JP2019517570A - Trailベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを用いて患者を選択および治療する方法 - Google Patents
Trailベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを用いて患者を選択および治療する方法 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書には、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストによる治療から利益を受ける癌患者(例えば、結腸直腸癌)をそのDR4およびcIAP1のレベルに基づき特定する方法が提供される。癌(例えば、結腸直腸癌)であると診断された患者をそのDR4およびcIAP1のレベルに基づき治療する方法も提供される。また、特定レベルの1つまたは複数のバイオマーカー(DR4および/またはcIAP1)を有すると判定された癌患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療する方法も提供される。【選択図】なし
Description
(関連出願)
本願は、2016年6月13日に出願された米国特許仮出願第62/349,497号および2017年2月14日に出願された米国特許仮出願第62/458,824号に対する優先権を主張するものである。上記出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、2016年6月13日に出願された米国特許仮出願第62/349,497号および2017年2月14日に出願された米国特許仮出願第62/458,824号に対する優先権を主張するものである。上記出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
Apo2L/TRAIL(腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド、CD253としても知られる)は、細胞死受容体(特にDR4およびDR5)に結合し活性化させるTNFファミリーのメンバーである。TRAILは、非シグナル伝達デコイ受容体であるDcR1、DcR2およびオステオプロテジェリン(OPG)にも結合する。TRAILは、天然では2型膜貫通タンパク質として存在し、切断されて可溶性三量体タンパク質を解離することができる細胞外ドメインを有する。細胞死受容体による効率的なシグナル伝達およびアポトーシス誘導には、例えばTRAILの三量体構造を介する、受容体複合体のクラスター化が必要である。さらに、受容体複合体のさらに高次のオリゴマー化によりシグナル伝達が増幅され、より大規模なアポトーシス誘導が起こり得る。
TRAILは、癌細胞に優先的にアポトーシスを誘導することが可能であることから、長年にわたって、TRAILおよびその腫瘍学における可能性に関心が持たれてきたが、組換えヒトTRAIL(rhTRAIL)およびその他の細胞死受容体アゴニストの臨床的成果は少ない。このように臨床的成果がほとんど上がっていないことの原因であると考えられる2つの因子として、最適以下のアゴニスト設計および患者の腫瘍の内因性抵抗性が挙げられる。
本開示はこの必要性に対処し、さらなる利点を提供するものである。
本明細書には、細胞死受容体アゴニストのTRAILベースの治療剤による治療から利益を受ける癌患者(例えば、結腸直腸癌患者)をその特定レベルのDR4および/またはcIAP1発現に基づき特定する方法が提供される。また、特定レベルの1つまたは複数のバイオマーカー(DR4および/またはcIAP1)を有すると判定された癌患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療する方法も提供される。
別の態様では、2遺伝子予測バイオマーカーにより応答患者の特定が可能である。この後者の態様は、TRAIL細胞シグナル伝達経路では細胞死受容体4(DR4)と細胞内アポトーシス阻害因子1(cIAP1)が重要なノードとなっているという観察に基づくものである。細胞死受容体4(DR4)のレベルが高くcIAP1のレベルが低い場合、TRAILアンタゴニストまたは細胞死受容体(DR4またはDR5)アゴニストによる治療が細胞死の誘導、ひいては腫瘍サイズの縮小に極めて効果的であることが明らかにされている。
一実施形態では、患者のDR4のレベルが十分に高く、患者のcIAP1のレベルが十分に低いため、患者を治療することにより50%超の癌細胞死が得られる。別の実施形態では、治療により60%超の癌細胞死、65%超の癌細胞死、70%超の癌細胞死、75%超の癌細胞死、80%超の癌細胞死、85%超の癌細胞死、90%超の癌細胞死、95%超の癌細胞死または100%の癌細胞死が得られる。一実施形態では、癌(例えば、結腸直腸癌)であると診断され、DR4のレベルが高くcIAP1のレベルが低い腫瘍を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを治療有効量投与することを含む。
別の態様では、1遺伝子予測バイオマーカーにより応答患者の特定が可能である。例えば、一実施形態では、DR4のレベルが十分に高いため、患者を治療することにより50%超の癌細胞死が得られる。別の実施形態では、治療により60%超の癌細胞死、70%超の癌細胞死、80%超の癌細胞死、90%超の癌細胞死または100%の癌細胞死が得られる。
一実施形態では、癌(例えば、結腸直腸癌)であると診断され、DR4および/またはcIAP1のレベルが高い腫瘍を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、細胞死受容体アゴニストを治療有効量投与することを含む。一実施形態では、細胞死受容体アゴニストはDR4アゴニストである。別の実施形態では、細胞死受容体アゴニストはDR5アゴニストである。別の実施形態では、細胞死受容体アゴニストはDR4/5二重アゴニストである。
別の実施形態では、癌(例えば、結腸直腸癌)であると診断され、DR4および/またはcIAP1のレベルが高い腫瘍を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、TRAILベースの治療剤を治療有効量投与することを含む。様々な実施形態では、このようなTRAILベースの治療剤は、架橋、ペグ化または組換えヒトtrail(rhTRAIL)であり得る。一実施形態では、TRAILベースの治療剤はTRAILポリペプチドである。別の実施形態では、TRAILポリペプチドはTRAIL単量体、二量体または三量体である。別の実施形態では、TRAILポリペプチドは少なくとも1つの安定化変異を含む。別の実施形態では、TRAILポリペプチドはFc−TRAIL融合ポリペプチドである。別の実施形態では、TRAILポリペプチドは、「Fc−T148」、「Fc−T151」、「Fc−T153」、「Fc−T182」、「Fc−T183」、「Fc−T186」、「Fc−T191」、「Fc−T196」、「Fc−T202」、「Fc−T203」、「Fc−T204」、「Fc−T205」、「Fc−T206」、「Fc−T207」、「Fc−T208」、「Fc−T209」、「Fc−T210」および「Fc−T211」(それぞれ配列番号22〜39)からなる群より選択されるFc−TRAIL融合ポリペプチドである。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T191(配列番号28)である。
DR4および/またはcIAP1のレベルは、RNAまたはタンパク質の測定を含めた任意の適切な技術により測定することができる。一実施形態では、RT−PCR、定量的蛍光発生RT−PCRまたはRNA−ISHによりDR4および/またはcIAP1のRNAレベルを測定する。別の実施形態では、免疫組織化学法(IHC)、酵素結合免疫測定法(ELISA)またはウエスタンブロット法によりDR4および/またはcIAP1のタンパク質レベルを測定する。
一実施形態では、患者試料は、DR4 IHCスコアが1以上、2以上または3以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RNA−ISHスコアが1+以上、2+以上または3+以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RT−PCRスコアが−5以上であると判定される。
別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 IHCスコアが0、1以下または2以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RNA−ISHスコアが0、1+以下または2+以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RT−PCRスコアが5以下であると判定される。
別の実施形態では、バイオマーカーをcIAP1に対するDR4の比(すなわち、DR4/cIAP1)として測定する。一実施形態では、相対DR4/cIAP1比は、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9または少なくとも約2.0である。別の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.5である。別の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.7である。
別の実施形態では、DR4/cIAP1比が少なくとも約0.5であると判定された癌(例えば、結腸直腸癌)を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、TRAILベースの治療剤(例えば、TRAIL−ポリペプチドまたはFc−TRAIL融合ポリペプチド、例えばFc−T191(配列番号28)など)または細胞死受容体アゴニスト(例えば、DR4、DR5またはDR4/DR5アゴニスト)を治療有効量投与することを含む。
別の実施形態では、DR4/cIAP1比が少なくとも約0.5であると判定された結腸直腸癌を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、配列番号28を含むFc−TRAIL融合ポリペプチドを治療有効量投与することを含む。
別の実施形態では、この方法は、(1)癌のDR4/cIAP1比を判定することと、(2)DR4/cIAP1比が約0.5以上である場合にTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを投与することとを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、単独療法としてのTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与を含む。別の態様では、癌(例えば、結腸直腸癌)を有する患者に対し、治療法を選択する、または治療を実施する方法が提供され、この方法は、患者由来の少なくとも1つの癌細胞試料のDR4/cIAP1比を判定し、その比が少なくとも約0.5である場合、患者に対し、1)有効量のTRAILベースの治療剤もしくは細胞死受容体アゴニストによる治療を選択すること、および/または2)有効量のTRAILベースの治療剤もしくは細胞死受容体アゴニストを投与することを含む。一実施形態では、DR4/cIAP1比は、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9または少なくとも約2.0である。特定の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.5である。別の特定の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.7である。
別の態様では、細胞死受容体アゴニストのTRAILベースの治療剤による治療から利益を受ける癌患者(例えば、結腸直腸癌患者)をその特定レベルのDR4および/またはcIAP1発現に基づき特定する方法が提供され、その特定はDR4およびcIAP1のレベルにのみ基づくものである。例えば、この方法は、以下のバイオマーカー:APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2およびXIAPの1つまたは複数のもののレベルを測定することを含まない。別の実施形態では、この方法は、DR4およびcIAP1ならびに1つまたは複数の追加のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、1つまたは複数の追加のバイオマーカーは、APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2および/またはXIAPではない。
別の態様では、特定レベルの1つまたは複数のバイオマーカー(DR4および/またはcIAP1)を有すると判定された癌患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療する方法が提供され、患者を治療するという決定は、Dr4および/またはcIAP1のレベルにのみ基づくものである。例えば、患者の以下のバイオマーカー:APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2およびXIAPの1つまたは複数のもののレベルは、この方法の一環として評価されていない。別の実施形態では、患者を治療するという決定は、Dr4および/またはcIAP1ならびに1つまたは複数の追加のバイオマーカーのレベルに基づくものであり、1つまたは複数の追加のバイオマーカーは、APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2および/またはXIAPではない。
(詳細な説明)
本明細書には、TRAILベースの治療剤(例えば、rhTRAILまたはTRAILポリペプチド)または細胞死受容体アゴニストによる治療に応答する癌患者(例えば、結腸直腸癌)を特定する方法が提供される。
本明細書には、TRAILベースの治療剤(例えば、rhTRAILまたはTRAILポリペプチド)または細胞死受容体アゴニストによる治療に応答する癌患者(例えば、結腸直腸癌)を特定する方法が提供される。
定義
便宜上、本明細書、実施例および請求項で使用される特定の用語および語句の意味を以下に記載する。
便宜上、本明細書、実施例および請求項で使用される特定の用語および語句の意味を以下に記載する。
本明細書で使用される「comprising(〜を含む)」は、「including(〜を含む)」、「containing(〜を含む)」または「characterized by(〜を特徴とする)」と同義であり、包括的またはオープンエンドなものであり、記載されていないほかの要素も方法の段階も除外しない。本明細書で使用される「consisting of(〜からなる)」は、請求項の要素に記載されないあらゆる要素、段階または成分を除外する。本明細書で使用される「consisting essentially of(〜から実質的になる)」は、請求項の基本的で新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料も段階も除外しない。本明細書の各場合において、「comprising(〜を含む)」、「consisting essentially of(〜から実質的になる)」および「consisting of(〜からなる)」のいずれの用語も、任意選択で他の2つの用語と置き換えられ、したがって、主題の範囲の代替的態様を記載し得る。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の不在下でも適切に実施され得る。
本明細書で使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き複数形の指示対象を包含する。「または」または「および」の使用は、別途記載がない限り「および/または」を意味する。さらに、用語「including(含む)」およびその他の形、例えば「include」、「includes」および「included」などの使用は、限定するものではない。
本明細書で量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に使用される「約」という用語は、明記される値から最大±10%の変動を包含する。特に明示されない限り、本明細書で使用される成分量、特性、例えば分子量、反応条件などを表す数値はいずれも、用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、ヒト患者(例えば、結腸直腸癌などの癌を有する患者)である。
本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、本明細書に記載される治療または予防手段を指す。「治療」の方法には、疾患もしくは障害の1つもしくは複数の症状または疾患もしくは障害の再発を予防する、治癒させる、遅延させる、その重症度を軽減する、改善するため、あるいはこのような治療の不在下で予測される対象の生存期間を延ばすため、本明細書に開示される組成物を対象に投与することを用いる。
本明細書で使用される「抗悪性腫瘍剤」または「抗癌剤」は、ヒトでの新生物、特に癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病などの悪性(癌性)病変の発現または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤を指す。多くの場合、転移の阻害が抗悪性腫瘍剤の特性である。
本明細書で使用される「TRAIL」(「Apo2L/TRAIL」、「TNF関連アポトーシス誘導リガンド」および「CD253」とも呼ばれる)は、細胞死受容体(特にDR4およびDR5)に結合し活性化させるTNFファミリーのメンバーを指す。ヒトTRAILのアミノ酸配列(1〜281)(NP_003801.1)は:
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG(配列番号1)
である。
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG(配列番号1)
である。
TRAILは、非シグナル伝達デコイ受容体であるDcR1、DcR2およびオステオプロテグリン(osteoprotegrin)(OPG、破骨細胞形成阻害因子(OCIF)としても知られる)にも結合する。TRAILは、天然では2型膜貫通タンパク質として存在し、切断されて可溶性三量体タンパク質を解離することができる細胞外ドメインを有する。細胞死受容体による効率的なシグナル伝達およびアポトーシス誘導には、例えばTRAILの三量体構造を介する、受容体複合体のクラスター化が必要である。さらに、受容体複合体のさらに高次のオリゴマー化によりシグナル伝達が増幅され、より大規模なアポトーシス誘導が起こり得る。
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合(例えば、ペプチドイソスター)により結合したアミノ酸を2つ以上含む任意のペプチドを指す。ペプチドには、天然に存在し核酸によってコードされる20種類のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれていてもよく、翻訳後プロセシングなどの天然の過程または当該技術分野で周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列が含まれる。修飾は、ペプチドのペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を含めた任意の場所に存在し得る。所与のペプチド内の複数の部位に同じタイプの修飾が同程度または様々な程度で存在し得ることが理解されよう。また、所与のポリペプチドには多数のタイプの修飾が含まれていてもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてよく、分岐の有無を問わず環状であってもよい。環状、分岐状および分岐環状のポリペプチドは、天然の翻訳後過程から得られるものであっても、合成法により作製されるものであってもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などの転移RNAを介するタンパク質へのアミノ酸付加およびユビキチン化が挙げられる。
「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」という用語は、その起源もしくは由来源により天然の状態でそれに付随する天然の付随成分が付随していない;同じ種に由来する他のタンパク質が実質的に含まれていない;異なる種由来の細胞から発現する;または天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドのことである。したがって、化学的に合成される、または天然の起源である細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然の付随成分から「単離されている」ことになる。タンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いる単離により天然の付随成分を実質的に含まないようにしたものであってもよい。
本明細書で使用される「バリアント」という用語は、野生型配列の修飾型または改変型であると定義され、例えば、1つまたは複数のアミノ酸が、実質的に機能に影響を及ぼさない他のアミノ酸(1つまたは複数)または非アミノ酸(1つまたは複数)に置き換えられていてよい。いくつかの実施形態では、バリアントは少なくとも1つのアミノ酸残基に改変側鎖を含み得る。
「阻害する」または「阻害」という用語は、測定可能な量だけ低下させることを意味する。
「阻害剤」および「アンタゴニスト」または「活性化因子」および「アゴニスト」はそれぞれ、例えば、例えばリガンド、受容体、補助因子、遺伝子、細胞、組織または器官を活性させる、阻害分子または活性化分子を指す。例えば遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞のモジュレーターとは、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を変化させる分子のことであり、この場合、活性はその調節特性が活性化されるか、阻害されるか、または変化し得る。モジュレーターは、単独で作用するもの、または補助因子、例えばタンパク質、金属イオンもしくは小分子を用いるものであり得る。阻害剤とは、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞に抑制、阻止、妨害、活性化遅延、不活性化、脱感作またはダウンレギュレートの作用を示す化合物のことである。活性化因子とは、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞に増大、活性化、促進、活性化増大、感作またはアップレギュレートの作用を示す化合物のことである。阻害剤は、恒常的活性を抑制、阻止または不活性化する化合物とも定義され得る。
「アゴニスト」とは、標的と相互作用して標的の活性化の増大を引き起こす、または促進する化合物(例えば、TRAILシグナル伝達を刺激(促進)するポリペプチド)のことである。
「アンタゴニスト」とは、アゴニストの作用に対抗する化合物のことである。アンタゴニストは、アゴニストの活性を妨害、抑制、阻害または中和する。アンタゴニストは、特定されたアゴニストが存在しない場合でも、標的、例えば標的受容体の恒常的活性を妨害、阻害または抑制し得る。
当業者には、過度の実験を用いずに、具体的に例示されるもの以外の出発物質、生物学的および化学的材料、生物学的および化学的試薬、合成方法、精製方法、分析方法、アッセイ方法ならびに生物学的方法を本発明の実施に用いることが可能であることが理解されよう。任意のこのような材料および方法の機能的均等物であり当該技術分野で既知のものはいずれも、本開示に含まれるものとする。
本明細書で用いられている用語および表現は、限定するのではなく説明するための用語として使用されるのであって、そのような用語および表現を使用するにあたっては図示および記載されている特徴またはその一部のいかなる均等物も除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態、例示的実施形態および任意選択の特徴を含み得る様々な実施形態により本発明の態様が具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正形態および変形形態が当業者により用いられ得ることを理解するべきである。このような修正形態および変形形態は、記載される本発明の実施形態および添付の請求項により定められ得る本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。
A.バイオマーカー
本明細書に記載される方法は、特定レベルの1つまたは複数の特定のバイオマーカーを有すると判定された患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療することを含む。
本明細書に記載される方法は、特定レベルの1つまたは複数の特定のバイオマーカーを有すると判定された患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療することを含む。
本明細書で使用される「DR4」(「TNFRSF10A」、「APO2」、「CD261」、「TRAILR−1」および「TNF受容体スーパーファミリーメンバー10a」とも呼ばれる)は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの1つを指す。用語DR4とTNFRSF10Aは本明細書全体を通して互換的に使用される。DR4は、TRAILと結合しアポトーシスを媒介する膜結合細胞表面受容体である。ヒトDR4(TNFRSF10A)のアミノ酸配列(1〜468)(NP_003835.3)は:
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCCCIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE(配列番号2)
である。
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCCCIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE(配列番号2)
である。
TRAILがDR4と結合することにより受容体の三量体化が起こり、プロカスパーゼ−8/10の動員を促進する細胞死誘導シグナル伝達複合体(DISC)が形成される。DR4は、細胞死経路およびアポトーシスの調節に加えて、細胞生存シグナルも媒介する。
本明細書で使用される「cIAP1」(「BIRC−2」、「BIRC2」、「cIAP−1」および「バキュロウイルスIAP反復含有2」とも呼ばれる)は、カスパーゼの活性化に干渉することによりアポトーシスを阻害するアポトーシス阻害タンパク質ファミリーのメンバーの1つを指す。用語cIAP1とBIRC2は本明細書全体を通して互換的に使用される。CIAP1は、活性化されたカスパーゼ−3およびカスパーゼ−7に直接結合し、その活性を阻害することがわかっている。CIAP1はTNF誘導性アポトーシスを阻害する。ヒトcIAP1(BIRC2)(アイソフォーム1)のアミノ酸配列(1〜618)(NP_001157)は:
MHKTASQRLFPGPSYQNIKSIMEDSTILSDWTNSNKQKMKYDFSCELYRMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQNLVSASLGSTSKNTSPMRNSFAHSLSPTLEHSSLFSGSYSSLSPNPLNSRAVEDISSSRTNPYSYAMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFACGGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENSLETLRFSISNLSMQTHAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCCDGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRYPHLLEQLLSTSDTTGEENADPPIIHFGPGESSSEDAVMMNTPVVKSALEMGFNRDLVKQTVQSKILTTGENYKTVNDIVSALLNAEDEKREEEKEKQAEEMASDDLSLIRKNRMALFQQLTCVLPILDNLLKANVINKQEHDIIKQKTQIPLQARELIDTILVKGNAAANIFKNCLKEIDSTLYKNLFVDKNMKYIPTEDVSGLSLEEQLRRLQEERTCKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICRGIIKGTVRTFLS(配列番号3)
である。
MHKTASQRLFPGPSYQNIKSIMEDSTILSDWTNSNKQKMKYDFSCELYRMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQNLVSASLGSTSKNTSPMRNSFAHSLSPTLEHSSLFSGSYSSLSPNPLNSRAVEDISSSRTNPYSYAMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFACGGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENSLETLRFSISNLSMQTHAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCCDGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRYPHLLEQLLSTSDTTGEENADPPIIHFGPGESSSEDAVMMNTPVVKSALEMGFNRDLVKQTVQSKILTTGENYKTVNDIVSALLNAEDEKREEEKEKQAEEMASDDLSLIRKNRMALFQQLTCVLPILDNLLKANVINKQEHDIIKQKTQIPLQARELIDTILVKGNAAANIFKNCLKEIDSTLYKNLFVDKNMKYIPTEDVSGLSLEEQLRRLQEERTCKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICRGIIKGTVRTFLS(配列番号3)
である。
B.バイオマーカーの検出および測定
一実施形態では、試料で測定された1つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを用いて、(例えば、バイオマーカーの「高」発現または「低」発現と相関する)値またはスコアを導出または算出する。この値は、これらの発現レベルのみから導出しも、あるいは任意選択で、より包括的な値/スコアを得るため発現値/スコアと他の構成要素との組合せから導出してもよい。
一実施形態では、試料で測定された1つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを用いて、(例えば、バイオマーカーの「高」発現または「低」発現と相関する)値またはスコアを導出または算出する。この値は、これらの発現レベルのみから導出しも、あるいは任意選択で、より包括的な値/スコアを得るため発現値/スコアと他の構成要素との組合せから導出してもよい。
本明細書に提供される方法では、バイオマーカーであるDR4(TNFRSF10A)またはcIAP1(BIRC−2)のうちいずれか一方のみのスコアを用い得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療する患者は、高DR4スコア(すなわち、高DR4発現)を有すると判定された者である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療する患者は、低cIAP1スコア(すなわち、低cIAP1発現)を有すると判定された者である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療する患者は、高DR4スコア(すなわち、高DR4発現)および低cIAP1スコア(すなわち、低cIAP1発現)を有すると判定された者である。別の実施形態では、バイオマーカースコアは、cIAPのRNAまたはタンパク質発現に対して正規化したDR4のRNAまたはタンパク質発現の比である。
別の実施形態では、患者は、DR4/cIAP1比が少なくとも約0.5であると判定された癌(例えば、結腸直腸癌)を有する。一実施形態では、DR4/cIAP1比は、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9または少なくとも約2.0である。特定の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.5である。別の特定の実施形態では、DR4/cIAP1比は少なくとも約0.7である。
組織または細胞試料中の遺伝子またはタンパク質の状態を判定する様々な技術が当該技術分野で公知であり、特に限定されないが、マイクロアレイ解析(例えば、mRNAまたはマイクロRNAの発現、コピー数などをアッセイする)、定量的リアルタイムPCR(商標)(「qRT−PCR(商標)」、例えば、TaqMan(商標))、免疫解析(例えば、ELISA、免疫組織化学)などがこれに含まれる。遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性レベルを遺伝子またはポリペプチドの発現レベルとほぼ同じ方法で用い得る。多くの場合、活性レベルが高いほど発現レベルが高いことを表し、活性レベルが低いほど発現レベルが低いことを表す。本開示の方法は、用いる具体的な技術とは無関係に実施され得る。
様々な実施形態では、核酸レベルでバイオマーカーの発現を検出する。例えば、DR4(TNFRSF10A)またはcIAP1(BIRC−2)のバイオマーカースコアをRNAレベルに基づき評価することができる。遺伝子のRNAレベルを測定する場合、便利で感度の高い方法の1つに逆転写反応後に実施するリアルタイム定量的PCR(商標)(qPCR)アッセイがある。したがって、一実施形態では、試料中のRNAレベルを求める方法は、ホモジナイズした組織から例えばRT−PCRにより核酸を増幅した(RNAを逆転写し、次いで、得られたcDNAをPCRまたはその他の核酸増幅法を用いて増幅した)後、増幅された分子を検出する工程を含む。通常、サイクル閾値(Ct)、すなわち、バックグラウンドを上回るqPCR反応の蛍光が検出可能となるサイクル数を各被験遺伝子および各正規化遺伝子について求める。
一実施形態では、例えばTaqMan(商標)Systemを用いることにより、RNA発現を定量的蛍光発生RT−PCR(qPCR)により評価する。このような方法では通常、目的の核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いる。このようなアッセイのさらなる詳細については、のちに実施例で記載する。
別の実施形態では、患者試料は、DR4 RT−PCRスコアが−5以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RT−PCRスコアが、5.0、4,9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0,7、0.6、0.5、0.4、0,3、0.2、0,1、0、−0.1、−0.2、−0.3、−0.4、−0.5、−0.6、−0.7、−0.8、−0.9、−1.0、−1.1、−1.2、−1,3、−1.4、−1.5、−1.6、−1.7、−1.8、−1.9、−2.0、−2.1、−2.2、−2.3、−2.4、−2.5、−2.6、−2.7、−2.8、−2.9、−3.0、−3.1、−3.2、−.3.3、−3.4、−3.5、−3.6、−3.7、−3.8、−3.9、−4.0、−4.1、4.2、−4.3、−4.4、−4.5、−4.6、−4.7、−4.8、−4.9、−5.0からなる群より選択されるものであると判定される。
別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RT−PCRスコアが5以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RT−PCRスコアが、5.0、4,9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0,7、0.6、0.5、0.4、0,3、0.2、0,1、0、−0.1、−0.2、−0.3、−0.4、−0.5、−0.6、−0.7、−0.8、−0.9、−1.0、−1.1、−1.2、−1,3、−1.4、−1.5、−1.6、−1.7、−1.8、−1.9、−2.0、−2.1、−2.2、−2.3、−2.4、−2.5、−2.6、−2.7、−2.8、−2.9、−3.0、−3.1、−3.2、−.3.3、−3.4、−3.5、−3.6、−3.7、−3.8、−3.9、−4.0、−4.1、4.2、−4.3、−4.4、−4.5、−4.6、−4.7、−4.8、−4.9、−5.0からなる群より選択されるものであると判定される。
一実施形態では、被験遺伝子の発現の正規化に用いるため、1つまたは複数の正規化遺伝子(多くの場合、「ハウスキーピング」遺伝子と呼ばれる)の発現も明らかにする。本明細書で使用される「正規化遺伝子」は、発現が、測定した目的の遺伝子(例えば、被験遺伝子)の発現量を校正または正規化するのに用いられる遺伝子を指す。重要なのは、正規化遺伝子の発現が癌の転帰/予後とは無関係なものであるべきであり、正規化遺伝子の発現が腫瘍試料全体で極めて類似していることである。正規化は、異なる試料間で被験遺伝子の発現を正確に比較できるようにするものである。この目的には、当該技術分野で公知のハウスキーピング遺伝子を用いることができる。ハウスキーピング遺伝子は当該技術分野で周知であり、例として、特に限定されないが、GUSB(グルクロニダーゼ、ベータ)、HMBS(ヒドロキシメチルビラン合成酵素)、SDHA(コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットA、フラボタンパク質)、UBC(ユビキチンC)およびYWHAZ(チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド)が挙げられる。1種類または複数種類のハウスキーピング遺伝子を用いることができる。好ましくは、少なくとも2種類、5種類、10種類または15種類のハウスキーピング遺伝子を用いて、正規化遺伝子を組み合わせたセットとする。このような正規化遺伝子の遺伝子発現量を直接加算または定義されたアルゴリズムにより合計し平均値を求めることができる。一実施形態では、幾何平均を用いて遺伝子発現量を算出する。
1つまたは複数の正規化遺伝子の全発現量を、全正規化遺伝子の発現量を等しく重み付け(直接加算または平均化)して、または様々な所定の係数により合計して求められる、「正規化値」により表すことができる。例えば、もっとも単純な方法では、正規化値CtHを単一の正規化遺伝子のサイクル閾値(Ct)、または2種類以上、好ましくは10種類以上もしくは15種類以上の正規化遺伝子のCt値の平均値とすることができ、この場合、所定の係数は1/Nであり、Nは用いる正規化遺伝子の総数である。したがって、CtH=(CtH1+CtH2+−CtHn)/Nとなる。当業者には明らかなように、用いる正規化遺伝子および各正規化遺伝子に与えることが望まれる重みに応じて、そのような正規化遺伝子の発現量に重みを付ける際に任意の係数(0/N〜N/N)を正規化遺伝子に与えることができる。つまり、CtH=xCtH1+yCtH2+−zCtHnであり、式中、x+y+...+z=1である。
様々な実施形態では、RNA発現値を2−ΔΔctとして算出する。Δct値は、ハウスキーピング遺伝子のct値に対して正規化した目的の遺伝子のct値である。一実施形態では、基準細胞系CCK81のΔct値に対して正規化することによりΔΔct値を求める。
別の実施形態では、RNA−ISHアッセイを用いてRNA発現を検出する。例えば、発色RNA−in situハイブリダイゼーションアッセイ(RNA−ISH)を用いてRNAを検出し得る。発色RNA−ISHアッセイを用いて、FFPE組織切片の目的とするRNAを染色し得る。各RNA−ISHアッセイでは、有資格病理学者によりスコアリングシステムが適用され得る。このシステムは、各レベルを離散変数0、1+、2+、3+または4+としてスコア化する。Advanced Cell Diagnostics(登録商標)(「ACD」Hayward社、カリフォルニア州)RNAscope(登録商標)アッセイの以下の変法を用いて、FFPE腫瘍試料のバイオマーカーのRNAレベルをスコア化し得る。このアッセイでは、細胞に透過処理を実施し、バイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチド「Z」プローブのセット(例えば、米国特許第7,709,198号)とインキュベートする。「Z」プローブの使用のほかにも1転写当たり複数のプローブセットを使用することにより、アッセイの特異性が標準的なISH法よりも増大する。Zプローブとインキュベートした後、標的転写産物と結合した1対の隣接するZプローブとのみハイブリダイズすることができる前増幅剤を加える。これにより非特異的結合の増幅が最小限に抑えられる。次いで、前増幅剤との配列特異的ハイブリダイゼーションに基づき増幅段階を連続して数回実施した後、腫瘍組織のバイオマーカーのRNAレベルを半定量的に測定にすることが可能な酵素媒介性発色検出を実施する。
段階1:FFPE組織切片を脱パラフィンし、内在性のホスファターゼおよびペルオキシダーゼを阻止しRNA結合部位を脱マスキングするため前処理する。段階2:標的RNAの隣接した配列と特異的にハイブリダイズする標的特異的二本鎖Zプローブを加える。段階3:前増幅オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチド、最終HRPコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよびDABを連続して添加することにより標的を検出する。段階4:光学顕微鏡を用いてスライドを可視化し、病理学者によるスコア化を実施する。
アッセイをスコア化するため、腫瘍試料と並行して4種類の細胞系の基準組織マイクロアレイ(TMA)を染色する。これらの細胞系は、低レベルから高レベルの範囲の様々なレベルのバイオマーカーを発現する。次いで、病理学者が基準TMAとの視覚的比較に基づき患者試料にスコアを割り当てる。
別の実施形態では、患者試料は、DR4 RNA−ISHスコアが1+以上、2+以上または3+以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RNA−ISHスコアが1+以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RNA−ISHスコアが2+以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 RNA−ISHスコアが3+以上であると判定される。
別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RNA−ISHスコアが0、1+以下または2+以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RNA−ISHスコアが0であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RNA−ISHスコアが1+以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 RNA−ISHスコアが2+以下であると判定される。
バイオマーカーの発現はタンパク質レベルでも検出することができる。したがって、DR4(TNFRSF10A)またはcIAP1(BIRC−2)のスコアをタンパク質の検出レベルに基づき評価することができる。特定の実施形態では、免疫組織化学(IHC)を用いてタンパク質レベルの発現を測定する。免疫組織化学は、タンパク質と特異的に結合する抗体を用いることにより組織切片の細胞内のタンパク質を検出する技術である。Fl−IHCおよびqIHCなどの例示的IHCアッセイが当該技術分野で周知である。
例えば、Fl−IHCを用いてFFPE組織の腫瘍細胞内のバイオマーカーレベルを測定することができる。Fl−IHCは、撮像をベースとするアッセイであり、各試料の腫瘍細胞1個当たりのタンパク質分子数の尺度となる。患者から外科的に切除した腫瘍組織またはコア針生検試料を採取し、ホルマリンで固定し、標準的方法を用いてパラフィンブロックに包埋する。FFPEブロックを薄切し、スライドガラスに載せ、DNA、サイトケラチン(CK)およびバイオマーカー(1つまたは複数s)を同時染色する。最終的なマーカーの検出は蛍光に基づく。Aperio(登録商標)ScanScope(登録商標)FLセットを用いてスライドを倍率20倍で撮像し、定量的デジタル画像解析を用いて解析し得る。自動画像解析アルゴリズムでは、四角いタイル1つがそれぞれほぼ単一細胞の大きさに相当する規則的な格子を組織領域全体に当てる。次いで、バイオマーカータンパク質レベルのわかっている細胞系から構成され、患者試料と同時に染色し撮像した組織マイクロアレイ(TMA)から作成した標準曲線を用いて、CK+タイルの蛍光測定値を絶対尺度(1細胞当たりの受容体数)に変換する。
qIHCを用いてバイオマーカーのタンパク質レベルを検出することもできる。qIHCでは、標準的な褐色染色技術を用いてFFPE組織切片のタンパク質レベルを明らかにする。有資格病理学者によりTMAに基づくスコアリングシステムが適用され得る。このシステムでは染色強度に基づきスコアを出す(例えば、0、1、2、3、4)。
一実施形態では、患者試料は、DR4 IHCスコアが1以上、2以上または3以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 IHCスコアが1以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 IHCスコアが2以上であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、DR4 IHCスコアが3以上であると判定される。
別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 IHCスコアが0、1以下または2以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 IHCスコアが0であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 IHCスコアが1以下であると判定される。別の実施形態では、患者試料は、cIAP1 IHCスコアが2以下であると判定される。
別の態様では、細胞死受容体アゴニストのTRAILベースの治療剤による治療から利益を受ける癌患者(例えば、結腸直腸癌患者)をその特定レベルのDR4および/またはcIAP1発現に基づき特定する方法が提供され、その特定はDR4およびcIAP1のレベルにのみ基づくものである。例えば、この方法は、以下のバイオマーカー:APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2およびXIAPのうち1つまたは複数のもののレベルを測定することを含まない。別の実施形態では、この方法は、DR4およびcIAP1ならびに1つまたは複数の追加のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、1つまたは複数の追加のバイオマーカーは、APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2および/またはXIAPではない。
別の態様では、特定レベルの1つまたは複数のバイオマーカー(DR4および/またはcIAP1)を有すると判定された癌患者をTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストの投与により治療する方法が提供され、患者を治療するという決定は、Dr4および/またはcIAP1のレベルにのみ基づくものである。例えば、患者の以下のバイオマーカー:APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2およびXIAPの1つまたは複数のもののレベルは、この方法の一環として評価されていない。別の実施形態では、患者を治療するという決定は、Dr4および/またはcIAP1ならびに1つまたは複数の追加のバイオマーカーのレベルに基づくものであり、1つまたは複数の追加のバイオマーカーは、APAF1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、FADD、SPTAN1、BCL2、GAS2、BID、LMNA、CFLAR、MAP3K14、BIRC3、CHUK、NFKB1、NFKBIA、TNFRSF10B、TNFSF25、TNFSF10、TNFSF12、CYCS、DFFA、DFFB、RELA、TRADD、RIPK1、TRAF2および/またはXIAPではない。
例えば、一実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはAPAF1ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP3ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP6ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP7ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP8ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP9ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCASP10ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはFADDではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはSPTAN1ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはBCL2を含まない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはGAS2ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはBIDではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはLMNAではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCFLARではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはMAP3K14ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはBIRC3ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCHUKではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはNFKB1ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはNFKBIAではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTNFRSF10Bではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTNFSF25を含まない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTNFSF10ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTNFSF12ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはCYCSではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはDFFAではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはDFFBではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはRELAではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTRADDではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはRIPK1ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはTRAF2ではない。別の実施形態では、1つまたは複数のバイオマーカーはXIAPを含まない。
C.生体試料
対象から採取した生体試料(生検)の1つまたは複数のバイオマーカー(例えば、DR4またはcIAP1)の発現を検出し得る。
対象から採取した生体試料(生検)の1つまたは複数のバイオマーカー(例えば、DR4またはcIAP1)の発現を検出し得る。
本明細書で使用される「腫瘍試料」は、1つもしくは複数の腫瘍細胞または1つもしくは複数の腫瘍由来RNAもしくはタンパク質を含み、患者(例えば、癌患者)から採取された任意の生体試料を指す。例えば、癌患者の腫瘍組織から採取した組織試料は、本明細書に記載される方法に有用な腫瘍試料である。好ましくは、試料は主として腫瘍細胞を含むものである。癌患者の腫瘍に由来する単一の悪性細胞も有用な腫瘍試料である。このような悪性細胞は、患者の腫瘍から直接採取するか、または患者の体液(例えば、血液、尿)から精製することができる。したがって、腫瘍細胞または腫瘍由来RNAもしくはタンパク質を含有する血液、尿、痰および唾液などの体液も、腫瘍試料として本明細書に記載される方法の目的に有用なものであり得る。このような試料は通常、それを対象から採取した後にさらに処理する。本明細書に記載されるバイオマーカーの検出および定量化に適した生検試料は、新鮮なもの、凍結したもの、または固定したものであり得る。適切な試料は、薄切するのが好ましい。あるいは、試料を可溶化および/またはホモジナイズした後、解析してもよい。一実施形態では、新たに採取した生検試料をOCT(登録商標)またはCryomatrix(登録商標)などの凍結保護物質に包埋し、例えば液体窒素またはジフルオロジクロロメタンを用いて凍結する。凍結試料をクリオスタットで連続的に薄切する。別の実施形態では、薄切する前に試料を固定し包埋する。例えば、組織試料を例えばホルマリン、グルテルアルデヒド(gluteraldehyde)、エタノールまたはメタノールで固定し、(例えば、アルコールおよび/またはキシレンを用いて)連続的に脱水し、例えばパラフィンに包埋し得る。
別の実施形態では、試料は生検試料(例えば、ミクロトーム薄切前のFFPE)のミクロトーム切片である。別の実施形態では、生検試料は、患者を治療する前30日、60日または90日以内に採取したものである。
別の実施形態では、腫瘍試料は、血液中の循環腫瘍細胞に由来するものである。循環腫瘍細胞とは、原発性腫瘍から脱離し脈管系に侵入した細胞のことである。このような細胞は、転移性疾患を有する患者の全血1mL当たり約1〜10個CTCの頻度でみられ、これらの細胞の単離は、腫瘍生検に代わる非侵襲的方法となり得るものであり、生検試料の入手が不可能な場合に頻繁に用いられ得る。
D.TRAILベースの治療剤
i.TRAILポリペプチド
rhTRAILに加えて、国際出願PCT/US2017/022789号(明示的に参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているTRAILポリペプチドも本明細書に記載される方法に有用である。TRAILポリペプチドは、正確な形式または融合パートナー(存在する場合)に関係なく、単一ポリペプチド鎖構築物のTRAIL単量体、二量体または三量体であり得る。例えば、一本鎖TRAIL構築物は、1つ、2つまたは3つのTRAIL単量体を含み得る。
i.TRAILポリペプチド
rhTRAILに加えて、国際出願PCT/US2017/022789号(明示的に参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているTRAILポリペプチドも本明細書に記載される方法に有用である。TRAILポリペプチドは、正確な形式または融合パートナー(存在する場合)に関係なく、単一ポリペプチド鎖構築物のTRAIL単量体、二量体または三量体であり得る。例えば、一本鎖TRAIL構築物は、1つ、2つまたは3つのTRAIL単量体を含み得る。
一実施形態では、TRAILポリペプチドは1つのTRAILドメインを含む(単量体)。別の実施形態では、TRAILポリペプチドは2つのTRAIL単量体を含む(二量体)。別の実施形態では、ポリペプチドは3つのTRAIL単量体を含む(三量体)。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸残基95〜281、114〜281または120〜281を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、抗体Fc領域もしくはそのフラグメントおよび/またはFabもしくはそのフラグメントおよび/または抗体および/またはアルブミン(例えば、HSA)と結合した(例えば、融合した)TRAILポリペプチドを含む。
一実施形態では、TRAIL単量体は完全長ヒトTRAIL(すなわち、配列番号1のアミノ酸残基1〜281)を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の一部分を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は配列番号1のアミノ酸114〜281を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は配列番号1のアミノ酸114〜281よりなる。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基95〜281を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は配列番号1のアミノ酸残基95〜281よりなる。別の実施形態では、TRAIL単量体は配列番号1のアミノ酸残基120〜281を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は配列番号1のアミノ酸残基120〜281よりなる。
別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基90〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基91〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基92〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基93〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基94〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基95〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基96〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基97〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基98〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基99〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基100〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基101〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基102〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基103〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基104〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基105〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基106〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基107〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基108〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基109〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基110〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基111〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基112〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基113〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基114〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基115〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基116〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基117〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基118〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基119〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基120〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基121〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基122〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基123〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基124〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基125〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基126〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基127〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基128〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基129〜281よりなるか、これを含む。別の実施形態では、TRAILドメインは配列番号1のアミノ酸残基130〜281よりなるか、これを含む。
別の実施形態では、TRAIL単量体は、配列番号1のアミノ酸残基90〜130のいずれか1つにN末端を有し配列番号1のアミノ酸残基251〜281のいずれか1つにC末端を有する配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含むか、これよりなる。
別の実施形態では、TRAIL単量体は約250個以下のアミノ酸残基、好ましくは約200個以下のアミノ酸残基、より好ましくは約150個以下のアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、TRAIL単量体は約250個以下のアミノ酸残基、好ましくは約200個以下のアミノ酸残基、より好ましくは約150個以下のアミノ酸残基よりなる。
一実施形態では、融合ポリペプチドは、3つ1組のヒトTRAIL単量体を含み一本鎖TRAIL三量体を形成する。一実施形態では、一本鎖TRAIL三量体は、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で第一のTRAIL単量体、リンカー、第二のTRAIL単量体、第二のリンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む。一実施形態では、リンカーはG4Sドメインを含む(配列番号40)。別の実施形態では、各リンカーは15〜20個のアミノ酸からなる。別の実施形態では、2つのTRAIL単量体間のリンカーはそれぞれ3つのG4Sドメインを含む(配列番号50)。
一実施形態では、TRAIL融合ポリペプチドはFc−TRAIL融合ポリペプチドである。別の実施形態では、TRAIL融合ポリペプチドはFab−TRAIL融合ポリペプチドである。さらに別の実施形態では、TRAIL融合ポリペプチドはHSA−TRAIL融合ポリペプチドである。このようなHSA−TRAIL融合ポリペプチドに使用するのに適したヒト血清アルブミン(HSA)部分としては、米国特許第8,927,694号および同第8,877,687号に開示されている天然HSAおよび変異体HSAが挙げられる。
一実施形態では、TRAILポリペプチドは、そのシグナル伝達受容体(特にDR4およびDR5)または非シグナル伝達デコイ受容体であるDcR1、DcR2およびオステオプロテグリン(osteoprotegrin)(OPG)のうち少なくとも1つと結合する。別の実施形態では、TRAILポリペプチドはアポトーシスを誘導する。
各TRAIL単量体が変異を含み得るか、または3つの単量体それぞれに変異の組合せが独立して存在するか、存在しなくてよい。一実施形態では、TRAIL変異は、配列番号1の121位、130位、213位、215位、228位および247位のうち1つまたは複数の位置のアミノ酸置換から選択され得る。国際出願PCT/US2017/022789号(明示的に参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、一本鎖TRAIL分子に使用するのに有益なTRAIL単量体の変異としては、以下の個々の変異:R121I、R130G、Y213W、S215D、N228SおよびI247V(上の配列番号1に従って番号を付した)が挙げられる。
一態様では、3つの単量体それぞれが同じ変異または同じ変異の組合せを含み、別の態様では、3つの単量体のうち2つは同じ変異または同じ変異の組合せを含み、第三の単量体は異なる変異または変異の組合せを含むか、あるいは変異を含まず、さらに別の態様では、3つの単量体それぞれが異なる変異または変異の組合せを含むか、あるいは3つの単量体のうち1つまたは2つには変異が存在しない。例えば、例示的な一本鎖変異体TRAIL三量体は、「T148」、「T151」、「T153」、「T182」、「T183」、「T186」、「T191」、「T196」、「T202」、「T203」、「T204」、「T205」、「T206」、「T207」、「T208」、「T209」、「T210」および「T211」(それぞれ配列番号4〜21)から選択され得る。
本明細書には、DR4のレベルが高くcIAP1のレベルが低い癌を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを治療有効量投与することを含む。一実施形態では、TRAILベースの治療剤はrhTRAILである。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤は、TRAIL単量体、二量体または三量体である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT148(配列番号4)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT151(配列番号5)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT153(配列番号6)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT182(配列番号7)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT183(配列番号8)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT186(配列番号9)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT191(配列番号10)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT196(配列番号11)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT202(配列番号12)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT203(配列番号13)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT204(配列番号14)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT205(配列番号15)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT206(配列番号16)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT207(配列番号17)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT208(配列番号18)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT209(配列番号19)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT210(配列番号20)である。別の実施形態では、TRAILベースの治療剤はT211(配列番号21)である。
その他の既知のTRAILベースのポリペプチドおよびリガンド(例えば、明示的に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9359420号に記載されているものなど)も本明細書に記載される方法に使用することができる。
ii.Fc−TRAIL融合ポリペプチド
本明細書に記載される方法に有用なTRAILベースの治療剤は、Fc領域またはそのフラグメントと結合したTRAILポリペプチドも含み得る。
本明細書に記載される方法に有用なTRAILベースの治療剤は、Fc領域またはそのフラグメントと結合したTRAILポリペプチドも含み得る。
「Fc領域」(フラグメント結晶化可能領域)」、「Fcドメイン」または「Fc」は、免疫グロブリンと免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)上にあるFc受容体または古典的補体系の第一成分(C1q)との結合を含めた宿主組織または諸因子との結合を媒介する抗体重鎖のC末端領域を指す。したがって、Fc領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、CH1またはCL)を除く抗体の定常領域を含む。IgG、IgAおよびIgD抗体アイソタイプでは、Fc領域は、抗体の2つの重鎖の第二定常ドメイン(CH2)および第三定常ドメイン(CH3)に由来する2つの同一のタンパク質フラグメントを含み;IgMおよびIgEのFc領域は、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含む。IgGでは、Fc領域は、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3ならびにCγ1とCγ2の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は様々であり得るが、ヒトIgG重鎖のFc領域は通常、C226位またはP230位のアミノ酸残基(またはこの2つのアミノ酸の間にあるアミノ酸)から重鎖のカルボキシ末端までの区間に定められ、この場合、番号付けはKabatのEUインデックスに従うものである。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメインはアミノ酸231前後からアミノ酸340前後の範囲に及ぶのに対し、CH3ドメインはFc領域のCH2ドメインのC末端側に位置する、すなわち、IgGのアミノ酸341前後からアミノ酸447前後の範囲に及ぶ。本明細書で使用されるFc領域は、任意のアロタイプバリアントを含めた天然配列FcまたはバリアントFc(例えば、非天然Fc)であり得る。Fcは、単離した状態またはFcを含むタンパク質ポリペプチド、例えば「Fc融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも呼ばれる「Fc領域を含む結合タンパク質」などに含まれた状態のこの領域を指し得る。
別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは天然配列Fc領域を含む。「天然配列Fc領域」または「天然配列Fc」は、天然にみられるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトFc領域としては、天然配列ヒトIgG1 Fc領域;天然配列ヒトIgG2 Fc領域;天然配列ヒトIgG3 Fc領域;および天然配列ヒトIgG4 Fc領域ならびにその天然のバリアントが挙げられる。天然配列Fcとしては、Fcの様々なアロタイプが挙げられる(例えば、Jefferisら(2009)mAbs 1:1を参照されたい)。
特定の実施形態では、Fc領域はバリアントFc領域、例えば、所望の構造的特徴および/または生物活性が得られるよう親Fc配列(例えば、のちに改変されてバリアントを生じる未改変Fcポリペプチド)と比較して(例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入により)改変が施されているFc配列である。
例えば、親Fcと比較して(a)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)が増大もしくは低下したFcバリアント、(b)補体媒介性細胞傷害性(CDC)が増大もしくは低下したFcバリアント、(c)C1qに対する親和性が増大もしくは低下したFcバリアントおよび/または(d)Fc受容体に対する親和性が増大もしくは低下したFcバリアントを得るため、Fc領域に改変を施し得る。このようなFc領域バリアントは一般に、Fc領域に少なくとも1つのアミノ酸改変を含むことになる。アミノ酸改変を組み合わせるのが特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントFc領域はその中に、例えば本明細書に明記される特定のFc領域の位置の2つ、3つ、4つ、5つなどの置換を含み得る。
バリアントFc領域は、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されているか、他のアミノ酸に置き換わっている配列変化も含み得る。このような除去により、本明細書に記載される抗体の産生に用いる宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応が回避され得る。システイン残基を除去してもなお、一本鎖Fcドメインは非共有結合により結合した二量体Fcドメインを形成することができる。他の実施形態では、Fc領域を改変して、選択した宿主細胞に対する適合性を増大させ得る。例えば、典型的な天然Fc領域のN末端付近にあり、大腸菌(E.coli)の消化酵素、例えばプロリンイミノペプチダーゼなどによって認識され得るPA配列を除去し得る。他の実施形態では、Fcドメイン内の1つまたは複数のグリコシル化部位を除去し得る。通常はグリコシル化されている残基(例えば、アスパラギン)により細胞溶解反応が起こり得る。このような残基は、欠失させるか、非グリコシル化残基(例えば、アラニン)で置換し得る。他の実施形態では、Fc領域から補体との相互作用に関与する部位、例えばC1q結合部位などを除去し得る。例えば、ヒトIgG1のEKK配列に欠失または置換を施し得る。特定の実施形態では、Fc受容体との結合に影響を及ぼす部位、サルベージ受容体結合部位以外の部位を除去し得る。他の実施形態では、Fc領域を改変してADCC部位を除去し得る。ADCC部位は当該技術分野で公知であり、例えば、IgG1のADCC部位に関してはMolec.Immunol.29(5):633−9(1992)を参照されたい。バリアントFcドメインの具体例が、例えば国際公開第97/34631号および同第96/32478号に開示されている。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するようFcのヒンジ領域を改変する。この方法については、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。Fcのヒンジ領域内のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進する、または抗体の安定性を増大もしくは低下させる。一実施形態では、抗体のFcヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインA(SpA)結合が天然FcヒンジドメインのSpA結合と比較して低下するようFcヒンジフラグメントのCH2−CH3ドメイン境界領域内に1つまたは複数のアミノ酸変異を導入する。この方法については、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に記載されている。
また別の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによりFc領域を変化させて、抗体のエフェクター機能(1つまたは複数)を変化させる。例えば、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性は変化しているが、親抗体の抗原結合能は保持されるようアミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。親和性が変化するエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分であり得る。この方法については、Winterらによる米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。
また別の例では、抗体のC1q結合が変化し、かつ/または補体依存性細胞傷害(CDC)が低下もしくは消失するようアミノ酸残基329、331および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。この方法については、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載されている。
また別の例では、アミノ酸位置231と239の内側にある1つまたは複数のアミノ酸残基を変化させることにより、抗体の補体固定能を変化させる。この方法については、BodmerらによるPCT国際公開第94/29351号にさらに記載されている。
さらに別の例では、以下の位置:234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438または439の1つまたは複数のアミノ酸を改変することによりFc領域を改変して、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を増大させ、かつ/またはFcγ受容体に対する親和性を増大させ得る。例示的置換としては、236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332Dおよび332Eが挙げられる。例示的バリアントとしては、239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324Tおよび267E/268F/324Tが挙げられる。FcyRおよび補体との相互作用を増大させるその他の改変としては、特に限定されないが、置換298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305Iおよび396Lが挙げられる。これらおよびそれ以外の改変については、Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685−691に概説されている。
Fcγ受容体との結合を増大させるFc改変としては、Fc領域のアミノ酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439のいずれか1つまたは複数の位置でのアミノ酸改変が挙げられ、この場合、Fc領域の残基の番号付けはKabatと同じEUインデックス(国際公開第00/42072号)の番号付けである。
Fcに施し得るその他のFc改変には、FcγRおよび/または補体タンパク質との結合を低下または消失させることによりADCC、ADCPおよびCDCなどのFc媒介性エフェクター機能を低下または消失させるものがある。例示的改変としては、特に限定されないが、位置234、235、236、237、267、269、325および328での置換、挿入および欠失が挙げられ、この場合、番号付けはEUインデックスに従うものである。例示的置換としては、特に限定されないが、234G、235G、236R、237K、267R、269R、325Lおよび328Rが挙げられ、この場合、番号付けはEUインデックスに従うものである。Fcバリアントは236R/328Rを含み得る。FcyRおよび補体との相互作用を低下させるその他の改変としては、変異もしくは酵素による手段またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物体での産生による置換297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233Pおよび234Vならびに297位のグリコシル化の除去が挙げられる。これらおよびそれ以外の改変については、Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685−691に概説されている。
任意選択で、Fc領域は、当業者に公知のものとは別の位置および/またはこれに代わる位置に非天然アミノ酸残基を含み得る(例えば、米国特許第5,624,821号;同第6,277,375号;同第6,737,056号;同第6,194,551号;同第7,317,091号;同第8,101,720号;PCT国際公開第00/42072号;同第01/58957号;同第02/06919号;同第04/016750号;同第04/029207号;同第04/035752号;同第04/074455号;同第04/099249号;同第04/063351号;同第05/070963号;同第05/040217、同第05/092925号および同第06/020114号を参照されたい)。
抑制性受容体FcγRIIbに対する親和性を増大させるFcバリアントも使用し得る。このようなバリアントは、Fc融合タンパク質に、例えばB細胞および単球を含めたFcγRIIb+細胞に関連する免疫調節性活性をもたらし得る。一実施形態では、Fcバリアントにより、1つまたは複数の活性化受容体と比較してFcγRIIbに対する親和性が選択的に増大し得る。FcγRIIbとの結合を変化させる改変としては、EUインデックスに従う234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328および332からなる群より選択される位置での1つまたは複数の改変が挙げられる。FcγRIIb親和性を増大させる例示的置換としては、特に限定されないが、234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Yおよび332Eが挙げられる。例示的置換としては、235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328Wおよび328Yが挙げられる。FcγRIIbとの結合を増大させるその他のFcバリアントとしては、235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268Eおよび267E/328Fが挙げられる。
Fc領域のそのリガンドに対する親和性および結合特性は、特に限定されないが、平衡法(例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA))または速度論(例えば、BIACORE解析)およびその他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲルろ過)を含めた当該技術分野で公知の様々なin vitroのアッセイ法(生化学または免疫学に基づくアッセイ)により判定し得る。これらおよびその他の方法では、1つまたは複数の被験成分上の標識を利用し、かつ/または特に限定されないが、発色、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた様々な検出方法を用い得る。結合親和性および速度論に関する詳細な説明については、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てたPaul,W.E.編,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott−Raven,Philadelphia(1999)にみることができる。
特定の実施形態では、抗体を改変してその生物学的半減期を長くする。様々な方法が可能である。例えば、Fc領域のFcRnに対する結合親和性を増大させることによりこれを実施し得る。例えば、米国特許第6,277,375号に記載されているように、以下の残基:252、254、256、433、435および436のうち1つまたは複数のものを変異させることができる。具体的な例示的置換としては、以下のもの:T252L、T254Sおよび/またはT256Fのうち1つまたは複数のものが挙げられる。あるいは、生物学的半減期を長くするため、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および同第6,121,022号に記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むようにCH1またはCL領域内で抗体を変化させることができる。FcRnとの結合を増大させ、かつ/または薬物動態特性を改善するその他の例示的バリアントとしては、例えば、259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Yおよび434Mを含めた位置259、308、428および434での置換が挙げられる。FcのFcRnとの結合を増大させるその他のバリアントとしては、250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hintonら,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213−6216,Hintonら,2006 Journal of Immunology 176:346−356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shieldsら,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591−6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1 S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acquaraら,Journal of Immunology,2002,169:5171−5180,Dall’Acquaら,2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514−23524)が挙げられる。FcRn結合を調節するその他の改変については、Yeungら,2010,J Immunol,182:7663−7671に記載されている。特定の実施形態では、特定の生物学的特性を有するハイブリッドIgGアイソタイプを使用し得る。例えば、CH2および/またはCH3領域のIgG1の位置をIgG3の2つのアイソタイプが異なっている位置のアミノ酸で置換することによりIgG1/IgG3ハイブリッドバリアントを構築し得る。したがって、1つまたは複数の置換、例えば、274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435Rおよび436Fを含むハイブリッドバリアントIgG抗体を構築し得る。本明細書に記載される他の実施形態では、CH2および/またはCH3領域のIgG2の位置をIgG1の2つのアイソタイプが異なっている位置のアミノ酸で置換することによりIgG1/IgG2ハイブリッドバリアントを構築し得る。したがって、1つまたは複数の置換、例えば、以下のアミノ酸置換:233E、234L、235L、−236G(236位へのグリシン挿入を指す)および327Aのうち1つまたは複数のものを含むハイブリッドバリアントIgG抗体を構築し得る。
さらに、ヒトIgG1上のFcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対する結合部位が既にマッピングされており、結合が改善されたバリアントが既に記載されている(Shields,R.L.ら(2001)J.Biol.Chem.276:6591−6604を参照されたい)。位置256、290、298、333、334および339での特異的変異によりFcγRIIIとの結合が改善されることが示されている。さらに、以下の組合せ変異体:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224AならびにFcγRIIIa結合およびADCC活性が増大することが示されているS298A/E333A/K334AがFcγRIII結合を改善することが示されている(Shieldsら,2001)。カニクイザルでFcγRIIIaに対する親和性増大が最も大きく、FcγRIIb結合が低下し、強い細胞傷害活性がみられたS239D/I332EおよびS239D/I332E/A330L変異を有するバリアントを含めたFcγRIIIaとの結合が大幅に増大したその他のIgG1バリアントが特定されている(Lazarら,2006)。アレムツズマブ(CD52特異的)、トラスツズマブ(HER2/neu特異的)、リツキシマブ(CD20特異的)およびセツキシマブ(EGFR特異的)などの抗体への三重変異の導入ではin vitroのADCC活性の大幅な増大がみられ、S239D/I332EバリアントはサルのB細胞を枯渇させる能力の増大を示している(Lazarら,2006)。さらに、B細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルでは、ヒトFcγRIIIaを発現するトランスジェニックマウスにおいてFcγRIIIaとの結合の増大と同時にADCC活性の増大を示すL235V、F243L、R292P、Y300LおよびP396L変異を含むIgG1変異体が特定されている(Stavenhagenら,2007;Nordstromら,2011)。使用し得るその他のFc変異体としては、S298A/E333A/L334A,S239D/I332E,S239D/I332E/A330L,L235V/F243L/R292P/Y300L/P396LおよびM428L/N434Sが挙げられる。
別の実施形態では、Fc−TRAILポリペプチド鎖を第二のFc−TRAILポリペプチド鎖と二量体化する。特定の実施形態では、2つのFc−TRAILポリペプチド鎖を少なくとも1つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つのFc−TRAILポリペプチド鎖を少なくとも2つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つのFc−TRAILポリペプチド鎖を少なくとも3つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。
特定の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、少なくとも1つのFc間ジスルフィド結合により二量体化した2つのポリペプチド鎖を含み、各鎖は、3つ1組のヒトTRAILドメインとペプチド結合してアミノ末端からカルボキシル末端の順序でFc部分、リンカー、第一のTRAIL単量体、単量体間リンカー、第二のTRAIL単量体、第二の単量体間リンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む単一の非分岐ポリペプチドを形成しているヒトIgG Fc部分を含み、各リンカーは15〜20個のアミノ酸からなり、2つのTRAIL単量体間リンカーはそれぞれ3つのG4Sモチーフを含む。
別の実施形態では、疾患、例えば癌を治療するポリペプチドの効果を増大させるため、Fc領域のエフェクター機能を改変する。例えば、Fc領域にシステイン残基(1つまたは複数)を導入することにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させ得る。このように作製したホモ二量体ポリペプチドは、内部移行能の改善ならびに/あるいは補体媒介性殺細胞作用および抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の増大を示し得る。ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、抗腫瘍活性が増大したホモ二量体を調製してもよい。あるいは、二重Fc領域を有し、それにより補体溶解およびADCC能の増大を示し得るポリペプチドを設計することができる。
特定の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、3つ1組のヒトTRAILドメインと結合してアミノ末端からカルボキシル末端の順序でFc部分、リンカー、第一のTRAIL単量体、単量体間リンカー、第二のTRAIL単量体、第二の単量体間リンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む単一の非分岐ポリペプチドを形成しているヒトIgG Fc部分またはそのフラグメントを含む。特定の実施形態では、例えば、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは配列番号22〜39のいずれか1つを含む。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトTRAILにみられない変異を少なくとも1つ、2つ、3つまたは4つ含む。
例示的一本鎖変異体Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、「Fc−T148」、「Fc−T151」、「Fc−T153」、「Fc−T182」、「Fc−T183」、「Fc−T186」、「Fc−T191」、「Fc−T196」、「Fc−T202」、「Fc−T203」、「Fc−T204」、「Fc−T205」、「Fc−T206」、「Fc−T207」、「Fc−T208」、「Fc−T209」、「Fc−T210」および「Fc−T211」(それぞれ配列番号22〜39)から選択され得る。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはT148(配列番号22)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T151(配列番号23)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T153(配列番号24)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T182(配列番号25)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T183(配列番号26)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T186(配列番号27)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T191(配列番号28)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T196(配列番号29)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T202(配列番号30)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T203(配列番号31)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T204(配列番号32)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T205(配列番号33)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T206(配列番号34)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T207(配列番号35)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T208(配列番号36)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T209(配列番号37)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T210(配列番号38)である。別の実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドはFc−T211(配列番号39)である。
一実施形態では、Fc−TRAIL融合ポリペプチドは癌細胞アポトーシスを誘導する。
これ以外の既知のTRAILベースの治療剤およびFc融合物も本明細書に記載される方法に使用することができる。例えば、一実施形態では、TRAILベースの治療剤は六価のFc融合タンパク質(例えば、ABBV−621)(内容が明示的に参照により本明細書に組み込まれるClinicalTrials.gov識別番号NCT03082209も参照されたい)である。ABBV−621は、ヒトIgG1抗体のFcドメインと融合した6つのTRAILの受容体結合ドメインからなるTRAIL受容体アゴニストである。
さらに、本明細書に記載される方法に使用することができるFc融合ポリペプチドとしては、一本鎖trail受容体アゴニスト(例えば、内容が明示的に参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/164588号および米国特許出願公開第2015/0337027号記載されているものなど)が挙げられる。
iii.Fab−Fc−TRAILおよびFab−TRAIL融合ポリペプチド
本明細書に記載されるFc−TRAIL融合ポリペプチドは、抗体Fab領域またはそのフラグメントをさらに含み得る(例えば、Fab−Fc−TRAIL融合ポリペプチド)。「Fab」は、2つの鎖、すなわち、VHドメインとCH1ドメインとを含む第一の鎖およびVLドメインとCLドメインとを含む第二の鎖を含む、抗体の抗原結合部分を指す。Fabは通常、パパインで処理した抗体のN末端フラグメントとして記載され、ヒンジ領域の一部を含むが、本明細書では、重鎖がヒンジの一部を含まない結合ドメインを指すものとしても使用される。別の実施形態では、TRAIL融合物は、完全長の重鎖および軽鎖またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、TRAIL融合物は完全長抗体を含む。
本明細書に記載されるFc−TRAIL融合ポリペプチドは、抗体Fab領域またはそのフラグメントをさらに含み得る(例えば、Fab−Fc−TRAIL融合ポリペプチド)。「Fab」は、2つの鎖、すなわち、VHドメインとCH1ドメインとを含む第一の鎖およびVLドメインとCLドメインとを含む第二の鎖を含む、抗体の抗原結合部分を指す。Fabは通常、パパインで処理した抗体のN末端フラグメントとして記載され、ヒンジ領域の一部を含むが、本明細書では、重鎖がヒンジの一部を含まない結合ドメインを指すものとしても使用される。別の実施形態では、TRAIL融合物は、完全長の重鎖および軽鎖またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、TRAIL融合物は完全長抗体を含む。
一実施形態では、Fab−Fc−TRAIL融合物もしくは完全長重鎖および軽鎖重鎖TRAIL融合物またはそのフラグメントを第二の融合ポリペプチド鎖と二量体化することができる。特定の実施形態では、2つの融合ポリペプチド鎖を少なくとも1つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つの融合ポリペプチド鎖を少なくとも2つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つの融合ポリペプチドを少なくとも3つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。
別の実施形態では、Fab−Fc、重鎖および軽鎖、完全長抗体またはそのフラグメントをリンカーでTRAILポリペプチドと融合する。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸リンカーである。改変後も抗原結合親和性が維持される限り、Fab領域または抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のフレームワークまたは連結領域内のうち1つまたは複数のものに改変を施すこともできる。
別の実施形態では、Fab−Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、3つ1組のヒトTRAIL単量体と結合してアミノ末端からカルボキシル末端の順序でFc部分、リンカー、第一のTRAIL単量体、単量体間リンカー、第二のTRAIL単量体、第二の単量体間リンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む単一の非分岐ポリペプチドを形成するヒトFc部分またはそのフラグメントと結合したヒトFab部分またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、Fab−Fc−TRAIL融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトTRAILにみられない変異を少なくとも1つ、2つ、3つまたは4つ含む。
本明細書に記載されるTRAIL融合物は、抗体Fab領域またはその抗原結合部分も含み得る(Fab−TRAIL)。一実施形態では、Fab領域は完全長の重鎖を含む。別の実施形態では、Fab領域は、完全長の重鎖および軽鎖またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、Fab−TRAIL融合物を第二の融合ポリペプチド鎖と二量体化することができる。特定の実施形態では、2つの融合ポリペプチド鎖を少なくとも1つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つの融合ポリペプチド鎖を少なくとも2つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。別の実施形態では、2つの融合ポリペプチド鎖を少なくとも3つのFc間ジスルフィド結合により二量体化する。
別の実施形態では、FabまたはそのフラグメントをリンカーでTRAILポリペプチドと融合する。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸リンカーである。改変後も抗原結合親和性が維持される限り、Fab領域または抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のフレームワークまたは連結領域内のうち1つまたは複数のものに改変を施すこともできる。
別の実施形態では、Fab−TRAIL融合ポリペプチドは、3つ1組のヒトTRAIL単量体と結合してアミノ末端からカルボキシル末端の順序でFab部分、リンカー、第一のTRAIL単量体、単量体間リンカー、第二のTRAIL単量体、第二の単量体間リンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む単一の非分岐ポリペプチドを形成するヒトFab部分またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、Fab−TRAIL融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトTRAILにみられない変異を少なくとも1つ、2つ、3つまたは4つ含む。例示的Fab−TRAIL融合ポリペプチドは、可溶性TRAIL(scTRAIL)ポリペプチドと融合した抗EpCAM Fabを含み得る。
iv.アルブミン−TRAIL融合ポリペプチド
別の実施形態では、TRAILポリペプチドはアルブミン部分(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA))と結合している。別の実施形態では、アルブミン−TRAIL融合ポリペプチドは、1つ、2つまたは3つのTRAIL単量体を含む。
別の実施形態では、TRAILポリペプチドはアルブミン部分(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA))と結合している。別の実施形態では、アルブミン−TRAIL融合ポリペプチドは、1つ、2つまたは3つのTRAIL単量体を含む。
特定の実施形態では、単一のTRAIL融合ポリペプチド鎖は、3つ1組のヒトTRAIL単量体とペプチド結合してアミノ末端からカルボキシル末端の順序でアルブミン部分、リンカー、第一のTRAIL単量体、単量体間リンカー、第二のTRAIL単量体、第二の単量体間リンカーおよび第三のTRAIL単量体を含む単一の非分岐ポリペプチドを形成するヒト血清アルブミン部分を含む。
v.二重特異性融合ポリペプチド
二重特異性抗体融合物も提供される。一実施形態では、TRAILポリペプチドは二重特異性抗体の重鎖のC末端と融合している。本明細書の二重特異性抗体は、好ましくは非重複または非競合エピトープと結合し、同じまたは異なるタンパク質に対して少なくとも2つの結合特異性を有する。このような二重特異性抗体は、追加の結合特異性、例えば、発癌遺伝子の産物などの別の抗原に対する第三のタンパク質結合特異性を有し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体融合物も提供される。一実施形態では、TRAILポリペプチドは二重特異性抗体の重鎖のC末端と融合している。本明細書の二重特異性抗体は、好ましくは非重複または非競合エピトープと結合し、同じまたは異なるタンパク質に対して少なくとも2つの結合特異性を有する。このような二重特異性抗体は、追加の結合特異性、例えば、発癌遺伝子の産物などの別の抗原に対する第三のタンパク質結合特異性を有し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
E.TRAIL融合ポリペプチドを作製する方法
本明細書に記載されるTRAIL融合タンパク質は、標準的な組換え技術により作製することができる。組換えによる作製の方法については最先端のものが広く知られており、原核および真核細胞でのタンパク質発現とそれに続く抗体の単離ならびに通常は薬学的に許容される純度までの精製を含む。宿主細胞で結合タンパク質を発現させるには、各ポリペプチドをコードする核酸を標準的方法により発現ベクター内に挿入する。適切な原核または真核宿主細胞(CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母または大腸菌(E.coli)細胞など)で発現を実施し、その細胞(上清または溶解後の細胞)から結合タンパク質を回収する。組換えにより抗体を作製する一般的方法については最先端のものが周知であり、例えば、Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif 17 183−202(1999);Geisse,S.ら,Protein Expr.Purif.8 271−282(1996);Kaufman,R.J.,MoI.Biotechnol.16 151−161(2000);Werner,R.G.,Drug Res.48 870−880(1998)の総説に記載されている。
本明細書に記載されるTRAIL融合タンパク質は、標準的な組換え技術により作製することができる。組換えによる作製の方法については最先端のものが広く知られており、原核および真核細胞でのタンパク質発現とそれに続く抗体の単離ならびに通常は薬学的に許容される純度までの精製を含む。宿主細胞で結合タンパク質を発現させるには、各ポリペプチドをコードする核酸を標準的方法により発現ベクター内に挿入する。適切な原核または真核宿主細胞(CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母または大腸菌(E.coli)細胞など)で発現を実施し、その細胞(上清または溶解後の細胞)から結合タンパク質を回収する。組換えにより抗体を作製する一般的方法については最先端のものが周知であり、例えば、Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif 17 183−202(1999);Geisse,S.ら,Protein Expr.Purif.8 271−282(1996);Kaufman,R.J.,MoI.Biotechnol.16 151−161(2000);Werner,R.G.,Drug Res.48 870−880(1998)の総説に記載されている。
ポリペプチドは、従来の精製方法により培地から適切に分離され得る。細胞成分またはその他の夾雑物、例えば細胞内の他の核酸またはタンパク質を除去するため、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他の当該技術分野で周知のものを含めた標準的技術により精製を実施することができる。Ausubel,F.ら編,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)を参照されたい。タンパク質の精製には様々な方法、例えば微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAまたはタンパク質Gアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換(カルボキシルメチルレジン)、陰イオン交換(アミノエチルレジン)および混合モード交換)、チオフィリック吸着(例えば、ベータメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドを用いるもの)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリックレジンまたはm−アミノフェニルボロン酸を用いるもの)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Ni(II)親和性物質およびCu(II)親和性物質を用いるもの)、サイズ排除クロマトグラフィーおよび電気泳動法(ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など)などが十分に確立されており、広く用いられている(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75 93−102(1998))。ポリペプチドをコードするDNAおよびRNAは、従来の方法を用いて容易に単離されシーケンシングされる。
F.患者集団
本明細書には、ヒト患者の癌を治療する方法および特定レベルのバイオマーカー、例えばDR4(TNFRSF10A)またはcIAP1(BIRC2)などに基づきそのように治療する患者を選択する方法が提供される。一実施形態では、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、メラノーマ(例えば、皮膚または眼内悪性メラノーマ)、漿液性卵巣癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、食道癌、胃癌、胃食道接合部癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、脊髄腫瘍、神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌および中皮腫からなる群より選択される。この方法は転移性癌の治療にも適用可能である。
本明細書には、ヒト患者の癌を治療する方法および特定レベルのバイオマーカー、例えばDR4(TNFRSF10A)またはcIAP1(BIRC2)などに基づきそのように治療する患者を選択する方法が提供される。一実施形態では、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、メラノーマ(例えば、皮膚または眼内悪性メラノーマ)、漿液性卵巣癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、食道癌、胃癌、胃食道接合部癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、脊髄腫瘍、神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌および中皮腫からなる群より選択される。この方法は転移性癌の治療にも適用可能である。
一実施形態では、患者には、一次化学療法後に疾患の再発または持続の証拠がみられる。別の実施形態では、患者は、原発性または再発性疾患の管理のため少なくとも1回、事前に白金系化学療法レジメンを受けている。別の実施形態では、患者は白金抵抗性または難治性の癌を有する。別の実施形態では、患者には、a)一次治療またはb)アジュバント治療後に疾患の再発または持続の証拠がみられる。
別の実施形態では、患者は進行癌を有する。一実施形態では、「進行」癌という用語は、ステージIIより上の癌を意味する。別の実施形態では、「進行」は、通常は化学療法が推奨される疾患のステージを指し、それは以下のもの:1.疾患再発の場合:任意のステージもしくはグレード;2.ステージIC以上、任意のグレード;3.ステージIAもしくはIB、グレード2もしくは3;または4.不完全手術の場合もしくは外科手術後(さらなる外科手術を施行することができない場合)後に残存疾患が疑われる場合:任意のステージもしくはグレードのうちのいずれか1つである。
G.転帰
本明細書に提供される治療方法の有効性は、任意の適切な手段を用いて評価することができる。一実施形態では、治療により、腫瘍増殖速度の低下、腫瘍サイズの減少、転移性病巣数の経時的減少、無進行生存期間の増大および全奏効率の上昇からなる群より選択される少なくとも1つの治療効果が得られる。本明細書に提供される方法は、腫瘍増殖を少なくとも約10%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約99%または100%阻害する。
本明細書に提供される治療方法の有効性は、任意の適切な手段を用いて評価することができる。一実施形態では、治療により、腫瘍増殖速度の低下、腫瘍サイズの減少、転移性病巣数の経時的減少、無進行生存期間の増大および全奏効率の上昇からなる群より選択される少なくとも1つの治療効果が得られる。本明細書に提供される方法は、腫瘍増殖を少なくとも約10%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約99%または100%阻害する。
一実施形態では、本明細書に記載される治療方法により50%超の癌細胞死が得られる。別の実施形態では、この治療により60%超の癌細胞死、65%超の癌細胞死、70%超の癌細胞死、75%超の癌細胞死、80%超の癌細胞死、85%超の癌細胞死、90%超の癌細胞死、95%超の癌細胞死または100%の癌細胞死が得られる。
標的病変に関して、治療法に対する応答には以下のものが含まれ得る:
完全奏効(CR):標的病変がすべて消失している。いずれの病的リンパ節(標的であるか非標的であるかは問わない)も短軸が10mm未満に短縮していなければならない;
部分奏効(PR):標的病変の直径の合計がベースラインの合計直径を基準として少なくとも30%減少している;
進行性疾患(PD):標的病変の直径の合計が試験の最小合計値(ベースラインの合計値が試験の最小値である場合はその値がこれに含まれる)を基準として少なくとも20%増大している。20%の相対的増大に加えて、合計値に少なくとも5mmの絶対的増大もみられなければならない。(注:1つまたは複数の新たな病変の出現も進行したと見なされる);および
不変(SD):試験で最小の合計直径を基準として、PRと見なされるのに十分な退縮もPDと見なされるのに十分な増大もみられない。(注:直径の合計に5mm以上増大がみられない20%以下の変化は不変とされる)。不変の状態を割り当てるには、試験登録後に最小で6週間の間隔を空けて少なくとも1回、測定値が不変の基準を満たさなければならない。
完全奏効(CR):標的病変がすべて消失している。いずれの病的リンパ節(標的であるか非標的であるかは問わない)も短軸が10mm未満に短縮していなければならない;
部分奏効(PR):標的病変の直径の合計がベースラインの合計直径を基準として少なくとも30%減少している;
進行性疾患(PD):標的病変の直径の合計が試験の最小合計値(ベースラインの合計値が試験の最小値である場合はその値がこれに含まれる)を基準として少なくとも20%増大している。20%の相対的増大に加えて、合計値に少なくとも5mmの絶対的増大もみられなければならない。(注:1つまたは複数の新たな病変の出現も進行したと見なされる);および
不変(SD):試験で最小の合計直径を基準として、PRと見なされるのに十分な退縮もPDと見なされるのに十分な増大もみられない。(注:直径の合計に5mm以上増大がみられない20%以下の変化は不変とされる)。不変の状態を割り当てるには、試験登録後に最小で6週間の間隔を空けて少なくとも1回、測定値が不変の基準を満たさなければならない。
非標的病変に関して、治療法に対する応答には以下のものが含まれ得る:
完全奏効(CR):非標的病変がすべて消失し、腫瘍マーカーレベルが正常化している。全リンパ節のサイズが非病的(短軸が10mm未満)である。最初に腫瘍マーカーが正常範囲上限値を超えている場合、患者を臨床的完全奏効に含まれると見なすにはそれを正常化しなければならない;
非CR/非PD:1つもしくは複数の非標的病変(1つまたは複数)が持続しており、かつ/または腫瘍マーカーレベルが正常範囲を超えた状態で維持されている;および
進行性疾患(PD):1つもしくは複数の新たな病変の出現および/または既存の非標的病変の明白な進行がみられる。明白な進行は通常、標的病変の状態を上回るものであってはならない。それは単一の病変増大ではなく、疾患状態の変化全体を代表するものでなければならない。
完全奏効(CR):非標的病変がすべて消失し、腫瘍マーカーレベルが正常化している。全リンパ節のサイズが非病的(短軸が10mm未満)である。最初に腫瘍マーカーが正常範囲上限値を超えている場合、患者を臨床的完全奏効に含まれると見なすにはそれを正常化しなければならない;
非CR/非PD:1つもしくは複数の非標的病変(1つまたは複数)が持続しており、かつ/または腫瘍マーカーレベルが正常範囲を超えた状態で維持されている;および
進行性疾患(PD):1つもしくは複数の新たな病変の出現および/または既存の非標的病変の明白な進行がみられる。明白な進行は通常、標的病変の状態を上回るものであってはならない。それは単一の病変増大ではなく、疾患状態の変化全体を代表するものでなければならない。
例示的転帰では、本明細書に開示される方法に従って治療した患者には、少なくとも1つの癌の徴候に改善が認められ得る。
一実施形態では、そのように治療した患者は、CR、PRまたはSDを示す。
別の実施形態では、そのように治療した患者には、腫瘍の退縮および/または増殖速度の低下、すなわち腫瘍増殖の抑制が認められ得る。さらに別の実施形態では、以下のうち1つまたは複数のことが起こり得る:癌細胞の数が減少する;腫瘍サイズが減少する;末梢器官内への癌細胞浸潤の阻害、遅延、速度低下もしくは停止がみられる;腫瘍転移の速度低下もしくは阻害がみられる;腫瘍増殖が阻害される;腫瘍の再発が予防もしくは遅延される;または癌に関連する1つもしくは複数の症状がある程度緩和される。
他の実施形態では、このような改善を測定可能な腫瘍病変の量および/またはサイズの減少により測定する。測定可能な病変は、少なくとも1つの寸法が臨床検査でCTスキャン(CTスキャンのスライス厚は5mm以下)およびノギスによる測定のうち一方もしくは両方により10mm超であるか、または胸部X線により20mm超であると正確に測定され得る(最長直径が記録され得る)病変と定義される。非標的病変、例えば病的リンパ節のサイズも改善の尺度とすることができる。一実施形態では、病変を胸部X線またはCTもしくはMRIの結果で測定することができる。
他の実施形態では、細胞診または組織学検査を用いて治療法に対する応答性を評価することができる。測定可能な腫瘍が奏効または不変の基準を満たしている場合に治療時に出現または悪化する任意の浸出液が新生物起源であるかどうかを細胞診により確認することにより、奏効または不変(浸出液が治療の副作用である可能性がある)と進行性疾患とを鑑別することができると考えられる。
H.キットおよび製品
さらに、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストと、本明細書に記載される方法に従って使用するための指示書とを含む、キットが提供される。キットには通常、所定量の試薬の組合せが指示書およびキットの内容物が目的とする用途を示すラベルとともに包装されて含まれている。ラベルまたは指示書という用語は、キットの上に、もしくはキットとともに提供されるか、またはキットの製造、輸送、販売もしくは使用の際に随時別の方法でキットに添付される任意の書面または記録資料を包含する。それは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形態であり得、その注意書きには、ヒトへの投与または獣医学的使用のための製造、使用または販売がその機関により承認されたことが示されている。ラベルまたは指示書は、広告の小冊子およびパンフレット、包装材料ならびに音声またはビデオによる指示も包含し得る。
さらに、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストと、本明細書に記載される方法に従って使用するための指示書とを含む、キットが提供される。キットには通常、所定量の試薬の組合せが指示書およびキットの内容物が目的とする用途を示すラベルとともに包装されて含まれている。ラベルまたは指示書という用語は、キットの上に、もしくはキットとともに提供されるか、またはキットの製造、輸送、販売もしくは使用の際に随時別の方法でキットに添付される任意の書面または記録資料を包含する。それは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形態であり得、その注意書きには、ヒトへの投与または獣医学的使用のための製造、使用または販売がその機関により承認されたことが示されている。ラベルまたは指示書は、広告の小冊子およびパンフレット、包装材料ならびに音声またはビデオによる指示も包含し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、キットは、適切な容器に入ったTRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストと、本明細書に記載される治療レジメンに従って投与するための指示書とを含む。いくつかの実施形態では、キットは追加の抗悪性腫瘍剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストは、投与単位として適切な容器に入った形で提供される。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されたものであり得る。
以下の実施例は、単に例示的なものであり、当業者には本開示を読めば変形物および均等物が多数明らかになることから、決して本開示の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。
本明細書に引用される特許、特許出願および刊行物はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(実施例)
実施例1:CRCの予想バイオマーカーを導き出すのに用いた論理モデル
遺伝子発現データを用いて、架橋組換えヒトTRAIL(rhTRAIL)に対する応答を予測する論理モデルを訓練した。訓練セットには、公開されているデータ、すなわちCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)の遺伝子発現データおよびCRC細胞系パネルでの架橋rhTRAILによる細胞生存率の変化を用いた。BIOCARTA Death Pathway遺伝子リストの遺伝子で可能なあらゆるペアにANDおよびOR機能を適用して論理モデルスコアを得た。架橋rhTRAILによる最大阻害とよく相関する2遺伝子バイオマーカー、TNFRSF10A AND(NOT BIRC2)を発見し、ブートストラップにより、それが統計的に有意であることが予測された。
実施例1:CRCの予想バイオマーカーを導き出すのに用いた論理モデル
遺伝子発現データを用いて、架橋組換えヒトTRAIL(rhTRAIL)に対する応答を予測する論理モデルを訓練した。訓練セットには、公開されているデータ、すなわちCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)の遺伝子発現データおよびCRC細胞系パネルでの架橋rhTRAILによる細胞生存率の変化を用いた。BIOCARTA Death Pathway遺伝子リストの遺伝子で可能なあらゆるペアにANDおよびOR機能を適用して論理モデルスコアを得た。架橋rhTRAILによる最大阻害とよく相関する2遺伝子バイオマーカー、TNFRSF10A AND(NOT BIRC2)を発見し、ブートストラップにより、それが統計的に有意であることが予測された。
材料および方法
細胞系
表1Aおよび1Bに示す通り、結腸直腸細胞系をAmerican Type Culture Collection(ATCC、マナッサス、バージニア州、米国)、米国国立癌研究所(NCI、フレデリック、メリーランド州、米国)、Sigma−Aldrich社(セントルイス、ミズーリ州、米国)、Korean Cell Line Bank(KCLB、ソウル、韓国)、医薬基盤研究所(NIBIO、大阪、日本)または医薬基盤研細胞バンク(JCRB、大阪、日本)から購入/入手した。恒温器中、100%空気雰囲気下で維持したSW1417細胞を除くいずれの細胞も37℃、5%CO2で増殖させた。全細胞系の培養条件を表1Aおよび1Bに記載する。いずれの増殖培地にも10%熱不活化ウシ胎児血清(HI FBS、Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)、100単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco Life Technologies社)を補充した。C2BBe−1細胞系では、増殖培地に0.01mg/mLのヒトトランスフェリン(Sigma社、カタログ番号T8158)を他の補充物質とともに添加した。細胞培地は、ATCCから入手したEMEM培地を除き、Gibco Life Technologies社から購入した。
細胞系
表1Aおよび1Bに示す通り、結腸直腸細胞系をAmerican Type Culture Collection(ATCC、マナッサス、バージニア州、米国)、米国国立癌研究所(NCI、フレデリック、メリーランド州、米国)、Sigma−Aldrich社(セントルイス、ミズーリ州、米国)、Korean Cell Line Bank(KCLB、ソウル、韓国)、医薬基盤研究所(NIBIO、大阪、日本)または医薬基盤研細胞バンク(JCRB、大阪、日本)から購入/入手した。恒温器中、100%空気雰囲気下で維持したSW1417細胞を除くいずれの細胞も37℃、5%CO2で増殖させた。全細胞系の培養条件を表1Aおよび1Bに記載する。いずれの増殖培地にも10%熱不活化ウシ胎児血清(HI FBS、Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)、100単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco Life Technologies社)を補充した。C2BBe−1細胞系では、増殖培地に0.01mg/mLのヒトトランスフェリン(Sigma社、カタログ番号T8158)を他の補充物質とともに添加した。細胞培地は、ATCCから入手したEMEM培地を除き、Gibco Life Technologies社から購入した。
細胞生存率アッセイ:
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン(Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)で細胞を剥離し、pH7.4のPBS(Gibco Life Technologies社)で1回洗浄し、新鮮な完全増殖培地に懸濁させた。細胞を表1Aおよび1Bに示す通り最適な密度で96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩回復させた。次いで、細胞を漸増濃度(0〜10nM)の組換えヒトTRAIL(rhTRAIL、R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州、米国)で処置した。処置から24時間後、CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Assay(CTG、Promega Life Sciences社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて細胞内ATPの量を測定することにより生存率を求めた。少なくとも2つの独立した試験からデータを入手し、発光を未処置対照に対して正規化した。用量反応曲線を作成し、MATLAB(Natick社、マサチューセッツ州、米国)を用いてAmax値を算出した。
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン(Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)で細胞を剥離し、pH7.4のPBS(Gibco Life Technologies社)で1回洗浄し、新鮮な完全増殖培地に懸濁させた。細胞を表1Aおよび1Bに示す通り最適な密度で96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩回復させた。次いで、細胞を漸増濃度(0〜10nM)の組換えヒトTRAIL(rhTRAIL、R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州、米国)で処置した。処置から24時間後、CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Assay(CTG、Promega Life Sciences社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて細胞内ATPの量を測定することにより生存率を求めた。少なくとも2つの独立した試験からデータを入手し、発光を未処置対照に対して正規化した。用量反応曲線を作成し、MATLAB(Natick社、マサチューセッツ州、米国)を用いてAmax値を算出した。
RNAseqデータの処理
CCLEコンソーシアムはこれまでに933の細胞系に関するRNA−Seqの生データを公開している。これらのデータをRNA−Seq定量化プログラムであるkallisto(N.L.Bray,H.Pimentel,P.Melsted,L.Pachter,A.Rxiv(2015))を用いて処理した。このプログラムは各細胞系の遺伝子存在量を出力するものであり、次いで、これらのデータを上四分位正規化した。生物学的ノイズがシグナルに比例することが多いため、次いで、特定の遺伝子のmRNA発現量が多い試料により結果がゆがめられないようデータをlog2で正規化した。最後に、このデータを論理モデルに用いるため、各遺伝子の発現を0から1までの値に対して正規化した。全933種類のCCLE試料について各遺伝子の発現をその遺伝子の第95および第5百分位数の値により正規化した。
CCLEコンソーシアムはこれまでに933の細胞系に関するRNA−Seqの生データを公開している。これらのデータをRNA−Seq定量化プログラムであるkallisto(N.L.Bray,H.Pimentel,P.Melsted,L.Pachter,A.Rxiv(2015))を用いて処理した。このプログラムは各細胞系の遺伝子存在量を出力するものであり、次いで、これらのデータを上四分位正規化した。生物学的ノイズがシグナルに比例することが多いため、次いで、特定の遺伝子のmRNA発現量が多い試料により結果がゆがめられないようデータをlog2で正規化した。最後に、このデータを論理モデルに用いるため、各遺伝子の発現を0から1までの値に対して正規化した。全933種類のCCLE試料について各遺伝子の発現をその遺伝子の第95および第5百分位数の値により正規化した。
のちの解析に含めた遺伝子は、キュレートされ公開されているBIOCARTA Death Pathwayの遺伝子である(表2を参照されたい)。
論理モデルの構築
0から1までの範囲の連続型変数XおよびYを考慮に入れる際には、以下の等式:
NOT X=1−X
X AND Y=X*Y
X OR Y=NOT((NOT X)AND(NOT Y))=1−((1−X)*(1−Y))
を用いて論理ゲート「AND」、「OR」および「NOT」を記述することができる。
0から1までの範囲の連続型変数XおよびYを考慮に入れる際には、以下の等式:
NOT X=1−X
X AND Y=X*Y
X OR Y=NOT((NOT X)AND(NOT Y))=1−((1−X)*(1−Y))
を用いて論理ゲート「AND」、「OR」および「NOT」を記述することができる。
CCLEの全CRC細胞系について遺伝子の全ペアおよびそのNOT値に関する論理モデルを作成した。残存細胞のパーセントを論理モデルスコアと相関させた。モデルが少なくともスクランブル出力の95%との相関と同程度に実際の生存能と相関する場合、そのモデルを非ランダムであると見なした。
最良モデルの選択
架橋rhTRAILに対する細胞系の応答を報告している公開データセットを訓練セットに用いて、最も予測性能の高い論理モデルを選択した(P.M.Nairら,Proceedings of the National Academy of Sciences 112,5679−5684(2015))。結腸および盲腸に由来するCCLE細胞系の細胞生存率データを論理モデルスコアと相関させた。生存率のスクランブルデータを論理モデルスコアと相関させることによりブートストラップを実行した。論理モデルが少なくともスクランブル出力の95%との相関と同程度に実際の生存能と相関する場合、そのモデルを非ランダムであると見なした。
架橋rhTRAILに対する細胞系の応答を報告している公開データセットを訓練セットに用いて、最も予測性能の高い論理モデルを選択した(P.M.Nairら,Proceedings of the National Academy of Sciences 112,5679−5684(2015))。結腸および盲腸に由来するCCLE細胞系の細胞生存率データを論理モデルスコアと相関させた。生存率のスクランブルデータを論理モデルスコアと相関させることによりブートストラップを実行した。論理モデルが少なくともスクランブル出力の95%との相関と同程度に実際の生存能と相関する場合、そのモデルを非ランダムであると見なした。
rhTRAILを用いたモデルの検証
次いで、rhTRAILを用いてバイオマーカー仮説を検証した。最初のデータセット内にあった14種類の細胞系をrhTRAILに用量依存性に曝露し、CellTiter Glo(登録商標)(CTG)アッセイを用いて細胞生存率を測定した。
次いで、rhTRAILを用いてバイオマーカー仮説を検証した。最初のデータセット内にあった14種類の細胞系をrhTRAILに用量依存性に曝露し、CellTiter Glo(登録商標)(CTG)アッセイを用いて細胞生存率を測定した。
仮説を新たな細胞系で検証する前に、rhTRAILデータセットから得た論理モデルスコアに基づき、線形モデルを当てはめて細胞生存率を予測した。追加の9種類のCRC細胞系について、そのCCLEのRNA−Seq値に基づき(訓練セットについて実施した通りに)論理モデルスコアを算出し、細胞生存率を予測し、次いで、各細胞系の実際の最小生存率の中央値と比較した。
結果
バイオマーカー予測
細胞生存率の最も優れた予測因子の1つはDR4(TNFRSF10A)であることがわかった。TNFSFR10Aは細胞死受容体4をコードする遺伝子であり、BIRC2は抗アポトーシスタンパク質cIAP1をコードする遺伝子である。この論理関数の出力値が大きいほど、架橋rhTRAILが細胞生存率を低下させる能力が高いものとした。論理モデルスコアと細胞生存率との間のピアソン相関は−0.69であった。これは27例の試料を用いて算出したものである。論理モデルフィット対残存生存細胞のパーセントのグラフを図1Aに示す。
バイオマーカー予測
細胞生存率の最も優れた予測因子の1つはDR4(TNFRSF10A)であることがわかった。TNFSFR10Aは細胞死受容体4をコードする遺伝子であり、BIRC2は抗アポトーシスタンパク質cIAP1をコードする遺伝子である。この論理関数の出力値が大きいほど、架橋rhTRAILが細胞生存率を低下させる能力が高いものとした。論理モデルスコアと細胞生存率との間のピアソン相関は−0.69であった。これは27例の試料を用いて算出したものである。論理モデルフィット対残存生存細胞のパーセントのグラフを図1Aに示す。
ブートストラップ解析から、1000回のうち974回(すなわち、p=0.026)は論理関数TNFRSF10A AND(NOT BIRC2)から得た予測因子と実際の応答との間の相関の方がスクランブルデータセットから得た最良の予測因子の間の相関より優れていることがわかった。このことは、バイオマーカーのデータがランダムではないことを示していた。したがって、このモデルは、TRAILシグナル伝達経路ではDR4とcIAP1が最も感度の高いノードであることを示している。このモデルから、DR4が存在しなければ、rhTRAILはそのシグナルを細胞外から伝達することができないことが示唆される。cIAP1レベルが高過ぎれば、抗アポトーシスシグナルがTRAILからのアポトーシスの合図を圧倒することになり、したがって、rhTRAILがアポトーシスを誘導するには高DR4と低cIAP1のバランスが必要となる。
元の公開されているデータセットで観察されたものと同じ傾向は、より小さい細胞系のセットをrhTRAILに曝露するアッセイにも当てはまった、すなわち、各細胞系の細胞生存率の最大阻害の中央値は関数TNFRSF10A AND(NOT BIRC2)の論理スコアと相関することがわかった。回帰モデルに当てはめて論理モデルスコアから細胞生存率を予測するのに用いた元の公開されているデータセットと重複する11種類のCRC細胞系を用いたモデル訓練セットのCTGデータを表3にまとめる。
論理モデル出力、パーセント細胞生存率およびフィットのグラフを図1Bに示す。回帰モデル(赤線)をフィットさせて、10nMのrhTRAILに応答した細胞生存率を論理モデルスコアの関数として予測する。11種類の細胞系のうち10種類の細胞系のデータを用いて回帰を実施した。MDST8(論理モデルスコア=0.14および細胞生存率=6%)は明らかに外れ値であるため、これをフィットから除外して予測モデルを作成した。回帰モデルは、残存生存細胞のパーセント=86.7−122.0*(論理モデルスコア)とするものである。
次いで、元の公開されているデータセットに含まれていなかったさらに9種類のCRC細胞系をrhTRAILに曝露し、細胞生存率を測定した。CCLEデータに基づけば、これらの細胞系は様々なレベルのDR4およびcIAP1を発現する。
rhTRAILに曝露した9種類の追加のCRC細胞系を用いてバイオマーカー仮説を検証した試験セットで得たCTGのデータを表4にまとめる。
rhTRAILに曝露した9種類の追加のCRC細胞系を用いてバイオマーカー仮説を検証した試験セットで得た正規化DR4レベルおよびcIAP1レベルを表5にまとめる。
細胞系をrhTRAIL(4反復/細胞系)に用量依存性に曝露した。最小細胞生存率を記録した。
論理モデルにより、50%阻害のカットオフを用いて、9種類の追加の細胞系のうち8種類の細胞系の応答がrhTRAILに応答する細胞系または応答しない細胞系として正確に予測され(例えば、処置後の細胞死が50%を超える細胞系は応答細胞系に分類され、処置後の細胞死が50%未満の細胞系は非応答細胞系に分類される)、細胞系のうち6種類の細胞系で実際の生存率が少なくとも1つの測定値の10%以内にあることが予測された。予測値対実際の細胞生存率を図1Cに示す。以上の結果を考え合わせると、腫瘍のDR4レベルが高くcIAP1レベルが低い患者が細胞死受容体アゴニストによる治療に良好に応答する可能性があることがわかる。
実施例2:癌ゲノム情報の解析
The Cancer Genome Atlas(TCGA)の結腸直腸に関するデータに解析を実施して、TRAILに応答すると考えられる集団の割合を予測した。簡潔に述べれば、全適応症の全試料にわたって各試料の遺伝子発現を正規化した。図2Aに、CRC腫瘍試料の正規化DR4レベルのヒストグラムを示す。分布は明らかに右側に偏っており、大部分のCRC腫瘍試料はDR4のレベルが高いことを示している。図2Bに、左側に偏ったCRC腫瘍試料の正規化cIAP1レベルのヒストグラムを示す。図2Cに、正規化DR4レベルおよびcIAP1レベルに基づくCRC腫瘍試料全体のバイオマーカースコアの分布を示す。試料の58%は、バイオマーカースコアが細胞生存率低下の予測値75%に対応する0.5より大きいことに注目するべきである。試料の21%はバイオマーカースコアが0.7より大きく、この0.7という数値は、腫瘍細胞が完全に根絶されると予測されるものである。
The Cancer Genome Atlas(TCGA)の結腸直腸に関するデータに解析を実施して、TRAILに応答すると考えられる集団の割合を予測した。簡潔に述べれば、全適応症の全試料にわたって各試料の遺伝子発現を正規化した。図2Aに、CRC腫瘍試料の正規化DR4レベルのヒストグラムを示す。分布は明らかに右側に偏っており、大部分のCRC腫瘍試料はDR4のレベルが高いことを示している。図2Bに、左側に偏ったCRC腫瘍試料の正規化cIAP1レベルのヒストグラムを示す。図2Cに、正規化DR4レベルおよびcIAP1レベルに基づくCRC腫瘍試料全体のバイオマーカースコアの分布を示す。試料の58%は、バイオマーカースコアが細胞生存率低下の予測値75%に対応する0.5より大きいことに注目するべきである。試料の21%はバイオマーカースコアが0.7より大きく、この0.7という数値は、腫瘍細胞が完全に根絶されると予測されるものである。
TCGAの結腸直腸の正常組織試料に同様の解析を実施した。結腸直腸の正常組織試料全体のバイオマーカースコアスコアのヒストグラムを図2Dに示す。注目すべきなのは、スコアが0.5を上回る試料はわずか12%であり、スコアが0.7を上回る試料は皆無であることであり、TRAIL治療が正常な結腸直腸組織に毒性を示す可能性はないことが示唆される。
実施例3:DR4/cIAP1 mRNA発現比はTRAILベースの治療法に対する応答と相関する
結腸直腸細胞系を様々な濃度のrhTRAIL(0〜10nM)で24時間処置した。CellTiter−Glo発光アッセイを用いて10nM(Cmax)での抗腫瘍活性(生存率)を評価した。図3Aに、示される細胞系の処置後のパーセント生存率を示す。生存率が80%低下した細胞系を感受性の細胞系に分類し、残りの細胞系を抵抗性の細胞系に分類した。感受性の細胞系の方が抵抗性の細胞系よりDR4/cIAP1 mRNA発現比が有意に高かった(図1Bおよび1C)。
結腸直腸細胞系を様々な濃度のrhTRAIL(0〜10nM)で24時間処置した。CellTiter−Glo発光アッセイを用いて10nM(Cmax)での抗腫瘍活性(生存率)を評価した。図3Aに、示される細胞系の処置後のパーセント生存率を示す。生存率が80%低下した細胞系を感受性の細胞系に分類し、残りの細胞系を抵抗性の細胞系に分類した。感受性の細胞系の方が抵抗性の細胞系よりDR4/cIAP1 mRNA発現比が有意に高かった(図1Bおよび1C)。
現在用いられているTRAILアゴニスト(すなわち、rhTRAIL)は、薬物動態特性が不良であり、かつ/または効力が低いという問題がある。一方、Fc−TRAIL(例えば、Fc−T191)は、DR4およびDR5の両方を標的としFc領域とそれに続く3つの連続するTRAIL単量体からなる単一の融合ポリペプチドであり、マウスPK試験で優れた終末相半減期を示す。Fc−T191はrhTRAILと同等の活性を示し、相関係数=0.92である。このため、rhTRAILに良好に応答したCRC細胞系のほとんどがFc−T191にも良好に応答した(図4)。
Colo205細胞系はDR4(TNFRSF10A)の発現が高く、cIAP1(BIRC2)の発現が低い、すなわちDR4/cIAP1比が大きいことから、この細胞系を用いてバイオマーカー仮説をin vivoで検証した。Fc−T191(10mg/kg IP)単独で処置したところ、腫瘍増殖が有意に阻害された(図5A)。注目すべきなのは、それぞれDR4/cIAP1比が比較的小さいRKO細胞系およびKM12細胞系の増殖がFc−T191処置による影響をほとんど受けなかったことである(図5Bおよび5C)。以上の結果から、DR4(TNFRSF10A)レベルが高くcIAP1(BIRC2)レベルが低いことはTRAIL治療が成功を収めることを示すものであることが示唆された。
実施例4:細胞死受容体およびcIAP1のノックダウンによりCRC細胞系のTRAILに対する応答が変化し、このことは2遺伝子バイオマーカーと応答との間に機序的関係があることを示している
コンピュータモデル化を用いてDR4とcIAP1が有望なバイオマーカーシグネチャーとして特定されたことから、LIM−1215細胞およびHCT116細胞を用いてFc−T191処置に応答したDR4またはDR5の機能的役割を検討した。
コンピュータモデル化を用いてDR4とcIAP1が有望なバイオマーカーシグネチャーとして特定されたことから、LIM−1215細胞およびHCT116細胞を用いてFc−T191処置に応答したDR4またはDR5の機能的役割を検討した。
材料および方法
RNAサイレンシング/トランスフェクション
ヒトDR4、DR5およびcIAP1遺伝子を標的とするsiRNA(1つまたは複数)ならびに汎用スクランブルsiRNAをIDT社(Integrated DNA Technologies社、コーラルビル、アイオワ州、米国)から入手し、siRNA配列は以下の通りであった:
siDR4−二本鎖−1 GGAACUUUCCGGAAUGACAAUUCTG(配列番号41)
siDR4−二本鎖−2 GGACAAUGCUCACAACGAGAUUCTG(配列番号42)
siDR4−二本鎖−3 CAGAAUCUCGUUGUGAGCAUUGUCCUC(配列番号43)
siDR5−二本鎖−1 GUCACAUGACCGGUACUGGAAGAAA(配列番号44)
siDR5−二本鎖−2 UACCUUCUAGAUACAUGAACUUUCCAG(配列番号45)
siDR5−二本鎖−3 UCUGAGACAGUGCUUCGAUGACUTT(配列番号46)
SiCIAP−1二本鎖−1 AAUGAUGCAUAACAAGCAGUGACACUA(配列番号47)
SiCIAP−1二本鎖−2 AUACCUUUACAAGCGAGAGAACUGA(配列番号48)
SiCIAP−1二本鎖−3 UUGGAAUAUACUUCAUAUUCUUAUCCA(配列番号49)。
RNAサイレンシング/トランスフェクション
ヒトDR4、DR5およびcIAP1遺伝子を標的とするsiRNA(1つまたは複数)ならびに汎用スクランブルsiRNAをIDT社(Integrated DNA Technologies社、コーラルビル、アイオワ州、米国)から入手し、siRNA配列は以下の通りであった:
siDR4−二本鎖−1 GGAACUUUCCGGAAUGACAAUUCTG(配列番号41)
siDR4−二本鎖−2 GGACAAUGCUCACAACGAGAUUCTG(配列番号42)
siDR4−二本鎖−3 CAGAAUCUCGUUGUGAGCAUUGUCCUC(配列番号43)
siDR5−二本鎖−1 GUCACAUGACCGGUACUGGAAGAAA(配列番号44)
siDR5−二本鎖−2 UACCUUCUAGAUACAUGAACUUUCCAG(配列番号45)
siDR5−二本鎖−3 UCUGAGACAGUGCUUCGAUGACUTT(配列番号46)
SiCIAP−1二本鎖−1 AAUGAUGCAUAACAAGCAGUGACACUA(配列番号47)
SiCIAP−1二本鎖−2 AUACCUUUACAAGCGAGAGAACUGA(配列番号48)
SiCIAP−1二本鎖−3 UUGGAAUAUACUUCAUAUUCUUAUCCA(配列番号49)。
6ウェルプレートで抗生物質の不在下、RNAi−Max(Invitrogen社)トランスフェクション試薬9ulを用いてHCT116細胞、LIM1215細胞(800,000個)にSiRNAプールをリバーストランスフェクトした(DR4、DR5およびcIAP1単独を計30pmolまたはDR4とDR5を併せて15pmol)。トランスフェクション後、細胞をPBSで洗浄し、2日間培養し、トリプシン処理し、96ウェルプレートに入れ替え(10,000細胞/ウェル)、漸増濃度のFc−T191で24時間(用量0〜30uM)、3連で処置した。24時間後、CTGリードアウトを測定した。同時に、細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロット解析を用いてノックダウンを検証した。
ウエスタンブロット解析
トランスフェクションから48時間後、pH7.4の氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Gibco社)で細胞を洗浄し、0.25%トリプシン(Gibco社)でトリプシン処理し、15mlチューブに収集した。細胞をペレット化し、氷冷PBSで1回洗浄した後、溶解緩衝液(RIPA Lysis and Extraction Buffer(Thermo Scientific社)+Protease Inhibitor Cocktail(Sigma社)、Phosphatase Inhibotor Cocktail 2(Sigma社)、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10mMピロリン酸ナトリウム、50μMフェニルアルシン、10μM bpV、10mM Bグリセロリン酸、1Mフッ化ナトリウム)250μlを加えた。細胞溶解物を氷上で最低30分間インキュベートし、次いで1.5ml微小遠心管に移し、−80℃で保管した。 BCA Assay(Pierce社)を製造業者のプロトコル通りに用いてタンパク質濃度を求めた。
トランスフェクションから48時間後、pH7.4の氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Gibco社)で細胞を洗浄し、0.25%トリプシン(Gibco社)でトリプシン処理し、15mlチューブに収集した。細胞をペレット化し、氷冷PBSで1回洗浄した後、溶解緩衝液(RIPA Lysis and Extraction Buffer(Thermo Scientific社)+Protease Inhibitor Cocktail(Sigma社)、Phosphatase Inhibotor Cocktail 2(Sigma社)、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10mMピロリン酸ナトリウム、50μMフェニルアルシン、10μM bpV、10mM Bグリセロリン酸、1Mフッ化ナトリウム)250μlを加えた。細胞溶解物を氷上で最低30分間インキュベートし、次いで1.5ml微小遠心管に移し、−80℃で保管した。 BCA Assay(Pierce社)を製造業者のプロトコル通りに用いてタンパク質濃度を求めた。
タンパク質試料(20μg)をCriterion XT 4−12% Bis‐Trisゲル(Biorad社)に装填し、120Vのゲル電気泳動により分離した。IBLOT Dry Blotting System(Invitrogen社)を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜をODYSSEYブロッキング緩衝液(LI−COR社)中、室温で1時間ブロックした後、Odysseyブロッキング緩衝液/PBST(1:1混合物)で希釈した一次抗体と4℃で一晩インキュベートした(DPBS(Gibco)+0.1% TWEEN20)。以下のタンパク質:CIAP1(1:400、R&D system社、AF8181)、DR4(1:500、Abcam社、ab8414)、DR5(1:400、Abcam社、ab8416)およびGAPDH(1:1000、Cell Signaling Technology社、#2118)に対する抗体を用いた。翌日、膜をPBSTで洗浄し、二次抗体:IRDYE 800CWヤギ抗ウサギIgG(H+L)またはIRDYE 800CWロバ抗ヤギIgG(H+L)(LI−COR社)と室温で1時間インキュベートした。膜をPBSTでもう1回洗浄し、ODYSSEY CLx Imagingシステム(LI−COR社)を用いて撮像した。
細胞生存率アッセイ
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン(Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)で細胞を剥離し、PBS(Gibco Life Technologies社)で1回洗浄し、新鮮な完全増殖培地に懸濁させた。細胞を表1Aおよび1Bに示す通り最適な密度で96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩回復させた。次いで、細胞を漸増濃度の単一薬剤の社内化合物Fc−T191(0〜30nm、3倍希釈物)で処置した。処置から24時間後、CellTiter−Glo Luminescent Assay(CTG、Promega Life Sciences社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて細胞内ATPの量を測定することにより生存率を求めた。発光値を未処置対照に対して正規化した。MATLAB(Natick社、マサチューセッツ州、米国)を用いて用量反応曲線を作成した。
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン(Gibco Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)で細胞を剥離し、PBS(Gibco Life Technologies社)で1回洗浄し、新鮮な完全増殖培地に懸濁させた。細胞を表1Aおよび1Bに示す通り最適な密度で96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩回復させた。次いで、細胞を漸増濃度の単一薬剤の社内化合物Fc−T191(0〜30nm、3倍希釈物)で処置した。処置から24時間後、CellTiter−Glo Luminescent Assay(CTG、Promega Life Sciences社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて細胞内ATPの量を測定することにより生存率を求めた。発光値を未処置対照に対して正規化した。MATLAB(Natick社、マサチューセッツ州、米国)を用いて用量反応曲線を作成した。
結果
低cIAP1(BIRC2)のLIM1215細胞のDR4をsiRNAによりノックダウンし、DR5はノックダウンしない場合、スクランブル(非標的化)siRNAをトランスフェクトした細胞と比較してFc−T191に対する応答が低くなった(図6A〜6C)。しかし、DR4とDR5を組み合わせてノックダウンしたところ、DR4ノックダウン単独よりも細胞がFc−T191から保護された(図6B〜6C)。
低cIAP1(BIRC2)のLIM1215細胞のDR4をsiRNAによりノックダウンし、DR5はノックダウンしない場合、スクランブル(非標的化)siRNAをトランスフェクトした細胞と比較してFc−T191に対する応答が低くなった(図6A〜6C)。しかし、DR4とDR5を組み合わせてノックダウンしたところ、DR4ノックダウン単独よりも細胞がFc−T191から保護された(図6B〜6C)。
高cIAP(BIRC2)のHCT116細胞では、DR4またはDR5を単独でノックダウンしても、スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して有意な効果はみられなかった(図7A〜7C)。しかし、DR4とDR5を組み合わせてノックダウンしたところ、高濃度のFc−T191に対してさえHCT116細胞の抵抗性が高くなった(図7B〜7C)。注目すべきなのは、cIAP1(BIRC−2)のノックダウンによりHCT116細胞がFc−T191に対してさらに感受性になったことである(図7B〜7C)。以上の結果から、Fc−T191によりDR4またはDR5を介して誘導される細胞死は細胞型依存性であり、cIAP1はFc−T191誘導性細胞死に対する抵抗性を生じさせ得ることが示唆される。
実施例5:TRAIL感受性PDXモデルは相対的に高レベルのDR4(TNFRSF10A)および低レベルのcIAP1(BIRC2)を発現する。
バイオマーカー仮説をさらに検証するため、患者由来異種移植(PDX)結腸直腸癌モデルを用いて、バイオマーカーレベルならびにrhTRAIL治療およびFc−T191治療(患者試料:TX−CRC−066、−096、−088、−206、−169および−171)に対する感受性を評価した。
バイオマーカー仮説をさらに検証するため、患者由来異種移植(PDX)結腸直腸癌モデルを用いて、バイオマーカーレベルならびにrhTRAIL治療およびFc−T191治療(患者試料:TX−CRC−066、−096、−088、−206、−169および−171)に対する感受性を評価した。
材料および方法
結腸直腸癌の細胞系由来異種移植マウスモデル
体重18〜20gの6週齢ヌードマウス(NU−Foxn1nu;Charles River Laboratories社)の右側腹部の皮下にRKOまたはHCT116細胞系(5e6)の50%マトリゲル(Corning社)懸濁液を注射した。デジタルノギスを用いて腫瘍測定を実施し、「W」を幅の最大値とし「L」を長さの最大値とする方程式:π/6(L×W2)を用いて腫瘍体積を算出した。腫瘍が十分なサイズ(100〜250mm3)になったとき、マウスを無作為化により対照群と実験群に割り付けた。マウスに溶媒対照のPBS(pH7.4)または示される用量のFc−T191を投与した。試験期間中、腫瘍体積および体重をモニターした。最後の測定の後、組織学的評価用に腫瘍を回収した。治療群の間の統計学的差を求めるため、接種後第22日の腫瘍体積の変化率を用いてt検定解析を実施した。
結腸直腸癌の細胞系由来異種移植マウスモデル
体重18〜20gの6週齢ヌードマウス(NU−Foxn1nu;Charles River Laboratories社)の右側腹部の皮下にRKOまたはHCT116細胞系(5e6)の50%マトリゲル(Corning社)懸濁液を注射した。デジタルノギスを用いて腫瘍測定を実施し、「W」を幅の最大値とし「L」を長さの最大値とする方程式:π/6(L×W2)を用いて腫瘍体積を算出した。腫瘍が十分なサイズ(100〜250mm3)になったとき、マウスを無作為化により対照群と実験群に割り付けた。マウスに溶媒対照のPBS(pH7.4)または示される用量のFc−T191を投与した。試験期間中、腫瘍体積および体重をモニターした。最後の測定の後、組織学的評価用に腫瘍を回収した。治療群の間の統計学的差を求めるため、接種後第22日の腫瘍体積の変化率を用いてt検定解析を実施した。
結腸直腸癌の患者由来異種移植マウスモデル
テキサス工科大学癌センターからTX−CRC−066、−096、−088、−206、−169、−171、患者由来結腸直腸癌断片を入手した。Charles River Laboratories社(ウィルミントン、マサチューセッツ州)から5〜8週齢の雌NOD−SCIDマウスを購入した。イソフルラン吸引麻酔下、NOD−SCIDマウスの背側腹部の皮下に小さいポケットを開けた後、30〜60mm3の断片を皮下移植した。切開部位を外科用ステープルで閉じた。次いで、試験期間中、マウスの腫瘍増殖をモニターした。デジタルノギスを用いて腫瘍測定を実施し、「W」を幅の最大値とし「L」を長さの最大値とする方程式:(L×W2)/2を用いて腫瘍体積を算出した。次いで、良好な異種移植片を新たな宿主マウス内に継代した。継代3代または4代の時点で移植腫瘍の体積が十分なサイズ(約100〜250mm3)に達したとき、マウスを5〜7個体の対照群および実験群に無作為化により割り付けた。マウスをPBSまたはFc−T191で処置した。試験期間中、腫瘍体積および体重を週2回モニターした。最後の測定の後、組織学的評価(IHC)用に腫瘍を回収した。
テキサス工科大学癌センターからTX−CRC−066、−096、−088、−206、−169、−171、患者由来結腸直腸癌断片を入手した。Charles River Laboratories社(ウィルミントン、マサチューセッツ州)から5〜8週齢の雌NOD−SCIDマウスを購入した。イソフルラン吸引麻酔下、NOD−SCIDマウスの背側腹部の皮下に小さいポケットを開けた後、30〜60mm3の断片を皮下移植した。切開部位を外科用ステープルで閉じた。次いで、試験期間中、マウスの腫瘍増殖をモニターした。デジタルノギスを用いて腫瘍測定を実施し、「W」を幅の最大値とし「L」を長さの最大値とする方程式:(L×W2)/2を用いて腫瘍体積を算出した。次いで、良好な異種移植片を新たな宿主マウス内に継代した。継代3代または4代の時点で移植腫瘍の体積が十分なサイズ(約100〜250mm3)に達したとき、マウスを5〜7個体の対照群および実験群に無作為化により割り付けた。マウスをPBSまたはFc−T191で処置した。試験期間中、腫瘍体積および体重を週2回モニターした。最後の測定の後、組織学的評価(IHC)用に腫瘍を回収した。
逆転写酵素およびPCRアッセイ
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン処理した細胞をPBSで洗浄し、Qiagen社のRNeasy Kitを製造業者の指示に従い記載された通りに用いて全RNAを単離した。同じキットを用いてPDX組織からRNAを単離した。次いで、Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて全RNA 1μgを逆転写した。次いで、転写された遺伝子特異的RNAを定量化するため、TaqMan(登録商標)Fast Advanced Master MixならびにTNFRSF10A、BIRC2、ACTB、RPL4およびPPP2CA用のTaqMan Gene Expression Assays(以上、Applied Biosystems社)を用いてcDNA(TaqMan Assay毎に3回の技術的反復)を増幅した。
結腸直腸細胞系を完全培地でサブコンフルエントまで培養した。トリプシン処理した細胞をPBSで洗浄し、Qiagen社のRNeasy Kitを製造業者の指示に従い記載された通りに用いて全RNAを単離した。同じキットを用いてPDX組織からRNAを単離した。次いで、Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)を製造業者のプロトコル通りに用いて全RNA 1μgを逆転写した。次いで、転写された遺伝子特異的RNAを定量化するため、TaqMan(登録商標)Fast Advanced Master MixならびにTNFRSF10A、BIRC2、ACTB、RPL4およびPPP2CA用のTaqMan Gene Expression Assays(以上、Applied Biosystems社)を用いてcDNA(TaqMan Assay毎に3回の技術的反復)を増幅した。
QuantStudio 12K Flex Real−Time PCR System(Life Technologies社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)でLife Technologies社が推奨するサイクル条件下にて反応を実施した。初期設定の閾値を用いて閾値サイクル(Ct)を求めた。Ctは、蛍光が固定閾値を超える小数のサイクル数として定義される。2−ΔCtの式を当てはめてTNFRSF10A、BIRC2のRNA発現量を算出し、この場合、ΔCt=Ct(TNFRSF10AまたはBIRC2遺伝子)−Ct(ハウスキーピング遺伝子の幾何平均)とした。
結果
TX−CRC−066、−096、−088および−206は、Fc−T191処置(5mg/kg週1回)後に腫瘍サイズの有意な減少がみられたため、感受性の腫瘍モデルに分類した。これとは対照的に、抵抗性PDXモデルである−169および−171では、同様の濃度およびスケジュールのFc−T191に応答した有意な増殖阻害はみられなかった。in vivoでのFc−T191に対するTX−CRC−096およびTX−CRC−0169の応答をそれぞれTRAIL感受性PDXモデルおよびTRAIL抵抗性PDXモデルの例として図6Aおよび6Bに示す。
TX−CRC−066、−096、−088および−206は、Fc−T191処置(5mg/kg週1回)後に腫瘍サイズの有意な減少がみられたため、感受性の腫瘍モデルに分類した。これとは対照的に、抵抗性PDXモデルである−169および−171では、同様の濃度およびスケジュールのFc−T191に応答した有意な増殖阻害はみられなかった。in vivoでのFc−T191に対するTX−CRC−096およびTX−CRC−0169の応答をそれぞれTRAIL感受性PDXモデルおよびTRAIL抵抗性PDXモデルの例として図6Aおよび6Bに示す。
感受性および抵抗性のPDXモデルでのDR4(TNFRSF10A)およびcIAP1(BIRC2)の発現も検証し、TRAIL療法に対する応答と相関させた。予想通り、4種類の感受性PDXモデルでは、2種類の抵抗性PDXモデルより高いDR4/cIAP1 mRNA発現比がみられた(図9)。ウエスタンブロット解析および/またはIHCによるさらなるタンパク質レベル測定では、感受性PDXモデルの方が抵抗性モデルよりDR4の発現が高く、cIAP1の発現が低いことがさらに確認された(図10)。以上の結果から、DR4(TNFRSF10A)レベルが高くcIAP1(BIRC2)レベルが低いことによりTRAIL療法に対する応答が予測されることがさらに示唆された。
均等物
当業者であれば、慣例的な実験のみを用いて本明細書に記載される具体的な実施形態の均等物を多数認識する、または確認することができるであろう。このような均等物はのちの請求項に包含されるものとする。任意の複数の従属請求項または実施例に開示される諸実施形態の任意の組合せが本開示の範囲内に含まれることが企図される。
当業者であれば、慣例的な実験のみを用いて本明細書に記載される具体的な実施形態の均等物を多数認識する、または確認することができるであろう。このような均等物はのちの請求項に包含されるものとする。任意の複数の従属請求項または実施例に開示される諸実施形態の任意の組合せが本開示の範囲内に含まれることが企図される。
参照による組込み
本明細書で参照される米国および外国特許ならびに係属中の特許出願および特許公報のあらゆる開示は、任意の配列表および図面の内容と同じく、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
本明細書で参照される米国および外国特許ならびに係属中の特許出願および特許公報のあらゆる開示は、任意の配列表および図面の内容と同じく、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
(配列表)
Claims (19)
- 高いレベルのDR4を有すると判定された結腸直腸癌を有する患者を治療する方法であって、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを治療有効量投与することを含む、方法。
- 高いレベルのDR4および低いレベルのcIAP1を有すると判定された結腸直腸癌を有する患者を治療する方法であって、TRAILベースの治療剤または細胞死受容体アゴニストを治療有効量投与することを含む、方法。
- TRAILベースの治療剤の投与を含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TRAILベースの治療剤が架橋されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TRAILベースの治療剤がペグ化されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TRAILベースの治療剤がrhTRAILである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TRAILベースの治療剤がTRAILポリペプチドである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TRAILポリペプチドがFc−TRAIL融合ポリペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 前記Fc−TRAIL融合ポリペプチドがFc−T191(配列番号28)である、請求項8に記載の方法。
- DR4のレベルが十分に高く、cIAP1が十分に低いため、前記治療により50%超の癌細胞死が得られる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結腸直腸癌が少なくとも約0.5のDR4/cIAP1比を有する、請求項2〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DR4/cIAP1比が少なくとも約1.0である、請求項11に記載の方法。
- DR4アゴニストの投与を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- DR5アゴニストの投与を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- DR4/DR5二重アゴニストの投与を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも約0.5のDR4/cIAP1比を有すると判定された結腸直腸癌を有する患者を治療する方法であって、配列番号28を含むFc−TRAIL融合ポリペプチドを治療有効量投与することを含む、方法。
- 少なくとも約0.5のDR4/cIAP1比を有すると判定された結腸直腸癌を有する患者を治療する方法であって、DR4アゴニスト、DR5アゴニストまたはDR4/DR5アゴニストを治療有効量投与することを含む、方法。
- 前記患者が、少なくとも約0.7のDR4/cIAP1比を有すると判定された結腸直腸癌を有する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記患者が、少なくとも約1.0のDR4/cIAP1比を有すると判定された結腸直腸癌を有する、請求項16または17に記載の方法。
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