KR20160092992A - 암 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

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에프-스타 바이오테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은, 특이적 결합 멤버, 및 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 결합 도메인과 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 반응하는 암을 동정하기 위한 바이오마커로서 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 유전자 카피 수 및 HER2 mRNA의 용도에 관한 것이다.

Description

암 바이오마커 및 이의 용도 {CANCER BIOMARKERS AND USES THEREOF}
본 발명은 바이오마커로서 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 유전자 카피 수(GCN) 및 HER2 mRNA 수준의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 특이적 결합 멤버, 및 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 결합 도메인과 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 반응하는 암을 동정하기 위한 바이오마커로서 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 유전자 카피 수 및 HER2 mRNA의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 상피 성장 인자 수용체 2(또한 HER2, HER2/neu 또는 ErbB-2라 지칭됨)은 185kDa 세포질 막관통 티로신 키나제 수용체이다. 이는 염색체 17q의 긴 아암 상에 위치하는 c-erbB-2 유전자이고 HER 패밀리의 멤버이다[참조: Ross et al., 2003]. HER 패밀리는 통상 세포 성장 및 생존 뿐만 아니라 부착, 이동, 분화 및 기타 세포 반응을 조절한다[참조: Hudis, C, 2007]. HER2의 과발현 및 증폭은 유방[참조: Yarden, Y, 2001], 위장[참조: Gravalos et al., 2008], 위[참조: Ruschoff et al., 2010], 결장직장[참조: Ochs et al., 2004], 난소[참조: Lanitis et al., 2012], 췌장[참조: Lei et al., 1995], 자궁내막 (endometrial)[참조: Berchuk et al., 1991] 및 비-소세포 폐암[참조: Brabender et al., 2001]을 포함하는 다양한 고형 암의 발달에서 관찰된다.
유방, 결장직장 및 위암은 2008년에 모든 진단된 암 사례의 30% 및 모든 암 사망의 24%를 점유한다[참조: CRUK and WHO World Cancer Report]. 유방암은 특히 여성 중에서 암 사망의 주요 원인이다. HER2는 유방암의 15 내지 30%에서 과발현되거나 증폭되고, 불량한 예측, 무병 및 전체 생존의 짧은 기간 뿐만 아니라 보다 적극적 암 표현형과 연관되어 있다[참조: Vinatzer et al., 2005]. 유방암에서, 약 20%의 환자는 HER2 원발암유전자를 함유하는 염색체 17 상의 앰플리콘의 증폭을 수반하는 게놈 변화를 보유하는 종양이 발달한다[참조: Ross, J, 2009; and Hicks et al., 2005]. 이러한 종양은 질환의 사망율에 과잉 기여하는 유방암의 보다 적극적 아형을 나타낸다[참조: Hudis C, 2007].
다수의 HER2 표적화 요법은 HER2 양성 종양의 치료를 위해 승인되었다.
헤르셉틴TM(트라스투주맙)은 탁솔TM(파클리탁셀)과 조합하여 전이성 유방암의 치료를 위해, 및 전이성 질환에 대한 하나 이상의 화학요법 과정을 제공받은 환자에서 단독으로 HER2 양성 유방암의 치료를 위해 승인되어 있다. 트라스투주맙은 또한 작동가능한 또는 국소 진행된 HER2 양성 종양에서 보조제 화학요법(파클리탁셀, 도세탁셀 및 비노렐빈)의 유효성을 증강시키기 때문에, 초기 또는 진행기의 HER2-과발현 유방암을 갖는 환자에 대한 관리 표준으로 고려된다. 트라스투주맙은 또한 이들의 전이성 질환에 대한 치료 전에 제공받지 않은 환자에서 화학요법(시스플라틴 및 카페시타빈 또는 5-플루오로우라실)과 조합하여 위의 HER2 양성 전이성 암 또는 위식도 접합 암의 치료를 위해 승인되어 있다[참조: Genentech, About Herceptin. [online] Available at: http://www.herceptin.com/about [accessed on 17 September 2013]].
페르제타TM(페르투주맙)는 또한 트라스투주맙 및 도세탁셀과 조합하여 HER2 양성 전이성 유방암의 치료를 위해 승인되어 있다[참조: Genentech, PERJETA Can Help Strengthen Your Treatment. [online] Available at: http://www.perjeta.com/patient/about [accessed on 17 September 2013]]. 페르투주맙은 HER2의 상이한 도메인을 표적화하고, 트라스투주맙과는 상이한 작용 메카니즘을 갖는다. 구체적으로, 페르투주맙은 HER2 이량체화 억제제이고, 이는 HER2가 다른 HER 수용체(EGFR/HER1, HER3 및 HER4)와 페어링하는 것을 방지한다. 카드실라TM(아도-트라스투주맙 엠탄신, T-DM1)은 항체-약물 접합체이고, 이는 세포 사멸을 가져 오는 분화 세포에서 미소관의 집합을 파괴하는 세포독성제 메르탄신(DM1)에 결합된 트라스투주맙을 포함하고, 트라스투주맙 및 탁산 화학요법을 사용한 치료 전에 제공받은 환자에서 전이성 유방암의 치료를 위해 승인되어 있다[참조: Genentech, How KadcylaTM(ado-trastuzumab emtansine) is Believed to Work (Proposed Mechanism of Action). [online] Available at: http://www.gene.com/media/product-information/kadcyla-moa [accessed on 17 September 2013]].
티케르브TM(라파티닙)은 HER2 및 EGFR 둘 다의 촉매 작용을 차단하는 소분자 키나제 억제제이다. 이는 페마라TM(레트로졸)과 조합하여 폐경 여성에서 HER2 양성, 호르몬 수용체 양성, 전이성 유방암의 치료를 위해, 및 안트라사이클린, 탁산 및 헤르셉틴TM을 포함하는 요법 전에 제공받은 환자에서 젤로다TM(카페시타빈)와 조합하여 진행성 또는 전이성 HER2 양성 유방암의 치료를 위해 승인되어 있다[참조: U.S. Food and Drug Administration, Highlights of Prescribing Information. [online] Available at: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/022059s007lbl.pdf [accessed on 28 September 2013]]. 추가의 약물은 임상 개발중이다.
승인된 HER2-특이적 요법은 HER2-양성 유방 및 위암의 치료 표준을 개선시켰지만, 이들 약물에 대한 내인성 또는 획득 내성에 기인하여 상당히 만족스럽지 않은 의학적 필요가 존재한다. HER2 양성 유방암에 대한 치료 상황의 트라스투주맙 표준에도 불구하고, 보조제 설정으로부터 20 내지 50% 환자 및 단일요법 설정으로부터 대략 70%의 환자는 트라스투주맙에 대한 내성을 발달하도록 진행한다[참조: Wolff et al., 2007; and Harris et al., 2007].
바이오마커로서 암의 주요한 유전자 또는 분자 메카니즘의 평가에 기초하여 치료를 위한 환자의 선택을 향해 암 요법에서 새로운 경향이 존재한다. 특정 암에 관련되는 것으로 밝혀진 바이오마커에 기반한 진단 시험은 특이적 암 요법을 사용한 치료에 감수성인 환자를 동정하기 위해 FDA에 의해 승인되어 있다. 2013년 5월까지, 동반 진단약으로 또한 공지된 15개의 이러한 진단 시험은 FDA에 의해 승인되었고[참조: Genetic Engineering and Biotechnology News, 2013, Companion Diagnostics: 52 Pick-Up. [online] Available at: http://www.genengnews.com/insight-and-intelligenceand153/companion-diagnostics-52-pick-up/77899813/ [accessed on 28 September 2013]] 다양한 기타 것들이 개발중에 있다. 예를 들면, 테라스크린TM KRAS 시험은 에르비툭스TM(세툭시맙)으로 치료되는 야생형 KRAS 유전자를 갖는 EGFR 양성 전이성 결장직장암을 갖는 환자를 동정하는 EGFR 면역조직화학 시험이다. DAKO C-키트 PharmDx 면역조직화학 시험은 글리벡(이마티닙)을 사용한 치료에 감수성인 c-키트 양성 소화관 간질 종양을 갖는 환자를 동정한다. 다수의 진단 시험은 또한, 통상 함께 사용되는 면역조직화학 시험 헤르셉테스트TM 및 Her2 FISH PharmDx 키트TM 등의 헤르셉틴TM(트라스투주맙)으로 치료하기 위한 HER2 양성 종양의 동정을 위해 승인되었다. HER2 양성 종양의 면역조직화학을 위해 추가로 상업적으로 입수가능한 키트는 오라클(Leica Biosystems) 및 패쓰웨이(Ventana)를 포함한다. 치료에 대한 임상 반응을 예측하는 바이오마커를 동정하기 위한 임상전 및 임상 연구 노력들은 또한, HER2 표적화 요법으로부터 혜택을 받을 가능성이 있는 결장직장암, 난소암 등을 포함하여 "비-전통적" HER2+ 암을 갖는 추가의 환자를 동정할 가능성이 있다[참조: Gun et al., 2013].
HER2를 과발현하거나 HER2 유전자를 증폭시키는 종양의 공격적 성질의 결과로서, HER2 증폭 상태는 질환 결과의 점차 중요한 예측인자가 되고, 광범위하게 시험되고 있다. HER2 특이적 생물학적 요법을 사용한 치료에 감수성일 수 있는 HER2 양성 종양은 통상 면역조직화학(IHC)을 사용함으로써 최초로 동정된다. 환자의 샘플은, 상기 샘플 중의 염색된 종양 세포의 비율과 함께 염색의 강도를 반영하는 스코어 시스템 (score system)을 사용하여 반-정량적 방식으로 평가된다. HER2 발현 또는 과발현의 수준을 측정하고, 스코어는 강력한 완전한 막 염색이 3+의 스코어를 제공하는 것으로 보고, 강력한 양성 또는 명확한 것으로 간주한다. 약한 내지 중간 완전한 막 염색은 종양 세포의 10% 초과에서 관찰되고 2+의 스코어를 제공하며 약한 양성 또는 애매모호한 것으로 간주한다. 막 염색이 종양 세포의 10% 미만의 경우이거나 불완전한 희미한 경우, 샘플은 1+/0의 스코어를 제공하고, HER2 음성으로 간주한다. IHC 분석에서 3+ 스코어의 이들 종양, 즉 종양 세포 표면 상의 HER2 단백질의 강력한 과발현이 존재하는 경우는, HER2 특이적 요법을 사용한 가능한 치료를 위해 임상의에게 보고되어 있다.
IHC는 단지 반-정량적이고 HER2 단백질의 세포 표면 과발현을 측정하기 때문에, 이는 부정확할 수 있고 항상 정확한 판독을 제공하는 것은 아니다. 특히, IHC에 의해 HER2 발현에 대해 약하게 양성성인 종양, 즉 분석에서 2+ 스코어를 제공하는 종양을 정확하게 동정하는 것은 곤란할 수 있다. 이러한 종양의 HER2 상태의 명확화를 위해, 샘플은, 종양 샘플에서 HER2 유전자 증폭 수준을 측정하기 위해, 예를 들면, 형광 제자리 하이브리드화(FISH)에 의해 추가 시험에 제공된다. 다양한 방법이 FISH 수행을 위해 공지되어 있다. HER2 유전자 카피 수를 CEP17 등의 내부 대조군과 비교하고 FISH 스코어가 2 미만, 달리 말하면 HER2/CEP17 비율이 2 미만인 방법에서, HER2 유전자 상태는 비-증폭된다고 하고, 종양은 HER2 음성으로 간주된다. FISH 스코어가 2 이상인 경우, HER2 유전자 상태는 증폭된다고 하고, 종양은 HER2 양성으로 간주되고, HER2 특이적 요법을 사용한 가능한 치료를 위해 임상의에게 보고된다.
그러나, HER2 양성 종양에 대한 시험의 이들 복수의 층에도 불구하고, HER2 양성으로 동정된 모든 종양이 현재의 HER2 특이적 요법에 반응성인 것은 아니다. 따라서, 이러한 요법으로부터 유리할 가능성이 있는 환자를 동정하는 수단 뿐만 아니라 HER2 양성 종양을 갖는 환자의 치료법에 대한 필요성이 당해 기술분야에 남아 있다. 또한, 상술한 바와 같이, 트라스투주맙 등과 같이 HER2에 대한 공지된 요법에 대한 획득 내성은 이러한 내성 HER2 양성 암의 치료에 적합한 요법의 필요성이 당해 기술분야에 있음을 의미한다.
예를 들면, HER2에 고친화성으로 결합하는 변형된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항원-결합 Fc 단편(또한 FcabTM(항원 결합을 갖는 Fc 단편)으로 지칭됨)은 국제공개공보 제WO 2009/132876 A1호 및 제WO 2009/000006 A1호에 기재되어 있다. 이러한 Fcab는 마우스에서 대략 60시간의 반감기 수명 등의 양호한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들은 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버가 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 암을 치료하기 위해 사용될 있음을 발견했다. 본 발명자들은 또한 이러한 특이적 결합 멤버가 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 발견했다. 특히, 이러한 특이적 결합 멤버는 트라스투주맙 단독요법, 또는 페르투주맙과 조합된 트라스투주맙을 사용한 치료 등의 공지된 HER2 특이적 치료법을 사용한 치료에 내성인 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, HER2는 다수의 상이한 암에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. 보다 많은 데이터는 HER2를 발현하는 것으로 공지된 기타 암보다는 유방암에서 이용가능한데, 이는 아마도 가장 잘 연구된 HER2 양성 암이기 때문이다. 대부분의 데이터는 3+의 IHC 스코어를 갖는 종양을 위해 이용가능하다. 문헌[참조: Hoff et al. (2002)]은 모든 유방암 환자의 8%가 10 이상의 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정했다. 트라스투주맙의 최대 보조제 유방암 시험(HERA 시험)에서, 종양의 유전자 카피 수는 FISH에 의해 2071(61%) 환자에서 평가되었다. 이들 환자 중에서, 10 이상의 유전자 카피 수는 환자의 약 65%에서 동정되었다. 이는 모든 유방암 환자의 약 13%를 나타낸다[참조: Dowsett et al., 2009]. HER2 유전자 카피 수는 일부 임상 시험에서 연구되었지만, 이들 암에서 HER2 mRNA의 상응하는 수준에 대한 정보는 거의 이용할 수 없다. 그러나, 세포 중의 유전자 카피 수의 증가는 종종 상기 유전자의 보다 큰 발현을 야기하고 따라서 상기 유전자에 의해 코딩된 mRNA의 증가된 수준을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 결과적으로, 종양 세포당 고도의 HER2 유전자 카피 수(즉 10 이상)을 갖는 암 환자는 또한 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 예상된다.
따라서, 종양 세포당 10 이상의 HER2 GCN을 갖는 암을 앓고 있는 상당한 수의 환자가 존재하고, 이는 특이적 결합 멤버, 또는 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료로부터 유익할 수 있다. 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 암을 앓고 있는 환자에 대해서도 동일하게 적용된다.
본 발명자들은 유전자 카피 수가 본원에 개시된 바와 같은 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 예측하고, 사전 승인된 HER-2-특이적 치료 트라스투주맙을 사용한 치료를 예측하지 않음을 밝혀냈다.
본원에는, 환자의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 특이적 결합 멤버, 뿐만 아니라 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버가 제공되고, 여기서 상기 암은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는다.
또한, 본원에는, 환자의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 특이적 결합 멤버, 뿐만 아니라 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버가 제공되고, 여기서 상기 암은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는다.
한 가지 관점에서, 본 발명은, 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서,
상기 암은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고,
상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
본원에 지칭하는 환자는 인간 환자이다.
상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정된다. 따라서, 본 발명은, 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정되었고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
대안적으로, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함하고,
상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "HER2 유전자 카피 수"는 종양/암 세포당 평균 HER2 유전자 카피 수를 지칭할 수 있다. HER2 유전자 카피 수는 10 이상일 수 있다. 대안적으로 HER2 유전자 카피 수는 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상 또는 25 이상일 수 있다. 한 가지 예에서, HER2 유전자 카피 수는 10 초과이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 11 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 12 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 13 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 14 이상이다. 추가의 예에서, HER2 유전자 카피 수는 15 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 16 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 17 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 18 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 19 이상이다. 또 다른 예에서, HER2 유전자 카피 수는 20 이상이다. 추가의 예에서, HER2 유전자 카피 수는 23 이상이다. 추가의 예에서, HER2 유전자 카피 수는 25 이상이다. 바람직하게는, HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수는 15 이상이다.
바람직하게는, HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수는 10 이상이고, 여기서 상기 유전자 카피 수는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)에 의해 측정된다.
바람직하게는, HER2 유전자 카피수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수는 18 이상이고, 여기서 상기 유전자 카피 수는 FISH에 의해 측정된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서, 상기 암은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 측정된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명은, 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 측정되었고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
대안적으로, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버로서, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함하고,
상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버를 제공한다.
샘플에서 특이적 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준은 정량적 PCR에 의해, 참조 유전자, 바람직하게는 하우스키핑 유전자의 cDNA 카피와 비교하여, 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 샘플에서 mRNA로부터 유래된 cDNA의 카피를 정량화함으로써 간접적으로 측정할 수 있다. 참조 유전자는 다양한 조직/샘플 유형에서 정상 프로파일을 갖고, 표준으로서 사용된다. 본원에서 지칭되는 종양/암 또는 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준은 바람직하게는, 참조 유전자의 cDNA 카피의 수에 의해 반영되고 각각 종양/암 또는 종양 샘플에서 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된 참조(예: 하우스키핑) 유전자의 mRNA 수준과 비교하여, 종양/암 또는 종양 샘플에서 HER2 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된 HER2 mRNA 수준을 지칭한다. cDNA 카피 수는 CopyCallerTM 소프트웨어 버젼 2.0(Life Technologies), 또는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 또 다른 동등한 소프트웨어를 사용하여 정량적 PCR 데이터로부터 측정할 수 있다. CopyCallerTM 소프트웨어는 하우스키핑 유전자의 cDNA의 카피 수와 비교하여 HER2 cDNA의 카피 수의 비교 사이클 역치 상대적 정량화 분석을 수행한다. 임의로, cDNA 카피 수는, 세포당 HER2 유전자의 2개 카피를 갖거나 갖는 것으로 예상되는 10 인간 세포주의 풀로부터 수득된 cDNA 샘플 등과 같이 참조 cDNA 샘플에 대한 참조로서 정규화할 수 있다[참조: LifeTechnologies, CopyCaller Software - User Manual].
따라서, 본원에서 지칭되는 종양/암 또는 종양 샘플에서 고도의 HER2 mRNA 수준은 바람직하게는, 참조 유전자의 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 각각 종양/암 또는 종양 샘플에서 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 참조 유전자의 mRNA 수준과 비교하여, 종양/암 또는 종양 샘플에서 고도의 HER2 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 고도의 HER2 mRNA 수준을 지칭한다. 구체적으로, 역전사 PCR을 사용하여 종양 샘플 중의 HER2 또는 참조 유전자 mRNA를 cDNA로 전사시키고, 이어서 qPCR을 사용하여 정량화한다. 참조 유전자는 바람직하게는 하우스키핑 유전자이다. 바람직한 예에서, 참조 유전자는 TATA-결합 단백질(TBP)이지만, 기타 적합한 참조 유전자는 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 종양/암 또는 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준은 세포당 HER2 유전자의 2개 카피를 갖는 것으로 공지된 대조군 세포 샘플 중의 HER2 mRNA 수준과 비교하여 정규화할 수 있다. 특히, 종양/암 또는 종양 샘플에서 HER2 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 종양/암 또는 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준은, 세포당 HER2 유전자의 2개 카피를 갖는 것으로 공지된 대조군 세포 샘플에서 HER2 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 HER2 mRNA 수준과 비교하여 정규화할 수 있다. 대조군 샘플의 HER2 mRNA 수준은 바람직하게는, 참조 유전자의 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 대조군 샘플에서 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 참조 유전자의 mRNA 수준과 비교하여, 대조군 샘플에서 cDNA 카피 수에 의해 반영되고 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는 HER2 mRNA 수준이다. 참조 유전자는 바람직하게는 종양/암 또는 종양 샘플, 예를 들면, TBP에서 HER2 mRNA 수준을 측정하기 위해 사용된 것과 동일한 참조 유전자이다.
따라서, 본원에서 지칭되는 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은 바람직하게는, 각각 종양/암 또는 종양 샘플에서 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된 참조 유전자의 cDNA 카피 수에 의해 반영되는 참조 유전자의 mRNA 수준과 비교하여, RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된 종양/암 또는 종양 샘플에서 고도의 HER2 cDNA 카피 수에 의해 반영되는 고도의 HER2 mRNA 수준을 지칭한다. 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은,상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 75 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 110 이상, 120 이상, 130 이상, 140 이상, 150 이상, 160 이상, 168 이상, 170 이상, 180 이상, 190 이상, 200 이상, 210 이상, 220 이상, 229 이상, 248 이상의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 삼기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 종양/종양의 샘플에서 168 이상의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 DNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 248 이상의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 바람직하게는, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 200 이상의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 보다 바람직하게는, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여 상기 암/종양의 샘플에서 229 이상의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다.
상기 기재된 하한치 이외에, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 820 이하, 850 이하, 900 이하, 950 이하, 1000 이하, 1100 이하, 1200 이하, 1300 이하, 1400 이하, 1500 이하, 1600 이하, 1700 이하, 1800 이하 또는 1900 이하의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 바람직하게는, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 820 이하의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다.
바람직하게는, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 200 내지 820개의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다. 보다 바람직하게는, 종양/암 또는 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은, 상기 샘플에서 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 암/종양의 샘플에서 229 내지 820개의 HER2 cDNA 카피 수를 지칭하거나 이에 상응할 수 있고, 여기서 샘플에서 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수는 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정된다.
본원에서 지칭되는 암은 위암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 췌장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 위암 또는 자궁내막암일 수 있다. 이들 암 모두는 HER2를 과발현하는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 암은 위암, 유방암 또는 결장직장암이다. 보다 바람직하게는, 암은 위암 또는 유방암이다. 한 가지 바람직한 실시형태에서, 암은 위암이다. 본원에서 지칭되는 위암은 식도암을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 암은 유방암이다. 암의 HER2 유전자 카피 수는 상기 기재된 바와 같다. 이러한 암은 HER2 양성(HER2+)로서 지칭되거나 HER2를 과발현하는 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 본원에서 지칭되는 암은 HER2 양성일 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 본원에서 지칭되는 암은 HER2를 과발현할 수 있다. 암이 HER2 양성이거나 HER2를 과발현하는지의 여부는, 예를 들면, 면역조직화학(IHC), 임의로 이어서 상기 기재된 바와 같은 qPCR 등의 방법을 사용하여 초기에 측정할 수 있다.
본 발명자들은 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버가 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 내성이 있거나 난치성인 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암은 본질적으로 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 내성 또는 난치성일 수 있거나, 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 대해 획득 내성 또는 난치성을 가질 수 있다. 암은 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 내성 또는 난치성인 위암일 수 있다. 대안적으로, 암은 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 내성 또는 난치성인 유방암일 수 있다. 암이 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 내성 또는 난치성인지를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 트라스투주맙을 사용한 치료에 내성인 유방암은 보조제 트라스투주맙 치료 동안 또는 치료 후 12개월 이내에 진단된 전이성 설정 또는 새로운 재발에 있어서 화학요법의 존재 또는 부재하에 일선 트라스투주맙 치료 후 8 내지 12주 또는 3개월에서 일차 방사선 재평가에서 진행을 나타낼 수 있다. 트라스투주맙에 난치성인 유방암은 일차 방사선 평가에서 질환 반응 또는 안정화를 초기에 달성한 트라스투주맙-함유 섭생의 2개 이상의 라인 후에 질환 질행을 나타낼 수 있다[참조: Wong et al., 2011].
이외에 또는 대안적으로, 본원에서 지칭되는 환자는 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 대한 부적절한 반응을 나타낼 수 있다. 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 +페르투주맙에 대한 부적절한 반응은, 환자가 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙으로 치료되는 경우, 종양 성장 지연의 부족 또는 불충분한 종양 성장 지연을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 대해 부적절한 반응을 나타낸 환자는, 부작용, 특히 심각한 부작용과 같이, 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료로부터 발생하는 역효과 또는 유해 사상에 기인하여 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료를 중단해야 하는 환자를 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 대한 부적절한 반응은, 환자를 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙으로 치료하는 경우, 종양 성장 지연의 부족 또는 불충분한 종양 성장 지연을 지칭한다. 의료 시술자는 소정 암 치료가 특정 환자의 경우에 성공적인지 또는 성공적이지 않은지 및 따라서 지속해야 하는지 또는 그렇지 않은지를 판단하는데 경험이 있기 때문에, 의료 시술자는 소정 환자가 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙 치료에 부적절한 반응을 나타냈는지를 측정하는데 곤란함이 없을 것이다. 예를 들면, 환자의 질환 부담 및 임상적 증상이 치료 개시 시점에서 가벼운 경우에 장기간의 안정한 질환은 양호한 임상적 상태로 간주될 수 있는 반면, 상기 질환 부담이 높고 임상 증상이 치료 개시 시점에서 현저한 경우, 안정한 질환은 부적절한 반응으로 간주될 수 있다.
용어 "특이적 결합 멤버"는 서로 특이적으로 결합하는 분자 쌍의 하나의 멤버를 기재한다. 특이적 결합 멤버는 자연적 또는 부분적 또는 완전 합성적으로 생산될 수 있다. 특이적 결합 멤버는 통상 항원-결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, 특이적 결합 멤버는 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편일 수 있다. 특이적 결합 멤버는 또한 항원에 특이적으로 결합하는 비-항체 단백질 스캐폴드, 예를 들면, 변형된 면역글로불린 유사 폴드, 예를 들면, 피브로넥틴 도메인(10Fn3 도메인)을 포함하는 분자일 수 있다. 표적 항원에 대한 항체 및 항체 단편을 수득하는 다양한 방법은 당해 기술분야에서 이용가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체일 수 있고, 이는 당해 기술분야의 통상의 숙련가에게 공지된 표준 방법에 따라 수득할 수 있다.
항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편은, 이로써 한정되지 않지만, Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어짐); F(ab')2 단편(2개의 결합된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편); 단일쇄 Fv 분자(scFc)(항원 결합 부위를 형성하기 위해 2개의 도메인을 연결시키는 펩티드 링커에 의해 결합된 VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어짐; Bird et al. [1988] Science, 242, 423-426; Houston et al. [1988] PNAS USA, 85, 5879-5883); 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965); Fv 단편(단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어짐); dAb 단편(VH 또는 VL 도메인으로 이루어짐; Ward et al. [1989] Nature 341, 544-546; McCafferty et al., [1990] Nature, 348, 552-554; Holt et al. [2003] Trends in Biotechnology 21, 484-490); Fd 단편(VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐); 디아바디(유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편; WO94/13804; Holliger et al. [1993a], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448); 및 항원-결합 Fc 단편을 포함한다.
항원-결합 Fc 단편은 Fc 단편의 불변 도메인, 예를 들면, CH2 또는 CH3 도메인의 하나 이상의 구조 루프 영역으로 작제된 항원-결합 부위를 포함한다. 항원-결합 Fc 단편의 제조는 국제공개공보 제WO 2006/072620호 및 제WO 2009/132876호에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 멤버는 당해 기술분야에서 FcabTM으로 또한 지칭되는 항원-결합 Fc 단편이거나 이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본원 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 멤버는 항원-결합 Fc 단편이다. 특이적 결합 멤버는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 항원-결합 Fc 단편이다. 가장 바람직하게는, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 IgG1 항원-결합 Fc 단편이다.
항원-결합 Fc 단편은 면역글로불린 분자 내로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 멤버는 Fc 영역에 항원-결합 부위를 포함하는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 분자일 수 있다. 이러한 분자는 바람직하게는 분자의 가변 영역에 제2 CDR-기반 결합 부위를 포함하고, 따라서 이중특이적이다. 특히, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 멤버는 Fc 영역에 항원-결합 부위를 포함하는 IgG1 분자일 수 있다.
본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 60 kD 이하, 보다 바람직하게는 55 kD 이하, 54 kD 이하 또는 53 kD 이하의 분자량(MW)을 갖는다. 본원에 개시된 특이적 결합 멤버 H561-4는 대략 53 kD의 MW를 갖는다. 특이적 결합 멤버 H561-4는 또한 FS102로서 공지되어 있다.
본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함하거나 함유한다. 대안적으로, 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12), NGQPE(서열번호 13) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유한다.
본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 아미노산 서열 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함한다. 특히, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 CH3 도메인의 AB 루프 내에 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12), 및 EF 루프 내에 아미노산 서열 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함한다. 바람직하게는, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함하고, 서열번호 12는 CH3 도메인의 AB 루프의 잔기 14-18에 위치하고, 서열번호 14는 CH3 도메인의 EF 루프의 잔기 92-98에 위치하고, 상기 잔기는 IMGT(ImMunoGeneTics) 넘버링 도식에 따라 넘버링된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함하고, 서열번호 12는 잔기 381-385에 위치하고, 서열번호 14는 CH3 도메인의 EF 루프의 잔기 440-450에 위치하고, 상기 잔기는 KABAT[참조: Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services, 및 이의 업데이트, 현재 인터넷 주소immuno.bme.nwu.edu에서 이용가능하거나 임의의 인터넷 검색 엔진을 사용하여 "Kabat"을 발견한다.]에 따라 넘버링된다.
본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 서열번호 11의 CH3 도메인을 포함한다. 특이적 결합 멤버는 서열번호 10의 CH2 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 서열번호 8의 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체이다. 예를 들면, 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 2개의 폴리펩티드에 의해 형성된 이량체, 예를 들면 각각의 폴리펩티드가 서열번호 8에 제시된 서열로 이루어진 2개 폴리펩티드로 이루어진 이량체일 수 있다(이러한 특이적 결합 멤버는 또한 본원에서 H561-4로서 지칭된다).
CH3 도메인 C-말단 리신(K) 또는 C-말단 리신 및 인접한 리신(GK) 잔기의 소실은 면역글로불린의 제조 동안 발생하는 것으로 이전에 보고되었다. 이러한 소위 "C-말단 클리핑"은 이들 마이크로변이체에 대한 기능적 의미를 갖지 않는 통상의 현상인 것으로 생각된다[참조: Beck et al. 2013]. C-말단 클리핑은 H561-4의 제조 동안 발생할 수 있는 것으로 예상된다. C-말단 클리핑에 제공될 수 있는 C-말단 리신 및 글리신 잔기를 포함하는 H561-4 CH3 도메인은 서열번호 11에 제시되어 있고, 또한, 예를 들면, 하기 수록되는 비공식 서열에 표시딘 바와 같이 서열번호 8에 존재한다.
따라서, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 서열번호 11의 CH3 도메인, 또는 1 또는 2개의 C-말단 잔기(예를 들면, C-말단 리신 또는 C-말단 리신 및 글리신 잔기)가 빠진 서열번호 11의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 서열, 또는 1 또는 2개의 C-말단 잔기(예를 들면, C-말단 리신 또는 리신 및 글리신 잔기)가 빠진 서열번호 8의 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 서열번호 8 및 11에 대한 임의의 참조는 C-말단 아미노산 잔기(예를 들면, C-말단 리신 또는 리신 및 글리신 잔기) 중의 1 또는 2개를 결실하는 이들 서열에도 적용되는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 지칭되는 CH3 도메인에 대한 참조는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산 잔기(예를 들면, C-말단 리신 또는 리신 및 글리신 잔기)를 결여하고 있는 CH3 도메인을 포함한다.
이러한 특이적 결합 멤버의 변이체는 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12), 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함하거나 함유할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 대안적으로, 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 HER2 항원 결합 부위는 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12), NGQPE(서열번호 13) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함한다. 변이체는 또한 서열번호 8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 변화는 통상 기능의 소실을 가져오지 않으며, 따라서 이렇게 변화된 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 멤버는 HER2에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들면, 이는 치환이 이루어지지 않은 특이적 결합 멤버와 동일한 친화성으로 HER2에 결합할 수 있다.
HER2에 대한 결합에 대해, 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 포함하는 특이적 결합 멤버, 또는 상기 기재된 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인의 하나 이상, 바람직하게는 2개의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 하나 이상, 바람직하게는 2개의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함한다. CH3 도메인 중의 구조 루프는 잔기 7-21(AB 루프), 25-39(BC 루프), 41-81(CD 루프), 83-85(DE 루프), 89-103(EF 루프) 및 106-117(FG 루프)에 위치하고, 여기서 상기 잔기는 IMGT(ImMunoGeneTics) 넘버링 도식(WO 2006/072620 A1)에 따라 넘버링된다. 보다 바람직하게는, 이러한 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역 AB 및 EF로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함한다. 특히, 이러한 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 잔기 14-18 및 92-98 내로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 잔기는 IMGT 넘버링 도식에 따라 넘버링된다. 잔기 14-18은 AB 루프에 위치하고, 잔기 92-98은 CH3 도메인의 EF 루프에 위치한다. 이러한 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 잔기 381-385 및 440-450 내로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 잔기는 KABAT에 따라 넘버링된다. 잔기 381-385는 AB 루프에 위치하고, 잔기 440-450은 CH3 도메인의 EF 루프에 위치한다. 대안적으로, 이러한 특이적 결합 멤버는 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역 AB, CD 및 EF 내로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고, 특이적 결합 멤버가 HER2에 대한 결합에 대해 경쟁하는 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)을 함유하는 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체이다.
동일한 표적, 이 경우에 HER2에 대한 결합에 대해 2개의 특이적 결합 멤버가 경쟁하는지를 측정하는 적합한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR), 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 면역세포화학을 사용하는 경쟁 방법을 포함한다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법은 BIAcore를 포함한다. 따라서, HER2에 대한 결합에 대해 제2 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버는, 표면 플라스몬 공명(SPR)(예: BIAcore), 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 면역세포화학을 사용하여 측정된 바와 같이 HER2에 대한 결합에 대해 제2 결합 멤버와 경쟁할 수 있다. 바람직하게는, HER2에 대한 결합에 대해 제2 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버는 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들면, BIAcore을 사용하여 측정된 바와 같이 HER2에 대한 결합에 대해 제2 결합 멤버와 경쟁한다. 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 트라스투주맙 및 페르투주맙은, HER2에 대한 결합에 대해, 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 이의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버 H561-4와 경쟁하지 않는다.
상기 수록된 경쟁 방법을 위해, HER2는 칩 표면(BIAcore) 상에, 플레이트(ELISA) 상에 고정되거나, 세포 표면(FACS 및 면역조직화학) 상에 표시된다. 이어서, 비교되는 2개 특이적 결합 멤버 중의 하나는 HER2 항원의 포화를 유도하는 시간 및 농도에서 고정된 HER2와 함께 항온처리하여, 이러한 특이적 결합 멤버가 결합하는 모든 HER2 에피토프를 차단한다. 이어서, 제2 특이적 결합 멤버는 고정된 HER2와 함께 항온처리한다. HER2에 대한 제2 특이적 결합 멤버의 결합은 특이적 결합 멤버가 HER2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 나타내는 반면, 제2 결합이 고정된 HER2에 결합하지 않는 경우, 이는 제2 특이적 결합 멤버가 HER2에 대한 결합에 대해 제1 특이적 결합 멤버와 경쟁하고 2개의 특이적 결합 멤버가 HER2 상의 동일한(또는 중첩) 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 결합 멤버는, 예를 들면, BIAcore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 H561-4의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 억제한다. 특정 실시형태에서, H561-4는, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 결합 멤버의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 억제한다. 특정 실시형태에서, 결합 멤버는 HER2에 대한 H561-4의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상 억제하고, H561-4는, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 결합 멤버의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 억제한다(즉, 경쟁은 두 방향이다).
특정 실시형태에서, 결합 멤버는 HER2에 대한 결합에 대해 H561-4와 경쟁하지만, 트라스투주맙 또는 페르투주맙과 경쟁하지 않는다. 특정 실시형태에서, 결합 멤버는, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 결합을 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이상 억제하지 않는다. 특정 실시형태에서, 트라스투주맙 또는 페르투주맙은, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 H561-4의 결합을 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하로 억제하지 않는다. 특정 실시형태에서, 결합 멤버는 HER2에 대한 H561-4의 결합을 억제하고/하거나 H561-4는 결합 멤버의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 억제하지만, HER2에 대한 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 결합을 억제하지 않고/않거나 트라스투주맙 또는 페르투주맙은, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 H561-4의 결합을 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하로 억제하지 않는다. 예를 들면, 결합 멤버는 HER2에 대한 H561-4의 결합을 억제하고/하거나 H561-4는 결합 멤버의 결합을 적어도 50% 억제하지만, HER2에 대한 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 결합을 억제하지 않고/않거나 트라스투주맙 또는 페르투주맙은, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이, HER2에 대한 H561-4의 결합을 50% 이상 억제하지 않는다. 또 다른 예에서, 결합 멤버는 HER2에 대한 H561-4의 결합을 억제하고/하거나 H561-4는 결합 멤버의 결합을 적어도 90% 억제하지만, HER2에 대한 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 결합을 억제하지 않고/않거나 트라스투주맙 또는 페르투주맙은, 예를 들면, Biacore, ELISA 또는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 HER2에 대한 H561-4의 결합을 10% 이상 억제하지 않는다.
본원에서 지칭되는 특이적 결합 멤버는 이량체성 HER2에 결합할 수 있다. 특이적 결합 멤버는 1nM의 친화성 또는 보다 높은 친화성으로 이량체성 HER2에 결합할 수 있다. 특이적 결합 멤버는 단량체성 HER2와 비교하여 이량체성 HER2에 우선적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체와 HER2 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 상기 에피토프는 배좌성, 즉 비선형 에피토프일 수 있다. 에피토프는 HER2의 도메인 1 및 3을 신장시킬 수 있다. 에피토프는 서열번호 15, 16 및 17을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 에피토프는 HER2 세포외 도메인의 아미노산 13 내지 27, 31 내지 45 및 420 내지 475를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 서열번호 15, 16 및 17, 또는 HER2 세포외 도메인의 아미노산 13 내지 27, 31 내지 45 및 420 내지 475 내에 위치할 수 있다. HER2 세포외 도메인의 서열은 서열번호 18에 제시되어 있다.
2개의 특이적 결합 멤버가 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 방법은 펩스칸, 수소/중수소 교환 질량 분광분석(HDX-MS) 및 X-선 결정학을 포함한다. 에피토프 맵핑 연구에서, 항원, 이 경우에 HER2는 작은 영역, 즉 펩티드 또는 도메인으로 분할되고, 이어서 특이적 결합 멤버에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 결합을 나타내는 영역은 특이적 결합 멤버에 의해 결합된 에피토프를 추론하기 위해 사용될 수 있다. 2개의 상이한 특이적 결합 멤버에 결합하는 영역의 비교는 에피토프를 비교하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이는 항원(여기서는 HER2)에서 이루어질 수 있고, 이어서 특이적 결합 멤버에 대한 결합을 시험할 수 있다. 결합의 소실을 유발하는 잔기 돌연변이는 특이적 결합 멤버에 의해 결합된 에피토프의 일부인 것을 표시된다. 그러나, 돌연변이는 HER2의 구조에서 일반적 소실을 유발하지 않도록 보장하는 것에 주의해야한다. X-선 결정학에서, 항원(여기서는 HER2) 및 특이적 결합 멤버는 복합체로서 결정화된다. 이어서, 결정 데이터를 사용하여 특이적 결합 멤버에 의해 결합된 에피토프를 측정한다. 이어서, 2개의 상이한 특이적 결합 멤버에 의해 결합된 HER2 에피토프를 비교할 수 있다.
HER2 유전자 카피 수를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, HER2 유전자 카피 수는 형광 제자리 하이브리드화(FISH), 색원성 제자리 하이브리드화(CISH) 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 측정할 수 있다. 선행 연구는 CISH 및 FISH에 의해 측정된 HER2 GCN이 선형 회귀 분석에 의해 제시된 바와 같이 고도로 상관되는 것을 보고했다[참조: Garcia-Caballero et al., 2010]. 추가의 연구는 2개 방법에 의해 측정된 HER2 증폭 상태가 또한 강력한 상관관계가 있음을 입증했다[참조: Arnould et al., 2012; Mollerup et al., 2012]. 따라서, CISH에 의해 측정된 HER2 GCN은 FISH에 의해 측정된 GCN과 유사한 것을 예상된다. 바람직하게는, HER2 유전자 카피 수는 FISH를 사용하여 측정된다. HER2 mRNA 수준을 측정하는 방법은 유사하게 당해 기술분야에 공지되어 있고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, HER2 mRNA 수준은 역전사 PCR(RT-PCR)에 이어서 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 측정할 수 있다. HER2 유전자의 과발현은 면역조직화학(IHC)에 의해 측정하여 세포 표면 상에서 발현된 HER2의 양을 측정할 수 있다.
FISH는 형광 현미경에 의해 조직 샘플 중의 특정 DNA 서열을 검출하기 위해 형광-태그 프로브를 사용한다. FISH는 HER2 서열과 하이브리드화하는 특이적 프로브를 사용하여 포르말린-고정된, 파라핀-매립된(FFPE) 암 조직 시료에서 HER2 유전자 증폭을 정량적으로 측정하기 위해 사용된다. HER2 GCN을 측정하기 위해 FISH를 수행하는 상이한 FDA 승인된 방법이 존재한다[참조: Press et al, 2002]. 한 가지 방법에서, HER2 및 염색체 17 둘 다는 샘플에서 종양 세포당 평균 HER2 GCN을 측정하기 위해 측정 및 비교한다. CEP17 프로브[염색체 17의 동원체 영역에서 알파 부수체(satellite) DNA 서열에 특이적인 직접 표지된 형광 DNA 프로브인 염색체 산출 (chromosome enumeration) 프로브]는 염색체 이수성에 대한 내부 대조군으로 이 시험에서 사용될 수 있다. HER2 유전자 및 CEP17은 상이한 형광체로 표지되고, 현미경을 위한 특정 필터를 사용하여 관측할 수 있다. HER2 유전자 증폭의 측정은 현미경에 의해 계수된 HER2 카피 대 CEP17 카피의 수 사이의 비율에 기반하고, 이에 의해 증가된 HER2 GCN의 공급원으로서 염색체 17의 이수성을 배제한다. 예를 들면, 상기 비율이 10 이상인 경우, 종양/암 세포당 평균 HER2 GCN은 10 이상이다. 따라서, 본원에서 지칭된 HER2, 또는 평균 HER2, 종양/암 세포당 유전자 카피 수는 염색체 이수성, 특히 염색체 17의 이수성에 기인하여 HER2 유전자 카피 수의 임의의 증가를 배제할 수 있다. 대안적으로, 바람직한 방법에서, 전체 HER2 유전자 카피 수는 CEP17 신호에 대해 정규화하지 않고서 HER2 신호를 직접 계수함으로써 측정할 수 있다. 이 방법은 전체 HER2 유전자 카피 수의 계수가 HER2/CEP17 비율의 변화를 가져올 수 있는 진정한 다염색체(전체 염색체의 중복)보다 더욱 통상적으로 관찰되는 염색체 17의 동원체주변 영역의 소실 또는 획득에 기인하는 거짓-양성 또는 거짓-음성 결과를 회피할 수 있기 때문에 바람직하다[참조: Wolff et al., 2013; Hanna et al., 2014]. 추가의 대안으로서, FISH는 HER2 유전자의 국지화를 위한 간접 방법으로서 FFPE 상의 단지 HER2 프로브만을 사용하여 수행할 수 있다[참조: Press et al, 2002].
특정 종양에 대해 FISH 및 qPCR에 의해 수득된 유전자 카피 수는 고도로 상관성인 것으로 밝혀졌다(실시예 9 참조). 따라서, 상이한 방법(예: FISH 및 qPCR)에 의해 수득된 GCN 값 사이의 전환이 가능하다.
또한, 환자에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 특이적 결합 멤버, 뿐만 아니라 HER2에 대한 결합에 대해 이러한 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버의 용도가 제공되고, 여기서 상기 암은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고/갖거나 상기 암은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는다.
본 발명은 추가로 환자에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버의 용도를 제공하고, 여기서 상기 암은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고/갖거나 상기 암은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
또한, 환자에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버의 용도가 제공되고, 여기서 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정되고/되거나, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 측정되고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
추가로, 환자에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버의 용도가 제공되고, 상기 치료는
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계 및
(ii) 상기 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함하고,
상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
또한, 환자에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버의 용도가 제공되고, 상기 치료는
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계 및
(ii) 상기 HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함하고,
상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 암은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고, 상기 방법은
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 종양 세포당 10 이상의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정되고, 상기 방법은
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
대안적으로, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계; 및
(ii) 상기 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 상기 특이적 결합 멤버를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 암은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖고, 상기 방법은
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버를 제공하고, 여기서 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플은 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖는 것으로 측정되고, 상기 방법은
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
대안적으로, 상기 방법은
(i) 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(ii) HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은
(i) 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(ii) HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 상기 특이적 결합 멤버를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 특이적 결합 멤버는
(a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버이다.
본원에 기재된 특이적 결합 멤버는 환자, 바람직하게는 인간 환자의 치료 방법에 사용되도록 설계된다. 특이적 결합 멤버는 통상적으로 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이고, 이는 특이적 결합 멤버 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재되고 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은, 활성 성분 이외에, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하고, 활성 성분의 효력을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존하고, 이는 주사, 예를 들면, 정맥내 또는 피하에 의한 것일 수 있다. 특이적 결합 멤버는 정맥내 또는 피하 투여될 수 있다.
액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성유 등의 액체 담체를 포함한다. 생리학적 염수 용액, 덱스트로즈 또는 기타 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들면, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 발병 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은, 병원체-비함유이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재한다. 관련 기술분야의 숙련가는, 예를 들면, 등장성 비히클, 예를 들면, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 링거 주사액을 사용하여 적합한 용액을 또한 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및/또는 기타 첨가제는 필요에 따라 사용할 수 있다. 약제학적 제형을 제조하는 다수의 방법은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다[참조: Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
본 발명에 따르는 접합체를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 치료되는 상태에 따라 동시에 또는 연속적으로 또는 또 다른 치료제 또는 치료제들과의 조합 제제로서 투여할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 멤버는 치료되는 질환을 위한 종래의 치료제와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 특이적 결합 멤버는 아비타테론 아세테이트(Zytiga), 아파티닙, 아플리베르셉트, 아나스트로졸, 베바시주맙, 비칼루타미드, BRAF 억제제, 카보플라틴, 카페시타빈, 세툭시맙, 시스플라틴, 크리조티닙, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 페길화된 리포좀 독소루비신, 엔잘루타미드(XTANDI), 에피루비신, 에리불린 메실레이트, 에를로티닙, 에토포사이드, 에베롤리무스, 에제메스탄, FOLFIRI, FOLFOX, 플루로락실, 5-플루오로우라실, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 젬시타빈, 고세렐린, 헷지호그 경로 억제제, 이레노테칸, 이자베필론, 라파티닙, 레트로졸, 류코보린, 류프로렐린, 메토트렉세이트, 미토크산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 알부민-결합 나노 입자 파클리탁셀, 파니투무맙, 페메트렉시드, 페르투주맙, 프레드니손, 라디움 R 22 디클로라이드(Xofigo Injection), 라무시루맙, 레고라페닙, S-1, 타목시펜, 토포테칸, 트라스투주맙 DM-1, 트리프토렐린 또는 비노렐빈과 조합하여 사용할 수 있다.
투여는 "치료학적 유효량"으로 존재할 수 있고, 이는 환자에 대해 이익을 나타내기에 충분하다. 이러한 이익은 적어도 하나의 증상의 적어도 개선일 수 있다. 따라서, 특정 질환의 "치료"는 적어도 하나의 증상의 개선을 지칭한다. 투여된 실제 양 및 투여 속도 및 시간-경과는 치료되는 것의 성질 및 중증도, 치료되는 특정 환자, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 조성물의 전달 부위, 접합체의 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의사에게 공지된 기타 인자에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들면, 용량 등의 결정은 일반 개업의 및 기타 의사의 책임하에 있고, 치료되는 질환의 증상 및/또는 진행의 중증도에 의존할 수 있다. 항체의 적절한 용량은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다[참조: Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; and Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922]. 투여되는 의약의 유형에 적절한 본원 또는 문헌[참조: the Physician's Desk Reference (2003)]에 지시된 특정한 용량을 사용할 수 있다. 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 이의 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교함으로써 측정할 수 있다. 마우스 및 기타 시험 동물 내지 인간에서 유효 용량을 외삽하는 방법이 공지되어 있다. 정확한 양은 치료되는 부분의 크기 및 위치 및 특이적 결합 멤버의 정확한 성질을 포함하는 다수의 인자에 의존할 것이다. 치료는 의사의 재량으로 매일, 1주 2회, 매주 또는 매달 간격으로 반복할 수 있다. 치료는 수술 전 및/또는 수술 후에 제공될 수 있고, 외과 치료의 해부학적 부위에 직접 투여되거나 적용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버에 감수성인 환자에서 암을 동정하는 방법을 제공하고, 여기서
상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 세포당 10 이상의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 유전자 카피 수는 암이 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타낸다.
치료에 감수성인 환자에서 암을 동정하는 방법은 (ii) HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 환자를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 대한 암의 반응을 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 세포당 10 이상의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수는 암이 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타내고, 종양 세포당 10 미만의 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수는 암이 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성이지 않은 것을 나타낸다.
치료에 대한 암의 반응을 예측하는 방법은
(ii) HER2 유전자 카피 수, 예를 들면, 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 암을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 환자에서 암을 동정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(i) 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 고도의 HER2 mRNA 수준은 암이 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타낸다.
치료에 감수성인 환자에서 암을 동정하는 방법은 (ii) 종양 샘플의 HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 환자를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
(b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 대한 암의 반응을 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 HER2 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 샘플 중의 고도의 HER2 mRNA 수준은 암이 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타낸다.
치료에 대한 암의 반응을 예측하는 방법은
(ii) 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준이 높은 경우, 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 암을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 HER2에 결합하는 특이적 결합 멤버를 제공하고, 여기서 상기 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체이다. 예를 들면, 특이적 결합 멤버는 서열번호 8의 2개 폴리펩티드에 의해 형성된 이량체, 예를 들면, 2개 폴리펩티드로 이루어진 이량체일 수 있고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 서열번호 8에 제시된 서열로 이루어진다(이러한 특이적 결합 멤버는 또한 본원에서 H561-4로서 지칭된다.)
또한, 본 발명의 특이적 결합 멤버를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본 발명의 특이적 결합 멤버 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 멤버를 코딩하는 핵산이 또한 제공된다. 바람직하게는, 상기 핵산은 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현을 위해 최적화되었지만, 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 특이적 결합 멤버를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 설계하는데 곤란함이 없을 것이다. 또한, 본 발명의 특이적 결합 멤버를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 본 발명의 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 재조합 숙주 세포를 특이적 결합 멤버의 생성을 위한 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 특이적 결합 멤버를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 특이적 결합 멤버를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 특이적 결합 멤버를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1은 동일한 영역에서 야생형 IgG1 아미노산 서열(WT)와 함께 항원-결합 Fc 단편 H561-4 아미노산 서열(H561-4)의 정렬을 나타낸다. 아미노산은 Kabat에 따라 넘버링된다 - Kabat 넘버링은 정렬된 서열 위에 제시되어 있다(주: Kabat 넘버링은 IgG1에서 293-294, 297-298, 315-316, 356,362, 380, 403-404, 409, 412-413, 429, 431-431를 갖지 않는다). AB 루프의 부분은 볼드체로 제시되어 있고, EF 루프의 부분은 볼드체 및 이중 하선으로 제시되어 있다.
도 2는 H561-4가 트라스투주맙 또는 페르투주맙보다 HER2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 입증한다. 도 2a는 BIAcore를 사용하여 트라스투주맙 및 H561-4의 에피토프 경쟁의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 나타낸다. HER2 ECD의 1000 RU로 코팅된 CM5 BIAcore 칩을 3분 동안 10㎍/ml의 트라스투주맙의 주입에 의해 트라스투주맙(TR)으로 포화시키고, 이어서 10㎍/ml의 트라스투주맙의 제2 주입은 HER2 칩이 제1 주입 후에 트라스투주맙으로 포화되었음을 나타낸다(흑색 점선). HER2 ECD의 1000 RU로 코팅된 CM5 BIAcore 칩을 3분 동안 10㎍/ml의 트라스투주맙의 주입에 의해 트라스투주맙으로 포화시키고, 이어서 H561-4(10㎍/ml) 및 트라스투주맙(10㎍/ml)의 혼합물의 제2 주입은, HER2 칩이 트라스투주맙으로 포화되는 경우, H561-4가 여전히 결합할 수 있음을 나타낸다(흑색 실선). HER2 ECD의 1000 RU로 코딩된 CM5 BIAcore 칩을 3분 동안 10㎍/ml의 H561-4의 주입에 의해 H561-4로 포화시키고, 이어서 H561-4(10㎍/ml)의 제2 주입은 HER2 칩이 제1 주입 후에 H561-4로 포화되었음을 나타낸다(흑색 점선). HER2 ECD의 1000RU로 코팅된 CM5 BIAcore 칩을 3분 동안 10㎍/ml의 H561-4의 주입에 의해 H561-4로 포화시키고, 이어서 트라스투주맙(10㎍/ml) 및 H561-4(10㎍/ml)의 혼합물의 제2 주입은, HER2 칩이 H561-4로 포화되는 경우, 트라스투주맙이 여전히 결합할 수 있음을 나타낸다(넓은 흑색 점선). 도 2b는 Octet를 사용하는 페르투주맙(PE) 및 H561-4의 에피토프 경쟁의 SPR 분석을 나타낸다. 스트렙트아비딘 코팅된 팁은 30분 동안 비오트-HER2에서 항온처리하여 부하하고, 이어서 완충제에서 1분 동안 세척했다. HER2는 30분 동안 325nM 페르투주맙의 항온처리에 의해 페르투주맙으로 포화시키고, 이어서 325nM에서 페르투주맙의 제2 항온처리는 HER2 코팅된 팁이 제1 항온처리 후 페르투주맙으로 포화되었음을 나타낸다(회색선). 스트렙트아비딘 코팅된 팁은 30분 동안 비오트-HER2에서 항온처리하여 부하하고, 이어서 완충제에서 1분 동안 세척했다. HER2는 30분 동안 325nM 페르투주맙의 항온처리에 의해 페르투주맙으로 포화시키고, 이어서 325nM의 H561-4 및 325nM의 페르투주맙의 제2 항온처리는 페르투주맙으로 포화된 HER2 코팅된 팁이 여전히 H561-4에 결합할 수 있음을 나타낸다(흑색선). 도 2C는 HER2의 세포외 도메인 상의 H561-4의 예측된 결합 영역(도메인 1 및 3으로 연장하는 흑색 표지)을 나타낸다. H561-4의 결합 에피토프는 펩스탄 CLIPS(Chemical Linkage of Peptides onto Scaffolds) 기술을 사용하여 예측했다. HER2 도메인은 로마 숫자로 표시되어 있다. 도 2c 중의 표는 결합 포켓으로부터 신장하는 도메인 1 및 3과 함께 H561-4의 결합 에피토프 각각에 대한 예측된 선형 서열을 나타낸다.
도 3은 H561-4가 아폽토시스를 유도하고 HER2 내재화 및 열화를 유도하는 것을 입증한다. 도 3a는 SKBr3 세포의 H561-4 처리가 세포의 전체 수 및 생존 세포의 비율의 감소를 유발했음을 나타낸다. PI 및 아넥신 V 염색은 H561-4 처리 후 후기 아폽토시스 및 괴사 세포의 증가를 나타냈다. 도 3b는 SKBr3 세포의 H561-4 처리가 전체 HER2 및 포스포릴화 HER2의 감소를 유발했음을 나타낸다. 도 3c는 SKBr3 세포의 H561-4 처리가 세포 표면 HER2 및 전체 HER2의 감소를 유발했음을 나타낸다. Her2에서 이러한 감소는 트라스투주맙으로 처리한 SKBr3 세포, 야생형(WT) 항원-결합 Fc 단편(서열번호 19) 또는 IgG1 대조군(IgG) 또는 무처리 세포에서 관찰되지 않았다. 도 3d는 카스파제 3/7 활성이 SKBr3 세포의 H561-4 처리에 의해 유도되지만, 트라스투주맙을 사용한 SKBr3 세포, 야생형 항원-결합 Fc 단편 또는/및 IgG1 대조군(ctrl)의 H561-4 처리에 의해 유도되지 않음을 나타낸다.
도 4는 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 H561-4 처리 인간 환자 유래된 종양 이종이식편(PDX) 모델의 유효성을 입증한다. 도 4a는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 15개 카피)를 갖는 위 종양(GXF281)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4b는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 25개 카피)를 갖는 위 종양(GXA3039)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4c는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 32개 카피)를 갖는 결장직장 종양(CXF1991)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4d는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 35개 카피)를 갖는 결장직장 종양(CSF2102)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4e는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 76개 카피)를 갖는 위 종양(GXA3054)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4f는 고도의 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 29개 카피)를 갖는 위 종양(GXA3038)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4g는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 23개 카피)를 갖는 유방 종양(HBCx-13B)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4h는 고도의 HER2 유전자 카피 수(HER2 GCN = 세포당 43개 카피)를 갖는 위 종양(GA0060)으로부터 생체내 종양 반응 데이터를 나타낸다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 도 4a 내지 h에서 에러 바는 평균의 표준 오차(SEM)을 나타낸다.
도 5는 H561-4가 GXF281 위 PDX 모델(세포당 HER2 GCN =25)에서 트라스투주맙 + 페르투주맙(TR+PE) 내성을 극복했음을 나타낸다. 마우스를 범례에 수록된 화합물로 정맥내(i.v.) 처리했다("/"는 제2 사이클의 것들로부터 제1 처리 사이클의 투여 화합물을 분리한다). 화살표는 투여 스케쥴을 나타낸다. 이식된 종양이 100mm3의 평균 용적에 도달한 후, 이들은 TR+PE 병용 요법의 1주 4회 용량(또는 대조군으로서 H561-4의 1주 4회 용량)으로 처리했다. TR+PE 병용 요법은 보다 느린 속도이기는 하지만 성장을 계속했다. 33일 간격은 제2 투여 사이클 전에 이들 항체의 클리어런스를 가능하게 하기 위해 실시했다. 간격 후, 평균 종양 용적이 500mm3 초과에 도달한 경우, 마우스는 TR+PE 또는 H561-4로 매주 재투여했다. 에러 바는 평균의 표준 오차(SEM)을 나타낸다.
도 6은, 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여, 10 이상의 HER2 유전자 카피 수(GCN)를 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. P 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용한 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
도 7은, 200 미만의 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델과 비교하여, 200 이상의 HER2 mRNA 수준(mRNA)을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. P 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용한 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
도 8은, 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여, 10 초과의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. T/C 값은 업데이트 T/C 방정식을 사용하여 계산했다. P 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
도 9는, 200 미만의 HER2 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델과 비교하여, 200 이상의 HER2 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. T/C 값은 업데이트 T/C 방정식을 사용하여 계산했다. T 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
도 10은, 18 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여, FISH에 의해 측정된 18 초과의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. P 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
도 11은 각각의 17 PDX 종양 모델에서 FISH 및 qPCR에 의해 측정된 유전자 카피 수의 산포도를 나타낸다. 2개 방법으로 측정된 GCN은 상관 분석에 기반하여 고도로 상관된다(피어슨 r = 0.90; p < 0.0001; 95% CI = 0.74-0.96).
도 12는, HER2 단백질 과발현 음성을 갖는 PDX 모델과 비교하여, HER2 단백질 과발현 양성을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. P 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비대응 T-시험에 의해 계산했다.
본 발명의 추가의 양태 및 실시형태는 하기 실험적 예시를 포함하는 본 개시를 제공함으로써 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
용어 "및/또는"은, 본원에 사용되는 경우, 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개 특정한 특징 또는 성분의 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 예를 들면, "A 및/또는 B"는, 각각이 본원에서 개별적으로 기재되어 있는 바와 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 기재된 특징의 기재 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 국면 또는 실시형태로 한정되지 않고, 기재되어 있는 모든 국면 및 실시형태에 동등하게 적용된다.
본 발명의 특정 국면 및 실시형태는 이제 상기 기재된 도면을 참조로 하여 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
실시예 1 - H561-4는 트라스투주맙 또는 페르투주맙보다 HER2 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여, HER2에 대한 결합에 대해, H561-4가 공지된 항-HER2 항체, 트라스투주맙 및 페르투주맙과 경쟁하는지를 측정했다.
트라스투주맙과의 경쟁
BIAcore 3000(GE Healthcare)을 사용하여, H561-4가 트라스투주맙(TR)으로 포화된 인간 HER2 코팅된 칩에 결합하는지 및 그 반대인지를 측정했다. CM5 칩은 표준 아민 커플링을 사용하여 인간 HER2(BenderMed Systems)의 세포외 도메인(ECD)의 1000 RU로 코팅하고, 실험은 HBS-P 완충제(GE Healthcare) 중의 20㎕/분의 유속을 사용하여 수행하고, HER2 표면은 4M MgCl2를 사용하여 재생했다. 제1 HER2 결합 화합물(H561-4 또는 트라스투주맙)은 3분 동안 10㎍/ml로 주입하고, 이어서 제2 HER2 결합 화합물(트라스투주맙 또는 H561-4)는 3분 동안 주입하고(제2 주입은 제2 주입 동안 화합물 1의 해리를 배제하기 위해 10㎍/ml의 제1 화합물의 존재하에 수행했다), 이어서 완충제에서 해리시켰다(도 2a). 주입 1 및 2가 동일한 화합물인 경우(트라스투주맙, 이어서 트라스투주맙 또는 H561-4, 이어서 H561-4), 제2 주입에서 결합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았고, 이는 HER2 결합 표면이 두 경우에 포화되었음을 나타낸다. 하기 표 1은 상이한 주입의 조합물로 관찰된 반응(RU)을 나타낸다:
주입 1 반응 ( RU ) 주입 2 추가 반응 ( RU )
트라스투주맙 794 트라스투주맙 20
트라스투주맙 771 H561-4 (+트라스투누맙) 246
H561-4 254 H561-4 0
H561-4 253 트라스투주맙 (H561-4) 746
표 1은 트라스투주맙(246RU)으로 포화된 HER2 칩 상의 H561-4의 결합 반응이 네이키드 HER2 표면(253-254RU) 상의 H561-4 결합의 것과 유사함을 나타내고, 이는 H561-4가 HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁하지 않음을 나타낸다. 동일한 결과는, H561-4 포화된 표면(746RU) 상의 트라스투주맙의 결합 반응이 네이키드 HER2 표면(771-794RU)에 결합할 때의 반응과 유사하다는 점에서, 주입 시리즈가 역전된 경우에 관찰되었다.
페르투주맙과의 경쟁
Octet(ForteBio)를 사용하여, H561-4가 페르투주맙(PE)으로 포화된 인간 HER2 코팅된 팁에 결합할 수 있는지 및 그 반대인지를 측정했다. 모든 단계는 동력학 완충제(ForteBio)에서 1000rpm으로 수행했다. 스트렙트아비딘 코팅된 팁(ForteBio)은 30분 동안 50㎍/ml biot-HER2에서 항온처리에 의해 코팅하고, 이어서 팁은 1분 동안 완충제에서 세척한 다음, 30분 동안 325nM 페르투주맙에서 항온처리하여 모든 페르투주맙 결합 부위를 포화시킨 다음, 즉시 H561-4(325nM) 및 페르투주맙(325nM)의 혼합물로 이동시키고, 30분 동안 항온처리한 다음, 10분 동안 완충제에서 해리시켰다. 모든 페르투주맙 결합 부위가 점유되는 것을 보장하는 대조군으로서, 신선한 팁을 사용하여, 제1 단계에서 페르투주맙(325nM) 및 제2 단계에서만 페르투주맙(325nM)을 사용하여 실험을 반복했다(도 2b). 두 단계가 페르투주맙인 경우, 추가의 결합은 제2 단계에서 거의 또는 전혀 관찰되지 않았고, 이는 HER2 결합 표면이 페르투주맙으로 포화되었음을 나타낸다. 하기 표 2는 주입의 상이한 조합물로 관찰된 반응(RU)을 나타낸다:
항온처리 1 반응 ( RU ) 항온처리 2 추가 반응 ( RU )
페르투주맙 1.15 페르투주맙 0.04
페르투주맙 1.01 H561-4 (+페르투주맙) 0.41
표 2는 페르투주맙(0.41RU)으로 포화된 HER2 칩 상의 H561-4의 결합 반응이 페르투주맙(0.04RU)의 추가의 결합 반응보다 현저히 더 크다는 것을 나타내고, 이는 H561-4가 HER2에 대한 결합에 대해 페르투주맙과 경쟁하지 않음을 나타낸다.
실시예 2 - HER2에 대한 H561-4의 결합 조사
단량체성 대 이량체성 HER2에 대한 H561-4 결합의 비교
H561-4는 단량체성 HER2와 비교하여 이량체성 HER2에 우선적으로 결합하는 것이 밝혀졌다. ELISA 기반 및 SPR 기반 방법을 사용하여 단량체성 HER2(태그 부재하에 HER2의 세포외 도메인[ECD]) 대 이량체성 HER2(Fc 태그 존재하에 HER2의 ECD, R&D biological)에 대한 H561-4의 결합을 비교했다. ELISA 포맷에서, HER2는 플레이트 표면 상으로 코팅되고 따라서 고정된 HER2인 반면, BIAcore 실험에서 H561-4는 포획되고 HER2는 분석물로서 주입되고 따라서 가용성 HER2이었다.
단량체 HER2 및 이량체 HER2에 대한 H561-4 결합의 ELISA 기반 비교
단량체 HER2(태그되지 않은 HER2 ECD) 및 이량체 HER2(HER2 ECD Fc-태그)는 4℃에서 밤새 PBS 중의 96-웰 맥시소프(maxisorp) 플레이트(Nunc) 상에서 2㎍/ml로 고정시켰다. 플레이트를 PBS 중의 200㎕의 5% BSA로 1시간 동안 차단시켰다. H561-4 및 트라스투주맙(Roche)은 제조업자의 지침에 따라 이노바 바이오사이언스 비오티닐화 키트(%704-0010)을 사용하여 비오티닐화시켰다. 희석 계열의 비오티닐화 H561-4 또는 비오티닐화 트라스투주맙은 5% BSA에서 제조했다. 차단 용액을 제거하고, 100㎕의 희석 계열의 H561-4 및 트라스투주맙을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 희석 계열을 제거하고, 플레이트를 트윈 20(PBST)와 함께 인산염 완충 염수로 3회 세척했다.
Strep-HRP(Abcam ab)의 1:5000 희석물은 5% BSA에서 제조하고, 100㎕를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 이어서, 플레이트를 PBST로 3회 세척한 다음, 100㎕의 TMB(Roche)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2분 동안 항온처리했다. 반응은 100㎕의 2M H2SO4를 사용하여 중지시키고, 플레이트를 450nM에서 판독했다.
트라스투주맙 대조군은 단량체 및 이량체 HER2에 대해 동일한 절반 최대 유효 농도(EC50)(1.3 내지 1.5nM)를 갖는 반면, H561-4는 각각 1.7nM 및 20.6nM의 EC50 값으로 제시된 바와 같이, 단량체 HER2와 비교하여 이량체 HER2에 대해 10배 선호도를 가졌다. EC50은 기준선과 특정 노출 시간 후의 최대치 사이의 반응 절반을 유도하는 결합 멤버의 농도를 지칭한다.
단량체 HER2 및 이량체 HER2에 대한 H561-4의 BIAcore 기반 비교
가용성 HER2에 대한 결합을 가능하게 한 배향으로 H561-4를 포획하기 위해, 항-EGFR-H561-4 mAb2(EGFR/H561-4)를 사용했다. 이 분자는 CH3 도메인에서 H561-4의 결합 루프를 함유하도록 변형된 Fc 영역을 갖는 항-EGFR 항체이다. 이어서, 이 EGFR/HER2 이중특이적 분자는, Fab 아암으로 존재하는, EGFR 결합 특이성에 의해 EGFR 코팅된 BIAcore 칩 상에 포획되고, 이에 의해 분석물에 노출된 HER2 결합 CH3 도메인을 잔류시켰다. 항-HER2 mAb 트라스투주맙과의 비교를 가능하게 하기 위해, 유사한 이중특이적 분자, 트라스투주맙-EGFR 항원-결합 Fc 단편(TR/EGFR)을 작제했다. 이 이중특이적 분자는 CH3 도메인에서 항-EGFR 항원-결합 Fc 단편의 결합 루프를 함유하도록 변형된 Fc 영역과 함께 항-HER2 mAb 트라스투주맙을 포함한다. EGFR mAb 및 EGFR 항원-결합 Fc 단편 둘 다는 EGFR에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는다(1nM). TR/EGFR을 EGFR 항원-결합 Fc 단편 Fc 영역에 의해 EGFR 칩 상에 포획시켜, 분석물에 노출된 Fab 아암에서 HER2 결합 특이성을 잔류시켰다.
BIAcore 스트렙트아비딘 칩을 1000RU의 biot-EGFR로 고정시켰다. 실험은 HBS-P 완충제(GE Healthcare)에서 20㎕/분의 유속을 사용하여 수행했다. EGFR/HER2 이중특이적 분자는 60㎕의 100mM mAB2를 주입하여 포획하고, EGFR 표면은 50mM NaOH를 사용하여 재생시켰다. 희석 계열의 단량체(비태그된 HER2 ECD, 가정) 및 이량체(Fc-태그된 HER2 ECD, R&D)를 분석물로서 주입했다. 데이터는 랑뮈어(Languir) 1:1 결합 모델을 사용하여 적합시켰다.
하기 표 3은 데이터의 1:1 적합에 의해 수득된 KD 값을 나타낸다. H561-4는 1000nM 이하의 농도에서도 가용성 단량체 HER2에 대해 약한 결합만을 나타내는 반면, 이량체 HER2에 대한 친화성은 1nM이다. 트라스투주맙은 1nM의 친화성으로 단량체 HER2에 결합하고 서브-nM 친화성으로 이량체 HER2에 결합한다.
K D 단량체성 HER2 K D 이량체성 HER2
H561-4 >1 μM 1 nM
트라스투주맙 1 nM 서브 nM (BIAcore 2000을 사용하여 적합시킬 수 있는 범위 외의 오프 속도)
Pepscan을 사용한 HER2 상의 H561-4 에피토프의 예측
CLIPS 기술(Pepscan)을 사용하여, H561-4는 세포외 HER2의 2개 도메인 사이에서 결합시키기 위해 측정했다. 이들 도메인은, 도메인 1의 아미노산 13 내지 27(LPASPETHLDMLRHL) 및 아미노산 31 내지 45(CQVVQGNLELTYLPT)에 대해 맵핑된 결합 에피토프를 갖는 HER2의 도메인 1 및 3이었다. 도메인 3은 아미노산 420 내지 475(SLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTA)의 보다 큰 결합 부위를 가졌다. 선형 형성에서, 이들 3개의 상이한 에피토프는 랜덤으로 보이지만, 입체배좌 형식으로 관찰하는 경우, 이들 2개의 도메인으로 연장하는 별개의 결합 포켓이 나타났다(도 2c).
선형 및 CLIPS(Chemical LInkage of Peptides onto Scaffolds) 펩티드는 표준 FMOC-화학을 사용하여 세포외 HER2의 아미노산 서열에 기반하여 합성했고, 스캐빈저에서 트리플루오르산을 사용하여 탈보호시켰다. 구속된 펩티드는 CLIPS 기술[참조: Timmerman et al., 2007, Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPSTM technology. J MoL Recognit. 20:283-99]을 사용하여 입체배좌 에피토프를 재구성하기 위해 화학적 스캐폴드 상에서 합성했다. 펩티드 중의 다중 시스테인의 측쇄는 크레디트-카드 형식 폴리프로필렌 PEPSCAN 카드(455 펩티드 형식/카드) 상에서 중탄산암모늄(20mM, pH 7.9)/아세토니트릴(1:1[v/v]) 중의 CLIPS 주형(1,3-비스(브로모메틸) 벤젠)의 0.5mM 용액과 반응시켜 CLIPS 주형에 커플링시켰다. 카드는 30 내지 60분 동안 용액에서 온화하게 진탕시키면서, 용액에서 완전히 피복했다. 마지막으로, 카드를 과량의 H2O로 철저하게 세척하고, 30분 동안 70℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 차단-완충제에서 초음파 처리하고, 이어서 추가로 45분 동안 H2O에서 초음파 처리했다. 각 펩티드에 대한 항체의 결합은 PEPSCAN-기반 ELISA에서 시험했다. 공유 결합된 펩티드를 함유하는 455-웰 크레디트 카드 형식 폴리프로필렌 카드는, 예를 들면, 차단 용액에서 희석시킨 1㎍/mL로 이루어진 일차 항체 용액, 5% 말 혈청, PBS/1% 트윈 80 중의 5% 난알부민(w/v)과 함께 항온처리했다.
세척 후, 펩티드는 25℃에서 1시간 동안 항체 퍼옥시다제 접합체의 1:1000 희석으로 항온처리했다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 2㎕의 3% 11202를 첨가했다. 1시간 후, 발색을 측정했다. 발색은 전하 커플링된 장치(CCD)-카메라 및 화상 처리 시스템으로 정량화했다(문헌[참조: Slootstra et al., 1996, Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity, 1, 87-96]에 최초로 기재된 바와 같음).
따라서, 생 데이터는 CCD-카메라에 의해 수득된 광학 값이었다. 상기 값은 대부분 0 내지 3000 범위, 표준 96-웰 플레이트 ELISA-판독기의 1 내지 3과 유사한 로그 스케일 범위이다. 이 실험에서, 수득된 값은 0 내지 380 범위였다.
CCD-카메라는 퍼옥시다제 착색 전에 카드의 화상을 먼저 찍고, 이어서 퍼옥시다제 착색 후에 또 다른 화상을 찍었다. 이들 2개의 화상은 서로 감산하고, 이는 생-데이터를 제공했다. 이는 Peplabtm 데이터베이스에 카피했다. 이어서, 상기 값을 엑셀로 카피하고, 이 파일은 생-데이터 파일로서 표지했다. 하나의 후속 조작을 허가했다. 종종, 웰은 거짓-양성 값을 제공하는 공기-버블을 함유하고, 카드는 수동으로 검사하고, 공기-버블에 의해 유발된 임의의 값은 0으로 스코어링했다. 양성 값은 결합 신호(에피토프 맵)로 취하고, HER2의 서열로 맵핑했다. 세포외 HER2 단백질의 컴퓨터 생성 숫자를 생성하고, 양성 결합 신호를 맵핑하고, 이는 항원-결합 Fc 단편 결합의 부분을 나타낸다(도 2c).
실시예 3 - H561-4는 아폽토시스를 유도하고, 독특한 및 심원한 HER2 내재화 및 분해를 유도한다
HER2 과발현 유방암 세포주 SKBr3는 H561-4의 작용 메카니즘을 측정하기 위해 모델 시스템으로 사용했다. SKBr3 세포주는 ATCC(HTB-30)으로부터 수득했고, 10% 태소 혈청(FBS)을 함유하는 맥코이(McCoy) 5a + GlutaMAX 배지(Invitrogen)에서 항온처리했다. 트라스투주맙(Roche)은 작용 연구의 모든 메카니즘에서 대조군으로 사용했다.
H561-4는 SKBr3 세포에서 항-증식 활성을 갖고, 아폽토시스를 유도한다.
SKBr3 세포는 96 웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 7.5×103 세포로 파종하고, 웰당 100㎕로 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리했다. 다음날, 처리제(H561-4 또는 트라스투주맙)을 함유하는 20㎕ 배지를 첨가하여 H561-4 또는 트라스투주맙의 농도 희석 계열을 수득했다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 처리제와 함께 항온처리했다. 이어서, 세포는 아넥신 V 결합 완충제(12.5 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.4) 중의 1㎍/ml 최종 훽스트 염색(Sigma Aldrich, H6024), 2.5㎍/ml 프로피디움 요오다이드(PI) 및 1:100 Alexa-488 아넥신 V(Invitrogen, V13245)의 혼합물로 염색시키고, 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리했다. 이어서, 세포는 ImageXpress Micro(Molecular Devices) 상에서 판독했다. 각 웰 중의 세포 수는 4배 배율로 훽스트 염색을 사용하여 계수했다. 아넥신 V 및 PI 염색을 사용하여 40배 배율로 생존 세포(세포는 PI로 염색되지 않음), 초기 아폽토시스 세포(세포는 아넥신 V 단독으로 염색됨), 후기 아폽토시스 세포(세포는 아넥신 V 및 PI로 염색됨) 및 괴사 세포(세포는 PI 단독으로 염색됨)의 비율을 측정했다. 시험된 최고 농도(300nM)에서, H561-4는 트라스투주맙에 의한 22% 감소와 비교하여 세포의 37% 감소를 유발했다. 또한, 나머지 H561-4 처리된 세포 중에서 단지 43%만이 트라스투주맙의 경우의 79%와 비교하여 생존가능했다. 전체 세포 및 생존 세포의 이러한 감소는 H561-4 처리된 세포 단독에 있어서 후기 아폽토시스 및 괴사 세포(각각 18% 및 35%)의 증가와 연관되었다. 이 실험의 결과는 도 3A에 제시되어 있다.
H561-4는 HER2의 내재화 및 분해를 유발한다.
SKBr3 세포는 6 웰 플레이트에서 3ml/웰로 3.3×105 세포/ml로 파종하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리했다. 다음 날, 배지를 0.1% FBS를 함유하는 배지로 변경하고, 적어도 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리한 다음, 배지를 제거하고, 0.1% FBS 및 200nM의 처리제(H561-4 또는 트라스투주맙)을 함유하는 배지로 대체했다. 세포는 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리했다. 이어서, 용해물을 아이스 상에서 수집하고: 배지를 제거하고, 250㎕의 용해 완충제(10mM 트리스 pH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1:100 프로테아제 칵테일[Calbiochem, 539131], 1:100 포스파타제 칵테일[Calbiochem, 524625])을 첨가했다. 이어서, 세포를 웰 표면으로부터 긁어내고, 250㎕를 15분 동안 아이스 상에서 항온처리하고, 15분 동안 4℃에서 14,000rpm으로 원심분리하고, 상청액을 분석용으로 수집했다. 샘플은 β-머캅토에탄올을 함유하는 NuPAGE 부하 완충제와 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 항온처리한 다음, 사용할 때까지 -20℃에서 저장했다. 20㎕의 샘플을 4-12% 비스-트리스 SDS PAGE 상에서 작동시키고, 니트로셀롤로즈 막으로 이동시키고, 막을 5% Marvel/TBST로 차단시킨 다음, HER2(Cell signalling, #2248), 포스포르-HER2(세포 신호전달, #2243) 또는 부하 대조군으로서 α-β-액틴(Sigma A1978)에 대해 조사했다. 이어서, 막을 세척하고, HRP(항-마우스, Jackson ImmunoResearch, 또는 항-래빗 Jackson ImmunoResearch)에 접합된 적절한 이차 항체를 첨가했다. 막은 ECL 시약(GE Heatthcare, RPN2105)를 사용하여 발색시키고, 화상화했다. H561-4 처리는 48시간 및 72시간에서 완전 감소와 함께 24시간에서 전체 HER2의 감소를 유발했다(도 3b). 대조적으로, 트라스투주맙 처리는 조사된 시점에서 HER2 수준을 검출가능하게 감소시키지 않았다(도 3b). H561-4 처리는 또한 pHER2의 동시 감소를 유발했다. 이러한 감소는 48시간에서 추가의 감소 및 72시간에서 잔류하는 검출가능한 pHER2 없이 24시간에서 입증되었다. 트라스투주맙 처리는 단지 72시간 시점에서 pHER2의 약간의 감소를 유발했다(도 3b).
이어서, 면역형광 화상화를 사용하여 HER2의 분해를 정량화했다. SKBr3 세포는 1×104 세포/웰로 96-웰에 파종하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리했다. 다음 날, 처리제(H561-4, 트라스투주맙[TR]) 또는 대조군(야생형[WT] 항원-결합 Fc 단편; 또는 IgG1 이소형 대조군, Sigma I5154[IgG/IgG1 ctrl])을 배지에 첨가하여 200nM의 최종 농도를 수득했다.
세포는 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 다음, 20분 동안 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 세포 표면 화상화를 위해, 세포의 절반은 전체 단백질 화상화를 위해 PBS 중의 0.1% 트리톤 X100/글루코즈 0.1mg/ml에서 침투되었다. 이어서, 세포를 세척하고 1시간 동안 실온에서 5% FBS/PBS에서 차단시킨 다음, PBS에서 1:100으로 희석시킨 일차 항체(마우스 항-Her2 MGR2, Enzo Life Sciences)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 이어서 1시간 동안 실온에서 암 상태로 5㎍/ml의 이차 항체(항-마우스 alexa647, Invitrogen A21237) 및 1㎍/ml의 훽스트(Invitrogen, 33342)와 함께 항온처리했다. 이어서, 세포를 세척하고, 이들을 ImageXpress 마이크로(Molecular Devices) 상에서 판독할 때까지 PBS 중의 0.05% NaN3에서 저장했다. 분석은 40배율 화상화로 수행했고, 다조파 스코어링 함수를 사용하여 HER2 양성 염색을 갖는 세포 핵 및 세포 수를 계수한 다음, HER2 양성 세포의 백분율을 계산했다.
200nM에서 SKBr3 세포의 H561-4 처리는 세포 표면 및 전체 HER2 둘 다의 감소를 제공했다. HER2 수준의 감소는 증가된 시점(48시간 및 72시간)에서 증가된 24시간 처리 후에 검출가능했다(도 3c). 대조군 항체, 트라스투주맙을 사용한 처리는 HER2 수준에서 검출가능한 감소를 제공하지 않았다(도 3c).
H561-4 처리는 카스파제-의존성 아폽토시스를 유발한다.
SKBr3 세포는 웰 100㎕로 96 웰 플레이트에서 7.5×104 세포/ml로 파종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 항온처리했다. 다음 날, 처리제(H561-4, 트라스투주맙, 야생형(WT) 항원-결합 Fc 단편 또는 IgG1 이소형 대조군)을 배지 중의 웰에 첨가하여 1000nM, 100nM, 10nM, 1nM, 0.1nM 및 0.01nM의 최종 농도 + 무처리 대조군을 수득했다. 세포는 5일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리한 다음, 프로메가 카스파제-Glo 3/7 검정을 사용하여 측정했다. 50㎕의 카스파제 3/7 글로 시약을 각 웰에 첨가하고, 이어서 혼합하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리한 다음, 발광은 시너지 4 마이크로플레이트 판독기(BIOTEK)를 사용하여 측정했다.
SKBr3 세포의 H561-4 처리는 카스파제 3/7 활성의 현저한 용량 의존적 유도를 제공했고(도 3d), 대조군 항체, 트라스투주맙을 사용한 처리 뿐만 아니라 WT 항원-결합 Fc 단편 또는 IgG1 이소형 대조군을 사용한 처리도 카스파제 3/7 활성의 검출가능한 증가를 제공하지 않았다.
요약하면, 상기 결과는 SKBr3 세포의 H561-4 처리가 아폽토시스를 유도했고 HER2의 내재화 및 분해를 제공했음을 입증한다.
실시예 4 - 생체내 유효성 연구: 인간 환자의 H561-4 처리는 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 종양 이종이식편(PDX) 모델을 유도했다.
10 이상의 유전자 카피 수를 갖는 HER2를 발현하는 종양 모델에서 H561-4의 생체내 유효성은 인간 환자 유래된 이종이식편 종양을 포함하는 마우스를 사용하여 평가했다. 면역결핍 마우스는 인간 종양의 이종이식 및 성장을 가능하게 하도록 사용했다. 마우스는, 마우스에 대략 6 내지 8주에서 이식된 GA0060 PDX 모델로부터 격리된 대략 5 내지 7주령에서 종양을 이식했다. GA0060 작업은 다른 PDX 모델에 사용된 임상 연구 조직에 약간 상이한 실험 절차를 사용하는 크라운 바이오사이언스(Crown BioScience)에 의해 수행했다. 크라운 바이오사이언스 실험 절차에서의 임의의 차이는 하기에 특정되어 있다. 모든 실험은 지방 당국에 의해 승인되었고, 모든 적용가능한 국내, 국제 및 지역 법률 및 가이드라인에 따라 수행했다. 허용가능한 건강을 갖는 동물만을 선택하여 시험 절차에 들어갔다. 마우스는 도착후 및 임의의 실험 개시 전에 적어도 7일의 순화 기간을 허가했다. 이 연구에서 시험 종양으로 사용된 종양 이종이식편은 누드 마우스에 직접 피하 이식된 환자로부터 수술 시료, 따라서 지정 "환자 유래된 종양 이종이식편"(PDX)으로부터 유래했다. 종양 단편은 누드 마우스에서 연속 계대로 이종이식편으로부터 수득했다. 공여체 마우스로부터 제거 후, 종양은 단편(GA0060의 경우 직경 2 내지 5mm 또는 직경 2 내지 4mm)으로 절단하고, 이어서 마우스의 옆구리 내로 일방적 피하 이식에 사용했다. 랜덤화에서, 종양-함유 동물은 종양 용적에 따라 다양한 그룹으로 계층화했다. 적절한 크기(GA0060의 경우 50mm3 내지 250mm3 또는 100mm3 내지 300mm3)를 함유하는 마우스만을 랜덤화용으로 고려했다.
마우스fmf, 마우스의 필요한 수가 랜덤화용으로 자격을 얻었을 때에 랜덤화했다. 랜덤화 일은 0일로서 지정했다. 투여의 최초 일은 또한 0일이었다. 동물은, 이들의 종양이 2000mm3의 용적을 초과한 경우에 희생시켰다. 동물이 종양 부하에 기인하여 희생된 경우, 사전 수행된 최종 관찰(LOCF)은 후속 종양 용적 값을 위해 사용했다.
GA0060 PDX 모델로부터 격리된 모든 PDX 모델의 경우, 항체 샘플을 PBS에서 1mg/ml로 희석하고, 10mg/kg으로 투여했다. 투여 섭생은 연구에 따라 매주 1회 또는 매주 2회였다. 절대 종양 용적(ATV)는 종양 이식 1일 후 및 이어서 매주 2회, (즉, 마우스가 칭량된 동일한 일)에 캘리퍼로 2차원 측정에 의해 측정했다. 종양 용적은 하기 식에 따라 계산했다: (a x b2) x 0.5, 여기서 a는 최대를 나타내고, b는 수직 종양 직경을 나타낸다. 특정 일에 대한 종양 억제(T/C %)는 100%를 곱한 시험 그룹 대 대조군 그룹의 평균 절대 종양 용적 값(즉, 종양의 평균 성장)의 비율로부터 계산했다.
T/C(Dayx)[%]= (x일에서 시험 그룹의 평균 종양 용적 - 0일에서 시험 그룹의 평균 종양 용적)/(x일에서 대조군 그룹의 평균 종양 용적 - 0일에서 대조군 그룹의 평균 종양 용적) ×100
x일은 최소(최적) T/C가 관찰되는 임의의 일을 나타낸다. 0일은 투여 최초 일이었다.
GA0060 PDX 모델로부터 격리된 모든 PDX 모델에 있어서, 실험 동안 특정 시험 그룹에 대해 기록된 최소(또는 최적) T/C% 값은 각 처리에 대한 최대 항-종양 유효성을 나타낸다. T/C 값은 그룹 중의 랜덤화 동물의 적어도 50%가 당해 일에 생존한 경우에 계산했다.
GA0060 PDX 모델에 있어서, 항체 샘플은 PBS에서 6mg/ml로 희석시키고, 60mg/kg으로 투여했다. 투여 섭생은 연구에 따라 매주 2회였다. 절대 종양 용적(ATV)는 종양 이식 후 1일에 및 이어서 매주 2회 캘리퍼로 2차원 측정에 의해 측정했다. 종양 용적은 식 (a×b2)×0.5에 따라 계산했고, 여기서 a는 최대를 나타내고, b는 수직 종양 직경을 나타낸다. 특정 일에 대한 종양 억제(T/C %)는 100%를 곱한 시험 그룹 대 대조군 그룹의 평균 절대 종양 용적 값의 비율로부터 계산했다. 2개 T/C 방정식 사이의 차이는 실시예 7에 설명되어 있다.
T/C(일x)[%] = 일x에서 시험 그룹의 평균 절대 종양 용적/일x에서 대조군 그룹의 평균 절대 종양 용적 ×100
여기서, x는 그룹 중의 동물의 적어도 50%가 생존한 경우에 최종 투여 후의 대략 1회 용량 기간이다.
간단히 하기 위해, 이 방정식은 업데이트된 T/C 방적으로 지칭될 것이다.
위 PDX 모델 GXF281에서 H561-4 유효성
GXF281는 46세의 남성 환자로부터 위의 원발성 선암으로부터 단리하고, 온코테스트(Oncotest)(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(10mg/kg), 트라스투주맙(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)을 5주 동안 매주 1회 주입했다. 각 그룹을 6마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 81일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플로팅했다(도 4a). H561-4를 사용한 매주 5회 처리는 완전한 종양 퇴축(0% 미만의 최소 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 매주 5회 처리는 단지 중간 유효성(30%의 최소 T/C)를 제공했다.
위 PDX 모델 GXA3039에서 H561-4 유효성
GXA3039은 65세의 남성 환자로부터 위의 원발성 선암으로부터 단리하고, 온코테스트(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(10mg/kg), 트라스투주맙(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10mg/kg)을 4주 동안 매주 1회 주입했다. 각 그룹은 5마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 91일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4b). H561-4를 사용한 매주 4회 처리는 완전한 종양 퇴축(0% 미만의 최소 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 매주 4회 처리는 단지 약간의 유효성(88%의 최소 T/C)를 제공했다.
결장직장 PDX 모델 CXF1991에서 H561-4 유효성
CXF1991은 59세의 여성 환자로부터 결장의 원발성 선암으로부터 단리하고, 온코테스트(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(10mg/kg), 트라스투주맙(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)fmf 6주 동안 매주 1회 주입했다. 각 그룹은 5마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 62일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4c). H561-4를 사용한 매주 6회 처리는 완전한 종양 퇴축(0% 미만의 최소 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 매주 6회 처리는 단지 약간의 유효성(57%의 최소 T/C)만을 제공했다.
결장직장 PDX 모델 CXF2102에서 H561-4 유효성
CXF2102는 환자로부터 결장의 선암의 간 전이로부터 단리하고, 온코테스트(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구하고, 이 환자의 연령 및 성별은 공지되지 않았다. H561-4(10mg/kg), 트라스투주맙(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)을 4주 동안 매주 1회 주입했다. 각 그룹은 5마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 58일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4d). H561-4를 사용한 매주 4회 처리는 현저한 종양 퇴축(0% 미만의 최소 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 매주 6회 처리는 현저한 효과를 유발하지 않았다(76%의 최소 T/C).
위 PDX 모델 GXA3054에서 H561-4 유효성
GXA3054는 65세의 남성 환자로부터 위의 선암의 원발성 종양으로부터 단리하고, 온코테스트(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서의 PBS(10ml/kg)는 5주 동안 매주 1회 주입했다. 4주 동안 투여 중단이 있었고, 이어서 매주 투여를 4주 동안 재개했다. 각 그룹은 5마리 마우스를 함유했고, 트라스투주맙 단독 그룹은 이 모델에 포함되지 않았다. 종양 용적은 최대 100일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4e). H561-4를 사용한 매주 처리는 종양 퇴축(17%의 최소 T/C 값)을 제공했다.
위 PDX 모델 GXA3038에서 H561-4 유효성
GXA3038은 63세 남성 환자로부터 위의 선암의 원발성 종양으로부터 단리하고, 온코테스트(Freiburg, Germany)에 의해 NMRI 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)를 5주 동안 매주 1회 주입했다. 1주 동안 투여 중단이 있은 다음, 매주 투여를 4주 동안 재개했다. 각 그룹은 5마리 마우스를 함유했고, 트라스투주맙 단독 그룹은 이 모델에 포함되지 않았다. 종양 용적은 최대 77일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4f). H561-4를 사용한 매주 처리는 약간의 종양 퇴축(55%의 최소 T/C 값)을 제공했다.
유방 PDX 모델 HBCx -13B에서 561-4 유효성
HBCx-13B는 임파 전이 암으로부터 단리하고, 젠테크(Xentech)(Evry, France)에 의해 무흉선 누드 마우스(Hsd;Athymic Nude-Fox1nu)에서 연구했다. H561-4(10mg/kg), 트라스투주맙(10mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)를 8주 동안 매주 2회 주입했다. 각 그룹은 9마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 56일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다(도 4g). H561-4를 사용한 매주 2회 처리는 현저한 종양 퇴축(7%의 최소 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 매주 6회 처리는 단지 약간의 유효성(48%의 최소 T/C)을 제공했다.
위 PDX 모델 GA0060에서 H561-4 유효성
GA0060은 인간 위암으로부터 단리하고, 크라운 바이오사이언스(Crown BioScience)(Beijing, China)에 의해 BALB/c 누드 마우스에서 연구했다. H561-4(30 및 60mg/kg), 트라스투주맙(30mg/kg) 및 비히클 대조군으로서 PBS(10ml/kg)을 6주 동안 매주 2회 주입하고, 각 그룹은 10마리 마우스를 함유했다. 종양 용적은 최대 41일 동안 매주 2회 측정하고, 평균 절대 종양 용적을 플롯팅했다 (도 4h). T/C 값은 업데이트된 T/C 방정식을 사용하여 계산했다. H561-4를 사용한 2주간 6회 처리는 약간의 종양 퇴축(각각 60 및 30mg/kg에서 49% 및 60%의 T/C 값)을 제공한 반면, 트라스투주맙을 사용한 2주간 6회 처리는 종양 퇴축(25%의 T/C 값)을 제공했다. 60mg/kg 트라스투주맙은 이미 30mg/kg에서 종양 퇴축을 유발했기 때문에 시험되지 않았다.
실시예 5 - H561-4는 트라스투주맙 및 페르투주맙 내성 모델에서 유효성을 나타낸다.
상기 실시예 4에 제시된 바와 같이, H561-4는 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 환자 유래된 이종이식편(PDX)에서 항-종양 효과를 갖는다. 이는 또한 H561-4가 이들 PDX 모델에서 트라스투주맙보다 현저히 우수한 항-종양 효과를 갖는 것으로 관찰되었다.
트라스투주맙은 유방암 및 위암을 치료하기 위해 임상에서 페르투주맙과 조합하여 종종 사용된다. 위 PDX 모델 GXF281에서, 트라스투주맙 및 페르투주맙 병용 치료는 종양 성장의 감소를 제공했다. 그러나, 종양은 최종적으로 진행했다. 트라스투주맙 및 페르투주맙에 대해 진행된 종양의 H561-4 치료는 완전한 종양 퇴축을 제공했다. 이들 결과는 도 5에 제시되어 있다.
환자 유래된 종양 GXF281로부터의 종양 단편을 마취된 NMRI nu/nu 마우스에 피하 이식했다. 적합한 종양 성장(50mm3 내지 250mm3 종양)을 갖는 마우스는 다음과 같이 3개 그룹으로 랜덤화했다:
ㆍ 그룹 1: 10mg/kg으로 PBS의 매주 4회 정맥내 주사를 제공한 5마리 마우스
ㆍ 그룹 2: 10mg/kg의 트라스투주맙 및 10mg/kg의 페르투주맙의 매주 4회 정맥내 주사를 제공한 20마리 마우스.
ㆍ 그룹 3: 10mg/kg의 H561-4의 매주 4회 정맥내 주사를 제공한 5마리 마우스
그룹 2에서 마우스의 평균 종양 용적이 500mm2에 도달한 52일째에, 그룹 2로부터의 마우스(트라스투주맙 및 페르투주맙 병용 그룹)를 다음과 같이 4개 그룹으로 랜덤화했다:
ㆍ 그룹 4: 추가의 치료를 제공하지 않은 5마리 마우스.
ㆍ 그룹 5: 10mg/kg의 트라스투주맙 및 10mg/kg의 페르투주맙의 매주 7회 정맥내 주사를 제공한 5마리 마우스.
ㆍ그룹 6: 10mg/kg의 H561-4의 매주 7회 정맥내 정맥내 주사를 제공한 5마리 마우스.
ㆍ 그룹 7: 3.6mg/kg의 H561-4의 매주 7회 정맥내 주사를 제공한 5마리 마우스
종양 용적은 105일 동안 매주 2회 모니터링했다(도 5). 그룹 3은 완전한 종양 퇴축을 나타냈고 어떠한 마우스도 연구 46일 후에 검출가능한 종양을 갖지 않았으며 연구 종료까지 어떠한 재성장도 발생하지 않았다(105일). 그룹 2는 대조군 그룹(그룹 1)보다 느린 종양 성장을 가졌다. 트라스투주맙 및 페르투주맙을 사용한 마우스의 반복된 투여는 종양 성장을 추가로 지연시키지 않았다(그룹 4 및 그룹 5는 유사한 종양 성장을 가졌다). 트라스투주맙 및 페르투주맙 병용 치료에 대해 진행된 마우스에서 H561-4(10mg/kg 또는 3.6mg/kg에서)을 사용한 처리는 현저한 종양 퇴축을 제공했고, 53일째에 H561-4 처리 전의 716mm3과 비교하여 그룹 6의 평균 종양 크기는 105일째에 19mm3이었고, 53일째에 H561-4 처리 전의 659mm3과 비교하여 그룹 7의 평균 종양 크기는 105일째에 37.5mm2이었다.
실시예 6 - H561-4는 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 PDX 모델에서 종양 성장을 선택적으로 억제한다.
H561-4의 생체내 활성은 23개의 상이한 환자 유래된 이종이식편(PDX)에서 연구했고, 이들 모두는 온코테스트에 의해 사용된 표준에 따라 IHC에 의해 HER2 양성으로 분류되었다. H561-4 처리 및 트라스투주맙 처리의 유효성은 백분율로 나타낸 최소 T/C 값에 기반하여 평가했다. T/C 값은 다음 방정식을 사용하여 계산했다:
T/C(일x)[%] = (일x에서 시험 그룹의 평균 종양 용적 - 일0에서 시험 그룹의 평균 종양 용적)/(일x에서 대조군 그룹의 평균 종양 용적 - 일0에서 대조군 그룹의 평균 종양 용적) ×100
일 x는 최소(최적) T/C가 관찰된 임의의 일을 나타낸다. 일 0은 투여의 최초 일이었다.
표 4는 최소 T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성 기준을 나타낸다.
-
+/-
+
++
+++
++++		 불활성
경계선 활성
중등 활성
고도 활성
매우 고도 활성
완전 관해		 T/C ≥65%
50% ≤ T/C < 65%
25% ≤ T/C < 50%
10% ≤ T/C < 25%
5% ≤ T/C < 10%
T/C < 5%
정량적 PCR에 의한 PDX 종양 모델에서 HER2 유전자 카피 수의 측정:
각각의 종양으로부터의 DNA는 100ng/㎕의 초기 농도로 제공하고, 후속적으로 분자 등급 물(SIGMA #W4502-1L)에서 5ng/㎕로 희석시켰다. PCR 반응을 위한 마스터 혼합물은 2배 Taqman 제노타이핑 마스터 믹스(Invitrogen, #371355), 1㎕ HER2 taqman 프로브 및 프라이머 세트(Invitrogen, Gene Assay ID: Hs00817646 Cat No:4400291) 및 1㎕ 하우스키핑 RNAseP taqman 프로브 및 프라이머 세트(Invitrogen, #4403326)로 이루어지도록 생성했다. 20ng의 샘플 DNA를 dH2O에 첨가하여 20㎕의 최종 반응 용적을 제공했다. 정량적 PCR 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95℃에서 유지한 다음, 15초 동안 95℃ 및 이어서 60초 동안 60℃의 40 사이클을 수행한다. 생 CT(사이클 역치) 데이터의 획득 후, 0.2의 수동 CT 및 자동-기준을 결과에 적용했다.
수득된 모든 데이터는 하우스키핑 유전자(RNAseP taqman 프로브 및 프라이머 세트, Invitrogen, #4403326)에 의해 표준화하고, 이는 세포당 2개 카피가 있는 것으로 공지되어 있다. 정량적 PCR의 결과는 임의의 단위(AU, 세포당 카피 수와 관련됨)로 나타냈다. 먼저, 각 샘플에 있어서, 하우스키핑 유전자 및 HER2 유전자의 CT 값(사이클 역치) 사이의 차이는 다음과 같이 계산했다:
표적 유전자 발현 = 2(CT 하우스키핑 유전자( RNAse P)-CT HER2 유전자)
결과는 선형 증폭을 위해 분석했고, HER2 유전자의 카피 수 측정을 위해 카피 콜러TM 소프트웨어 버젼 2.0(Invitrogen)으로 추출했다. HER2의 2개 카피(HEr2 유전자 및 하우스키핑 유전자의 CT 값은 동일하고, 이는 HER2의 세포당 2개 카피를 나타낸다)를 갖는 것으로 밝혀진 DNA 참조 샘플(Roche, #11691112001)은 정확한 카피 수 측정을 가능하게 하고 검정 작동 조정을 가능하게 하기 위해 포함되었다. 2AU는 참조 게놈 DNA에서 HER2 유전자에 대한 정상 값인 것으로 간주되었다. 인간 표준 게놈 DNA에 대해 수득된 카피 수가 정확하게 2AU가 아닌 경우, 승수를 적용하여 이를 2AU로 전환시켰다. 이 승수는 또한 종양 샘플에 대해 수득된 결과에 적용되었다. 각 샘플에 대한 유전자 카피 수는 표 5에 수록되어 있다.
표 5는 시험된 각각의 PDX 종양 샘플에서 유전자 카피 수(GCN) 뿐만 아니라 H561-4 및 트라스투주맙 처리된 PDX 모델에서 최소 T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성을 나타낸다.
HER2 유전자 카피 수 T/C (처리/대조군 종양 용적 %)
H561-4 트라스투주맙
HER2 GCN ≥10을 갖는 PDX 종양 모델
HBCx-13B 23 7 48
위 GXF281 15 <0 30
위 GXA3039 25 <0 88
위 GXA 3054 76 17 N/A
위 GXA3038 29 55 N/A
결장 CXF2102 35 <0 76
결장 CXF1991 32 <0 57
HER2 GCN <10을 갖는 PDX 종양 모델
유방 MAXF583 2 65 60
유방 MAXF508 1 147 126
결장 CXF647 2 76 47
결장 CXF1103 2 86 41
결장 CXF975 6 98 170
결장 CXF1729 2 127 65
결장 CXF260 2 68 68
결장 CXF1034 2 155 56
위 GXA3067 9 98 N/A
위 GXA3005 2 106 47
폐 LXFA983 4 71 86
폐 LXFE690 2 121 59
난소 OVXF1023 2 115 74
췌장 PAXF736 3 62 N/A
췌장 PAXF2005 2 96 69
H561-4는 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 7개 PDX 모델 중의 6개에서 유효성을 갖는 반면, 10 미만의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델의 2개에서 단지 경계선 활성이 있었다. 트라스투주맙은 10 이상의 GCN을 갖는 2개 PDX 모델에서 중등 활성 및 또 다른 모델에서 경계선 활성을 가졌다. 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델에서, 트라스투주맙은 3개의 PDX 모델에서 경계선 활성 및 또 다른 3개 모델에서 중등 활성을 가졌다. 도 6은, 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여, 10 이상의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. 산포도는, 10 미만의 GCN을 갖는 암과 비교하여, H561-4가 10 이상의 GCN을 갖는 암에서 통계학적으로 보다 큰 유효성을 갖는 것을 나타낸다.
역전사(RT) PCR, 이어서 정량적 PCR에 의해 PDX 종양 모델에서 mRNA 수준의 측정
각각의 종양으로부터의 mRNA는 250ng/㎕의 농도로 제공했다. mRNA는 제조업자의 지침에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트(Invitrogen, #N8080234)를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, 전사된 cDNA는 나노드롭(Nanodrop) 2000(Thermo Scientific)을 사용하여 정량화하여 cDNA 농도를 ng/㎕로 측정했다. 수득된 cDNA를 분자 등급 물(SIGMA #W4502-1L)에서 25ng/㎕로 희석시켰다. 정량적 PCR 반응을 위한 마스터 혼합물은 2배 Taqman 유전자 발현 마스터 혼합물(Invitrogen, # 4369016), 1.25㎕ HER2 taqman 프로브 및 프라이머 세트(Invitrogen, Hs01001580_m1 #4331182) 및 1.25㎕ 하우스키핑 인간 TBP taqman 프로브 및 프라이머 세트(Invitrogen, Hs00427620_m1 #4331182)로 이루어지도록 생성했다. 50ng의 샘플 cDNA를 dH2O와 함께 첨가하여 25㎕의 최종 반응 용적을 생성했다. 정량적 PCR 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95℃에서 유지한 다음, 15초 동안 95℃ 및 이어서 30초 동안 61℃의 50 사이클을 수행했다. 생 CT(사이클 역치) 데이터의 획득 후, 0.2의 수동 CT 및 자동-기준선을 결과에 적용했다.
세포당 HER2 유전자의 2개 카피를 갖는 것으로 예상되는(세포주는 정상 프로파일을 갖는 것으로 간주된다), 10 인간 세포주를 풀링함으로써 제조한 "범용 인간 참조 RNA(Agilent technologies, #740000)"로부터 역전사된 "인간 표준 cDNA"를 종양 샘플 cDNA와 동일한 농도로 참조로서 사용했다. 이러한 인간 표준 cDNA는 정상 mRNA 프로파일을 갖는 것으로 간주된다.
수득된 모든 데이터는 다수의 조직 유형에 대해 일정한 발현 수준을 갖는 것으로 공지되어 있는 하우스키핑 유전자(하우스키핑 인간 TBP taqman 프로브 및 프라이머 세트(Invitrogen, Hs00427620_m1 #4331182))에 의해 정규화했다. 정량적-PCR의 결과는 임의 단위(AU)에 의해 나타냈다. 먼저, 각각의 샘플에 있어서, 하우스키핑 유전자 및 HER2 유전자의 CT 값(사이클 역치)의 차이는 다음과 같이 계산했다:
HER2 발현 = 2(CT 하우스키핑 유전자(TBP)-CT HER2 유전자)
결과는 선형 증폭을 위해 분석하고, 카피 콜러 소프트웨어 버젼 2.0(Invitrogen)으로 추출했다. 이 소프트웨어를 사용하여, 인간 표준 cDNA 샘플에서 HER2 cDNA 카피 수에 대해 정규화된, 종양 샘플 중의 하이스키핑 유전자의 cDNA 카피 수에 대한 HER2의 cDNA 카피 수를 측정했다.
정규화는 인간 표준 cDNA 중의 하이스키핑 유전자의 cDNA 유전자 수에 대하여 HER2 cDNA 카피 수의 경우에 2AU를 정상 값으로 설정함으로써 수행했다. 승수(상수)를 적용하여 이를 2AU로 전환시켰다. 이러한 승수는 종양 샘플에 대해 수득된 결과에 적용했고, 수득되는 cDNA 카피 수는 mRNA 수준으로서 표 6에 수록되어 있다.
즉, 표준 cDNA의 HER2 발현 × 상수 = 2
종양 샘플 중의 HER2 발현 × 상수 = cDNA 카피 수
상수가 승수인 경우는 2의 값으로 표준 cDNA에서 HER2 발현을 정규화하기 위해 사용했다.
표 6은 H561-4 및 트라스투주맙 처리된 PDX 모델의 최소 T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성 뿐만 아니라 각각의 PDX 종양 샘플에 대한 HER2 mRNA 수준을 나타낸다.
HER2 mRNA 수준 T/C (처리/대조군 종양 용적 %)
H561-4 트라스투주맙
HER2 mRNA >200을 갖는 PDX 종양 모델
HBCx-13B 550 7 48
위 GXF281 392 <0 30
위 GXA3039 775 <0 88
위 GXA 3054 820 17 N/A
위 GXA3038 1930 55 N/A
결장 CXF2102 540 <0 76
결장 CXF1991 229 <0 57
HER2 mRNA<200을 갖는 PDX 종양 모델
유방 MAXF583 12 65 60
유방 MAXF508 15 147 126
결장 CXF647 11 76 47
결장 CXF1103 10 86 41
결장 CXF975 15 98 170
결장 CXF1729 5 127 65
결장 CXF260 3 68 68
결장 CXF1034 14 155 56
위 GXA3067 71 98 N/A
위 GXA3005 16 106 47
폐 LXFA983 6 71 86
폐 LXFE690 7 121 59
난소 OVXF1023 17 115 74
췌장 PAXF736 26 62 N/A
췌장 PAXF2005 8 96 69
H561-4는 종양에서 HER2 mRNA 수준 ≥ 200을 갖는 7개 PDX 모델 중 6개에서 유효성을 갖고, 종양에서 HER2 mRNA 수준 ≥ 200 및 ≤ 820을 갖는 모든 PDX 모델에서 유효성을 갖는 반면, 종양에서 HER2 mRNA 수준 <200을 갖는 PDX 모델 중 2개에서 단지 경계선 활성이 존재했다. mRNA 수준 ≤ 820을 갖는 모델에서 HER2 mRNA 수준은 168인 반면, 시험된 모든 모델의 경우 HER2 mRNA 수준은 248이었다. 트라스투주맙은 HER2 mRNA 수준 ≥ 200을 갖는 2개 PDX 모델에서 중등 활성을 갖고, 다른 모델에서 경계선 활성을 가졌다. mRNA 수준 <200을 갖는 PDX 모델에서, 트라스투주맙은 3개의 PDX 모델에서 경계선 활성을 가졌고, 다른 3개 모델에서 중등 활성을 가졌다. 도 7은 종양에서 200 미만의 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델과 비교하여 종양에서 200 이상의 HER2 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. 이는, H561-4가 HER2 mRNA 수준 < 200을 갖는 암과 비교하여 HER2 mRNA 수준 ≥ 200인 암에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. 특히, 데이터는, H561-4가 HER2 mRNA 수준 < 200 및 > 820을 갖는 PDX 모델과 비교하여, HER2 mRNA ≥200 및 ≤ 820을 갖는 암에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. 트라스투주맙 활성은 시험된 범위에서 HER2 mRNA 수준과 무관하다.
실시예 7 - H561-4는 T/C 값의 업데이트된 측정을 사용하여 10 이상의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 PDX 모델에 종양 성장을 선택적으로 억제한다.
H561-4 처리 및 트라스투주맙 처리의 유효성은 T/C 값을 계산하기 위한 상이한 방정식을 사용하여 추가로 평가했다.
T/C 값은 다음 방정식을 사용하여 계산했다:
T/C(일x)[%] = 일x 시험 그룹의 평균 절대 종량 용적/일x 대조군의 평균 절대 용적 × 100
여기서, x는 그룹 중 동물의 적어도 50%가 생존했을 경우, 최종 투여 후 대략 1회 투여 기간이다.
상기 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 이 방정식은 업데이트된 T/C 방정식으로 지정된다. 이 업데이트된 방정식은 상이한 임상 연구 기관으로부터 수집된 데이터의 비교를 용이하게 하도록 설계되었다.
실시예 6에 사용된 T/C 방정식과 비교하여 업데이트된 T/C 방정식에 2개의 변화가 도입되었다: 일x 비교 시점을 정의하고, 기저 감산을 제거한다.
이전에 사용된 T/C 화학식에서, 일x는 최소(최적) T/C가 관찰되는 임의의 일을 나타냈다. 따라서, x는 각 실험의 전체 기간 중의 어느 일일 수 있다. 업데이트된 T/C 방정식에서, 일x는 최종 투여 후(그룹의 동물 중 적어도 50%가 생존했을 경우) 대략 1회 투여 기간의 고정된 시점이 된다. 따라서, 업데이트된 T/C 화학식은 일x를 표준화하는 이점을 갖고, 이는 상이한 연구로부터 처리 효과를 비교할 수 있게 한다. 기저 감산 단계가 업데이트된 T/C 방정식에 포함되지 않았지만, 이는 상이한 시험 그룹 사이에 동등한 평균 종양 크기를 수득하기 위해 균일하게 접종된 마우스의 랭크 분포로 보상되었다. 종양 부하로 인해 제거된 마우스로부터의 값은, 이것이 그룹 평균을 증가시킨 경우, 최종 관찰 동반된 전방 방법론을 사용하여 희생일 이상으로 간주되었다.
이 업데이트된 방정식을 사용하여, 본 발명자들은 표 5 및 6에 기재된 23개의 상이한 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델의 T/C 값을 재평가하고, HER2 유전자 카피 수(GCN)와 함께 표 7에, HER2 mRNA 수준과 함께 표 8에 요약했다. T/C 유효성 값은 표 4에 나타낸 바와 같이 측정되었다. 트라스투주맙을 갖는 위 GXA 3054 및 위 GXA3038 PDX 모델 및 이 정보는 또한 표 7 및 8에 포함시켰다.
표 7은 H561-4 및 트라스투주맙 처리된 PDX 모델의 (업데이트된 T/C 화학식을 사용하는) T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성을 나타낸다.
qPCR에 의한 HER2 유전자 카피 수 T/C (처리/대조군 종양 용적 %)
H561-4 트라스투주맙
qPCR에 의한 HER2 GCN≥10을 갖는 PDX 종양 모델
HBCx-13B 23 14.0 63.6
위 GXF281 15 1.9 54.0
위 GXA3039 25 1.4 93.7
위 GXA 3054 76 15.5* 33.4
위 GXA3038 29 57.0* 48.8
결장 CXF2102 35 11.1 58.3
결장 CXF1991 32 8.8 77.6
위 GA0060 43 49.2+ 25.1*
qPCR에 의한 HER2 GCN<10을 갖는 PDX 종양 모델
유방 MAXF583 2 85.3 68.5
유방 MAXF508 1 150.7 141.1
결장 CXF647 2 85.9 67.4
결장 CXF1103 2 115.0 76.1
결장 CXF975 6 90 147
결장 CXF1729 2 129.9 67.6
결장 CXF260 2 83.1 80.3
결장 CXF1034 2 173.6 66.6
위 GXA3067 9 95.9 N/A
위 GXA3005 2 148.3 63.9
폐 LXFA983 4 76.8 103.4
폐 LXFE690 2 113.8 74.7
난소 OVXF1023 2 112.7 78.9
췌장 PAXF736 3 84.0 N/A
췌장 PAXF2005 2 145.2 104.4
*+이러한 그룹은 생체내 연구에서 관찰된 최대 유효성에 도달하기 위해 30* 및 60+ mg/kg H561-4로 처리했다.
H561-4는 10 초과의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 8개 PDX 모델 중 7개에서 유효성을 갖고, 이중 6개는 고활성을 갖는 반면, 10 미만의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델 모두에서 어떤 활성도 존재하지 않았다. 트라스투주맙은 10 초과의 GCN을 갖는 3개의 PDX 모델에서 중등 활성을 가졌고, 다른 3개에서 경계선 활성을 가졌지만, 그들 중 어떤 것도 고활성을 나타내지 않았다. 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델에서, 트라스투주맙은 1개 모델에서 경계선 활성을 가졌다.
도 8은 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여 10 초과의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. 산포도는, H561-4가 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여 10 초과의 GCN을 갖는 PDX 모델에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. 10 초과 또는 10 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델 중 트라스투주맙의 평균 활성은 둘 다 50% 이초과로, HER2 유전자 카피 수 값은 트라스투주맙 유효성을 예측하지 않는다는 견해를 지지한다.
요약하면, 업데이트된 T/C 방정식을 사용하여 수득된 T/C 값은 이전과 동일한 결론(실시예 6에 기재된)에 도달했다.
표 8은 H561-4 및 트라스투주맙 처리된 PDX 모델의 (업데이트된 T/C 화학식을 사용하는) T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성을 나타낸다.
RT- PCR 에 의한 HER2 mRNA 수 T/C (처리/대조군 종양 용적 %)
H561-4 트라스투주맙
RT-PCR 에 의한 HER2 mRNA =200을 갖는 PDX 종양 모델
HBCx-13B 550 14.0 63.6
위 GXF281 392 1.9 54.0
위 GXA3039 775 1.4 93.7
위 GXA 3054 820 15.5* 33.4
위 GXA3038 1930 57.0* 48.8
결장 CXF2102 540 11.1 58.3
결장 CXF1991 229 8.8 77.6
위 GA0060 1045 49.2+ 25.1*
RT-PCR 에 의한 HER2 mRNA <200을 갖는 PDX 종양 모델
유방 MAXF583 12 85.3 68.5
유방 MAXF508 15 150.7 141.1
결장 CXF647 11 85.9 67.4
결장 CXF1103 10 115.0 76.1
결장 CXF975 15 90 147
결장 CXF1729 5 129.9 67.6
결장 CXF260 3 83.1 80.3
결장 CXF1034 14 173.6 66.6
위 GXA3067 71 95.9 N/A
위 GXA3005 16 148.3 63.9
폐 LXFA983 6 76.8 103.4
폐 LXFE690 7 113.8 74.7
난소 OVXF1023 17 112.7 78.9
췌장 PAXF736 26 84.0 N/A
췌장 PAXF2005 8 145.2 104.4
*+이러한 그룹은 생체내 연구에서 관찰된 최대 유효성에 도달하기 위해 30* 및 60+ mg/kg H561-4로 처리했다.
H561-4는 종양에서 HER2 mRNA 수준 ≥200을 갖는 8개 PDX 모델 중 7개에서 유효성을 갖고, 종양에서 HER2 mRNA 수준 ≥200 및 ≤ 820을 갖는 모든 PDX 모델에서 유효성을 갖는 반면, 종양에서 HER2 mRNA 수준 < 200을 갖는 PDX 모델 모두에서는 어떤 활성도 존재하지 않았다. 트라스투주맙은 HER2 mRNA 수준 ≥200을 갖는 3개의 PDX 모델에서 중등 활성을 가졌고, 다른 3개에서 경계선 활성을 가졌지만, 그들 중 어떤 것도 고활성을 나타내지 않았다. mRNA 수준 < 200을 갖는 PDX 모델에서, 트라스투주맙은 1개 모델에서 경계선 활성을 가졌다.
도 9는 종양에서 200 미만의 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델과 비교하여 종양에서 200 이상의 HER2 mRNA 수준을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. 산포도는, H561-4가 HER2 mRNA 수준 < 200 및 > 820을 갖는 PDX 모델과 비교하여 HER2 mRNA 수준 ≥ 200 및 ≤ 820을 갖는 PDX 모델에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. HER2 mRNA ≥200의 그룹 및 < 200의 그룹 중 PDX 모델에서 트라스투주맙의 평균 활성은 둘 다 50% 이상으로, HER2 유전자 카피 수 값은 트라스투주맙 유효성을 예측하지 않는다는 견해를 지지한다.
업데이트된 T/C 방정식을 사용하여 수득된 T/C 값은 이전과 동일한 결론에 도달했다.
실시예 8 - H561-4는 유전자 카피 수가 FISH에 의해 측정되는 18 초과의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 PDX 모델을 억제한다
H561-4의 생체내 활성에 관하여 FISH에 의해 측정된 HER2 유전자 카피 수는 유방, 위 및 결장 모델을 포함하는 17개의 상이한 환자 유래된 이종이식편(PDX) 모델에서 연구했다. H561-4 처리 및 트라스투주맙 처리의 유효성은 업데이트된 T/C 방정식을 사용하여 T/C 값에 기초하여 평가했다:
T/C(일X)[%] = 일X에 시험 그룹의 평균 절대 종양 용적/ 일X에 대조군 그룹의 평균 절대 용적 × 100
T/C 값으로 정의된 유효성 기준은 표 4에 기재된다.
형광 제자리 하이브리드화(FISH)에 의해 PDX 종양 모델 중의 HER2 유전자 카피 수의 측정:
포르말린 고정된 파라핀 매립(FFPE) 암 조직 시험편을 PDX 모델로부터 수득했다. FISH 검정은 PathVysion HER-2 DNA 프로브 키트 II(Abbott Molecular #06N46-030)를 사용하여 수행했다. 이 검정은 CEP17 신호로의 정규화 없이 HER2 신호의 직접 계수를 사용했다. 조직 슬라이드는 5분 동안 크실렌 중에서 3회 탈파라핀화되도록 전처리하고, 5분 동안 공업용 메틸화 주정(IMS)에서 2회 재수화 및 95 내지 99℃에서 30분 동안 시트레이트 완충제 pH 6.0의 항온처리를 수행한다. 전처리 후, 슬라이드를 프로테아제 소화를 위한 펩신 프로테아제 완충제에서 20분 동안 37℃에서 항온처리했다. 표적 HER2 DNA 서열의 효율적 제조를 위해, 슬라이드를 DNA 변성을 위해 5분 동안 73℃로 가열하고, 37℃에서 14 내지 18시간 동안 프로브 하이브리드화가 이어진다. 비특이적 하이브리드화 사상은 2분 동안 72℃에서 후-하이브리드화 완충제에서 세척 제거했다. 이어서, 슬라이드를 신호 산출을 위해 형광 현미경을 사용하여 관찰할 때까지 암 상태에서 15분 동안 DAPI 대비 염색제로 항온처리했다. 산출은 샘플당 20 내지 60 종량 세포에 기초하여 평가하고, HER2 유전자 카피 수의 평균을 취했다. 각 샘플에 대해 FISH에 의해 측정된 HER2 유전자 카피 수는 표 9에 나열된다.
표 9는 H561-4 및 트라스투주맙 처리된 PDX 모델의 T/C 값(%)으로 정의된 유효성 뿐만 아니라 시험된 각 PDX 종양 중의 유전자 카피 수(GCN)를 나타낸다:

 HER2 유전자 카피 수(FISH에 의한) T/C
처리 /대조군 종양 용적 %)
H561-4 트라스투주맙
HER2 GCN=18(FISH에 의한)을 갖는 PDX 종양 모델
HBCx-13B 21 14.0 63.6
위 GXF281 25 1.9 54.0
위 GXA3039 30 1.4 93.7
위 GXA 3054 40 15.5* 33.4
위 GXA3038 30 57.0* 48.8
결장 CXF2102 25 11.1 58.3
결장 CXF1991 25 8.8 77.6
위 GA0060 40 49.2+ 25.1
HER2 GCN<18(FISH에 의한)를 갖는 PDX 종양 모델
위 GXA3067 17 95.9 N/A
유방 MAXF583 3 85.3 68.5
유방 MAXF508 2 150.7 141.1
결장 CXF647 2 85.9 67.4
결장 CXF1103 2 115.0 76.1
결장 CXF1729 2 129.9 67.6
결장 CXF260 2 83.1 80.3
결장 CXF1034 2 173.6 66.6
위 GXA3005 2 148.3 63.9
*+이러한 그룹은 생체내 연구에서 관찰된 최대 유효성에 도달하기 위해 30* 및 60+ mg/kg H561-4로 처리한다.
H561-4는 FISH에 의해 측정된 18 초과의 HER2 유전자 카피 수를 갖는 8개 PDX 모델 중 7개에서 유효성을 가졌고, 이중 6개는 고활성을 가졌지만, 18 미만의 HER2 GCN을 갖는 모든 PDX 모델에서 활성은 없었다. 트라스투주맙은 18 초과의 GCN을 갖는 3개의 PDX 모델에서 완만한 활성을 가졌고, 다른 3개에서 경계선 활성을 가졌지만, 이들 중 어떤 것도 고활성을 나타내지 않았다. 18 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델에서, 트라스투주맙은 1개 모델에서 경계선 활성을 가졌다.
도 10은 18 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여 18 초과의 HER2 GCN을 갖는 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. 산포도는, H561-4가 18 미만의 GCN을 갖는 PDX 모델과 비교하여 18 초과의 GCN을 갖는 PDX 모델에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. 트라스투주맙 활성은 HER2 유전자 카피 수 값과 무관하다. 18 초과의 GCN을 갖는 그룹 또는 18 미만을 갖는 그룹에서 PDX 모델 중 트라스투주맙의 평균 활성은 둘 다 50% 이상으로, HER2 유전자 카피 수 값은 트라스투주맙 유효성을 예측하지 않는다는 견해를 지지한다.
실시예 9 - FISH 및 qPCR에 의한 HER2 유전자 카피 수의 측정 및 이들의 관계
상기 실시예 6 및 실시예 8에 나타낸 바와 같이, HER2 유전자 카피 수는 qPCR 및 FISH에 의해 측정했다. qPCR에 의해 측정된 PDX 종양 중 HER2 GCN은 1 내지 76 카피로 변한 반면, FISH에 의해 측정된 이러한 종양 중의 GCN은 2 내지 40 카피로 변했다. 어느 하나의 방법으로 측정된 높은 HER2 유전자 증폭을 갖는 종양(qPCR에 의한 10 이상의 GCN 또는 FISH에 의한 18 이상의 GCN)은 통계학적으로 H561-4 처리에 더 반응하기 쉽다. 두 방법에 의해 측정된 GCN의 관계는 두 방법에 의해 수집된 데이터가 이용가능한 17 PDX 종양에서 평가했다. 두 방법에 의해 측정된 HER2 유전자 카피 수는 표 10에 나열된다.

qPCR 및 FISH에 의해 측정된 PDX 종양 중의 HER2 GCN의 요약
HER2 GCN
(qPCR) 		HER2 GCN
(FISH)
위 GXA3054 76 40
위 GA0060 43 40
결장 CXF2102 35 25
결장 CXF1991 32 25
위 GXA3038 29 30
위 GXA3039 25 30
HBCx-13B 23 21
위 GXF281 15 25
위 GXA3067 9 17
유방 MAXF583 2 3
결장 CXF1034 2 2
결장 CXF647 2 2
결장 CXF1103 2 2
결장 CXF1729 2 2
위 GXA3005 2 2
결장 CXF260 2 2
유방 MAXF508 1 2
상관 분석은 qPCR에 의해 측정된 HER2 GCN과 FISH에 의해 측정된 것 사이의 관계를 정의하기 위해 수행되었다. 도 11에 도시된 산포도는 각 PDX 종양 샘플에서 FISH 및 qPCR로 측정된 GCN의 관계를 나타내고, 점은 1:1 상관관계를 나타내는 대각선에 밀접하게 위치한다. 두 방법에 의해 측정된 GCN은 상관 분석에 기초하여 매우 상관적이다(피어슨 r = 0.90; p < 0.0001; 95% CI = 0.74-0.96).
실시예 10 - 상이한 프로토콜에 의해 측정된 HER2 IHC 스코어링의 변동 조사
HER2 증폭 상태는 예측 인자로서 사용되었다. 면역조직화학(IHC) 검정은 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 조직 샘플에서 HER2 단백질 발현을 평가하기 위해 일반적으로 사용된 방법이다. 이미 논의된 바와 같이, IHC의 반-정량적 성질은 이는 부정확할 수 있고, 항상 정확한 판독을 제공하지 않는다는 것을 의미한다. 또한, 다양한 검정 프로토콜, HER2 항체 및 스코어링 시스템이 사용중임을 감안하면, IHC 검정의 공급자들 사이의 HER2 IHC 결과의 변동성이 문제가 될 수 있다.
HercepTest는 유방 및 위암에서 HER2 단백질 과발현의 측정을 위한 표준화된 IHC 검정으로서 FDA에 의해 승인되었지만, 대부분의 HER2 양성 샘플은 FISH 검정에 의해 측정된 바와 같이 HER2 유전자 증폭이 결여된다는 것을 일부 연구에서 보고되었다[참조: Jacobs et al., 1999]. 한편, 유방암은 유전자 증폭의 부재하에 HER2 단백질 과발현을 나타낼 수 있지만, 이 현상은 이미 케이스의 7%에서만 관찰되었다[참조: Persons et al., 1997]. 이러한 불일치는 HercepTest 3+ 양성 집단이 증폭될 HER2인 것으로 간주되는 현재 임상 사례와 모순된다.
이 연구에서, HercepTest를 포함하는 상이한 IHC 검정 및 온코테스트에 의해 개발된 면역조직화학적 검정을 22 포르말린 고정된 파라핀 매립 PDX 종양에서 HER2 단백질의 과발현을 동정하기 위해 사용했다. 목적은 H561-4 바이오마커로서 IHC의 신뢰성을 조사하기 위한 것이었다.
HercepTest IHC 검정을 위해, HercepTest의 제조 프로토콜이 사용되었다. 간단하게, 포르말린 고정된 파라핀 매립 암 조직은 5분 동안 크실렌에서 3회 탈파라핀화한 다음, 공업용 메틸화 주정(IMS)에서 5분 동안 2회 탈수를 수행한다. 이어서, 슬라이드를 97℃에서 40분 동안 에피토프 회복 용액에서 항온처리하고, 염색 전에 20분 동안 세척 완충액 중에서 강타했다. 슬라이드를 30분 동안 1차 토끼 항-인간 HER2 항체로 항온처리한 다음, 30분 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 2차 염소 항-토끼 항체로 항온처리했다. DAB 색소원을 신호 시각화를 위한 효소적 전환에 적용했다.
온코테스트로 개발된 면역조직화학적 검정을 조직의 제1 탈파라핀화 및 재수화로 수행했다. 슬라이드를 720와트 마이크로웨이브에서 20분 동안 항원 회복을 위해 10mM 삼나트륨 시트레이트에서 항온처리했다. 샘플을 0.2% 트리톤 X100에 의해 투과성화하고, 내인성 퍼옥사다제를 불활성화하기 위해 3% H2O2로 차단시켰다. 슬라이드를 10% BSA에서 비특이적 결합을 위해 차단시키고, 4℃에서 밤새 폴리클로날 토끼 항-인간 HER2 항체(Dako Cat# A0485)로 항온처리했다. 슬라이드를 다음 날 실온에서 60분 동안 바이오티닐화 염소 항-토끼 IgG(Jackson Cat# 111-065-045)로 항온처리했다. 바이오티닐화 2차 항체는 아비딘/바이오티닐화 효소 복합체(ABC 복합체, Vector Lab Cat#PK-4000)에 의한 항온처리, 이어서 DAB 색원체에 의한 신호 개발로 검출시켰다.
미국 임상 종양 학회(ASCO) 스코어링 가이드라인이 두 방법에 의해 사용되었다. 간단하게, HER2 단백질 과발현은 0 내지 3+의 규모로 등급화한다. HER2 단백질을 발현시키는 종양의 퍼센트 및 HER2 염색의 강도에 의해 측정된 종양 조직 단편의 IHC 염색 수준은 HER2 단백질 발현을 스코어링하기 위해 사용된다. IHC에 의한 HER2의 스코어링의 가이드라인은 이하 표 11에 나타낸다(2013년, IHC 2+의 평가는 '약양성'(2007년 가이드라인에 사용된)으로부터 '모호한'으로 업데이트되었다).
HER2 단백질 과발현의 ASCO IHC 스코어링 가이드라인
보고하는 스코어 발현 평가에 대한 HER2 단백질 염색 패턴
0 음성 어떤 염색도 관찰되지 않거나 막 염색은 10% 미만의 종양 세포에서 관찰된다
1+ 음성 약한/드물게 인지가능한 막 염색이 10% 이상의 종양 세포에서 검출가능하다. 세포는 불완전한 막 염색을 나타낸다.
2+ 약양성(모호함) 약 내지 중등 완전 막 염색이 10% 이상의 종량 세포에서 관찰된다.
3+ 강양성 강한 완전 막 염색이 10% 이상의 종양 세포에서 관찰된다.
유효성 연구에서 시험된 각 PDX 종양에 대해 HercepTest 및 온코테스트에 의해 개발된 IHC 방법에 의해 측정된 HER2 IHC 과발현 스코어는 표 12에 나열한다. 2개의 상이한 염색 방법으로 수득된 HER2 IHC 결과는 광범위한 변동, 특히 두 HercepTest 및 온코테스트가 동일한 스코어링 가이드라인을 사용한다는 사실에도 불구하고, qPCR에 의한 HER2 GCN ≤ 10을 갖는 종양을 나타냈다. 또한, 심지어 온코테스트에 의해 수행된 동일한 방법 중 반복(n = 1 대 n = 2)은 모순을 나타냈다. 따라서, IHC는 공급업체 사이에서 그리고 동일 공급업체에 의해 다수의 검정 내에서 상당히 다양하게 나타난다.
HER2 음성 케이스의 수는 온코테스트에 의해 수행된 IHC와 비교하여 HercepTest에 의해 훨씬 더 높다(두 방법으로 시험된 종양에 대해 8 대 2 케이스). 한편, HercepTest는 보다 높은 양성율을 유도하는 것으로 보고되었다[참조: Jacobs et al., 1999]. 함께, 이러한 결과는 HER2 IHC 결과의 변화 방향을 가리킨다. 이전의 연구는 조직 고정 및 처리에서의 변동 및 항체 감도 및 특이성에서의 변동을 포함하여 HER2 단백질을 위해 IHC 검정의 사용에서 변동을 유도할 수 있는 상이한 문제를 기술했다. 그러나, 현재 연구에서 1차 항체 특이성은 동일한 항체가 두 방법에 사용되었을 때의 원인일 것 같지는 않다.
전반적인 HER2 IHC 결과와 HER2 GCN 및 HER2 mRNA 결과(실시예 7 및 실시예 8)를 비교하면, FISH 또는 qPCR 방법에 의해 측정된 HER2 GCN 또는 HER2 mRNA는 H56104에 반응성 환자 집단인 바이오마커 양성 집단을 선택하는데 있어서 훨씬 더 예측적이다(p < 0.0001; 짝이 없는 t 테스트).
도 12는 HercepTest에 의해 측정된 HER2 단백질 과발현 음성인 PDX 모델과 비교하여 HER2 단백질 과발현 양성인 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값의 산포도를 나타낸다. HercepTest가 Herceptin 처리를 위한 환자를 선택하기 위한 FDA-승인 동반 시험 키트였지만, 시험된 16개 샘플에서 트라스투주맙 활성은 HER2 단백질 과발현 상태와 무관했다(p = 0.09; 짝이 없는 t 테스트). 두 HER2 단백질 과발현 양성 또는 음성인 PDX 모델에서 트라스투주맙의 평균 활성은 50%보다 더 높아서 HER2 단백질 과발현이 트라스투주맙 유효성에 대해 견고하게 예측되지 않다는 개념을 제시한다.
흥미롭게도, 산포도는, H561-4가, IHC가 HercepTest에 의해 측정될 때, HER2 단백질 과발현 음성인 PDX 모델과 비교하여 HER2 단백질 과발현 양성인 PDX 모델에서 통계학적으로 더 큰 유효성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, HER2 IHC 상태가 트라스투주맙보다 H561-4에 반응성 집단을 선택하는데 있어서 더욱 예측적이다는 것을 입증한다.
표 12 : 시험된 각각의 PDX 종양 샘플에서 HercepTest 및 온코테스트에 의한 IHC에 의해 측정된 HER2 과발현 스코어링 뿐만 아니라 PDX 모델에서 H561-4 및 트라스투주맙 처리의 T/C 값(%)에 의해 정의된 유효성

 HER2 과발현 IHC 스코어 T/C
처리/대조군 종양 용적%)
HercepTest 온코테스트 n=1 온코테스트 n=2 H561-4 트라스투주맙
HER2 GCN≥10(RT-PCR에 의한)을 갖는 PDX 종양 모델
유방 HBCx-13B 2+ N.D N.D 14.0 63.6
위 GXF281 3+ 3+ 3+ 1.9 54.0
위 GXA3039 3+ 3+ 3+ 1.4 93.7
위 GXA 3054 3+ 3+ 3+ 15.5* 33.4
위 GXA3038 3+ 3+ 3+ 57.0* 48.8
결장 CXF2102 3+ 3+ 3+ 11.1 58.3
결장 CXF1991 3+ 3+ 3+ 8.8 77.6
위 GA0060 3+ N.D N.D 49.2+ 25.1
HER2 GCN<10(RT-PCR에 의한)을 갖는 PDX 종양 모델
유방 MAXF583 0 3+ 2+ 85.3 68.5
유방 MAXF508 1+ 3+ 2+ 150.7 141.1
결장 CXF647 0 3+ 2+ 85.9 67.4
결장 CXF1103 0 3+ 1+ 115.0 76.1
결장 CXF1729 0 3+ 2+ 129.9 67.6
결장 CXF260 0 2+ 1+ 83.1 80.3
결장 CXF1034 1+ 3+ 3+ (2+) 173.6 66.6
위 GXA3067 3+ 3+ 2+ 95.9 N.D
위 GXA3005 0 3+ 2+ 148.3 63.9
폐 LXFA983 N.D 2+ 1+ 76.8 103.4
폐 LXFE690 N.D 3+ 2+ 113.8 74.7
난소 OVXF1023 N.D 3+ 2+ 112.7 78.9
췌장 PAXF736 N.D 2+ 1+ 84.0 N.D
췌장 PAXF2005 N.D 2+ 1+ 145.2 104.4
**이러한 그룹은 생체내 연구에서 관찰된 최대 유효성에 도달하기 위해 30* 및 60+ mg/kg H561-4로 처리했다.
비공식적 서열 목록
항원-결합 Fc 단편 H561-4의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 1)
Figure pct00001
H561-4 뉴클레오타이드 서열의 개시시 서열 "ACCTGCCCCCCTTGTCCT"는 IgG1 힌지 영역의 일부를 코딩한다. H561-4의 CH2 도메인을 코딩하는 서열은 밑줄을 친다. H561-4의 CH3 도메인을 코딩하는 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 CH3 도메인의 AB 구조적 루프의 일부를 코딩하는 서열은 굵게 나타내고, 항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 CH3 도메인의 EF 구조적 루프를 코딩하는 서열의 일부는 굵게 이중 밑줄친다.
항원-결합 Fc 단편 H561-4 힌지 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)
Figure pct00002
항원-결합 Fc 단편 H561-4 CH2 도메인의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)
Figure pct00003
항원-결합 Fc 단편 H561-4 CH3 도메인의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 4)
Figure pct00004
항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 H561-4 AB 구조적 루프 영역의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5)
Figure pct00005
H561-4 CD 구조적 루프 영역의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)
Figure pct00006
항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 H561-4 EF 구조적 루프 영역의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7)
Figure pct00007
항원-결합 Fc 단편 H561-4의 아미노산 서열(서열번호 8)
Figure pct00008
H561-4 아미노산 서열의 개시에서 서열 "TCPPCP"는 IgG1 힌지 영역의 일부를 나타낸다. H561-4의 CH2 도메인은 밑줄친다. H561-4의 CH3 도메인은 이탤릭체로 나타낸다. CH3 도메인의 AB 구조적 루프의 일부는 굵게 나타내고, CH3 도메인의 EF 구조적 루프의 일부는 굵게 나타내고, 이중 밑줄친다. CH3 도메인의 C-말단 리신(K) 또는 C-말단 리신 및 인접 글리신(GK)의 절단이 보고되었다. C-말단 리신 및 인접 글리신(또한, 이하 서열번호 11에 제시됨)은 상기 서열에서 박스로 나타낸다.
H561-4 힌지 영역의 아미노산 서열(서열번호 9)
Figure pct00009
H561-4 CH2 도메인의 아미노산 서열(서열번호 10)
Figure pct00010
H561-4 CH3 도메인의 아미노산 서열(서열번호 11)
Figure pct00011
항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 H561-4 AB 구조적 루프 영역의 일부의 아미노산 서열(서열번호 12)
Figure pct00012
H561-4 CD 구조적 루프 영역의 일부의 아미노산 서열(서열번호 13)
Figure pct00013
항원 결합에 관여하는 것으로 간주되는 H561-4 EF 구조적 루프 영역의 일부의 아미노산 서열(서열번호 14)
Figure pct00014
Pepscan에 의해 측정된 H561-4에 의해 결합된 HER2 아미노산 서열(서열번호 15)
Figure pct00015
Pepscan에 의해 측정된 H561-4에 의해 결합된 HER2 아미노산 서열(서열번호 16)
Figure pct00016
Pepscan에 의해 측정된 H561-4에 의해 결합된 HER2 아미노산 서열(서열번호 17)
Figure pct00017
HER2 세포외 도메인의 아미노산 서열(서열번호 18)
Figure pct00018
Figure pct00019
실험에서 대조군 그룹으로서 사용된 야생형 Fc 항원 결합 단편의 아미노산 서열(서열번호 19)
Figure pct00020
참조문헌
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> F-star Biotechnology LTD F-star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. <120> Cancer Biomarkers and Uses Thereof <130> IPA160209-GB <150> GB 1317622.7 <151> 2013-10-04 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of antigen-binding Fc fragment H561-4 <400> 1 acctgccccc cttgtcctgc ccccgagctg ctgggaggcc cttccgtgtt tctgttcccc 60 ccaaagccca aggacaccct gatgatctcc cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg 120 gacgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 180 cacaacgcca agaccaagcc cagagaggaa cagtacaact ccacctaccg ggtggtgtcc 240 gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 300 aacaaggccc tgcctgcccc catcgaaaag accatctcca aggccaaggg ccagccccgc 360 gagccccagg tgtacaccct gccccctagc cgggacgagt tcttcaccta ctgggtgtcc 420 ctgacctgcc tggtcaaggg cttctacccc tccgatatcg ccgtggaatg ggagtccaac 480 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggactccga cggctcattc 540 ttcctgtact ccaagctgac cgtggaccgg cggagatgga ccgccggcaa cgtgttctcc 600 tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgagc 660 cccggcaagt gatgagaatt c 681 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the antigen-binding Fc fragment H561-4 hinge region <400> 2 acctgccccc cttgtcct 18 <210> 3 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the antigen-binding Fc fragment H561-4 CH2 domain <400> 3 gcccccgagc tgctgggagg cccttccgtg tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc 60 ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac 120 cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180 cccagagagg aacagtacaa ctccacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240 caggactggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc 300 cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 330 <210> 4 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the antigen-binding Fc fragment H561-4 CH3 domain <400> 4 gaaaagacca tctccaaggc caagggccag ccccgcgagc cccaggtgta caccctgccc 60 cctagccggg acgagttctt cacctactgg gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc 120 tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag tccaacggcc agcccgagaa caactacaag 180 accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc tcattcttcc tgtactccaa gctgaccgtg 240 gaccggcgga gatggaccgc cggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca cgaggccctg 300 cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc ctgagccccg gcaag 345 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence encoding the part of the H561-4 AB structural loop region believed to be involved in antigen binding <400> 5 ttcttcacct actgg 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence encoding part of the H561-4 CD structural loop region <400> 6 aacggccagc ccgag 15 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence encoding the part of the H561-4 EF structural loop region believed to be involved in antigen binding <400> 7 gaccggcgga gatggaccgc c 21 <210> 8 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of antigen-binding Fc fragment H561-4 <400> 8 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Phe Phe Thr Tyr Trp Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Arg Arg Arg 180 185 190 Trp Thr Ala Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the H561-4 hinge region <400> 9 Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 10 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the H561-4 CH2 domain <400> 10 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the H561-4 CH3 domain <400> 11 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Phe Phe Thr Tyr Trp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Arg Arg Arg Trp Thr Ala Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the part of the H561-4 AB structural loop region believed to be involved in antigen binding <400> 12 Phe Phe Thr Tyr Trp 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of part of the H561-4 CD structural loop region <400> 13 Asn Gly Gln Pro Glu 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the part of the H561-4 EF structural loop region believed to be involved in antigen binding <400> 14 Asp Arg Arg Arg Trp Thr Ala 1 5 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His 20 25 30 Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 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Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro 195 200 205 Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly 210 215 220 Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly 225 230 235 240 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr 245 250 255 Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser 260 265 270 Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser 275 280 285 Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp 290 295 300 Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys 305 310 315 320 Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 325 330 335 Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu 340 345 350 Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile 370 375 380 Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala 565 570 575 Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp 580 585 590 Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys 595 600 605 Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln 610 615 620 Arg Ala Ser Pro Leu Thr 625 630 <210> 19 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

Claims (54)

  1. 환자에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한 인간 상피 성장 인자 수용체 2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2: HER2)에 결합하는 특이적 결합 멤버로서,
    상기 암은 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고,
    상기 특이적 결합 멤버는
    (a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
    (b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버인, 특이적 결합 멤버.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플이 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정된 것인, 특이적 결합 멤버.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암이 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖거나 갖는 것으로 측정되고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 200 이상의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 상기 샘플 중의 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는, 특이적 결합 멤버.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암이 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖거나 갖는 것으로 측정되고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 200 내지 820의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 상기 샘플 중의 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는, 특이적 결합 멤버.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계 및
    (ii) 상기 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자를 상기 특이적 결합 멤버로 치료하는 단계를 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상 또는 18 이상인, 특이적 결합 멤버.
  7. 제6항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 18 이상인, 특이적 결합 멤버.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 위암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 췌장암, 폐암, 위암 또는 자궁내막암인, 특이적 결합 멤버.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암이 위암, 유방암 또는 결장직장암인, 특이적 결합 멤버.
  10. 제8항에 있어서, 상기 암이 위암인, 특이적 결합 멤버.
  11. 제8항에 있어서, 상기 암이 유방암인, 특이적 결합 멤버.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 대해 부적절한 반응을 나타내는, 특이적 결합 멤버.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 트라스투주맙 또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 대해 난치성인, 특이적 결합 멤버.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 상기 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  15. 제14항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버가 상기 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역 AB 및 EF로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (a) 부분 및/또는 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 항원-결합 Fc 단편이거나 항원-결합 Fc 단편을 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (a) 부분 및/또는 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 서열번호 11의 CH3 도메인 또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 11의 CH3 도메인을 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  18. 제17항에 있어서, 제1항의 (a) 부분 및/또는 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 서열번호 10의 CH2 도메인을 추가로 포함하는, 특이적 결합 멤버.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (a) 부분의 특이적 결합 멤버가 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체, 또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체인, 특이적 결합 멤버.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가, 표면 플라스몬 공명(SPR), 경쟁 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 경쟁 면역세포화학에 의해 측정시, HER2에 대한 결합에 대해 제1항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는, 특이적 결합 멤버.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 제1항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버로서 HER2 상의 동일한 에피토프에 결합하고, 제1항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버가 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체, 또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체인, 특이적 결합 멤버.
  22. 제2항 또는 제5항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 형광 제자리 하이브리드화(FISH), 색원성 제자리 하이브리드화(CISH) 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 측정되는, 특이적 결합 멤버.
  23. 제22항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 FISH를 사용하여 측정되는, 특이적 결합 멤버.
  24. 제3항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준을 측정하는 것을 포함하고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 종양 샘플에서 200 이상의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 고도의 HER2 mRNA 수준이 종양 세포당 평균 HER2 유전자 카피 수가 10 이상인 것을 나타내는, 특이적 결합 멤버.
  25. 제24항에 있어서, HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 역전사 PCR에 이어서 정량적 PCR을 사용하여 측정되는, 특이적 결합 멤버.
  26. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 암이 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖고,
    상기 방법이
    (a) 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버 또는
    (b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플이 종양 세포당 10 이상의 평균 HER2 유전자 카피 수를 갖는 것으로 측정된 것인, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 암이 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖거나 갖는 것으로 측정되고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 200 이상의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 상기 샘플 중의 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는, 방법.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 암이 고도의 HER2 mRNA 수준을 갖거나 갖는 것으로 측정되고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 200 내지 820의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 상기 샘플 중의 HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 RT-PCR에 이어서 정량적 PCR에 의해 측정되는, 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계; 및
    (ii) 상기 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 상기 특이적 결합 멤버를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. (a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
    (b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버에 감수성인 환자에서 암을 동정하는 방법으로서,
    상기 방법이
    (i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 세포당 10 이상의 평균 유전자 카피 수는 상기 암이 상기 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타내는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 방법이
    (ii) 상기 평균 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 환자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. (a) 특이적 결합 멤버의 CD3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하고 아미노산 서열 FFTYW(서열번호 12) 및 DRRRWTA(서열번호 14)를 함유하는 특이적 결합 멤버; 또는
    (b) HER2에 대한 결합에 대해 상기 (a)에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 대해 암의 반응을 예측하는 방법으로서,
    상기 방법이
    (i) 환자로부터 수득된 종양 샘플에서 종양 세포당 HER2 유전자의 평균 유전자 카피 수를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 세포당 10 이상의 평균 유전자 카피 수는 상기 암이 상기 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성인 것을 나타내고, 종양 세포당 10 미만의 유전자 카피 수는 상기 암이 상기 특이적 결합 멤버를 사용한 치료에 감수성이지 않음을 나타내는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법이
    (ii) 상기 HER2 유전자 카피 수가 종양 세포당 10 이상인 경우, 상기 특이적 결합 멤버를 사용한 치료를 위해 상기 암을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상 또는 18 이상인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 18 이상인, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 위암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 췌장암, 폐암, 위암 또는 자궁내막암인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 암이 위암, 유방암 또는 결장직장암인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 암이 위암인, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방법.
  41. 제26항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 대한 대해 부적절한 반응을 나타내는, 방법.
  42. 제26항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 트라스투주맙 또는 트라스투주맙 + 페르투주맙을 사용한 치료에 대해 난치성인, 방법.
  43. 제26항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (b) 부분, 제31항의 (b) 부분 또는 제33항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 상기 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역으로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 특이적 결합 멤버가 상기 특이적 결합 멤버의 CH3 도메인의 구조 루프 영역 AB 및 EF로 조작된 HER2 항원 결합 부위를 포함하는, 방법.
  45. 제26항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 제31항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 또는 제33항의 (a) 및/또는 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 항원-결합 Fc 단편이거나 항원-결합 Fc 단편을 포함하는, 방법.
  46. 제26항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 제31항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 또는 제33항의 (a) 및/또는 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 11의 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 제26항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 제31항의 (a) 및/또는 (b) 부분, 또는 제33항의 (a) 및/또는 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 서열번호 10의 CH2 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제26항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (a) 부분, 제31항의 (a) 부분, 또는 제33항의 (a) 부분의 특이적 결합 멤버가 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체, 또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체인, 방법.
  49. 제26항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (b) 부분, 제31항의 (b) 부분, 또는 제33항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가, 표면 플라스몬 공명(SPR), 경쟁 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 경쟁 면역세포화학에 의해 측정시, HER2에 대한 결합에 대해 각각 제26항의 (a) 부분, 제29항의 (a) 부분, 또는 제33항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버와 경쟁하는, 방법.
  50. 제26항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 제26항의 (b) 부분, 제31항의 (b) 부분, 또는 제33항의 (b) 부분의 특이적 결합 멤버가 각각 제26항의 (a) 부분, 제29항의 (a) 부분, 또는 제33항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버로서 HER2 상의 동일한 에피토프에 결합하고, 제26항의 (a) 부분, 제29항의 (a) 부분, 또는 제33항의 (a) 부분에 따르는 특이적 결합 멤버가 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체, 또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 빠진 서열번호 8의 폴리펩티드의 이량체인, 방법.
  51. 제26항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 형광 제자리 하이브리드화(FISH), 색원성 제자리 하이브리드화(CISH) 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 측정되는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 HER2 유전자 카피 수가 FISH를 사용하여 측정되는, 방법.
  53. 제26항 내지 제52항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 환자로부터 수득된 종양 샘플 중의 HER2 mRNA 수준을 측정하는 것을 포함하고, 고도의 HER2 mRNA 수준이, 상기 샘플 중의 참조 유전자의 cDNA 카피 수와 비교하여, 종양 샘플에서 200 이상의 HER2 cDNA 카피 수에 상응하고, 고도의 HER2 mRNA 수준이 종양 세포당 평균 HER2 유전자 카피 수가 10 이상인 것을 나타내는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, HER2 및 참조 유전자의 cDNA 카피 수가 역전사 PCR에 이어서 정량적 PCR을 사용하여 측정되는, 방법.
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