JPH11503026A

JPH11503026A - インジツーハイブリダイゼーション溶液及び方法

Info

Publication number: JPH11503026A
Application number: JP8530511A
Authority: JP
Inventors: キム，イン，シー．; トンプソン，ドナルド，エム．; サルト，グロリア，イー．
Original assignee: ユニバーシティオブニューメキシコ
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 1999-03-23
Also published as: EP0820525A1; US5750340A; AU5712096A; CA2217509A1; WO1996031626A1

Abstract

(57)【要約】インジツー蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手法と溶液とが開示されている。全体的なＦＩＳＨ処理は迅速（１５分以内）であり、ハイブリダイゼーションステップは５分以内で完了する。ジゴキシゲニン標識、あるいはビオチン標識プローブでの全体的なＦＩＳＨ処理は約３０分間を要する。ホルムアミドを含まない溶液（硫化デキストランとグリセロール）が提供される。別溶液（１０％のデキストランと２０％のホルムアミド）も提供される。ｍＲＮＡ用のインジツー・ハイブリダイゼーションのための他の溶液がさらに提供され、処理は２４時間以内に完了する。

Description

【発明の詳細な説明】インジツーハイブリダイゼーション溶液及び方法発明の分野本発明は、インジツーの蛍光ハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization）に関する。背景技術インジツー・ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞標本あるいは組織標本内の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の検出並びに局在（localization）を検出する強力で万能な技術である。標識（labeled）ＤＮＡまたはアンチセンス（anti-se nse）ＲＮＡプローベの使用によって、この技術は個々の細胞または染色体内の特定のＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖（sequence）の局在に関する高度な三次元情報を提供する。ＩＳＨは分娩前の遺伝子異常や分子細胞遺伝学領域での研究や診断に幅広く利用されている。分子生物学の一般領域において、ＩＳＨは遺伝子発現（ expression）及び過発現（over-expression）を検出して遺伝子をマップ化処理し、遺伝子の発現部位を特定し、標的遺伝子を局在し、多様なウィルス及び細菌感染の同定及び局在検出するのに利用されている。現在、ＩＳＨ技術の研究は、腫瘍の診断、試験管授精の予備的な遺伝子診断、骨髄移植の評価、並びに中間期核（interphase nuclei）及び中期核（metaphase nuclei）での染色体異常（ane uploidy）の分析領域にまで広がりを見せている。ＩＳＨにおいて、標識核酸（ＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ）は鏡検用ガラススライド上で固定された細胞内の染色体あるいはｍＲＮＡに対してハイブリダイズされる（インジツー・ハイブリダイゼーション：「メディカル・アプリケーションズ」（Ｇ．Ｒ．コウルトン及びＪ．ド・ベレロチェ）ボストン市／クルワー・アカデミック・パブリッシャ発行（１９９２年）並びにインジツー・ハイブリダイゼーション：神経生物学「方法学の進歩」（Ｊ．Ｈ．エバーワイン、Ｋ．Ｌ．バレンチノ、Ｊ．Ｄ．バーチャス）イギリス／オクスフォード・ユニバーシティ・プレス・インク発行（１９９４年）、インジツー・ハイブリダイゼーション：「実用的アプローチ」（Ｄ．Ｇ．ウイキンソン）イギリス／オクスフォード・ユニバーシティ・プレス・インク発行（１９９２年））。多数の非放射性システム（non-isotopic system）が開発され、標識ＤＮＡプローベを可視化させた。それらには、ａ）蛍光ベースの直接的検出法、ｂ）蛍光検出法を利用したジゴキシゲニンとビオチン標識ＤＮＡプローベの利用、並びにｃ）抗体酵素検出法を利用したジゴキシゲニンとビオチン標識ＤＮＡプローベの利用等が含まれる。蛍光標識核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）プローベがＤＮＡあるいはＲＮＡに対してハイブリダイズされたとき、それらハイブリダイズされたプローベを蛍光顕微鏡を使用して直接的に見ることが可能である。異なる蛍光色でのマルチ式核酸プローベを使用することで、同時多色分析（複数の遺伝子あるいは複数のＲＮＡ用）が１つの標的細胞に対して一度に達成可能である。蛍光色素源−直接標識核酸プローベは、多段階的な検出（例：抗体ベースシステム）の必要性を排除する。よって、迅速な処理が可能であり、非特異的なバックグラウンドシグナルをも減少させる。従って、インジツー・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）での蛍光検出法はその需要を高めており、基礎及び臨床科学の両方で貴重な道具となっている。分子生物学や細胞遺伝学におけるＦＩＳＨ技術の重要性に鑑み、現行のＦＩＳＨ技術を改良してハイブリダイゼーション（蛍光）シグナルの感度を高め、単純化し、処理時間を短縮し、ＦＩＳＨ処理において使用される有害な試薬を無害な薬剤に置き換えることが望まれている。ＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）または染色体に対するＦＩＳＨ技術は以下の主たる４要素に依存する。（ａ）ＤＮＡの二重鎖（double strand）を効率的に変性（２つのＤＮＡ鎖の分離）のための最良温度、（ｂ）標的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）と標識ＤＮＡあるいはＲＮＡプローベ（すなわち、酵素、蛍光色素、発色団、化学発光体、生物発光体、放射性同位体、ビオチンあるいはアビジンが共に配合（conjugate）されるＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ断片）との間のアニール処理（annealing）またはハイブリダイゼーションのための最良温度、（ｃ）変性とハイブリダイゼーション処理の双方を増進させる適した溶液の選択、及び（ｄ）効果的なハイブリダイゼーション後の洗浄条件である。核、染色体、細胞、組織部分、及び蛍光シグナルの三次元解析の構造的集積性がＦＩＳＨ処理の最中に犠牲とならないことが重要である。よって、ＦＩＳＨ技術の改善には、増強されたハイブリダイゼーション効率、増強された検出精度、及び細胞、組織、核並びに染色体の形態学的特性の保存が要求される。現在、世界中の多くの研究所で実行されているＦＩＳＨ処理は一般的にクオ他のものに非常に類似している（「中間期及び中期アムニオサイト（amniocytes）に対する蛍光インジツー・ハイブリダイゼーションによる染色体１３、１８、あるいは２１が関与する異常の検出」Ａｍ．Ｊ．ヒト遺伝学・４９：１１２−１１９（１９９１年）；クリンジャー他、「インジツー蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用した非培養アムニオサイト（羊水細胞）での染色体異常の迅速検出」Ａｍ．Ｊ．ヒト遺伝学・５１：５５−６５（１９９２年）；ワード・Ｂ．Ｅ．他「インジツー蛍光ハイブリダイゼーションによる染色体異常の迅速分娩前診断；４５００標本での臨床実験」Ａｍ．Ｊ．ヒト遺伝学・５２：８５４−８６５（１９９３年））。しかし、たいていの研究所は便利さのために２つの主要な民間供給源のシステムを利用している。それらは、オンコール・インク社の” 迅速染色体インジツー・ハイブリダイゼーション・システム（第１版、１９９３年１０月）”と、マサチューセッツ州０１７０１のフラミンガム市ニューヨーク・アベニュー３１番地のイマジェネティックス／バイシス・インク社のものである。生物学検出システムは推薦されたＦＩＳＨプロトコール用の標識ＤＮＡプローベのみを提供する（ペンシルバニア州１５２３８のピッツバーグ市ウィリアム・ピッツ・ウェイ９５５番地の生物検出システム・インク社）。これらのＦＩＳＨ手法は全ては、時間がかかり、人手を要し、非常に面倒で、その検出精度が限定されたものである。プレッサー他に付与された米国特許５２２５３２６号は、 ”１ステップのインジツー・ハイブリダイゼーション”を教示しており、固定とＦＩＳＨとが５分から４時間で完了するとされている。ハー他の「定量顕微鏡学のための迅速ＦＩＳＨ技術」（バイオ技術、１７巻、その２、ページ３４６−３５３（１９９４年８月））はＦＩＳＨに必要な時間を”原則的”に３０分に短縮する技術を開示している。前述のＦＩＳＨ手法を利用して蛍光シグナルを算定（スコアリング）するには、低シグナル感度のため、一般的にトリプルバンドパス（triple bandpass）フィルタを使用した１００ｘ油浸対物レンズを必要とする。ＦＩＳＨ処理中の高濃度のホルムアミドの使用は、細胞、核あるいは染色体構造の形態学的破壊を引き起こすと考えられている。さらに、これら全ての処理は、ハイブリダイゼーション処理中に、またはハイブリダリゼーション処理後にホルムアミドを使用する。ホルムアミドは高価で、有害な溶剤であり、奇形発生因子でもある。よって、ホルムアミドを利用しないＦＩＳＨ処理は環境的にも衛生学的にも望ましい。発明の概要迅速で簡単な高感度のインジツー蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手法は以下の２つの好適な変性ハイブリダイゼーション溶液に基づいて開発された。１）ホルムアミド使用：１０％の硫酸デキストラン／２０％のホルムアミド／０．９％のＮａＣｌまたはＫＣｌの溶液と、２）ホルムアミド不使用：１０％の硫酸デキストラン／２０％のグリセロール／０．９％のＮａＣｌまたはＫＣｌの溶液とである。ＲＮＡ−ＦＩＳＨにおいては、１と２の溶液は０．１％のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水溶液内でその硫酸デキストランを溶解させて調整し、Ｆ−ＤＥＰＣ（１の溶液＋ＤＥＰＣ）とＧ−ＤＥＰＣ（２の溶液＋ＤＥＰＣ）の溶液を準備することもできる。標識核酸（ＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ）プローベが、これら２つの変性ハイブリダイゼーション溶液のいずれかに溶解された。標識プローベを含む溶液は、顕微鏡ガラススライド上で固定された核または適当に処理された細胞及び組織切片に適用され、その後にガラスのカバースリップがスライド上に注意深く置かれ、プローベ溶液が均等に拡散された。ガラススライド上の標識核酸プローベ及び染色体内の核酸と、適当に処理された細胞及び組織切片は、カバースリップとガラススライド間にシーラントを挟んだ状態か、あるいは挟まない状態で、約１００℃±５℃のオーブン内で同時的に約１．５±０．５分間変性され、その後直ちに約５５℃±５℃で５分間オーブン内でハイブリダイズ処理された。スライドからカバースリップを取り外した後、ハイブリダイズ処理されたスライドは、５０％ホルムアミド０．４５％ＮａＣｌ溶液内で、あるいは３８℃で３分間洗浄され、その後に３８℃で０．９％のＮａＣｌ内で５分間洗浄された。あるいは、ハイブリダイズ処理されたスライドはホルムアミドを含まない６０℃の０．１−０．２％のＮａＣｌで５分間洗浄され、その後に６０℃の新しい０．１ −０．２％のＮａＣｌでさらに３分間洗浄された。空気乾燥後にスライドは４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）あるいはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で対比染色された。蛍光シグナルは、トリプルバンドパスフィルタと２０ｘまたは４０ｘドライ対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で鏡検された。全部のＦＩＳＨ処理には５分から１５分を要した。これら２つの変性ハイブリダイゼーション溶液を使用したこれら手法の利点は以下の通りである。１）ＦＩＳＨ処理中にスライドへのカバースリップのラバーセメントでのシール処理を不要としたこと、２）同時変性によりＦＩＳＨ処理を単純化させたこと（結果に悪影響を及ぼさずに±１０℃の変化を可能にした）、３）１５分以内での迅速なＦＩＳＨ処理を可能にしたこと、４）ハイブリダイゼーション（蛍光）シグナルの検出感度を大きく改善させたこと、及び５）完全にホルムアミドを排除したインジツー蛍光ハイブリダイゼーション処理を可能にしたことである。本発明の主要な目的は、高感度で、迅速（１５分以内のハイブリダイゼーション、並びに、ハイブリダイゼーション前、ハイブリダイゼーション中、及びハイブリダイゼーション後の全ステップを２４時間以内で終了）で、技術的に容易で確実なＦＩＳＨ手法を提供することである。本発明の別目的は、ホルムアミドを使用しないＦＩＳＨ溶液と手法とを提供することである。本発明の利点は、ＦＩＳＨ処理に単純で効率的で環境にも安全な溶液を使用させることである。本発明の他の目的、新規な特徴、並びにその適用範囲は以下の詳細な説明に解説されており、その解説を通じて、あるいは本発明の実施を通じて当業界の技術者には理解されるであろう。好適実施例の解説（発明実施のための最良形態）本発明は現行のＦＩＳＨ技術の改良に関するいくつかの領域を含んでいる。（ａ）高感度で形態学的に高維持率を備えた、約１５分間でのＦＩＳＨ処理を可能にする簡単な変性ハイブリダイゼーション溶液の開発、及び（ｂ）完全にホルムアミドを排除したＦＩＳＨ技術の開発である。本発明は、培養細胞（cultured cells）、組織切片、腫瘍内、及びブロット処理技術に関連して使用するためのニトロセルロースあるいはナイロン紙上の標的遺伝子あるいはＲＮＡの１コピーの検出を可能にする。本発明は、従来技術（オンコール・インク社；イマジェネティックス／パイシス社；ＢＤＳ・インク社）が要求するものよりも希薄な溶液を使用して中間期核のシグナルの検出を可能にし、処理コストを低減させ、大量スクリーン化を低コストで可能にする。本発明は、多様な温度と時間で、シグナル検出に悪影響を及ぼさずに処理全体を達成させ、小さな偏差を許容し、多数のサンプルの処理を可能にしている。本発明によるＦＩＳＨ処理の迅速性（１５分間）と信頼性とは、例えばプレインプランテーション遺伝学（preimplantation genetics）でのごとき速度が重要となる場合での適用を可能にしている。現在、最も幅広く使用されている民間のシステムは、ホルムアミドとＳＳＣ（サリンソジウムシトレート）を含んだハイブリダイゼーションを含んでいるか提案している。提供されたプロトコールに従って多様な民間システムがＦＩＳＨに利用されるとき、ハイブリダイゼーションシグナルは４０ｘ対物レンズでは検出が困難である。よって、従来技術でのシグナルの列挙にはほとんどが１００ｘオイル液浸対物レンズが要求される。従って、提供されたプロトコールに従って、硫化デキストランを使用し、あるいは使用せずにホルムアミドとＳＳＣを使用することはハイブリダイゼーションの効率を下げ、さらに長いハイブリダイゼーション処理時間（好適には１晩）を必要とするようである。よって、本発明はハイブリダイゼーション用の高効率媒液を提供する。民間の従来式ＦＩＳＨ技術は少なくとも２時間から１２時間以上を必要とする。さらに、これらの手法は、多様で面倒なステップを関与させ、標的核酸と標識プローベの別々な変性を要求し、別々な変性及びハイブリダイゼーション処理を必要とし、クレードされたアルコール等での標的核酸の反復的脱水処理を必要とする。一方、本発明は３ステップのみで充分であり、高感度を提供する。これらステップとは以下のものである。変性処理（約１．５±０．５分）、ハイブリダイゼーション処理（約５分以下）、及びハイブリダイゼーション後の洗浄（約８分以下）である。従って、本発明のＦＩＳＨ処理のは全体で約１５分間を必要とするだけである（例１参照）。従来のＦＩＳＨ処理の変性処理とハイブリダイゼーション処理には正確なタイミングと温度とが要求された。本発明は感度にほとんど影響を及ぼさずに時間と温度の多様性に対応させる。従来のＦＩＳＨ手法にはシグナルの適正な列挙にオイル液浸１００ｘ対物レンズが必要であった。変性−ハイブリダイゼーション溶液の最良組成と最良条件（温度とタイミング）とによって蛍光シグナルは非常に明確となる。従って、シグナル列挙は、本発明では１５分のＦＩＳＨ処理後にトリプル・バンドパスフィルタを使用した２０ｘあるいは４０ｘドライ対物レンズで可能である。一般的に、ＦＩＳＨ処理中にはＳＳＣが使用される。ＳＳＣを使用すると、そのｐＨは７．０周辺に調整されなければならない。ＳＳＣの準備には時間がかかる。本発明の生理食塩水（saline）の代用としてＳＳＣが利用可能であるが、本発明においてはＳＳＣは生理食塩水に代用される。ハイブリダイゼーション後の洗浄に生理食塩水のｐＨ調整は不要であり、ＦＩＳＨ処理の時間短縮と単純化が可能である。溶液Ｇと呼称する本発明の好適な溶液は、ホルムアミドを含まない１０重量％ ±２重量％の硫化デキストランと１５重量％−２５重量％（好適には２０重量％）のＮａＣｌ、ＫＣｌあるいは他の塩の混合物を含む。標識核酸プローベと混合された１０％−２０％の硫化デキストラン溶液あるいは２０％−５０％のグリセロール溶液のみでは効果的なハイブリダイゼーションは達成されない。しかし、本発明のグリセロールと硫化デキストランの組み合せはハイブリダイゼーションを著しく改善させる。ハイブリダイゼーションの効率は主としてグリセロールの濃度に影響される。グリセロール濃度が３０％以上に上昇すると、恐らくは溶液の増加した粘性によってハイブリダイゼーションシグナルは減少する。しかし、プローベ溶液内にグリセロールを含ませると、ラバーセメントでのシール処理を施さずともハイブリダイゼーション処理を通じて乾燥が防止される（例：３８℃ で１５時間まで）。粘性が増加すると、ハイブリダーゼーションシグナルは弱くなり、最良の蛍光シグナルを得るには変性−ハイブリダイゼーション時間の増加と温度の上昇が必要となる。グリセロールと硫化デキストランとは比較的に不活性な化学物質である。よって、溶液Ｇは望ましい溶液である。溶液Ｆと呼称される本発明の別溶液は、１０重量％±２重量％の硫化デキストランと、１０体積％−３０体積％（好適には２０体積％）のホルムアミドと、０．９重量％のＮａＣｌ、ＫＣｌあるいは他の塩を含む。ホルムアミドは硫化デキストランとの組み合せでのみハイブリダイゼーションで効果を発揮する。１５％以下あるいは２５％以上のホルムアミド濃度でも蛍光インジツー・ハイブリダイゼーションに利用が可能であるが、これらホルムアミド濃度の使用には異なる変性温度セッティング、異なる変性時間、異なるハイブリダイゼーション温度セッティング、及び異なるハイブリダイゼーション時間が必要である。例えば、これらの条件はＦＩＳＨ処理の完成にずっと長い時間（好適には１晩）の湿化インクベータ内での３８℃での処理が要求される。さらに、長いインキュベーション時間は、ＦＩＳＨ溶液の湿化あるいは乾燥を避けるためにラバーセメントでのカバースリップとガラススライドとのしっかりとしたシール処理を必要とさせる。従って、好適なホルムアミド濃度は２０体積％±５体積％である。加えて、ホルムアミドのさらに高い濃度（３５％以上）は細胞及び核形態学上の構造的破壊を増進させる。ラバーセメントや他のシーラントの使用は可能であるが、本発明はＦＩＳＨ分析のいかなるステップにおいてもラバーセメントでのカバースリップのシール処理を必要としない。従来技術においては、ラバーセメントによるシールが処理ミスによって破られたときにはハイブリダイゼーションシグナルは弱くなった。従って、ラバーセメントの適用には細心の注意が必要であり、面倒であり、変性処理以前に３０−６０分を必要とした。ラバーセメントシーリングはハイブリダイゼーション後の洗浄開始以前に取り外さなければならない。よって、ラバーセメントによるシール処理とその取り外しは不便であり、特に多数のサンプルを処理する場合には非常に時間を要する作業となる。本発明は、ハイブリダイゼーションを妨害せずにこの面倒で時間がかかる作業（例：ラバーセメントでのシール処理とその取り外し）を排除する。従って、本発明は非常に簡単であり、実施に便利である。変性−ハイブリダイゼーション処理後に、処理されたスライドは、好適には、ホルムアミドを含まない０．１−０．２％のＮａＣｌ溶液で洗浄される。非特定結合（non-specifically bound）あるいは非過剰結合（excess unbound）プローベはこれら条件下で効果的に排除される。従って、溶液Ｇを使用することで、まったくホルムアミドを使用しないＦＩＳＨ処理が達成される。ホルムアミドは有害で高価であるため、ホルムアミドを使用しないＦＩＳＨ分析は環境に優しく、経済的である。本発明の前述の説明は、１５分間でＦＩＳＨ処理を完了させ、トリプル・バンドパスフィルタを使用した２０ｘあるいは４０ｘドライ対物レンズでの中間期核のシグナルの列挙を可能にするＤＮＡ用の最良条件を定義している。例えば、温度が約１１０℃を越えない限り、変性とハイブリダイゼーションの温度等の他の条件でも利用が可能である。これら”他の条件”下でのシグナルの列挙には１０ｘ接眼レンズと６０ｘドライ対物レンズとの両方が必要となるが、１００ｘオイル液浸レンズは必要としない。ＦＩＳＨ処理のこれら他の条件は以下に提供されている。（ａ）溶液Ｇ：１０％の硫化デキストランとの３５−５０％のグリセロールの場合、変性条件はそれぞれ５分間と１分間である７５℃と９０℃の範囲である。ハイブリダオゼーション条件は、３０分間から１晩（ラバーセメントの使用如何に拘らず）での４５℃から３８℃の範囲である。（ｂ）溶液Ｆ：変性温度はそれぞれ２分間と１分間以上である７５℃から９０ ℃までの範囲である。ハイブリダイゼーション条件は、３０分間から１晩である４５℃から３８℃の範囲である。１晩のインキュベーションにはラバーセメントでのカバースリップのシール処理が必要である。（ｃ）溶液Ｆ−ＤＥＰＣ：これら溶液は、約１０体積％から３０体積％のホルムアミドと塩の、０．１％のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水に溶解された約８重量％と１２重量％の硫化デキストランを含んでいる。ＲＮＡを変性させる必要はない。ハイブリダイゼーション時間は７５℃で１時間から２４時間である。ラバーセメントでのカバーガラスのシール処理は２時間以上のハイブリダイゼーションには必要である。（ｄ）溶液Ｇ−ＤＥＰＣ：この溶液は、約１５重量％から２５受領％のグリセロールと塩の、約８重量％と１２重量％の硫化デキストランを含んでいる。ＲＮＡを変性させる必要はない。ハイブリダイゼーション時間は７５℃で１時間から２４時間である。ラバーセメントでのカバーガラスのシール処理は２時間以上のハイブリダイゼーションには必要である。産業上の利用性本発明は限定を意図しない以下の例でさらに詳細の説明されている。例１サンプルとプローベの同時的変性による様々な細胞と組織のサンプルに対する溶液ＦとＧでのハイブリダイゼーションと、ホルムアミドを含んだ溶液での洗浄及びホルムアミドを含まない溶液での洗浄を伴うＦＩＳＨ処理。１）材料ローダミン−Ｘ染色体用の標識特定ＤＮＡと、ＦＩＴＣ（フルオレスセインイソチオシアネート）−Ｙ染色体プローベ用の標識特定ＤＮＡとの混成プローベ（あるいは、ローダミン標識Ｙ染色体とＦＩＴＣ標識Ｘ染色体ＤＮＡプローベ）が民間供給源（オンコール・インク社、イマジェネチックス／バイシス・インク社、ＢＤＳインク社）から入手された。これらプローベは様々な変性−ハイブリダイゼーション溶液で希釈された（以下参照）。２）細胞と組織サンプルの準備ａ）白血球が以下のようにして末梢血液（peripheral blood）から得られた。ドナーから採血された新鮮血液がヒストペーク遠心分離器にかけられた。単核細胞と顆粒細胞（granulocyte）が組み合わされ、ＰＢＳ（燐酸塩緩衝化生理食塩水）で洗浄された。洗浄された細胞ペレットは冷却メタノール／酢酸（３：１）で処理され、ＦＩＳＨに利用されるまで−２０℃に保たれた。ｂ）培養末梢白血球と非培養末梢白血球の中間拡散培養（metaphase spread）あるいは中間期細胞（interphase cell）は標準細胞遺伝学手順に従ってガラススライド上で固定された。メタノール／酢酸処理された細胞はガラススライドに載せられた。スライドは空気乾燥された。ｃ）５％のパラホルムアミド処理された細胞は冷却メタノール／酢酸（３：１）で処理され、少なくとも３０分間−２０℃に保たれた。その後に、メタノル／酢酸処理された細胞はガラススライドに載せられた。スライドが乾燥されたとき、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）がその細胞塗抹に適用され、３８℃で１０分間インキュベート処理された。その後にスライドは０．０５トリスバッファ、ｐＨ７．４で洗浄され、空気乾燥された。ｄ）標準手法に従って（キシレンとグレードされたアルコールで）パラホルムアミド固定のパラフィン埋め込み組織切片からパラフィンが除かれた。パラフィンが除かれた切片は前述のようにしてプロテイナーゼＫで処理された。スライドは空気乾燥された。３）変性−ハイブリダイゼーション溶液の準備：溶液ＦとＧａ）溶液Ｆ：ホルムアミドを含む変性ハイブリダイゼーション溶液。溶液Ｆは１０重量％±２重量％の硫化デキストランと、２０体積％±１０体積％（好適には２０体積％）のホルムアミドと、０．９％の生理食塩水（例：ＮａＣｌあるいはＫＣｌ）を以下のように含んだ。（好適な）１グラムの硫化デキストランと０．０９グラムのＮａＣｌあるいはＫＣｌは８ｍｇの脱イオン水に溶解され、２ｍｇのホルムアミドが加えられた。この溶液は完全に混合され、使用するまで−２０℃に保たれた。ｂ）溶液Ｇ：ホルムアミドを含まない変性−アイブリダイゼーション溶液。溶液Ｇは、１０重量％±２重量％の硫化デキストランと、２０重量％±５重量％（好適には２０重量％）のグリセロールと、０．９重量％の生理食塩水（例：ＮａＣｌあるいはＫＣｌ）を以下のように含んだ。（好適な）１グラムの硫化デキストランと０．０９グラムのＮａＣｌあるいはＫＣｌは８ｍｇの脱イオン水に溶解され、その後に２ｍｇのグリセロールが加えられた。この溶液は完全に混合され、使用まで−２０℃で保存された。４）サンプルとプローベの同時的変性本発明において、”標識プローベ”とは、比較的に熱に対する安定度が高い酵素とリガンド、蛍光色素、（例：ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド）発色団、化学発色体、生物発色体、あるいは放射性同位体が共有結合的に結合されているＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを指す。これら標識プローベは溶液ＦまたはＧで適当な濃度にまで希釈された。よって、この”プローベ溶液”とは、溶液ＦまたはＧで希釈された標識プローベ（オンコール・インク社、イマジェネティックス／バイシス・インク社、ＢＤＳインク社）のことである（例２、表Ｉ参照）。５μｌから３０μｌの希釈プローベ溶液は、ガラススライド上の核あるいは適当に処理された細胞または組織切片でスポット処理された。ガラスカバースライドがプローベ溶液をカバーするために注意深く載せられ、軽く圧力がかけられ、サンプル域内でプローベ溶液は均等に広げられた。ラバーセメントによるカバースリップとガラススライドのシール処理は必要ではなかった。スライドは９５℃ から１００℃（１００℃±５℃）のオーブンに入れられ、１．５±０．５分間変性処理された。この最中に、標的核酸と標識プローベの双方は溶液ＦあるいはＧの存在下で同時的／効果的に変性された。５）ハイブリダイゼーション変性処理に続いて、スライドは５５℃±５℃の別オーブンに移され、約５分間ハイブリダイズ処理された。１台のオーブンしかない場合には、スライドをその上に載せたホットアルミ棚をオーブンから引き出し、ラボベンチの引き出しに置いて、室温で約５分間冷却する。どちらの場合でも、この５分間でシングルストランドされた標的ＤＮＡとプローベが溶液ＦまたはＧによって最大限の効率でハイブリダイズ処理された。２０分から３０分間までのハイブリダイゼーションでハイブリダイゼーションシグナルは少々増加したが、この５分間のインキュベーション処理で、２０ｘあるいは４０ｘ対物レンズによるハイブリダイゼーションシグナルの顕微鏡検出には充分であることが確認された（例２、表ＩＩ参照）。６）ハイブリダイゼーション後の洗浄ハイブリダイゼーション後に、カバースリップはガラススライドから外された。スライドには、非特定結合プローベを排除するために以下のハイブリダイゼーション後の洗浄のいずれかが適用された。ａ）ホルムアミドを含んだ洗浄液。ハイブリダイゼーション処理されたスライドは、０．４５％のＮａＣｌを含んだ３８℃の５０％のホルムアミド溶液内に３分間沈められ、続いて０．９％のＮａＣｌ溶液内に５分間沈められた。ｂ）ホルムアミドを含まない洗浄液。ハイブリダイゼーション処理されたスライドは０．１％−０．２％のＮａＣｌ溶液内に５分間沈められ、新規な０．１％−０．２％ＮａＣｌ溶液内でさらに３分間沈められた。７）蛍光インジツー・ハイブリダイゼーションシグナルの可視化ハイブリダイゼーション後の洗浄の後に、スライドは空気乾燥された。その後、少量の対比染色剤（着色固定液内の２００ｎｇ／ｍｌのヨウ化プロピヂウム（ＰＩ）あるいは２０ｎｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））がスライド上に点滴され、核が対比染色された。核内のハイブリダイゼーションシグナルは、トリプル・バンドパスフィルタと１００ワット水銀灯及び１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、６０ｘドライ対物レンズ並びに１０ｘ接眼レンズを備えたオリンパス反転蛍光顕微鏡（モデルＩＭＴ−２）で観察された。実験条件下では、オイル液浸レンズは不要であった。蛍光によるシグナル列挙処理は２０ｘあるいは４０ｘドライ対物レンズで充分に実行された。例２変性／ハイブリダイゼーション溶液、変性／ハイブリダイゼーション時間と温度の特定：２０ｘ、４０ｘドライレンズによる中間期核での蛍光シグナルの列挙処理この例では、ローダミン−結合ＸとＦＩＴＣ−結合Ｙ染色体プローベ（あるいは、ローダミン−結合ＹとＦＩＴＣ−結合Ｘ染色体プローベ）を含んだ混成プローベが、培養及び非培養の、男性末梢血液白血球に対して使用された。特定のレッドあるいはオレンジＸ（またはＹ）とグリーンＹ（またはＸ）シグナルが、トリプル・バンドパスフィルタと１０ｘ、２０ｘ及び４０ｘ対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で検査された。この目的は、本発明を利用して、４０ｘ非オイル対物レンズで中間期核の蛍光シグナルを確実に列挙処理可能にするＦＩＳＨ手法を提供することであった。場合によっては、中間期核の列挙処理は２０ｘ対物レンズで達成された。１）溶液ＦとＧは例１に従って準備された。２）変性−ハイブリダイゼーション溶液。ホルムアミドのみ、グリセロールのみ、あるいは硫化デキストランのみを含んだ標識プローベでのハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションを促進しなかった。ＦＩＳＨが溶液Ｇ（グリセロールと硫化デキストトランを含む）あるいは溶液Ｆ（ホルムアミドと硫化デキストランを含む）で実施されたとき、ハイブリダイゼーションシグナルは確実に増強された。考えられる範囲の薬物混合体の研究から、前記の溶液（溶液ＦとＧ）がＦＩＳＨ用の最も効果的な変性−ハイブリダイゼーション媒液であることが確認された。硫化デキストランの濃度は少なくとも１０％、あるいは８％から１２％の範囲でなければならない。ハイブリダイゼーションの効果は５％以下の濃度ではかなり減少した。硫化デキストラン濃度が１５％以上に増加すると、変性−ハイブリダイゼーション溶液の粘性は増加し、標的核酸と標識ＤＮＡプローベとの間のハイブリダイゼーション効果は減少した。溶液Ｆにおいて、ホルムアミドは塩が存在しない環境下でハイブリダイゼーションの効果を高めるのに重要な役割を演じた。１０％の硫化デキストランの存在下でホルムアミド濃度が増加すると、溶液の粘性の増加はハイブリダイゼーション効果を減少させるようであった。さらに、高濃度のホルムアミドはＦＩＳＨ処理中に核や染色体に対して修繕不能な構造的ダメージを引き起こす。最良のホルムアミド濃度は２０％±５％であると確認された。１０％以下のホルムアミド濃度では、ラバーセメントでのシール処理が施されていなければ、スライドはハイブリダイゼーション中にカバースリップの周辺で乾燥する傾向にあった。これらの乾燥スライドは蛍光シグナルを発生しなかった。３０％以上のホルムアミド濃度では、本発明の変性−ハイブリダイゼーション条件下で、スライドは細胞あるいは核の形態学上の特性に大きな破壊作用を及ぼした。ホルムアミドは変性作用を有しており、酵素に対して不活性であるため、溶液Ｆは、タンパクあるいは酵素（例：ワサビ過酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、あるいはアルカリホスファターゼ）とラベルされたプローベに対しては普通は使用できない。しかし、ホルムアミドはＤＮＡ／ＲＮＡの特定プローベでの効果的なハイブリダイゼーションに対しては限定された濃度（すなわち、２０％±５％）で使用が可能なようである。溶液Ｆで処理されたサンプルは、ラバーセメントでシール処理がされていないものにおいては、長時間にわたる乾燥オーブン（または乾燥インキュベータ）内でのハイブリダイゼーションの最中にホルムアミドの蒸発によって素早く乾燥する傾向を有している。一方、ハイブリダイゼーションが湿化インキュベータで長時間実施されれば（ラバーセメント処理なし）、サンプルは過剰に湿気を吸収する傾向にあった。従って、長時間にわたるハイブリダイゼーションでは、スライドを乾燥や過剰湿気吸収から保護するためにラバーセメントによるシール処理は必要である。溶液Ｇは非常に万能な変性−ハイブリダイゼーション媒液であった。蛍光インジツー・ハイブリダイゼーション中のグリセロールや硫化デキストランの正確な役割は決定されていないが、グリセロール濃度が硫化デキストランの存在下でハイブリダイゼーション効果を高めるのに重要な役割を演じているように考えられる。加えて、一般的に、グリセロールは酵素とタンパクを安定させて保護する傾向を有している。効果的なインジツー・ハイブリダイゼーションのための最良のグリセロール濃度は２０％−３０％であった。グリセロール濃度が３５％以上に上昇すると、あるいは、１０％以下に下降すると、蛍光シグナルは大きく劣化した。しかし、１０％の硫化デキストランと共に２０％−５０％の範囲でグリセロール濃度を調整することで、ハイブリダイゼーションに悪影響を及ぼさず、シグナル検出能力にも悪影響を及ぼさずにハイブリダイゼーション温度とハイブリダイゼーション時間を変化させることが可能である。２０％−５０％のグリセロール濃度はハイブリダイゼーションシグナルを達成させるのにさらに長いハイブリダイゼーション時間を要した。ラバーセメントでのシール処理は不要であった。３）細胞内のプローベと核酸のための温度と時間。８０℃から１１５℃の範囲の変性温度を使用した末梢白血球の研究で、変性処理が溶液Ｆで実施されようと、溶液Ｇで実施されようとも、（ラバーセメントでのカバースリップのシール処理なしの）標的核酸と標識プローベの同時変性処理が最も明るい蛍光シグナルを提供することが確認された。これら蛍光シグナルは８０℃以下あるいは１１０℃以上での変性処理によって大きく損なわれた。従って、標的核酸の変性は溶液ＦあるいはＧの存在下で９５℃から１０５℃にて最も効果的であると思われる。９５℃から１１０℃での最良の変性時間は１．５±０．５分間であると確認された。１００℃±５℃での１分間以内あるいは２分間以上の変性処理ではハイブリダイゼーションシグナルは劣化した。ハイブリダイゼーションシグナルの密度はこれら条件下では溶液Ｆでも溶液Ｇでもほとんど同じであった。４）ハイブリダイゼーションのための温度と時間１００℃±５℃での１．５±０．５分間の標的核酸とプローベの同時変性処理後、異なるハイブリダイゼーション温度（５分間の３８℃から９０℃）がラバーセメントでのカバースリップのシール処理なしでテストされた。その結果、５０ ℃から６０℃（５５℃±５℃）が効果的なハイブリダイゼーションには最適であることが確認された。ハイブリダイゼーション温度が４５℃以下に降下すると、あるいは６０℃以上に上昇すると、蛍光シグナルの密度は大きく損なわれた。従って、標的核酸と標識プローベとの（溶液ＦあるいはＧの存在下での）効果的なハイブリダイゼーションには５５℃±５℃が最適であることが確認された。４０ｘドライ対物レンズを使用した中間期核でのシグナルの列挙処理には５分間のハイブリダイゼーション時間が前述の実験条件下で適当であった。一方、全体で２０−３０分間のインキュベーション処理はハイブリダイゼーションシグナルを増強し、２０ｘ対物レンズで蛍光シグナルの列挙処理を可能にした。２０ｘ対物レンズを使用した場合、核のサイズは列挙には小さすぎた。他に、サンプルスライドを変性（denaturation）させるため、１．５±０．５分間摂氏１００度±５度にてアルミニウムシェルフ上に置かれた。前記スライドとシェルフは、ラボラトリーベンチのドローワー内に５分間入れられ、ラボラトリー内の周囲の温度まで自然冷却された。これも、効果的なハイブリダイゼーション（hybridization）という結果を得た。これらの条件下で観察された蛍光（f luorescence）シグナルは、上記の５分間摂氏５５度±５度でのハイブリダイゼーションにより観察されたものとほとんど同じであった。上記のハイブリダイゼーション手順は、どちらも１５分間で蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを非常に効果的に検出できたため、本発明にとって一晩中（overnight）のハイブリダイゼーションは不要である。しかしながら、一晩中のハイブリダイゼーションの有効性を確かめるため、以下の３つの手順が行われた。（ａ）変性スライドが約摂氏３８度のドライインキュベーター又はオーブン内にて一晩中培養された（incubated）。カバースリップとグラススライドの間にはラバーセメントによるシーリング（sealing）はされなかった。翌朝、当該スライドは、直接、ホストハイブリダイゼーション洗浄（post-hybridization was hings）の対象とされた（以下参照）。明るいハイブリダイゼーションシグナルが得られ、それによって４０Ｘドライレンズ（dry lens）によるシグナルの計数（enumeratin）が可能となった。（ｂ）変性スライドがラボラトリーベンチのドローワー内に室温にて一晩中入れられた。カバースリップとグラススライドの間にはラバーセメントによるシーリングはされなかった。翌朝、当該スライドは、直接、ポストハイブリダイゼーション洗浄の対象とされた（以下参照）。当該スライドの内のいくつかは、ポストハイブリダイゼーション洗浄の前に、５分間摂氏５５度±５度で培養（インキュベート）された。何れの場合も、明るいハイブリダイゼーションシグナルが検鏡でき、４０Ｘドライレンズによる分析が可能であった。従って、摂氏５５度にて再度ハイブリダイズする必要は無かった。（ｃ）摂氏９５度−１０５度での１．５分間の変性の後、変性スライドを収納した熱いアルミニウムシェルフをラボラトリーベンチのドローワー内に一晩中入れ、ついで当該アルミニウムシェルフ上のスライドを自然冷却し、一晩中放置した。カバースリップとグラススライドの間にはラバーセメントによるシーリングはされなかった。翌朝、当該スライドは、ポストハイブリダイゼーション洗浄の対象とされた（以下参照）。明るいハイブリダイゼーションシグナルが、４０Ｘドライレンズにて鏡検できた。これらの研究から、本発明においては、変性スライド（熱いアルミニウムオーブンシェルフ上の又は外の）をラボラトリー内の室温にて一晩中放置した後、さらにハイブリダイゼーションすることを必要としないことが確かめられた。溶液Ｇについては、周囲の温度にて一晩中放置することにより十分なハイブリダイゼーションが自然に生じた。溶液Ｆは早く乾燥するため、室温の又は摂氏３８度でのドライインキュベーター内でのラバーセメントによるシーリング無しで一晩中ハイブリダイゼーションすることは、溶液Ｆについては試みられなかった。しかしながら、ラバーセメントを用いた一晩中のハイブリダイゼーションによっては、強いハイブリダイゼーションシグナルが観察された。一方、上記から分かるように、溶液Ｇでは、ラバーセメントに頼ることなく、一晩中のハイブリダイゼーションにより、効果的なハイブリダイゼーションシグナルが得られた。溶液Ｇ内のグリセロール（glycer ol）の存在が、サンプルを乾燥から防いだのである。５）ポストハイブリダイゼーション洗浄及びシグナルの可視化（visualizatio n）ハイブリダイズされたスライドは、（カバースリップが取り除かれた後）摂氏３８度の５０％フォルムアミド（formamide）／０．４５％ＮａＣｌ内に３分間浸され、余分なプローベ（probes）又は非特異バウンド（non-specifically bou nd）プローベを取り除き、引き続いて摂氏３８度の０．９％ＮａＣｌ内に５分間置かれ、フォルムアミドを取り除いた。あるいは、ハイブリダイズされたスライドを摂氏６０度の０．１％−０．２％ＮａＣｌ内に５分間入れ、さらに摂氏６０度の新しい０．１％−０．２％ＮａＣｌ内に３分間入れることにより、フォルムアミドを使用しない洗浄が達成される。スライドを空気乾燥した後、顕微鏡にて鏡検できるようにすべく、当該スライドは、ＰＩ（ＦＩＴＣシグナルのため）のＤＡＰＩ（Rhodaminシグナルのため）にて染色された。上記の条件により、フォルムアミドを用いる又は用いない何れの洗浄手順も、非特異バウンド標識プローベ（non-specifically bound labeled probes）を取り除くのに非常に効果的である。フォルムアミドは、高価であり毒性のある化学品である。本発明は、フォルムアミドをＦＩＳＨ手順から除くことができ、さらに、健康障害を防止するという点でより好ましいものである。例３ジゴキシゲニン標識Ｘ(digoxygenin-labeled X)及びビオチン標識Ｙ(biotin-l abeled Y)(又はビオチン標識Ｘ及びジゴキシゲニン標識Ｙ(dioxygenin-labeled Y))を用いた溶液Ｆ及びＧによるＦＩＳＨ（間接ＦＩＳＨ法）ジゴキシゲニン標識Ｘ及びビオチン標識Ｙプローベ(又はビオチン標識Ｘ及びジゴキシゲニン標識Ｙプローベ)の混合プローベは、コマーシャルソースから（商品として）得ることができた。当該プローベは、変性ハイブリダイゼーションＦ又はＧ溶液にて希釈された。 In situ ハイブリダイゼーション処理（即ち変性とハイブリダイゼーションとポストハイブリダイゼーション洗浄）は、例１にて記載の通りに実施された。ポストハイブリダイゼーション洗浄の後、当該スライドは、空気乾燥された。ローダミン結合した（rhodamine-conjugated）アンチ-ジゴキシゲニン（種々のコマーシャルソースから利用可）及びＦＩＴＣコンジュゲートしたアビジン（avidin ）の適当な量の混合物が当該スライドに適用された。あるいは、ローダミンコンジュゲートした及びＦＩＴＣコンジュゲートしたアンチ-ジゴキシゲニンの混合物が当該スライドに適用できる。当該スライドは、摂氏３８度にて５分間湿気のあるインキュベーターの中でインキュベートされた。当該スライドは、ＰＢＳ（ phosphate-buffered saline：りん酸塩緩衝化生理食塩水）内にて２分間づつ３回洗浄された。ついで当該スライドは、空気乾燥された。少量の染色剤（ＤＡＰＩ又はＰＩ）が、例１にて述べたように、顕微鏡による鏡検の前に染色（counte rstain）のために当該スライド上に置かれた（spotted on）。これらの実験から得られた状況から、分析のための油浸（immersion）レンズは不要であった。蛍光による中間期核シグナルの計数（interphase nuclei signal enumeration by fluorescen ce）は、４０Ｘ又は６０Ｘドライ対物レンズ（dry objective）によって十分達成された。このインダイレクトＦＩＳＨにては、追加的な抗体反応（antibody reaction ）とそれに引き続く洗浄のために、全処理に１１分間余分に必要となった。全インダイレクトＦＩＳＨプロトコールは、約３０分から６０分にて終了できる。例４ダイレクト標識蛍光（direct labeled fluorescent）及びインダイレクト標識ＲＮＡプローベを用いた固定パラフィン埋設組織片(fixed paraffin embedded t issue sections)におけるｍＲＮＡＦＩＳＨこの例では、パラフィン埋設された胎盤の組織が、脱パラフィン処理(deparaf finized)、脱水(hydrated)及びプレハイブリダイズ（prehybridized）され、標識ＲＮＡプローベを用いて、胎盤(placental)組織片内の核又は細胞質内のｍＲＮＡを検出すべく、溶液Ｆと０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）の混合物内にてハイブリダイズされた。この目的は、本発明によってｍＲＮＡＦＩＳＨが容易になり、明確なシグナルを作り出すことができるか否かを確かめるためである。本発明は、以下に示す条件下において、ｍＲＮＡＦＩＳＨ処理手順を２４時間以内で終了させることができた。放射性同位体を用いる従来技術においては、１５日以上要している。当該組織サンプルは、適当なサイズに切断され、摂氏５度の４％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）（最低一晩中）内に固定され（fixed）た後、５％サッカロース（sucrose）（最低一晩中）内に処理されるまで置かれ、パラフィン内に埋設され（embedded）、組織片（ＴＳ：tissue sections）に切断された。当該組織片は、キシレン内にて脱パラフィン処理され、さらに、従来技術にて定められたように、段階的な（graded）ＥｔＯＨにて脱水処理された（hydr ated）。当該ＴＳは、プロテイナーゼＫ（Proteinase K）、２．５ug/mlから１０ug/ml 内にて、摂氏３７度で３０分間から１時間半、消化処理され（digested）、りん酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）内にて３回洗浄された。当該ＴＳは、溶液Ｆ及びＤＥＰＣ（プローベ無し）の混合物内にて摂氏３７度で１時間プレハイブリダイズされ、ＰＢＳにて３回洗浄され、シェイキング（shaking）により余分なＰＢＳが取り除かれた。当該プローベは、Ｆ−ＤＥＰＣ溶液内にて２０ng/mlから２００ng/mlに希釈され、当該サンプルに加えられ（およそ 12.5ul／サンプル又は当該サンプルをカバーするのに十分な量）、当該サンプル上にカバーグラスが置かれた。当該カバーグラスは、一晩中のハイブリダイゼーションのためにラバーセメントにてシールされたが、５時間以内のハイブリダイゼーションには、ラバーセメントは不要であった。当該ＴＳは、当該プローベの濃度(concentration)に依存して摂氏５５度から９０度で３から２４時間オーブン内に置かれた。当該カバーグラスは、取り除かれ、当該サンプルは、摂氏６０度で０．１５％ＮａＣｌ内で７分間洗浄された。１５ulのアンチフェード（antifade）（Vector Laboratories）が各サンプルに置かれ、カバーグラスが施された。当該スライドは、６０Ｘのドライレンズを用いて、Texas redトリプルバンドパスフィルタ付きの蛍光顕微鏡にて観察された。シグナルが細胞質（cytoplasm）内に見られた。例５ダイレクト標識蛍光及びインダイレクト標識ＲＮＡプローベを用いた固定パラフィン埋設組織片における、ＤＮＡＦＩＳＨこの例において、パラフィン埋設組織片は、脱パラフィン処理され、再び脱水処理され、変性され、溶液Ｆ及びＧ内でハイブリダイズされた。その目的は、パラフィン埋設組織片内におけるＤＮＡＦＩＳＨについての本発明の有効性を確かめるためである。当該組織及び組織片（ＴＳ）は、例４における場合と同様に準備された。当該プローベ(Imagenetics／Vyses，Inc.、Oncor Inc.、BDS Inc.)は、１ulから９９ ulまで希釈され、およそ12.5 ul／サンプル又はサンプルをカバーするのに充分な量が加えられ、サンプル上にカバーグラスが置かれた。当該カバーグラスは、ラバーセメントにてシールされ、摂氏１００度から１１０度で１．５分間変性された後、一晩中のハイブリダイゼーションに供されたが、５時間以内のハイブリダイゼーションにはラバーセメントは使用されなかった。当該ＴＳは、ハイブリダイゼーションオーブン内に摂氏５５度から９０度の温度で３時間から２４時間置かれた。当該ガバーグラスは取り除かれ、当該サンプルは、摂氏６０度で０．１５％ＮａＣｌ内で７分間洗浄された。１５ulのアンチフェード（Vector Laborator ies）と染色剤（ＤＡＰＩ又はＰＩ）の混合物が各サンプルに置かれ、カバーグラスが施された。当該スライドは、Texas redトリプルバンドパスフィルタ付きのエピ蛍光顕微鏡（epifluorescence microscope）にて観察され、中間期の核（ interphase nuclei）内のシグナルが４０Ｘのドライレンズを用いて見られた。例６異なるフィクサチーフ（fixatives）及びダイレクト標識蛍光及びインダイレクト標識ＤＮＡプローベを用いたペリフェラルブラッド単核細胞（Peripheral b lood mononuclear cells：ＰＢＭＣ）及びポリモルフォヌクレアセル（polymorp honuclear cells：ＰＭＮ）における、ＤＮＡＦＩＳＨこのサンプルにおいては、異なるフィクサチーフが、ダイレクト標識蛍光及びインダイレクト標識ＤＮＡプローベとともに使用された。その目的は、種々のフィクサチーフにて本発明が使用できることを示すためである。ペリフェラルブラッドが、アンチコアギュラント（anticoagulant）チューブ内に集められ、従来技術にて述べたようにＰＢＭＮ及びＰＮＭセパレートされ、種々のフィクサチーフ、１）摂氏−２０度で少なくとも３０分間 3:1 メタノール(Methanol)：グレーシャルアシディックアシド(Glacial acidic acid)（ＭｅＯＨ：Ｈａｃ）フィクサチーフ、２）３０分から３時間４％パラフォルマリデハイド(paraform aldehyde)の後、処理のため、スライドに適用され、空気乾燥された、３）摂氏−２０度で少なくとも３０分間メタノール、にて固定された。フィクサチーフ（１）３：１ＭｅＯＨ：Ｈａｃによる固定方法は、例１にて先に述べた。（２）空気乾燥されたスライド上のパラフォルマリデハイドにて固定された細胞は、２．５ug/mlから１０ug/mlのプロテイナーゼＫ（proteinase k）にて処理され、摂氏３７度で３０分間から１時間半消化され、ＰＢＳ内にて３回洗浄された。（３）当該細胞は、高速で旋回され（vortexed）摂氏−２０度のメタノールが一度に数滴計８ｍｌ加えられ、その後、摂氏−２０度の冷凍庫内に少なくとも３０分間入れられた。上記の各固定方法に従い、当該サンプルは、本発明の既に述べた理想的な方法（例１）で処理された。当該スライドは、Texas redトリプルバンドパスフィルタ付きの蛍光（fluorescent）顕微鏡にて見られ、中間期の核内のシグナルが４０Ｘのドライレンズを用いて観察された。例７ダイレクト標識蛍光及びインダイレクト標識ＤＮＡプローベを用いた、３：１ＭｅＯＨ/Ｈａｃにて固定されたマターナルペリフェラルブラッドサーキュレーション(maternal peripheral blood circulation)からのフェイタル細胞(Feta l cells)内でのＦＩＳＨマターナルペリフェラルブラッドが、アンチコアキュラント（anticoagulant ）チューブ内に集められ、従来技術にて述べたように、当該フェイタル細胞が分離され、摂氏−２０度で少なくとも３０分間 3:1 ＭｅＯＨ：Ｈａｃフィクサチーフ内にて固定された。当該サンプルは、１０００ｇにて１０分間遠心分離され、細胞密度が分析に充分な量に達するまで、各スライドに１０ulのサンプルが適用された（１２ｍｍの蛍光抗体サークル:antibody circle）。７ulの希釈されたプローベがサンプルに加えられ、サンプル上にカバーグラスが施された。当該サンプルは、既に述べた本発明の理想的な方法（例１）で処理された。当該スライドは、Texas redトリプルバンドパスフィルタ付きのエピ蛍光顕微鏡にて鏡検された。例８ダイレクト標識蛍光及びインダイレクト標識ＤＮＡプローベを用いた、３：１ＭｅＯＨ/Ｈａｃにて固定された精液(Sperm)及びノンカルチャードアムニオサイト(noncultured Amniocytes)内でのＦＩＳＨＦＩＳＨのための精液及びノンカルチャードアムニオサイトの準備方法は、同じである。精液又はアムニオサイトのアリコット(aliquots)は、１５ｍｌセントリフュージチューブ内に置かれた。２ｍＭジチオスレイトル(Dithiothreitol：ＤＴＴ)を有するＰＢＳが、クロマチン(chromatin)をデコンデンス(decondense)するために、室温にて４５分間、ｍｌ当たり１０〜２０ｘ１０⁶の濃度で精液又はアムニオサイトに加えられ、その後、１６０ｇにて５分間遠心分離された。スーパーネイタント(supernatant)が破棄され(discarded)、摂氏−２０度の８ｍｌの３：１ＭｅＯＨ/Ｈａｃが加えられ、当該サンプルは、旋回された(vortexed)。当該サンプルは、摂氏−２０度で少なくとも３０分間３：１ＭｅＯＨ/Ｈａｃにて固定された。好ましい固定時間は、摂氏−２０度で一晩中である。当該精液又はアムニオサイトサンプルは、１０００ｇにて１０分間遠心分離された。スーパーネイタントは取り除かれ、サンプルは、適量の３：１ＭｅＯＨ：Ｈａｃにて再度サスペンドされた(resuspended)。フィクサチーフ内にサスペンドされた１０u lのサンプルは、スライド上に置かれ(12mmサークル)、均一な拡散(even distrib ution)が確保される。当該スライドは、少なくとも５分間空気乾燥された。溶液Ｆ又はＧ内で希釈された（１ulから９９ulまで）７ulのＤＮＡプローベ(Imagene tics／Vysis，Inc.、Oncor Inc.、BDS Inc.)が各々１２ｍｍサークルに加えられ、１２ｍｍの円形カバーグラスにてカバーされた。当該サンプルは、既に述べた本発明の理想的な方法（例１）で処理された。当該スライドは、Texas redトリプルバンドパスフィルタ付きの６０Ｘドライレンズの蛍光顕微鏡にて鏡検された。上記の例は、上記の例中で一般的に又は特に記載された反応剤及び／又は操作条件を変更しても同様の成功を収めることができる。本発明は、好適実施例を特に参照しながら詳細に説明されたが、他の実施例においても同様の結果を得ることができる。本発明のバリエーション及び変更例は、当業者にとって明らかであり、そのような変更例と均等物は、添付の請求の範囲にてカバーされるべきものである。上記において引用された全ての参考文献、出願、特許及び刊行物における全ての開示事項は、参考とされたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トンプソン，ドナルド，エム. アメリカ合衆国ニューメキシコ州 87108 アルバカーキ，ノースイースト, モントクレールドライブ，507番地 (72)発明者サルト，グロリア，イー. アメリカ合衆国ニューメキシコ州 87109 アルバカーキ，ノースイースト, チャージャートレール，7833番地

Claims

【特許請求の範囲】１．インジツー・ハイブリダイゼーション処理を実行するための溶液であって、約８重量％から１２重量％の硫化デキストランと、約１０体積％から３０体積％のホルムアミドと、塩と、を含むことを特徴とする溶液。２．前記塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びサリンソジウムシトレート（saline sod ium citrate）から成る群から選択されたものであることを特徴とする請求項１記載の溶液。３．ジエチルピロカーボネート（diethylpyrocarbonate）をさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の溶液。４．グリセロールを含んだインジツー・ハイブリダイゼーション処理を実行するための溶液。５．硫化デキストランをさらに含んでいることを特徴とする請求項４記載の溶液。６．前記硫化デキストランは約８重量％から１２重量％が含まれていることを特徴とする請求項５記載の溶液。７．前記グリセロールは約１５重量％から２５重量％が含まれていることを特徴とする請求項４記載の溶液。８．塩をさらに含んでいることを特徴とする請求項４記載の溶液。９．前記塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びサリンソジウムシトレートから成る群から選択されていることを特徴とする請求項８記載の溶液。１０．前記塩は約０．９重量％含まれていることを特徴とする請求項８記載の溶液。１１．ジエチルピロカーボネートをさらに含んでいることを特徴とする請求項４記載の溶液。１２．蛍光インジツー・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のための方法であって、変性ステップと、５分以内のハイブリダイゼーションステップと、ハイブリダイゼーソン後のステップと、を含んでいることを特徴とする方法。１３．前記変性ステップは約１分間から２分間実施されることを特徴とする請求項１２記載の方法。１４．前記変性ステップは約９５℃から１０５℃で実施されることを特徴とする請求項１３記載の方法。１５．前記ハイブリダイゼーション後のステップは約５分間から１０分間実施されることを特徴とする請求項１２記載の方法。１６．前記ハイブリダイゼーション後のステップは約５５℃から６５℃で実施されることを特徴とする請求項１３記載の方法。１７．前記ハイブリダイゼーションステップは溶液内で実施され、その溶液は、約８重量％から１２重量％の硫化デキストランと、約１０体積％から３０体積％のホルムアミドと、塩と、を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。１８．前記溶液はジエチルピロカーボネートをさらに含んでいることを特徴とする請求項１７記載の方法。１９．前記ハイブリダイゼーションステップは溶液内で実施され、その溶液は硫化デキストランとグリセロールとを含んでいることを特徴とする請求項１２記載の方法。２０．前記溶液はジエチルピロカーボネートをさらに含んでいることを特徴とする請求項１９記載の方法。２１．前記溶液は塩をさらに含んでいることを特徴とする請求項１９記載の方法。２２．前記変性ステップと前記ハイブリダイゼーションステップとは基材上のサンプルの定着剤が存在しない条件下で実施されることを特徴とする請求項１２記載の方法。２３．前記変性ステップと前記ハイブリダイゼーションステップとはホルムアミドが存在しない条件下で実施されることを特徴とする請求項１２記載の方法。２４．前記ハイブリダイゼーションの後ステップはホルムアミドが存在しない条件下での洗浄ステップを含んでいることを特徴とする請求項１２記載の方法。２５．インジツー蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のための方法であって、９５℃から１０５℃での変性ステップと、４５℃から６０℃でのハイブリダイゼーションステップと、ハイブリダイゼーション後のステップと、を含んでいることを特徴とする方法。２６．前記変性ステップと、前記ハイブリダイゼーションステップと、前記ハイブリダイゼーション後のステップとは全て１５分以内に完了することを特徴とする請求項２５記載の方法。２７．前記ハイブリダイゼーションステップは溶液内で実施され、その溶液は、約８重量％から１２重量％の硫化デキストランと、約１０体積％から３０体積％のホルムアミドと、塩と、を含むことを特徴とする溶液。２８．前記溶液はジエチルピロカーボネートをさらに含んでいることを特徴とする請求項２７記載の方法。２９．前記ハブブリダイゼーションは溶液内で実施され、その溶液は硫化デキストランとグリセロールとを含んでいることを特徴とする請求項２５記載の方法。３０．前記溶液はジエチルピロカーボネートをさらに含んでいることを特徴とする請求項２９記載の方法。３１．前記溶液は塩をさらに含んでいることを特徴とする請求項２９記載の方法。３２．前記変性ステップと前記ハイブリダイゼーションステップとは基材上のサンプルの定着剤が存在しない条件下で実施されることを特徴とする請求項２５記載の方法。３３．前記変性ステップと前記ハイブリダイゼーションステップとはホルムアミドが存在しない条件下で実施されることを特徴とする請求項２５記載の方法。３４．前記ハイブリダイゼーション後のステップはホルムアミドが存在しない条件下での洗浄ステップを含んでいることを特徴とする請求項２５記載の方法。３５．ｍＲＮＡのためのインジツー・ハイブリダイゼーション処理方法であって、ａ）ハイブリダイゼーション前ステップと、ｂ）５分以内でのハイブリダイゼーションステップと、ｃ）ハイブリダイゼーション後ステップと、を含んでいることを特徴とする方法。３６．前記ハイブリダイゼーション前ステップと、前記ハイブリダイゼーションステップと、前記ハイブリダイゼーション後ステップとは２４時間以内で完了することを特徴とする請求項３５記載の方法。３７．前記ｍＲＮＡは固定されたパラフィン埋め込み組織の核から得られたものであることを特徴とする請求項３５記載の方法。３８．培養細胞あるいは非培養細胞の核内のＤＮＡまたはｍＲＮＡに対して有効であることを特徴とする請求項３５記載の方法。３９．ｍＲＮＡのためのインジツー・ハイブリダイゼーション処理方法であって、ａ）３７℃から５５℃でのハイブリダイゼーション前ステップと、ｂ）４５℃から８５℃でのハイブリダイゼーションステップと、ｃ）ハイブリダイゼーション後ステップと、を含んでいることを特徴とする方法。４０．前記ハイブリダイゼーション前ステップと、前記ハイブリダイゼーションステップと、前記ハイブリダイゼーション後ステップとは２４時間以内で完了することを特徴とする請求項３９記載の方法。４１．前記ｍＲＮＡあるいはＤＮＡは固定されたパラフィン埋め込み組織の核から得られたものであることを特徴とする請求項３９記載の方法。４２．前記ＤＮＡあるいはｍＲＮＡは培養細胞あるいは非培養細胞の核から得られたものであることを特徴とする請求項３９記載の方法。４３．前記ハイブリダイゼーションステップは、変性温度から室温までの制御温度降下のもとに実行されることを特徴とする請求項２５記載の方法。４４．前記ハイブリダイゼーションステップは、変性温度から室温までの非制御温度降下のもとに実行されることを特徴とする請求項２５記載の方法。４５．固定されたパラフィン埋め込み組織と、冷凍組織切片と、培養細胞あるいは非培養細胞から成る群から選択された少なくとも１つの構成要素の核あるいは細胞質のｍＲＮＡに対して有効であることを特徴とする請求項３５記載の方法。４６．ニトロセルロース紙と、ナイロン紙と、ブロット処理技術媒体とから成る群から選択された少なくとも１つの媒体において有効であることを特徴とする請求項３５記載の方法。４７．固定されたパラフィン埋め込み組織と、冷凍組織切片と、培養細胞あるいは非培養細胞の核あるいは細胞質の核酸の検出と、ニトロセルロースまたはナイロン紙あるいはブロット処理技術に関連して使用される他の媒体に対して有効であることを特徴とする請求項１２記載の方法。４８．ニトロセルロース紙、ナイロン紙、及びブロット技術媒体から成る群から選択された少なくとも１つの媒体上に載せられた、固定されたパラフィン埋め込み組織と、冷凍組織切片と、培養細胞あるいは非培養細胞から成る群から選択された少なくとも１つの構成要素の核あるいは細胞質のｍＲＮＡに対して有効であることを特徴とする請求項３５記載の方法。４９．前記ハイブリダイゼーションステップは約４５℃から６０℃で実施されることを特徴とする請求項１２記載の方法。