CN107868814A - 一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法，包括以下步骤：（1）选取针对HER‑2基因的BAC克隆RP11‑94L15，提取BAC DNA；（2）提取的BAC DNA经限制性内切酶SnaBI的剪切后，用琼脂糖凝胶电泳，回收含有HER2 DNA的片段，进一步纯化得到HER2 DNA；（3）使用切口平移法对HER2 DNA进行Dig标记，得到Dig‑HER2探针。本发明的优点是制备方法简单、获得的探针特异性高，灵敏度好，有效改善显色原位杂交的信号与背景比，检测HER2的结果经临床试验证明与传统FISH的结果是等效的，结果封片后可以长期保存，有利于医生的会诊和档案的保存。

Description

一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法。
背景技术
乳腺癌是导致女性死亡的主要癌症，发病率以每年4%左右的速度递增。在所有乳腺癌患者中，约有2 0～3 0 %的患者是由于HER2基因(人类表皮生长因子受体2，也称ERBB2)异常扩增导致。靶向生物药——赫赛汀适用于HER-2过度表达和基因扩增的的乳腺癌，在使用赫赛汀治疗前，需要对肿瘤组织进行HER2的检测。荧光原位杂交（FISH）是确定HER2是否存在异常扩增的金标准，能够在细胞中标记出HER2基因的拷贝数，结合HER2蛋白的免疫组化，是目前临床上检测HER2基因的主要方法。应用荧光原位杂交法杂交后荧光信号易衰减，组织片不能长期保存，并且需要价格昂贵的荧光显微镜进行拍照。中国专利申请CN104561361A公开的一种HER2 基因扩增检测探针、试剂盒以及方法，以及中国专利申请CN103409504A公开的一种用于检测HER2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法都是采用制作FISH探针的方法，在探针制备过程中需要采用大量不同的PCR产物作为模版，工作较为繁琐。
显色原位杂交（CISH）是近几年出现的新的检测技术。CISH的探针携带抗体可以识别的标记如地高辛 (digoxigenin,简称Dig)或者二硝基苯（DNP），杂交后经过抗Dig或者DNP的一抗和酶偶联的二抗识别，加入底物后显色。显色原位杂交（CISH）灵敏度高，染色后组织片子可以长期保存，有利于保护病人档案的完整性，同时染色结果在普通的光学显微镜即可观察到。清晰的信号和干净的背景是显色原位杂交（CISH）技术的主要挑战，CISH特异性受到诸多因素的影响，如探针、缓冲液、温度、清洗和染色时间等。其中探针的质量决定了显色原位杂交的成功与否。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法，制备的探针特异性高，用于HER2基因的检测。
实现上述目的的技术方案如下：
一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）选取针对HER-2基因的BAC克隆RP11-94L15，提取BAC DNA；
（2）提取的BAC DNA经限制性内切酶SnaBI的剪切后，用琼脂糖凝胶电泳，回收含有HER2DNA的片段，进一步纯化得到HER2 DNA；
（3）使用切口平移法对HER2 DNA进行Dig标记，得到Dig-HER2探针。
其中，步骤（1）中BAC DNA的提取使用Zymo或者Qiagen公司的BAC提取试剂盒。
步骤（2）限制性内切酶SnaBI剪切后收集65kb片段。
步骤（3）中切口平移反应体系中以0.2-1ug的HER2 DNA作为模版，添加DNAse I、DNA polymerase I、 Dig-UTP、dNTP在10-16℃条件反应2-12小时。
步骤（3）中当Dig-HER2探针的长度为200-500bp时，终止反应。
步骤（3）中利用氯化锂和酒精沉淀Dig-HER2探针，进行纯化。
本发明采用BAC DNA作为模板合成用于CISH染色的Dig探针，是一种快速有效的方法，较PCR方法价格低廉简便。制备的Dig-HER2探针特异性高，灵敏度好，有效改善显色原位杂交的信号与背景比。通过CISH检测HER2的结果经临床试验证明与传统FISH的结果是等效的，结果封片后可以长期保存，有利于医生的会诊和档案的保存。
附图说明
图1本发明制备探针的电泳图。
图2乳腺癌组织样本CISH检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1 一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备
一种用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备，包括以下步骤：
（1）选取BAC克隆RP11-94L15，无菌条件下接种，选取单克隆置于LB培养基中，在37ºC，250rpm的振荡培养箱中进行过夜（12-16小时）培养。
（2）培养后的细菌离心后遵照Zymo或者Qiagen公司的BAC提取试剂盒按照说明书要求的操作方法提取BAC DNA，提取BAC DNA分装后，可在 -20℃密封保存。
（3）提取的BAC DNA中加入SnaBI内切酶，BAC DNA被切成多个片段，大小从10kb-65kb，65kb的片段中包含全部40kb的HER2基因位点，跑0.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，利用荧光染料SYBR染色，在蓝光下切出65kb的部分，利用ZYMO公司的ZymocleanTM Large FragmentDNA回收试剂盒，按照其说明书，进一步纯化分离，得到HER2DNA。采用限制性内切酶SnaBI消化去掉BAC DNA上非HER2部分的大部分DNA片段，能提高制备探针的特异性。
（4）采用切口平移法对HER2 DNA进行Dig标记，其中切口平移体系为：
（a）纯化HER2DNA的量为0.2-1µg，（b）缓冲液：其成份和终浓度分别为Tris pH7.550mM, MgCl2 10mM,β-巯基乙醇8mM，BSA50µg/ml；（c）DNase I 的终浓度为0.04-0.2 ng/ml；（d）DNA polymerase I的终浓度为0.1-1u；（e）反应中未标记的dATP, dGTP和dCTP的终浓度各为10-50μM，优选各20μM；（f） dTTP和Dig标记UTP的总浓度为10-50μM，优选20μM，比例为1:1-3:1，优选2:1。
反应温度15ºC，时间2-10小时。反应2小时后，跑电泳，探针电泳图如图1所示，检测Dig探针的长度，达到200-500bp时，加入1-2µl 0.5M的EDTA，加热到70ºC，10分钟，终止反应。向反应液中加入氯化锂和乙醇，沉淀DNA 探针，洗掉未结合的核苷，对Dig-HER2探针进行纯化。
表1为一种优化的切口平移反应体系。
表1切口平移反应体系
实施例2 Dig-HER2探针临床使用评价
利用实施例1中制作的两种探针: A经酶切的HER2DNA作为模版制作的探针Dig-HER2，B未经酶切的BAC DNA作为模版制作的探针Dig-BAC。显色原位杂交CISH参考ZytoVision公司的试验方法，具体步骤如下：
（1）石蜡包埋的肿瘤样本，切成4μm厚的切片，在56 ºC条件下烘干。
（2）切片经二甲苯脱蜡，并在通过100%的乙醇去除二甲苯。
（3）切片经EDTA处理15分钟后，再用胰蛋白酶处理5分钟，以便于探针的穿入细胞核。
（4）探针经变性后，滴加到组织上，盖玻片封片，37 ºC条件过夜杂交。
（5）利用SSC（柠檬酸钠氯化钠缓冲液）清洗液去掉未结合探针。
（6）向组织上加入抗Dig抗体培养1小时，PBST清洗后，加入HRP二抗培养1个小时，PBST（磷酸缓冲液，tween20）清洗掉未结合抗体。
（7）加入DAB（二氨基联苯胺）底物，室温培养30分钟，终止反应。
（8）切片在70-100%的乙醇中脱水，滴上封片剂，加盖玻片封片。
染色完成的切片在普通光学显微镜下观察、拍照， 采用实施例1中制作的探针，染色结果具有较好的特异性，细胞核中的HER2基因信号呈点状分布，如图2中A所示，而采用整个BAC 作为模版制作的探针特异性较差，容易造成过度染色， 整个细胞核颜色融为一体，如图2中B所示。

Claims (9)

1.用于检测HER2基因的Dig标记探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）选取针对HER-2基因的BAC克隆RP11-94L15，提取BAC DNA；
（2）提取的BAC DNA经限制性内切酶SnaBI的剪切后，用琼脂糖凝胶电泳，回收含有HER2DNA的片段，进一步纯化得到HER2 DNA；
（3）使用切口平移法对HER2 DNA进行Dig标记，得到Dig-HER2探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤（2）限制性内切酶SnaBI剪切后收集65kb片段。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤（3）中切口平移反应体系中以0.2-1ug的HER2 DNA作为模版，添加DNAse I、 DNA polymerase I、 Dig-UTP、dNTP在10-16℃条件反应2-12小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是切口平移反应体系中缓冲液：其成份和终浓度分别为Tris pH7.5 50mM, MgCl2 10mM,β-巯基乙醇8mM，BSA50µg/ml。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是切口平移反应体系中DNase I 的终浓度为0.04-0.2 ng/ml。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是切口平移反应体系中DNA polymerase I的终浓度为0.1-1U。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是切口平移反应体系中dTTP和Dig标记UTP的总浓度为10-50μM，优选20μM，比例为1:1-3:1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征是步骤（3）中当Dig-HER2探针的长度为200-500bp时，终止反应。
9.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征是步骤（3）中利用氯化锂和酒精沉淀Dig-HER2探针进行纯化。
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