KR102406696B1 - 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법 및 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 변이 및 발현정보와 약물의 분자 프로파일의 결합 분석에 의해 약물의 민감성을 신뢰성 있게 예측할 수 있는 새로운 학습모델인 GBLscan (Genetic biomarker Labeling Scan)에서 예측한 결과물을 검증하는 시스템 및 검증을 거쳐 발굴한 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 크게 GBLscan이 예측한 특정 유전자의 발현량이 약물의 민감성에 영향을 주는지를 실험을 통하여 검증하는 검증 시스템과, 검증을 통하여 발굴한 바이오마커로 이루어진다. 혈액암 세포주에서 LEPRE1 유전자의 과발현은 EGFR TK inhibitor인 Peletinib에 높은 반응성을 보이고, LEPRE1이 발현저해된 세포는 Peletinib에 대하여 내성을 가지게 된다. 또한 이러한 검증을 위하여 Western blot, siRNA를 이용한 발현저해실험, electroporation을 활용한 과발현 및 발현저해 실험 등의 향후 다른 바이오마커 후보에도 활용이 가능할 것으로 예상되는 검증 시스템을 구축하였다.

Description

약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법 및 진단용 조성물 { Detection Method of Genes for Prediction of Drug Sensitivity and Diagnostic composition }

본 발명은 공용 암약물반응성정보, 차세대시퀀싱정보 (유전체 및 전사체) 정보를 활용하여 진단용 바이오마커를 예측하여 발굴하는 방법과 이를 통해 검증된 바이오마커 유전자 LEPRE1에 관한 것으로, 본 발명은 유전자발현을 조절하는 부위의 하플로타입(haplotype) 바이오마커 조성물 혹은 유전자발현 정보를 알고 있을 경우 암 약물 반응성을 향상시키는 진단용 바이오마커 유전자 및 변이 조성물을 예측 및 검증을 할 수 있고, 특히 EGFR 저해제의 진단 바이오마커에 관한 것이다.

최근 차세대시퀀싱 (NGS, next generation sequencing) 기술의 혁신으로 복잡하고 다양한 암을 이해하는데 필요한 유전자 염기서열정보 및 발현정보가 빠르게 확보되고 있다. 이와 함께 국제적인 컨소시엄 구성을 통해 다양한 암 종의 체세포 돌연변이에 대한 카탈로그 및 포괄적인 암 유발 돌연변이(driver mutation) 데이터베이스가 구축되었다 [선행문헌 1, 2]. 이러한 성과로 인해 종양의 상태 뿐 아니라 동종 종양 별 환자 간의 차이를 확인할 수 있는 바이오 마커 발굴과 이를 이용한 암 맞춤치료에 대한 기대 또한 급속도로 커지고 있으나, 아직까지 임상에서 승인되고 사용되는 바이오 마커는 부족한 상황이다. 암 세포주 및 약물 독성 데이터의 분자 프로파일링 데이터를 통합하기 위한 여러 협력 컨소시엄 (www.lincsproject.org)을 통해 265 개의 항암 화합물에 대하여 1,070 개의 인간 암 세포의 약물 독성 정보의 실험 결과값을 포함하는 데이터베이스인 GDSC (GDSC, Genomics of Drug Sensitivity in Cancer)[선행문헌 3] 가 공개되었으며, 이를 이용한 본사의 GBLscan(Genetic biomarker Labeling Scan) 수행 결과 EGFR 억제제 처리 시 나타나는 약물 민감도와 LEPRE1 간의 상관관계를 확인했다.

Leprecan으로도 알려져 있는 LEPRE1(P3H1)은 collagen prolyl hydroxylase family에 속하는 단백질로서 피브릴(fibril)을 구성하는 콜라겐(collagen)의 프롤린(proline)을 수산화 시키는 기능을 가지며[선행문헌 4] 콜라겐의 합성과 구조형성에 필수적인 기능을 갖는 효소이다[선행문헌 5]. 인간의 몸에 존재하는 28개 형태의 콜라겐들은 그 기능에 따라 크게 미소섬유(fibrillar)를 구성하는 I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII 형 콜라겐과 구조적인 네트워크를 형성하는 IV, VIII 형 콜라겐으로 분류할 수 있다[선행문헌 6]. LEPRE1은 이중 I 형 콜라겐의 896번째 프롤린(Pro896)을 수산화 시켜 콜라겐 단백질의 변형을 유도해 세포와 세포 사이 공간에 존재하는 세포외 기질(extracellular matrix)을 구성하는 중요한 역할을 하며, LEPRE1에 돌연변이가 생길 경우 골형성부전증(osteogenesis imperfecta)을 포함한 뼈연골형성장애 (osteochondrodysplasia), 척추후만증(kyphosis), 사지발육부진(rhizomelia) 등의 질병이 유도된다는 것이 보고되었다[선행문헌 7].

LEPRE1에 의한 I 형 콜라겐의 수산화는 뼈 암(bone cancer)과 골조직으로의 암세포 전이(cancer related bone metastasis) 과정에도 관련이 있으며[선행문헌 8], 췌장암, 대장암, 유방암, 폐암 등의 고형암에서 역시 그 발현량이 증가하는 등 암의 진행과정에 밀접하게 연관되어 있다 [선행문헌 9, 10, 11]. 또한 암종 주위 섬유모세포 (carcinoma associated fibroblast)의 구성 역시 LEPRE1과 I 형 콜라겐에 의해 영향을 받아 암의 진행 과정에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있는데[선행문헌 12], 뼈암, 췌장암, 직장암, 난소암, 폐암 등의 경우, 정상 조직보다 I형 콜라겐의 양이 증가되어 TGF-β의 과발현을 유도하고, 그 결과 암세포의 증식이 촉진되고 세포자연사가 감소하게 된다[선행문헌 13, 14]. 이외에도 I형 콜라겐에 가까이 위치한 암세포들의 증식률이 그렇지 않은 세포들에 비해 높고, 전이와 관련된 침습성이 증가되며, 순환 종양세포의 수 역시 증가되는 등 LEPRE1이 I형 콜라겐을 변형하는 과정이 골형성과정 뿐 아니라 암의 발병과 전이 등의 진행 과정에서 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있다 [선행문헌 15, 16, 17].

EGFR (Epidermal growth factor receptor)은 암 유발 유전자로서 이 유전자의 돌연변이로 인한 발현 증가 혹은 활성증가는 폐암, 두경부암 등을 포함한 다양한 암종에서 높은 질병 연관성을 보인다[선행문헌 18, 19]. 유방암에서 이 EGFR의 증가로 LEPRE1의 발현감소가 유도되는 것이 보고된 바 있으며 [선행문헌 20], EGFR과 LEPRE1 간의 직접적인 결합가능성이 제시되기도 하였다 [선행문헌 21]. 위와 같은 내용을 통해 암의 발병과 진행에 밀접하게 연관되어 있는 LEPRE1과 그 대상이 되는 I형 콜라겐이 EGFR과도 연관되어 있음을 알 수 있으며 본 발명에서 제시하는 LEPRE1의 발현양에 따른 EGFR 저해제 활성의 차이에 대한 직접적인 근거가 될 수 있다.

본 발명에서는 본사 고유의 GBLscan 법을 이용하여 발굴한 LEPRE1과 EGFR 저해제에 대한 약물 민감성 간의 상관관계를 확인하였으며 LEPRE1을 EGFR 저해제 처리를 통한 암 치료 시 사용될 바이오마커로 제시하고자 한다.

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본 발명은 암 약물과 세포주 유전체의 발현정보 및 유전자 복제수변이의 관련성을 양적형질위치들의 모음 정보기반 선형 회귀 모델링 및 딥러닝 기계학습을 통하여 예측하는 시스템(GBLscan)을 통하여 예측한 바이오마커를 실험을 통해 확인하여, 기계학습 시스템을 통한 예측을 증명함으로써 신뢰도를 제공하고자 하는 것이다. EGFR의 발현이 높은 암세포에서 LEPRE1 유전자의 발현양이 길항제 (tyrosine kinase inhibitor) 항암제에 대한 민감도를 결정하는 증명실험의 예를 보여주고 있다. 또한 길항제 바이오마커의 검증 모델을 제공함으로써 향후 다른 약물 및 다른 유전자에 대해서도 같은 방식으로 검증을 할 수 있도록 하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 본 발명은 크게 세포주 유전체의 발현정보 및 유전자, 복제수변이와 약물에 대한 반응성을 예측하는 단계와, 시스템을 통하여 예측한 변이가 실제로 약물의 민감성에 영향을 미치는지 검증하는 두 단계로 구성되어 있다. 예측 단계에서는 자사 개발 프로그램(기계학습 시스템)인 GBLscan을 활용하였고, 실험을 통한 증명은 국가 검증 기관인 안전성평가연구소와의 공동연구를 통하여 이루어졌다.

이와 같은 본 발명에 의하면, 본 발명은 체내(in vivo), 체외(in vitro) 혹은 유전정보에 대한 알려진 약물의 민감성 결과들로부터, 약리 효과가 밝혀지지 않은 약물의 민감성 정도를 예측할 수 있는 효과가 있는 GBLscan의 예측 결과물에 대하여 실험으로 유전자의 변이나 복제수 변이, 발현량의 변화가 실제로 약물 반응성에 영향을 주는지를 검증한 것이다.

도 1은 유전자 발현과 약물반응성 관계를 도시한 그래프.
도 2는 본 발명에 의한 혈액암 세포주(THP-1, U-937, KG-1, HL-60)에서 LEPRE1의 발현량을 도시한 도면.
도 3은 본 발명에 의한 혈액암 세포주(THP-1, U-937, KG-1, HL-60)에서 EGFR의 발현량을 도시한 도면.
도 4는 본 발명에 의한 폐암 세포주(A549)에서 siRNA를 이용한 LEPRE1 유전자의 발현저해 결과를 도시한 도면.
도 5는 본 발명에 의한 폐암 세포주(A549)에서 LEPRE1 유전자의 과발현과 발현저해 및 유전자의 발현량에 따른 약물반응성 결과를 도시한 도면.
도 6은 본 발명에 의한 혈액암 세포주(KG-1, THP-1)에서 LEPRE1 유전자의 과발현과 발현저해 및 유전자의 발현량에 따른 약물반응성 결과(1차 실험)를 도시한 도면.
도 7은 본 발명에 의한 혈액암 세포주(KG-1, THP-1)에서 LEPRE1 유전자의 과발현과 발현저해 및 유전자의 발현량에 따른 약물반응성 결과(전압을 달리한 2차 실험)를 도시한 도면.
도 8은 본 발명에 의한 혈액암 세포주(KG-1, THP-1)에서 LEPRE1 유전자의 과발현과 발현저해 및 유전자의 발현량에 따른 약물반응성 결과(전압 및 시간을 달리한 3차 실험)를 도시한 도면.
도 9는 본 발명에 의한 LEPRE1 유전자의 과발현 및 발현저해와 발현량이 약물반응성에 미치는 영향을 도시한 도면.

이하에서는 본 발명에 의한 세포주 변이 및 암 약물 병합 데이터 기반 인공지능 딥러닝 모델을 이용한 약물 반응 예측 시스템을 통하여 예측한 LEPRE1 유전자의 발현이 실제로 암 약물 반응성에 영향을 미치는지 검증한 예를 상세히 설명하기로 한다.

표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor)는 ErbB 수용체 패밀리의 일원이며, 밀접하게 관련된 4 가지 수용체 (티로신 키나제의 서브 패밀리 : EGFR (ErbB-1), HER2 / neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 및 Her 4 (ErbB-4)로 구성된다. 그리고, 많은 암 유형에서 EGFR 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이는 암을 초래할 수 있다.

도 1. 상기에 서술한 GBLscan의 핵심 기술을 활용하여 유전자의 과발현과 발현저해가 약물의 내성 및 민감성에 영향을 미칠 수 있는 유전자 및 약물을 선정하였다. LEPRE1 유전자의 경유 과발현되면 EGFR TK inhibitor인 Peletinib에 대하여 약물 반응성이 증가하고, 반대로 LEPRE1 유전자의 발현이 저해되는 경우 Peletinib에 대한 내성이 생기게 된다고 예측하였다. 과발현 및 발현저해가 약물 반응성에 크게 영향을 줄 수 있는 유전자인 LEPRE1을 이 단계에서 선정하였고, 이하의 실험을 통하여 증명하였다.

도 2. 타겟 암종인 혈액암에서 LEPRE1 저발현 혈액암 세포주를 찾기 위해, Acute Myeloid Leukemia (AML) 세포주인 KG-1, U-937, HL-60를 후보 세포주로 선정하였다. RT-PCR 결과, LEPRE1 유전자는 THP-1 세포주에서 가장 높게 발현되었다. 단백질 수준에서 LEPRE1은 U-937에서 가장 높은 발현량을 보이고, HL-60에서 저발현되는 것을 확인하였다.

도 3. 실험에 사용할 약물인 Pelitinib이 EGFR의 Tyrosine kinase를 타켓으로 하는 약물이므로 AML 세포주에서 EGFR의 발현을 확인하였다. 그 결과 KG-1, THP-1에서 EGFR이 발현되는 것을 확인하였다. 따라서 LEPRE1의 과발현 세포주로는 THP-1, 저발현 세포주로는 KG-1을 선정하여 이후 과정을 진행하였다.

도 4. 폐암 세포주(A549)와 혈액암 세포주(THP-1)에서 siRNA를 통하여 LEPRE1 유전자의 발현저해 실험을 진행하였다. A549에서 LEPRE1은 si2293 siRNA 사용시 발현량이 83% 감소하였으나, THP-1에서는 si2293 siRNA 사용시 발현량이 15% 감소하였다. 부착 세포인 A549 세포주의 경우 siRNA를 통하여 발현저해 조건을 만들기가 용이하였지만, 부유 THP-1 세포주의 경우에는 siRNA를 통하여 발현저해를 진행하기에 효율이 A549 세포주보다 좋지 못했다. 이에 따라 우선적으로 A549 세포주에서 먼저 세포주의 발현량에 따른 약물반응성의 변화를 검증하기로 결정하였다.

도 5. A549 세포주에서 LEPRE1 유전자의 과발현 및 발현저해를 유도하고, 이후 Peletinib 약물을 처리하여 유전자의 Ic50 값을 표기하였다. LEPRE1의 발현 수준을 Western Blot으로 확인하고, Pelitinib에 대한 약물 반응성 시험 (WST-1 Assay)을 수행하였다. GBLscan을 통해 예측한 값과 마찬가지로, A549에 pcDNA3.1, LEPRE1/pcDNA3.1을 과발현시킨 후 Pelitinib을 처리한 결과, IC50값이 각각 1.66533±0.52009, 1.03267±0.04055으로 나타났다. LEPRE1 과발현 시 Pelitinb에 대한 약물 감수성이 증가하는 효과를 확인하였다. A549에 Negative Control, LEPRE1 siRNA(si2293)를 Transfection한 후 Pelitinib을 처리한 결과, IC50값이 각각 1.731±0.18688, 4.0067±1.00963로 나타났다. LEPRE1 발현저해 시 Pelitinb에 대한 약물 감수성이 감소하는 효과를 확인하였다.

도 6. 이후 electroporation으로 혈액암 세포주 KG-1과 THP-1에서 유전자의 과발현 및 발현저해를 성공하였고, 순차적으로 약물을 처리하여 약물반응성의 변화를 검증하였다. 실험은 1차부터 3차까지 순차적으로 이루어졌으며, 1차에서는 과발현시 약 140%의 발현, 발현저해시는 70%의 발현치를 만들어내는 데에 성공하였다. 약물반응성의 경우 과발현시에는 약물에 대하여 민감성을 보였고, 발현 저해시에는 정상 발현치를 보이는 세포와 비교하여 약물 저항성을 나타내었다

도 7. electroporation를 통한 유전자의 과발현 및 발현저해 조건을 특정하고, 압과 시간을 조절하여 과발현 및 발현저해 실험을 반복하였다. KG-1과 THP-1 세포주에서 유의미하게 유전자의 발현량이 증가 혹은 감소하는 컨디션을 찾아서 세포의 약물반응성을 검사하였다. 또한 반복적인 실험에서 같은 결과를 얻어냄으로써 실험의 반복성을 검증하였다.

도 8. 두 개의 혈액암 세포주인 KG-1과 THP-1 세포주에서 LEPRE1 유전자의 발현저해 및 과발현이 적절하게 이루어지는 전압 및 시간 컨디션을 찾아서 유전자의 과발현과 발현저해 조건을 만들었다. 이후 Peletinib 약물을 처리하여 유전자가 과발현 및 발현저해된 세포의 약물반응성을 측정하고 GBLscan의 예측값과 비교하였다.

도 9. A549에 Negative Control, LEPRE1 siRNA(si2293)를 Transfection한 후 Pelitinib을 처리한 결과, IC50값이 각각 1.731±0.18688, 4.0067±1.00963로 나타났다. LEPRE1 발현저해 시 Pelitinb에 대한 약물 감수성이 감소하는 Loss-of-function 효과를 확인하였다. 이 결과는 A549 세포에서 263개 약물에 대한 1000여 개의 세포주들의 약물반응성을 근거로 하여 예측한 결과와 동일하다.

본 발명은 질병 관련 유전자 변이 및 발현량과 약물의 분자 결합분석에 의해 약물의 민감성을 신뢰성 있게 예측할 수 있는 새로운 선형 회귀 모델인 약물 적응증 및 반응 예측 시스템 및 방법인 GBLscan (Genetic Biomarker Scan)의 결과물에 대한 검증에 관한 것으로, 본 발명에 의하면, 본 발명에서는 체외 및 체내 임상시험으로부터 수집되는 유전체에 대한 약물의 민감성 결과가 실제 약물반응성과 일치하는지를 검증하여 검증 시스템의 개발을 통하여 향후 다른 GBLscan의 예측 결과물에 대한 검증을 가능하게 함과 동시에, 약리적으로 사용 가능한 biomarker를 발굴하여 임상에 기여할 가능성을 보였다.

Claims (15)

1. 유전자의 발현 정도에 따라 암세포주에 대한 약물의 민감성을 판단하되;
   상기 유전자는 LEPRE1 유전자이고, 상기 약물은 EGFR 저해제인 Pelitinib 약물이며;
   상기 LEPRE1 유전자의 과발현 정도에 따라 상기 암세포주에 대한 EGFR 저해제 약물의 민감도가 높고, 상기 LEPRE1 유전자의 저발현 정도에 따라 암세포주에 대한 EGFR 저해제 약물의 저항성이 높은 것으로 약물 민감도를 판단함을 특징으로 하는 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 암세포주는,
   혈액암의 세포주인 THP-1, KG-1, 또는 폐암 세포주인 A549 중 어느 하나 이상임을 특징으로 하는 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법.
   
4. 삭제
5. LEPRE1 유전자의 RNA 발현 정도를 측정하는 제제 또는 LEPRE1 유전자에 의한 단백질 발현 정도를 특정하는 제제를 포함하여 구성되어, EGFR 저해제인 Pelitinib 약물의 민감도 판단함을 특징으로 하는 진단용 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 LEPRE1 유전자의 RNA 발현 정도를 측정하는 제제는,
   LEPRE1 유전자 또는 이의 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 진단용 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 LEPRE1 유전자에 의한 단백질 발현 정도를 특정하는 제제는,
   LEPRE1 유전자에 의한 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 진단용 조성물.
   
8. 삭제
9. (A) 약물의 민감성 정도를 예측하는 스캐닝 시스템을 통하여 표적 약물에 대한 반응성을 결정하는 후보유전자를 선별하는 단계와;
   (B) 상기 표적 약물의 대상 세포주에 대하여, 상기 후보유전자에 대한 과발현상태를 구현하는 단계와;
   (C) 상기 (B)단계에 의해 상기 후보유전자가 과발현된 상태에서, 상기 표적 약물의 상기 대상 세포주에 대한 반응성을 산출하는 단계와;
   (D) 상기 표적 약물의 대상 세포주에 대하여, 상기 후보유전자에 대한 저발현상태를 구현하는 단계와;
   (E) 상기 (D)단계에 의해 상기 후보유전자가 저발현된 상태에서, 상기 표적 약물의 상기 대상 세포주에 대한 반응성을 산출하는 단계; 그리고
   (F) 상기 (C) 단계 및 (E) 단계에서 산출된 반응성을 대비하여, 상기 후보유전자에 대한 상기 표적 약물에 대한 반응성 결정 마커 여부를 검증하는 단계를 포함하고:
   상기 제 (C) 단계 및 상기 제 (E) 단계의 반응성은,
   상기 대상 세포주에 대한 상기 표적 약물의 IC50 값을 통해 산출되며:
   상기 표적 약물은 EGFR 저해제인 Peletinib 약물이고, 상기 후보유전자는 LEPRE1 유전자임을 특징으로 하는 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 (B) 단계의 상기 후보유전자에 대한 과발현상태는,
    pcDNA3.1 을 이용하여 구현됨을 특징으로 하는 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법.
    
11. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 (D) 단계의 상기 후보유전자에 대한 저발현상태는,
    siRNA 를 이용하여 구현됨을 특징으로 하는 약물 민감도 판단을 위한 유전자 검출 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

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