已经在致力于本发明第一方面的部分中广泛地解释。
治疗自身免疫性和/或炎症性疾病或病症可以是长期给予本文较早提到的促炎细胞因子抑制剂中的一种和/或B细胞抑制剂中的一种。
这样的治疗旨在治愈或长期(chronically)抑制或减轻所述受试者在至少一周、一个月、六个月治疗后的症状或参数。这类参数可以是本文中较早定义的促炎细胞因子的表达水平或分布和/或B细胞的数量。这种表达水平或分布可以标准化,趋向于比在治疗开始时在所述受试者中测得的值更低的值。在本上下文中,“低于…”可以表示低于…5%,低于…10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更多。
序列同一性
在本文中“序列同一性”定义为通过比较序列确定的两种或更多种氨基酸(多肽或蛋白)序列之间或两种或更多种核酸(多核苷酸)序列之间的关系。两氨基酸或两核酸序列之间的同一性优选通过评价其在本文中所定义的完整SEQIDNO或其部分内的同一性来定义。其部分可以意为至少50%的SEQIDNO长度,或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%。
在本领域中,“同一性”也是指氨基酸序列或者核酸序列之间的序列关联程度,根据具体情况,其由这类序列的字符串之间的匹配所确定。两氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一种多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸替换与第二多肽的序列进行比较来确定的。可以容易地通过已知的方法计算“同一性”和“相似性”,包括但不限于那些在(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeine,G.,AcademicPress,1987;和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991;以及Carillo,H.,andLipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988))中所描述的。
设计确定同一性的优选的方法以给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法编码在公众可获得的计算机程序中。用来确定两序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.,etal.,NucleicAcidsResearch12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul,S.F.etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从NCBI及其他来源(BLASTManual,Altschul,S.,etal.,NCBINLMNIHBethesda,MD20894;Altschul,S.,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))获得。众所周知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。
用于多肽序列比较的优选参数包括以下:算法:NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970);比较矩阵:BLOSSUM62,来自HentikoffandHentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992);空位罚分(GapPenalty):12;和空位长度罚分:4。这些参数可用的程序公开可用,作为来自GeneticsComputerGroup的“Ogap”程序,位于麦迪逊,WI。上述参数为用于氨基酸比较的默认参数(连同对于末端空位(endgap)没有罚分)。
用于核酸比较的优选参数包括以下:算法:NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970);比较矩阵:匹配=+10,不匹配=0;空位罚分:50;空位长度罚分:3。可用,作为Gap程序,来自GeneticsComputerGroup,位于麦迪逊,威斯康辛州。上面所给出的是用于核酸比较的默认参数。
可选地,在确定氨基酸相似度中,本领域技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换,其对于本领域技术人员将是清楚的。保守氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如,具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸;具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸;具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺(asparagine)和谷氨酰胺(glutamine);具有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸,以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文中公开的氨基酸序列的替换变体是其中在所公开的序列中移去至少一个残基并在其位置上插入不同的残基的那些。优选地,氨基酸变化是保守的。对于天然存在氨基酸中的每一个优选的保守替换如下:Ala对Ser;Arg对Lys;Asn对Gln或His;Asp对Glu;Cys对Ser或Ala;Gln对Asn;Glu对Asp;Gly对Pro;His对Asn或Gln;Ile对Leu或Val;Leu对Ile或Val;Lys对Arg,Gln或Glu;Met对Leu或Ile;Phe对Met、Leu或Tyr;Ser对Thr;Thr对Ser;Trp对Tyr;Tyr对Trp或Phe;以及Val对Ile或Leu。
抗体
本发明的一些方面涉及使用与促炎细胞因子特异性地结合的抗体或抗体片段。在例如Harlow和Lane(1988,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)、WO91/19818;WO91/18989;WO92/01047;WO92/06204;WO92/18619;和US6,420,113以及其中引用的参考文献中描述了用于产生与这样的多肽特异性地结合的抗体或抗体片段的方法。如本文所用的术语“特异性地结合”包括低和高亲和力的特异性结合。可以例如,通过具有至少约10-4M的Kd的低亲和力抗体或抗体片段显示出特异性结合。也能够通过高亲和力的抗体或抗体片段显示出特异性结合,例如,具有至少约10-7M、至少约10-8M,至少约10-9M,至少约10-10M,或可具有至少约10-11M或10-12M或更大的Kd的抗体或抗体片段。
肽模拟物
肽样分子(称为肽模拟物)或非肽分子,其与本文所定义的促炎细胞因子或其受体多肽特异性地结合,并且其可应用于本文中定义的本发明的方法(用于评价促炎细胞因子的表达水平)并利用本领域本身已知的方法可以被识别,如,例如在通过引用并入本文的US6,180,084中详细描述的。这样的方法包括如筛选肽模拟物文库、肽文库、DNA或cDNA表达文库、组合化学(combinatorialchemistry)和,特别有用的,噬菌体展示文库。通过将文库与基本上纯化的促炎细胞因子、其片段或其结构类似物接触,可筛选这些文库用于促炎细胞因子的这类肽模拟物。
一般
在本文中和在其权利要求书中,动词“包含(包括)”和其变型以其非限制性含义使用,意为包括该词之后的项,但没有特别提及的项也不排除在外。此外动词“由…组成”可以由“基本上由...组成”替换,是指本文中定义的方法相比于具体识别的步骤可以包含一个或多个其它步骤,所述一个或多个其他步骤不改变本发明的独特特性。此外,通过不定冠词“一种”或“一个”提到元素时并不排除这样的可能性,即存在多于一种的元素,除非上下文清楚地要求有且仅有一种元素。不定冠词“一个”或“一种”通常是指“至少一种”。
本说明书中引用的所有专利和参考文献在此通过参考全文引入。下面的实施例是仅出于阐述目的而提供,并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1.半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)对IL-1β产生的影响。将人PBMC暴露于几种PRR激动剂24h以刺激IL-1β产生。除了PRR配体,用PRR配体在半胱天冬酶-1抑制剂存在下刺激PBMC(左上图)。将50位受试者的PBMC包括在这些实验中。在独立图(panel)中,显示有或没有半胱天冬酶-1抑制剂的不同PPR激动剂。由Elisa测定IL-1β。
图2.依赖于ATG16L1基因型的半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)的效果。将50位受试者针对ATG16L1基因型进行基因分型,此后每种基因型表达IL-1β产生。显示了三种不同PRR配体,MDP、LPS以及MDP和LPS的组合。通过Elisa测定IL-1β。左图;显示了每位受试者的IL-1β产生。右图;显示箱形图(Box-plot)。
图3.依赖于LPS-和MDP-诱导的IL-1β产生的半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)的效果。在用LPS或MDP刺激后,将受试者分级为高(>2000pg.ml)、中(1000-2000pg/ml)和低(<1000pg.ml)IL-1β产生者。与载体对照相比,半胱天冬酶-1抑制的作用以抑制百分比在每组受试者中显示。
图4.健康个体中的TNFα产生。将来自104位个体的PMBC根据标准方法进行分离。通过24h暴露于10ng/ml大肠杆菌LPS或106HK假丝酵母菌(Candida)/ml来测定TNFα产生能力。然后,使用ELISA测定TNFα。
图5.LPS-诱导的和假丝酵母菌-诱导的TNFα产生的关联性。用大肠杆菌LPS或HK白色念珠菌(Candidaalbicans)刺激来自104位受试者的PMBC。通过24h暴露于10ng/ml大肠杆菌LPS或106HK白色念珠菌/ml来测定TNFα产生能力。然后,使用ELISA测定TNFα。该图示出了,不是所有受试者都显示为对于LPS和假丝酵母二者均为高TNFα产生者。
图6.克罗恩氏患者的分级。从23位IBD患者中分离PMBC,并用大肠杆菌LPS(10ng/ml)或Pam3cys/MDP(10ug/ml和10ug/ml)刺激24小时。然后用ELISA测定TNFα。MDP(胞壁酰基-二-肽(Muramyl-Di-Peptide))被认为是疾病特异性刺激,因为这将被细胞内NOD2受体识别。
图7.将来自2位RA患者的PMBC用IgG对照(Ivlg)或3种不同TNFα抑制剂刺激30分钟。然后加入106HK假丝酵母/ml。24h后,用ELISA测定IL-1β产生。在4μg/ml的剂量中测试抗TNFα,其为将出现在抗TNFα治疗后的RA患者中的剂量。注意所有3种TNFα阻断剂(blockers)均降低IL-1β产生。已知TNFα利于通过假丝酵母菌暴露诱发的PMBC的IL-1β产生。
图8.将188位痛风患者的PBMC用媒介物(介质,Medium)(RPMI1640)Pam3Cys,或MSU/C16.0刺激24h。之后,利用ELISA测定IL-1β。这里看出,MSU/C16.0(痛风特异性的)是IL-1β的有力的诱导剂。
图9.MS患者的分级。将从4位MS患者和4位年龄和性别匹配的健康对照分离的PBMC用RPMI、白色念珠菌(1.106/ml)、MOG肽(10μg/ml)、抗-CD3/CD28(1μg/ml:0.1μg/ml)以及MOG/抗-CD3/28(10μg/ml和1μg/ml:0.1μg/ml)的组合刺激7天。图9A表明MS患者的IL-17A产生在暴露于MOG/抗-CD3/28后,在与健康对照相比时,强烈上调。图9B显示在MS患者中MPBC的IL-22产生在暴露于白色念珠菌和MOG/抗-CD3/28后,当与对照相比时,是升高的。有趣的是,在MOG/抗-CD3/28刺激后IL-22产生是强烈上调的。在MS患者和健康对照之间的IFN-γ产生中没有观察到明显差异,尽管白色念珠菌诱导的IFN-g略高(图9C)。
表1.炎症性疾病基于细胞因子/B细胞参与的分级
表2:促炎细胞因子或B细胞的已知抑制剂
实施例
实施例1
材料和方法
分离人外周血单核细胞和体外细胞因子产生。从健康志愿者或患有CGD的患者的肘静脉(cubitalvein)中提取静脉血到10ml的EDTA管中(Monoject,Covidien,曼斯菲尔德,马萨诸塞州,USA)。通过将在无致热原生理盐水中1:1稀释的血液经菲科帕克(Ficoll-Paque)(PharmaciaBiotech,匹兹堡市,宾夕法尼亚州,USA)密度离心来获得单核细胞部分。将细胞在生理盐水中洗涤两次并悬浮在补充有庆大霉素10mg/ml、L-谷氨酰胺10mM和丙酮酸盐(pyruvate)10mM的培养基(RPMI,Invitrogen,卡尔斯巴德市,加利福尼亚,USA)中。在Coulter计数器(CoulterElectronics,布雷亚市,加利福尼亚,USA)中计数细胞,并将其数量调整到5x106细胞/ml。
将100μl体积的总共5x105的单核细胞加入到圆底96孔板(Greiner,门罗市,北卡罗来纳州,美国)中,并用100μl培养基(阴性对照),或LPS(10ng/ml,Sigma,MO,USA)、Pam3Cys(10μg/ml,EMCMicrocollections,图宾根,德国)、鞭毛蛋白(TLR5配体)、MDP(10μg/ml,Sigma,MO,USA)培养。24小时后,收集上清液并贮存在-20℃直至检测。将来自50位的健康供体组的PBMC用明确定义的模式识别受体(patternrecognitionreceptor,PRR)配体组刺激。供体血获自Sanquin血库(SanquinBloodbank),奈梅亨市,荷兰。培养24小时后,利用市售ELISA试剂盒(R&DSystems,MN,USA)测定IL-1β。
用于ATG16L1Thr300Ala多态性的基因分型。从全血中通过使用分离试剂盒Puregene(GentraSytems,MN,USA)根据生产商的方法分离DNA。针对ATG16L1Thr300Ala多态性存在的基因分型是通过在7300ABI实时聚合酶链式反应系统(AppliedBiosystems,CA,USA)上应用TaqMan单核苷酸多态性(SNP)分析C_9095577_20来进行的。
结果
原代人细胞的离体研究。在受试者中比较了半胱天冬酶-1抑制剂降低IL-1β产生的能力。将来自50位的健康供体组的PBMC用明确定义的模式识别受体配体组刺激,该配体组与肠内炎症相关(例如LPS-TLR4配体、Pam3Cys-TLR2配体、鞭毛蛋白-TLR5配体、MDP-NOD2配体,和这些配体的若干组合)。图1A显示LPS、Pam3cys和MDP是IL-1β经由人PMBC产生的强诱导剂。发现鞭毛蛋白(TLR5配体)是IL-1β产生的弱诱导剂。当LPS或Pam3cys与MDP组合时,观察到IL-1β产生的强烈上调(图1A)。热灭活的大肠杆菌显示是IL-1β的潜在诱导剂,可能是由于存在于整个微生物上的多个TLR/NLR配体。
半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)表现出对经由大批刺激的IL-1β刺激显著的抑制作用,这些刺激包括纯化的TLR配体、肽聚糖的胞壁酰二肽组分(NOD2激动剂),以及整个革兰氏阴性肠细菌如大肠杆菌(图1)。虽然MDP为IL-1β的弱诱导剂,但半胱天冬酶-1抑制仍然显著地(p<0.03)减少IL-1β产生。但有趣的是,当IL-1β产生被LPS、LPS/MDP、Pam3cys/MDP或HK大肠杆菌强烈升高时,通过半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)的抑制IL-1β产生则更加明显(图1)。
依赖于ATG16L1基因型的半胱天冬酶-1抑制剂的效果。由于事实上增强的IL-1β产生与非功能性的自噬机制关联,进行了下一组分析,包括评价半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)的效果是否依赖于ATG16L1基因型。用几种配体刺激后,对于ATG16L1基因型,IL-1β产生没有差异(图2)。半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)在所有亚组的个体中同样有效,这不依赖于其在自噬基因ATG16L1中的基因型(图2)。
依赖于IL-1β产生能力的半胱天冬酶-1抑制剂的效果。在下一组实验中,我们评价了以下构思:半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)的效果可能依赖于个体产生高、中,或低的IL-1β的量的能力。如图3所示,虽然半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)抑制大于80%的由LPS诱导的IL-1β产生,但抑制由克罗恩氏病特异性的刺激物MDP诱导的IL-1β强烈地依赖于初始产生:在高产生者中85%抑制,在低产生中70%抑制,而在低产生中仅34%抑制。
讨论
半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)是IL-1β产生的强抑制剂,有希望在未来用于治疗IL-1β-依赖性疾病如克罗恩氏病。该特别的半胱天冬酶-1抑制剂用于体外抑制人原代细胞中的IL-1β是非常有效的。
为了识别最可能受益于用半胱天冬酶-1抑制剂治疗的患者,我们研究了其在具有各种T300AATG16L1基因型的个体中抑制IL-1β的能力(4)。用于本研究的半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)能够非常有效地抑制IL-1β,不依赖于T300AATG16L1多态性。多种基因型之间在IL-1β释放中的差异,如先前报告的(4),并未在本研究中重复。该原因尚不清楚,虽然用于这些研究的不同MDP批次可能是其中的一个原因。MDP混有小量的LPS以模拟可能的市售产品污染的其它实验也不能提供基因型之间的不同IL-1β产生差异(未示出)。
用于个性化药物(personalisedmedicine)的第二方法是为了评价半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)是否在在响应用LPS,或用为与克罗恩氏病尤其相关的刺激物NOD2激动剂MDP的非特异性刺激中展现高、中,或低的产生IL-1β的能力的个体中是同等有效的。有趣的是,虽然半胱天冬酶-1抑制剂(VRT)强烈抑制由有力的非特异性刺激物LPS诱导的IL-1β产生,而由克罗恩氏病特异性的刺激物MDP诱导的IL-1β抑制强烈地依赖于初始产生:在高产生者中由半胱天冬酶-1抑制剂诱导的85%抑制,在低产生中70%抑制,而在低产生中仅34%抑制。这强有力地表明半胱天冬酶-1抑制剂在用MDP刺激后释放高量的IL-1β的高-和中-应答个体可能是最有效的。用半胱天冬酶-1抑制剂的个性化(个人化)治疗方案,基于个体患者的IL-1β产生状态,似乎因此有希望未来用于克罗恩氏病的治疗。
以将患有(自身)炎症性疾病的患者组群分级为高和低细胞因子产生者的这种方法可适用于所有基于当前使用的生物疗法的治疗。患者分级对于不太可能成功的限制性治疗和有潜在重要的副作用的患者而言,以及由于这样的个性化方法显著的成本节省方面对于卫生保健系统而言都可能是非常有意义的。
实施例2
材料和方法
健康个体的分级。按照在实施例1中描述的分离104位个体的PBMC。将100μl体积的总共5x105的单核细胞加入到圆底96孔板(Greiner,门罗市,北卡罗来纳州,美国)中,并用100μl培养基(阴性对照),或LPS(10ng/ml,Sigma,MO,USA)、或HK白色念珠菌(106/ml)培养。24小时后,收集上清液并贮存在-20℃直至检测。培养24小时后,利用市售ELISA试剂盒(R&DSystems,MN,USA)测定TNFα。
结果
评价每个个体的TNFα产生。基于产生TNFα的内在能力,将健康个体分类为低、中和高TNFα的产生者(见图4)。在将PBMC暴露于LPS后,将37数目的个体分类为TNFα产生者,40位作为中产生者以及27位作为高产生者(图4a)。每种类别的平均TNFα产生分别为363ng/ml、1120pg/ml和1838pg/ml。图4b示出在暴露于热灭活的(HK)白色念珠菌24小时后的人PBMC的TNFα产生。如用于LPS刺激那样,将个体分类成相似的组。每种类别的平均TNFα产生分别为10.182ng/ml、19.761pg/ml和29.524pg/ml。
为了检查受试者是否总是独立于刺激物产生高浓度的TNFα,将LPS诱导和白色念珠菌诱导的TNFα产生进行了关联。图5表明,R为0.5111,指示并不是所有的受试者在暴露于LPS或HK白色念珠菌后都产生高TNFα。
讨论
利用大数目的个体,其显示可以将每位受试者基于TNFα产生分级成低、中、以及高产生者。有趣的,可以看到在暴露于白色念珠菌或LPS后个体不是总产生高TNFα。
实施例3
材料和方法
克罗恩氏病患者的分级。筛查24位患有克罗恩氏病的患者其细胞因子分布(TNFα)。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将PBMC暴露于疾病相关的刺激物LPS(10ng/ml)、Pam3Cys(10μg/ml)、胞壁酰二肽(MDP)(10μg/ml)和Pam3Cys/MDP。MDP是熟知的NOD2配体并被认为是疾病特异性的。
结果
基于在LPS暴露□□后产生TNFα的能力,将IBD患者分类为低(低于250pg/ml),中(在>250和<500pg/ml之间)和高(>500pg/ml)的TNFα产生者。图6a表明暴露于LPS后的PBMC的TNFα产生。依赖于TNFα的浓度,将IBD患者分类为低、中、高的TNFα产生者。图6b表明暴露于Pam3Cys/MDP之后的PBMC的TNFα产生。与LPS类似的,IBD患者可以分为3组。低(低于250pg/ml)、中(在>250和<500pg/ml之间)和高(>500pg/ml)。
讨论
利用大数目的个体IBD患者,其揭示每位受试者产生不同溶度的TNFα并由此可以分级成低、中、高产生者。假定LPS只激活TLR4,而假设MDP/Pam3Cys激活TLR2和NOD2通路两者。TLR2和NOD2通路表现出较强的协同作用。这两种途径都与疾病相关联。
有趣的是,疾病有关的触发因子(trigger)Pam3cys/MDP可以用于分级IBD患者。如针对RA患者所看到的,在暴露于LPS后个体的TNFα产生不与Pam3cys刺激后的TNFα产生高度相关。
实施例4
材料和方法
分级RA患者。在开始生物治疗之前,筛查RA患者基础细胞因子分布(basiccytokineprofile)。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将PBMC用一系列刺激物刺激,包括LPS、Pam3Cys、和白色念珠菌。此外,我们添加了几种生物制剂(4μg/ml的修美乐、依那西普或高利单抗,所有都来自Sanquin,荷兰,IgIV(Nanogam))到培养系统中以探讨特定生物制剂对离体细胞因子产生的影响。将来自RA患者的PBMC用IgG对照(IvIg)或如上所定义的3种不同TNFα抑制剂温育30分钟。此后加入106HK假丝酵母/ml。24h后,利用ELISA测定IL-1β。在4μg/ml的剂量中测试抗TNFα,其为将出现在抗TNFα治疗后的RA患者中的剂量。
结果
如图7所示,可以基于其IL-1β的产生分级来自RA患者的PBMC。注意到所有3种TNFα阻断剂均减少IL-1β产生。已知TNFα有助于由白色念珠菌暴露引发的经由PBMC的IL-1β产生。
讨论
基于TNFα的产生,TNFα有助于在用HK白色念珠菌刺激后通过免疫细胞产生IL-1β。通过利用中和TNFα策略,可以调节体外产生TNFα的生物活性。有趣的是,第一个结果表明测试的抗TNF形式(modality)的中和能力有差异。
实施例5
材料和方法
分级MS患者。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将来自MS患者和年龄/性别对照的PBMC暴露于白色念珠菌(1.106/ml)、抗-CD3/CD28(1μg/ml:0.1μg/ml)、MOG(MS相关的肽,10μg/ml),以及MOG/抗-CD3/CD28的组合7天。7天后测定细胞因子。利用酶联免疫吸附法测定IL-17A、IL-22和IFN-γ。
结果
图9表明从MS患者分离的PBMC在用白色念珠菌刺激后与对照相比产生更多的IL-17A。当PBMC在单独暴露于MOG肽或抗-CD3/CD28后,观察到IL-17A增强。然而,在暴露于抗-CD3/CD28和MOG肽后,MS患者产生强烈地增强的IL-17A浓度。与IL-17A一致,显示当暴露于抗-CD3/CD28/MOG肽时IL-22(Th17相关的细胞因子)的浓度在来自MS患者的PBMC中是提高的。有趣的是,当暴露于MOG肽、抗-CD3/CD28或这两种刺激物的组合时,来自MS患者和健康个体的PBMC之间的IFN-γ产生是类似的。
讨论
结果表明,MS患者的PBMC清楚地不同地响应疾病特异性刺激物(MOG肽和抗-CD3/CD28/MOG肽)。经由PBMC的IL-17和IL-22产生可以用于MS患者的分级,与IFN-γ相反。
实施例6
材料和方法
分级痛风患者。分析188位痛风患者其内在细胞因子产生能力。由于痛风是一种IL-1疾病,我们测定了PBMC在暴露于疾病特异性刺激物(单钠尿酸盐(MSU)晶体和脂肪酸(C16.0))后的IL-1β产生。MSU是根据本领域技术人员已知的技术在我们的实验室制备。C16.0购自SigmaAldrich(USA)。将PBMC暴露于MSU/C16.0(300μg/ml,200μMC16.0)或Pam3cys(10μg/ml)24h。此后由ELISA测定IL-1β。
结果
如图9所示,基于其在暴露于MSU/C16.0后的IL-1β产生可以分级来自痛风患者的PBMC。其显示,MSU和C16.0(棕榈酸)的组合对于产生IL-1β是重要的(10)。MSU单独不刺激IL-1β的释放,C16.0也不能。非常有趣的,对于经由人PBMC的TNFα的产生没有发现MSU/C16.0的协同作用。将共有188位痛风患者的组分级成低(<350pg/ml),中(>350<2000pg/ml)和高(>2000pg/ml)IL-1β产生者。当在PBMC的Pam3cys暴露后的IL-1β产生用于分类痛风患者时,其揭示了Pam3cys诱导的IL-1β产生与MSU/C16.0产生不相关。该后者表明MSU/C16.0可以用作用于痛风患者分级的疾病特异性刺激物。
讨论
结果表明,痛风患者的PBMC清楚地不同地响应疾病特异性刺激物(MSU/C16.0)。如前所示的,参与痛风的经典细胞因子IL-1β的浓度在痛风患者中是增强的(9)。经由PBMC的IL-1β产生可以用于痛风患者的分级。
实施例7
图5是由图4A和4B的数据作成。用大肠杆菌LPS或HK白色念珠菌(Candidaalbicans)刺激来自104位受试者的PMBC。通过暴露于10ng/ml大肠杆菌LPS或106HK白色念珠菌/ml24h来测定TNFα产生能力。然后,使用ELISA测定TNFα。该图显示不是所有受试者都显示为对于LPS和假丝酵母二者的高TNFα产生者。
由Graphpad软件计算相关性并在图中示出。从图5中,可以看到相比于假丝酵母,细胞因子响应不同于LPS。这意味着,TLR4和Dectin-l/MR-1的通路在每个个体中是不同的。
参考文献
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9.EMylonaEE,MouktaroudiM,CrisanTO,MakriS,PistikiA,GeorgitsiM,SavvaA,NeteaMG,vanderMeerJW,Giamarellos-BourboulisEJ,JoostenLA.Enhancedinterleukin-1βproductionofPBMCsfrompatientswithgoutafterstimulationwithToll-likereceptor-2ligandsanduratecrystals.ArthritisResTher.2012;14(4):R158.
10.JoostenLA,NeteaMG,MylonaE,KoendersMI,MalireddiRK,OostingM,StienstraR,vandeVeerdonkFL,StalenhoefAF,Giamarellos-BourboulisEJ,KannegantiTD,vanderMeerJW.EngagementoffattyacidswithToll-likereceptor2drivesinterleukin-1βproductionviatheASC/caspase1pathwayinmonosodiumuratemonohydratecrystal-inducedgoutyarthritis.ArthritisRheum.2010Nov;62(11):3237-48.
Claims (10)
1.一种用于在怀疑患有自身免疫和/或炎症性疾病或病症的受试者中评价促炎细胞因子的抑制剂的效力的方法,其中所述促炎细胞因子选自由IL-1-β、IL-6、IL-17、IL-23、IL-12、TNFα、IL-5和IFNγ所组成的组,并且所述方法包括下列步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的化合物接触所述样品,以及
(b2)用所述样品中所述促炎细胞因子的所述抑制剂与所述样品接触,
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时确定所述促炎细胞因子在所述样品中的表达水平,以及
(d)当在步骤(b1)结束时检测到所述促炎细胞因子的可检测表达水平或表达水平增加时以及当在步骤(b2)结束时检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平降低时,评价所述促炎细胞因子的所述抑制剂的效力为足够的。
2.一种优选根据权利要求1所述的方法,用于在受试者中评价B细胞的抑制剂的效力,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述受试者获得样品,
(b1)用能够在所述样品中诱导B细胞产生的化合物与所述样品接触,以及
(b2)用所述样品中所述B细胞的所述抑制剂与所述样品接触,
(c)在步骤(b1)和(b2)结束时确定所述样品中B细胞的数量,以及
(d)当在步骤(b1)结束时检测到所述B细胞的可检测数量或数量增加时以及当在步骤(b2)结束时检测到所述B细胞的可检测的数量减少时,评价所述抑制剂的效力为足够的。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述方法施用于以下自身免疫性和/或炎症性疾病或病症和/或施用于以下促炎细胞因子和/或施用于以下B细胞标记物:
i.RA和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组和/或所述B细胞标记物是CD20和/或CD19
ii.另一种RA样疾病和/或所述促炎细胞因子是TNFα,
iii.溃疡性结肠炎和/或所述促炎细胞因子是TNFα,
iv.克罗恩氏病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组,
v.银屑病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组,
vi.MS和/或所述促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组和/或所述细胞标记物是CD20和/或CD19。
vii.哮喘和/或所述促炎细胞因子选自由IL-5和IFNγ所组成的组,
viii.败血症和/或所述促炎细胞因子选自由IL-1β和IFNγ所组成的组,
ix.痛风和/或所述促炎细胞因子是IL-1β,
x.莱姆病和/或所述促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组,
xi.II型糖尿病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα和IL-1β所组成的组。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中在步骤(b1)中能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的所述化合物是针对所述自身免疫和/或炎症性疾病或病症特异性的。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,其中所述促炎细胞因子的表达水平通过直接地定量所述促炎细胞因子的量和/或间接地通过定量编码所述促炎细胞因子的核苷酸序列的量而确定。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法,其中当在步骤(b1)之后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平已增加至少20%以及在步骤(b2)之后的步骤(d)中评价的所述促炎细胞因子的表达水平已减少至少10%时,促炎细胞因子的抑制剂的效力为所述足够的。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中所述样品是获自所述受试者的流体。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述流体选自血液或脊髓液。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述流体是血液并包括PBMC。
10.一种用于治疗怀疑患有自身免疫和/或炎症性病症或疾病的受试者的方法,包括以下步骤:如在权利要求1到9中任一项所限定的在受试者中评价促炎细胞因子的抑制剂的效力,以及随后如果所述抑制剂的效力是令人满意的,则用所述抑制剂治疗所述受试者。
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