KR101960431B1 - Her2 양성 암 및 항-her2 치료에 대한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
Her2 양성 암 및 항-her2 치료에 대한 바이오마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HER2(Human epidermal growth factor receptor2) 양성 암 및 항-HER2 치료에 대한 바이오마커인 MEL-18 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, MEL-18은 HER2+ 암에서 항 HER2 표적치료제에 대한 개체의 반응에 대한 예후인자이자 예측인자로서 HER2+ 암 개체의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단에 사용할 수 있으며, 이를 통해 ADAM 10/17 저해제 투여 여부 또는 HER2 표적치료제와 병용 투여 여부를 결정하여 HER2 치료제에 대한 저항성을 극복하고 치료 효능을 향상시킴으로써 보다 효과적으로 HER2 양성 암을 치료할 수 있게 한다.
Description
본 발명은 HER2(Human epidermal growth factor receptor2) 양성 암 및 항-HER2 치료에 대한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
약물은 의사의 처방에 따라 올바르게 복용하더라도 사람마다 그 반응이 다르게 나타날 수 있는데, 약 200만 명의 환자에게서 약물 부작용이 나타나고 그 중 0.5%는 약물 부작용에 의한 사망에 이른다고 보고된바 있다. 또한, 약물을 처방 받은 환자의 1/3 에서만이 실제로 원하는 치료 효과를 보이고 있으며, 미국에서 주요 사망원인이 약물 역작용(adverse drug reaction)에 기인한다는 보고는 'one size fits all' 약물 치료법의 맹점을 여실히 보여주는 사례이다. 이렇게 개개인에서 약물반응의 차이를 보이는 가장 큰 이유는 "유전적 요인"이다. 사람마다 다른 유전자 때문에 체내 효소량, 단백질량 등의 차이가 생겨 약물 대사에서 차이를 보이게 된다. 이러한 개인 간 다양성은 특정 환자에서의 약물 효과와 안정성 예측을 어렵게 하기 때문에 이를 극복하기 위해 환자 개인별 유전정보에 따른 맞춤의약적 접근이 필요하다.
MEL-18은 polycomb-repressive complex 1(PRC1)에 속하는 폴리콤 그룹(polycomb group, PcG)의 단백질이다. PcG 단백질은 2 개의 다중 복합체로 구성된 중요한 후성 유전 조절제이다. 하나는 PRC2로, 라이신 27(H3K27me3)에서 히스톤 3의 3 중 메틸화에 의한 침묵하는 유전자의 개시 복합체이고, 다른 하나는 PRC1으로, H3K27me3을 인식하고 라이신 119(H2AK119ub)에서 히스톤 H2A 단일-유비퀴틴화 및 전사 개시 시스템의 봉쇄(1-3)를 비롯한 다양한 기작을 통해 유전자 침묵을 유지한다. MEL-18의 상동체인 BMI-1과 PRC1의 핵심 구성 요소는 잘 확립되어있는 반면, PRC1/2-매개 후성 유전자 침묵에서 MEL-18의 역할은 잘 알려져 있지 않다. 이전 연구는 MEL-18이 유방암에서 세포 증식, 혈관 신생, 암줄기 세포(CSCs) 및 상피 간엽 전이(EMT)의 억제에 관여한다는 것을 보여주었다(4, 11-14). 또한, MEL-18의 소실이 에스트로겐 수용체(ER) 감소, 호르몬 독립 및 타목시펜 내성(15)을 중재함으로써 삼중 네거티브 유방암(TNBC)과 관련이 있음을 보고하였고, MEL-18 소실이 보다 공격적인 상태로 유방암이 진행하는데 결정적인 역할을 하는 것을 밝혔다.
모든 유방암의 15-25%를 차지하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 증폭 또는 과발현을 가진 유방암은 공격적 표현형으로 여겨진다(16, 17). HER2는 ErbB/HER라고 불리는 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 표피 성장 수용체 군에 속하다. HER2는 확인된 리간드가 없지만 다른 ErbB 가족 구성원과의 동종 이합체화 또는 이종이량화를 위한 적절한 구조로 존재하므로 세포 증식, 생존, CSC 및 전이와 관련된 여러 발암 신호를 유발하다(18-21). 지난 수십 년 동안 HER2는 HER2 양성(HER2+) 유방암의 주요 치료 표적으로 여겨져 왔다(16, 18). HER2 세포 외 부위에 대한 인간화 단일 클론 항체인 트라스투주맙은 HER2+ 유방암 환자에게 가장 흔한 약물이며 FDA의 승인을 받았지만(22), 전이성 유방암 환자의 30%만이 트라스투주맙 단독 치료에 반응하고 많은 환자가 지속적인 치료에 대한 내성(23-26)을 갖는다. 트라스투주맙 내성에는 표적 변형(target alteration)(27, 28), 리간드 생성 및 ErbB 패밀리 구성 사이의 이량체화(29-31), 다운스트림 돌연변이(32), 그리고 우회 신호전달(33)을 포함한 여러 가지 메커니즘이 있다. 특히, ErbB 패밀리 수용체 사이의 이종 이량체화(heterodimerization)는 HER2에 대한 트라스투주맙의 억제 효과를 우회하는 주된 원인이다(34). 따라서, 라파티닙(lapatinib, 35) 및 퍼투주맙(pertuzumab, 36)과 같은 ErbB 신호전달에 대한 표적 약물을 사용하여 트라스투주맙 내성을 극복하기 위한 다양한 전략이 시도되고 있다. 그러나 트라스투주맙 내성의 기작에 대한 완전한 이해와 HER2+ 암에 대한 새로운 치료 전략이 여전히 요구된다.
상기 종래 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명자들은 지속적인 연구를 통해서 HER2+ 암에서 HER2 표적치료제에 대한 반응을 매개하는데 종양 억제자인 MEL-18이 중추적인 역할을 함을 밝히고, HER2+ 암에 대한 새로운 치료 전략을 제시한다.
구체적으로, HER2+ 암 환자의 거의 절반에서만 MEL-18이 증폭되어 있는 것을 확인하였고, MEL-18은 리간드-의존성 ErbB 이량체화를 억제함으로써 HER2 표적치료제, 특히 트라스투주맙 내성을 억제하고, PcG 의존적인 방법으로 ErbB 리간드 쉐데이즈(sheddases) ADAM 10/17의 후성적 조절을 통해 하류 신호전달을 억제하는 역할을 함을 본 발명에서 새롭게 밝혔다. 따라서, MEL-18이 HER2+ 암에서 항 HER2 치료에 대한 반응의 유망한 예후인자이자 예측인자로서 역할을 하며, 이를 활용하면 HER2 표적치료에 대한 내성을 극복할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HER2 양성 암에 대한 새로운 치료 전략의 제시를 위해, MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준 및/또는 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물을 제공한다.
상기 동반진단용 조성물은 구체적으로, HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 암은 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 조성물에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수 또는 MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 조성물에서 단백질 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하는 것을 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 측정결과 시료에서 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 경우, 상기 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함할 수 있다:
ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여가 필요함;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용투여가 필요함.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 개체의 HER2 양성 암 치료를 위해 MEL-18 유전자; MEL-18 유전자 발현 활성화제; MEL-18 단백질; MEL-18 단백질 활성화제; ADAM10 유전자 억제제; ADAM17 유전자 억제제; ADAM10 단백질 발현 억제제; ADAM17 단백질 발현 억제제; ADAM10 단백질 활성 억제제; 및 ADAM17 단백질 활성 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 처방 또는 상기 중 하나 이상과 HER2 표적치료제를 함께 처방하기 위한 정보를 제공하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 방법에서 유전자 복제(copy)수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준은 형광 핵산 혼성화(FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR)으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의하여 확인하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18의 mRNA 발현 수준; 및/또는 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트를 제공한다.
상기 키트는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자의 복제(copy)수, HER2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 HER2 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
상기 키트에서 유전자의 복제(copy) 수 또는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 유전자 또는 이의 mRNA나 HER2 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 키트에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 단백질 또는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 키트는 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 및/또는 MEL-18 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; 또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암 환자의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암 환자의 HER2 표적치료제 치료 보조용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에서 ADAM10 및/또는 ADAM17의 유전자 저해제는 ADAM10 및/또는 ADAM17 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물에서 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질 활성 저해제는 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 작용하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물에서 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질 활성 저해제는 INCB3619, INCB7839, WAY-022, TMI-2, CGS 27023, GW280264 및 GI254023로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
상기 조성물은 HER2 표적치료제와 함께 투여되는 것일 수 있고, 또는 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 단백질, ADAM10 유전자, ADAM10 단백질, ADAM17 유전자 및 ADAM17 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질과 MEL-18 유전자; MEL-18 단백질; ADAM10 유전자; ADAM10 단백질; ADAM17 유전자 및 ADAM17 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 접촉시키는 것, 및 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준;을 증가시키거나, ADAM10 및/또는 ADAM17 유전자의 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 억제하는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법은 상기 MEL-18 유전자 증폭; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 촉진하거나 ADAM10 및/또는 ADAM17 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 억제하는 후보물질을 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약물로 판단하는 것;을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; 및/또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체에 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물이 투여되는 개체에 HER2 표적치료제를 병용투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 투여 전에, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로부터 수득한 시료로부터 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 방법에서 ADAM10 및/또는 ADAM17의 유전자 또는 mRNA 발현 저해제는 ADAM10 및/또는 ADAM17 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법에서 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질 활성 저해제는 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 작용하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법에서 ADAM10 및/또는 ADAM17 단백질 활성 저해제는 INCB3619, INCB7839, WAY-022, TMI-2, CGS 27023, GW280264 및 GI254023로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 MEL-18은 HER2+ 암에서 항 HER2 표적치료제에 대한 개체의 반응에 대한 예후인자이자 예측인자로서 HER2+ 암 개체의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단에 사용할 수 있으며, 이를 통해 ADAM 10/17 저해제 투여 여부 또는 HER2 표적치료제와 병용 투여 여부를 결정하여 HER2 치료제에 대한 저항성을 극복하고 치료 효능을 향상시킴으로써 보다 효과적으로 HER2 양성 암을 치료할 수 있게 한다.
도 1a은 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, 상이한 유방암 코호트(TCGA 및 METABRIC)에서 MEL-18의 유전적 변이를 갖는 경우의 백분율(왼쪽)과 HYU 코호트에서 MEL-18 유전자 증폭 상태를 FISH분석으로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸다. 오른쪽 아래는 MEL-18 증폭의 양성인 경우의 대표적인 이미지를 보여주는 사진이다. MEL-18 신호는 적색; CEP17는 녹색; DAPI는 파란색으로 나타내었다. MEL-18amp는 MEL-18-증폭된 케이스; MEL-18 non-amp는 MEL-18 비-증폭된 케이스를 의미한다.
도 1b는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, 표시된 데이터 세트에서 MEL-18 발현과 증폭간의 상관관계를 보여주는 산포도이고, r값은 Pearson's 상관 관계 계수 분석을 통해 계산되었다.
도 1c는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, MEL-18 발현과 HER2 발현 사이의 상관 관계를 보여주는 산점도(위)와 표시된 데이터세트의 다른 유방암 아형에서 MEL-18 발현 수준의 박스 플롯(하단) 이고, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 기초해서, *** P <0.001 이다.
도 1d는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, METABRIC의 HER2 증폭 유방암 277 케이스 중에서 MEL-18 증폭과 관련된 OS 및 DFS 분석결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 로그-순위(log-rank) 테스트와 함께 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석되었다
도 1e는 MEL-18 증폭(왼쪽) 또는 mRNA 발현(오른쪽)에 따른 트라스트주맙으로 치료한 유방암 케이스의 DFS 분석을 나타낸다: 왼쪽 그래프는 임상 코호트, n=213; 오른쪽 그래프는 GSE55348, n=53. GSE55348(GEO의 코호트)는 MEL-18 발현의 66 번째 백분위 수에 따라 두 그룹으로 나뉘었다(high, > 66%; low, < 33%). 데이터는 로그-순위(log-rank) 테스트와 함께 Kaplan-Meier 방법(왼쪽) 또는 Gehan-Breslow-reslowk 테스트(오른쪽)를 이용해서 분석되었다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, HER2 증폭 유방암 세포주에서 MEL-18 증폭 및 발현을 나타내는 데이터(왼쪽) 및 MEL-18 발현과 증폭 간의 상관관계를 보여주는 산포도로, Pearson's 상관 계수 분석에 의한 결과이다(오른쪽).
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 각 유방암 세포주(BT474, SKBR3)에서 FISH로 측정 한 MEL-18 증폭 상태(왼쪽)를 나타내는 사진과, 각 유방암 세포주(BT474, MDA-MB-361, HCC1954, SKBR3)에서 MEL-18의 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타내는 그래프(오른쪽) 이며, 평균±SD(n=3), * P <0.05(Welch's ANOVA) 이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암 세포주에서 트라스트주맙 저항성에 대한 MEL-18의 효과를 확인한 결과이다. 각 세포주에서 MEL-18의 안정한 넉다운 또는 과발현은 면역블로팅을 통해서 확인되었다(위). 5일 동알 트라스트주맙(㎍/ml) 또는 비히클(Con)의 처리에 따른 세포 생존능은 SRB 분석법에 의해 분석되었다(아래). shCon은 shRNA 대조군; shMEL은 MEL-18 shRNA; Con은 빈 벡터(empty vector); 그리고 MEL은 MEL-18을 의미한다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 10 ㎍/ml 트라스투주맙(Trz) 또는 비히클로 처리한 세포의 생존능을 보여주는 그래프이다. 평균±SD(n=3), *** P <0.001 대 대조군(Con)(one-way ANOVA).
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 대조군 또는 MEL-18억제 BT474 세포가 주입된 NOD/SCID 마우스에서 종양 성장곡선을 보여주는 그래프로, 화살표는 트라스투주맙 또는 비히클로 치료가 시작된 시기를 의미한다. 평균±SEM(n=7). * P <0.05 대 대조군(Con 또는 shCon) 및 ††† P < 0.01 대 비히클-처리된 대조군(one-way ANOVA).
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따라 각 그룹의 이종이식 종양에서 MEL-18 및 Ki-67에 대한 면역염색결과를 나타낸다(평균±표준편차, n=5). IRS는 면역반응 점수(immunoreactive score). 스케일 바, 100 μm. *P < 0.05 vs. shCon 및 †P < 0.05 vs. 비히클(one-way ANOVA와 post-hoc LSD 테스트).
도 3a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 대조군(shCon)과 MEL-18 shRNA(shMEL)를 발현하는 BT474 세포에서, 서로 다른 RTK 신호-관련 마커를 보여주는 마이크로어레이 분석의 히트맵(heatmap) 사진이다.
도 3b 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 유전자세트에서 BT474/shMEL-18 세포의 유전자 발현 프로파일의 상관관계(상단) 분석 및 MEL-18 표적 유전자의 GO분석(Gene Ontology analysis)(하단) 분석 결과를 나타낸다.
도 3c 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 유전자의 발현을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타내며, 상기 값은 평균±SD(n=3)이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한, *** P <0.001 대 대조군(shCon 또는 Con)이다.
도 3d 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 RTK의 상이한 인산화 수준을 나타내는 MEL-18 또는 대조군을 발현하는 SKBR3 세포의 인산화-RTK 분석 결과(상단의 스팟 분석) 및 AlphaEaseFC Software로 측정한 상대적인 밴드의 강도 변화의 결과(하단의 막대그래프)를 나타낸다.
도 3e 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, MEL-18-넉다운(shMEL) 또는 MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포(BT474, ZR-75-30, SKBR3, HCC-1419)와 대조군 세포(shCon과 Con)의 면역블롯팅 결과를 나타내는 것으로, 각 RTK 및 하류의 인산화 변화 및 상대적인 발현을 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, MEL-18의 넉다운 또는 과발현에 의한 단백질 수준에서의 ADAM10과 ADAM17 발현 변화를 보여주는 면역블로팅 결과이다. SKBR3 및 HCC-1419 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군을 의미)는 ADAM10(~ 65kDa)의 성숙한 형태를 지배적으로 발현하였으며, BT474 및 ZR-75-30 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군을 의미)는 ADAM10(~ 80 kDa)의 전(pro)-형태를 발현하였다.
도 4b는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, 안정 세포주에서 ADAM10 및 ADAM17의 mRNA 수준의 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 것으로, BT474 세포에서 shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군을 의미하고, SKBR3 세포에서 MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군을 의미하며, qRT-PCR 결과는 3 회 측정의 평균±표준편차로 나타내고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 * P < 0.05, *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con) 이다.
도 4c는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포주 SKBR3(위), MEL-18-넉다운(shMEL) 유방암 세포주 BT474(아래), 대조군 세포(shCon 및 Con) 에서 ADAM10 및 ADAM17의 프로모터 영역에 모집된 각 단백질의 양을 보여주는 ChIP-qPCR 분석 결과로, 결과값은 3회 측정의 평균±SD 이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con)이며, IgG는 음성대조군이다.
도 4d는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 EZH2 및 RING1B와 MEL-18의 결합 수준에 대한 공동-면역침전 결과를 나타낸다. MEL-18에 대한 항체로 면역 침전(IP) 한 후, 지시 된 항체를 사용하여 면역 블로팅(IB)을 수행 하였다; MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포주 SKBR3 및 대조군 세포(Con).
도 4e는 본 발명의 실시예에 따른 MEL-18에 의해 제안된 유전자 사일런싱 모델을 보여준다.
도 5a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+ 유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, SKBR3 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군)와 BT474 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군)의 배양 배지 상등액에 존재하는 NRG1 리간드의 단백질 수준을 ELISA로 확인한 결과로, 각 결과값은 3 회 측정의 평균±SD이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 ** P < 0.01, *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con) 이다.
도 5b는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, HER2와 EGFR 사이의 이량체화 상태를 확인하기 위한 SKBR3 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군)와 BT474 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군)에 대한 면역침전 및 면역블로팅 결과이다.
도 5c는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, ADAM 10/17 억제제인 GW280264(GW) 1 μM로 24시간 동안 처리된 BT474 세포주의 용해물에서 ErbB 패밀리 단백질들의 발현 수준 및 인산화의 변화를 면역블로팅으로 측정한 결과이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군).
도 5d는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, BT474 세포주에 GW280264(GW)로 처리 한 후, ErbB 리간드의 분비 수준의 변화를 측정한 결과이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군, 비히클(vehicle)은 대조군).
도 5e는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, BT474 세포주에 트라스투주맙(Trz) 및/또는 GW280264(GW) 또는 비히클로 5 일간 처리한 세포생존능을 SRB 분석법(상부 그래프) 및 콜로니 형성 분석법(하단의 사진)으로 확인한 결과로, SRB 분석 결과값은 평균±SD(n=3)이고, *** P < 0.001 vs. 대조군(shCon), ††††† P < 0.001 vs. 비히클-처리군 그리고 one-way ANOVA에 근거한 ‡ P < 0.001 이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군, 비히클(vehicle)은 대조군).
도 5f는 ADAM10/17이 MEL-18 소실-유도된 ErbB 인산화 및 트라스트주맙 저항성을 매개하는 것을 보여주는 결과로, 각 그룹의 이종 이식 마우스로부터 얻은 종양 조직에서 ADAM10 및 ADAM17 발현의 면역화학 분석 결과를 보여준다. IRS는 면역반응 점수(immunoreactive score). 스케일 바, 100 μm. Mean ar, 100n = 5. *P < 0.05 vs. shCon(Student's t-test) (shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군).
도 5g는 ADAM10/17 발현과 MEL-18의 증폭 상태(왼쪽) 또는 발현 수준 (오른쪽)에 따른 트라스트주맙 치료받은 유방암 환자의 생존 분석결과를 나타낸다. A, 증폭; NA, 비-증폭; H, 높음; L, 낮음. 공개 자료의 코호트에서(GSE55348, n = 53), 환자는 표시된 유전자(고 발현군의 컷오프: MEL-18, 66번째 백분위수(percentile); ADAM10은 25 번째 백분위수 및 ADAM17은 33 번째 백분위수)의 여러 가지 분위수 표현에 의해 4 그룹으로 나누었다. 로그-순위 테스트(왼쪽)와 함께 Kaplan-Meier 방법을 또는 Gehan-Breslow-Wilcoxon 테스트(오른쪽)를 사용하여 데이터를 분석.
도 6은 본 발명의 일 실시예 따른 HER2+ 유방암에서 MEL-18에 의한 ErbB 신호 및 트라스투주맙 반응의 조절을 위해 제안된 모델을 보여준다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 여러 종류의 인간 암에서의 MEL-18 증폭 패턴을 보여주는 것으로, 다양한 암 유형 공용 데이터 세트의 HER2 증폭 케이스에서 MEL-18 증폭이 나타나는 경우의 백분율을 보여주는 그래프로, amp는 증폭된 경우; non-amp는 증폭이 되지 않은 경우를 의미한다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 여러 종류의 인간 암에서의 MEL-18 증폭 패턴을 보여주는 것으로, 17q12-21 증폭 산물에 위치한 다른 유전자와 HER2 유전자의 동시 증폭 백분율과 HER2 유전자좌 위치로부터의 거리를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 이용한 마이크로어레이의 MEL-18 표적 유전자의 기능을 분석확인한 결과로, 마이크로어레이 분석으로부터 확인한 MEL-18-억제 BT474 세포에서 상이하게 발현된 유전자와 GSEA를 보여준다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 이용한 마이크로어레이의 MEL-18 표적 유전자의 기능을 분석 확인한 결과로, 서로 다른 암 발생 경로로부터 유래된 MEL-18 억제와 통계학적으로 양의 관례를 갖는 유전자 세트의 플롯을 보여준다.
도9a 및 9b는 ADAM 패밀리 유전자의 프로모터 부위에 대한 MEL-18 결합의 ChIP-seq 분석의 결과를 보여주는 것으로, 마우스 배아줄기세포(GSE67868)로부터 MEL-18 표적의 ChIP-seq 데이터에 대한 피크맵의 예를 나타낸다.
도 1b는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, 표시된 데이터 세트에서 MEL-18 발현과 증폭간의 상관관계를 보여주는 산포도이고, r값은 Pearson's 상관 관계 계수 분석을 통해 계산되었다.
도 1c는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, MEL-18 발현과 HER2 발현 사이의 상관 관계를 보여주는 산점도(위)와 표시된 데이터세트의 다른 유방암 아형에서 MEL-18 발현 수준의 박스 플롯(하단) 이고, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 기초해서, *** P <0.001 이다.
도 1d는 MEL-18이 HER2 양성 유방암에서 긍정적 생존 결과와 관련되었음을 보여주는 결과로, METABRIC의 HER2 증폭 유방암 277 케이스 중에서 MEL-18 증폭과 관련된 OS 및 DFS 분석결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 로그-순위(log-rank) 테스트와 함께 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석되었다
도 1e는 MEL-18 증폭(왼쪽) 또는 mRNA 발현(오른쪽)에 따른 트라스트주맙으로 치료한 유방암 케이스의 DFS 분석을 나타낸다: 왼쪽 그래프는 임상 코호트, n=213; 오른쪽 그래프는 GSE55348, n=53. GSE55348(GEO의 코호트)는 MEL-18 발현의 66 번째 백분위 수에 따라 두 그룹으로 나뉘었다(high, > 66%; low, < 33%). 데이터는 로그-순위(log-rank) 테스트와 함께 Kaplan-Meier 방법(왼쪽) 또는 Gehan-Breslow-reslowk 테스트(오른쪽)를 이용해서 분석되었다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, HER2 증폭 유방암 세포주에서 MEL-18 증폭 및 발현을 나타내는 데이터(왼쪽) 및 MEL-18 발현과 증폭 간의 상관관계를 보여주는 산포도로, Pearson's 상관 계수 분석에 의한 결과이다(오른쪽).
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 각 유방암 세포주(BT474, SKBR3)에서 FISH로 측정 한 MEL-18 증폭 상태(왼쪽)를 나타내는 사진과, 각 유방암 세포주(BT474, MDA-MB-361, HCC1954, SKBR3)에서 MEL-18의 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타내는 그래프(오른쪽) 이며, 평균±SD(n=3), * P <0.05(Welch's ANOVA) 이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암 세포주에서 트라스트주맙 저항성에 대한 MEL-18의 효과를 확인한 결과이다. 각 세포주에서 MEL-18의 안정한 넉다운 또는 과발현은 면역블로팅을 통해서 확인되었다(위). 5일 동알 트라스트주맙(㎍/ml) 또는 비히클(Con)의 처리에 따른 세포 생존능은 SRB 분석법에 의해 분석되었다(아래). shCon은 shRNA 대조군; shMEL은 MEL-18 shRNA; Con은 빈 벡터(empty vector); 그리고 MEL은 MEL-18을 의미한다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 10 ㎍/ml 트라스투주맙(Trz) 또는 비히클로 처리한 세포의 생존능을 보여주는 그래프이다. 평균±SD(n=3), *** P <0.001 대 대조군(Con)(one-way ANOVA).
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 HER2 양성 유방암에서 MEL-18의 억제가 트라스투주맙 저항성을 유도함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 대조군 또는 MEL-18억제 BT474 세포가 주입된 NOD/SCID 마우스에서 종양 성장곡선을 보여주는 그래프로, 화살표는 트라스투주맙 또는 비히클로 치료가 시작된 시기를 의미한다. 평균±SEM(n=7). * P <0.05 대 대조군(Con 또는 shCon) 및 ††† P < 0.01 대 비히클-처리된 대조군(one-way ANOVA).
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따라 각 그룹의 이종이식 종양에서 MEL-18 및 Ki-67에 대한 면역염색결과를 나타낸다(평균±표준편차, n=5). IRS는 면역반응 점수(immunoreactive score). 스케일 바, 100 μm. *P < 0.05 vs. shCon 및 †P < 0.05 vs. 비히클(one-way ANOVA와 post-hoc LSD 테스트).
도 3a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 대조군(shCon)과 MEL-18 shRNA(shMEL)를 발현하는 BT474 세포에서, 서로 다른 RTK 신호-관련 마커를 보여주는 마이크로어레이 분석의 히트맵(heatmap) 사진이다.
도 3b 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 유전자세트에서 BT474/shMEL-18 세포의 유전자 발현 프로파일의 상관관계(상단) 분석 및 MEL-18 표적 유전자의 GO분석(Gene Ontology analysis)(하단) 분석 결과를 나타낸다.
도 3c 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 유전자의 발현을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타내며, 상기 값은 평균±SD(n=3)이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한, *** P <0.001 대 대조군(shCon 또는 Con)이다.
도 3d 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, 각 RTK의 상이한 인산화 수준을 나타내는 MEL-18 또는 대조군을 발현하는 SKBR3 세포의 인산화-RTK 분석 결과(상단의 스팟 분석) 및 AlphaEaseFC Software로 측정한 상대적인 밴드의 강도 변화의 결과(하단의 막대그래프)를 나타낸다.
도 3e 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18이 ErbB 인산화와 하류 신호를 조절함을 보여주는 결과로, MEL-18-넉다운(shMEL) 또는 MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포(BT474, ZR-75-30, SKBR3, HCC-1419)와 대조군 세포(shCon과 Con)의 면역블롯팅 결과를 나타내는 것으로, 각 RTK 및 하류의 인산화 변화 및 상대적인 발현을 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, MEL-18의 넉다운 또는 과발현에 의한 단백질 수준에서의 ADAM10과 ADAM17 발현 변화를 보여주는 면역블로팅 결과이다. SKBR3 및 HCC-1419 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군을 의미)는 ADAM10(~ 65kDa)의 성숙한 형태를 지배적으로 발현하였으며, BT474 및 ZR-75-30 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군을 의미)는 ADAM10(~ 80 kDa)의 전(pro)-형태를 발현하였다.
도 4b는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, 안정 세포주에서 ADAM10 및 ADAM17의 mRNA 수준의 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 것으로, BT474 세포에서 shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군을 의미하고, SKBR3 세포에서 MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군을 의미하며, qRT-PCR 결과는 3 회 측정의 평균±표준편차로 나타내고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 * P < 0.05, *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con) 이다.
도 4c는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 결과를 보여주는 것으로, MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포주 SKBR3(위), MEL-18-넉다운(shMEL) 유방암 세포주 BT474(아래), 대조군 세포(shCon 및 Con) 에서 ADAM10 및 ADAM17의 프로모터 영역에 모집된 각 단백질의 양을 보여주는 ChIP-qPCR 분석 결과로, 결과값은 3회 측정의 평균±SD 이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con)이며, IgG는 음성대조군이다.
도 4d는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17 억제에 따른 EZH2 및 RING1B와 MEL-18의 결합 수준에 대한 공동-면역침전 결과를 나타낸다. MEL-18에 대한 항체로 면역 침전(IP) 한 후, 지시 된 항체를 사용하여 면역 블로팅(IB)을 수행 하였다; MEL-18-과발현(MEL) 유방암 세포주 SKBR3 및 대조군 세포(Con).
도 4e는 본 발명의 실시예에 따른 MEL-18에 의해 제안된 유전자 사일런싱 모델을 보여준다.
도 5a는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+ 유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, SKBR3 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군)와 BT474 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군)의 배양 배지 상등액에 존재하는 NRG1 리간드의 단백질 수준을 ELISA로 확인한 결과로, 각 결과값은 3 회 측정의 평균±SD이고, two-tailed Student's t 검정에 기초한 ** P < 0.01, *** P < 0.001 대 대조군(shCon 또는 Con) 이다.
도 5b는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, HER2와 EGFR 사이의 이량체화 상태를 확인하기 위한 SKBR3 세포주(MEL은 MEL-18 과발현 실험군, Con은 대조군)와 BT474 세포주(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군)에 대한 면역침전 및 면역블로팅 결과이다.
도 5c는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, ADAM 10/17 억제제인 GW280264(GW) 1 μM로 24시간 동안 처리된 BT474 세포주의 용해물에서 ErbB 패밀리 단백질들의 발현 수준 및 인산화의 변화를 면역블로팅으로 측정한 결과이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군).
도 5d는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, BT474 세포주에 GW280264(GW)로 처리 한 후, ErbB 리간드의 분비 수준의 변화를 측정한 결과이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군, 비히클(vehicle)은 대조군).
도 5e는 본 발명의 실시예에 따라 MEL-18 억제(Knockdown)에 의해 증가된 ADAM10/17 발현이 ErbB 인산화를 증가시키고, HER2+유방암에서 트라스투주맙 저항성을 유도함을 보여주는 것으로, BT474 세포주에 트라스투주맙(Trz) 및/또는 GW280264(GW) 또는 비히클로 5 일간 처리한 세포생존능을 SRB 분석법(상부 그래프) 및 콜로니 형성 분석법(하단의 사진)으로 확인한 결과로, SRB 분석 결과값은 평균±SD(n=3)이고, *** P < 0.001 vs. 대조군(shCon), ††††† P < 0.001 vs. 비히클-처리군 그리고 one-way ANOVA에 근거한 ‡ P < 0.001 이다(shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군, 비히클(vehicle)은 대조군).
도 5f는 ADAM10/17이 MEL-18 소실-유도된 ErbB 인산화 및 트라스트주맙 저항성을 매개하는 것을 보여주는 결과로, 각 그룹의 이종 이식 마우스로부터 얻은 종양 조직에서 ADAM10 및 ADAM17 발현의 면역화학 분석 결과를 보여준다. IRS는 면역반응 점수(immunoreactive score). 스케일 바, 100 μm. Mean ar, 100n = 5. *P < 0.05 vs. shCon(Student's t-test) (shMEL은 MEL-18이 억제된 실험군, shCon은 대조군).
도 5g는 ADAM10/17 발현과 MEL-18의 증폭 상태(왼쪽) 또는 발현 수준 (오른쪽)에 따른 트라스트주맙 치료받은 유방암 환자의 생존 분석결과를 나타낸다. A, 증폭; NA, 비-증폭; H, 높음; L, 낮음. 공개 자료의 코호트에서(GSE55348, n = 53), 환자는 표시된 유전자(고 발현군의 컷오프: MEL-18, 66번째 백분위수(percentile); ADAM10은 25 번째 백분위수 및 ADAM17은 33 번째 백분위수)의 여러 가지 분위수 표현에 의해 4 그룹으로 나누었다. 로그-순위 테스트(왼쪽)와 함께 Kaplan-Meier 방법을 또는 Gehan-Breslow-Wilcoxon 테스트(오른쪽)를 사용하여 데이터를 분석.
도 6은 본 발명의 일 실시예 따른 HER2+ 유방암에서 MEL-18에 의한 ErbB 신호 및 트라스투주맙 반응의 조절을 위해 제안된 모델을 보여준다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 여러 종류의 인간 암에서의 MEL-18 증폭 패턴을 보여주는 것으로, 다양한 암 유형 공용 데이터 세트의 HER2 증폭 케이스에서 MEL-18 증폭이 나타나는 경우의 백분율을 보여주는 그래프로, amp는 증폭된 경우; non-amp는 증폭이 되지 않은 경우를 의미한다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 여러 종류의 인간 암에서의 MEL-18 증폭 패턴을 보여주는 것으로, 17q12-21 증폭 산물에 위치한 다른 유전자와 HER2 유전자의 동시 증폭 백분율과 HER2 유전자좌 위치로부터의 거리를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 이용한 마이크로어레이의 MEL-18 표적 유전자의 기능을 분석확인한 결과로, 마이크로어레이 분석으로부터 확인한 MEL-18-억제 BT474 세포에서 상이하게 발현된 유전자와 GSEA를 보여준다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 이용한 마이크로어레이의 MEL-18 표적 유전자의 기능을 분석 확인한 결과로, 서로 다른 암 발생 경로로부터 유래된 MEL-18 억제와 통계학적으로 양의 관례를 갖는 유전자 세트의 플롯을 보여준다.
도9a 및 9b는 ADAM 패밀리 유전자의 프로모터 부위에 대한 MEL-18 결합의 ChIP-seq 분석의 결과를 보여주는 것으로, 마우스 배아줄기세포(GSE67868)로부터 MEL-18 표적의 ChIP-seq 데이터에 대한 피크맵의 예를 나타낸다.
이하에서, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18의 mRNA 발현 수준; 및/또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하는 제제를 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물에 관한 것이다.
상기 MEL-18은 polycomb-repressive complex 1(PRC1)에 속하는 폴리콤 그룹(polycomb group, PcG)의 단백질이다. PcG 단백질은 2개의 다중 복합체로 구성된 중요한 후성 유전 조절제이다. 하나는 PRC2로, 라이신 27(H3K27me3)에서 히스톤 3의 3중 메틸화에 의한 침묵하는 유전자의 개시 복합체이고, 다른 하나는 PRC1으로, H3K27me3을 인식하고 라이신 119(H2AK119ub)에서 히스톤 H2A 단일-유비퀴틴화 및 전사 개시 시스템의 봉쇄(1-3)를 비롯한 다양한 기작을 통해 유전자 침묵을 유지한다. MEL-18은 polycomb group ring finger 2, RNF110, ZNF144라고도 알려져 있으며, NCBI 등에 유전자, mRNA 및 단백질 정보를 참고할 수 있다. 예를 들어, NCBI Gene ID: 454614(Homo sapiens (human)); NCBI Reference Sequence: NP_009075.1; 또는 NCBI Gene ID: 7703로 등록되어 있으며, 상기 유전자 정보 외에, MEL-18로 알려진 서열 정보를 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, HER2 양성 유방암을 갖는 개체에서 MEL-18 유전자의 증폭이 나타나지 않거나, MEL-18 mRNA이 저발현되는 경우 HER2 표적치료제인 트라스트주맙에 대한 저항성을 갖는 것을 확인하였고, MEL-18의 과발현을 유도하는 경우 또는 ADAM 10 및/또는 ADAM17 저해제를 처리하는 경우 트라스트주맙에 대한 저항성이 개선되는 것을 확인하였다. 또한, HER2 양성을 나타내는 위암, 폐암, 식도암 개체에서도 유방암과 유사하게 MEL-18이 절반 정도만 증폭된 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 MEL-18은 HER2 양성 암 개체에서 HER2 표적치료제의 적용 여부; ADAM 10 및/또는 ADAM17 저해제의 적용 여부; 또는 이들의 병용 투여 여부를 결정하기 위한 동반진단용 마커로서 새로운 용도를 갖는다.
본 발명에서 용어 "MEL-18"로 지칭하는 경우, MEL-18 유전자, MEL-18 유전자의 mRNA 또는 MEL-18 단백질을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, MEL-18, MEL-18 유전자 또는 MEL-18 단백질은 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 단편 또는 재조합 단백질, 코돈 최적화된 cDNA 등을 포함하는 것으로 해석된다. 따라서, 본 발명에서 MEL-18의 발현 수준은 MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 MEL-18 단백질 발현 수준을 포함하는 의미이다. 또한, 본 발명에서 언급되는 용어 "HER2", "ADAM 10", "ADAM 17"은 모두 각각의 유전자, mRNA 또는 이의 단백질을 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 용어 "동반진단(Companion Diagnostic)"이란, 특정 치료 약물을 특정 환자에 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위한 진단 테스트 중 하나를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체에 HER2 표적치료제를 적용하기 위한 가능성을 확인하거나 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제를 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위해서, 상기 암을 갖는 개체에서 MEL-18 유전자의 복제수, mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 MEL-18 단백질 발현 수준을 동반진단 마커로서 측정할 수 있다. 따라서, 이러한 측면에서 본 발명에서 동반진단은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "판별"은 특정 기준에 따라 대상을 구별하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 것으로 진단되거나 가질 가능성이 있는 개체가 HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성을 갖거나 갖지 않는 것을 구별하는 것, 또는 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 갖거나 갖지 않는 것을 구별하는 의미로 사용 될 수 있다.
또한, 본 발명에서 "투여의 필요성"이라는 표현은 특정 치료제(약물)에 대한 치료효과를 가질 것이라고 예상되는 개체에만 상기 치료제를 투여하고자 하는 목적으로, 상기 치료제의 투여 여부를 결정하기 위한 것일 수 있고, 상기 결정은 동반진단 마커의 수준을 측정을 통해서 할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 HER2 표적치료제; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여 여부를 결정하기 위해서, 동반진단용 동반바이오 마커로서 MEL-18 유전자의 복제수, mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 MEL-18 단백질 발현 수준을 동반진단 마커로서 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암"은 HER2 유전자의 증폭 또는 과발현을 나타내는 암을 의미하는 것으로, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 양성을 나타내는 유방암, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, HER2 양성 암은 HER2 양성 유방암, HER2 양성 위암, 또는 HER2 양성 폐암일 수 있다. 상기 HER2 양성(유전자 증폭 또는 과발현) 여부는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 기준에 의해서 결정될 수 있고, 이는 각 나라에서 HER2 양성 여부를 진단하는 임상적 기준 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, HER2 양성을 나타내는 유방암 세포에서 MEL-18이 동반진단용 마커로 이용될 수 있음을 확인하였고, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암의 경우에도 유방암과 유사한 MEL-18의 증폭 특성을 가짐을 확인하였는바, 본 발명의 MEL-18은 상기 암에서 동반진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 동반진단용 조성물은 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및/또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "유전자의 복제(copy) 수"는 각 개체의 특정 유전자형(genotype)에서 특정 유전자의 수를 의미하는 것으로, 여러 복제가 형성되는 특정 유전자 또는 유전자 단편의 수를 의미한다. 본 발명에서 유전자의 복제수를 측정하는 것은 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 복제수변이(Copy number variation 또는 Copy number variant, CNV) 및 유전자 복제수(Gene Copy Number, GCN)를 측정하는 것과 동일한 것으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 유전자의 복제 수는 특정한 기준값에 대하여 복제수가 그 이상 또는 초과인 경우 “유전자의 증폭”이 있는 것으로 나타낼 수 있고, 기준값 미만 또는 이하인 경우 “유전자의 증폭”이 없는 것으로 나타낼 수 있다. 본 발명에서 상기 "유전자의 증폭"은 유전자의 중복과 혼용해서 사용될 수 있는 것으로, 유전자 복제(copy)의 수가 기준값의 이상 또는 초과인 경우를 의미한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 HER2 양성 유방암 개체에서, FISH에 의한 유전자의 복제수를 측정한 측정값에서, MEL-18의 유전자의 복제수가 6.0을 기준값으로 하여, 이를 초과하는 경우 유전자의 증폭이 있는 것으로 설정하고, 분석을 수행하였다.
본 발명에서 용어 "mRNA 발현 수준" 또는 "단백질 발현 수준"은 특정 유전자의 유전정보를 리보솜에 전달하는 메신저 RNA가 발현되는 정도 또는 이로부터 단백질이 발현되는 정도를 의미한다. 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 특정 기준값에 대하여 발현 수준이 그 이상 또는 초과인 경우 “과발현”이라고 나타낼 수 있고, 기준값 미만 또는 이하인 경우 “저발현”이라고 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, MEL-18 CNA 2 이상에 해당하는 MEL-18 mRNA 발현값 MEL-18(약 1 (도 1b의 TCGA), 약 11(도 1b의 METABRIC); RNA-seq 또는 마이크로어레이를 통한 측정, z-scores)을 기준값으로 설정하고 분석을 수행하였다. 본 발명의 또 다른 실시예에서 마이크로어레이를 통해 얻은 측정값에서 MEL-18의 mRNA 발현값이 상위 2/3(66%)에 해당하는 그룹을 과발현(양성)으로 설정하고 분석을 수행하였다.
본 발명에서 용어 "유전자의 복제(copy) 수를 측정하는 제제" 또는 "mRNA 발현 수준을 측정하는 제제"는 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynuleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서 프라이머는 MEL-18 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은, 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 프라이머는 MEL-18 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적인 센스 및/또는 안티센스 프라이머일 수 있다. 센스 또는 안티센스 프라이머를 단독으로 포함할 수도 있고, 센스 및 안티센스 프라이머를 함께 포함할 수도 있다. 또한, MEL-18에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 일 수 있다.
본 발명에서 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 라벨링되어 있어서 특정 유전자 또는 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 "유전자 복제수를 측정하는 방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 유전체 전장 분석방법과 표적 특이적 방법을 모두 사용할 수 있다. 구체적으로 형광 핵산 혼성화(fluorescent in situ hybridization, FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR) 으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준을 측정하는 방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), RNA-염기순서결정법(RNA-seq; RNA-sequencing), 나노스트링 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 동반진단이 필요한 개체로부터 수득한 생물학적 시료의 mRNA 발현량과 대조시료에서의 mRNA 발현량을 비교해서 mRNA의 과발현/저발현 여부를 확인하거나, 상기 시료의 mRNA 발현값을 측정해서 기준값과 비교해서 과발현/저발현 여부를 확인, 또는, HER2 표적치료제 처리 후 mRNA 발현 수준이 HER2 치료제 처리 전 MEL-18 mRNA 발현 수준 보다 낮은지 비교해서 발현 증가/발현 저하 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서 "단백질 수준을 측정하는 제제"는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 MEL-18 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학 염색(IHC), 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "약제 저항성"은 특정 약제에 대하여 통계학적으로 유의하게 세포성 또는 생물학적 반응을 나타내지 않는 것을 의미한다. 구체적으로 약제를 이용한 치료에 대해 암세세포의 사멸 속도 또는 세포 사멸이 나타나지 않거나, 감소하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "HER2 표적치료제"는 "HER2 유전자 또는 단백질 저해제"와 혼합하여 사용되고, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자 또는 단백질에 특이적으로 작용하여 HER2 유전자 또는 단백질 저해제의 발현 또는 활성을 억제 또는 저해시키는 효과를 갖는 제제로서의 항 HER2 치료제를 모두 포함하는 의미이다. 구체적으로 HER2의 이량체화 억제를 통한 발현 또는 활성 저해제일 수 있다.
상기 HER2 발현 저해제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
상기 HER2 단백질 활성 저해제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 천연 또는 합성화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER-2 수용체를 표적으로 하는 치료제를 의미하는 것으로, 예를 들어 항체성 치료제 일 수 있다. HER-2 표적치료제는 현재 상업적으로 판매하고 있는 의약품 외에도, 이미 논문, 특허 등을 통해서 알려진 표적인 HER-2 수용체를 치료 표적으로 하는 치료제라면 모두 본 발명에서 의도하는 HER2 표적치료제 범위에 속할 수 있다. 구체적으로 본 발명은 HER-2 수용체에서 신호전달에 MEL-18이 관여함을 구체적으로 밝혔으므로, MEL-18을 이용한 HER-2 표적치료제에 대한 저항성/민감성 판별, 민감성 회복, ADAM 10/17 저해제 처리여부 등을 결정하기 위한 동반진단을 치료제의 종류에 관계없이 폭 넒게 적용될 수 있음을 알 수 있으므로, HER-2 수용체를 표적으로 하는 치료제는 모두 본 발명에 포함될 수 있다. 구체적으로 HER-2 수용체를 표적으로 하는 치료제는 트라스투주맙, 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군으로부터 선택 된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트라스트주맙(Trastuzumab)은 허셉틴(Herceptin)이라고도 한다. 사람 상피증식인자 수용체 HER-2유전자 또는 그의 유전자산물 과잉발현으로 나타나는 전이성암에 대한 치료제로, HER2의 세포외 부분을 항원 결정부(epitope)로 하여 인식하는 항체성 치료제이다.
상기 퍼투주맙은 전이성 질환에 대한 항-HER2 치료제로서, 퍼제타 등의 상품명으로 상업적으로 판매되고 있다. HER-2의 신호전달을 차단하여 HER2 이합체화를 억제하는 작용을 한다. 상기 퍼투주맙은 트라스트주맙 또는 도세탁셀과 병용투여될 수 있다.
상기 T-DM1(트라스투주맙엠탄신, trastuzumab emtansine)은 ado-trastuzumab emtansine이라고도 하며, 캐싸일라(Kadcyla)의 상품명으로 상업적으로 판매되고 있는 항체-약물 컨쥬게이트 형태의 치료지에다. 트라스트주맙이 세포독성제(cytotoxic agent)인 엠탄신(emtansine, DM1)에 결합된 구조를 갖는다.
본 발명에서 용어 "개체" 또는 "환자"는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 상기 포유동물은 개, 말, 고양이, 소, 영장류, 마우스 및 랫트를 모두 포함하는 것으로, 바람직한 구현예에 따라 인간일 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 동반진단용 조성물에 대한 기재내용은 본 발명의 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법은 또한 상기 측정결과 시료에서 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 경우, 상기 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함할 수 있다:
ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여가 필요함;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용투여가 필요함.
상기 유전자 복제 수 및/또는 mRNA 발현 수준이 기준값 미만 또는 이하이거나 단백질 활성 수준이 기준값 미만 또는 이하인 경우에는 MEL-18 유전자 미증폭(또는 음성) 또는 MEL-18 저발현으로 구분될 수 있고, 이는 MEL-18 유전자 유전자의 증폭이 없거나 발현이 감소된 상태를 의미하는 것이다.
상기 측정에 의하여 MEL-18이 미증폭(음성) 또는 저발현으로 판단된 개체, 즉 기준값보다 낮은 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 나타내는 개체는 HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮거나, 상기 치료제에 대한 저항성을 갖는 것으로 구분 할 수 있다. 또한, 상기 개체가 HER2 표적치료제의 투여를 받은 개체인 경우, HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량할 것으로 예측할 수 있고, 투여된 HER2 표적치료제에 이하여 약제 저항성을 갖는다고 판단할 수 있다. 따라서, 상기 개체에서 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 높이거나 저항성을 낮추기 위해서 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여(또는 처방)가 필요하다고 판단하거나 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용투여; 또는 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제의 투여(또는 처방)이 필요하다고 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "기준값(reference value)"은 유전자의 증폭/비증폭; 또는 mRNA 또는 단백질의 과발현/저발현을 나누는 기준이 되는 값을 의미한다. 상기 기준값은 일 예로 특정 약물의 처리 전 개체의 평균 유전자 복제 수 또는 평균 mRNA/단백질 발현 수준 이거나, 정상 개체의 평균 유전자 복제 수 또는 평균 mRNA/단백질 발현 수준 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 기준값은 특정 환자군의 평균 유전자 복제수의 분포 또는 mRNA/단백질 발현 수준의 분포에 따라 정해질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 유전자 복제수, mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용하는 유전자, mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 방법을 이용하여 각 개체의 시료로부터 평균 유전자 복제수, mRNA 발현 수준 이나 단백질 발현 수준을 측정하고, 측정값의 분포에서 상위 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에 해당하는 경우의 측정값을 기준값으로 설정할 수 있다.
일 예로, MEL-18 유전자 복제 수의 경우, 기준값은 유전자 복제수 1 카피 이상, 2 카피 이상, 3카피 이상, 4 카피 이상, 5카피 이상, 6카피 이상, 7카피 이상, 8카피 이상, 9 카피 이상, 또는 10 카피 이상 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유전자 복제수의 경우, 형광 핵산 혼성화(FISH)법에 따라 각 개체의 유전자 복제수를 측정하고, 약 상위 50%에 해당하는 경우를 MEL-18 유전자의 양성/음성 여부를 나누는 기준으로 설정하였다. 이때 기준값은 6 카피(copy)였고, 유전자 복제수가 6.0 카피(gene/chromosome ratio > 6.0)를 초과하는 경우 MEL-18 유전자가 증폭된 것으로 경우로 분류하였다.
다른, 구체적인 예로 전체-엑솜 염기서열분석(Whole-exome seq) 또는 SNP 어레이 6.0를 통해서 복제수변이(CNV)를 검출하고, GISTIC 알고리즘을 이용하여 다음과 같이 분류하고: (+2(증폭; amplication), +1(중복; duplication), 0 (뉴트럴; neutral), -1 (결손; deletion), -2 (동형접합성 결손; homozygous deletion), +2 이상 일 때(유전자 복제(copy)수가 4 이상) 일 때 증폭(amplification)으로 분류하였다.
다른, 구체적인 예로 단백질 발현 수준의 경우, MEL-18 항체를 이용해서 면역조직화학 염색에 의해서 단백질을 측정하고, 염색 강도와 면적을 정량화해서 단백질 발현의 측정값을 구할 수 있다. 면역 염색된 세포의 백분율에 따라 0점(염색된 세포 없음), 1점(1% 내지 24%의 세포가 염색됨), 2점(25% 내지 49% 세포가 염색됨), 3점(50% 내지 74% 세포가 염색됨), 4점(75% 내지 100% 세포가 염색됨)점수화 하고, 염색 강도(intensity)에 따라 0점(염색 안됨), 1점(약한(weak) 염색), 2점(중간 염색), 그리고 3점(강한 염색)으로 각각 점수화해서, 상기 두 점수를 곱하여 단백질 발현에 대한 최종 측정값(점수)을 얻을 수 있다. 상기 최종 측정값의 분포에서 상위 25%에 해당하는 경우를 양성/음성(또는 과발현/저발현)을 나누는 기준으로 설정하였고, 이 경우 측정값은 4 였다. 따라서 측정값이 4 이상인 시료 또는 개체에 대해서는 단백질 발현이 과발현 또는 양성이라고 판단할 수 있다.
또 다른 본 발명의 일 실시예에서, mRNA 발현 수준은 MEL-18 CNA 2 이상에 해당하는 MEL-18 mRNA 발현값 MEL-18(약 1(도 1b의 TCGA), 약 11(도 1b의 METABRIC); RNA-seq 또는 마이크로어레이를 통한 측정, z-scores)을 기준값으로 설정하고 분석을 수행하였고, 또 다른 실시예에서는 마이크로어레이를 통해 얻은 측정값에서 MEL-18의 mRNA 발현값이 상의 2/3(66%)에 해당하는 그룹을 과발현(양성)으로 설정하고 분석을 수행하였다.
그 외에 MEL-18 유전자 또는 단백질의 판독 또는 기준값 설정은 [Jeong-Yeon Lee et al., jci.org Volume 125, Number 5, May 2015, “MEL-18 loss mediates estrogen receptor-￥α downregulation and hormone independence“] 또는 http://www.cbioportal.org/faq.jsp를 참고할 수 있다.
앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 기준값은 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 설정될 수 있고, 각종 통계법 및 통계를 구하기 위한 소프트웨어 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 기준값은 시료(또는 개체)의 총 수(n)에 따라서 달라지거나 설정하고자 하는 목적에 따라서 값이 상이해질 수 있고, 본 발명의 MEL-18 마커를 이용해서 키트 등을 제조하는 경우, 제품의 최적화 수준 등에 따라 달라질 수 있으나, 그 기준값은 본 발명을 참고하여 설정할 수 있는 것이므로, 모두 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 기준값은 통상적인 방법에 따라서 설정된 소정(pre-determined)의 값 일 수 있다.
또한, 상기 방법은 MEL-18 유전자 미증폭(또는 음성) 또는 MEL-18 저발현으로 구분된 개체에게 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 처방(또는 처방을 위해 정보를 제공)하는 것;을 더 포함할 수 있다. 또는, MEL-18 유전자 미증폭(또는 음성) 또는 MEL-18 저발현으로 구분된 개체에게 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 HER2 표적치료제를 함께 처방(또는 처방을 위해 정보를 제공)하는 것;을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"는 소변, 체액(혈액, 림프액 또는 조직액 등 포함), 또는 생검 조직일 수 있고, 바람직하게는 암을 갖는 개체로부터 얻은 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 HER2 양성 암으로 의심되거나, 판별 또는 진단받은 개체로부터 얻은 것일 수 있다.
본 발명은 또한, MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트 또는 동반진단 시스템 제공한다.
상기 동반진단용 조성물 또는 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 설명은 본 발명의 동반진단용 키트 또는 동반진단 시스템에 준용 될 수 있다.
상기 키트는 또는 시스템은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자의 복제(copy) 수; HER2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 HER2 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 동반진단용 키트는 시료의 개체가 HER2 양성인지 여부와 HER2 표적치료제에 대한 저항성(또는 감수성)을 갖는지를 동시에 판단할 수 있다. HER2 양성에 해당하는지 여부는 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법에 따라 판단할 수 있고, 예를 들어 HER2 양성 유방암의 경우 [J Clin Oncol. 2007 Jan 1;25(1):118-45. Epub 2006 Dec 11; PMID: 17159189]에 개시된 기준에 따라 판단, HER2 유전자 복제수가 6을 초과하는 경우 양성으로 판단할 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니고, HER2 양성 암종에 따라 달라질 수 있고, 임상 기준에 따라 각 국가에서 개별적으로 정하는 방법 및/또는 기준이 있는 경우, 이에 따라 결정될 수 있다.
상기 유전자의 복제(copy) 수 또는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 유전자/mRNA 또는 HER2 유전자/mRNA 각각에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 단백질 또는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 키트 또는 시스템은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에서, 암 개체로부터 얻은 시료로부터 HER2 양성여부를 확인하고, MEL-18 유전자의 복제수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현수준 또는 MEL-18 단백질의 발현/활성 수준을 측정해서, 항 HER2 치료제에 대한 처방 여부를 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 개체가 기준값 이하의 MEL-18 유전자 복제수 및/또는 mRNA 발현 수준을 갖는 경우, 상기 개체는 HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮거나, HER2 표적치료제에 대한 저항성을 갖는 것으로 구분 할 수 있다. 또한, 상기 개체가 HER2 표적치료제의 투여를 받은 개체인 경우, HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량할 것으로 예측할 수 있고, 투여된 HER2 표적치료제에 대하여 약제 저항성을 갖는다고 판단할 수 있다. 따라서, 상기 개체에서 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 높이거나 저항성을 낮추기 위해서 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 투여가 필요하다고 판단하거나 HER2 표적치료제와 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 저해제의 병용투여; 또는 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제의 투여(또는 처방)이 필요하다고 판단할 수 있다.
상기 키트는 통상적인 유전자 복제수, mRNA 발현 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 또는 어레이 키트일 수 있다. RT-PCR 키트의 경우, MEL-18 유전자 및/또는 HER2 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 통상적으로 키트의 구성에 포함될 수 있는 것을 포함할 수 있다. 또한, 동반진단 키트 또는 시스템을 위한 통상적인 기술이 본 발명에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암 환자의 HER2 표적치료제 치료 보조용 약학 조성물을 제공한다.
상기에서 기재한 동반진단용 조성물, 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 동반진단용 키트에 대한 설명은 본 발명의 약학 조성물에 준용될 수 있다.
상기 MEL-18 유전자는 MEL-18 유전자를 포함하는 벡터시스템의 형태로 본 조성물에 포함될 수 있고, 상기 조성물은 유전자 치료제 등의 형태로 투여될 수 있다.
MEL-18 유전자 발현 활성화제 역시, MEL-18 유전자의 발현을 촉진할 수 있는 단백질, 화합물, 핵산분자 등 일 수 있고, 또는 상기 핵산분자는 벡터시스템의 형태로 본 조성물에 포함될 수 있다.
MEL-18 단백질은 단백질 그 자체로 투여되거나, 상기 단백질을 코딩할 수 있는 mRNA 서열을 포함하는 벡터시스템으로 투여될 수 있다. MEL-18 단백질 활성화제는 상기 단백질의 활성을 촉진할 수 있는 단백질, 화합물, 핵산분자 등 일 수 있고, 상기 핵산분자는 벡터시스템에 포함된 형태로 본 조성물에 포함될 수 있고, 유전자 치료제 등의 형태로 투여될 수 있다. 상기 유전자 치료제 또는 벡터 시스템 등의 구현은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. HER2 양성 암을 가지면서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 및/또는 MEL-18 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; 및/또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성이 발현되거나 발현 가능성이 예상되는 개체에 ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제을 투여하거나, 상기 ADAM 10/17 저해제와 HER2 표적치료제를 병용 투여하는 경우, 상기 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 억제하고, 약제 민감성 및 치료제의 효과를 향상시키고, 예후를 좋게 할 수 있다. 상기 ADAM10 유전자 및/또는 ADAM17 유전자 저해제는 ADAM 10 및/또는 ADAM 17 유전자의 발현을 저해하는 것으로, 상기 저해는 유전자의 전사(transcript) 조절하여 전사가 되지 못하도록 하거나, 상기 유전자의 mRNA에서 단백질로 해독(translation)되는 과정을 방해하여 단백질의 발현이 되지 못하도록 하거나, 단백질 및/또는 mRNA 자체를 분해시키는 것을 모두 포함하는 의미이다. 따라서, 상기 유전자 저해제는 유전자의 mRNA 발현 저해제 및 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 저해제를 모두 포함하는 의미이다.
상기 저해제는 ADAM10, ADAM17 또는 ADAM10 및 ADAM17 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 화합물 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 ADAM10 또는 ADAM17의 단백질 활성 저해제는 ADAM10, ADAM17 또는 ADAM10 및 ADAM17 단백질에 특이적으로 작용하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성이 MEL-18 유전자의 복제수/발현 여부에 따라서 다르게 나타났음을 구체적으로 밝히고, 이에 따라 MEL-18의 유전자 소실 또는 발현/활성이 저하된 개체의 저항성을 개선할 수 있도록 MEL-18을 증폭 또는 활성화 하거나, ADAM10 및/또는 ADAM 17의 증폭, 발현 또는 활성을 저해함으로써 약제 저항성을 억제 또는 개선할 수 있음을 밝혔다는 점에 의의가 있다. 따라서, 본 발명은 ADAM10 및/또는 ADAM 17의 억제를 통해서 HER2 표적치료제에 대한 내성을 개선 또는 억제할 수 있음을 새롭게 밝히고, HER2 표적치료제와 병용 투여할 수 있는 새로운 치료적 접근을 제시한다는 점에서 상기 ADAM10 및/또는 ADAM 17의 저해제 또는 활성화제가 구체적인 종류의 화합물, 항체 등의 제제에 한정되지 않고, 본 발명에 폭 넓게 포함될 수 있다.
구체적인 예로 상기 ADAM10 및/또는 ADAM17의 단백질 활성 저해제는 INCB3619, INCB7839, WAY-022, TMI-2, CGS 27023, GW280264, INCB8765 및 GI254023로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 INCB3619 및 INCB7839는 ADAM 10 및 ADAM 17을 모두 억제할 수 있는 이중 저해제이고(Incyte Corporation, Wilmington, DE), WAY-022(Wyeth-Aherst, Pearl River, NY), TMI-2, 또는 PF-5480090(pfizer)는 ADAM 17의 저해제이다. GI254023는 ADAM 10 저해제이고(Glaxo Smith Kline), GW280264는 ADAM 10 및 ADAM 17의 저해제 이다(Glaxo Smith Kline). 상기 각 저해제에 대한 구체적인 내용은 본 발명의 기술분야에 공지된 내용을 참조하여 알 수 있고, 일 예로 [Duffy et al, Clin Proteomics. 2011 Jun 9;8(1):9]에 기재된 바를 참고할 수 있다.
상기 INCB3619는 메틸 (6S,7S)-7-(히드록시카바모일)-6-(4-페닐 -3,6-디히드로-2H-피리딘-1-카보닐)-5-아자스피로[2.5]옥탄-5-카복실레이트(methyl (6S,7S)-7-(hydroxycarbamoyl)-6-(4-phenyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-1-carbonyl)-5-azaspiro[2.5]octane-5-carboxylate; Incyte)로 하기 화학식 1로 나타낼 수 있고, CAS 번호는 791826-72-7이다. ADAM 10 및 ADAM 17을 모두 억제할 수 있는 이중 저해제인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라, MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 INCB3619를 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 INCB7839는 아데르바십(aderbasib)이라고도 하며, (6S,7S)-7-[(히드록시아미노)카보닐]-6-[(4-페닐-1-피페라지닐)카보닐]-5-아자스피로[2.5]옥탄-5-카복실산 메틸 에스테르) ((6S,7S)-7-[(hydroxyamino)carbonyl]-6-[(4-phenyl-1-piperazinyl)carbonyl]-5-azaspiro[2.5]octane-5-carboxylic acid methyl ester; Incyte)로, 하기 화학식 2로 나타낼 수 있으며, CAS 번호는 7918228-58-5 이다. INCB7839 또한 ADAM 10 및 ADAM 17을 모두 억제할 수 있는 이중 저해제인 것을 특징으로 한다. INCB7839는 HER2의 p95 형을 발현하는 HER2-양성 전이성 유방암 환자의 그룹에서 임상적으로 허셉틴의 치료효과를 향상시키는 것으로 보고되었었으나, 결과적으로 이에 대한 임상실험은 실패한 것으로 보고 되었다. 그러나, 본 발명에 따라, MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 INCB7839를 HER2 표적치료제와 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 WAY-022(Wyeth-Aherst, Pearl River, NY), 또는 TMI-2(또는 PF-5480090; pfizer)는 ADAM17의 선택적 저해제로서, PF-5480090는 하기 화학식 3으로 나타내어 진다. 상기 WAY-022 또는 TMI-2(PF-5480090)를 본 발명에 따라 MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 HER2 표적치료제와 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 GW280264는 GW280264X로도 알려져 있고, 벤질 N-[(5S)-5-[[(2R,3S)-3-(포르밀히드록시아미노)-2-(2-메틸프로필)-1-옥소헥실]아미노]-6-옥소-6-(2-티아졸일아미노)헥실]-카바메이트(Benzyl N-[(5S)-5-[[(2R,3S)-3-(Formylhydroxyamino)-2-(2-methylpropyl)-1-oxohexyl]amino]-6-oxo-6-(2-thiazolylamino)hexyl]-carbamate) 화합물명으로 가지며, 하기 화학식 4로 나타낼 수 있고, CAS번호는 866924-39-2 이다. ADAM17을 억제할 수 있다. 본 발명에 따라 MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 GW280264를 HER2 표적치료제와 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 GI254023은 GI254023X로도 알려져 있고, (2R)-N-[(1S)-2,2-디메틸-1-[(메틸아미노)카보닐]-프로필]-2-[(1S)-1-[포르밀 (히드록시)아미노]에틸]-5-페닐펜탄아미드)(2R)-N-[(1S)-2,2-dimethyl-1-[(methylamino)carbonyl]-propyl]-2-[(1S)-1-[formyl(hydroxy)amino]ethyl]-5-phenylpentanamide)로, 하기 화학식 5로 나타낼 수 있다. GI254023은 ADAM10 선택적 억제제로 ADAM17 대비 ADAM10에 약 100배(fold)의 선택성을 갖는다. 본 발명에 따라 MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 GI254023를 HER2 표적치료제와 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 INCB8765(Incyte Corporation)는 히드록사메이트(hydroxamate) 모이어티를 함유하는 작은 분자로, 화합물명은 (1R,3S,4S)-3-[(히드록시아미노)카보닐]-4-[(4-페닐피페리딘-1-일)카보닐]시클로헥실피롤리딘-1-카르복실레이트((1R,3S,4S)-3-[(hydroxyamino)carbonyl]-4-[(4-phenylpiperidin-1-yl)carbonyl]cyclohexyl pyrrolidine-1-carboxylate)이다. 아연 결합 메카니즘을 통해 ADAM10을 저해할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 MEL-18 유전자의 증폭이 없는 개체 또는 MEL-18 유전자의 발현이 낮은 개체에 INCB8765를 HER2 표적치료제와 함께 처리하는 경우 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 개선할 수 있고, HER2 표적치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 HER2 양성 유방암 환자에게 ADAM10 및 ADAM17를 동시에 억제하는 GW280264를 이용하여, 트라스투주맙과 병용 투여하는 경우, MEL-18이 소실된 BT474 세포에서 트라스투주맙에 대한 저항성이 개선, 저항성 유발이 억제됨을 확인 하였고, 이에 따라 트라스투주맙에 의한 항종양 효과가 향상됨을 확인하였다. 또한, MEL-18과 ADAM10/17의 활성에 있어서 구체적인 신호전달체계를 확인하였다.
이러한 측면에서, 본 발명의 조성물은 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “병용투여”는 두 가지 이상의 약물을 함께 투여하는 것을 의미하며, 함께 투여된다고도 표현할 수 있다. 상기 병용 투여는 두 가지 이상을 약물을 동시에 투여하거나 두 가지 이상의 약물을 순차적으로 투여하는 것을 모두 포함한다. 상기 HER2 표적치료제와 병용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 경우, 상기 저해제에 의하여 유도된 저항성을 개선할 수 있고, 저해제에 의한 저항성의 생성을 억제할 수 있으며, 종래 치료제의 효과 또한 개선할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한, MEL-18 유전자 또는 MEL-18 단백질, ADAM10 유전자, ADAM10 단백질, ADAM17 유전자 및 ADAM17 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 후보물질과 MEL-18 유전자; MEL-18 단백질; ADAM10 유전자; ADAM10 단백질; ADAM17 유전자 및 ADAM17 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 접촉시키는 것, 및 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준;을 증가시키거나, ADAM10 및/또는 ADAM17 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 억제하는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
위에서 기술한 바와 같이, MEL-18 유전자 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준을 향상시키거나, ADAM10 및/또는 ADAM17의 단백질 또는 유전자를 억제하면 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 유발하는 ErbB 신호 전달의 활성화를 저해할 수 있으므로, MEL-18 유전자 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준을 촉진하는 물질 또는 ADAM10 및/또는 ADAM17의 단백질 또는 유전자를 억제하는 물질은 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 의약의 후보물질으로서 선별되어 사용될 수 있다.
단백질 또는 mRNA와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) MEL-18 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, MEL-18 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), MEL-18 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.
상기 스크리닝용 조성물은 유효성분 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 MEL-18를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 MEL-18를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 유효성분 외에도, 후보물질 간의 반응 확인 방법에 따라 Dvl을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명은 또한, MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 HER2 표적치료제에 대해 저항성을 가질 것으로 예상되는 개체에 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
앞서 본 발명에 대하여 기술한 모든 내용이 본 치료방법에도 준용될 수 있다.
상기 치료방법은 상기 약학적 조성물이 투여되는 개체에 HER2 표적치료제를 병용투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 치료방법은 상기 약학적 조성물 투여 전에, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로부터 수득한 시료로부터 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 단계는 HER2 표적치료제에 대한 동반진단 마커로서 MEL-18을 측정하여 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 하는 것을 의미한다.
상기 투여는 경구투여 또는 비경구투여의 모든 방법을 포함할 수 있고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 통해서 투여가 이루어질 수 있다. 또한, 병용 투여서 제1의 약물은 비경구투여를 통해서 투여되고, 제2의 약물은 경구투여를 통해서 투여되는 것과 같이, 서로 다른 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에서는 HER2 표적치료제에 저항성을 갖는 HER2 양성 유방암 개체에 ADAM10 및 17 억제제를 트라스트주맙과 함께 투여하는 경우, 상기 트라스트주맙에 대한 저항성이 개선되고, 트라스트주맙의 치료효과가 더욱 향상되는 것을 구체적인 실시예를 통해서 확인하였다.
또한, 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및 또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 갖는 것으로 예상되는 개체를 진단하기 위한 조성물의 제조를 위한 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및 또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 갖는 것으로 예상되는 개체를 위한 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물의 제조를 위한 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및 또는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 측정하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 표적치료제에 대한 동반진단용 키트의 제조를 위한 HER2 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제의 용도(application)를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 MEL-18 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 낮은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 갖는 것으로 예상되는 개체의 치료용 약물의 제조를 위한 MEL-18 유전자, MEL-18 유전자 발현 활성화제, MEL-18 단백질, MEL-18 단백질 활성화제, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용도(application)를 제공한다.
앞서 본 발명에 대하여 기술한 모든 내용이 본 발명의 용도에도 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
재료 및 실험방법
1. 형광 핵산
혼성화
(
Fluorescence
in
situ
hybridization
)
본 발명에서는 한양대학교의 생명윤리위원회(Institutional Review Boards)의 승인을 받아, 2000년 1월부터 2009년 12월까지 한양대학교 병원에서 유방암 환자 230명(HER2+ 케이스, n=54; HER2- 케이스, n=176)으로부터 획득한 원발성 인간 유방암(primary human breast cancer)을 실험에 사용했다.
혼성화(hybridization) 전에 단백질 분해성 슬라이드 처리를 위해, 절편을 탈파라핀화, 공기 건조, 탈수화 및 70% 포름아미드-2×SSC 용액 중 74 ℃에서 5 분 동안 변성시켰다. 선택한 DNA 프로브(PCGF2 FISH probe red 5-ROX dUTP, green 5-fluorescein dUTP chromosome 17 control probe; Empire Genomics, Buffalo, NY, USA)와 함께 습한 챔버에서 37 ℃ 조건으로 하룻밤 동안 혼성화 한 후, 슬라이드를 세척하고, 안티페드 용액(antifade solution)에서 0.2 μmol/L DAPI로 대비 염색 하였다. 각 TMA 코어에 대해 50 개의 종양 핵에서 세포당 유전자 신호를 평가했다. 평균 유전자 복제수와 유전자:CEP 비율은 각 코어에 대해 개별적으로 계산되었고, 평균 유전자 복제수가 6.0을 초과(> 6.0)하면 유전자가 증폭된 것으로 간주하였다. 모호한 사례는 두 병리학자(SEL과 WSK)에 의하여 독립적으로 채점되었다.
또한, 2010년 1월부터 2016년 12월까지 건국대학교 병원에서 트라스트주맙으로 치료를 받았고 외과적 수술로 절제된 환자의 213개의 HER2+ 침윤성 유방암 조직을 건국대학교 의료원의 생명유리 위원회(서울, 한국)의 승인을 받아 실험에 사용하였다. 환자에게 사전동의를 받았다. 조직 마이크로어레이 제작 후, 절편을 탈파라핀화, 탈수화 그리고 변성시켰다. DNA 프로브(PCGF2 FISH probe red 5-ROX dUTP, green 5-fluorescein dUTP chromosome 17 control probe; Empire Genomics, Buffalo, NY, USA)와 함께 습한 챔버에서 37 ℃ 조건으로 하룻밤 동안 혼성화 한 후, 상기 슬라이드를 0.2 μmol/L DAPI로 대비 염색 하였다. 세포당 유전자 신호를 각각의 케이스의 50개의 종양 핵에서 측정하였다: 평균 유전자 복제 수와 유전자: CEP 비율은 각각의 핵에 대해 개별적으로 계산되었고, 평균 유전자 복제 수가 6.0을 초과하면 종양이 증폭된 것으로 간주하였다.
2. 세포 배양 및 약물
모든 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 인간 유방암 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI-1640 배지(Welgene, Daegu, Korea)에서 배양 하였다. 293T 세포는 10% FBS가 보충된 DMEM(Welgene)에서 배양하였다. 모든 세포를 가습된 5% CO2 배양기에서 37 ℃로 배양했다. 트라스투주맙(Herceptin)은 Roche(Basel, Switzerland)에서 구입하였고, GW280264는 Aobious(Gloucester, MA, USA)에서 구입했다.
3. 항체
본 발명의 실험에 사용된 항체는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하였다: MEL-18(H-115, sc-10744X), phospho-EGFR(Tyr1173, sc-12351), EGFR(1005, sc-03), HER2(3B5, sc-33684)(H-224, sc-9001), HER3(C-17, sc-285), HES1(H-140, sc-25392), RING1B(N-32, sc101109), Polymerase II(H-224, sc-9001), normal mouse IgG(sc-2025), normal rabbit IgG(sc-2027), goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005), goat anti-rabbit IgG-HRP(sc-2030), 및 donkey anti-goat IgG-HRP(sc-2020)는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했다; beta-actin(C4, MAB1501R), phospho-HER2(Tyr1248, 06-229), H3ac(06-599), 및 H3K27me3(07-499)는 Merck Millipore(Billerica, MA, USA)로부터 구입했다; phospho-HER3(Tyr1289, 4791S), phospho-AKT(D9E, 4060S), AKT(9272S), EZH2(D2C9, 5246S), 및 H2AK119ub(D27C4, 8240S)는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 구입했다; CBX7(ab21873) 및 ADAM10(ab1997)는 Abcam(Cambridge, UK)로부터 구입했다; 그리고 ADAM17(C2C3, GTX101358)는 GeneTex(Irvine, CA, USA)로부터 구입했다.
4. 안정화 세포의 생산
MEL-18 과발현 세포주를 확립하기 위해, 293T 세포를 pLVX-MEL-18 또는 빈 벡터 구조체와 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 [J. Y. Lee et al, J Clin Invest 125, 1801-1814(2015)]에 기술된 바와 같이 공동-형질감염 시켰다(15). 형질감염 60 시간 후, 렌티 바이러스를 함유하는 배지를 수확하고, 6 ㎍/ml 폴리브렌(Polybrene, Sigma-Aldrich)을 이용하여 표적 세포로 형질도입 시켰다. MEL-18-억제 세포주(knockdown cell line)를 확립하기 위해, GIPZ 인간 렌티 바이러스 MEL-18 shRNA 클론 유전자 세트(GIPZ Human Lentiviral MEL-18 shRNA Clone Gene Set, RHS4531-EG7703-V3LHS334758; 5'-AGACAAUGUCUUGAAGUGU-3')를 암호화하는 렌티 바이러스를 GE Dharmacon(Lafayette, CO, USA)로부터 구입하여, 생성시키고, 상기한 바와 같이, 세포에 감염시켰다.
5. 세포
생존능
시험
In vitro 독성 시험 분석 키트(Sulforhodamine B based, TOX6)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 제조사의 프로토콜에 따라 사용했다. 10 ㎍/ml 트라스투주맙, 1 μM GW280264, PBS 및 DMSO가 첨가되거나 첨가되지 않은 RPMI-1640 배지(Welgene)로 96 웰 세포 배양 플레이트에서 세포(3x103 cell/well)를 배양하고, 배지를 3일 후에 약물을 함유하는 새로운 배지로 교환했다. 5일 후, 배지에 TCA 용액을 레이어링해서 세포를 고정시키고 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 고정된 세포를 물로 여러 번 세척하고, 0.4% 설포로다민 B(sulforhodamine B) 용액으로 30 분 동안 염색하였다. 그 다음, 염색 된 세포를 1% 아세트산 용액으로 잔류 염료가 관찰되지 않을 때까지 세척하고, 편입된 염료는 부드럽게 교반하면서 10mM Tris 용액으로 용해시켰다. 준비된 플레이트는 490nm에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다.
6.
콜로니
형성 분석
세포(1x104 cell/well)를 24-well 세포 배양 플레이트에서 10㎍/ml 트라스투주맙, 1 μM GW280264 및 비히클과 함께 또는 없이 1 주일 동안 처리하였고, 배지는 3 일마다 신선한 배지로 교환하였다. 2 주 후, 세포를 5분 동안 4% 포름알데히드 용액으로 고정시키고, PBS로 세척하고, 0.02% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich C0775)으로 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 염색한 다음 다시 세척했다. 준비된 플레이트를 완전히 건조시키고 실험을 진행했다.
7. 실시간 정량
PCR
(
Real
-
Time
Quantitative
PCR
)
총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 분리하였고, 역전사 PCR(RT-PCR)은 Access RT-PCR 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. RNA 발현 수준을 측정하기 위해 SYBR Green 염료(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 함께 Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 제조업체의 설명에 따라 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 수행했다. 데이터는 GAPDH의 발현으로 정규화 되었다.
본 실험에서 사용한 프라이머는 다음과 같다:
MEL-18, 5'-GTACTTCATCGACGCCACCACTATC-3' 및 5'-CTCGTCCTCGTACAGAACCTCCA-3'; ADAM10, 5'-GCTACGGGCACAAGTGACTA-3' 및 5'-AGACGTAAGCAGAAACCAGACA-3'; ADAM17, 5'-AGCTCCAAAACTGGACCACC-3' 및 5'-GCTGCTATTTGGGAAGGGGT-3'; BCL-2, 5'-GAGACAGCCAGGAGAAATCA-3' 및 5'-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3'; TGF-alpha, 5'-TCAGTCAATTTGGCCGGGAT-3' 및 5'-GGGCAGGTTGGAAGAGATCA-3'; S100A9, 5'-ACACATCATGGAGGACCTGG-3' 및 5'-TCACCCTCGTGCATCTTCTC-3'; IGFBP3, 5'-AACTGTGGCCATGACTGAGG-3' 및 5'-AGTCTCCCTGAGCCTGACTT-3'; MDK, 5'-CTCCCGGAAAGGCACTGG-3' 및 5'-CACCTGGGGCGGTTTCC-3'; CMTM3, 5'-GTATCTGGGCAGCAGGTGTT-3' 및 5'-ACCAAGTGCAGACAAACCCA-3'; RALGAPA2, 5'-CACTCGAATGCCGTCAGACT-3' 및 5'-TGCGGTAGTCTCTGGAGTGT-3'; USP48, 5'-GGCCGTCTGTCTCTTGGTATT-3' 및 5'-TGCACCAAAGCAAAAAGCCT-3'; 그리고 GAPDH, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' 및 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'.
8. 면역 블로팅 및 면역 침전(Immunoblotting and Immunoprecipitation)
세포를 RIPA 버퍼에서 용해시키고, 상기 용해액을 [M. H. Cho et al, Nat Commun 6, 7821(2015)]에 기술된 바에 따라 면역 블로팅 및 면역침전을 수행했다(60). 면역 블로팅을 위해, 세포 용해물을 6% 내지 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 막을 차단 한 후, 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 그 다음 실온에서 HRP(horseradish peroxidase)-컨쥬게이트된 2차 항체와 1 시간 동안 반응시켰다. ECL 검출 시스템(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)을 사용하여 밴드를 시각화했다.
면역침전(immunoprecipitation)을 위해, 세포 용해물(1mg 내지 3mg)을 4 ℃에서 밤새 적절한 항체(1㎍)와 함께 인큐베이션했다. 상기 샘플을 4 ℃에서 2 시간 동안 단백질 아가로즈 A 또는 G(20㎕)와 함께 다시 인큐베이션하고 미리 냉각시킨 PBS로 3회 세척한 다음 베타-머캅토 에탄올(beta-mercaptoethanol)이 첨가된 5x 샘플 로딩 완충액 20㎕를 면역침전된 펠렛에 첨가하였다. 샘플을 95℃에서 5분간 가열한 후, SDS-PAGE 및 면역 블럿팅을 상기한바와 같이 수행하였다.
9. 유전자 발현
마이크로어레이
분석
대조군과 MEL-18-억제 BT474 세포 사이의 서로 다른 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해서, HumanHT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina)을 이용해서 유전자 발현 마이크로어레이를 제조사의 지침에 따라 [J. Y. Lee et al, J Clin Invest 125, 1801-1814(2015)]에 기술된 바와 같이 수행했다. 세포로부터 총 RNA를 분리하고, Illumina Total Prep RNA 증폭 키트(Ambion)를 사용하여 cDNA 및 바이오틴화 cRNA를 생성 하였다. cRNA를 HumanHT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina)에 혼성화시킨 다음 칩을 세척, 건조하고 비드 어레이 리더기(Bead Array Reader)에서 스캔했다. 로우데이터는 GenomeStudio 버전 2011.1 소프트웨어(Illumina)를 사용하여 얻었고 존재/부존재의 콜(call)은 검출 P값(검출 P 값이 0.05 미만인 유전자 프로브, 존재; 다른 모든 유전자, 부존재)에 기초한 분류 방법에 의존했다. 선택된 유전자 프로브 신호값은 대수적으로 변환하고, 대수법을 사용하여 정규화하였다. 비교 대조군간에 1.5 이상의 절대 배수 변화(absolute fold change)를 나타내는 모든 유전자 프로브는 차별되게 발현된 것으로 간주하였다. 차별되게 발현된 유전자의 기능분석은 Visualization 및 Integrated Discovery(DAVID)(61, 62)와 Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)(63, 64) 데이터베이스를 사용하여 수행되었다.
10. 공용 데이터의 사용
인간 유방암 환자의 공개적으로 이용 가능한 두 가지 데이터세트 인 TCGA(37)와 METABRIC(38)을 cBioportal(65, 66)을 통해 다운로드하고 분석한 다음, Python 및 R 프로그래밍 패키지를 이용해서 재-분석했다. CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia) 데이터세트를 cBioportal을 통해 분석하였다. 아쥬반트 트라스트주맙으로 처리된 HER2+ 유방암의 임상 데이터세트(GSE55348)(68, 69)는 GEO 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)에서 다운로드하였고, 재-분석하였다(사용된 프로브(Probe) ID: PCGF2, ILMN_1809859; ADAM10, ILMN_1718946; ADAM17, ILMN_1765779). MEL -18 증폭/mRNA 발현과 유방암 환자의 OS와 DFS의 관계를 분석하기 위해 Kaplan-Meier 추정 방법이 사용되었다. 마우스 배아줄기 세포에서 Mel-18 ChIP-seq의 공용 데이터 세트(GSE67868)(67)는 MEL-18 단백질 결합 유전자의 재분석을 위해 GEO로부터 얻었다.
11. 크로마틴면역침강 분석(ChIP Assay)
크로마틴면역침강(Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 분석은 [M. H. Cho et al, Nat Commun 6, 7821(2015)]에 기술된 바에 따라 수행했다(60). 세포를 실온에서 1% 포름알데히드로 10분 동안 가교 결합시키고, 200㎕의 SDS 용해 완충액에서 용해시켜, Bioruptor(Cosmo Bio Co. Ltd, Tokyo, Japan)를 사용하여 초음파 처리하였다. 세포 용 해물을 4℃에서 밤새 특정 항체와 함께 인큐베이션한 다음 4℃에서 2 시간 동안 더 연어정자(salmon sperm) DNA(Millipore)에 결합시킨 단백질 A- 또는 G- 아가로오스와 함께 인큐베이션하였다. 면역 침전물을 세척 및 용출하고, 20㎕의 5M NaCl로 65℃에서 하룻밤 동안 역가교결합시켰다. 용출액으로부터 침전된 DNA 단편을 실시간 정량 PCR(qPCR)을 사용하여 ChIP 신호의 세기를 분석하였다.
다음의 특이적 프라이머를 사용하여 ChIP-qPCR을 수행하였다: ADAM10 프라이머, 5'-GCTCGGAAAATTACATCTCGGAC-3' 및 5'-GCCCCAGTGATGCGAACATA-3'; 그리고 ADAM17 프라이머, 5'-GCCGCTTTCTACAGCTCCTTT-3' 및 5'-GCCTCCTTTGTCTTGATGCC-3'.
12.
Phospho
-
RTK
(
Receptor
tyrosine
kinase
) 분석
인간 Phospho-RTK 어레이 키트(R&D Systems)를 사용하여 RTK 패널 내에서 키나아제 활성을 검출했다. 제조사의 프로토콜에 따라 세포를 수거하고 차가운 PBS로 세척하여 용해 완충액에서 용해시킨 다음, 100-200㎍의 용해물을 차단된 멤브레인과 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 멤브레인을 화학발광 시약에 노출시키고, 이미지를 캡쳐하고, AlphaEaseFC 소프트웨어(Alpha Innotech, Inc., San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량화했다.
13. 효소면역측정 분석(ELISA,
enzyme
-
linked
immunospecific
assay
)
HER 리간드 HB-EGF 및 헤레굴린 1(heregulin1, NRG1-beta1, NRG1)의 수준을 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(BosterBio 및 R&D Systems)를 사용하여 세포 배양 상등액(supernatant)에서 측정하였다.
R&D Systems 키트의 경우, ELISA 플레이트를 포획 항체로 밤새 코팅한 다음 3% BSA로 1시간 동안 차단했다. 그 후, 100㎕의 시료와 표준물질을 넣고 2시간 동안 실온에서 유지시켰다. 상기 플레이트 웰을 세척하고 검출 항체로 2 시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척하고 horseradish peroxidase로 표지된 스트렙트아비딘(streptavidin)과 20분 동안 인큐베이션하였다.
BosterBio ELISA 키트의 경우 항체가 코팅된 플레이트를 샘플과 표준물질로 직접 채우고 90 분간 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 제거하고, 플레이트를 바이오틴화된 항-인간 HB-EGF 항체와 함께 60 분 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 상기 플레이트를 ABC 용액으로 30 분 동안 인큐베이션하고 세척 하였다. 이 단계에서, 상기 두 키트 모두의 플레이트를 기질용액으로 20분 동안 채우고, 정지용액을 이용해서 반응을 20분 동안 정지시킨 다음, 450nm의 파장에서 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정하였다. BosterBio ELISA 키트에 대한 각각의 인큐베이션은 모두 37℃에서 수행되었다.
14. 마우스 이종이식 모델(
Mouse
Xenograft
Model
)
모든 동물 실험은 한양 대학교 실험동물운영위원회(서울, 한국)의 승인을 받아 수행되었다. 4주령 암컷 NOD/SCID 마우스는 Koatech(평택, 경기도)에서 구입했다. 동소 이종이식(orthotopic xenografts)을 위해, 대조군 및 MEL-18-억제 BT474 세포(2x106)를 1:1 PBS/Matrigel의 150㎕에 재현탁하고, 마우스의 유방 지방 패드에 직접 주입(왼쪽, 컨트롤; 오른쪽, MEL-18 shRNA) 했다. 마우스에게는 세포 주입 1 일 전에 에스트라디올(estradiol) 펠릿(0.72mg, 60일 이상 방출; Innovative Research of America, Sarasota, FL, USA)을 공급했다. 종양 크기가 100 mm3에 도달 한 후, 마우스를 복강 내 투여에 의하여 비히클(PBS) 또는 트라스투주맙(20 mg/kg)으로 매주 2 회 처리하였다. 종양 크기는 매주 2 회 측정하였고, 치료 기간 동안 독성의 임상 징후가 있는지 마우스를 매일 모니터링 하였다.
종양 크기는 다음과 같이 계산되었다: 부피(mm3)=(a x b2)/2, 여기서 a는 가장 큰 직경을, b는 수직 직경을 나타낸다.
15. 면역조직화학 (
Immunohistochemistry
)
이종 이식 마우스의 포르말린-고정 및 파라핀-내장된 종양 절편을 탈파라핀화, 재수화하고, Leica Bond III(Leica Biosystems, Nusslock, Germany) 및 키트(Bond Polymer Refine Detection Kit, Leica Biosystems) 자동화 시스템을 사용하여 MEL-18 (1:25), Ki-67 (1:150), ADAM10 (1:100), 및 ADAM17 (1:100)에 대한 적합한 일차 항체로 면역염색 하였다. 발현은 다음의 종양 세포의 양성 염색 강도 및 백분율에 따라 등급이 매겨졌다: 강도, 0(염색 없음), 1 (약함), 2 (보통) 및 3 (강함); 0 (0 % - 5 %), 1 (6 % - 25 %), 2 (26 % - 50 %), 3 (51 % - 75 %) 및 4 (> 75 %); 염색 범위, 0(0% - 5%), 1(6% - 25%), 2(26% - 50%), 3(51% - 75%), 및 4(> 75%). 종합 면역 반응 점수(immunoreactive score; IRS)를 얻기 위해, 강도 점수에 범위 점수를 곱하였다. ADAM10 또는 ADAM17 발현에 따른 트라스트주맙으로 치료받은 유방암 환자(n=213)의 생존 분석을 위해, 면역조직화학 분석을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다. 강도 점수가 2 이상이면 발현 상태는 양성으로 간주하였다.
16. 통계 분석
대조군과 실험군 간의 차이의 유의성은 two-tailed Student's t-검정을 이용해서 결정했다. 여러 그룹 비교의 경우, Welch ANOVA에 이어, Dunnett's T3 검정으로 불균등 분산 또는 일원 분산 분석을 수행 한 후 등가 분산에 대한 사후 확정 LSD 검정을 수행했다. Pearson's 상관 관계(correlation)는 MEL-18 발현과 이의 증폭 또는 HER2 발현 사이의 상관관계 분석에 사용하였다. OS 및 DFS 분석을 위한 Kaplan-Meier 곡선은 로그-순위 테스트를 사용하여 평가하였다. 이러한 분석은 SPSS 소프트웨어(버전 12.0), Python 통계 패키지(https://www.python.org/) 및 R 통계 패키지(http://www.r-project.org/) 또는 Excel(Microsoft, Redmond, WA, USA) 소프트웨어 패키지를 이용하여 수행되었다. 모든 경우에서 0.05 미만의 P 값(P 값 < 0.05)은 유의 한 것으로 간주되었다.
[
시험예
: 결과]
1.
HER2
+ 유방암에서
MEL
-18 증폭의 임상적 의미
우리의 이전 연구는 인간 유방암에서 MEL-18의 다양한 종양 억제 기능을 뒷받침 해 왔으며(4, 11-15), MEL-18의 소실이 유방암에서 공격적 표현형 획득에 대한 지표임을 의미한다. 인간 암에서의 MEL-18 발현의 중요성을 추가로 정의하기 위해, 유방암에서 17q21에 위치한 MEL-18을 코딩하는 유전자인 PCGF2의 유전적 이상과 MEL-18 유전자의 유전적 수차(aberration)를 다중 유방암 코호트에서 조사하였다. TCGA(Cancer Genome Atlas)(37) 및 METABRIC datasets(38)에서는 MEL-18 유전자에서 낮은 결실률 및 체세포 돌연변이가 없었고, 기저부-유사 유방암에서 MEL-18 mRNA 수준의 하향 조절이 이전 연구(15)와 일치한다(도 1a). 주목할 것은, MEL-18 유전자 증폭이 HER2-증폭 유방암에서 독점적으로 발생했고, 약 절반을 차지한다(도 1a 및 표 1)는 점이다.
| MEL -18 발현여부 | |||
| 코호트 ( Cohorts ) | HER2 발현여부 | 양성 | 음성 |
| HYU(n = 230) | Positive (n = 54) |
23 cases (42.6%) |
31 cases (57.4%) |
| Negative (n = 176) |
0 case (0%) |
176 cases (90%) |
|
| TCGA (n = 817) |
Positive (n = 105) |
47 cases (44.8%) |
58 cases (55.2%) |
| Negative (n = 712) |
2 cases (6%) |
710 cases (94%) |
|
| METABRIC (n = 1980) |
Positive (n = 298) |
146 cases (49.0%) |
152 cases (51.0%) |
| Negative (n = 1682) |
4 cases (0.2%) |
1678 cases (99.8%) |
|
코호트의 형광 in situ 혼성화(Fluorescence in situ hybridization, FISH) 분석에서도 HER2+ 유방암 환자의 거의 절반이 MEL-18 증폭을 나타냈다(도 1a). 유방암 이외에도, HER2+ 상태에 따라, 다른 유형의 암에서도 비슷한 비율로 MEL-18 증폭이 발생했다(도 7a). 17q12-21 증폭 산물(amplicon)에서 MEL-18 유전자 증폭의 빈도는 HER2 유전자와의 거리에 의존적이었다(도 7b). TCGA와 METABRIC datasets로부터의 유방암 환자에서 MEL-18 유전자 증폭이 mRNA 수준의 증가된 발현과 밀접하게 관련되어있었다(도 1b). 또한, MEL-18과 HER2 발현 사이의 양의 상관관계는 이들 코호트에서 확인되었고(도 1c), MEL-18 발현은 다른 아형보다 HER2 아형에서 더 높았다(도 1c). METABRIC datasets를 이용한 HER2+ 유방암 환자의 생존 분석에서, MEL-18이 증폭된 환자는 전체 생존(overall survival, OS)과 무병 생존(disease-free survival, DFS)률이 훨씬 높았다(P=0.013 및 P=0.023, 각각, 도 1d). 또한, MEL-18 증폭 또는 높은 MEL-18 발현은 트라스트주맙 치료를 받은 환자의 유리한 무병 생존(DFS)률과 관련이 있다. 종합적으로 이러한 결과는 항-HER2 치료에 대한 반응과 관련된 유리한 생존 결과의 지표로서 HER2+ 유방암에서 MEL-18의 임상적 중요성을 뒷받침한다.
2.
HER2
+ 유방암에서
MEL
-18 증폭-유도된
트라스트주맙
민감성
항암제 내성과 관련된 CSC와 EMT의 조절에서 MEL-18의 억제 역할을 뒷받침하는 이전의 연구에 기반하여(13, 14), MEL-18이 트라스투주맙에 대한 반응에 관여 할 가능성이 있고, HER2+ 유방암의 예후에 영향을 줄 것이라고 추정하고, 이를 확인하기 위한 실험을 실시했다.
HER2+ 유방암에서의 MEL-18 증폭의 기능적 관련성을 확인하기 위해, 다양한 유형의 HER2+ 유방암 세포주에서 MEL-18의 유전적 변이와 mRNA 수준을 조사했다. 임상 데이터와 일치하는, 암 세포주 백과 사전(Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) 데이터세트는 이들 HER2+ 세포주에서 거의 절반의 MEL-18 증폭 및 이와 상관관계의 mRNA 발현을 보여주었고, 이는 FISH 및 qRT-PCR 분석에 의해 확인된 바와 같았다(도 2a 및 도 2b).
그 다음, MEL-18-증폭 및 MEL-18-비-증폭된 다양한 HER2+ 유방암 세포주(BT474, ZR-75-30, SKBR2 및 HCC-1419) 각각에 렌티바이러스 MEL-18 억제 및 과발현 시스템을 구축하였고(도 2c), 이들 세포의 트라스투주맙 처리에 대한 반응을 비교했다.
도 2c, 2d 및 2e에 나타낸 바와 같이, in vitro 세포 생존능 분석에 의한 결과와 동일하게, MEL-18의 shRNA-매개된 넉아웃으로 트라스트주맙 저항성을 유도하였고, 반면에 MEL-18 과발현은 이러한 세포에서 트라스트주맙 민감성을 증가시켰다(도 2c). 구체적으로 BT474 세포에서 MEL-18의 shRNA-매개된 억제는 트라스투주맙 저항성을 유도한 반면, MEL-18-과발현 SKBR3 세포는 트라스투주맙 처리된 대조군 세포보다 더 높은 성장 억제 효과를 보였다. I3KH1047R 돌연변이를 통해 트라스투주맙에 내성을 갖는 HCC-1954 세포에서, MEL-18 과발현이 상기 세포를 트라스투주맙에 민감하게 만들지 못했지만, 세포 성장에서 현저한 감소를 가져왔다(도 2d). In vitro 결과와 동일하게, MEL-18 억제 BT474 세포의 동소 마우스 이종이식 모델은 트라스트주맙 처리에도 불구하고, 증가된 촉진된 종양 성장을 보였으나, 대조군 마우스는 트라스투주맙에 반응하였다(도 2e, 2f). 이러한 결과는 MEL-18의 소실이 트라스투주맙 내성을 매개한다는 것을 보여주며, MEL-18 증폭이 HER2 양성 유방암에서 트라스투주맙 민감도에 대한 예측 인자가 될 수 있음을 나타낸다.
3.
ErbB
패밀리
수용체의 활성화에 대한
MEL
-18의 효과 확인
다음으로, HER2+ 유방암에서 트라스투주맙 반응 조절에서 MEL-18이 어떻게 기능 하는지를 조사하고, 그 결과를 도 3a, 3b, 3c, 7a 및 7b에 나타내었다.
유전자 발현 마이크로어레이 분석은 대조군과 MEL-18-억제 HER2+ 유방암 세포 사이에 서로 다른 유전자 발현 프로파일을 보여주었는데(도 3a), 여기에서 EGFR 신호 전달 및 성장 인자 활성, 그리고 다른 발암 경로와 연관된 유전자 세트에서 유의성있게 증가되었다(도 3b, 도 8a 및 8b). ADAM10, ADAM17, S100A9, TGF - 및 BCL-2와 같은 이러한 경로에 관여하는 MEL-18 표적 유전자의 발현 변화는 qRT-PCR에 의해 입증되었다(도 3c).
마이크로어레이 분석에서 제시된 것처럼 MEL-18이 EGFR 관련 신호 전달 경로의 활성을 변화시키는지를 더 확인하기 위해, MEL-18 발현 하에서 여러 RTK의 인산화 프로파일을 포스포-RTK 어레이와 면역블로팅을 사용하여 측정했다.
도 3d 및 3e에 나타낸 바와 같이, MEL-18 과발현 SKBR3 세포에서 ErbB 패밀리 구성 EGFR, HER2 및 HER3의 인산화 수준은 대조군 세포와 비교하여 현저하게 감소했고, 발현 수준은 그렇지 않았다(도 3d 및 3e). MEL-18-억제 BT474 세포에서도 유사한 효과가 관찰되었다(도 3e). 결과적으로, AKT의 인산화는 이들 세포에서 MEL-18에 의해 음성적으로 조절되고, ErbB-PI3K-AKT 경로가 MEL-18 매개에 의해 억제됨을 의미한(도 3e). 따라서, 우리는 MEL-18이 ErbB 패밀리의 키나아제 활성을 변화시킴으로써 ErbB 신호 전달 경로의 조절에서 억제하는 역할을 한다는 결론을 얻었다.
4.
MEL
-18-
매개된
ErbB
리간드 분비효소(
sheddase
)
ADAM10
/17의
후성적
억제효과 확인
MEL-18이 ErbB 패밀리 수용체의 인산화 수준에 영향을 주는 분자적 메커니즘을 밝히기 위해, 리간드-의존성 ErbB 신호전달 활성 및 항-HER2 치료 저항성에 관여하는 ErbB 리간드에 대한 ADAM 패밀리 분비효소(sheddase)의 발현을 더 확인했다.
도 4a, 4b, 4c 및 도 9에 나타낸 바와 같이, MEL-18 억제는 BT474 세포에서 ADAM10 및 ADAM17의 단백질 및 mRNA 수준을 증가시키는 반면, MEL-18 과발현은 SKBR3 세포에서 그들의 발현을 감소시켰다(도 4a 및 4b). 이는 유전자 전사의 조절에 있어서 MEL-18이 역할을 한다는 것을 의미한다. 크로마틴 면역침전(ChIP) 분석을 통해서 HER2+ 인간 유방암 세포주에서 ADAM10 및 ADAM17의 프로모터 영역에 MEL-18의 결합증가를 확인하였다(도 4c). 프로모터에 대한 MEL-18 결합 후, 전사 활성 마커 RNA 중합 효소 II(Pol II)는 이들 부위로부터 해리되고, 히스톤 H3 아세틸화(H3ac) 또한 MEL-18 과발현 SKBR3 세포에서 감소했다(도 4c). 또한, MEL-18은 이들 부위에서 PRC1- 및 PRC2-의존성 히스톤 변형을 변화시켰다. PRC1 멤버 중에서, MEL-18의 결합 파트너로 잘 알려진(42, 43), CBX7과 RING1B가 ADAM10과 ADAM17 프로모터 영역에서 공동-결합되었고, MEL-18 발현 수준에 의존적으로 H2AK119ub 수준을 증가시켰다. 또한, MEL-18은 이들 영역에서 H3K27에 대한 PRC2의 촉매 서브유닛인 EZH2의 결합 및 효소 활성을 촉진시켰다. 마찬가지로, MEL-18 억제는 BT474 세포에서 ADAM10 및 ADAM17의 프로모터에서 PRC2-유도된 H3K27me3 및 PRC1-매개된 H2AK119ub를 감소시켰다(도 4c).
또한, 도 4d 및 4e에 나타낸 바와 같이, 공동면역침전분석을 통해 표적 크로마틴에 대한 MEL-18 의존적 EZH2 증가(recruitment)는 MEL-18과 EZH2 단백질 사이의 상호작용 때문인 것을 명확하게 확인했다(도 4d). 이러한 결과는 MEL-18이 PRC2 및 PRC1과 협력하여 전사 억제성 복합체를 형성함으로써 ErbB 리간드 쉐데이즈(sheddase) ADAM10 및 ADAM17의 발현을 후성적으로 억제함을 의미한다(도 4e).
5.
MEL
-18 소실-유도된 트라스투주맙 저항성 매개에서
ADAM10
/17의 역할
트라스투주맙 저항성과 관련된 리간드 의존성 ErbB 신호전달에서 MEL-18에 의한 ADAM10 및 ADAM17의 발현 변화를 일으키는 역할을 하는지 확인하기 위해, ErbB 리간드의 생산에 대한 MEL-18의 영향을 조사하였다.
도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, MEL-18-억제 BT474 세포에서 분비된 HB-EGF와 헤레구린-1(heregulin-1, NRG1)의 양, EGFR과 HER3에 특이적인 리간드(17)의 양이 증가했다(도 5a). 이와 대조적으로, 이들 리간드의 생성은 SKBR3 세포에서 MEL-18 과발현에 반응하여 감소 하였다(도 5a). 또한, ErbB 리간드 생산에 대한 MEL-18의 효과는 ErbB 패밀리 수용체들간의 이종이량체화를 변화시켰다. 동시 면역침전 분석 결과는 BT474 세포에서의 MEL-18 억제가 HER2와 EGFR 및 HER3의 결합을 강화시키고, SKBR3 세포에서의 MEL-18 과발현이 그들의 이량체화를 억제함을 의미한다(도 5b).
그리고, 도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이, 이러한 효과는 ADAM10 /17 이중 억제제 GW280264로 치료 한 결과, ErbB 리간드의 MEL-18 억제 매개 분비와 BT474 세포에서의 ErbB-PI3K-AKT 신호전달의 활성화를 역전시킨 ADAM10 및 ADAM17의 쉐데이즈(sheddase) 활성에 의해 매개되었다(도 5c 및 5d).
또한, 도 5e에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙과 병용하여 GW280264로 치료 한 결과, MEL-18이 소실된 BT474 세포에서 트라스투주맙의 항 증식 효과가 개선되었음을 확인하였다(도 5e).
더욱이, in vitro 결과와 일치하게, MEL-18 소실은 이종이식 마우스로부터의 유방 종양에서 ADAM10 및 ADAM17의 단백질 수준의 증가와 관련되었다(도 5f). 특히, 트라스트주맙 치료받은 유방암 환자(n=213)에서 MEL-18 증폭과 낮은 수준의 ADAM17 발현이 있는 하위 그룹은 현저히 유리한 무병 생존(DFS)를 보였으나, 높은 ADAM17 발현과 MEL-18의 비-증폭 그룹은 더 나쁜 무병 생존(DFS)률과 관련이 있었다(도 5g 왼쪽). 낮은 ADAM10 발현과 MEL-18 증폭을 보이는 환자는 보다 유리한 생존 결과를 나타내는 경향이 있었다. 공공 데이터베이스로부터 유전자 발현 배열을 분석한 결과, MEL-18 mRNA의 과발현과 ADAM10 또는 ADAM17 mRNA의 발현부족을 갖는 트라스트주맙-치료 환자는 재발 없는 생존 기간이 연장되었다(도 5g, 오른쪽)
따라서, 이러한 결과는 데이터는 ADAM10/17 분비효소가 ErbB 리간드 생산 및 수용체 활성화 매개에 의하여 MEL-18 소실-유도된 트라스트주맙 저항성을 유발한다는 것을 나타낸다.
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SEQUENCE LISTING
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation
Hanyang University)
<120> BIOMARKER FOR HER2 POSITIVE CANCER AND ANTI-HER2 THERAPY AND USE
THEREOF
<130> X18U10C0007
<150> KR 10-2017-0029627
<151> 2017-03-08
<150> KR 10-2017-0042224
<151> 2017-03-31
<160> 29
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> MEL-18 forward primer
<400> 1
gtacttcatc gacgccacca ctatc 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> MEL-18 reverse primer
<400> 2
ctcgtcctcg tacagaacct cca 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> ADAM10 forward primer
<400> 3
gctacgggca caagtgacta 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> ADAM10 reverse primer
<400> 4
agacgtaagc agaaaccaga ca 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> ADAM17 forward primer
<400> 5
agctccaaaa ctggaccacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> ADAM17 reverse primer
<400> 6
gctgctattt gggaaggggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> BCL-2 forward primer
<400> 7
gagacagcca ggagaaatca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> BCL-2 reverse primer
<400> 8
cctgtggatg actgagtacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> TGF-alpha forward primer
<400> 9
tcagtcaatt tggccgggat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> TGF-alpha reverse primer
<400> 10
gggcaggttg gaagagatca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> S100A9 forward primer
<400> 11
acacatcatg gaggacctgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> S100A9 reverse primer
<400> 12
tcaccctcgt gcatcttctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> IGFBP3 forward primer
<400> 13
aactgtggcc atgactgagg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> IGFBP3 reverse primer
<400> 14
agtctccctg agcctgactt 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> MDK forward primer
<400> 15
ctcccggaaa ggcactgg 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> MDK reverse primer
<400> 16
cacctggggc ggtttcc 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> CMTM3 forward primer
<400> 17
gtatctgggc agcaggtgtt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> CMTM3 reverse primer
<400> 18
accaagtgca gacaaaccca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> RALGAPA2 forward primer
<400> 19
cactcgaatg ccgtcagact 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> RALGAPA2 reverse primer
<400> 20
tgcggtagtc tctggagtgt 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> USP48 forward primer
<400> 21
ggccgtctgt ctcttggtat t 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> USP48 reverse primer
<400> 22
tgcaccaaag caaaaagcct 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> GAPDH forward primer
<400> 23
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH reverse primer
<400> 24
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> GIPZ Human Lentiviral MEL-18 shRNA Clone Gene Set
<400> 25
agacaauguc uugaagugu 19
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> ADAM10 promoter primer
<400> 26
gctcggaaaa ttacatctcg gac 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> ADAM10 promoter primer
<400> 27
gccccagtga tgcgaacata 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM17 promoter primer
<400> 28
gccgctttct acagctcctt t 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> ADAM17 promoter primer
<400> 29
gcctcctttg tcttgatgcc 20
Claims (26)
- MEL-18 유전자의 복제(copy) 수를 측정하는 제제; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 및 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 동반진단용 조성물은
HER2 표적치료제 투여의 필요성;
ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, 또는 ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성;
HER2 표적치료제에 대한 민감성;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는
HER2 표적치료제와 ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, 또는 ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수 또는 MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물. - 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 MEL-18 유전자의 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및 MEL-18 단백질 발현 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 측정하는 것을 포함하는 HER2 양성 암에서의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법으로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 측정결과 시료에서 MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 및 MEL-18 단백질의 발현 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 기준값(reference value)보다 낮은 경우, 상기 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함하는 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, 또는 ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 투여가 필요함;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
HER2 표적치료제와 ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, 또는 ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 병용투여가 필요함. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
유전자 복제(copy)수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 MEL-18 단백질의 발현 수준은 형광 핵산 혼성화(FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 확인하는 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - MEL-18 유전자의 복제(copy) 수를 측정하는 제제; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 및 MEL-18 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트. - 제9항에 있어서,
인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자의 복제(copy)수를 측정하는 제제; HER2 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 및 HER2 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
MEL-18 유전자의 복제(copy) 수 또는 MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 MEL-18 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트. - 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 키트는
HER2 표적치료제의 투여의 필요성;
ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 투여의 필요성;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성;
HER2 표적치료제에 대한 민감성;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는
HER2 표적치료제;과 ADAM 10 저해제, ADAM 17 저해제, ADAM 10 및 ADAM 17 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트. - MEL-18 유전자, MEL-18 단백질, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제, 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 가지면서, MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준 및 MEL-18 단백질의 발현 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 기준값(reference value)보다 낮은, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성이 발현되거나 발현 가능성이 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 유전자 저해제는 ADAM10 또는 ADAM17 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며,
상기 단백질 활성 저해제는 ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 미메틱스, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, INCB3619, INCB7839, WAY-022, TMI-2, CGS 27023, GW280264, INCB8765 및 GI254023로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인, 항암용 약학 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항암용 약학 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 조성물은 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것인, 항암용 약학 조성물. - MEL-18 유전자, MEL-18 단백질, ADAM10 유전자 저해제, ADAM10 단백질 활성 저해제, ADAM17 유전자 저해제 및 ADAM17 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 가지면서, MEL-18 유전자의 복제(copy) 수, MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준 및 MEL-18 단백질의 발현 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 기준값(reference value)보다 낮은, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성이 발현되거나 발현 가능성이 예상되는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 유전자 저해제는 ADAM10 또는 ADAM17 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며,
상기 단백질 활성 저해제는 ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 미메틱스, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, ADAM10 또는 ADAM17 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, INCB3619, INCB7839, WAY-022, TMI-2, CGS 27023, GW280264, INCB8765 및 GI254023로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인, HER2 양성 암 환자의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 조성물은 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것이고, 상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암 환자의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물. - MEL-18 유전자 및 MEL-18 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물 스크리닝용 조성물로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 약물 스크리닝용 조성물. - 후보물질과 MEL-18 유전자 및 MEL-18 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 접촉시키는 것, 및
MEL-18 유전자 복제(copy) 수; MEL-18 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 이로부터 발현되는 MEL-18 단백질 발현 수준;을 증가시키는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법으로,
상기 HER2 표적치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법. - 삭제
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