JP6449308B2 - がんバイオマーカー及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、バイオマーカーとしてのヒト上皮成長因子受容体２（HER2）遺伝子コピー数（GCN）及びＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルの使用に関する。特に、本発明は、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー及びＨＥＲ２に対する結合についてそのような結合メンバーと競合する特異的結合メンバーによる治療に応答するがんを同定するためのバイオマーカーとしてのＨＥＲ２遺伝子コピー数及びＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルの使用に関する。本発明は、特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー及びその使用にも関する。

ヒト上皮成長因子受容体２（HER2、HER2/neu又はErbB-2とも称する）は、１８５ｋＤａの細胞質性膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。それは、染色体１７ｑの長腕に位置するｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子にコードされ、ＨＥＲファミリーのメンバーである（Ross et al.、2003）。ＨＥＲファミリーは、通常細胞成長及び生存、並びに接着、遊走、分化及び他の細胞応答を調節する（Hudis, C、2007）。ＨＥＲ２の過剰発現及び増幅は、乳がん（Yarden, Y、2001）、胃（gastric）（Gravalos et al.、2008）、胃（stomach）（Rueschoff et al.、2010）、結腸直腸（Ochsら、2004）、卵巣がん（Lanitis et al.、2012）、膵臓（Lei et al.、1995）、子宮内膜（Berchuk et al.、1991）、及び非小細胞肺がん（Brabender et al.、2001）を含めた種々の固形がんの発症において観察される。

２００８年において、乳がん、結腸直腸がん及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、診断された全てのがん症例の３０％、全てのがん死の２４％を占めた（CRUK及びWHO世界がん報告）。乳がんは、特に女性の間でがん死の主要因となっている。ＨＥＲ２は、乳がんの１５〜３０％において過剰発現又は増幅されており、予後不良、より短い無病及び全生存期間並びにより悪性のがん表現型と関係する（Vinatzer et al.、2005）。乳がんにおいて、患者の約２０％は、ＨＥＲ２がん原遺伝子を含有する染色体１７上のアンプリコンの増幅を伴うゲノム変化を保有する腫瘍を発症する（Ross, J、2009；及びHicks et al.、2005）。そのような腫瘍は、疾患の死亡率に大きく寄与する乳がんのより悪性のサブタイプを表す（Hudis C、2007）。

ＨＥＲ２陽性腫瘍を治療するためのいくつかのＨＥＲ２標的療法が、承認されている。

Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）は、Ｔａｘｏｌ（商標）（パクリタキセル）と併用して転移性乳がんの治療用として、及び転移性疾患に対する１つ又は複数の化学療法のコースを受けたことがある患者におけるＨＥＲ２陽性乳がんの治療用として単独で承認されている。手術可能な又は局所的に進行したＨＥＲ２陽性腫瘍においてトラスツズマブは、補助化学療法（パクリタキセル、ドセタキセル及びビノレルビン）の効力も向上させるので、ＨＥＲ２過剰発現乳がんの初期又は進行段階の患者に対する標準的治療とみなされる。胃又は胃食道接合部がんのＨＥＲ２陽性転移性がんに対する治療をこれまでに受けていない患者において、トラスツズマブは、化学療法（シスプラチン及びカペシタビン又は５−フルオロウラシルのいずれか）と併用してそれら転移性疾患の治療用としても承認された（Genentech、About Herceptin.［オンライン］:http://www.herceptin.com/aboutで利用可能［2013年9月17日にアクセスした］）。

Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）（ペルツズマブ）も、トラスツズマブ及びドセタキセルと併用してＨＥＲ２陽性の転移性乳がんの治療用として承認された（Genentech、PERJETA Can Help Strengthen Your Treatment.［オンライン］:http://www.perjeta.com/patient/aboutで利用可能［2013年9月17日にアクセスした］）。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の異なるドメインを標的にし、トラスツズマブと異なる作用機序を有する。特に、ペルツズマブはＨＥＲ２二量体化インヒビターであり、ＨＥＲ２が他のＨＥＲ受容体（EGFR/HER1、HER3及びHER4）と対合することを防ぐ。Ｋａｄｃｙｌａ（商標）（ado-トラスツズマブエムタンシン、T-DM1）は、抗体−薬物コンジュゲートであり、細胞毒性薬剤メルタンシン（DM1）に連結されたトラスツズマブを含み、分裂細胞における微小管の集合を乱して細胞死をもたらし、トラスツズマブ及びタキサン化学療法による治療をこれまでに受けたことがある患者における転移性乳がんの治療用として承認されている（Genentech、How Kadcyla（商標）（ado-trastuzumab emtansine） is Believed to Work （Proposed Mechanism of Action）.［オンライン］:http://www.gene.com/media/product-information/kadcyla-moaで利用可能［2013年9月17日にアクセスした］）。

Ｔｙｋｅｒｂ（商標）（ラパチニブ）は、ＨＥＲ２とＥＧＦＲの両方の触媒作用を遮断する小分子キナーゼインヒビターである。それは、閉経後女性におけるＨＥＲ２陽性、ホルモン受容体陽性、転移性乳がんの治療用としてＦｅｍａｒａ（商標）（レトロゾール）との併用で、並びにアントラサイクリン、タキサン及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を含めた療法をこれまでに受けたことがある患者における進行性又は転移性ＨＥＲ２陽性乳がんの治療用としてＸｅｌｏｄａ（商標）（カペシタビン）との併用で承認された（米国食品医薬品局、Highlights of Prescribing Information.［オンライン］:http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/022059s007lbl.pdfで利用可能［2013年9月28日にアクセスした］）。更なる薬物が、臨床開発中である。

承認されたＨＥＲ２特異的療法は、ＨＥＲ２陽性乳がん及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）の標準的な治療を改善したが、これらの薬物に対する内因的又は後天的な抵抗性により、著しく満たされない医学的な必要性が存在する。ＨＥＲ２陽性乳がんに対するトラスツズマブの標準的治療状態にもかかわらず、補助療法の状態からの患者の２０〜５０％及び単剤療法の状態からの患者のおよそ７０％が、トラスツズマブに対する抵抗性を発症するようになる（Wolff et al.、2007；及びHarris et al.、2007）。

がん療法において、バイオマーカーとして、がんの根底にある遺伝的又は分子的機構の評価に基づく治療のための患者の選択へ向かう新たな傾向がある。特定のがんに関連性があると判明しているバイオマーカーに基づいた診断試験が、特定のがん療法による治療に感受性の患者を同定するためにＦＤＡによって承認された。２０１３年５月１５日までに、コンパニオン診断としても公知のそのような診断試験がＦＤＡによって承認され（Genetic Engineering and Biotechnology News, 2013, Companion Diagnostics: 52 Pick-Up.［オンライン］:http://www.genengnews.com/insight-and-intelligenceand153/companion-diagnostics-52-pick-up/77899813/で利用可能［2013年9月28日にアクセスした］）、他の様々な試験が開発中である。例えば、ｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ（商標）ＫＲＡＳ試験は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）により治療すべき野生型ＫＲＡＳ遺伝子を持つＥＧＦＲ陽性転移性結腸直腸がんを有する患者を同定するＥＧＦＲ免疫組織化学試験である。ＤＡＫＯ Ｃ−ｋｉｔ ＰｈａｒｍＤｘ免疫組織化学試験は、グリベック（イマチニブ）による治療に感受性のｃ−ｋｉｔ陽性消化管間質腫瘍の患者を同定する。免疫組織化学試験Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ（商標）及びＨｅｒ２ ＦＩＳＨ ＰｈａｒｍＤｘ Ｋｉｔ（商標）など、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）による治療のためのＨＥＲ２陽性腫瘍の同定用としていくつかの診断試験（Hamburg and Collins、2010）も承認されており、これらは一般に一緒に使用される。ＨＥＲ２陽性腫瘍の免疫組織化学用の更なる市販のキットには、Ｏｒａｃｌｅ（Leica Biosystems）及びＰａｔｈｗａｙ（Ventana）がある。治療に対する臨床応答を予測するバイオマーカーを同定するための前臨床及び臨床研究の取り組みは、結腸直腸がん、卵巣がん及びその他を含めた「非伝統的な」ＨＥＲ２＋がんを持つ追加の患者を同定する潜在性も有し、その患者はＨＥＲ２標的療法から利益を得る可能性がある（Gun et al.、2013）。

ＨＥＲ２を過剰発現する又はＨＥＲ２遺伝子を増幅する腫瘍の悪性の性質により、ＨＥＲ２増幅状態は、疾患転帰についての益々重要な予測因子になり、そのため広く試験される。ＨＥＲ２特異的生物学的治療薬による治療に感受性である可能性のあるＨＥＲ２陽性腫瘍は、免疫組織化学（IHC）を使用することにより第一に通常同定される。患者からのサンプルは、サンプル中の染色された腫瘍細胞のパーセンテージと同時に染色の強度を反映するスコア化システムを使用して半定量的な方式で評価される。ＨＥＲ２発現又は過剰発現のレベルが測定され、強い完全な膜染色に３＋のスコアを与えることによってスコアが判定され、強陽性又は明確であるとみなされる。弱〜中等度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％より多くで観察され、２＋のスコアに判定され、弱陽性又は疑わしいとみなされる。膜染色がわずかであり、それが腫瘍細胞の１０％未満である場合、又は不完全な場合、サンプルは１＋／０のスコアに判定され、ＨＥＲ２陰性とみなされる。ＩＨＣ分析において３＋を記録するそれらの腫瘍は、即ち腫瘍細胞表面にＨＥＲ２タンパク質の強い過剰発現がある場合、ＨＥＲ２特異的療法による治療の可能性について臨床医に報告される。

ＩＨＣは半定量的であり、ＨＥＲ２タンパク質の細胞表面過剰発現を測定するだけなので、不正確である可能性があり、正確な測定値を必ずしも提供しない。特に、ＩＨＣによりＨＥＲ２発現について弱陽性の腫瘍、即ち分析においてスコア２＋を達成する腫瘍を正しく同定することは、困難な場合がある。そのような腫瘍のＨＥＲ２の状態を明確化するために、サンプルを、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（FISH）による更なる試験に供して、腫瘍サンプル中のＨＥＲ２遺伝子増幅のレベルを確定する。ＦＩＳＨを実行するための様々な方法が公知である。ＨＥＲ２遺伝子コピー数をＣＥＰ１７などの内部対照と比較する方法において、ＦＩＳＨスコアが２未満である、換言すればＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比が２未満である場合、ＨＥＲ２遺伝子状態は非増幅であると言われ、腫瘍はＨＥＲ２陰性とみなされる。ＦＩＳＨスコアが２以上である場合、ＨＥＲ２遺伝子状態は増幅していると言われ、腫瘍はＨＥＲ２陽性とみなされ、ＨＥＲ２特異的療法による治療の可能性について臨床医に報告される。

しかしながら、ＨＥＲ２陽性腫瘍に対するこれら複数の層の試験にもかかわらず、ＨＥＲ２陽性と同定される腫瘍の全てが、現在のＨＥＲ２特異的療法に応答性であるというわけではない。したがって、ＨＥＲ２陽性腫瘍の患者の治療、並びにそのような療法から利益を得る可能性がある患者を同定する手段の必要性が当技術分野に残されている。加えて、上述の通り、トラスツズマブなどＨＥＲ２に対する公知の療法に対する後天的な抵抗性は、そのような抵抗性ＨＥＲ２陽性がんを治療するのに適切な療法の必要性が当技術分野にあることを意味する。

高い親和性でＨＥＲ２に結合する例えば修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗原結合Ｆｃフラグメント（Fcab（商標）とも称される［抗原結合を持つＦｃフラグメント］）については、ＷＯ２００９／１３２８７６Ａ１及びＷＯ２００９／０００００６Ａ１に記載されている。そのようなＦｃａｂは、マウスにおいておよそ６０時間の半減期など、好ましい特性を有することが示された。

本発明者らは、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを使用して、腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つがんを治療できることを発見した。本発明者らは、そのような特異的結合メンバーを使用して、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つがんを治療できることも発見した。特に、そのような特異的結合メンバーを使用して、トラスツズマブ単剤療法又はトラスツズマブによるペルツズマブとの併用治療など、公知のＨＥＲ２特異的治療による治療に対して抵抗性のがんを治療できる。

上で説明した通り、ＨＥＲ２はいくつかの異なるがんにおいて発現されることが公知である。乳がんは、恐らく最もよく研究されたＨＥＲ２陽性がんなので、ＨＥＲ２を発現することが公知の他のがんより多くのデータが利用可能である。大部分のデータは、ＩＨＣスコア３＋を有する腫瘍について利用可能である。Ｈｏｆｆら（２００２）は、全乳がん患者の８％が１０以上の遺伝子コピー数を有することを確認した。最大の、トラスツズマブの補助乳がん臨床試験（HERA臨床試験）では、ＦＩＳＨにより２０７１名（６１％）の患者において腫瘍の遺伝子コピー数が評価された。それらの患者のうち、１０以上の遺伝子コピー数が、患者の約６５％において同定された。これは、全乳がん患者の約１３％を表す（Dowsett et al.、2009）。いくつかの臨床試験においてＨＥＲ２遺伝子のコピー数が研究されてきたが、これらのがんにおいて対応するＨＥＲ２ ｍＲＮＡのレベルに関する情報は殆ど利用できない。しかしながら、細胞中の遺伝子コピー数の増加はその遺伝子のより大きい発現、それ故その遺伝子にコードされるｍＲＮＡレベルの増加をしばしばもたらすことが公知である。結果的に、腫瘍細胞当たり高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（即ち１０以上）を持つがん患者は、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルも有すると予想される。

したがって、腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２ ＧＣＮのがんを患う患者が相当数おり、その患者は、特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー、又はＨＥＲ２に対する結合についてそのような特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーによる治療から利益を得る。同じことが、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルのがんを患う患者に適用される。

本発明者らは、本明細書に開示するように、遺伝子コピー数は特異的結合メンバーによる治療を予測し、以前に承認されているＨＥＲ２特異的治療トラスツズマブによる治療を予測しないことを示した。

腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を有する患者のがんを治療する方法で使用するための特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー、及びＨＥＲ２に対する結合についてそのような特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーが本明細書に提供される。

高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有する患者のがんを治療する方法で使用するための特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー、及びＨＥＲ２に対する結合についてそのような特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーも本明細書に提供される。

一態様において、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、がんは腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有し、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

本明細書で述べられる患者はヒト患者である。

患者から得た腫瘍サンプルは、腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されていてよい。したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、患者から得た腫瘍サンプルは、腫瘍細胞当たり１０以上の平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されており、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

別法として、本方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含むことができる。

したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーも提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含み、
特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

上で述べた通り、本明細書では用語「ＨＥＲ２遺伝子コピー数」は、腫瘍／がん細胞当たりの平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を指し得る。ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、１０以上でもよい。別法として、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上又は２５以上でもよい。一例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１０より大きい。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１１以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１２以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１３以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１４以上である。更なる例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１５以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１６以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１７以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１８以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１９以上である。別の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は２０以上である。更なる例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は２３以上である。更に他の例において、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は２５以上である。好ましくは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１５以上である。

好ましくは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１０以上であり、遺伝子コピー数は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって確定される。

好ましくは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は１８以上であり、遺伝子コピー数はＦＩＳＨによって確定される。

別の態様において、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、がんは高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

患者から得た腫瘍サンプルは、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有すると確定されていてよい。したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、患者から得た腫瘍サンプルは、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有すると確定されており、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

別法として、本方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含むことができる。

したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーも提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含み、
特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

サンプル中の特定のタンパク質をコードしているｍＲＮＡのレベルは、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）によってサンプル中のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡのコピーを定量的ＰＣＲによって定量化することにより、参照、好ましくはハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡコピーと比較して間接的に測定することができる。参照遺伝子は、多様な組織／サンプル型全体で正常なプロファイルを有し、標準として使用される。本明細書で述べられる腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、好ましくはそれぞれ、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の参照（例えばハウスキーピング）遺伝子のｃＤＮＡコピー数に反映される参照遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較した、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に反映されるＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを指す。ｃＤＮＡコピー数は、ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒ（商標）ソフトウェアバージョン２．０（Life Technologies）、又は当業者に公知の別の同等のソフトウェアを使用して定量的ＰＣＲデータから確定することができる。ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒ（商標）ソフトウェアは、ハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡのコピー数に対するＨＥＲ２ ｃＤＮＡのコピー数の比較サイクル閾値相対定量分析を実行する。任意選択により、ｃＤＮＡコピー数は、細胞当たり２コピーのＨＥＲ２遺伝子を有する又は有すると予想される１０個のヒト細胞系のプールから得られるｃＤＮＡサンプルなど、参照ｃＤＮＡサンプルを参照することによって正規化されてもよい（LifeTechnologies、CopyCaller Softwareユーザーマニュアル）。

したがって、本明細書で述べられる腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、好ましくはそれぞれ、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数に反映される参照遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較して、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に反映される高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを指す。特に、逆転写ＰＣＲを使用して、腫瘍サンプル中のＨＥＲ２又は参照遺伝子ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、次いでｃＤＮＡを、ｑＰＣＲを使用して定量化する。参照遺伝子は、好ましくはハウスキーピング遺伝子である。好ましい例において、参照遺伝子は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（TBP）であるが、他の適切な参照遺伝子も当技術分野において公知である。腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、細胞当たり２コピーのＨＥＲ２遺伝子を有することが公知の対照細胞サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルに対して正規化することができる。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に反映される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、細胞当たり２コピーのＨＥＲ２遺伝子を有することが公知の対照細胞サンプル中のＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定されるＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に反映されるＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルに対して正規化することができる。対照サンプルのＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、好ましくは、対照サンプル中のＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数に反映される参照遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較して、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される対照サンプル中のｃＤＮＡコピー数に反映されるＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルである。参照遺伝子は、好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定するのに使用されたものと同じ参照遺伝子、例えばＴＢＰである。

したがって、本明細書で述べられる腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、好ましくはそれぞれ、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数に反映される参照遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較して、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に反映される高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを指す。腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の７５以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１６８以上、１７０以上、１８０以上、１９０以上、２００以上、２１０以上、２２０以上、２２９以上、若しくは２４８以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の１６８以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の２４８以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の２００以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。より好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較したがん／腫瘍のサンプル中の２２９以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。

上で述べた下限に加えて、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の８２０以下、８５０以下、９００以下、９５０以下、１０００以下、１１００以下、１２００以下、１３００以下、１４００以下、１５００以下、１６００以下、１７００以下、１８００以下若しくは１９００以下のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の８２０以下のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。

好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の２００以上及び８２０以下のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。より好ましくは、腫瘍／がん又は腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、がん／腫瘍のサンプル中の２２９以上及び８２０以下のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数を指し又はそれに対応してもよく、サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数は、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される。

本明細書で述べられるがんは、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）又は子宮内膜がんでもよい。これらのがんの全ては、ＨＥＲ２を過剰発現することが示された。好ましくは、がんは、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳がん又は結腸直腸がんである。より好ましくは、がんは、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は乳がんである。好ましい一実施形態において、がんは胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）である。本明細書で述べられる胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、食道がんを含む。別の好ましい実施形態において、がんは乳がんである。がんのＨＥＲ２遺伝子コピー数は、上で述べた通りである。そのようながんは、ＨＥＲ２陽性（HER2+）又はＨＥＲ２を過剰発現していると称することができる。したがって、本明細書で述べられるがんはＨＥＲ２陽性であることができる。加えて又は別法として、本明細書で述べられるがんは、ＨＥＲ２を過剰発現することができる。上で概説した通り、がんがＨＥＲ２陽性であるかＨＥＲ２を過剰発現するかどうかは、例えば、最初に免疫組織化学（IHC）を使用して、任意選択によりその後のｑＰＣＲなどの方法によって確定することができる。

本発明者らは、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを使用して、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して抵抗性若しくは不応性のがんを治療できることを発見した。がんは、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して内因的に抵抗性若しくは不応性であることがあり、或はトラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して後天的な抵抗性若しくは不応性を有することがある。がんは、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して抵抗性又は不応性の胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）でもよい。別法として、がんは、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して抵抗性又は不応性の乳がんでもよい。がんが、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して抵抗性又は不応性であるかどうかを確定する方法は、当技術分野において周知であり、当業者に明らかであろう。例えば、トラスツズマブによる治療に対して抵抗性の乳がんは、転移療法における化学療法の有無に関わらず、ファーストラインのトラスツズマブ治療の８〜１２週間後若しくは治療後３カ月以内の初回の放射線再評価で進行を、又は補助トラスツズマブの間若しくはその後１２カ月以内に診断される新たな再発を示すことがある。トラスツズマブに対して不応性の乳がんは、初回の放射線評価で疾患の応答又は安定化を当初実現した２つ以上のラインのトラスツズマブ含有レジメン後に疾患の進行を示すことがある（Wong et al.、2011）。

加えて、又は別法として、本明細書で述べられる患者は、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブ治療に対して不十分な応答を呈していてもよい。患者がトラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブにより治療された場合、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブに対する不十分な応答は、腫瘍成長の遅延の欠如、又は不十分な腫瘍成長の遅延を指し得る。別法として、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブに対して不十分な応答を呈した患者は、副作用、特に重篤な副作用など、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に起因する有害作用又は有害事象のため、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療を中止しなければならなかった患者を指し得る。好ましくは、患者がトラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブにより治療された場合、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブに対する不十分な応答は、腫瘍成長の遅延の欠如、又は不十分な腫瘍成長の遅延を指す。開業医は、特定の患者の症例において所与のがん治療が奏効したか又はしなかったか、それ故、続けるべきか又は続けるべきでないかを判断することに熟練しているので、開業医が、所与の患者がトラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブ治療に対して不十分な応答を呈したかどうかを確定することは難しくないであろう。例えば、治療開始時に患者の疾患の負担及び臨床症状が軽い場合、長期間の安定な疾患は良好な臨床状態とみなすことができるが、治療開始時に疾患の負担が高く、臨床症状が重大な場合、安定な疾患は不十分な応答であるとみなすことができる。

用語「特異的結合メンバー」とは、互いに特異的に結合する一対の分子の１メンバーについて記載する。特異的結合メンバーは、天然でも又は部分的若しくは完全に合成で産生されてもよい。特異的結合メンバーは、抗原結合部位を有する分子を通常含む。例えば、特異的結合メンバーは、抗原結合部位を含む抗体分子又はそのフラグメントでもよい。特異的結合メンバーは、修飾された免疫グロブリン様の折りたたみ部分、例えばフィブロネクチンドメイン（¹⁰Fn3ドメイン）を含む分子など、抗原に特異的に結合する非抗体タンパク質骨格であってもよい。標的抗原に対する抗体及び抗体フラグメントを得るための様々な方法が、当技術分野において利用可能である。抗体は、モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体でもよく、当業者に周知の標準的な方法に従って得ることができる。

抗原結合部位を含む抗体フラグメントには、それらに限らないが、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）；一本鎖Ｆｖ分子（scFv）（２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインからなる；Bird et al.［1988］Science、242、423-426；Huston et al.［1988］PNAS USA、85、5879-5883）；二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）；Ｆｖフラグメント（単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる）；ｄＡｂフラグメント（ＶＨ又はＶＬドメインからなる；Ward et al. ［1989］Nature 341、544-546；McCafferty et al.、［1990］Nature、348、552-554；Holt et al.［2003］Trends in Biotechnology 21、484-490）；Ｆｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）；ダイアボディ（遺伝子融合によって構築される多価又は多重特異的フラグメント；ＷＯ９４／１３８０４；Holliger et al.［1993a］、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448）；及び抗原結合Ｆｃフラグメントがある。

抗原結合Ｆｃフラグメントは、Ｆｃフラグメントの定常ドメインの１つ又は複数の構造ループ領域、例えばＣＨ２又はＣＨ３ドメイン中に構築された抗原結合部位を含む。抗原結合Ｆｃフラグメントの調製については、ＷＯ２００６／０７２６２０及びＷＯ２００９／１３２８７６に記載されている。本発明における使用のための特異的結合メンバーは、好ましくは、当技術分野においてＦｃａｂ（商標）とも称される抗原結合Ｆｃフラグメントである、又はそれを含む。より好ましくは、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、抗原結合Ｆｃフラグメントである。特異的結合メンバーは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ抗原結合Ｆｃフラグメントでもよい。最も好ましくは、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、ＩｇＧ１抗原結合Ｆｃフラグメントである。

抗原結合Ｆｃフラグメントは、免疫グロブリン分子に組み込まれてもよい。したがって、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、Ｆｃ領域に抗原結合部位を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ分子でもよい。そのような分子は、好ましくは、分子の可変領域にＣＤＲに基づく第２の結合部位を含み、それ故二重特異的である。特に、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、Ｆｃ領域に抗原結合部位を含むＩｇＧ１分子でもよい。

本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、好ましくは６０ｋＤ以下、より好ましくは５５ｋＤ以下、５４ｋＤ以下又は５３ｋＤ以下の分子量（MW）を有する。本明細書に開示する特異的結合メンバーＨ５６１−４は、およそ５３ｋＤのＭＷを有する。特異的結合メンバーＨ５６１−４は、ＦＳ１０２としても公知である。

本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含む又は含有する。別法として、特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）、ＮＧＱＰＥ（配列番号１３）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する。

本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びアミノ酸配列ＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含む。特に、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、ＡＢループにアミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＣＨ３ドメインのＥＦループにアミノ酸配列ＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含む。好ましくは、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、ＨＥＲ２抗原結合部位は、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含み、配列番号１２は、ＣＨ３ドメインのＡＢループの残基１４〜１８に位置し、配列番号１４は、ＣＨ３ドメインのＥＦループの残基９２〜９８に位置し、残基は、ＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）付番方式に従って付番される。更に好ましい実施形態において、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、ＨＥＲ２抗原結合部位は、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含み、配列番号１２は、残基３８１〜３８５に位置し、配列番号１４は、ＣＨ３ドメインのＥＦループの残基４４０〜４５０に位置し、残基は、ＫＡＢＡＴに従って付番される（Kabat et al.、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services、及びimmuno.bme.nwu.eduで、インターネット上で現在利用可能なその最新版又は任意のインターネット検索エンジンを使用して「Kabat」を検索する）。

本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、好ましくは配列番号１１のＣＨ３ドメインを含む。特異的結合メンバーは、配列番号１０のＣＨ２ドメインを更に含んでもよい。本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、好ましくは配列番号８の配列を含む。より好ましくは、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、配列番号８のポリペプチドの二量体である。例えば、特異的結合メンバーは、２つのポリペプチドからなる二量体など、配列番号８の２つのポリペプチドによって形成される二量体でもよく、各ポリペプチドは、配列番号８（そのような特異的結合メンバーは、本明細書においてH561-4とも称される）に示される配列からなる。

ＣＨ３ドメインのＣ末端リジン（K）又はＣ末端リジンとリジンに隣接する残基（GK）の欠失は、免疫グロブリンの製造の間に起こることが以前に報告されている。このいわゆる「Ｃ末端クリッピング」は、これらのマイクロバリアントに対して機能的意味がない一般的な現象であると考えられている（Beck et al. 2013）。Ｃ末端クリッピングは、Ｈ５６１−４の製造の間に起こる可能性があると予想される。Ｃ末端クリッピングに供される可能性があるＣ末端リジン及びグリシン残基を含むＨ５６１−４ ＣＨ３ドメインは配列番号１１に示されており、以下の略式の配列表に示すように例えば配列番号８にも存在する。

したがって、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、配列番号１１のＣＨ３ドメイン又は１若しくは２つのＣ末端残基（例えばＣ末端リジン又はＣ末端リジン及びグリシン残基）を引いた配列番号１１のＣＨ３ドメインを含んでもよいことになる。本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、配列番号８の配列又は１若しくは２つのＣ末端残基（例えばＣ末端リジン又はリジン及びグリシン残基）を引いた配列番号８の配列を含んでもよい。本明細書では、配列番号８及び１１に対する任意の参照は、１又は２つのＣ末端アミノ酸残基（例えばＣ末端リジン又はリジン及びグリシン残基）を欠いているこれらの配列にも適用されると解釈すべきである。本明細書で述べられるＣＨ３ドメインに対する参照は、１又は２つのＣ末端アミノ酸残基（例えばＣ末端リジン又はリジン及びグリシン残基）を失っているＣＨ３ドメインを包含する。

そのような特異的結合メンバーのバリアントも、本発明において利用できる。例えば、本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、３、２若しくは１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を持つアミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含む又は含有する。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換でもよい。別法として、特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、ＨＥＲ２抗原結合部位は、３、２若しくは１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を持つアミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）、ＮＧＱＰＥ（配列番号１３）、及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する。バリアントは、配列番号８と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むものも含む。改変は、機能喪失を通常もたらさないので、このように改変されたアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーは、ＨＥＲ２を結合する能力を保持することができる。例えば、それは置換が作られていない特異的結合メンバーと同じ親和性でＨＥＲ２を結合できる。

特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー又は上で述べた特異的結合メンバーとＨＥＲ２に対する結合について競合する特異的結合メンバーは、好ましくは、当該特異的結合メンバーの定常ドメインの１つ又は複数、好ましくは２つの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む。より好ましくは、そのような特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１つ又は複数、好ましくは２つの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む。ＣＨ３ドメイン内の構造ループは、残基７〜２１（ＡＢループ）、２５〜３９（ＢＣループ）、４１〜８１（ＣＤループ）、８３〜８５（ＤＥループ）、８９〜１０３（ＥＦループ）、及び１０６〜１１７（ＦＧループ）に位置し、残基はＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）付番方式（ＷＯ２００６／０７２６２０ Ａ１）に従って付番される。更により好ましくは、そのような特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域ＡＢ及びＥＦ中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む。特に、そのような特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの残基１４〜１８及び９２〜９８中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、残基は、ＩＭＧＴ付番方式に従って付番される。残基１４〜１８はＡＢループに位置し、残基９２〜９８はＣＨ３ドメインのＥＦループに位置する。そのような特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーの残基３８１〜３８５及び４４０〜４５０中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよく、残基はＫＡＢＡＴに従って付番される。残基３８１〜３８５はＡＢループに位置し、残基４４０〜４５０はＣＨ３ドメインのＥＦループに位置する。別法として、そのような特異的結合メンバーは、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含んでもよい。ＨＥＲ２に対する結合について上記の特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバーは、好ましくは配列番号８のポリペプチドの二量体である。

２つの特異的結合メンバーが同じ標的、この場合ＨＥＲ２に対する結合について競合するかどうかを決定するための適切な方法は、当技術分野において周知であり、当業者に明らかであろう。そのような方法には、表面プラスモン共鳴（SPR）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）、又は免疫細胞化学を使用する競合方法がある。表面プラスモン共鳴（SPR）法はＢＩＡｃｏｒｅを含む。したがって、表面プラスモン共鳴（SPR）（例えばBIAcore）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）、又は免疫細胞化学を使用して確定される通り、ＨＥＲ２に対する結合について第２の特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーは、ＨＥＲ２に対する結合について第２の結合メンバーと競合する可能性がある。好ましくは、表面プラスモン共鳴（SPR）、例えばＢＩＡｃｏｒｅを使用して確定される通り、ＨＥＲ２に対する結合について第２の特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーは、ＨＥＲ２に対する結合について第２の結合メンバーと競合する。本明細書の実施例１に示すように、トラスツズマブ及びペルツズマブは、ＨＥＲ２に対する結合について特異的結合メンバーＨ５６１−４と競合せず、Ｈ５６１−４は、そのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する。

上記の競合方法の場合、ＨＥＲ２はチップ表面（BIAcore）に、プレート（ELISA）に固定される、又は細胞表面に提示される（ＦＡＣＳ及び免疫組織化学）。次いで、比較しようとする２つの特異的結合メンバーのうちの１つを、ＨＥＲ２抗原を飽和させる濃度で、固定したＨＥＲ２としばらくインキュベートし、それによって、この特異的結合メンバーが結合するＨＥＲ２エピトープを全てブロッキングする。次いで、第２の特異的結合メンバーを、固定したＨＥＲ２とインキュベートする。ＨＥＲ２への第２の特異的結合メンバーの結合は、特異的結合メンバーがＨＥＲ２上の異なるエピトープに結合していることを示すが、第２の結合が固定されたＨＥＲ２に結合しない場合、これは、第２の特異的結合メンバーがＨＥＲ２に対する結合について第１の特異的結合メンバーと競合すること、及び２つの特異的結合メンバーがＨＥＲ２上の同じ（又は重なり合う）エピトープに結合することを示す。

特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上阻害する。特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、Ｈ５６１−４は、ＨＥＲ２に対する結合メンバーの結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上阻害する。特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上阻害し、Ｈ５６１−４は、ＨＥＲ２に対する結合メンバーの結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上阻害する（即ち、競合は両方の方法である）。特定の実施形態において、結合メンバーはＨＥＲ２に対する結合についてＨ５６１−４と競合するが、トラスツズマブともペルツズマブとも競合しない。特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ又はペルツズマブの結合を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又はそれ以下を超えて阻害しない。特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、トラスツズマブ又はペルツズマブは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又はそれ以下を超えて阻害しない。特定の実施形態において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を阻害し、及び／又はＨ５６１−４は、ＨＥＲ２に対する結合メンバーの結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上阻害するが、トラスツズマブ若しくはペルツズマブの結合を阻害せず、及び／又はトラスツズマブ若しくはペルツズマブは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又はそれ以下を超えて阻害しない。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、例えば、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を阻害し、及び／又はＨ５６１−４は、ＨＥＲ２に対する結合メンバーの結合を少なくとも５０％阻害するが、トラスツズマブ若しくはペルツズマブの結合を阻害せず、及び／又はトラスツズマブ若しくはペルツズマブは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を、５０％を超えて阻害しない。別の例において、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって確定される通り、結合メンバーは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を阻害し、及び／又はＨ５６１−４は、ＨＥＲ２に対する結合メンバーの結合を少なくとも９０％阻害するが、トラスツズマブ若しくはペルツズマブの結合を阻害せず、及び／又はトラスツズマブ若しくはペルツズマブは、ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合を、１０％を超えて阻害しない。

本明細書で述べられる特異的結合メンバーは、二量体ＨＥＲ２を結合することができる。特異的結合メンバーは、１ｎＭの親和性又はより高い親和性で二量体ＨＥＲ２を結合することができる。特異的結合メンバーは、単量体ＨＥＲ２と比較して二量体ＨＥＲ２を優先的に結合することができる。好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号８のポリペプチドの二量体と同じ、ＨＥＲ２細胞外ドメイン上のエピトープに結合する。エピトープは、立体配置的、即ち非線形のエピトープでもよい。エピトープは、ＨＥＲ２のドメイン１及び３に跨ってもよい。エピトープは、配列番号１５、１６及び１７を含んでもよく、又はそれらからなってもよい。エピトープは、ＨＥＲ２細胞外ドメインのアミノ酸１３〜２７、３１〜４５及び４２０〜４７５を含んでもよく、又はそれらからなってもよい。別法として、エピトープは、配列番号１５、１６及び１７又はＨＥＲ２細胞外ドメインのアミノ酸１３〜２７、３１〜４５、及び４２０〜４７５の中に位置してもよい。ＨＥＲ２細胞外ドメインの配列を、配列番号１８に示す。

２つの特異的結合メンバーが同じエピトープに結合するかどうかを確定するための方法は、当技術分野において周知であり、当業者に明らかであろう。そのような方法には、Ｐｅｐｓｃａｎ、水素／ジュウテリウム交換質量分析（HDX-MS）、及びＸ線結晶構造解析がある。エピトープマッピング研究において、抗原、この場合ＨＥＲ２を、小さい領域、即ちペプチド又はドメインに分割し、次いで特異的結合メンバーに対する結合について試験してもよい。結合を示す領域を使用して、特異的結合メンバーに結合されるエピトープを推論することができる。２つの異なる特異的結合メンバーに結合する領域の比較を使用して、エピトープを比較することができる。別法として、突然変異を抗原、ここではＨＥＲ２に作製し、次いで特異的結合メンバーに対する結合を試験することができる。結合の消失を引き起こす残基突然変異は、特異的結合メンバーに結合されるエピトープの一部であることが示される。しかしながら、突然変異がＨＥＲ２の構造の全体的な消失を引き起こさないことを確認するための注意を払わなければならない。Ｘ線結晶構造解析において、抗原、ここではＨＥＲ２、及び特異的結合メンバーは、複合体として結晶化される。次いで結晶データを使用して、特異的結合メンバーに結合されるエピトープを確定する。次いで２つの異なる特異的結合メンバーに結合されるＨＥＲ２エピトープを比較することができる。

ＨＥＲ２遺伝子コピー数を確定するための方法は当技術分野において周知であり、当業者に明らかであろう。例えば、ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（FISH）、発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（CISH）、又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を使用して確定できる。先行研究は、一次回帰分析で示すようにＣＩＳＨ及びＦＩＳＨによって確定されるＨＥＲ２ ＧＣＮが高く相関していると報告した（Garcia-Caballero et al.、2010）。更なる研究は、２つの方法によって確定されるＨＥＲ２の増幅状態も、強い相関を有することを実証した（Arnould et al.、2012；Mollerup et al.、2012）。したがって、ＣＩＳＨによって確定されるＨＥＲ２ ＧＣＮは、ＦＩＳＨによって確定されるＧＣＮと類似していると予想される。好ましくは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数はＦＩＳＨを使用して確定される。ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定するための方法は、同様に当技術分野において公知であり、当業者に明らかであろう。例えば、ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）後の定量的ＰＣＲ（qPCR）を使用して確定できる。ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現を、免疫組織化学（IHC）によって測定して、細胞表面で発現しているＨＥＲ２の量を確定できる。

ＦＩＳＨは、蛍光タグ付きプローブを利用して、蛍光顕微鏡観察によって組織サンプル中の特定のＤＮＡ配列を検出する。ＨＥＲ２配列とハイブリダイズする特異的プローブを使用してホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）がん組織標本中のＨＥＲ２遺伝子の増幅を定量的に確定するには、ＦＩＳＨを使用する。ＦＩＳＨを実行してＨＥＲ２ ＧＣＮを確定するためのＦＤＡに承認された様々な方法が存在する（Press et al、2002）。一つの方法において、ＨＥＲ２及び染色体１７の両方の数を測定し、比較して、サンプル中の腫瘍細胞当たりの平均ＨＥＲ２ ＧＣＮを確定する。ＣＥＰ１７プローブ（染色体１７の動原体領域にあるαサテライトＤＮＡ配列に特異的な直接標識蛍光ＤＮＡプローブである、染色体算出プローブ）を、染色体異数性の内部対照としてこの試験に使用できる。ＨＥＲ２遺伝子及びＣＥＰ１７は異なる発蛍光団で標識され、顕微鏡用の特定のフィルターを使用して見ることができる。ＨＥＲ２遺伝子増幅の測定は、顕微鏡観察によって計数されるＨＥＲ２コピー数対ＣＥＰ１７コピー数の比に基づき、それによってＨＥＲ２ ＧＣＮの増加の原因となる染色体１７の異数性が排除される。例えば、比が１０以上である場合、腫瘍／がん細胞当たりの平均ＨＥＲ２ ＧＣＮは１０以上である。したがって、本明細書で述べられる腫瘍／がん細胞当たりのＨＥＲ２又は平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、染色体異数性、特に染色体１７の異数性によるＨＥＲ２遺伝子コピー数のどんな増加も除外できる。別法として、好ましい方法において、全体のＨＥＲ２遺伝子コピー数は、ＣＥＰ１７シグナルに対する正規化なしにＨＥＲ２シグナルの直接計数により確定できる。全体のＨＥＲ２遺伝子コピー数を計数することにより、ＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比に変化をもたらし得る真の多染色体性（染色体全体の複製）よりも一般的に観察される染色体１７の動原体周囲領域の消失又は獲得に起因する偽陽性又は偽陰性結果を回避することができるので、この方法は好ましい（Wolff et al.、2013；Hanna et al.、2014）。更に別の方法として、ＨＥＲ２遺伝子の位置測定のための間接的な方法として、ＦＦＰＥに対しＨＥＲ２プローブだけを使用するＦＩＳＨを実行することができる（Press et al、2002）。

特定の腫瘍についてＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによって得られる遺伝子コピー数は、高く相関すると判明した（実施例９を参照のこと）。したがって、異なる方法によって得られるＧＣＮ値間での転換（例えばＦＩＳＨ及びｑＰＣＲ）が可能である。

患者のがんを治療するための医薬品の製造における、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む特異的結合メンバー、及びＨＥＲ２に対する結合についてそのような特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーの使用も提供され、がんは腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有し、並びに／又はがんは高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有する。

本発明は、患者のがんを治療するための医薬品の製造における、ＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーの使用を更に提供し、がんは腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有し、並びに／又はがんは高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

患者のがんを治療するための医薬品の製造における、ＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーの使用も提供され、患者から得た腫瘍サンプルは、腫瘍細胞当たり１０以上の平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されており、並びに／又は患者から得た腫瘍サンプルは、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有すると確定されており、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

患者のがんの治療のための医薬品の製造における、ＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーの使用が更に提供され、その治療は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含み、
特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

患者のがんの治療のための医薬品の製造における、ＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーの使用も提供され、その治療は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含み、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーである。

別の態様において、本発明は、患者のがんを治療する方法を提供し、がんは、腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有し、その方法は、治療有効量の
ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
を患者に投与することを含む。

患者から得た腫瘍サンプルは、腫瘍細胞当たり１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されていてよい。したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法を提供し、患者から得た腫瘍サンプルは、腫瘍細胞当たり１０以上の平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されており、その方法は、治療有効量の
ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
を患者に投与することを含む。

別法として、本方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含むことができる。

したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法も提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、治療有効量の特異的結合メンバーを患者に投与すること
を含み、特異的結合メンバーは、
ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

別の態様において、本発明は、患者のがんを治療する方法を提供し、がんは高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、その方法は、治療有効量の
ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
を患者に投与することを含む。

別の態様において、本発明は、患者のがんを治療する方法で使用するためのＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、がんは高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、特異的結合メンバーは、
（ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

患者から得た腫瘍サンプルは、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有すると確定されていてよい。したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法を提供し、患者から得た腫瘍サンプルは、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有すると確定されており、その方法は、治療有効量の
ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
を患者に投与することを含む。

別法として、本方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、特異的結合メンバーで患者を治療すること
を含むことができる。

したがって、本発明は、患者のがんを治療する方法も提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定すること；及び
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、治療有効量の特異的結合メンバーを患者に投与すること
を含み、特異的結合メンバーは、
ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
である。

本明細書に記載される特異的結合メンバーは、患者、好ましくはヒト患者の治療方法に使用されるように設計される。特異的結合メンバーは医薬組成物の形態で通常投与され、その医薬組成物は特異的結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含むことができる。したがって、本明細書に記載され、本発明に従って使用するための医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含むことができる。そのような物質は非毒性であるべきであり、有効成分の効力に干渉すべきでない。担体又は他の物質の正確な性質は投与経路によって決まり、その経路は注射、例えば静脈内又は皮下によるものであってよい。特異的結合メンバーは、静脈内又は皮下に投与することができる。

液体医薬組成物は、水、石油、動物性若しくは植物性油、鉱油又は合成油などの液状担体を一般に含む。生理食塩水、ブドウ糖若しくは他の糖類溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。

静脈内注射又は苦痛な部位での注射の場合、有効成分は、非経口的に許容される水溶液の形態とし、その水溶液は発熱性物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する。関連する当業者は、例えば生理食塩液注射、リンゲル注射、乳酸リンゲル注射などの等張性媒体を使用して適切な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤及び／又は他の添加物を利用することができる。医薬製剤を調製するための多くの方法が、当業者に公知である。例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。

本発明によるコンジュゲートを含む組成物は、治療しようとする状態に応じて、単独で、又は並行して若しくは順次他の治療と併用して、又は別の治療薬剤（単数若しくは複数）との混合調製として投与することができる。例えば、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、治療しようとする疾患用の既存の治療薬剤と併用して使用できる。例えば、特異的結合メンバーは、アビラテロン酢酸エステル（ザイティガ）、アファチニブ、アフリベルセプト、アナストロゾール、ベバシズマブ、ビカルタミド、ＢＲＡＦインヒビター、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、ドセタキセル、ペグ化リポソームドキソルビシン、エンザルタミド（イクスタンジ）、エピルビシン、エリブリンメシラート、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、エクセメスタン、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸ、フルオラシル、５−フルオロウラシル、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘッジホッグ経路インヒビター、イリノテカン、イキサベピロン、ラパチニブ、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロレリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合ナノ粒子パクリタキセル、パニツムマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、プレドニゾン、二塩化ラジウムＲａ ２２３（エクソフィーゴ注）、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、Ｓ−１、タモキシフェン、トポテカン、トラスツズマブＤＭ−１、トリプトレリン、又はビノレルビンと併用して投与できる。

投与は、「治療有効量」であってもよく、これは患者に利益を示すのに十分である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも回復であることができる。したがって、指定された疾患の「治療」は、少なくとも１つの症状の回復を指す。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達の部位、コンジュゲートの型、投与の方法、投与の予定及び開業医に公知の他の因子で決まる。治療の処方、例えば用量その他の決定は、一般的な開業医及び他の医師の責任の範囲であり、症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行度によって決まり得る。抗体の適当な用量は、当技術分野において周知である（Ledermann et al.（1991）Int. J. Cancer 47: 659-664；及びBagshawe et al.（1991）Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。投与される医薬品の型に適している、本明細書又はＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）に示される特定の用量を使用できる。特異的結合メンバーの治療有効量又は適切な用量は、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性と動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性とを比較することによって決定できる。マウス及び他の試験動物における有効な用量のヒトへの外挿の方法は、公知である。正確な用量は、治療しようとする領域のサイズ及び位置はどうか、並びに特異的結合メンバーの正確な性質を含めたいくつかの因子によって決まる。治療は、医師の裁量により、毎日、週２回、毎週又は毎月の間隔で反復することができる。治療は、手術の前及び／又は後に行ってもよく、外科的治療の解剖学的部位に直接投与又は適用されてもよい。

別の態様において、本発明は、
（ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
による治療に感受性である患者のがんを同定する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数を確定することを含み、腫瘍細胞当たり１０以上の遺伝子コピー数、例えば平均遺伝子コピー数は、がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示す。

治療に感受性である患者のがんを同定する方法は、（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、当該患者を特異的結合メンバーによる治療に選択することを更に含むことができる。

別の態様において、本発明は、
（ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
による治療に対するがんの応答を予測する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子のＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を確定することを含み、腫瘍細胞当たり１０以上の遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示し、腫瘍細胞当たり１０未満の遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数は、がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性でないことを示す。

治療に対するがんの応答を予測する方法は、
（ｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子コピー数、例えば平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、当該がんを特異的結合メンバーによる治療に選択すること
を更に含むことができる。

別の態様において、本発明は、
（ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
による治療に感受性である患者のがんを同定する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定することを含み、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示す。

治療に感受性である患者のがんを同定する方法は、（ｉｉ）腫瘍サンプルのＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、当該患者を特異的結合メンバーによる治療に選択することを更に含むことができる。

別の態様において、本発明は、
（ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
による治療に対するがんの応答を予測する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定することを含み、腫瘍サンプル中の高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは、がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示す。

治療に対するがんの応答を予測する方法は、
（ｉｉ）腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが高い場合に、当該がんを特異的結合メンバーによる治療に選択すること
を更に含むことができる。

別の態様において、本発明は、ＨＥＲ２に結合する特異的結合メンバーを提供し、特異的結合メンバーは、配列番号８のポリペプチドの二量体である。例えば、特異的結合メンバーは、２つのポリペプチドからなる二量体など、配列番号８の２つのポリペプチドによって形成される二量体でもよく、各ポリペプチドは、配列番号８（そのような特異的結合メンバーは、本明細書においてH561-4とも称される）に示される配列からなる。

本発明の特異的結合メンバーを含む医薬組成物も提供される。医薬組成物は、本発明の特異的結合メンバー及び薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。本発明の特異的結合メンバーをコードする核酸も提供される。好ましくは、核酸は配列番号１の配列を含む又はそれからなる。このヌクレオチド配列は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中での発現用として最適化されているが、当業者が、本発明の特異的結合メンバーをコードする他のヌクレオチド配列を設計するのは難しくないであろう。本発明のベクター又は核酸を含む宿主細胞と同様に、本発明の特異的結合メンバーをコードする核酸を含むベクターも提供される。

本発明は、特異的結合メンバーの産生条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することを含む、本発明の特異的結合メンバーを産生する方法を更に提供する。本方法は、特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することを更に含むことができる。本方法は、特異的結合メンバーを医薬組成物に製剤化することを含むこともできる。

同じ領域における抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４アミノ酸配列（H561-4）と野生型ＩｇＧ１アミノ酸配列（WT）の整列化を示す図である。アミノ酸をＫａｂａｔに従って付番する−Ｋａｂａｔ付番を、整列した配列の上に示す（注：Ｋａｂａｔ付番は、ＩｇＧ１中の残基２９３〜２９４、２９７〜２９８、３１５〜３１６、３５６、３６２、３８０、４０３〜４０４、４０９、４１２〜４１３、４２９、４３１〜４３１がない）。ＡＢループの部分を太字体で示し、ＥＦループの部分を太字体で示し、二重下線を引く。 Ｈ５６１−４が、トラスツズマブ又はペルツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合することを実証する図である。図２Ａは、ＢＩＡｃｏｒｅを使用したトラスツズマブとＨ５６１−４のエピトープ競合の表面プラスモン共鳴（SPR）分析を示す。１０μｇ／ｍｌトラスツズマブ（TR）を３分間注入することにより、１０００ＲＵのＨＥＲ２ ＥＣＤでコーティングしたＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップをトラスツズマブで飽和させ、その後に続けた１０μｇ／ｍｌトラスツズマブの第２の注入は、第１の注入後にＨＥＲ２チップがトラスツズマブで飽和されていることを示した（黒点線）。１０μｇ／ｍｌトラスツズマブを３分間注入することにより、１０００ＲＵのＨＥＲ２ ＥＣＤでコーティングしたＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップをトラスツズマブで飽和させ、その後に続けたＨ５６１−４（１０μｇ／ｍｌ）とトラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）の混合物の第２の注入は、ＨＥＲ２チップがトラスツズマブで飽和されているときに、Ｈ５６１−４がまだ結合可能であることを示した（黒実線）。１０μｇ／ｍｌ Ｈ５６１−４を３分間注入することにより、１０００ＲＵのＨＥＲ２ ＥＣＤでコーティングしたＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップをＨ５６１−４で飽和させ、その後に続けたＨ５６１−４（１０μｇ／ｍｌ）の第２の注入は、第１の注入後にＨＥＲ２チップがＨ５６１−４で飽和されていることを示した（黒破線）。１０μｇ／ｍｌ Ｈ５６１−４を３分間注入することにより、１０００ＲＵのＨＥＲ２ ＥＣＤでコーティングしたＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップをＨ５６１−４で飽和させ、その後に続けたトラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）とＨ５６１−４（１０μｇ／ｍｌ）の混合物の第２の注入は、ＨＥＲ２チップがＨ５６１−４で飽和されているときに、トラスツズマブがまだ結合可能であることを示した（広い黒破線）。 Ｈ５６１−４が、トラスツズマブ又はペルツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合することを実証する図である。図２Ｂは、Ｏｃｔｅｔを使用したペルツズマブ（PE）とＨ５６１−４のエピトープ競合のＳＰＲ分析を示す。ストレプトアビジンコーティングした先端を、ビオチン−ＨＥＲ２中での３０分間のインキュベーションによりロードし、次いでバッファー中で１分間洗浄した。３２５ｎＭペルツズマブの３０分間のインキュベーションにより、ＨＥＲ２をペルツズマブで飽和させ、その後に続けた３２５ｎＭペルツズマブの第２のインキュベーションは、ＨＥＲ２コーティングした先端が第１のインキュベーション後にペルツズマブで飽和されていることを示した（灰色線）。ストレプトアビジンコーティングした先端を、ビオチン−ＨＥＲ２中での３０分間のインキュベーションによりロードし、次いでバッファー中で１分間洗浄した。３２５ｎＭペルツズマブの３０分間のインキュベーションにより、ＨＥＲ２をペルツズマブで飽和させ、その後に続けた３２５ｎＭ Ｈ５６１−４及び３２５ｎＭペルツズマブの第２のインキュベーションは、ペルツズマブで飽和させたＨＥＲ２コーティングした先端がまだＨ５６１−４を結合可能であることを示した（黒線）。 Ｈ５６１−４が、トラスツズマブ又はペルツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合することを実証する図である。図２Ｃは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインにおけるＨ５６１−４の予測される結合領域を示す（黒い標識は貫通ドメイン１及び３）。Ｈ５６１−４の結合エピトープは、Ｐｅｐｓｃａｎ ＣＬＩＰＳ（足場へのペプチドの化学結合）技術を使用して予測された。ＨＥＲ２ドメインをローマ数字で示す。図２Ｃ中の表は、Ｈ５６１−４の結合エピトープのそれぞれに対して予測される直鎖配列を示し、共に結合ポケット貫通ドメイン１及び３に由来する。 Ｈ５６１−４がアポトーシスを誘導し、ＨＥＲ２内部移行及び分解を導くことを実証する図である。図３Ａは、ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理が、細胞の総数及び生細胞のパーセンテージの減少を引き起こしたことを示す。ＰＩ及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色は、Ｈ５６１−４処理後の後期アポトーシス及び壊死細胞の増加を示した。 Ｈ５６１−４がアポトーシスを誘導し、ＨＥＲ２内部移行及び分解を導くことを実証する図である。図３Ｂは、ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理が、総ＨＥＲ２及びリン酸化ＨＥＲ２の減少を引き起こしたことを示す。 Ｈ５６１−４がアポトーシスを誘導し、ＨＥＲ２内部移行及び分解を導くことを実証する図である。図３Ｃは、ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理が、細胞表面ＨＥＲ２及び総ＨＥＲ２の減少を引き起こしたことを示す。Ｈｅｒ２におけるそのような減少は、トラスツズマブ、野生型（WT）抗原結合Ｆｃフラグメント（配列番号１９）又はＩｇＧ１対照（IgG）で処理したＳＫＢｒ３細胞でも、無処理の細胞でも見られなかった。 Ｈ５６１−４がアポトーシスを誘導し、ＨＥＲ２内部移行及び分解を導くことを実証する図である。図３Ｄは、カスパーゼ３／７活性が、ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理によって誘導されるが、トラスツズマブ、ｗｔ抗原結合Ｆｃフラグメント、又はＩｇＧ１対照（ctrl）によるＳＫＢｒ３細胞の処理では誘導されないことを示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ａは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝１５コピー）を持つ胃腫瘍（GXF281）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｂは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝２５コピー）を持つ胃腫瘍（GXA3039）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｃは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝３２コピー）を持つ結腸直腸腫瘍（CXF1991）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｄは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝３５コピー）を持つ結腸直腸腫瘍（CXF2102）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｅは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝７６コピー）を持つ胃腫瘍（GXA3054）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｆは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝２９コピー）を持つ胃腫瘍（GXA3038）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｇは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝２３コピー）を持つ乳房腫瘍（HBCx-13B）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。 １０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４治療の効力を実証する図である。図４Ｈは、高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝４３コピー）を持つ胃腫瘍（GA0060）からのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す。矢印は、治療日を示す。図４Ａ〜Ｈ中のエラーバーは、平均値の標準誤差（SEM）を表す。 ＧＸＦ２８１胃ＰＤＸモデル（細胞当たりＨＥＲ２ ＧＣＮ＝２５）においてＨ５６１−４が、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（TR+PE）抵抗性を克服することを示す図である。マウスは、凡例に挙げた化合物で静脈内治療（i.v.）された（「／」は、第１の治療サイクルの投薬化合物と第２のサイクルのそれとを区切る）。矢印は、投薬予定を示す。移植した腫瘍が平均容積１００ｍｍ^３に達した後に、それらをＴＲ＋ＰＥ併用療法の４回の毎週投与（又は対照としてＨ５６１−４の４回の毎週投与）により治療した。ＴＲ＋ＰＥ治療した腫瘍は、より遅い速度であるが成長し続けた。３３日間の間隔を開けて、第２の投薬サイクルの前にこれら抗体のクリアランスを可能にした。間隔の後に、平均腫瘍容積が５００ｍｍ^３超に達した場合、マウスをＴＲ＋ＰＥ又はＨ５６１−４により毎週再投薬した。エラーバーは、平均値の標準誤差（SEM）を表す。 １０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数（GCN）を持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。 ２００未満のｍＲＮＡレベル（mRNA）を持つＰＤＸモデルと比較した、２００以上のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。 １０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１０より大きいＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｔ／Ｃ値は、最新のＴ／Ｃ方程式を使用して算出した。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。 ２００未満のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルと比較した、２００以上のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｔ／Ｃ値は、最新のＴ／Ｃ方程式を使用して算出した。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。 ＦＩＳＨによって確定した１８未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１８より大きいＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。 １７個のＰＤＸ腫瘍モデルのそれぞれにおいてＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによって確定した遺伝子コピー数の散布図を示す図である。２つの方法で確定したＧＣＮは、相関分析に基づいて高く相関する（ピアソンｒ＝０．９０；ｐ＜０．０００１；９５％ＣＩ＝０．７４〜０．９６）。 ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陰性のＰＤＸモデルと比較した、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陽性のＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す図である。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して独立Ｔ検定によって算出した。

本発明の更なる態様及び実施形態は、以下の実験的な実例を含む本開示を得た当業者にとって明らかになる。

本明細書において使用される場合「及び／又は」は、他の有無にかかわらず２つの指定された特徴又は構成要素それぞれの特定の開示とみなされるべきである。例えば、まさしくそれぞれが本明細書において個々に述べられるかのように、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。

文脈に特段の指示がない限り、上で述べられる特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載されている全ての態様及び実施形態に等しく適用する。

本発明の特定の態様及び実施形態は、実施例によって及び上記の図を参照してここに例示される。

実施例１−Ｈ５６１−４は、トラスツズマブ又はペルツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合する
表面プラスモン共鳴（SPR）を使用して、Ｈ５６１−４が、ＨＥＲ２に対する結合について公知の抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ及びペルツズマブと競合するかどうかを決定した。

トラスツズマブとの競合
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（GE healthcare）を使用して、Ｈ５６１−４がトラスツズマブ（TR）で飽和させたヒトＨＥＲ２コーティングチップに結合できるかどうか、及びその逆も確認した。ＣＭ５チップを、標準アミンカップリングを使用して１０００ＲＵのヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ECD）（BenderMed Systems）でコーティングし、実験を流速２０μｌ／分を使用してＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare）中で実施し、ＨＥＲ２表面を４Ｍ ＭｇＣｌ_２を使用して再生した。第１のＨＥＲ２結合化合物（Ｈ５６１−４又はトラスツズマブ）を、１０μｇ／ｍｌで３分間注入し、次いで第２のＨＥＲ２結合化合物（トラスツズマブ又はＨ５６１−４）を３分間注入し（第２の注入の間の化合物１の解離を避けるために第２の注入を第１の化合物１０μｇ／ｍｌの存在下で実行した）、その後バッファー中で解離させた（図２Ａ）。注入１及び２が同じ化合物であった場合に（トラスツズマブ、続いてトラスツズマブ又はＨ５６１−４続いてＨ５６１−４）、第２の注入で結合が殆ど又は全く観察されなかったことは、両方の場合においてＨＥＲ２結合表面が飽和されたことを示した。下記の表１は、異なる組合せの注入で観察された応答（RU）を示す：

表１は、トラスツズマブで飽和させたＨＥＲ２チップに対するＨ５６１−４の結合応答（２４６ＲＵ）が、裸のＨＥＲ２表面に結合するＨ５６１−４のそれ（２５３〜２５４ＲＵ）と類似していることを示しており、Ｈ５６１−４がＨＥＲ２に対する結合についてトラスツズマブと競合しないことを示す。一連の注入を逆転させた場合、Ｈ５６１−４飽和した表面に対するトラスツズマブの結合応答（７４６ＲＵ）が、裸のＨＥＲ２表面に結合する場合のそれ（７７１〜７９４ＲＵ）と類似しているという点で、同じ結果が見られた。

ペルツズマブとの競合
Ｏｃｔｅｔ（ForteBio）を使用して、Ｈ５６１−４がペルツズマブ（PE）で飽和させたヒトＨＥＲ２コーティングした先端に結合できるかどうか、及びその逆も確認した。全ての工程を、速度論バッファー（ForteBio）中で、１０００ｒｐｍで実施した。ストレプトアビジンコーティングした先端（ForteBio）を５０μｇ／ｍｌビオチン−ＨＥＲ２中で３０分間インキュベーションすることによってコーティングし、次いで先端をバッファー中で１分間洗浄し、次いで３２５ｎＭペルツズマブ中で３０分間インキュベートして全てのペルツズマブ結合部位を飽和させ、次いでＨ５６１−４（３２５ｎＭ）及びペルツズマブ（３２５ｎＭ）の混合物中に直ちに移し、３０分間インキュベートした後にバッファー中で１０分間解離させた。全てのペルツズマブ結合部位がふさがれたことを確認するための対照として、次いで新しい先端を使用して、第１の工程においてペルツズマブ（３２５ｎＭ）を及び第２の工程においてペルツズマブ（３２５ｎＭ）だけを使用する実験を繰り返した（図２Ｂ）。両方の工程がペルツズマブであった場合に、第２の工程で追加の結合が殆ど又は全く観察されなかったことは、ＨＥＲ２結合表面がペルツズマブで飽和されたことを示した。下記の表２は、異なる組合せの注入で観察された応答（RU）を示す：

表２は、ペルツズマブで飽和させたＨＥＲ２チップに対するＨ５６１−４の結合応答（０．４１ＲＵ）が、ペルツズマブの追加の結合応答（０．０４ＲＵ）より有意に大きいことを示しており、Ｈ５６１−４がＨＥＲ２に対する結合についてペルツズマブと競合しないことを示す。

実施例２−ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４の結合の調査
単量体対二量体ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４結合の比較
Ｈ５６１−４は、単量体ＨＥＲ２と比較して二量体ＨＥＲ２に優先的に結合すると判明した。ＥＬＩＳＡに基づく及びＳＰＲに基づく方法を使用して、単量体ＨＥＲ２（タグのないＨＥＲ２の細胞外ドメイン［ECD］）対二量体ＨＥＲ２（Ｆｃタグを持つＨＥＲ２のＥＣＤ、R&D biological）に対するＨ５６１−４の結合を比較した。ＥＬＩＳＡ形式では、ＨＥＲ２をプレート表面上にコーティングし、したがって固定化ＨＥＲ２であり、一方でＢＩＡｃｏｒｅ実験では、Ｈ５６１−４を捕捉し、ＨＥＲ２を分析物として注入し、したがって可溶性ＨＥＲ２であった。

単量体ＨＥＲ２及び二量体ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４結合のＥＬＩＳＡに基づく比較
単量体ＨＥＲ２（タグ無しＨＥＲ２ ＥＣＤ）及び二量体ＨＥＲ２（ＨＥＲ２ ＥＣＤ Ｆｃ−タグ）を、ＰＢＳ中で９６ウェルマキシソーププレート（Nunc）上に２μｇ／ｍｌで、４℃で終夜固定した。プレートを、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ ２００μｌで１時間ブロッキングした。Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ（Roche）を、製品指示書に従ってＩｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅビオチン化キット（#704-0010）を使用してビオチン化した。ビオチン化Ｈ５６１−４又はビオチン化トラスツズマブの希釈系列を、５％ＢＳＡ中に調製した。ブロッキング溶液を除去し、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブの希釈系列１００μｌをプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。希釈系列を除去し、プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（PBST）で３回洗浄した。

Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ（Abcam ab）の１：５０００希釈を５％ＢＳＡ中に調製し、１００μｌをプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ＴＭＢ（Roche）１００μｌを添加し、プレートをＲＴで２分間インキュベートした。２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ １００μｌを使用して反応を停止させ、プレートを４５０ｎＭで読み取った。

トラスツズマブ対照は、単量体及び二量体ＨＥＲ２に対して同じ最大半数有効濃度（EC₅₀）（１．３〜１．５ｎＭ）を有したが、Ｈ５６１−４は、それぞれ１．７ｎＭ及び２０．６ｎＭのＥＣ_５０値に示されるように、単量体ＨＥＲ２と比較して二量体ＨＥＲ２に対して１０倍の選好を有した。ＥＣ_５０は、指定された曝露時間後のベースラインと最大値の中間応答を誘導する結合メンバーの濃度を指す。

単量体ＨＥＲ２及び二量体ＨＥＲ２に対するＨ５６１−４結合のＢＩＡｃｏｒｅに基づく比較
可溶性ＨＥＲ２に対して結合可能になる方向にＨ５６１−４を捕捉するために、抗−ＥＧＦＲ−Ｈ５６１−４ｍＡｂ^２（EGFR/H561-4）を使用した。この分子は、ＣＨ３ドメインにＨ５６１−４の結合ループを含有するように修飾されたＦｃ領域を持つ抗ＥＧＦＲ抗体である。次いでこのＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異的分子を、Ｆａｂ腕内にあるＥＧＦＲ結合特異性を介してＥＧＦＲコーティングしたＢＩＡｃｏｒｅチップに捕捉し、それによりＨＥＲ２結合ＣＨ３ドメインを分析物に曝露したままにした。抗ＨＥＲ２ ｍＡｂトラスツズマブとの比較を可能にするために、類似の二重特異的、トラスツズマブ−ＥＧＦＲ抗原結合Ｆｃフラグメント（TR/EGFR）を構築した。この二重特異的は、ＣＨ３ドメインに抗ＥＧＦＲ抗原結合Ｆｃフラグメントの結合ループを含有するように修飾されたＦｃ領域を持つ抗ＨＥＲ２ ｍＡｂトラスツズマブを含む。ＥＧＦＲ ｍＡｂとＥＧＦＲ抗原結合Ｆｃフラグメントの両方が、ＥＧＦＲに対して類似の結合親和性（１ｎＭ）を有する。ＴＲ／ＥＧＦＲを、ＥＧＦＲ抗原結合ＦｃフラグメントＦｃ領域を介してＥＧＦＲチップ上に捕捉し、それによりＦａｂ腕内のＨＥＲ２結合特異性を分析物に曝露したままにした。

ＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップを、１０００ＲＵのビオチン−ＥＧＦＲで固定した。実験を流速２０μｌ／分を使用してＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare）中で実施した。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異的分子を、１００ｍＭ ｍＡｂ^２ ６０μｌを注入することによって捕捉し、ＥＧＦＲ表面を５０ｍＭ ＮａＯＨを使用して再生した。単量体（自作のタグ無しＨＥＲ２ ＥＣＤ）及び二量体（Ｆｃ−タグ付きＨＥＲ２ ＥＣＤ、R&D）の希釈系列を、分析物として注入した。データを、ラングミュア１：１結合モデルを使用して適合させた。

下記の表３は、データの１：１適合によって得られたＫ_Ｄ値を示す。Ｈ５６１−４は、１０００ｎＭまでの濃度であっても可溶性単量体ＨＥＲ２に対して弱い結合しか示さないが、二量体ＨＥＲ２に対する親和性は１ｎＭである。トラスツズマブは、１ｎＭの親和性で単量体ＨＥＲ２に及びサブｎＭの親和性で二量体ＨＥＲ２に結合する。

Ｐｅｐｓｃａｎを使用する、ＨＥＲ２上のＨ５６１−４エピトープの予測
ＣＬＩＰＳ技術（Pepscan）を使用して、Ｈ５６１−４が細胞外ＨＥＲ２の２つのドメインを跨いで結合することを確認した。これらのドメインは、ドメイン１のアミノ酸１３〜２７（LPASPETHLDMLRHL）及びアミノ酸３１〜４５（CQVVQGNLELTYLPT）にマップされる結合エピトープを持つＨＥＲ２のドメイン１及び３であった。ドメイン３は、アミノ酸４２０〜４７５（SLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTA）のより大きい結合部位を有した。直鎖形成において、これらの３つの異なるエピトープはランダムに見えるが、立体配置的形式で見ると、これらの２つのドメインを貫通する固有の結合ポケットが明らかになる（図２Ｃ）。

直鎖及びＣＬＩＰＳ（足場へのペプチドの化学結合）ペプチドを、標準的なＦＭＯＣ化学を使用して細胞外ＨＥＲ２のアミノ酸配列に基づいて合成し、捕捉剤と共にトリフルオロ酢酸を使用して脱保護した。ＣＬＩＰＳ技術（Timmerman et al.、2007、Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TMtechnology. J MoL Recognit. 20:283-99）を使用して、不自然なペプチドを化学足場上に合成して、立体配置的エピトープを再構築した。ペプチド中の複数のシステインの側鎖を、ＣＬＩＰＳ鋳型の０．５ｍＭ溶液（重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１［ｖ／ｖ］）中の１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン）を用いてクレジットカード形式のポリプロピレンＰＥＰＳＣＡＮカード（４５５個のペプチド形式／カード）上で反応させることによって、ＣＬＩＰＳ鋳型に結合させた。カードを溶液で完全に覆いながら溶液中で３０〜６０分間穏やかに振盪した。最終的に、カードを、過剰のＨ_２Ｏで徹底的に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１パーセントＳＤＳ／０．１パーセント β−メルカプトエタノールを含有する破壊バッファー中で、７０℃で３０分間超音波処理し、その後更に４５分間Ｈ_２Ｏ中で超音波処理した。各ペプチドに対する抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮに基づくＥＬＩＳＡで試験した。共有結合したペプチドを含有する４５５ウェルクレジットカード形式ポリプロピレンカードを、例えばブロッキング溶液、即ちＰＢＳ／１％ Ｔｗｅｅｎ８０中に５％ウマ血清、５％オバルブミン（w/v）に希釈した１マイクログラム／ｍＬからなる一次抗体溶液とインキュベートした。

洗浄後、ペプチドを１：１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ABTS）及び３パーセント １１２０２ ２マイクロリットルを添加した。１時間後に発色を測定した。発色を、電荷結合素子（CCD）、即ちカメラ及び画像処理システムで定量化した（Slootstra et al.、1996、Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries、Molecular Diversity、1、87-96において最初に記載された）。

したがって生データは、ＣＣＤカメラによって得られた光学値であった。値は、大部分が０〜３０００の範囲であり、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ読取機の対数目盛１〜３と類似している。この実験において、得られる値は０〜３８０の範囲であった。

ＣＣＤカメラは、ペルオキシダーゼ発色前のカードの写真を最初に撮り、次いでペルオキシダーゼ発色後に別の写真を撮った。これらの２つの写真を互いから減算し、生データを得た。これをＰｅｐｌａｂｔｍデータベースに複製した。次いで、値をエクセルに複製し、このファイルを生データファイルと呼んだ。１回の追加操作が許された。ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を時々含有し、カードは手作業で検査され、気泡に起因するいかなる値も０とスコア化した。陽性値を結合シグナル（エピトープマップ）として取り込み、ＨＥＲ２の配列にマップした。細胞外ＨＥＲ２タンパク質のコンピュータ生成の図が生成され、陽性結合シグナルがマップされ、抗原結合Ｆｃフラグメントの結合領域を示した（図２Ｃ）。

実施例３−Ｈ５６１−４はアポトーシスを誘導し、固有且つ大きなＨＥＲ２内部移行及び分解を導く
ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞系ＳＫＢｒ３をモデル系として使用して、Ｈ５６１−４の作用機序を確認した。ＳＫＢｒ３細胞系をＡＴＣＣ（HTB-30）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するマッコイ５ａ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Invitrogen）中で培養した。トラスツズマブ（Roche）を、全ての作用機序研究において対照として使用した。

Ｈ５６１−４はＳＫＢｒ３細胞において抗増殖活性を有し、アポトーシスを誘導する
ＳＫＢｒ３細胞を、９６ウェル組織培養プレートにウェル当たり７．５×１０^３個細胞で播種し、ウェル当たり１００μｌ、５％ＣＯ_２、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、処理（Ｈ５６１−４又はトラスツズマブ）を含有する培地２０μｌを添加してＨ５６１−４又はトラスツズマブの濃度希釈系列を得た。細胞を、処理と一緒に５％ＣＯ_２、３７℃で５日間インキュベートした。次いで細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファー（１２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中で最終的に１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Sigma Aldrich、H6024）、２．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（PI）及び１：１００ Ａｌｅｘａ−４８８ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Invitrogen、V13245）の混合物で染色し、室温（RT）で２時間インキュベートした。次いで細胞をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Molecular Devices）で読み込んだ。各ウェル内の細胞数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用して４×倍率で計数した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩ染色を使用して、生細胞（ＰＩで染色されない細胞）、初期アポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖでだけ染色される細胞）、後期アポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩで染色される細胞）並びに壊死細胞（ＰＩでだけ染色される細胞）のパーセンテージを４０×倍率で確認した。試験した最高濃度（３００ｎＭ）で、トラスツズマブによる２２％の減少と比較して、Ｈ５６１−４は細胞数の３７％の減少を引き起こした。加えて、残りのＨ５６１−４処理した細胞のうち、トラスツズマブの場合の７９％と比較してわずか４３％しか生存できなかった。Ｈ５６１−４処理した細胞の場合にだけ、総細胞及び生細胞におけるこの減少は、後期アポトーシス及び壊死細胞の増加と関連した（それぞれ１８％及び３５％）。この実験の結果を図３Ａに示す。

Ｈ５６１−４は、ＨＥＲ２の内部移行及び分解を引き起こす
ＳＫＢｒ３細胞を、３．３×１０^５個細胞／ｍｌで、３ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、培地を、０．１％ＦＢＳを含有する培地に交換し、５％ＣＯ_２、３７℃で少なくとも２時間インキュベートした後、培地を除去し、０．１％ＦＢＳ及び２００ｎＭ処理（Ｈ５６１−４又はトラスツズマブ）を含有する培地と置き換えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で、２４時間、４８時間又は７２時間インキュベートした。次いで溶解物を氷上に採集し：培地を除去し、溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１：１００プロテアーゼカクテル［Calbiochem、539131］、１：１００ホスファターゼカクテル［Calbiochem、524625］）２５０μｌを添加した。次いで細胞をウェル表面からこそぎ取り、２５０μｌを氷上で１５分間インキュベートし、４℃で１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を分析用として採集した。サンプルを、β−メルカプトエタノールを含有するＮｕＰＡＧＥローディングバッファーと混合し、９５℃で１０分間インキュベートし、次いで使用まで−２０℃で保管した。サンプル２０μｌを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ ＰＡＧＥに流し、ニトロセルロース膜に移し、膜を５％Ｍａｒｖｅｌ／ＴＢＳＴでブロッキングし、次いでＨＥＲ２（Cell signalling、#2248）、リン−ＨＥＲ２（Cell Signalling、#2243）又はローディング対照としてα−β−アクチン（Sigma A1978）に対してプローブした。次いで膜を洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートした適当な二次抗体（抗マウス、Jackson ImmunoResearch、又は抗ウサギ、Jackson ImmunoResearch）を添加した。膜を、ＥＣＬ試薬（GE Healthcare、RPN2105）を使用して現像し、画像化した。Ｈ５６１−４処理は、２４時間で総ＨＥＲ２の減少を引き起こし、４８時間及び７２時間で完全に減少した（図３Ｂ）。それに対し、トラスツズマブ処理は、研究時点でＨＥＲ２レベルを検出可能に減少させなかった（図３Ｂ）。Ｈ５６１−４処理は、ｐＨＥＲ２の同時減少も引き起こした。この減少は、２４時間で明白であり、４８時間で更に減少し、７２時間で検出可能なｐＨＥＲ２は残っていなかった。トラスツズマブ処理は、７２時間時点でｐＨＥＲ２のわずかな減少しか引き起こさなかった（図３Ｂ）。

次いで免疫蛍光画像化を使用して、ＨＥＲ２の分解を定量化した。ＳＫＢｒ３細胞を、１ｘ１０^４個細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、処理（Ｈ５６１−４；トラスツズマブ［TR］）又は対照（野生型［WT］抗原結合Ｆｃフラグメント；又はＩｇＧ１アイソタイプ対照、Sigma I5154［IgG/IgG1 ctrl］）を培地に添加し、最終濃度２００ｎＭを得た。

細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間、４８時間又は７２時間インキュベートし、上清を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで２０分間固定した。細胞表面画像化の場合、次いで半分の細胞をＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．１ｍｇ／ｍｌグルコース中で透過化処理して、総タンパク質を画像化した。次いで細胞を洗浄し、５％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で、ＲＴで１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳに１：１００希釈した一次抗体（マウス抗Her2 MGR2、Enzo Life Sciences）とＲＴで１時間インキュベートした。次いで細胞を２回洗浄し、その後５μｇ／ｍｌ二次抗体（抗マウスalexa647、Invitrogen A21237）及び１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Invitrogen、33342）と暗所で、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Molecular Devices）で読み取るまでＰＢＳ中の０．０５％ＮａＮ３中に保管した。分析を４０×画像化で実行し、多重波スコア化機能を使用して細胞核及びＨＥＲ２陽性染色の細胞数を計数し、次いでＨＥＲ２陽性細胞のパーセントを算出した。

２００ｎＭでのＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理により、細胞表面及び総ＨＥＲ２の両方が減少した。ＨＥＲ２レベルの減少は２４時間の処理後に検出可能であり、時点の増加（４８時間及び７２時間）で増加した（図３Ｃ）。対照抗体、トラスツズマブによる処理は、ＨＥＲ２レベルの検出可能な減少をもたらさなかった（図３Ｃ）。

Ｈ５６１−４処理は、カスパーゼ依存的アポトーシスを引き起こす
ＳＫＢｒ３細胞を、７．５×１０^４個細胞／ｍｌで９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌで播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、処理（Ｈ５６１−４、トラスツズマブ、野生型（WT）抗原結合Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ１アイソタイプ対照）をウェルの培地に添加して、最終濃度１０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０１ｎＭ、並びに無処理の対照を得た。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイを使用してカスパーゼ３／７活性を測定する前に、細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃で５日間インキュベートした。Ｃａｓｐａｓｅ ３／７ Ｇｌｏ試薬５０μｌを各ウェルに添加し、混合し、次いでプレートをＲＴで２時間インキュベートした後、Ｓｙｎｅｒｇｙ４マイクロプレートリーダー（BIOTEK）を使用して発光を測定した。

ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理は、カスパーゼ３／７活性の有意な用量依存的誘導をもたらし（図３Ｄ）、対照抗体、トラスツズマブによる処理は、カスパーゼ３／７活性の検出可能な増加をもたらさず、ＷＴ抗原結合Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ１アイソタイプ対照による処理もまた増加をもたらさなかった。

要約すると、上記の結果は、ＳＫＢｒ３細胞のＨ５６１−４処理がアポトーシスを誘導し、ＨＥＲ２の内部移行及び分解をもたらしたことを実証する。

実施例４−ｉｎ ｖｉｖｏ効力研究：１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つヒト患者由来腫瘍異種移植片（PDX）モデルのＨ５６１−４処理
１０以上の遺伝子コピー数を持つＨＥＲ２を発現する腫瘍モデルにおけるＨ５６１−４のｉｎ ｖｉｖｏ効力を、ヒト患者由来異種移植片腫瘍を保有するマウスを使用して判断した。異種移植及びヒト腫瘍の成長を可能にする免疫不全マウスを使用した。およそ６〜８週齢でマウスに移植するＧＡ００６０ ＰＤＸモデルを除いておよそ５〜７週齢でマウスに腫瘍を移植した。ＧＡ００６０作業は、他のＰＤＸモデルに使用した臨床研究組織とわずかに異なる実験手順を使用するＣｒｏｗｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅによって実施された。Ｃｒｏｗｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ実験手順におけるどんな差異も以下で同定される。全ての実験は地方官庁によって承認されており、適用される全ての国際的、国家的並びに現地の法律及びガイドラインに従って行った。申し分ない健康の動物だけを、試験手順に入るように選択した。マウスは、到着後少なくとも７日間、任意の実験の開始前に順化期間を与えられた。本研究において試験腫瘍として使用した腫瘍異種移植片は患者の外科標本から得られ、その移植片をヌードマウスに皮下に直接移植した、それ故に、呼称「患者由来腫瘍異種移植片」（PDX）であった。腫瘍フラグメントは、ヌードマウスの連続継代における異種移植片から得られた。ドナーマウスから除去した後、腫瘍をフラグメントに切断し（直径２〜５ｍｍ又はＧＡ００６０の場合直径２〜４ｍｍ）、次いでマウス横腹への片側の皮下移植に使用した。ランダム化で、担腫瘍動物を腫瘍容積によって様々な群に層化した。適当なサイズ（５０ｍｍ^３〜２５０ｍｍ^３又はＧＡ００６０の場合１００ｍｍ^３〜３００ｍｍ^３）の腫瘍を持っているマウスだけでランダム化を考慮した。

必要な数のマウスがランダム化に適する場合に、マウスをランダム化した。ランダム化の日を、０日目に指定した。投薬の１日目も、０日目であった。腫瘍が２０００ｍｍ^３の容積を超えた場合に、動物を屠殺した。腫瘍細胞量により動物を屠殺した場合、最終観察繰越法（LOCF）を以降の腫瘍容積値に使用した。

ＧＡ００６０ ＰＤＸモデルを除く全てのＰＤＸモデルについて、抗体サンプルをＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。投薬レジメンは、研究に応じて１週間に１回又は１週間に２回のいずれかであった。腫瘍移植の１日後、次いで１週間に２回、絶対腫瘍容積（ATV）を、キャリパーを用いて二次元測定により確定した（即ち、マウスを秤量した同じ日）。腫瘍容積を、公式：（ａ×ｂ^２）×０．５に従って算出し、式中ａは最大の、ｂは垂直の腫瘍直径を表す。特定の日の腫瘍阻害（T/C%）を、試験の平均絶対腫瘍容積値（即ち腫瘍の平均成長）対対照群の比×１００％から算出した。

Ｄａｙｘは、最小の（最適な）Ｔ／Ｃが観察された任意の日を意味する。Ｄａｙ０は、投薬の１日目であった。

ＧＡ００６０ ＰＤＸモデルを除く全てのＰＤＸモデルの場合、実験の間に特定の試験群に対して記録された最小の（又は、最適な）Ｔ／Ｃ％値は、それぞれの治療に対する最大の抗腫瘍効力を表す。群内のランダム化した動物の少なくとも５０％が問題とする日に生存していた場合にＴ／Ｃ値を算出した。

ＧＡ００６０ ＰＤＸモデルの場合、抗体サンプルをＰＢＳ中に６ｍｇ／ｍｌに希釈し、６０ｍｇ／ｋｇで投与した。投薬レジメンは、研究に応じて１週間に２回であった。腫瘍移植の１日後、次いで１週間に２回、絶対腫瘍容積（ATV）を、キャリパーを用いて二次元測定により確定した。腫瘍容積を、公式：（ａ×ｂ^２）×０．５に従って算出し、式中ａは最大の、ｂは垂直の腫瘍直径を表す。特定の日の腫瘍阻害（T/C%）を、試験の平均絶対腫瘍容積値対対照群の比×１００％から算出した。２つのＴ／Ｃ方程式間の差異については、実施例７で説明する。

式中ｘは、群内の動物の少なくとも５０％が生存していた場合、最終用量後のおよその１用量期間である。

簡単にするために、この方程式を、最新のＴ／Ｃ方程式と称することにする。

胃ＰＤＸモデルＧＸＦ２８１におけるＨ５６１−４の効力
ＧＸＦ２８１を、４６歳の男性患者の胃の原発性腺癌から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回５週間注射した。各群は、６匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長８１日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ａ）。５回のＨ５６１−４による週１回の治療により、完全な腫瘍退縮（０％未満の最小Ｔ／Ｃ値）が得られたが、５回のトラスツズマブによる週１回の治療では中等度の効力（３０％の最小Ｔ／Ｃ）しか得られなかった。

胃ＰＤＸモデルＧＸＡ３０３９におけるＨ５６１−４の効力
ＧＸＡ３０３９を、６５歳の男性患者の胃の原発性腺癌から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回４週間注射した。各群は、５匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長９１日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｂ）。４回のＨ５６１−４による週１回の治療により、完全な腫瘍退縮（０％未満の最小Ｔ／Ｃ値）が得られたが、４回のトラスツズマブによる週１回の治療では軽度の効力（８８％の最小Ｔ／Ｃ）しか得られなかった。

結腸直腸ＰＤＸモデルＣＸＦ１９９１におけるＨ５６１−４の効力
ＣＸＦ１９９１を、５９歳の女性患者の結腸の原発性腺癌から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回６週間注射した。各群は、５匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長６２日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｃ）。６回のＨ５６１−４による週１回の治療により、完全な腫瘍退縮（０％未満の最小Ｔ／Ｃ値）が得られたが、６回のトラスツズマブによる週１回の治療では軽度の効力（５７％の最小Ｔ／Ｃ）しか得られなかった。

結腸直腸ＰＤＸモデルＣＸＦ２１０２におけるＨ５６１−４の効力
ＣＸＦ２１０２を、患者の結腸の腺癌の肝転移から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した、この患者の年齢及び性別は公知ではない。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回４週間注射した。各群は、５匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長５８日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｄ）。４回のＨ５６１−４による週１回の治療により、有意な腫瘍退縮（０％未満の最小Ｔ／Ｃ値）が得られたが、６回のトラスツズマブによる週１回の治療は有意な効果を全く引き起こさなかった（７６％の最小Ｔ／Ｃ）。

胃ＰＤＸモデルＧＸＡ３０５４におけるＨ５６１−４の効力
ＧＸＡ３０５４を、６５歳の男性患者の胃の腺癌の原発性腫瘍から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回５週間注射した。４週間の投薬の中断があり、その後週１回の投薬を４週間再開した。各群は、５匹のマウスを含有し、トラスツズマブだけの群は、このモデルに含まなかった。腫瘍容積を最長１００日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｅ）。Ｈ５６１−４による週１回の治療により、腫瘍退縮（１７％の最小Ｔ／Ｃ値）が得られた。

胃ＰＤＸモデルＧＸＡ３０３８におけるＨ５６１−４の効力
ＧＸＡ３０３８を、６３歳の男性患者の胃の腺癌の原発性腫瘍から単離し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ（Freiburg、Germany）によるＮＭＲＩヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に１回５週間注射した。１週間の投薬の中断があり、その後週１回の投薬を４週再開した。各群は、５匹のマウスを含有し、トラスツズマブだけの群は、このモデルに含まなかった。腫瘍容積を最長７７日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｆ）。Ｈ５６１−４による週１回の治療により、軽度の腫瘍退縮（５５％の最小Ｔ／Ｃ値）が得られた。

乳房ＰＤＸモデルＨＢＣｘ−１３ＢにおけるＨ５６１−４の効力
ＨＢＣｘ−１３Ｂを、リンパ転移癌から単離し、Ｘｅｎｔｅｃｈ（Evry、France）による無胸腺ヌードマウス（Hsd；無胸腺Nude-Fox1nu）で研究した。Ｈ５６１−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に２回８週間注射した。各群は、９匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長５６日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｇ）。Ｈ５６１−４による週２回の治療により、有意な腫瘍退縮（７％の最小Ｔ／Ｃ値）が得られたが、６回のトラスツズマブによる週１回の治療では軽度の効力（４８％の最小Ｔ／Ｃ）しか得られなかった。

胃ＰＤＸモデルＧＡ００６０におけるＨ５６１−４の効力
ＧＡ００６０を、ヒト胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）から単離し、Ｃｒｏｗｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Beijing、China）によるＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで研究した。Ｈ５６１−４（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（３０ｍｇ／ｋｇ）及び媒体対照としてＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を、１週間に２回６週間注射し、各群は１０匹のマウスを含有した。腫瘍容積を最長４１日間、１週間に２回測定し、平均絶対腫瘍容積をプロットした（図４Ｈ）。Ｔ／Ｃ値は、最新のＴ／Ｃ方程式を使用して算出した。６回のＨ５６１−４による週２回の治療により、軽度の腫瘍退縮（６０及び３０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ４９％及び６０％のＴ／Ｃ値）が得られたが、６回のトラスツズマブによる週２回の治療では腫瘍退縮（２５％のＴ／Ｃ値）が得られた。トラスツズマブは３０ｍｇ／ｋｇで腫瘍退縮を既に引き起こしたので、６０ｍｇ／ｋｇは試験しなかった。

実施例５−Ｈ５６１−４は、トラスツズマブ及びペルツズマブ抵抗性モデルにおいて効力を示す
上記実施例４で示す通り、Ｈ５６１−４は、１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つ患者由来異種移植片（PDX）モデルにおいて抗腫瘍効果を有する。これらのＰＤＸモデルにおいてＨ５６１−４が、トラスツズマブより有意に優れた抗腫瘍効果を有することも観察された。

病院において、乳がん及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）を治療するためにトラスツズマブは、ペルツズマブと併用してしばしば使用される。胃ＰＤＸモデルＧＸＦ２８１において、トラスツズマブとペルツズマブとの併用治療により、腫瘍成長の減少が得られた。しかしながら、腫瘍は最終的に進行した。トラスツズマブとペルツズマブとの併用治療に対して進行した腫瘍のＨ５６１−４治療により、完全な腫瘍退縮が得られた。これらの結果を、図５に示す。

患者由来腫瘍ＧＸＦ２８１の腫瘍フラグメントを、麻酔したＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した。適切な腫瘍成長（５０ｍｍ^３〜２５０ｍｍ^３腫瘍）があるマウスを、以下の通りに３つの群にランダム化した：
・群１：１０ｍｌ／ｋｇでＰＢＳのｉ．ｖ．注射を１週間に１回、４回受けたマウス５匹。
・群２：１０ｍｇ／ｋｇでトラスツズマブ及び１０ｍｇ／ｋｇでペルツズマブのｉ．ｖ．注射を１週間に１回、４回受けたマウス２０匹。
・群３：１０ｍｇ／ｋｇでＨ５６１−４のｉ．ｖ．注射を１週間に１回、４回受けたマウス５匹

５３日目に群２のマウスの平均腫瘍容積が５００ｍｍ^３に達した場合、群２のマウス（トラスツズマブ及びペルツズマブ併用群）を以下の通りに４つの群にランダム化した：
・群４：更なる治療を受けなかったマウス５匹。
・群５：１０ｍｇ／ｋｇでトラスツズマブ及び１０ｍｇ／ｋｇでペルツズマブのｉ．ｖ．注射を１週間に１回、７回受けたマウス５匹。
・群６：１０ｍｇ／ｋｇでＨ５６１−４のｉ．ｖ．注射を１週間に１回、７回受けたマウス５匹
・群７：３．６ｍｇ／ｋｇでＨ５６１−４のｉ．ｖ．注射を１週間に１回、７回受けたマウス５匹

腫瘍容積を、１週間に２回、１０５日間監視した（図５）。群３は、研究の４６日後にどのマウスにも検出可能な腫瘍が無い完全な腫瘍退縮を示し、研究終了まで（１０５日目）再成長が起こらなかった。群２は、対照群（群１）より遅い腫瘍成長を有した。トラスツズマブ及びペルツズマブによるマウスの反復投薬は、腫瘍成長を更に減速しなかった（群４及び群５は、類似の腫瘍成長を有した）。トラスツズマブとペルツズマブとの併用治療に対して進行したマウスにおけるＨ５６１−４による治療（１０ｍｇ／ｋｇ又は３．６ｍｇ／ｋｇのいずれか）により、有意な腫瘍退縮が得られ、群６の平均腫瘍サイズは、５３日目のＨ５６１−４治療の前の７１６ｍｍ^３と比較して、１０５日目に１９ｍｍ^３であり、群７の平均腫瘍サイズは、５３日目のＨ５６１−４治療の前の６５９ｍｍ^３と比較して、１０５日目に３７．５ｍｍ^３であった。

実施例６−１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つＰＤＸモデルにおいてＨ５６１−４は、腫瘍成長を選択的に阻害する
Ｈ５６１−４のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、２３個の異なる患者由来異種移植片（PDX）モデルで研究し、Ｏｎｃｏｔｅｓｔに使用される基準に従ったＩＨＣによりその全てがＨＥＲ２陽性に分類された。Ｈ５６１−４治療及びトラスツズマブ治療の効力を、最小Ｔ／Ｃ値に基づいて評価し、パーセンテージで表した。Ｔ／Ｃ値を、以下の方程式を使用して算出した：

Ｄａｙｘは、最小の（最適な）Ｔ／Ｃが観察された任意の日を意味する。Ｄａｙ０は、投薬の１日目であった。

表４は、最小Ｔ／Ｃ値（%）によって定義される効力の基準を示す：

定量的ＰＣＲによるＰＤＸ腫瘍モデルにおけるＨＥＲ２遺伝子コピー数の確定：
腫瘍のそれぞれからのＤＮＡを、１００ｎｇ／μｌの初濃度で得て、その後に分子生物学品質の水（SIGMA #W4502-1L）で５ｎｇ／μｌに希釈した。２×Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Invitrogen、#371355）、ＨＥＲ２ ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーセット（Invitrogen、Gene Assay ID: Hs00817646 Cat No:4400291）１μｌ並びにハウスキーピングＲＮＡｓｅＰ ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーセット（Invitrogen、#4403326）１μｌからなるＰＣＲ反応用のマスター混合物を作製した。ｄＨ２０にサンプルＤＮＡ ２０ｎｇを添加して、最終反応容積を２０μｌにした。定量的ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間保ち、その後９５℃で１５秒間次いで６０℃で６０秒間を４０サイクル。生Ｃ_Ｔ（サイクル閾値）データを取得した後に、０．２の手動Ｃ_Ｔ及び自動ベースラインを結果に適用した。

得られた全データを、細胞当たり２コピーあることが公知であるハウスキーピング遺伝子（RNAseP taqmanプローブ及びプライマーセット、Invitrogen、#4403326）によって正規化した。定量的ＰＣＲの結果は、任意の単位（AU、細胞当たりのコピー数に関連する）で表された。最初に、各サンプルについて、ハウスキーピング遺伝子とＨＥＲ２遺伝子の間のＣ_Ｔ値（サイクル閾値）の差異を以下の通り算出した：
標的遺伝子発現＝２^（Ｃ _Ｔ ^{ハウスキーピング遺伝子（ＲＮＡｓｅ Ｐ）−Ｃ} _Ｔ ^{ＨＥＲ２遺伝子）}

結果を線形増幅について分析し、Ｃｏｐｙ Ｃａｌｌｅｒ（商標）ソフトウェアバージョン２．０（Invitrogen）にエクスポートして、ＨＥＲ２遺伝子のコピー数を確定した。２コピーのＨＥＲ２を有することが判明しているＤＮＡ参照サンプル（ＨＥＲ２遺伝子とハウスキーピング遺伝子のＣ_Ｔ値が等しく、細胞当たり２コピーのＨＥＲ２であることを示す）（Roche、#11691112001）をアッセイに含めて、正確なコピー数の確定を可能にし、アッセイの動作中調整を可能にした。２ＡＵを、参照ゲノムＤＮＡにおけるＨＥＲ２遺伝子の正常値であるとみなした。ヒト標準ゲノムＤＮＡに対して得られるコピー数が厳密に２ＡＵでない場合、それを２ＡＵに変換するために乗数を適用した。この乗数を、腫瘍サンプルに対して得られる結果にも適用した。各サンプルに対する遺伝子コピー数を表５に挙げる。

表５は、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ治療を受けたＰＤＸモデルの最小Ｔ／Ｃ値（%）並びに試験した各ＰＤＸ腫瘍サンプルにおける遺伝子コピー数（GCN）によって定義される効力を示す：

Ｈ５６１−４は、１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数（GCN）を持つ７つのＰＤＸモデル中６つで効力があったが、１０未満のＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルのうち２つは境界線上の活性しかなかった。トラスツズマブは、１０以上のＧＣＮを持つ２つのＰＤＸモデルにおいて中等度の活性、及びもう１つで境界線上の活性を有した。１０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおいて、トラスツズマブは、３つのＰＤＸモデルにおいて境界線上の活性、及び別の３つのモデルにおいて中等度の活性を有した。図６は、１０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１０以上のＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。散布図は、Ｈ５６１−４が、１０未満のＧＣＮを持つがんと比較して、１０以上のＧＣＮを持つがんにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。トラスツズマブ活性は、ＨＥＲ２遺伝子コピー数値から独立している。

逆転写（RT）ＰＣＲ後の定量的ＰＣＲによるＰＤＸ腫瘍モデルにおけるｍＲＮＡレベルの確定：
腫瘍のそれぞれからのｍＲＮＡを、２５０ｎｇ／μｌの濃度で得た。ｍＲＮＡを、製造業者の指示の通りにＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Invitrogen、#N8080234）を使用して逆転写した。次いで転写したｃＤＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Thermo Scientific）を使用して定量化し、ｃＤＮＡ濃度をｎｇ／μｌで確定した。得られたｃＤＮＡを、分子生物学品質の水（SIGMA #W4502-1L）に２５ｎｇ／μｌに希釈した。２×Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Invitrogen、# 4369016）、ＨＥＲ２ ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーセット（Invitrogen、Hs01001580_m1 #4331182）１．２５μｌ並びにハウスキーピングヒトＴＢＰ ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーセット（Invitrogen、Hs00427620_m1 #4331182）１．２５μｌからなる定量的ＰＣＲ反応用のマスター混合物を作製した。サンプルｃＤＮＡ ５０ｎｇをｄＨ_２Ｏとともに添加し、最終反応容積２５μｌを作製した。定量的ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間保ち、その後９５℃で１５秒間次いで６１℃で３０秒間を５０サイクル。生Ｃ_Ｔ（サイクル閾値）データを取得した後に、０．２の手動Ｃ_Ｔ及び自動ベースラインを結果に適用した。

細胞当たり２コピーのＨＥＲ２遺伝子を有すると予想される（細胞系は正常なプロファイルを有するとみなすので）１０種のヒト細胞系をプールすることによって作製される「汎用ヒト参照ＲＮＡ」（Agilent technologies、#740000）から逆転写した「ヒト標準ｃＤＮＡ」を、腫瘍サンプルｃＤＮＡと同じ濃度で参照として使用した。このヒト標準ｃＤＮＡは、正常ｍＲＮＡプロファイルを有するとみなす。

得られた全データを、多くの組織型にわたって一定の発現レベルを有することが公知であるハウスキーピング遺伝子（ハウスキーピングヒトTBP taqmanプローブ及びプライマーセット（Invitrogen、Hs00427620_m1 #4331182））によって正規化した。定量的ＰＣＲの結果は、任意単位（AU）で表された。最初に、各サンプルについて、ハウスキーピング遺伝子とＨＥＲ２遺伝子の間のＣ_Ｔ値（サイクル閾値）の差異を以下の通り算出した：
ＨＥＲ２発現＝２^（Ｃ _Ｔ ^{ハウスキーピング遺伝子（ＴＢＰ）−Ｃ} _Ｔ ^{ＨＥＲ２遺伝子）}

結果を線形増幅について分析し、Ｃｏｐｙ Ｃａｌｌｅｒ（商標）ソフトウェアバージョン２．０（Invitrogen）にエクスポートした。このソフトウェアを使用して、腫瘍サンプル中のハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡコピー数に対するＨＥＲ２のｃＤＮＡコピー数を確定し、ヒト標準ｃＤＮＡサンプル中のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に対して正規化した。

ヒト標準ｃＤＮＡ中のハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡコピー数に対するＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数について２ＡＵが正常値になるように設定することによって正規化を実行した。それを２ＡＵに変換するために乗数（定数）を適用した。この乗数（定数）を、腫瘍サンプルに対して得られる結果にも適用し、得られたｃＤＮＡコピー数をｍＲＮＡレベルとして表６に挙げる。
即ち、標準ｃＤＮＡのＨＥＲ２発現×定数＝２
腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２発現×定数＝ｃＤＮＡコピー数

ここで定数は、２の値になるように、標準ｃＤＮＡ中のＨＥＲ２発現を正規化するのに使用される乗数である。

表６は、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ治療を受けたＰＤＸモデルの最小Ｔ／Ｃ値（%）並びにＰＤＸ腫瘍サンプルのそれぞれに対するＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルによって定義される効力を示す。

Ｈ５６１−４は、腫瘍中に≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つ７つのＰＤＸモデル中６つで効力があり、腫瘍中に≧２００及び≦８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルの全てで効力があったが、腫瘍中に＜２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルのうち２つは境界線上の活性しかなかった。ｍＲＮＡレベル≦８２０を有するそれらのモデルにおけるＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは１６８であったが、試験した全てのモデルの場合ＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルは２４８であった。トラスツズマブは、≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つ２つのＰＤＸモデルにおいて中等度の活性、及びもう１つで境界線上の活性を有した。＜２００のｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおいて、トラスツズマブは、３つのＰＤＸモデルにおいて境界線上の活性、及び別の３つのモデルにおいて中等度の活性を有した。図７は、腫瘍中に２００未満のｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルと比較した、腫瘍中に２００以上のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。これは、Ｈ５６１−４が、＜２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つがんと比較して、≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つがんにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。特に、データは、Ｈ５６１−４が、＜２００及び＞８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルと比較して、≧２００及び≦８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つがんにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。トラスツズマブ活性は、試験範囲においてＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルから独立している。

実施例７−Ｔ／Ｃ値の最新の測定を使用して１０以上のＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つＰＤＸモデルにおいてＨ５６１−４は、腫瘍成長を選択的に阻害する。
Ｈ５６１−４治療及びトラスツズマブ治療の効力を、Ｔ／Ｃ値を算出するための異なる方程式を使用して更に評価した。

Ｔ／Ｃ値を、以下の方程式を使用して算出した：

式中ｘは、群内の動物の少なくとも５０％が生存していた場合、最終用量後のおよその１用量期間である。

上記の実施例４で示すように、この方程式は、最新のＴ／Ｃ方程式と称される。この最新の方程式は、異なる臨床研究機関から収集したデータの比較を容易にするように設計された。

実施例６において使用したＴ／Ｃ方程式と比較して、最新のＴ／Ｃ方程式に２つの変更を導入した：Ｄａｙｘとして比較するための時点を定義し、基準減算を除去する。

以前に使用されたＴ／Ｃ公式において、Ｄａｙｘは、最小の（最適な）Ｔ／Ｃが観察された任意の日を意味した。したがって、ｘは、各実験の全ての期間にわたる任意の日であることができる。最新のＴ／Ｃ方程式において、Ｄａｙｘは最終用量後のおよそ１用量期間の一定の時点になる（群内の動物の少なくとも５０％が生存していた場合）。したがって、最新のＴ／Ｃ公式は、Ｄａｙｘを標準化するという長所を有し、それにより異なる研究からの治療の効果を比較することが可能になる。最新のＴ／Ｃ方程式には基準減算工程が含まれなかったが、これを、異なる試験群間で等しい平均腫瘍サイズを得るために、均一に植え付けたマウスのランク付け分布によって補償した。腫瘍細胞量のため除去したマウスからの値が群平均を増加させた場合、この値を、最終観察繰越法を使用して屠殺日を超えているとみなした。

この最新の方程式を使用して、表５及び６に記した２３個の異なる患者由来異種移植片（PDX）モデルのＴ／Ｃ値を再評価し、ＨＥＲ２遺伝子コピー数（GCN）と一緒に表７に並びにＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルと一緒に表８に要約した。Ｔ／Ｃ効力値を表４に示すように確定した。

更に、トラスツズマブによる胃ＧＸＡ３０５４及び胃ＧＸＡ３０３８ ＰＤＸモデルの治療に関連してデータを得て、この情報も表７及び８に含めた。

表７は、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ治療を受けたＰＤＸモデルのＴ／Ｃ値（%）（最新のＴ／Ｃ公式を使用する）によって定義される効力を示す。

Ｈ５６１−４は、１０より大きいＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つ８つのＰＤＸモデル中７つで効力があり、そのうち６つは高い活性を有したが、１０未満のＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルの全てで活性はなかった。トラスツズマブは、１０より大きいＧＣＮを持つ３つのＰＤＸモデルにおいて中等度の活性を、別の３つにおいて境界線上の活性を有したが、そのいずれも高い活性を示さなかった。１０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおいて、トラスツズマブは、１つのモデルにおいて境界線上の活性を有した。

図８は、１０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１０より大きいＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。散布図は、Ｈ５６１−４が、１０未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較して、１０より大きいＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。１０より大きい又は小さいＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるトラスツズマブの平均活性が、両方とも５０％より高いことは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数値がトラスツズマブの効力を予測しないという見解を裏づける。

要約すると、最新のＴ／Ｃ方程式を使用して得られるＴ／Ｃ値は、以前と同じ結論を導いた（実施例６に記載される）。

表８は、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ治療を受けたＰＤＸモデルのＴ／Ｃ値（%）によって定義される効力を示す（最新のＴ／Ｃ公式を使用する）。

Ｈ５６１−４は、腫瘍中に≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つ８つのＰＤＸモデル中７つで効力があり、腫瘍中に≧２００及び≦８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルの全てで効力があったが、腫瘍中に＜２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルの全てで活性はなかった。トラスツズマブは、≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つ３つのＰＤＸモデルにおいて中等度の活性を、別の３つにおいて境界線上の活性を有したが、そのいずれも高い活性を示さなかった。＜２００のｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおいて、トラスツズマブは、１つのモデルにおいて境界線上の活性を有した。

図９は、腫瘍中に２００未満のｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルと比較した、腫瘍中に２００以上のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。散布図は、Ｈ５６１−４が、＜２００及び＞８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルと比較して、≧２００及び≦８２０のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを持つＰＤＸモデルにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。≧２００のＨＥＲ２ ｍＲＮＡの群及び＜２００の群のＰＤＸモデルにおけるトラスツズマブの平均活性が、両方とも５０％より高いことは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数値がトラスツズマブの効力を予測しないという見解を裏づける。

最新のＴ／Ｃ方程式を使用して得られるＴ／Ｃ値は、以前と同じ結論を導いた。

実施例８−遺伝子コピー数がＦＩＳＨによって確定される場合、Ｈ５６１−４は、１８より大きいＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つＰＤＸモデルを選択的に阻害する
Ｈ５６１−４のｉｎ ｖｉｖｏ活性に照らしてＦＩＳＨによって確定したＨＥＲ２遺伝子コピー数を、乳房、胃、結腸モデルを含めた１７個の異なる患者由来異種移植片（PDX）モデルで研究した。Ｈ５６１−４治療及びトラスツズマブ治療の効力を最新のＴ／Ｃ方程式を使用してＴ／Ｃ値に基づいて評価した：

Ｔ／Ｃ値によって定義した効力の基準を、表４に記す。

蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（FISH）による、ＰＤＸ腫瘍モデルにおけるＨＥＲ２遺伝子コピー数の確定：
ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）がん組織標本をＰＤＸモデルから得た。ＦＩＳＨアッセイは、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ−２ ＤＮＡプローブキットＩＩ（Abbott Molecular #06N46-030）を使用して実行した。このアッセイは、ＣＥＰ１７シグナルに対する正規化なしにＨＥＲ２シグナルの直接計数を使用した。組織スライドを前処理して、キシレン中で５分間、３回、脱パラフィンし、それに続き産業用メタノール変性アルコール（IMS）中で５分間、２回再水和し、９５〜９９℃で３０分間クエン酸バッファーｐＨ６．０のインキュベーションをした。前処理後に、スライドを、プロテアーゼ消化のためにペプシンプロテアーゼバッファー中で、３７℃で２０分間インキュベートした。標的ＨＥＲ２ ＤＮＡ配列を効果的にマーキングする場合、ＤＮＡ変性のためにスライドを７３℃に５分間加熱し、その後３７℃で１４〜１８時間プローブハイブリダイゼーションさせた。非特異的なハイブリダイゼーション事象を、後ハイブリダイゼーションバッファー中で、７２℃で２分間洗い流した。次いでスライドを、シグナル算出のために蛍光顕微鏡観察を使用して見るまで暗所でＤＡＰＩ対比染色剤と１５分間インキュベートした。算出は、サンプル当たり２０〜６０個の腫瘍細胞に基づいて判断し、ＨＥＲ２遺伝子コピー数の平均を取った。各サンプルについてＦＩＳＨによって確定したＨＥＲ２遺伝子コピー数を、表９に挙げる。

表９は、Ｈ５６１−４及びトラスツズマブ治療を受けたＰＤＸモデルのＴ／Ｃ値（%）並びに試験した各ＰＤＸ腫瘍における遺伝子コピー数（GCN）によって定義される効力を示す：

ＦＩＳＨで確定した通り、Ｈ５６１−４は、１８より大きいＨＥＲ２遺伝子コピー数を持つ８つのＰＤＸモデル中７つで効力を有し、そのうちの６つは高い活性を有したが、１８未満のＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルの全てで活性はなかった。トラスツズマブは、１８より大きいＧＣＮを持つ３つのＰＤＸモデルにおいて中等度の活性を、別の３つにおいて境界線上の活性を有したが、そのいずれも高い活性を示さなかった。１８未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおいて、トラスツズマブは、１つのモデルにおいて境界線上の活性を有した。

図１０は、１８未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較した、１８より大きいＨＥＲ２ ＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。散布図は、Ｈ５６１−４が、１８未満のＧＣＮを持つＰＤＸモデルと比較して、１８より大きいＧＣＮを持つＰＤＸモデルにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。トラスツズマブ活性は、ＨＥＲ２遺伝子コピー数値から独立している。１８より大きいＧＣＮを持つ群又は１８未満を持つ群のＰＤＸモデルにおけるトラスツズマブの平均活性が、両方とも５０％より高いことは、ＨＥＲ２遺伝子コピー数値がトラスツズマブの効力を予測しないという見解を裏づける。

実施例９−ＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによるＨＥＲ２遺伝子コピー数の確定並びにその関係
上記の実施例６及び実施例８に示すように、ＨＥＲ２遺伝子コピー数をｑＰＣＲ及びＦＩＳＨによって確定した。ｑＰＣＲによって確定したＰＤＸ腫瘍中のＨＥＲ２ ＧＣＮは、１〜７６コピー異なり、一方でＦＩＳＨによって確定したこれらの腫瘍中のＧＣＮは、２〜４０コピー異なった。いずれかの方法によって確定した高いＨＥＲ２遺伝子増幅（ｑＰＣＲによる１０以上のＧＣＮ又はＦＩＳＨによる１８以上のＧＣＮ）を持つ腫瘍は、Ｈ５６１−４治療に応答する可能性が統計学的により高い。両方の方法によって収集したデータが利用可能である場合、２つの方法によって確定したＧＣＮの関係を１７個のＰＤＸ腫瘍において評価した。両方の方法によって確定したＨＥＲ２遺伝子コピー数を、表１０に挙げる。

相関分析を行って、ｑＰＣＲによって確定したＨＥＲ２ ＧＣＮとＦＩＳＨによるそれとの関係を定義した。図１１に示す散布図は、各ＰＤＸ腫瘍サンプルにおいてＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによって確定したＧＣＮの関係を示し、斜めの線の近くにある点は、１：１の相関を意味する。２つの方法で確定したＧＣＮは、相関分析に基づいて高く相関する（ピアソンｒ＝０．９０；ｐ＜０．０００１；９５％ＣＩ＝０．７４〜０．９６）。

実施例１０−異なるプロトコールによって確定されるＨＥＲ２ ＩＨＣスコア化の変動調査。
ＨＥＲ２増幅状態を予後因子として使用した。免疫組織化学的（IHC）アッセイは、抗原に特異的に結合する抗体によって組織サンプル中のＨＥＲ２タンパク質発現を判断するために一般に使用される方法である。前記のように、ＩＨＣの半定量的な性質は、それが不正確である可能性があり、正確な測定値を必ずしも提供しないことを意味する。更に、様々なアッセイプロトコール、即ちＨＥＲ２抗体及びスコア化システムが使用されるとすると、ＩＨＣアッセイの提供者間でのＨＥＲ２ ＩＨＣ結果の変動が懸念になりかねない。ハーセプテストは、乳がん及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）におけるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を確認するための標準化されたＩＨＣアッセイとしてＦＤＡによって承認されているが、いくつかの研究において、大部分のハーセプテストＨＥＲ２陽性サンプルが、ＦＩＳＨアッセイによって確定されるＨＥＲ２遺伝子増幅を欠いていると報告されている（Jacobs et al.、1999）。他方で、遺伝子増幅がない場合に乳がんはＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を呈することがあるが、この現象は以前、症例のうち７％でしか観察されなかった（Persons et al.、1997）。これらの矛盾は、ハーセプテスト３＋陽性集団が、増幅されたＨＥＲ２であると考える現在の臨床診療を否定する。

本研究において、ハーセプテスト及びＯｎｃｏｔｅｓｔによって開発された免疫組織化学的アッセイを含めた異なるＩＨＣアッセイを使用して、２２個のホルマリン固定、パラフィン包埋ＰＤＸ腫瘍においてＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を同定した。目的は、Ｈ５６１−４バイオマーカーとしてのＩＨＣの信頼性を調査することであった。

ハーセプテストＩＨＣアッセイの場合、ハーセプテストの製造業者のプロトコールを使用した。簡潔には、ホルマリン固定、パラフィン包埋がん組織を、キシレン中で５分間、３回、脱パラフィンし、それに続き産業用メタノール変性アルコール（IMS）中で５分間、２回再水和した。次いでスライドを、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で、９７℃で４０分間インキュベートし、染色前に洗浄バッファーに２０分間浸漬した。スライドを、抗ヒトＨＥＲ２ウサギ一次抗体と３０分間インキュベートし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに連結した抗ウサギヤギ二次抗体と３０分間インキュベーションした。ＤＡＢ色素原を酵素変換に適用してシグナル可視化した。

Ｏｎｃｏｔｅｓｔによって開発された免疫組織化学的アッセイを、第１に脱パラフィン及び組織の再水和によって実施した。抗原賦活化のために、スライドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−クエン酸ナトリウム中で、７２０ワットのマイクロ波で２０分間インキュベートした。サンプルを０．２％トライトンＸ１００によって透過化処理し、３％Ｈ_２Ｏ_２によってブロッキングして、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。スライドを、１０％ＢＳＡ中で非特異的な結合に対してブロッキングし、抗ヒトＨＥＲ２ウサギポリクローナル抗体（Dako Cat# A0485）と４℃で終夜インキュベートした。翌日スライドを、ビオチン化抗ウサギヤギＩｇＧ（Jackson Cat# 111-065-045）と室温で６０分間インキュベートした。ビオチン化二次抗体を、アビジン／ビオチン化酵素複合体（ABC complex、Vector Lab Cat#PK-4000）とインキュベーションし、続いてＤＡＢ色素原でシグナル発色させることによって検出した。

両方の方法によって米国臨床腫瘍学会（ASCO）スコア化ガイドラインが使用された。簡潔には、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現を、０〜３＋の程度で格付けする。ＨＥＲ２タンパク質発現腫瘍のパーセンテージによって確定される腫瘍組織切片のＩＨＣ染色のレベル及びＨＥＲ２染色の強度を使用して、ＨＥＲ２タンパク質発現をスコア化する。ＩＨＣによるＨＥＲ２のスコア化のためのガイドラインを下記の表１１に示す（２０１３年にＩＨＣ ２＋の評価は、「弱陽性」（２００７ガイドラインに使用されている）から「疑わしい」に更新された）

効力研究において試験した各ＰＤＸ腫瘍に対するハーセプテスト及びＯｎｃｏｔｅｓｔによって開発されたＩＨＣ法によって確定したＨＥＲ２ ＩＨＣ過剰発現スコアを、表１２に挙げる。ハーセプテスト及びＯｎｃｏｔｅｓｔの両方が同じスコア化ガイドラインを使用しているという事実にもかかわらず、２つの異なる染色法によって得られたＨＥＲ２ ＩＨＣ結果は、特にｑＰＣＲによりＨＥＲ２ ＧＣＮ≦１０の腫瘍で、幅広い変動を示した。更に、Ｏｎｃｏｔｅｓｔによって実行される同じ方法の間の反復（ｎ＝１対ｎ＝２）でさえ矛盾を示した。したがって、ＩＨＣは、提供者間及び同じ提供者による複数のアッセイ内でかなり違うことが示される。

ＨＥＲ２陰性症例の数は、Ｏｎｃｏｔｅｓｔによって実行されるＩＨＣと比較して、ハーセプテストによって一層高くなる（両方の方法によって試験した腫瘍について８対２の症例）。他方、ハーセプテストはより高い陽性率をもたらすと報告された（Jacobs et al.、1999）。合わせて、これらの結果は、ＨＥＲ２ ＩＨＣ結果における変動の方向を指す。これまでの研究は、組織固定及び処理における変動並びに抗体感度及び特異性における変動を含めた、ＨＥＲ２タンパク質に対するＩＨＣアッセイの使用において変動をもたらし得る様々な問題について述べている。しかしながら、本研究では両方の方法において同じ抗体を使用したので、一次抗体の特異性が原因である可能性は低い。

総合的なＨＥＲ２ ＩＨＣ結果とＨＥＲ２ ＧＣＮ及びＨＥＲ２ ｍＲＮＡの結果（実施例７及び実施例８）とを比較して、ＦＩＳＨ若しくはｑＰＣＲ法によって確定されるＨＥＲ２ ＧＣＮ又はＨＥＲ２ ｍＲＮＡは、Ｈ５６１−４に対して応答性の患者集団となるバイオマーカー陽性集団の選択において、一層よく予測する（ｐ＜０．０００１；独立ｔ検定）。

図１２は、ハーセプテストによって確定したＨＥＲ２タンパク質過剰発現陰性のＰＤＸモデルと比較した、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陽性のＰＤＸモデルにおけるＨ５６１−４及びトラスツズマブ治療のＴ／Ｃ値の散布図を示す。ハーセプテストは、ハーセプチン治療について患者を選択するためのＦＤＡに承認されたコンパニオン試験（companion test）キットであったが、試験した１６個のサンプルにおいて、トラスツズマブ活性は、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現状態から独立していた（ｐ＝０．０９；独立ｔ検定）。ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陽性又は陰性両方のＰＤＸモデルにおいてトラスツズマブの平均活性が５０％より高いことは、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現がトラスツズマブの効力を強く予測しないという見解を示唆している。

興味深いことに、ＩＨＣをハーセプテストによって確定する場合、散布図は、Ｈ５６１−４が、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陰性のＰＤＸモデルと比較して、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現陽性のＰＤＸモデルにおいて統計学的により大きな効力を有することを示す。これらの結果は、ＨＥＲ２ ＩＨＣの状態が、トラスツズマブよりＨ５６１−４に応答性の集団を選択する際によりよく予測することを実証する。

略式の配列表
抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４のヌクレオチド配列（配列番号１）

Ｈ５６１−４ヌクレオチド配列の始めにある配列「ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴ」は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部をコードする。Ｈ５６１−４のＣＨ２ドメインをコードする配列に、下線を引く。Ｈ５６１−４のＣＨ３ドメインをコードする配列を、イタリック体で示す。抗原結合に関与すると考えられるＣＨ３ドメインのＡＢ構造ループの一部をコードする配列を太字体で示し、抗原結合に関与すると考えられるＣＨ３ドメインのＥＦ構造ループをコードする配列の一部を太字体で示し、二重下線を引く。

抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４ヒンジ領域のヌクレオチド配列（配列番号２）
ACCTGCCCCCCTTGTCCT

抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４ ＣＨ２ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３）
GCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCC
CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTG
TCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAG
ACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC
CAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATC
GAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAG

抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４ ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４）
GAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGC
CGGGACGAGTTCTTCACCTACTGGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGAT
ATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG
GACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACCGGCGGAGATGGACCGCCGGC
AACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCC
CTGAGCCCCGGCAAG

抗原結合に関与すると考えられるＨ５６１−４ ＡＢ構造ループ領域の一部をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）
TTCTTCACCTACTGG

Ｈ５６１−４ ＣＤ構造ループ領域の一部をコードするヌクレオチド配列（配列番号６）
AACGGCCAGCCCGAG

抗原結合に関与すると考えられるＨ５６１−４ ＥＦ構造ループ領域の一部をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）
GACCGGCGGAGATGGACCGCC
抗原結合ＦｃフラグメントＨ５６１−４のアミノ酸配列（配列番号８）

Ｈ５６１−４アミノ酸配列の始めにある配列「ＴＣＰＰＣＰ」は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部を表す。Ｈ５６１−４のＣＨ２ドメインに下線を引く。Ｈ５６１−４のＣＨ３ドメインをイタリック体で示す。ＣＨ３ドメインのＡＢ構造ループの一部を太字体で示し、ＣＨ３ドメインのＥＦ構造ループの一部を太字体で示し、二重下線を引く。ＣＨ３ドメインのＣ末端リジン（K）又はＣ末端リジン及び隣接するグリシン（GK）の切断が報告されている。Ｃ末端リジン及び隣接するグリシン（下記の配列番号１１にも存在する）を、上記の配列において囲んで示す。

Ｈ５６１−４ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号９）
TCPPCP

Ｈ５６１−４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

Ｈ５６１−４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）

抗原結合に関与すると考えられるＨ５６１−４ ＡＢ構造ループ領域の一部のアミノ酸配列（配列番号１２）
FFTYW

Ｈ５６１−４ ＣＤ構造ループ領域の一部のアミノ酸配列（配列番号１３）
NGQPE

抗原結合に関与すると考えられるＨ５６１−４ ＥＦ構造ループ領域の一部のアミノ酸配列（配列番号１４）
DRRRWTA

Ｐｅｐｓｃａｎにより確定された、Ｈ５６１−４に結合されるＨＥＲ２アミノ酸配列（配列番号１５）
LPASPETHLDMLRHL

Ｐｅｐｓｃａｎにより確定された、Ｈ５６１−４に結合されるＨＥＲ２アミノ酸配列（配列番号１６）
CQVVQGNLELTYLPT

Ｐｅｐｓｃａｎにより確定された、Ｈ５６１−４に結合されるＨＥＲ２アミノ酸配列（配列番号１７）
SLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQAL

ＨＥＲ２細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）

実験において対照として使用した野生型Ｆｃ抗原結合フラグメントのアミノ酸配列（配列番号１９）
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

参照文献
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Claims (29)

1. ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する特異的結合メンバーを備える、患者のがんを治療するための医薬組成物であって、
   前記がんが、腫瘍細胞当たり１０以上の平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有し、
   当該特異的結合メンバーは、
   （ａ）当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
   （ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
   であり、
   前記（ａ）部分及び／又は（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、抗原結合Ｆｃフラグメントである又はそれを含む、
   医薬組成物。
2. 前記患者から得た腫瘍サンプルが、腫瘍細胞当たり１０以上の平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数を有すると確定されている、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記がんが、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、又は有すると確定されており、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、前記患者から得た腫瘍サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、前記サンプル中の２００以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に対応し、前記サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数が、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定されるか、あるいは、
   前記がんが、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを有し、又は有すると確定されており、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、前記患者から得た腫瘍サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、前記サンプル中の２００以上及び８２０以下のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に対応し、前記サンプル中のＨＥＲ２及び参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数が、ＲＴ−ＰＣＲとその後の定量的ＰＣＲによって確定される、
   請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記治療が、
   （ｉ）前記患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の平均遺伝子コピー数を確定すること；及び
   （ｉｉ）前記平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、腫瘍細胞当たり１０以上である場合に、前記特異的結合メンバーで前記患者を治療すること
   を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上又は１８以上である、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記がんが、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）又は子宮内膜がんである、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記患者が、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブに対して不十分な応答を呈する、及び／又は
   前記がんが、トラスツズマブ又はトラスツズマブ＋ペルツズマブによる治療に対して不応性である、
   請求項１から６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 請求項１の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記特異的結合メンバーが、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域ＡＢ及びＥＦ中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 請求項１の（ａ）部分及び／又は請求項１の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号１１のＣＨ３ドメイン、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号１１のＣＨ３ドメインを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 請求項１の（ａ）部分及び／又は請求項１の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号１０のＣＨ２ドメインを更に含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 請求項１の（ａ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号８のポリペプチドの二量体、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号８のポリペプチドの二量体である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は競合免疫細胞化学により確定される通り、請求項１の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、ＨＥＲ２に対する結合について、請求項１の（ａ）部分に記載の前記特異的結合メンバーと競合する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 請求項１の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、請求項１の（ａ）部分に記載の特異的結合メンバーと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合し、請求項１の（ａ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号８のポリペプチドの二量体、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号８のポリペプチドの二量体である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記治療が、前記患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定することを含み、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、前記サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、腫瘍サンプル中の２００以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に対応し、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、腫瘍細胞当たりの平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が１０以上であることを示す、請求項３から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. （ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
    （ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
    による治療に感受性である患者のがんを同定する方法であって、
    （ｉ）前記患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の平均遺伝子コピー数を確定することを含み、腫瘍細胞当たり１０以上の平均遺伝子コピー数が、前記がんが前記特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示し、
    前記（ａ）部分及び／又は（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、抗原結合Ｆｃフラグメントである又はそれを含む、
    方法。
17. （ａ）特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含み、アミノ酸配列ＦＦＴＹＷ（配列番号１２）及びＤＲＲＲＷＴＡ（配列番号１４）を含有する特異的結合メンバー；又は
    （ｂ）ＨＥＲ２に対する結合について（ａ）による特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー
    による治療に対するがんの応答を予測する方法であって、
    （ｉ）患者から得た腫瘍サンプル中の腫瘍細胞当たりのＨＥＲ２遺伝子の平均遺伝子コピー数を確定することを含み、腫瘍細胞当たり１０以上の遺伝子コピー数が、前記がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性であることを示し、腫瘍細胞当たり１０未満の遺伝子コピー数が、前記がんが特異的結合メンバーによる治療に感受性でないことを示し、
    前記（ａ）部分及び／又は（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、抗原結合Ｆｃフラグメントである又はそれを含む、
    方法。
18. 前記ＨＥＲ２遺伝子コピー数が、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上又は１８以上である、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記がんが、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）又は子宮内膜がんである、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記患者が、トラスツズマブ及び／又はトラスツズマブ＋ペルツズマブに対して不十分な応答を呈する、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 請求項１６の（ｂ）部分、又は請求項１７の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記特異的結合メンバーが、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域ＡＢ及びＥＦ中に構築されたＨＥＲ２抗原結合部位を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１６の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分又は請求項１７の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、抗原結合Ｆｃフラグメントである又はそれを含む、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 請求項１６の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分、又は請求項１７の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号１１のＣＨ３ドメイン、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号１１のＣＨ３ドメインを含む、請求項１６から２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 請求項１６の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分、又は請求項１７の（ａ）及び／若しくは（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号１０のＣＨ２ドメインを更に含む、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項１６の（ａ）部分、又は請求項１７の（ａ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号８のポリペプチドの二量体、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号８のポリペプチドの二量体である、請求項１６から２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、又は競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、又は競合免疫細胞化学により確定される通り、請求項１６の（ｂ）部分又は請求項１７の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、ＨＥＲ２に対する結合について、請求項１６の（ａ）部分、又は請求項１７の（ａ）部分に記載の特異的結合メンバーとそれぞれ競合する、請求項１６から２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 請求項１６の（ｂ）部分、又は請求項１７の（ｂ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、それぞれ請求項１６の（ａ）部分、又は請求項１７の（ａ）部分に記載の特異的結合メンバーと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合し、請求項１６の（ａ）部分、又は請求項１７の（ａ）部分に記載の前記特異的結合メンバーが、配列番号８のポリペプチドの二量体、又は１若しくは２つのＣ末端アミノ酸を引いた配列番号８のポリペプチドの二量体である、請求項１６から２７いずれか１項に記載の方法。
29. 前記患者から得た腫瘍サンプル中のＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルを確定することを含み、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、前記サンプル中の参照遺伝子のｃＤＮＡコピー数と比較して、腫瘍サンプル中の２００以上のＨＥＲ２ ｃＤＮＡコピー数に対応し、高いＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルが、腫瘍細胞当たりの平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数が１０以上であることを示す、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の方法。

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