CN109641033A - 用基于trail的治疗剂或死亡受体激动剂选择和治疗患者的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供确定癌症患者(例如，结肠直肠癌)的方法，所述癌症患者将受益于利用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂基于其DR4和cIAP1水平进行的治疗。还提供了基于其DR4和cIAP1水平治疗被诊断患有癌症(例如结肠直肠癌)的患者的方法。

Description

用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂选择和治疗患者的 方法
相关申请
本申请要求2016年6月13日提交的美国临时申请No.62/349,497和2017年2月14日提交的美国临时申请No.62/458,824的优先权。上述申请的内容在此通过参考引入。
背景技术
Apo2L/TRAIL(肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体，也称为CD253)是TNF家族的成员，其结合并激活死亡受体(特别是DR4和DR5)。TRAIL还结合非信号诱饵受体、DcR1、DcR2和骨保护素(OPG)。TRAIL作为2型跨膜蛋白天然存在，具有可被切割以释放可溶性三聚体蛋白的细胞外结构域。受体复合物的聚集，例如由TRAIL的三聚体结构介导，对于有效信号传导和死亡受体诱导细胞凋亡是必需的。另外，受体复合物的更高级寡聚化可以扩增信号传导，导致更大的细胞凋亡的诱导。
多年来，由于其在癌细胞中优先诱导凋亡的能力，人们对TRAIL及其在肿瘤学中的潜力一直感兴趣；然而，临床上重组人TRAIL(rhTRAIL)和其他死亡受体激动剂的成功是有限的。导致这种缺乏临床成功的两个可能因素包括次优(sub-optimal)激动剂设计和患者肿瘤的内在抗性。
本公开解决了这种需求并提供了额外的优势。
发明内容
本文提供了确定癌症患者(例如结肠直肠癌患者)的方法，基于其特定水平的DR4和/或cIAP1表达，该癌症患者将受益于使用死亡受体激动剂的基于TRAIL的治疗剂的治疗。还提供了通过施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂治疗已确定具有特定水平的一种或多种生物标志物(DR4和/或cIAP1)的癌症患者的方法。
在另一方面，双基因预测生物标志物允许识别患者应答者。后一方面基于观察到死亡受体4(DR4)和细胞凋亡抑制因子1(cIAP1)是TRAIL细胞信号传导途径中的重要节点。已经发现，当死亡受体4(DR4)水平高且cIAP1水平低时，用TRAIL拮抗剂或死亡受体(DR4或DR5)激动剂治疗在诱导细胞死亡方面非常有效，因此肿瘤大小减小。
在一个实施方案中，患者中DR4的水平足够高并且患者中cIAP1的水平足够低以至于治疗患者导致大于50％的癌细胞死亡。在另一个实施方案中，治疗导致大于60％的癌细胞死亡，大于65％的癌细胞死亡，大于70％的癌细胞死亡，大于75％的癌细胞死亡，大于80％的癌细胞死亡，大于85％的癌细胞死亡，大于90％的癌细胞死亡，大于95％的癌细胞死亡，或100％的癌细胞死亡。在一个实施方案中，提供了治疗具有高水平DR4和低水平cIAP1的肿瘤的被诊断患有癌症(例如，结肠直肠癌)的患者的方法，该方法包括给予治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。
在另一方面，一种基因预测生物标志物允许识别患者应答者。例如，在一个实施方案中，DR4的水平足够高以至于治疗患者导致大于50％的癌细胞死亡。在另一个实施方案中，治疗导致大于60％的癌细胞死亡，大于70％的癌细胞死亡，大于80％的癌细胞死亡，大于90％的癌细胞死亡，或100％的癌细胞死亡。
在一个实施方案中，提供了治疗具有高水平DR4和/或cIAP1的肿瘤的被诊断患有癌症(例如结肠直肠癌)的患者的方法，该方法包括给予治疗有效量的死亡受体激动剂。在一个实施方案中，死亡受体激动剂是DR4激动剂。在另一个实施方案中，死亡受体激动剂是DR5激动剂。在另一个实施方案中，死亡受体激动剂是DR4/5双重激动剂。
在另一个实施方案中，提供了治疗具有高水平DR4和/或cIAP1的肿瘤的被诊断患有癌症(例如结肠直肠癌)的患者的方法，该方法包括给予治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂。在各种实施方案中，此类基于TRAIL的治疗剂可以是交联、PEG化或重组人类TRAIL(rhTRAIL)。在一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是TRAIL多肽。在另一个实施方案中，该TRAIL多肽是TRAIL单体、二聚体或三聚体。在另一个实施方案中，TRAIL多肽包含至少一种稳定突变。在另一个实施方案中，TRAIL多肽是Fc-TRAIL融合多肽。在另一个实施方案中，TRAIL多肽是选自“Fc-T148”、“Fc-T151”、“Fc-T153”、“Fc-T182”、“Fc-T183”、“Fc-T186”、“Fc-T191”、“Fc-T196”、“Fc-T202”、“Fc-T203”、“Fc-T204”、“Fc-T205”、“Fc-T206”、“Fc-T207”、“Fc-T208”、“Fc-T209”、“Fc-T210”和“Fc-T211”(分别为SEQ ID NO:22-39)的Fc-TRAIL融合多肽。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T191(SEQ ID NO:28)。
DR4和/或cIAP1的水平可以通过任何合适的技术测定，包括RNA或蛋白质的测定。在一个实施方案中，通过RT-PCR、定量荧光RT-PCR或RNA-ISH测定DR4和/或cIAP1的RNA水平。在另一个实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹测定DR4和/或cIAP1的蛋白质水平。
在一个实施方案中，确定患者样品具有1或更高、2或更高、或3或更高的DR4IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有1+或更高、2+或更高、或3+或更高的DR4RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有大于或等于-5的DR4RT-PCR评分。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有0、1或更低、或2或更低的cIAP1IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有0、1+或更低、或2+或更低的cIAP1RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有小于或等于5的cIAP1RT-PCR评分。
在另一个实施方案中，生物标志物测定为DR4与cIAP1的比(即DR4/cIAP1)。在一个实施方案中，相对DR4/cIAP1比为至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2。至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、或至少约2.0。在另一个实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.5。在另一个实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.7。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有已经确定具有至少约0.5的DR4/cIAP1比的癌症(例如，结肠直肠癌)患者的方法，该方法包括施用治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂(例如，TRAIL-多肽或Fc-TRAIL融合多肽，如Fc-T191(SEQ ID NO:28))，或死亡受体激动剂(例如，DR4、DR5或DR4/DR5激动剂)。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有结肠直肠癌的患者的方法，该结肠直肠癌已被确定具有至少约0.5的DR4/cIAP1比，其中所述方法包括施用治疗有效量的包含SEQ IDNO:28的Fc-TRAIL融合多肽。
在另一个实施方案中，该方法包括(1)确定癌症的DR4/cIAP1比和(2)如果DR4/cIAP1比为约0.5或更高，则施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。
在另一个实施方案中，本文所述的治疗方法包括施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂作为单一疗法。在另一方面，提供了用于为患有癌症(例如结肠直肠癌)的患者选择治疗或用于提供治疗的方法，该方法包括确定来自患者的至少一种癌细胞样品的DR4/cIAP1比，其中如果该比至少约为0.5，则1)选择该患者用于治疗，和/或2)给患者施用有效量的基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。在一个实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、或至少约2.0。在特定实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.5。在另一个具体实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.7。
在另一个方面，提供了确定癌症患者(例如，结肠直肠癌患者)的方法，基于其特定水平的DR4和/或cIAP1表达，该癌症患者将受益于使用死亡受体激动剂的基于TRAIL的治疗剂的治疗，其中该确定仅基于DR4和/或cIAP1的水平。例如，该方法不涉及测定以下一种或多种生物标志物的水平：APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和XIAP。在另一个实施方案中，该方法包括测定DR4和/或IFN1和一种或多种另外的生物标志物的水平，其中该一种或多种另外的生物标志物不是APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和/或XIAP。
在另一个方面，提供了通过施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂治疗已确定具有特定水平的一种或多种生物标志物(DR4和/或cIAP1)的癌症患者的方法，其中仅基于DR4和/或cIAP1的水平决定治疗患者。例如，患者的一种或多种以下生物标志物的水平尚未作为该方法的一部分进行评估：APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和XIAP。在另一个实施方案中，治疗患者的决定基于DR4和/或cIAP1和一种或多种另外的生物标志物的水平，其中该一种或多种另外的生物标志物不是APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和/或XIAP。
附图说明
图1A是显示暴露于交联TRAIL的结肠直肠癌(CRC)细胞的逻辑模型评分与细胞活力的图。使用来自暴露于交联TRAIL(训练数据集)的27个CRC样品的标准化DR4和cIAP1基因表达水平和细胞活力数据来创建逻辑模型。逻辑模型评分等于DR4*(1-cIAP1)。逻辑模型评分与细胞活力相关，皮尔逊相关系数为-0.69(p<0.0001)。每个点代表一个细胞系。
图1B是显示拟合逻辑模型(参见图1A)对暴露于rhTRAIL的CRC细胞的细胞活力的图。DR4*(1-cIAP1)模型与响应rhTRAIL的11种CRC细胞系中细胞活力的最大抑制相关。每个点代表一个细胞系。回归模型(红线)适合于预测响应于10nM rhTRAIL的细胞活力作为逻辑模型评分的函数。使用来自11个细胞系中的10个的数据进行回归。MDST8(逻辑模型评分＝0.14，细胞活力＝6％)从拟合中排除以创建预测模型，因为其显然是一个异常值。回归模型是：剩余的活细胞百分比＝86.7-122.0*(逻辑模型评分)。
图1C是显示9种CRC细胞系中响应rhTRAIL的预测和实际细胞活力之间的比较的图。图1B中描述的回归模型用于预测9个新CRC细胞系(测试组)中响应10nM rhTRAIL的细胞活力。红色圆圈显示模型预测。箱形图显示响应rhTRAIL的实际细胞活力(4个重复/细胞系)。使用50％作为响应阈值，该模型能够准确预测9个响应细胞系中的8个。
图2A是正常组织和结肠直肠癌患者肿瘤中标准化DR4水平的直方图。
图2B是正常组织和结肠直肠癌患者肿瘤中标准化cIAP1水平的直方图。
图2C是结肠直肠癌患者的肿瘤组织的生物标志物逻辑模型评分的直方图。
图2D是结肠直肠癌患者的正常组织的生物标志物逻辑模型评分的直方图。
图3A是显示用10nM重组TRAIL处理后结肠直肠癌细胞系的细胞活力的图。
图3B是显示对TRAIL敏感或抗性的结肠直肠癌细胞系中DR4/cIAP1mRNA表达的比的图。
图3C是显示各种结肠直肠癌细胞系中TRAIL诱导的生长抑制与相对DR4/cIAP1mRNA表达之间的关系的散点图。
图4是显示rhTRAIL和Fc-T191对结肠直肠癌细胞系的生长抑制的图。使用CellTiter-Glo发光测定法评估rhTRAIL和Fc-T191的浓度高达10nM的抗肿瘤活性。每个点代表一个细胞系，并且显示每个处理的标准差(rhTRAIL重复7次，Fc-T191重复3次，相关系数＝0.92)。
图5A-5C是显示使用Colo205、RKO和KM12细胞的Fc-T191对肿瘤体积的影响的图。箭头表示处理开始的天。
图6A-6C显示DR4敲低足以使LIM1215结肠直肠癌细胞对TRAIL具有抗性。图6A是显示在30nM Fc-T191存在下结肠直肠癌细胞系的细胞活力的图。图6B是显示LIM1215细胞中DR4和/或DR5的siRNA敲低的蛋白质印迹。图6C是显示在递增浓度的Fc-T191存在下用针对DR4和/或DR5的siRNA转染的LIM1215细胞的生长抑制的图。
图7A-7C显示DR4敲低足以使HCT116结肠直肠癌细胞对TRAIL具有抗性。图7A是显示在30nM Fc-T191存在下结肠直肠癌细胞系的细胞活力的图。图7B是显示LIM1215细胞中DR4和/或DR5的siRNA敲低的蛋白质印迹。图7C是显示在递增浓度的Fc-T191存在下用针对DR4和/或DR5的siRNA转染的LIM1215细胞的生长抑制的图。
图8A-8B是显示在源自患者的异种移植物(PDX)小鼠模型中结肠直肠癌细胞对Fc-T191的响应的图。箭头表示处理开始的天。
图9是显示DR4/cIAP1比与结肠直肠癌PDX中的TRAIL响应相关的图。
图10显示了结肠直肠癌PDX中DR4和cIAP1的相对mRNA和蛋白质表达。
具体实施方式
本文提供了用于确定将对基于TRAIL的治疗剂(例如rhTRAIL或TRAIL多肽)或死亡受体激动剂的治疗有响应的癌症患者(例如，结肠直肠癌)的方法。
定义
为方便起见，在说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语和短语的含义提供如下。
如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征为”同义，并且是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的元素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”不包括权利要求元素中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”不排除不会实质上影响权利要求基本的和新颖的特征的材料或步骤。在本文的每个实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个可任选地用其他两个术语中的任一个替换，从而描述了本主题范围的替代方面。本文说明性地描述的本发明可适当地在缺少本文未具体公开的任何要素或限制的情况下实施。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。除非另有说明，否则“或”或“和”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。
当提及诸如量、时间期间等可测定值时，本文所用的术语“约”包括与指定值相差最大达±10％的变化。除非另有说明，否则本文所用的表示成分的量，性质如分子量、反应条件等的所有数字应理解为由术语“约”修饰。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是人类患者(例如患有癌症的患者，如结肠直肠癌)。
本文所用的术语“治疗”是指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法使用本文公开的组合物给予受试者以预防、治愈、延迟、，减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状或复发性疾病或病症，或在没有这种治疗的情况下，延长受试者的存活率超出预期。
如本文所用，“抗肿瘤剂”或“抗癌剂”是指具有抑制人体特别是恶性(癌性)病变(例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病)中肿瘤发展或进展的功能特性的药剂。抑制转移通常是抗肿瘤剂的特性。
如本文所用，“TRAIL”(也称为“Apo2L/TRAIL”，“TNF相关的凋亡诱导配体”和“CD253”)是指TNF家族的成员，其结合并激活死亡受体(特别是DR4和DR5)。人TRAIL氨基酸序列(1-281)(NP_003801.1)为：
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG(SEQ ID NO:1)。
TRAIL还结合非信号诱饵受体、DcR1、DcR2和骨保护蛋白(OPG，也称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF))。TRAIL作为2型跨膜蛋白天然存在，具有可被切割以释放可溶性三聚体蛋白的细胞外结构域。受体复合物的聚集，例如由TRAIL的三聚体结构介导，对于有效信号传导和死亡受体诱导细胞凋亡是必需的。另外，受体复合物的更高级寡聚化可以扩增信号传导，导致更大的细胞凋亡诱导。
“肽”或“多肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键(例如肽等排体)连接的两个或更多个氨基酸的任何肽。肽可以含有除天然存在的核酸编码的氨基酸之外的氨基酸，并且包括通过天然过程(例如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。修饰可以发生在肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以在给定肽中的几个位点以相同或不同的程度存在。而且，给定的多肽可含有许多类型的修饰。多肽可以通过遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的，有或没有支化。环状、支链和支链环状多肽可以由天然翻译后过程产生，或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(例如精氨酸化和泛素化)。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种由于其起源或来源而与其天然状态下伴随的天然相关组分无关的蛋白质或多肽；基本上不含同一物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或者不存在于自然界中。因此，在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中化学合成或合成的多肽将与其天然相关组分“分离”。还可以使用本领域熟知的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本上不含天然相关组分。
如本文所用的术语“变体”定义为野生型序列修饰或改变的形式，例如其中一个或多个氨基酸可以被基本上不影响功能的其他氨基酸或非氨基酸取代。在一些实施方案中，变体可含有至少一个氨基酸残基的改变的侧链。
术语“抑制”意指降低可测定的量。
“抑制剂”和“拮抗剂”，或“活化剂”和“激动剂”，分别指抑制或活化分子，例如，用于如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的激活。如基因、受体、配体或细胞的一种调节剂(modulator)，为一种改变基因、受体、配体或细胞活性的分子，其中活性可以在其标准性质上被激活、抑制、或者改变。调节剂可以单独起作用，或者可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是减少、阻断、妨碍、延迟激活、失活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。活化剂是增加、激活、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂也可以定义为减少、阻断或灭活组成性活性的化合物。
“激动剂”是与靶相互作用以引起或促进靶活化增加的化合物(例如，激动(促进)TRAIL信号传导的多肽)。
“拮抗剂”是一种对抗激动剂作用的化合物。拮抗剂阻碍、减少、抑制或中和激动剂的活性。拮抗剂还可以阻碍、抑制或降低靶的组成性活性，例如一种靶受体，即使此处没有确定的激动剂。
本领域普通技术人员将理解，起始材料、生物和化学材料、生物和化学试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法和除了具体示例的那些之外的生物学方法可以用于本发明的实施中而无需过度试验。任何此类材料和方法的所有本领域已知的功能等同物旨在包括在本公开中。
这里使用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且无意使用这些术语和表达排除所示或所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到在本发明所要求保护的范围内的各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管已经通过各种实施例(可包括优选实施例、示例性实施例和可选特征)具体公开了本发明的各方面，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改或变化。这些修改和变化被认为是在所描述的本发明的实施例的范围内的，并且可以由所附权利要求限定。
A.生物标志物
本文描述的方法涉及通过施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂治疗已确定具有特定水平的一种或多种特定生物标志物的患者。
如本文所用，“DR4”(也称为“TNFRSF10A”，“APO2”，“CD261”，“TRAILR-1”和“TNF受体超家族成员10a”)指TNF受体超家族的一个成员。术语DR4和TNFRSF10A在整个说明书中可互换使用。DR4是膜结合的细胞表面受体，其结合TRAIL并介导细胞凋亡。人DR4(TNFRSF10A)氨基酸序列(1-468)(NP_003835.3)为：
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCCCIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRR RLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE(SEQ ID NO:2)。
TRAIL与DR4的结合导致受体的三聚化和死亡诱导信号传导复合物(DISC)的形成，其促进半胱天冬酶原-8/10的补充(recruitment)。除了调节细胞死亡途径和细胞凋亡外，DR4还介导细胞存活信号。
如本文所用，“cIAP1”(也称为“BIRC-2”、“BIRC2”、“cIAP-1”和“含杆状病毒IAP重复2”)是指蛋白质细胞凋亡家族抑制剂的一个成员，其通过干扰胱天蛋白酶的活化来抑制细胞凋亡。术语cIAP1和BIRC2在整个说明书中可互换使用。已知cIAP1直接结合活化的胱天蛋白酶-3和7并抑制它们的活性。已显示cIAP1抑制TNF诱导的细胞凋亡。人cIAP1(BIRC2)(同种型1)氨基酸序列(1-618)(NP_001157)为：
MHKTASQRLFPGPSYQNIKSIMEDSTILSDWTNSNKQKMKYDFSCELYRMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQNLVSASLGSTSKNTSPMRNSFAHSLSPTLEHSSLFSGSYSSLSPNPLNSRAVEDISSSRTNPYSYAMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFACGGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENSLETLRFSISNLSMQTHAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCCDGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRYPHLLEQLLSTSDTTGEENADPPIIHFGPGESSSEDAVMMNTPVVKSALEMGFNRDLVKQTVQSKILTTGENYKTVNDIVSALLNAEDEKREEEKEKQAEEMASDDLSLIRKNRMALFQQLTCVLPILDNLLKANVINKQEHDIIKQKTQIPLQARELIDTILVKGNAAANIFKNCLKEIDSTLYKNLFVDKNMKYIPTEDVSGLSLEEQLRRLQEERTCKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICRGIIKGTVRTFLS(SEQ ID NO:3)
B.检测和测定生物标志物
在一个实施方案中，使用样品中测定的一种或多种生物标志物的表达水平来推导或计算值或分数(例如，其与生物标志物的“高”或“低”表达相关)。该值可以仅从这些表达水平得出，或者任选地从表达值/评分与其他组分的组合得出，以给出更全面的值/评分。
任何一种生物标志物DR4(TNFRSF10A)或cIAP1(BIRC-2)的评分可用于本文提供的方法中。在一个实施方案中，已经确定根据本文所描述方法治疗的患者具有高DR4评分(即，高DR4表达)。在另一个实施方案中，已经确定根据本文所描述方法治疗的患者具有低cIAP1评分(即，低cIAP1表达)。在另一个实施方案中，已经确定根据本文所述方法治疗的患者具有高DR4评分(即，高DR4表达)和低cIAP1评分(即低cIAP1表达)。在另一个实施方案中，生物标志物评分是标准化DR4RNA或蛋白质表达与cIAP RNA或蛋白质表达的比。
在另一个实施方案中，患者患有已经确定具有至少约0.5的DR4/cIAP1比的癌症(例如，结肠直肠癌)。在一个实施方案中，该DR4/cIAP1比为至少约0.5，至少约0.6，至少约0.7，至少约0.8，至少约0.9，至少约1.0，至少约1.1，至少约1.2，至少约1.3，至少约1.4，至少约1.5，至少约1.6，至少约1.7，至少约1.8，至少约1.9，或至少约2.0。在特定实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.5。在另一个具体实施方案中，DR4/cIAP1比为至少约0.7。
用于确定组织或细胞样品中基因或蛋白质状态的各种技术是本领域已知的，包括但不限于微阵列分析(例如，用于测定mRNA或微小RNA表达、拷贝数等)，定量实时PCRTM(“qRT-PCRTM”，例如TaqManTM)，免疫分析(例如，ELISA、免疫组织化学)等。由基因编码的多肽的活性水平可以与基因或多肽的表达水平大致相同的方式使用。通常较高的活性水平表明较高的表达水平，而较低的活性水平表明较低的表达水平。可以独立于所使用的特定技术来实践本公开的方法。
在各种实施方案中，在核酸水平检测生物标志物的表达。例如，可以基于RNA水平评估DR4(TNFRSF10A)或cIAP1(BIRC-2)的生物标志物评分。在测定基因的RNA水平的情况下，一种方便和灵敏的方法是反转录反应之后的实时定量PCRTM(qPCR)测定。因此，在一个实施方案中，用于确定样品中RNA水平的方法涉及从均质化组织进行核酸扩增的过程，例如通过RT-PCR(逆转录RNA后，使用PCR或任何其他核酸扩增方法扩增得到的cDNA)，然后检测扩增的分子。通常，确定每个测试基因和每个标准化基因的循环阈值(Ct)，即可检测到来自背景之上的qPCR反应的荧光的循环数。
在一个实施方案中，通过定量荧光RT-PCR(qPCR)评估RNA表达，例如，通过使用TaqManTM系统。此类方法通常利用对目的核酸特异的寡核苷酸引物对。以下实施例中提供了此类测定的进一步的细节。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有大于或等于-5的DR4RT-PCR评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有选自5.0、4，9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0，7、0.6、0.5、0.4、0，3、0.2、0，1、0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9、-1.0、-1.1、-1.2、-1,3、-1.4、-1.5、-1.6、-1.7、-1.8、-1.9、-2.0、-2.1、-2.2、-2.3、-2.4、-2.5、-2.6、-2.7、-2.8、-2.9、-3.0、-3.1、-3.2、-.3.3、-3.4、-3.5、-3.6、-3.7、-3.8、-3.9、-4.0、-4.1、4.2、-4.3、-4.4、-4.5、-4.6、-4.7、-4.8、-4.9、-5.0的DR4RT-PCR评分。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有小于或等于5的cIAP1RT-PCR评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有选自5.0、4,9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0，7、0.6、0.5、0.4、0,3、0.2、0,1、0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9、-1.0、-1.1、-1.2、-1,3、-1.4、-1.5、-1.6、-1.7、-1.8、-1.9、-2.0、-2.1、-2.2、-2.3、-2.4、-2.5、-2.6、-2.7、-2.8、-2.9、-3.0、-3.1、-3.2、-.3.3、-3.4、-3.5、-3.6、-3.7、-3.8、-3.9、-4.0、-4.1、4.2、-4.3、-4.4、-4.5、-4.6、-4.7、-4.8、-4.9、-5.0的cIAP1RT-PCR评分。
在一个实施方案中，还获得一种或多种标准化(通常称为“持家”)基因的表达，用于标准化测试基因的表达。如本文所用，“标准化基因”是指其表达用于校准或标准化测定的目的基因表达(例如，测试基因)的基因。重要的是，正常化基因的表达应该与癌症结果/预后无关，并且正常化基因的表达在所有肿瘤样品中非常相似。标准化确保了不同样品之间测试基因表达的准确比较。为此目的，可以使用本领域已知的持家基因。持家基因在本领域中是公知的，其实例包括但不限于GUSB(葡糖醛酸糖苷酶，β)、HMBS(羟甲基胆素合酶)、SDHA(琥珀酸脱氢酶复合物，亚基A，黄素蛋白)、UBC(遍在蛋白C)和YWHAZ(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，zeta多肽)。可以使用一种或多种持家基因。优选地，使用至少2、5、10或15个持家基因来提供组合的标准化基因组。可以将这种标准化基因的基因表达量平均，通过直接添加或通过定义的算法组合在一起。在一个实施方案中，使用几何平均值计算基因表达。
一个或多个标准化基因的整体表达可以由“标准化值”表示，其可以通过组合所有标准化基因的表达来产生，或者同等地加权(直接增加或平均)或通过不同的预定义系数。例如，以最简单的方式，标准化值CtH可以是一个单一标准化基因的循环阈值(Ct)，或Ct值的平均值为2或更高，优选10或更高，或15或更多标准化基因，在这种情况下，预定系数是1/N，其中N是使用的标准化基因的总数。从而，CtH＝(CtH1+CtH2+-CtHn)/N。对于技术人员来说，显而易见的是，取决于所使用的标准化基因，以及希望给予每个标准化基因的权重，任何回归系数(来自0/N至N/N)在加权这种标准化基因的表达时，可以给标准化基因赋予。即，CtH＝xCtH1+yCtH2+-zCtHn，wherein x+y+...+z＝1。
在各种实施方案中，RNA表达值计算为2-ΔΔct。Δct值是标准化至持家基因ct值的目的基因的ct值。在一个实施方案中，通过标准化参考细胞系CCK81的Δct值获得ΔΔct值。
在另一个实施方案中，使用RNA-ISH测定法检测RNA表达。例如，可以使用显色RNA-原位杂交测定法(RNA-ISH)检测RNA。可以使用显色RNA-ISH测定法对FFPE组织切片染色感兴趣的RNA。对于每个RNA-ISH测定，评分系统可以由经过认证的病理学家应用。系统将水平评分为离散变量0、1+、2+、3+或4+。可以使用以下Advanced Cell (“ACD”Hayward,California)测定法的变体为生物标志物RNA水平对FFPE肿瘤样品进行评分。在该测定中，将细胞透化并与一组特异于该生物标志物的寡核苷酸“Z”探针(参见例如美国专利号7,709,198)一起温育。使用“Z”探针，以及每个转录物使用多组探针，与标准ISH方法相比，增加了测定的特异性。在Z探针孵育后，添加扩增前体，其仅能与结合靶转录物的一对相邻Z探针杂交。这最小化了非特异性结合的扩增。然后基于与扩增前体的序列特异性杂交，进行几个连续的扩增步骤，接着进行酶介导的发色检测，其能够半定量测定肿瘤组织中的生物标志物RNA水平。
步骤1：将FFPE组织切片脱石蜡并预处理以阻断内源性磷酸酶和过氧化物酶并揭露RNA结合位点。步骤2：应用靶特异性双Z探针，其与相邻序列处的靶RNA特异性杂交。步骤3：通过依次应用扩增前体寡核苷酸、扩增寡核苷酸、最终HRP缀合的寡核苷酸和DAB的来检测靶标。步骤4：使用光学显微镜观察载玻片并由病理学家评分。
为了对测定进行评分，将四种细胞系的参考组织微阵列(TMA)与肿瘤样品一起染色。这些细胞系表达不同水平的生物标志物，范围从低到高。然后，病理学家基于与参考TMA的视觉比较为患者样本分配分数。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有1+或更高、2+或更高、或3+或更高的DR4RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有1+或更高的DR4RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有2+或更高的DR4RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有3+或更高的DR4RNA-ISH评分。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有0、1+或更低，或2+或更低的cIAP1RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有0的cIAP1RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有1+或更低的cIAP1RNA-ISH评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有2+或更低的cIAP1RNA-ISH评分。
还可以在蛋白质水平检测生物标志物的表达。因此，可以基于检测到的蛋白质水平评估DR4(TNFRSF10A)或cIAP1(BIRC-2)的评分。在一个具体实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)测定蛋白质水平的表达。免疫组织化学是一种通过使用特异性结合蛋白质的抗体检测组织切片细胞中蛋白质的技术。示例性IHC测定，例如Fl-IHC和qIHC，是本领域熟知的。
例如，Fl-IHC可用于测定FFPE组织中肿瘤细胞中的生物标志物水平。Fl-IHC是基于成像的测定，并且提供每个样品中每个肿瘤细胞的蛋白质分子数量的量度。从患者收集手术切除的肿瘤组织或核心针活组织检查，在福尔马林中固定，并使用标准程序包埋在石蜡块中。将FFPE块切片，安装在载玻片上，并共染色DNA、细胞角蛋白(CK)和生物标志物。标记物的最终检测基于荧光。可以使用 ScanScopeFL的20x放大的设置对载玻片成像并使用定量数字影响分析进行分析。自动图像分析算法在组织区域上应用规则网格，其中每个方形区块大约是单个细胞的大小。然后使用从组织微阵列(TMA)产生的标准曲线将CK+方形区的荧光测定值转换为绝对标度(每个细胞的受体)，与患者样品同时染色和成像，其由具有已知的生物标志物蛋白水平的细胞系组成。
qIHC还可用于检测生物标志物的蛋白质水平。qIHC使用标准的棕色染色技术来指示FFPE组织切片中的蛋白质水平。基于TMA的评分系统可以由经过认证的病理学家应用。该系统基于染色强度(例如，0、1、2、3、4)产生分数。
在一个实施方案中，确定患者样品具有1或更高、2或更高、或3或更高的DR4IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有1或更高的DR4IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有2或更高的DR4IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有3或更高的DR4IHC评分。
在另一个实施方案中，确定患者样品具有0、1或更低、或2或更低的cIAP1IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品的cIAP1IHC评分为0。在另一个实施方案中，确定患者样品具有1或更低的cIAP1IHC评分。在另一个实施方案中，确定患者样品具有2或更低的cIAP1IHC评分。
在另一个方面，提供了确定癌症患者(例如，结肠直肠癌患者)的方法，基于其特定水平的DR4和/或cIAP1表达，该癌症患者将受益于使用死亡受体激动剂的基于TRAIL的治疗剂的治疗，其中所述确定仅基于DR4和/cIAP1的水平。例如，该方法不涉及测定以下一种或多种生物标志物的水平：APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和XIAP。在另一个实施方案中，该方法包括测定DR4和/或cIAP1和一种或多种另外的生物标志物的水平，其中所述一种或多种另外的生物标志物不是APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和/或XIAP。
在另一个方面，提供了通过施用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂治疗已经确定具有特定水平的一种或多种生物标志物(DR4和/或cIAP1)的癌症患者的方法，其中决定治疗患者仅基于DR4和/或cIAP1的水平。例如，患者的一种或多种以下生物标志物的水平尚未作为该方法的一部分进行评估：APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和XIAP。在另一个实施方案中，治疗患者的决定基于DR4和/或cIAP1和一种或多种另外的生物标志物的水平，其中所述一种或多种另外的生物标志物不是APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2和/或XIAP。
例如，在一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是APAF1。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP3。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP6。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP7。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP8。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP9。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CASP10。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是FADD。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是SPTAN1。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不包含BCL2。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是GAS2。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是BID。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是LMNA。在另一个一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CFLAR。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是MAP3K14。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是BIRC3。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CHUK。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是NFKB1。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是NFKBIA。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是TNFRSF10B。在另一个实施方案中，一种或多种生物标志物不包含TNFSF25。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是TNFSF10。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是TNFSF12。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是CYCS。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是DFFA。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是DFFB。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是RELA。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是TRADD。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是RIPK1。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不是TRAF2。在另一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不包含XIAP。
C.生物样品
可以在从受试者获得的生物样品(活组织检查)中测定一种或多种生物标志物(例如，DR4或cIAP1)的表达。
如本文所用，“肿瘤样品”是指含有一种或多种肿瘤细胞或一种或多种肿瘤衍生的RNA或蛋白质并且从患者(例如癌症患者)获得的任何生物样品。例如，从癌症患者的肿瘤组织获得的组织样品是本文所述方法中的有用肿瘤样品。优选地，样品主要含有肿瘤细胞。来自癌症患者肿瘤的单个恶性细胞也是有用的肿瘤样品。这种恶性细胞可以直接从患者的肿瘤中获得，或者从患者的体液(例如，血液，尿液)中纯化。因此，出于本文所述方法的目的，含有一种或多种肿瘤细胞或肿瘤来源的RNA或蛋白质的体液如血液、尿液、痰液和唾液也可用作肿瘤样品。通常在从受试者获得这样的样品之后进一步处理这样的样品。适于检测和定量本文所述生物标志物的活组织检查样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的。合适的样品优选切片。或者，可以将样品溶解和/或均质化并随后分析。在一个实施方案中，将新鲜获得的活组织检查样品包埋在冷冻保护剂例如或中，并使用例如液氮或二氟二氯甲烷冷冻。将冷冻样品在低温恒温器中连续切片。在另一个实施方案中，在切片之前固定并包埋样品。例如，组织样品可以固定在例如福尔马林、戊二醛、乙醇或甲醇中，连续脱水(例如，使用醇和/或二甲苯)并包埋在例如石蜡中。
在另一个实施方案中，样品是活组织检查的切片机切片(例如，在切片机切片之前的FFPE)。在另一个实施方案中，在治疗患者之前30、60或90天内获得活组织检查。
在另一个实施方案中，肿瘤样品来源于血液中的循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是从原发性肿瘤脱离并进入血管系统的细胞。这些细胞可以在转移性疾病患者中以每毫升全血1-10CTC的量级的频率发现，并且这些细胞的分离可以提供肿瘤活组织检查的非侵入性替代物，并且通常可以用于不可能采购活检样本的情况。
D.基于TRAIL的治疗剂
i.TRAIL多肽
除rhTRAIL外，如国际申请号PCT/US2017/022789(其通过引用明确并入本文)中所描述的TRAIL多肽也可用于本文所述的方法。TRAIL多肽可以是单一多肽链构建体中的TRAIL单体、二聚体或三聚体，而不管精确的形式或融合配体(如果有的话)。例如，单链TRAIL构建体可包含一个、两个或三个TRAIL单体。
在一个实施方案中，TRAIL多肽包含一个TRAIL结构域(单体)。在另一个实施方案中，TRAIL多肽包含两个TRAIL单体(二聚体)。在另一个实施方案中，多肽包含三个TRAIL单体(三聚体)。在另一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-281、114-281或120-281。在另一个实施方案中，多肽包含与抗体Fc区或其片段和/或Fab或其片段和/或抗体和/或白蛋白(例如HSA)连接(例如，融合)的TRAIL多肽。
在一个实施方案中，TRAIL单体包含全长人TRAIL(即SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-281)。在另一个实施方案中，TRAIL单体包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的一部分。在另一个实施方案中，TRAIL单体包含SEQ ID NO:1的氨基酸114-281。在另一个实施方案中，TRAIL单体由SEQ ID NO:1的氨基酸114-281组成。在另一个实施方案中，TRAIL结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-281。在另一个实施方案中，TRAIL单体由SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-281组成。在另一个实施方案中，TRAIL单体包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基120-281。在另一个实施方案中，TRAIL单体由SEQ ID NO:1的氨基酸残基120-281组成。
在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基90-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基90-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基91-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基91-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基92-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基92-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基93-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基93-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基94-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基94-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基96-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基96-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基97-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基97-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基98-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基98-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基99-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基99-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基100-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基100-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基101-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基101-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基102-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基102-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基103-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基103-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基104-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基104-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基105-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基105-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ IDNO:1的氨基酸残基106-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基106-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基107-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基107-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基108-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基108-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQID NO:1的氨基酸残基109-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基109-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基110-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基110-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基111-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基111-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基112-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基112-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基114-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基114-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基115-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基115-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基116-281组成或包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基116-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基117-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基117-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基118-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基118-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基119-281组成或包含SEQID NO:1的氨基酸残基119-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基120-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基120-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基121-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基121-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基122-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基122-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基123-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基123-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基124-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基124-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基125-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基125-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ IDNO:1的氨基酸残基126-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基126-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基127-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基127-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基128-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基128-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQID NO:1的氨基酸残基129-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基129-281。在另一个实施方案中，TRAIL结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸残基130-281组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基130-281。
在另一个实施方案中，TRAIL单体包含与具有在SEQ ID NO:1的氨基酸残基90-130中的任意一个的N末端和在SEQ ID NO:1的氨基酸残基251-281中的任一个的C末端的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，TRAIL单体包含不超过约250个氨基酸残基，优选不超过约200个氨基酸残基，更优选不超过约150个氨基酸残基。在另一个实施方案中，TRAIL单体由不超过约250个氨基酸残基组成，优选不超过约200个氨基酸残基，更优选不超过约150个氨基酸残基。
在一个实施方案中，融合多肽包含一组三种人TRAIL单体以形成单链TRAIL三聚体。在一个实施方案中，该单链TRAIL三聚体以氨基至羧基末端顺序包含第一TRAIL单体、接头、第二TRAIL单体、第二接头和第三TRAIL单体。在一个实施方案中，接头包含G4S结构域(SEQ ID NO:40)。在另一个实施方案中，每个接头由15-20个氨基酸组成。在另一个实施方案中，两个TRAIL间单体接头中的每一个包含3个G4S结构域(SEQ ID NO:50)。
在一个实施方案中，TRAIL融合多肽是Fc-TRAIL融合多肽。在另一个实施方案中，TRAIL融合多肽是Fab-TRAIL融合多肽。在另一个实施方案中，TRAIL融合多肽是HSA-TRAIL融合多肽。适用于这种HSA-TRAIL融合多肽的人血清白蛋白(HSA)部分包括美国专利号8,927,694和8,877,687中公开的天然和突变HSA。
在一个实施方案中，TRAIL多肽与其信号传导受体(特别是DR4和DR5)或非信号诱饵受体、DcR1、DcR2和骨保护蛋白(OPG)中的至少一种结合。在另一个实施方案中，TRAIL多肽诱导细胞凋亡。
每种TRAIL单体可以含有突变或突变组合，可以独立地存在或不存在于三种单体中的每一种中。在一个实施方案中，TRAIL突变可以选自SEQ ID NO:1的第121、130、213、215、228和247位中的一个或多个的氨基酸取代。如PCT/US2017/022789(其通过引用明确并入本文)中所提供的，用于单链TRAIL分子的TRAIL单体中的有益突变包括如下的单个突变(按照SEQ ID NO:1编号)：R121I，R130G，Y213W，S215D，N228S和I247V。
在一个方面，三种单体中的每一种含有相同的突变或相同的突变组合，另一方面，三种单体中的两种含有相同的突变或相同的突变组合，而第三种包含不同的突变或突变组合。在另一个方面，三种单体中的每一种包含不同的突变或突变组合，或者在三种单体中的一种或两种中不存在突变。例如，示例性单链突变体TRAIL三聚体可选自“T148”,“T151”,“T153”,“T182”,“T183”,“T186”,“T191”,“T196”,“T202”,“T203”,“T204”,“T205”,“T206”,“T207”,“T208”,“T209”,“T210”和“T211”(分别为SEQ ID NO:4-21)。
本文提供了治疗具有高水平DR4和低水平cIAP1的患有癌症的患者的方法，该方法包括给予治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。在一个实施例中，基于TRAIL的治疗剂是rhTRAIL。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是TRAIL单体、二聚体或三聚体。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T148(SEQ ID NO:4)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T151(SEQ ID NO:5)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T153(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T182(SEQ ID NO:7)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T183(SEQ ID NO:8)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T186(SEQ ID NO:9)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T191(SEQ ID NO:10)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T196(SEQ ID NO:11)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T202(SEQ ID NO:12)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T203(SEQ ID NO:13)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T204(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T205(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T206(SEQ ID NO:16)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T207(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T208(SEQ ID NO:18)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T209(SEQ ID NO19)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T210(SEQ ID NO:20)。在另一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是T211(SEQ ID NO:21)。
其他已知的基于TRAIL的多肽和配体可用于本文所述的方法中(例如，如US9359420中所述的那些，其通过引用明确并入本文)。
ii.Fc-TRAIL融合多肽
可用于本文所述方法的基于TRAIL的疗法还可包含与Fc区或其片段连接的TRAIL多肽。
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或与经典补体系统的第一组分(C1q)结合。因此，Fc区包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的抗体的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，衍生自抗体的两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE的Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγl和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从C226或P230位置的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基末端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中CH2结构域的C-末端侧，即其从IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何异型变体、或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。Fc也可以单独指这一区域，或在包含Fc的蛋白质多肽(例如“包含Fc区的结合蛋白”，也称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素))的上下文中指该区域。
在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽包含天然序列Fc区。“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区，天然序列人IgG2Fc区，天然序列人IgG3Fc区，和天然序列的人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fe的各种同种异型(参见，例如，Jefferis等(2009)mAbs 1:1)。
在某些实施方案中，Fc区是变体Fc区，例如相对于亲本Fc序列(例如，未修饰的Fc多肽，其随后被修饰以产生变体)已经被修饰(例如，通过氨基酸取代、缺失和/或插入)的Fc序列，以提供期望的结构特征和/或生物活性。
例如，可以在Fc区中进行修饰以产生Fc变体，其(a)具有增加或减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或减少的补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)具有增加或减少对C1q的亲和力和/或(d)具有相对于亲本Fc对Fc受体增加或降低的亲和力。此类Fc区变体通常在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。组合氨基酸修饰被认为是特别理想的。例如，变体Fc区可以在其中包括两个、三个、四个、五个等取代，例如，在本文鉴定的特定Fc区位置。
变体Fc区还可以包含序列改变，其中涉及二硫键形成的氨基酸被去除或被其他氨基酸取代。这种去除可以避免与用于产生本文所述抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白质反应。即使当去除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍然可以形成非共价结合在一起的二聚体Fc结构域。在其他实施方案中，可以修饰Fc区以使其与选择的宿主细胞更相容。例如，可以去除典型天然Fc区的N末端附近的PA序列，其可以被大肠杆菌中的消化酶识别，例如脯氨酸亚氨基肽酶。在其他实施方案中，可以去除Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可以赋予细胞溶解反应。这些残基可以缺失或被非糖基化残基(例如丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可以从Fc区去除参与与补体相互作用的位点，例如C1q结合位点。例如，可以删除或替换人IgG1的EKK序列。在某些实施方案中，可以去除影响与Fc受体结合的位点，优选除了补救受体结合位点之外的位点。在其他实施方案中，可以修饰Fc区以去除ADCC位点。ADCC位点在本领域中是已知的；例如，关于IgG1中的ADCC位点可参见Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。变体Fc结构域的具体实例公开于例如WO 97/34631和WO 96/32478中。
在一个实施方案中，修饰Fc的铰链区使得铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如，增加或减少。在Bodmer等人的美国专利No.5，677，425中进一步描述了这种方法。改变Fc铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有受损的SpA结合。在Ward等人的美国专利No.6，165,745中进一步详细描述了该方法。
在又一个其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1组分。在Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换，使得抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。在Idusogie等人的美国专利No.6，194,551中进一步详细描述了该方法。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在又一个实例中，可修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。用于增强FcyR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。在“Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685-691”中综述了这些和其他修改。
增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括在Fc区的238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439的氨基酸位置中的任何一个或多个的修饰，其中Fc区中残基的编号为EU索引的编号，如Kabat(WO00/42072)。
可以对Fc进行的其他Fc修饰是用于减少或消除与FcγR和/或补体蛋白的结合的修饰，从而减少或消除Fc介导的效应子功能，例如ADCC、ADCP和CDC。示例性修饰包括但不限于位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，其中编号根据EU索引，示例性取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于减少FcγR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及通过突变或酶促手段或通过在诸如不糖基化蛋白质的细菌的生物体中产生来去除297位的糖基化。在“Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology 20:685-691”中综述了这些和其他修改。
任选地，Fc区可以在本领域技术人员已知的另外和/或替代位置包含非天然存在的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821、6,277,375、6,737,056、6,194,551、7,317,091、8,101,720；PCT专利公开文本WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO05/070963、WO 05/040217,WO 05/092925和WO 06/020114)。
还可以使用增强对抑制性受体FcyRllb的亲和力的Fc变体。此类变体可以提供具有与FcyRllb+细胞相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白，包括例如B细胞和单核细胞。在一个实施方案中，Fc变体相对于一种或多种活化受体提供对FcyRllb的选择性增强的亲和力。用于改变与FcyRllb的结合的修饰包括在选自234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332的位置处的一个或多个修饰，根据EU索引。用于增强FcyRllb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcyRllb结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
Fc区对其配体的亲和力和结合性质可以通过本领域已知的各种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，包括但不限于平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELLSA)，或放射免疫分析(RIA))，或动力学(例如BIACORE分析)，和其他方法，例如间接结合分析、竞争性抑制分析、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱(如凝胶)过滤。这些和其他方法可以利用待检查的一种或多种组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。关于结合亲和力和动力学的详细描述可以在专注于抗体-免疫原相互作用的Paul,W.E.编著的Fundamental Immunology,第四版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中找到。
在某些实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成。例如，可以突变一个或多个以下残基：252、254、256、433、435和436，如美国专利No.6,277,375中所述。具体的示例性取代包括以下一种或多种：T252L、T254S和/或T256F。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以包含来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等,2006Journal ofImmunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等，Journal of Biological Chemistry，2001，276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等，Journal of Immunology,2002，169:5171-5180,Dall'Acqua等,2006,Journal of Biological Chemistry281:23514-23524)。调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等,2010,J Immunol，182:7663-7671。在某些实施方案中，可以使用具有特定生物学特征的杂合IgG同种型。例如，IgG1/IgG3杂合体变体可以通过使用源于IgG3上的两个同种型有差异的位置的氨基酸取代IgG1的CH2和/或CH3区中的位置来构建。因此，可以构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如，274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R和436F。在本文所述的其他实施方案中，IgG1/IgG2杂合体变体可以通过使用源于IgG1上的两个同种型有差异的位置的氨基酸取代IgG2的CH2和/或CH3区中的位置来构建。。因此，可以构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如，一个或多个下列氨基酸取代：233E、234L、235L、-236G(指236位插入甘氨酸)和327A。
此外，已经绘制了人IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等，(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变改善了与FcγRIII的结合。此外，以下组合突变体显示出改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，已显示表现出增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields等，2001)。已经确定了与FcγRIIIa具有强烈增强结合的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E的变体和S239D/I332E/A330L突变显示对FcγRIIIa的亲和力最大的增加，FcγRIIb结合减少，并且在食蟹猴中具有强的细胞毒活性(Lazar等，2006)。将三重突变引入抗体如阿仑单抗(CD52特异性)，曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)，利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)在体外转化为大大增强的ADCC活性，并且S239D/I332E变体显示出增强的消耗猴子中B细胞的能力(Lazar等，2006)。此外，已经确定出含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，其表现出与FcγRIIIa的增强的结合，并且伴随着在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中的ADCC活性增强(Stavenhagen等，2007；Nordstrom等，2011)。可以使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。
在另一个实施方案中，Fc-TRAIL多肽链二聚化为第二Fc-TRAIL多肽链。在一个具体实施方案中，两条Fc-TRAIL多肽链通过至少一个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条Fc-TRAIL多肽链通过至少两个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条Fc-TRAIL多肽链通过至少三个Fc间二硫键二聚化。
在一个具体实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽包含通过至少一个Fc间二硫键二聚化的两条多肽链，每条链包含与一组三个人TRAIL结构域肽结合的人IgG Fc部分以形成未分支单链，包括按从氨基末端到羧基末端的顺序的Fc部分、接头、第一TRAIL单体、单体间接头、第二TRAIL单体、第二单体间接头和第三TRAIL单体，其中每个接头由15-20个氨基酸组成，并且两个TRAIL间单体接头中的每一个包含3个G4S基序。
在另一个实施方案中，Fc区在效应子功能方面被修饰，以增强多肽在治疗疾病(例如癌症)中的有效性。例如，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体多肽可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。也可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体多肽。或者，可以改造具有双Fc区的多肽，从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。
在一个具体实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽包含与一组三个人TRAIL结构域结合的人IgG Fc部分或其片段，以形成单个无支链多肽，其包含以从氨基末端到羧基末端顺序的Fc部分、连接基、第一TRAIL单体、单体间接头、第二TRAIL单体，第二单体间接头和第三TRAIL单体。在一个具体实施方案中，例如，Fc-TRAIL融合多肽包含SEQ ID NO:22-39中的任一个。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽包含在天然野生型人TRAIL中未发现的至少一个、两个、三个或四个突变。
示例性单链突变Fc-TRAIL融合多肽可选自“Fc-T148”、“Fc-T151”、“Fc-T153”、“Fc-T182”、“Fc-T183”、“Fc-T186”、“Fc-T191”、“Fc-T196”、“Fc-T202”、“Fc-T203”、“Fc-T204”、“Fc-T205”、“Fc-T206”、“Fc-T207”、“Fc-T208”、“Fc-T209”、“Fc-T210”和“Fc-T211”(分别为SEQ ID NO:22-39)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是T148(SEQ ID NO:22)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T151(SEQ ID NO:23)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T153(SEQ ID NO:24)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T182(SEQ ID NO:25)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T183(SEQID NO:26)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T186(SEQ ID NO:27)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T191(SEQ ID NO:28)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T196(SEQ ID NO:29)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T202(SEQ ID NO:30)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T203(SEQ ID NO:31)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T204(SEQ ID NO:32)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T205(SEQ ID NO:33)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T206(SEQ ID NO:34)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T207(SEQID NO:35)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T208(SEQ ID NO:36)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T209(SEQ ID NO:37)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T210(SEQ ID NO:38)。在另一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T211(SEQ ID NO:39)。
在一个实施方案中，Fc-TRAIL融合多肽诱导癌细胞凋亡。
其他已知的基于TRAIL的疗法和Fc融合物可用于本文所述的方法中。例如，在一个实施方案中，基于TRAIL的治疗剂是六价Fc-融合蛋白(例如，ABBV-621)(也可参见ClinicalTrials.gov标识符NCT03082209，其内容通过引用明确并入本文)。ABBV-621是TRAIL-受体激动剂，由TRAIL的六个受体结合结构域组成，与人IgG1抗体的Fc-结构域融合。
另外，可用于本文所述方法的Fc-融合多肽包括单链末端受体激动剂(例如，如WO2015/164588和US2015/0337027中所述的那些，其内容通过引用明确并入本文)。
iii.Fab-Fc-TRAIL和Fab-TRAIL融合多肽
本文所述的Fc-TRAIL融合多肽可进一步包含抗体Fab区或其片段(例如，Fab-Fc-TRAIL融合多肽)。“Fab”是指抗体的抗原结合部分，其包含两条链：包含VH结构域和CH1结构域的第一链和包含VL结构域和CL结构域的第二链。尽管Fab通常被描述为用木瓜蛋白酶处理并包含铰链区的一部分的抗体的N-末端片段，但是其在本文中也用作指其中重链不包含部分铰链的结合结构域。在另一个实施方案中，TRAIL融合物包含全长重链和轻链或其片段。在另一个实施方案中，TRAIL融合物包含全长抗体。
在一个实施方案中，Fab-Fc-TRAIL融合体或全长重链和轻链重链TRAIL融合体或其片段可二聚化为第二融合多肽链。在一个具体实施方案中，两条融合多肽链通过至少一个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条融合多肽链通过至少两个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条融合多肽链通过至少三个Fc间二硫键二聚化。
在另一个实施方案中，Fab-Fc、重链和轻链、全长抗体或其片段与接头融合至TRAIL多肽。在另一个实施方案中，接头是氨基酸接头。也可以在Fab区或抗体的重链和/或轻链可变区的一个或多个框架或连接区内进行修饰，只要保持这些修饰后的抗原结合亲和力即可。
在另一个实施方案中，Fab-Fc-TRAIL融合多肽包含与人Fc部分或其片段结合的人Fab部分或其片段，其与一组三种人TRAIL单体结合以形成单个无支链的多肽，包含从氨基末端到羧基末端顺序的Fc部分、接头、第一TRAIL单体、单体间接头、第二TRAIL单体、第二单体间接头和第三TRAIL单体。在另一个实施方案中，Fab-Fc-TRAIL融合多肽包含天然野生型人TRAIL中未发现的至少一个、两个、三个或四个突变。
本文描述的TRAIL融合物还可包含抗体Fab区或其抗原结合部分(Fab-TRAIL)。在一个实施方案中，Fab区包含全长重链。在另一个实施方案中，Fab区包含全长重链和轻链或其片段。在另一个实施方案中，Fab-TRAIL融合体可以二聚化为第二融合多肽链。在一个具体实施方案中，两条融合多肽链通过至少一个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条融合多肽链通过至少两个Fc间二硫键二聚化。在另一个实施方案中，两条融合多肽链通过至少三个Fc间二硫键二聚化。
在另一个实施方案中，Fab或其片段与接头融合至TRAIL多肽。在另一个实施方案中，接头是氨基酸接头。也可以在Fab区或抗体的重链和/或轻链可变区的一个或多个框架或连接区内进行修饰，只要保持这些修饰后的抗原结合亲和力即可。
在另一个实施方案中，Fab-TRAIL融合多肽包含与一组三种人TRAIL单体结合的人Fab部分或其片段，以形成单个无支链多肽，其包含以从氨基末端至羧基末端顺序的Fab部分、接头、第一TRAIL单体、单体间接头、第二TRAIL单体、第二单体间接头和第三TRAIL单体。在另一个实施方案中，Fab-TRAIL融合多肽包含天然野生型人TRAIL中未发现的至少一个、两个、三个或四个突变。示例性Fab-TRAIL融合多肽可包含与可溶性TRAIL(scTRAIL)多肽融合的抗-EpCAM Fab。
iv.白蛋白-TRAIL融合多肽
在另一个实施方案中，TRAIL多肽与白蛋白部分(例如，人血清白蛋白(HSA))连接。在另一个实施方案中，白蛋白-TRAIL融合多肽包含一个、两个或三个TRAIL单体。
在一个具体实施方案中，单个TRAIL融合多肽链包含与一组三种人TRAIL单体结合的肽的人血清白蛋白部分，以形成单个无支链多肽，其包含从氨基末端到羧基末端顺序的白蛋白部分、接头、第一TRAIL单体、单体间接头、第二TRAIL单体、第二单体间接头和第三TRAIL单体。
v.双特异性融合多肽
还提供了双特异性抗体融合体。在一个实施方案中，TRAIL多肽与双特异性抗体重链的C末端融合。本文的双特异性抗体包括对于相同或不同蛋白质的至少两种结合特异性，其优选结合非重叠或非竞争性表位。此类双特异性抗体可包括另外的结合特异性，例如对另一种抗原的第三种蛋白质结合特异性，例如致癌基因的产物。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。
E.产生TRAIL融合多肽的方法
本文所述的TRAIL融合蛋白可通过标准重组技术产生。用于重组生产的方法在现有技术中是众所周知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体并通常纯化至药学上可接受的纯度。为了在宿主细胞中表达结合蛋白，通过标准方法将编码各多肽的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞(如CHO细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母或大肠杆菌细胞)中进行表达，并从细胞(裂解后的上清液或细胞)回收结合蛋白。用于重组产生抗体的一般方法在现有技术中是公知的，并且描述于例如Makrides，S.C.,Protein Expr.Purif 17 183-202(1999)；Geisse,S.等，Protein Expr.Purif.8 271-282(1996)；Kaufman,R.J.，MoI.Biotechnol.16151-161(2000)；Werner,R.G.,Drug Res.48 870-880(1998)的综述文章中。
可以通过常规纯化方法将多肽适当地与培养基分离。通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的技术)，可以进行纯化以消除细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白质)。参见Ausubel,F.等,ed.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。已很好地建立并广泛用于蛋白质纯化的不同的方法，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白质A或蛋白质G亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如与β-巯基乙醇和其他SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附色谱(例如与苯基-琼脂糖，氮杂-嗜碱树脂或间氨基苯硼酸)，金属螯合亲和层析(例如，使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻色谱和电子理论方法(例如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75 93-102(1998))。编码多肽的DNA和RNA易于使用常规方法分离和测序。
F.患者人群
本文提供了用于治疗人类患者的癌症以及基于特定水平的生物标志物(例如DR4(TNFRSF10A)或cIAP1(BIRC2))选择患者已进行该治疗的的方法。在一个实施方案中，癌症选自结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、黑素瘤(例如、皮肤或眼内恶性黑素瘤)、浆液性卵巢癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃癌、胃食管癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌癌、癌症甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、脊髓轴肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌和间皮瘤。该方法也适用于治疗转移性癌症。
在一个实施方案中，患者在初次化疗后具有复发或持续疾病的证据。在另一个实施方案中，患者具有至少一种先前的基于铂的化疗方案，用于治疗原发性或复发性疾病。在另一个实施方案中，患者患有铂抗性或抵抗的癌症。在另一个实施方案中，患者在a)初次治疗或b)辅助治疗后具有复发或持续疾病的证据。
在另一个实施方案中，患者患有晚期癌症。在一个实施方案中，术语“晚期”癌症表示高于II期的癌症。另一方面，“晚期”是指通常推荐化疗的疾病阶段，其为以下任何一种：1.在复发性疾病的情况下：任何阶段或等级；2.IC阶段或更高，任何等级；3.IA或IB阶段，2级或3级；或4.不完全手术或手术后疑似残留疾病(无法进行进一步手术)：任何阶段或等级。
G.结果
可以使用任何合适的方法评估本文提供的治疗方法的功效。在一个实施方案中，所述治疗产生至少一种选自下组的治疗效果：肿瘤生长速率降低、肿瘤尺寸减小，转移性病变的数量随时间的减少、无进展存活的持续时间的增加、和总体反应率提高。本文提供的方法可以抑制肿瘤生长至少约10％，例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。
在一个实施方案中，本文所述的治疗方法导致大于50％的癌细胞死亡。在另一个实施方案中，治疗导致大于60％的癌细胞死亡、大于65％的癌细胞死亡、大于70％的癌细胞死亡、大于75％的癌细胞死亡、大于80％的癌细胞死亡、大于85％的癌细胞死亡、超过90％的癌细胞死亡、超过95％的癌细胞死亡、或100％的癌细胞死亡。
关于靶病变，对治疗的反应可包括：
完全反应(CR)：所有靶病变的消失。任何病理性淋巴结(无论目标还是非目标的)必须将短轴减少至10mm；
部分反应(PR)：以基线总和直径为参考，目标病变直径总和减少至少30％；
进行性疾病(PD)：以研究中的最小总和为参考(这包括基线总和，如果这是研究中最小的)，目标病变直径总和增加至少20％。除了相对增加20％之外，总和还必须表现出绝对增加至少5毫米。(注意：一个或多个新病灶的外观也被认为是进展)；和
稳定疾病(SD)：既没有足够的收缩率以符合PR，也没有足够的增加来符合PD，在研究时将最小总和直径作为参考。(注意：20％或更少的改变(直径总和不增加5mm或更多)被编码为稳定疾病)。为了获得稳定疾病的状态，在最小间隔为6周的研究进入后，测定必须至少一次达到稳定的疾病标准。
对于非靶病变，对治疗的反应可能包括：
完全反应(CR)：所有非靶病变的消失和肿瘤标志物水平的正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(短轴<10mm)。如果肿瘤标志物最初高于正常上限，则必须将患者标准化以便在完全临床反应中考虑；
非CR/非PD：持续存在一种或多种非靶病变和/或维持肿瘤标志物水平高于正常限值；和
进行性疾病(PD)：一种或多种新病变的出现和/或现有非靶病变的明确进展。明确的进展通常不应该胜过目标病变状态。它必须代表整体疾病状态的变化，而不是单一的病变增加。
在示例性结果中，根据本文公开的方法治疗的患者可以经历至少一种癌症迹象的改善。
在一个实施方案中，如此治疗的患者表现出CR，PR或SD。
在另一个实施方案中，如此治疗的患者经历肿瘤缩小和/或生长速率降低，即抑制肿瘤生长。在又一个实施方案中，可以发生以下一种或多种：癌细胞的数量减少，肿瘤大小减少，癌细胞浸润到外周器官被抑制、延迟、减慢或停止；肿瘤转移减慢或抑制，肿瘤生长受到抑制，预防或延迟肿瘤复发，或者一种或多种与癌症相关的症状在一定程度上得到缓解。
在其他实施方案中，通过减少可测定的肿瘤病变的数量和/或大小来测定这种改善。可测定的病变定义为可以通过CT扫描(CT扫描切片厚度不大于5mm)和通过临床检查的卡尺测定中的任一个或两者在至少一个维度(最长直径将被记录)中精确测定为＞10mm的病变，或通过胸部X射线＞20mm的病变。非靶病变(例如，病理性淋巴结)的大小，也可以进行测定改善。在一个实施例中，可以在胸部X射线或CT或MRI输出上测定病变。
在其他实施方案中，细胞学或组织学可用于评估对治疗的响应性。当可测定的肿瘤符合响应或稳定疾病的标准时，在治疗期间出现或恶化的任何积液的肿瘤起源的细胞学确认可以考虑用来区分响应或稳定疾病(积液可能是治疗的副作用)和进行性疾病。
H.试剂盒和制品
还提供了含有基于TRAIL的治疗或死亡受体激动剂的试剂盒和根据本文所述方法使用的说明书。试剂盒通常包括预定量的试剂的包装组合和说明书以及指示试剂盒内容物的预期用途的标签。标签或说明一词包括在套件上或与套件一起提供的任何书写或记录材料，或者在其制造、运输、销售或使用过程中随时随附的试剂盒。它可以由政府机构药品管理该药品或生物制品的制造、使用或销售，其通知反映了制造、使用或销售给予人或兽医用途的机构的批准。标签或说明书还可以包括广告传单和小册子，包装材料以及音频或视频说明。
例如，在一些实施方案中，试剂盒在合适的容器中的基于TRAIL的治疗或死亡受体激动剂，并且根据本文所述的治疗方案给药的说明。在一些实施方案中，试剂盒还包含另外的抗肿瘤剂。在一些实施方案中，基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂作为用于施用的剂量单位提供在合适的容器中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。
以下实施例仅是说明性的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围，因为本领域技术人员在阅读本公开后将会明白许多变化和等同物。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1：用于在CRC中推导预测性生物标志物的逻辑模型
基因表达数据用于训练预测对交联重组人TRAIL(rhTRAIL)的响应的逻辑模型。对于训练集，使用公开可用的数据：来自癌细胞系百科全书(CCLE)的基因表达数据和通过交联的rhTRAIL在一组CRC细胞系上的细胞活力变化。将AND和OR功能应用于来自BIOCARTA死亡途径基因列表的所有可能的基因对，以创建逻辑模型评分。发现了双基因生物标志物TNFRSF10AAND(非BIRC2)，其与交联rhTRAIL的最大抑制相关，并且自举预测这将具有统计学意义。
材料和方法
细胞系
结肠直肠细胞系购自/获得于美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，美国)，国家癌症研究所(NCI，Frederick，MD，美国)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，美国)，韩国细胞系库(KCLB，韩国首尔)，国立生物医学创新研究所(NIBIO，大阪，日本)，或日本研究生物资源采集细胞库(JCRB，大阪，日本)，如表1A和1B所示。除了SW1417细胞保持在100％空气气氛的培养箱中外，所有细胞在37℃，5％CO2中生长。所有细胞系的培养条件在表1A和1B中提供。所有生长培养基补充有10％热灭活的胎牛血清(HI FBS,Gibco LifeTechnologies,and Grand Island,NY,USA)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GibcoLife Technologies)。对于C2BBe-1细胞系，将0.01mg/mL人转铁蛋白(Sigma，Cat#T8158)与其他补充物一起加入生长培养基中。除了从ATCC获得的EMEM培养基外，细胞培养基购自Gibco Life Technologies。
细胞活力检测：
将结肠直肠细胞系在完全培养基中培养至亚融合。用胰蛋白酶(Gibco LifeTechnologies，Grand Island，NY，USA)分离细胞，用PBS pH 7.4(Gibco LifeTechnologies)洗涤一次并悬浮在完全新鲜的生长培养基中。如表1A和1B所示，将细胞以最佳密度接种在96孔板中，并使其在37℃下恢复过夜。然后用递增浓度(0-10nM)的重组人TRAIL(rhTRAIL，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)处理细胞。在处理后24小时，通过使用CellTiter-发光测定法(CTG，Promega Life Sciences，Madison，WI，USA)根据制造商的方案测定细胞ATP的量来确定存活力。从至少两个独立研究获得数据，并将发光标准化至未处理的对照。产生剂量-反应曲线，并使用MATLAB(Natick，MA，USA)计算Amax值。
表1A用于训练逻辑模型的细胞系
表1B用于测试逻辑模型的细胞系
处理RNAseq数据
CCLE联盟发布了933细胞系的原始RNA-Seq数据。使用RNA-Seq定量程序kallisto(N.L.Bray,H.Pimentel，P.Melsted,L.Pachter,A.Rxiv(2015))处理这些数据。该程序输出每个细胞系的基因丰度，然后将这些数据进行上分位数标准化。因为生物噪音经常发生与信号成比例，然后对数据进行log2标准化，使得结果不会被具有特定基因的高mRNA表达的样品所偏斜(skewed)。最后，为了使用逻辑模型中的数据，将每个基因的表达标准化为0和1之间的值，包括0和1。通过所有933个CCLE样品中该基因的第95百分位数和第5百分位数值对每个基因的表达进行标准化。
随后分析中包括的基因是那些在策划的可公开获得的BIOCARTA死亡途径中的基因(参见表2)。
表2：BIOCARTA死亡途径中的基因
构建逻辑模型
当考虑范围在0和1之间的连续变量X和Y时，可以使用以下等式描述逻辑门“AND”、“OR”和“NOT”：
NOT X＝1-X
X AND Y＝X*Y
X OR Y＝NOT((NOT X)AND(NOT Y))＝1-((1-X)*(1-Y))
为CCLE中所有CRC细胞系的所有基因对及其NOT值创建逻辑模型。剩余细胞百分比与逻辑模型评分相关。如果它们与实际可行性相关，至少与95％的加扰输出的相关性相关，模型被认为是非随机的。
选择最佳模型
一个报告细胞系对交联的rhTRAIL的响应的公开可用数据集被用作训练集以选择最具预测性的逻辑模型(P.M.Nair等，Proceedings of the National Academy ofSciences 112，5679-5684(2015))。来自结肠和盲肠的CCLE细胞系的细胞活力数据与逻辑模型评分相关。通过将加扰的可行性数据与逻辑模型评分相关联来执行自举法(Bootstrapping)。如果它们与实际可行性相关，至少与95％的加扰输出的相关性相关，逻辑模型被认为是非随机的。
用rhTRAIL测试模型
然后用rhTRAIL测试生物标记假设。将原始数据集中的14个细胞系以剂量依赖性方式暴露于rhTRAIL，并使用CellTiter Glo(CTG)测定法测定细胞活力。
在假设在新细胞系上得到验证之前，基于来自rhTRAIL数据集的逻辑模型评分，拟合线性模型以预测细胞活力。基于来自CCLE的RNA-Seq值计算另外9个CRC细胞系的逻辑模型评分(如对训练集所做的那样)并预测细胞活力，然后将其与每个细胞系的实际最小生存力的中值进行比较。
结果
生物标志物预测
发现细胞活力的最佳预测因子之一是DR4(TNFRSF10A)。TNFSFR10A是编码死亡受体4的基因，BIRC2是编码抗凋亡蛋白cIAP1的基因。该逻辑函数的输出越高，交联的rhTRAIL能够降低细胞活力越多。逻辑模型评分和细胞活力之间的皮尔逊相关性为-0.69。这是使用27个样品计算的。图1A中显示了逻辑模型拟合与剩余活细胞百分比的关系图。
自举分析表明，由逻辑函数TNFRSF10A AND(NOT BIRC2)得到的预测因子与实际响应之间的相关性优于来自1000次加扰数据集中的974次的最佳预测因子之间的相关性(即，p＝0.026)。这表明生物标志物数据不是随机的。因此，该模型提出DR4和cIAP1是TRAIL信号传导途径中最敏感的节点。该模型表明，如果DR4不存在，rhTRAIL不能从细胞外传输其信号。如果cIAP1水平过高，则抗凋亡信号将压制来自TRAIL的凋亡信号，因此需要高DR4和低cIAP1的平衡以使rhTRAIL诱导细胞凋亡。
在原始公开数据集中观察到的相同趋势在暴露于rhTRAIL的细胞系的一个较小数据集的测定中有效：发现每个细胞系的最大细胞活力抑制中位数与来自函数TNFRSF10AAND(NOT BIRC2)的逻辑评分相关。表3总结了模型训练集的CTG数据，使用了11个CRC细胞系，其与原始公开可用数据集重叠，该数据集用于拟合回归模型以从逻辑模型评分预测细胞活力。
表3在rhTRAIL存在下的最小细胞活力百分比
图1B中显示了逻辑模型输出、细胞活力百分比和拟合的图。回归模型(红线)适合于预测响应于10nM rhTRAIL的细胞活力作为逻辑模型评分的函数。使用来自11个细胞系中的10个的数据进行回归。由于MDST8(逻辑模型评分＝0.14，细胞活力＝6％)显然是一个异常值，因而从拟合中排除以创建预测模型。回归模型是：剩余的活细胞百分比＝86.7-122.0*(逻辑模型评分)。
然后将不是原始公开可用数据集的一部分的另外九个CRC细胞系暴露于rhTRAIL并测定细胞活力。基于CCLE数据，这些细胞系表达不同水平的DR4和cIAP1。
表4总结了来自测试组的CTG数据，其使用暴露于rhTRAIL的9个额外CRC细胞系以验证生物标志物假设。
表4在rhTRAIL存在下的最小细胞活力百分比
细胞系 Rep1 Rep2 Rep3 Rep4
CCK81 1.529686285 1.374531 5.771396 7.869524
GP2D 0.16305234 0.241734 0.342833 0.372376
LS123 67.20183486 70.06956 75.84583 68.95748
LS411N 31.07165504 32.54284 38.96952 37.78724
NCIH747 79.04129962 76.26916 82.04991 77.21605
RCM1 29.65709729 32.19447 43.95882 41.24717
SNU175 0.929614874 0.683234 0.445765 0.418994
SNUC2A 45.30132789 38.03599 23.17659 27.46143
SW1417 76.70129567 76.93096 58.28165 65.0076
表5总结了使用暴露于rhTRAIL以验证生物标志物假设的另外9个CRC细胞系从测试组中标准化的DR4和cIAP1水平。
表5测试集中的标准化DR4和cIAP1水平
细胞系 DR4 cIAP1
SW1417 0.64 0.31
LS123 0.69 0.81
RCM1 0.79 0.54
GP2D 0.80 0.20
SNUC2A 1.00 0.46
SNU175 0.79 0.35
NCIH747 0.74 0.76
LS411N 0.73 0.33
CCK81 0.81 0.15
将细胞系以剂量依赖性方式暴露于rhTRAIL(4个重复/细胞系)。记录最小细胞活力。
逻辑模型正确地预测了9个额外细胞系中的8个作为rhTRAIL的响应者或非响应者的反应，使用50％抑制截止值(例如，治疗后细胞死亡率超过50％的细胞系归类为响应者，治疗后细胞死亡率小于50％的细胞系为非响应者)，并且预测实际存活率在6个细胞系的至少一个测定值的10％内。预测与实际细胞活力的关系如图1C所示。总之，这些结果表明，肿瘤具有高水平DR4和低水平cIAP1的患者可能对用死亡受体激动剂治疗有利地响应。
实施例2：癌症基因组信息的分析
对来自癌症基因组图谱(TCGA)的结肠直肠数据进行分析，以预测对TRAIL有反应的群体的比例。简而言之，在所有适应症的所有样品中对每个样品的基因表达进行标准化。图2A显示CRC肿瘤样品中标准化DR4水平的直方图。分布明显偏向右侧，表明大多数CRC肿瘤样本具有高水平的DR4。图2B显示了CRC肿瘤样品中标准化的cIAP1水平的直方图，其向左倾斜。图2C显示了基于标准化DR4和cIAP1水平的CRC肿瘤样品的生物标志物评分的分布。应注意，58％的样品具有大于0.5的生物标志物评分，这对应于预测的细胞存活率降低75％。21％的样本的生物标志物评分大于0.7，预计完全根除肿瘤细胞。
对来自TCGA的正常结肠直肠组织样品进行类似分析。图2D中显示了正常结肠直肠组织样品的生物标志物评分的直方图。值得注意的是，只有12％的样本评分大于0.5，没有样本的评分大于0.7，这表明TRAIL治疗可能对正常的结直肠组织没有毒性。
实施例3：DR4/cIAP1mRNA表达比与对基于TRAIL的治疗响应相关
用不同浓度的rhTRAIL(0-10nM)处理结肠直肠细胞系24小时。使用CellTiter-Glo发光测定法在10nM(Cmax)下评估抗肿瘤活性(活力)。图3A显示处理后指定细胞系的存活率百分比。具有80％活力丧失的细胞系被分类为敏感细胞系，其余为抗性细胞系。与抗性细胞系相比，敏感细胞系显示出显著更高的DR4/cIAP1mRNA表达比(图1B和1C)。
目前的TRAIL激动剂(即rhTRAIL)具有差的药代动力学特性和/或具有低效力。然而，Fc-TRAIL(例如，Fc-T191)是单个融合多肽，其由Fc区然后是靶向DR4和DR5的三个连续TRAIL单体组成，其在小鼠PK研究中显示出优异的终末半衰期。Fc-T191显示与rhTRAIL相当的活性，相关系数＝0.92。因此，对rhTRAIL反应良好的大多数CRC细胞系也对Fc-T191反应良好(图4)。
Colo205细胞系用于测试体内生物标志物假设，因为它具有高DR4(TNFRSF10A)和低cIAP1(BIRC2)表达，即高DR4/cIAP1比。单独用Fc-T191(10mg/kg IP)处理显著抑制肿瘤生长(图5A)。值得注意的是，分别具有相对低的DR4/cIAP1比的RKO和KM12细胞系的生长在很大程度上不受Fc-T191处理的影响(图5B和5C)。这些结果表明高DR4(TNFRSF10A)和低cIAP1(BIRC2)水平预示TRAIL治疗将是成功的。
实施例4：死亡受体和cIAP1的敲低改变了CRC细胞系对TRAIL的反应，表明双基因生物标志物与反应之间的机制关系
由于使用计算模型确定了DR4和cIAP1为潜在的生物标志物特征，因此测试了在LIM-1215和HCT116细胞中的DR4或DR5响应于Fc-T191治疗的功能作用。
材料和方法
RNA沉默/转染
靶向人DR4、DR5和cIAP1基因的SiRNA和通用乱序siRNA获自IDT(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA，USA)，并且siRNA序列如下：
siDR4-Duplex-1 GGAACUUUCCGGAAUGACAAUUCTG(SEQ ID NO:41)
siDR4-Duplex-2 GGACAAUGCUCACAACGAGAUUCTG(SEQ ID NO:42)
siDR4-Duplex-3 CAGAAUCUCGUUGUGAGCAUUGUCCUC(SEQ ID NO:43)
siDR5-Duplex-1 GUCACAUGACCGGUACUGGAAGAAA(SEQ ID NO:44)
siDR5-Duplex-2 UACCUUCUAGAUACAUGAACUUUCCAG(SEQ ID NO:45)
siDR5-Duplex-3 UCUGAGACAGUGCUUCGAUGACUTT(SEQ ID NO:46)
SiCIAP-1Duplex-1 AAUGAUGCAUAACAAGCAGUGACACUA(SEQ ID NO:47)
SiCIAP-1Duplex-2 AUACCUUUACAAGCGAGAGAACUGA(SEQ ID NO:48)
SiCIAP-1Duplex-3 UUGGAAUAUACUUCAUAUUCUUAUCCA(SEQ ID NO:49)
使用不含抗生素的9ul RNAi-Max(Invitrogen)转染试剂，将HCT116、LIM1215细胞(800,000)在具有SiRNA库的6孔板中逆转染(DR4，DR5和cIAP1单独总共30pmol，或DR4-和DR5组合15pmol)。用PBS洗涤细胞并在转染后培养2天，用胰蛋白酶消化并重新铺板于96孔板(10,000个细胞/孔)中，并用递增浓度的Fc-T191处理24小时(0-30uM剂量)，一式三份。24小时后测定CTG读数。同时制备细胞溶液以使用蛋白质印迹分析验证敲低。
蛋白质印迹分析
转染后48小时，用冰冷的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4(Gibco)洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶(Gibco)胰蛋白酶化，并收集到15ml管中。将细胞沉淀并用冰冷的PBS洗涤一次，然后加入250μl裂解缓冲液(RIPA裂解和提取缓冲液(Thermo Scientific)+蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma)，1mM原钒酸钠，10mM焦磷酸钠，50μM苯基胂，10μM bpV，10mM B-甘油磷酸盐，1M氟化钠)。将细胞裂解物在冰上孵育至少30分钟；然后转移到1.5ml微量离心管中并在-80℃下储存。根据制造商的方案，使用BCA测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。
将蛋白质样品(20μg)上样到Criterion XT 4-12％Bis-Tris凝胶(Biorad)上，并在120V下通过凝胶电泳分离。使用IBLOT Dry Blotting System(Invitrogen)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在室温下在ODYSSEY封闭缓冲液(LI-COR)中封闭1小时，然后在4℃下与在Odyssey封闭缓冲液/PBST(1:1混合物)中稀释的一抗孵育过夜(DPBS(Gibco)+0.1％TWEEN 20)。使用针对以下蛋白质的抗体：CIAP1(1:400，R&D系统AF8181，DR4(1:500，Abcam，ab8414)，DR5(1:400，Abcam，ab8416)和GAPDH(1:1000Cell SignalingTechnology，#2118)。次日用PBST洗涤膜并与第二抗体孵育：IRDYE 800CW山羊抗兔IgG(H+L)或IRDYE 800CW驴抗山羊IgG(H+L)(LI-COR)在室温下孵育1小时。在PBST中再次洗涤膜并使用ODYSSEY CLx成像系统(LI-COR)成像。
细胞活力测定
将结肠直肠细胞系在完全培养基中培养至亚融合。用胰蛋白酶(Gibco LifeTechnologies，Grand Island，NY，USA)分离细胞，用PBS(Gibco Life Technologies)洗涤一次并悬浮在完全新鲜的生长培养基中。将细胞以表1A和1B中给出的理想密度接种在96孔板中，并使其在37℃下恢复过夜。然后用递增浓度的内部化合物Fc-T191(0-30nm，3倍稀释)作为单一试剂处理细胞。在处理后24小时，通过使用CellTiter-Glo发光测定法(CTG，Promega Life Sciences，Madison，WI，USA)根据制造商的方案测定细胞ATP的量来确定存活力。将发光值标准化为未处理的对照。使用MATLAB(Natick，MA，USA)产生剂量-反应曲线。
结果
与转染的乱序(非靶向)siRNA的细胞相比，cIAP1(BIRC2)低LIM1215细胞中的SiRNA介导的DR4而非DR5的敲低使得它们对Fc-T191的响应性较低(图6A-6C)。然而，与单独的DR4敲低相比，DR4和DR5的组合敲低进一步阻碍细胞响应Fc-T191(图6B-6C)。
与用乱序siRNA转染的细胞相比，单独的DR4或DR5的敲低对高cIAP(BIRC2)HCT116细胞没有显著影响(图7A-7C)。然而，DR4和DR5的组合敲低使得HCT116细胞对甚至高浓度的Fc-T191更具抗性(图7B-7C)。值得注意的是，cIAP1(BIRC-2)的敲低进一步使HCT116细胞对Fc-T191敏感(图7B-7C)。这些结果表明Fc-T191通过DR4或DR5诱导的细胞死亡是细胞类型依赖性的，并且cIAP1可能导致对Fc-T191诱导的细胞死亡的抗性。
实施例5：TRAIL敏感性PDX模型表达相对高的DR4(TNFRSF10A)和低cIAP1(BIRC2)水平。
为了进一步验证生物标志物假设，使用源自患者的异种移植物(PDX)结肠直肠癌模型来评估生物标志物水平和对rhTRAIL和Fc-T191治疗的敏感性(患者样品：TX-CRC-066，-096，-088，-206，-169和-171)。
材料和方法
来源于细胞系的异种移植小鼠结肠直肠癌模型
将6周龄和18-20g体重的裸鼠(NU-Foxn1nu；Charles River Laboratories)在右侧皮下注射含有50％基质胶(Corning)的RKO或HCT116细胞系(5e6)的悬浮液。使用数字卡尺进行肿瘤测定，并使用以下等式计算肿瘤体积：π/6(L x W^2)，其中“W”是最大宽度，“L”是最大长度。当肿瘤具有足够的大小(100-250mm3)时，将小鼠随机分成对照组和实验组。小鼠接受PBS(pH 7.4)作为载体对照或以指定剂量的Fc-T191。在研究期间监测肿瘤体积和体重。在最后一次测定后，收获肿瘤用于组织学评估。为了确定治疗组之间的统计学差异，使用接种后第22天肿瘤体积的分数变化进行t检验分析。
源自结肠直肠癌的患者来源的异种移植小鼠模型
TX-CRC-066、-096、-088、-206、-169、-171，源自患者的结肠直肠癌片段获自TexasTech University，Cancer Center。5至8周龄的雌性NOD-SCID小鼠购自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)。在异氟醚吸入麻醉下，于皮下开一小袋后，将30至60mm3的片段皮下移植到NOD-SCID小鼠的背侧。切口部位用外科钉固定。然后在研究期间监测小鼠的肿瘤生长。使用数字卡尺进行肿瘤测定，并使用以下等式计算肿瘤体积：(L x W^2)/2，其中“W”是最大宽度，“L”是最大长度。将成功的异种移植物随后传代到新的宿主小鼠中。在第3或第4代，当移植的肿瘤的体积达到足够的大小(～100-250mm3)时，将小鼠随机分成对照组和实验组，每组5至7只动物。用PBS或Fc-T191处理动物。在整个研究中每周监测肿瘤体积和体重两次。在最后一次测定后，获取肿瘤用于组织学评估(IHC)。
逆转录酶和PCR分析
将结肠直肠细胞系在完全培养基中培养至亚融合。胰蛋白酶消化的细胞用PBS洗涤，并根据制造商的说明书所述使用来自Qiagen的RNeasy试剂盒分离总RNA。使用相同的试剂盒从PDX组织中分离RNA。然后根据制造商的方案使用Applied Biosystems HighCapacity cDNAReverse Transcription Kit(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)逆转录1μg总RNA。为了量化转录的基因特异性RNA，然后使用针对TNFRSF10A、BIRC2、ACTB、RPL4和PPP2CA使用 Fast Advanced Master Mix和TaqMan Gene ExpressionAssays(均来自Applied Biosystems)扩增cDNA(每个TaqMan分析的3个技术重复)。
反应在QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR系统(Life Technologies,GrandIsland，NY,USA)在Life Technologies推荐的循环条件下进行。使用默认阈值设置确定阈值循环(Ct)值。Ct定义为荧光通过固定阈值的分数循环数。应用2-ΔCt等式计算TNFRSF10A、BIRC2的RNA表达，其中ΔCt＝Ct(TNFRSF10A或BIRC2基因)-Ct(持家基因的几何平均值)。
结果
TX-CRC-066、-096、-088和-206被归类为敏感肿瘤模型，因为Fc-T191处理后肿瘤大小显著减少(5mg/kg一次/周)。相反，抗性PDX模型-169和-171对Fc-T191的相似浓度和给药方案的响应并未显示出明显的生长抑制。TX-CRC-096和TX-CRC-0169对Fc-T191的体内响应分别在图6A和6B中显示为TRAIL敏感性和TRAIL抗性PDX模型的实例。
还测试了敏感和抗性PDX模型中DR4(TNFRSF10A)和cIAP1(BIRC2)的表达，并与对TRAIL治疗的反应相关。如所预期的，与2种抗性PDX模型相比，四种敏感PDX模型显示更高的DR4/cIAP1mRNA表达比(图9)。通过蛋白质印迹分析和/或IHC进一步蛋白质水平的测定进一步证实了与抗性模型相比，敏感PDX模型中DR4更高表达和cIAP1更低表达(图10)。这些结果进一步表明高DR4(TNFRSF10A)和低cIAP1(BIRC2)水平可预测对TRAIL治疗的响应。
等同
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述具体实施方案的许多等同。这些等同旨在由所附的权利要求涵盖。任何多个从属权利要求或实施例中公开的实施方案的任何组合都涵盖在本公开的范围内。
通过参考方式引入
本文提及的每个美国和外国专利以及待审专利申请和公开的公开内容通过引用整体并入本文，任何序列表和附图的内容也是如此。
序列表
序列表
<110> 梅里麦克制药股份有限公司
<120> 用基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂选择和治疗患者的方法
<130> MMJ-100PC
<140>
<141>
<150> 62/458,824
<151> 2017-02-14
<150> 62/349,497
<151> 2016-06-13
<160> 50
<170> PatentIn 版本号 3.5
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
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Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
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Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
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Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
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Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
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His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
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Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
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Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
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Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
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<210> 2
<211> 468
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val
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Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala
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Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile Glu Pro Arg
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Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg
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Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val
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Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu
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Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
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Gly Lys Leu Ser Asn Trp Glu Pro Lys Asp Asp Ala Met Ser Glu His
225 230 235 240
Arg Arg His Phe Pro Asn Cys Pro Phe Leu Glu Asn Ser Leu Glu Thr
245 250 255
Leu Arg Phe Ser Ile Ser Asn Leu Ser Met Gln Thr His Ala Ala Arg
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Met Arg Thr Phe Met Tyr Trp Pro Ser Ser Val Pro Val Gln Pro Glu
275 280 285
Gln Leu Ala Ser Ala Gly Phe Tyr Tyr Val Gly Arg Asn Asp Asp Val
290 295 300
Lys Cys Phe Cys Cys Asp Gly Gly Leu Arg Cys Trp Glu Ser Gly Asp
305 310 315 320
Asp Pro Trp Val Glu His Ala Lys Trp Phe Pro Arg Cys Glu Phe Leu
325 330 335
Ile Arg Met Lys Gly Gln Glu Phe Val Asp Glu Ile Gln Gly Arg Tyr
340 345 350
Pro His Leu Leu Glu Gln Leu Leu Ser Thr Ser Asp Thr Thr Gly Glu
355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Arg Met Ala Leu Phe Gln Gln Leu Thr Cys Val Leu Pro Ile Leu Asp
465 470 475 480
Asn Leu Leu Lys Ala Asn Val Ile Asn Lys Gln Glu His Asp Ile Ile
485 490 495
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500 505 510
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Met Lys Tyr Ile Pro Thr Glu Asp Val Ser Gly Leu Ser Leu Glu Glu
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565 570 575
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595 600 605
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610 615
<210> 4
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
polypeptide
<400> 4
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
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340 345 350
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530
<210> 5
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
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530
<210> 6
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
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<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<400> 7
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
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<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 9
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 10
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
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210 215 220
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
245 250 255
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Trp Thr Asp Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Trp Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 11
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val
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195 200 205
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Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu
305 310 315 320
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325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 12
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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115 120 125
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val
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225 230 235 240
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 13
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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225 230 235 240
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340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
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Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 14
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
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515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 15
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
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Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 16
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
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Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly
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Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
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405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
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500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 17
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
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Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 18
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
85 90 95
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
115 120 125
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val
180 185 190
Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp
210 215 220
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
245 250 255
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 19
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
85 90 95
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
100 105 110
Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
115 120 125
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val
180 185 190
Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp
210 215 220
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
245 250 255
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 20
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
85 90 95
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
100 105 110
Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
115 120 125
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val
180 185 190
Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp
210 215 220
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
245 250 255
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 21
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
85 90 95
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
100 105 110
Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
115 120 125
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val
180 185 190
Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp
210 215 220
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
245 250 255
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
260 265 270
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
275 280 285
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp
290 295 300
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
325 330 335
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg
355 360 365
Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly
370 375 380
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
405 410 415
Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
435 440 445
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
450 455 460
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
465 470 475 480
Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
485 490 495
Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser
500 505 510
Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
515 520 525
Gly Ala Phe Leu Val Gly
530
<210> 22
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
260 265 270
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
305 310 315 320
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
325 330 335
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
340 345 350
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile
420 425 430
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
465 470 475 480
Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
485 490 495
Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys
500 505 510
Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
515 520 525
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys
530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 23
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
260 265 270
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
305 310 315 320
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
325 330 335
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
340 345 350
Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
420 425 430
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
465 470 475 480
Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
485 490 495
Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys
500 505 510
Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
515 520 525
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys
530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 24
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
260 265 270
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
305 310 315 320
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
325 330 335
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
340 345 350
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
420 425 430
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 25
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
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435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
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Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
485 490 495
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500 505 510
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580 585 590
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 26
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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195 200 205
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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325 330 335
Tyr Ile Tyr Lys Trp Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
340 345 350
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile
420 425 430
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
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Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu
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Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
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690 695 700
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Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 27
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
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435 440 445
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Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
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625 630 635 640
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675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Trp Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 28
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
260 265 270
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Trp Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
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Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 29
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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165 170 175
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
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435 440 445
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485 490 495
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545 550 555 560
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565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
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610 615 620
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 30
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 31
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
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580 585 590
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Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
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Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 32
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 33
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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245 250 255
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275 280 285
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405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
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Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
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Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
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Tyr Gln Gly Gly Val Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 34
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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545 550 555 560
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565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 35
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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485 490 495
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580 585 590
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595 600 605
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Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 36
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
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325 330 335
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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580 585 590
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595 600 605
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 37
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 38
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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65 70 75 80
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165 170 175
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile
420 425 430
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435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
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500 505 510
Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
515 520 525
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys
530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ile Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 39
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
260 265 270
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
275 280 285
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
290 295 300
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
305 310 315 320
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
325 330 335
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
340 345 350
Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
370 375 380
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
385 390 395 400
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
420 425 430
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
435 440 445
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
450 455 460
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
465 470 475 480
Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
485 490 495
Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys
500 505 510
Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
515 520 525
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys
530 535 540
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu
545 550 555 560
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
565 570 575
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
595 600 605
Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Gly
610 615 620
Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala
625 630 635 640
Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser
645 650 655
Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu
660 665 670
Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu
675 680 685
Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
690 695 700
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala
705 710 715 720
Arg Ser Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile
725 730 735
Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val
740 745 750
Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe
755 760 765
Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
770 775
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 41
ggaacuuucc ggaaugacaa uuctg 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 42
ggacaaugcu cacaacgaga uuctg 25
<210> 43
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 43
cagaaucucg uugugagcau uguccuc 27
<210> 44
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 44
gucacaugac cgguacugga agaaa 25
<210> 45
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 45
uaccuucuag auacaugaac uuuccag 27
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
<400> 46
ucugagacag ugcuucgaug acutt 25
<210> 47
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 47
aaugaugcau aacaagcagu gacacua 27
<210> 48
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 48
auaccuuuac aagcgagaga acuga 25
<210> 49
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 49
uuggaauaua cuucauauuc uuaucca 27
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (19)

1.一种治疗患有已被确定为具有高水平DR4的结肠直肠癌的患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。
2.一种治疗患有已被确定为具有高水平DR4和低水平cIAP1的结肠直肠癌的患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的基于TRAIL的治疗剂或死亡受体激动剂。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用基于TRAIL的治疗剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基于TRAIL的治疗剂是交联的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基于TRAIL的治疗剂是PEG化的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基于TRAIL的治疗剂是rhTRAIL。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基于TRAIL的治疗剂是TRAIL多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述TRAIL多肽是Fc-TRAIL融合多肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述Fc-TRAIL融合多肽是Fc-T191(SEQ ID NO:28)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DR4的水平足够高并且所述cIAP1的水平足够低以使得所述治疗引起大于50％的癌细胞死亡。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述结肠直肠癌的DR4/cIAP1比为至少约0.5。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述DR4/cIAP1比为至少约1.0。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用DR4激动剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用DR5激动剂。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用双重DR4/DR5激动剂。
16.一种治疗患有已被确定为具有至少约0.5的DR4/cIAP1比的结肠直肠癌的患者的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:28的Fc-TRAIL融合多肽。
17.一种治疗患有已被确定为具有至少约0.5的DR4/cIAP1比的结肠直肠癌的患者的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的DR4、DR5或DR4/DR5激动剂。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述患者患有已被确定为具有至少约0.7的DR4/cIAP1比的结肠直肠癌。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述患者患有已被确定为具有至少约1.0的DR4/cIAP1比的结肠直肠癌。
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