ES2391975T3

ES2391975T3 - Vacunas a base de vector adenovírico

Info

Publication number: ES2391975T3
Application number: ES04779179T
Authority: ES
Inventors: Jason G. D. Gall; Thomas J. Wickham; William J. Enright; Douglas E. Brough; Mohammed Zuber; C. Richter King; Gary J. Nabel; Cheng Cheng
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Genvec Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Genvec Inc
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2012-12-03
Anticipated expiration: 2024-07-26
Also published as: US20060286121A1; EP1649028B1; WO2005012537A3; EP1649028A2; WO2005012537A2

Abstract

Uso de un vector adenovírico del no subgrupo C en la fabricación de una composición farmacéutica para la inducciónde una respuesta inmune en un mamífero, en el que (a) el vector adenovírico del no subgrupo C comprendeuna proteína de fibra adenovírica que comprende una secuencia de aminoácido que comprende 80% o más de identidadcon una secuencia de aminoácido de una proteína de fibra adenovírica del subgrupo C, (b) la proteína de fibraadenovírica se une a un virus Coxsackie y al receptor de adenovirus (CAR), y (c) el vector adenovírico comprendeademás una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno el cual es expresado en el mamífero para induciruna respuesta inmune.

Description

Vacunas a base de vector adenovirico

Campo de la invenci6n

La presente invencion pertenece al uso de un vector adenovirico recombinante en la fabricacion de una composicion 5 farmaceutica para induccion de una respuesta inmune en un mamifero.

Antecedentes de la invenci6n

El suministro de productos terapeuticos a sitios de enfermedad en cantidades biologicamente relevantes ha sido un obstaculo para el desarrollo de farmacos durante decadas. Una solucion que ha probado ser una alternativa con exito a las vias de suministro de farmacos tradicionales es el suministro de secuencias de acido nucleico exogeno

10 para la produccion de factores terapeuticos in vivo. Los vectores de transferencia de genes abarcan idealmente una amplia variedad de tipos de celulas, tienen la capacidad para aceptar grandes secuencias de acido nucleico, son seguros, y pueden producirse en cantidades requeridas para el tratamiento de pacientes. Los vectores adenoviricos tienen todos ellos estas propiedades ventajosas y se usan en una diversidad de protocolos para tratar o prevenir trastornos biologicos.

15 Sin embargo, el uso indiscriminado de vectores adenoviricos esta impedido, al menos en parte, por la inmunogenicidad del vector. Una mayoria de la poblacion de los Estados Unidos de America ha sido expuesta a adenovirus de tipo salvaje y han desarrollado inmunidad preexistente a vectores de transferencia de genes a base de adenovirus. Como un resultado de ello, los vectores adenoviricos son rapidamente aclarados de la corriente sanguinea, reduciendose, con ello, la eficacia del vector en el suministro de cantidades biologicamente relevantes de producto de

20 gen. La neutralizacion y/o aclaramiento de vectores adenoviricos en el cuerpo complica el uso de estos vectores como vacunas de ADN. Las vacunas de ADN usan vectores de transferencia de genes para suministrar ADN que codifica el antigeno a las celulas huespedes. Mediante la produccion de proteinas antigenicas in vivo, las colas mediadas por celulas y humorales del sistema inmune son activadas, generandose, de esta forma, una respuesta inmune mas completa contra el antigeno, en comparacion con las vacunas tradicionales en las que son inyectadas

25 dentro del cuerpo proteinas extrafas. A pesar de las caracteristicas ventajosas de los vectores adenoviricos como vehiculos de suministro de genes, la inmunogenicidad del vector evita la dosificacion repetida eficaz, lo que puede ser ventajoso para el "reforzamiento" del sistema inmune contra patogenos, y como resultado de ello, en unicamente una pequefa fraccion de una dosis de vector adenovirico se suministra su carga completa a las celulas huespedes.

El uso terapeutico de vectores adenoviricos esta igualmente limitado por la estabilidad de los vectores adenoviricos.

30 Por ejemplo, la eliminacion de la region E1 del genoma adenovirico del serotipo 5 hace que la deficiente replicacion del adenovirus frecuentemente de como resultado la atenuacion de la regulacion de la expresion de la proteina capsida iX (piX). Aunque la atenuacion de la regulacion de la piX no parece inhibir la produccion de particulas viricas, los vectores adenoviricos deficientes en piX se ha mostrado que son termolabiles in vivo (vease, por ejemplo, Colby y otros, J. Virol., vol. 39, pags. 977980, (1981)), y no pueden encapsidar genomas de longitud total (vease,

35 por ejemplo, GhoshChoudhury y otros, EMBO J., vol. 6, pags. 17331739, (1987), y Caravokyri y otros, J. Virol., vol. 69, pags. 66276633, (1995)).

De acuerdo con ello, existe una necesidad en la tecnica de constructos de vectores adenoviricos alternativos y procedimientos de uso de dichos constructos, para suministrar secuencias de acidos nucleicos, particularmente secuencias de acidos nucleicos que codifiquen antigenos, a las celulas huespedes. La invencion proporciona dicho

40 vector adenovirico y procedimientos de uso. Estas y otras ventajas de la invencion, asi como caracteristicas de la invencion adicionales, resultaran evidentes a partir de la descripcion de la invencion proporcionada en la presente invencion..

Breve sumario de la invenci6n

La invencion pertenece al uso de un vector adenovirico del nosubgrupo C de acuerdo con la reivindicacion 1.

45 La invencion proporciona ademas el uso de una composicion que comprende (a) un vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 que comprende un genoma adenovirico deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1A del genoma adenovirico y la region E1B del genoma adenovirico que codifica la proteina E1B de 55K y (b) un soporte. Ademas, la invencion proporciona un procedimiento de produccion de un vector adenovirico. El procedimiento comprende la introduccion de un vector adenovirico del serotipo 41 o un vector

50 adenovirico del serotipo 35 que comprende un genoma adenovirico deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1A del genoma adenovirico y la region E1B del genoma adenovirico que codifica la proteina E1B de 55K dentro de una celula que comprende una secuencia de acido nucleico adenovirico del subgrupo C que codifica la una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1A y la region E1B que son deficientes en el vector adenovirico. La celula comprende ademas un marco de lectura abierto 6

55 (ORF6) de una region E4 adenovirica del subgrupo C. La celula no comprende una secuencia de acido nucleico del nosubgrupo C que codifica la una o mas funciones de la region E1A y la region E1B deficientes en el vector adenovirico. El procedimiento comprende ademas la propagacion del vector adenovirico.

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Breve descripci6n de los dibujos

La Figura 1 es una grafica que ilustra el titulo del virus de los vectores adenoviricos Ad35f y Ad35P5 en funcion del tiempo a 48oC.

La Figura 2 es una grafica que ilustra los resultados del analisis mediante espectroscopia de masas del Ad35 de tipo salvaje y un vector adenovirico Ad35 eliminada la E1.

La Figura 3 es un diagrama que ilustra el genoma de un vector adenovirico Ad35 que comprende la secuencia de acido nucleico que codifica la piX ligada de manera operable a un promotor AAV p5.

La Figura 4 representa un analisis mediante gel de poliacrilamida tefido con plata de la proteinas codificadas por el Ad35 de tipo salvaje y el vector adenovirico Ad35f.

Descripci6n detallada de la invenci6n

La invencion proporciona materiales y su uso para la induccion de una respuesta inmune en un mamifero. En particular, la invencion proporciona vectores adenoviricos adecuados para el suministro de secuencias de acido nucleico que codifican uno o mas antigenos a celulas huespedes y procedimientos de uso de dichos vectores adenoviricos para inducir una respuesta inmune contra uno o mas antigenos codificados. En una realizacion, la invencion proporciona el uso de un vector adenovirico para la induccion de una respuesta inmune en un mamifero, que comprende la administracion al mamifero de un vector adenovirico del nosubgrupo C que comprende una proteina de fibra adenovirica que comprende una secuencia de aminoacido que comprende aproximadamente 80% o mas de identidad con la secuencia de aminoacido que codifica una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. El vector adenovirico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un antigeno que esta expresado en el mamifero, para inducir una respuesta inmune.

Pueden usarse adenovirus procedentes de cualquier origen, cualquier subgrupo, mezcla de subgrupos, o cualquier adenovirus quimerico como la fuente del genoma virico para el vector adenovirico de la invencion. Preferiblemente, se usa un adenovirus humano como la fuente del genoma virico para un vector adenovirico suministrado a pacientes humanos. A este respecto, el adenovirus puede ser del subgrupo C (por ejemplo, serotipos 2 y 5). Sin embargo, en el contexto del procedimiento de la invencion, preferiblemente el adenovirus no es un adenovirus del subgrupo C. Por ejemplo, un adenovirus puede ser del subgrupo A (por ejemplo, serotipos 12, 18, y 31), del subgrupo B (por ejemplo, serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, y 50), del subgrupo D (por ejemplo, serotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 2230, 32, 33, 3639, y 4248), del subgrupo E (por ejemplo, serotipo 4), del subgrupo F (por ejemplo, serotipos 40 y 41), o de un subgrupo no clasificado (por ejemplo, serotipos 49 y 51). Los serotipos adenoviricos 1 al 51 se encuentran disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Preferiblemente, el vector adenovirico es un vector adenovirico del subgrupo B o del subgrupo F. Mas preferiblemente, el vector adenovirico es un vector adenovirico del serotipo 35 o un vector adenovirico del serotipo 41.Los vectores adenoviricos del nosubgrupo C, asi como los procedimientos para la produccion de vectores adenoviricos del nosubgrupo C, estan divulgados, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 5.801.030; 5.837.511; y 5.849.561 y las Solicitudes de Patentes internacionales WO 97/12986 yWO 98/53087.

Un adenovirus usado como la fuente del genoma virico para un vector adenovirico no necesita ser un adenovirus humano. Los adenovirus (no humanos) caninos, ovinos, aviares, bovinos, o simios pueden servir como vectores adenoviricos. Los vectores adenoviricos a base de virus aislados a partir de animales no humanos evitaran igualmente la inmunidad preexistente, puesto que los pacientes humanos no estan de manera natural infectados por estos virus. Los vectores adenoviricos no humanos estan descritos adicionalmente en las Patentes de EE.UU.

6.083.716 y 6.479.290 y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de EE.UU. 2003/009678 A1 y 2003/0108569 A1.

Los adenovirus procedentes de diferentes subgrupos varian en cuanto la reactividad inmunologica, oncogenicidad, y eficacias de transduccion para diferentes tipos de celulas. En general, los adenovirus pueden infectar una amplia diversidad de tipos de celulas. Sin embargo, en la naturaleza, los adenovirus de diferentes subgrupos pueden infectar diferentes tejidos en el cuerpo, por ejemplo, el intestino frente a tejidos respiratorios. El procedimiento de la invencion aprovecha las diferencias de los adenovirus del no subgrupo C en comparacion con los adenovirus del subgrupo C comunmente usados para la transferencia de genes in vivo y a los cuales una mayoria de la poblacion tiene inmunidad preexistente. Los vectores adenoviricos del no subgrupo C no son neutralizados en los mamiferos con inmunidad preexistente a los vectores adenoviricos del subgrupo C tan rapidamente como los vectores adenoviricos del subgrupo C, lo cual permite un mayor tiempo de circulacion e incremento de la eficacia de transduccion (Vogels y otros, Journal of Virology, vol. 77, (no. 15), pags. 82638271, (2003)). Ademas, la tropicidad natural de los vectores adenoviricos del no subgrupo C puede facilitar el suministro de antigeno a un tejido diana deseado.

Sin embargo, los vectores adenoviricos del no subgrupo C pueden comprender atributos unicos que les hacer ser no deseables o, como mucho, menos deseables que los vectores adenoviricos del subgrupo C, en el contexto de vacunas de ADN. Por ello, aunque el vector adenovirico del serotipo 35 evade con exito la inmunidad preexistente a adenovirus, el vector adenovirico podria atenuar la regulacion, bloquear, o fallar en la estimulacion de una respuesta

inmune contra un antigeno deseado. La invencion busca superar los obstaculos asociados con el uso de los vectores adenoviricos del no subgrupo C como vehiculos de vacunas de ADN.

Los vectores adenoviricos del no subgrupo C incapaces de mediar una respuesta inmune contra un antigeno codificado tipicamente difieren de los vectores adenoviricos del subgrupo C en tres aspectos: tropismo para los receptores de superficie de celula, mecanismo de entrada virica, y genoma. Algunos serotipos de adenovirus usan diferentes receptores de superficie de celula para entrar en las celulas huespedes. Por ejemplo, los vectores adenoviricos del subgrupo C del serotipo 5 y serotipo 2 unen los receptores de virus Coxsackie y adenovirus (CAR), los cuales, en combinacion con las integrinas de superficie de celula, median en la entrada virica dentro de la celula huesped. igualmente, los adenovirus del subgrupo C pueden unir el dominio a2 del complejo1 de histocompatibilidad principal (MHC i) y los glucosaminoglicanos de sulfato de heparina a traves de la region boton y la region tallo de la proteina fibra, respectivamente (vease, por ejemplo, Hong y otros, EMBO J., vol. 16, pags. 22942306, (1997), y Dechecchi y otros, J. Virol., vol. 75, pags. 87728780, (2002)). Por el contrario, los vectores adenoviricos del subgrupo B2, tales como los vectores adenoviricos del serotipo 35, se unen de manera natural a CD46, una proteina complemento de superficie de celula, para lograr la entrada dentro de las celulas huespedes (vease, por ejemplo, Gaggar y otros, Molecular Therapy, vol. 7, (no 5), resumen 416, (2003)). La union de bloqueo de un vector adenovirico del no subgrupo C a su receptor de superficie de celula nativo (por ejemplo, una proteina complemento, tal como CD46), puede bloquear la regulacion negativa mediada por vector de una reaccion inmune. igualmente, la modificacion del mecanismo de entrada virica, incluyendo, por ejemplo, el uso de un receptor no nativo para entrar en las celulas, la ablacion de la union nativa y/o el redireccionamiento del sitio diana del capsido adenovirico a las moleculas accesorias de superficie de celula que facilitan la union viruscelula (por ejemplo, las integrinas av), y/o la redesignacion de vias intracelulares implicadas en el ciclado virico del nucleo, pueden inhibir, igualmente, la atenuacion de la regulacion mediada por el vector adenovirico del no subgrupo C, de una reaccion inmune de un mamifero hacia una region codificada. Por otra parte, el redireccionamiento del sitio diana de un capsido de vector adenovirico del no subgrupo C, el cual no se une a un receptor de superficie de celula para un vector adenovirico de un subgrupo C (por ejemplo, CAR, dominio a2 de MHC i, o gucosaminoglicanos de sulfato de heparina), para entrar en celulas huespedes a traves de la union del receptor de superficie de celula del subgrupo C (por ejemplo, mediante la insercion de una secuencia de aminoacido no nativa de union a CAR dentro de la proteina de fibra, el uso de una molecula biespecifica, y similares), puede inhibir o prevenir la atenuacion de la regulacion de la respuesta inmune mediada por el vector adenovirico del no subgrupo C o sobreregular (es decir, potenciar o activar) una reaccion inmune del mamifero a un antigeno codificado.

A tal fin, el vector adenovirico del no subgrupo C del procedimiento de la invencion, comprende, preferiblemente, una proteina de fibra adenovirica que comprende una secuencia de aminoacido que comprende aproximadamente 80% o mas de identidad con una secuencia de aminoacido que codifica una proteina de fibra adenovirica que se une a CAR para mediar en la entrada del virus dentro de una celula huesped. Las proteinas de fibra adenoviricas que se unen a CAR estan descritas, por ejemplo, en la Solicitud de Patente internacional WO 00/15823. De manera ideal, la proteina de fibra adenovirica del vector adenovirico del no subgrupo C comprende una secuencia de aminoacido que comprende aproximadamente 80% o mas de identidad con una secuencia de aminoacido que codifica una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. incluso mas preferiblemente, el vector adenovirico del no subgrupo C comprende proteinas de fibra adenoviricas del subgrupo C (por ejemplo, proteina de fibra adenovirica del serotipo 5) incorporada dentro del capsido virico. La inclusion de una proteina de fibra adenovirica que comprende aproximadamente 80% o mas de identidad con una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C, sirve para la ablacion de la union nativa del vector adenovirico del no sub grupo C, redireccionando el vector adenovirico a CAR, y sirve como un adyuvante en la potenciacion de la respuesta inmune al antigeno codificado. Los adenovirus del subgrupo C incluyen los serotipos adenoviricos 1, 2, 5, y 6. Una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C puede incorporarse dentro de la superficie adenovirica no modificada o puede modificarse segun sea el deseo del manipulador experto. Como alternativa, puede generarse una proteina de fibra sintetica. En cualquier caso, la secuencia de aminoacido de la proteina de fibra adenovirica comprende aproximadamente 80% o mas de identidad (por ejemplo, aproximadamente 85% o mas de identidad, o aproximadamente 90% o mas de identidad) con una secuencia de aminoacido que codifica una proteina de fibra adenovirica de union a CAR, de manera deseable una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. Preferiblemente, la proteina de fibra adenovirica comprende una secuencia de aminoacido que comprende aproximadamente 95% o mas de identidad (por ejemplo, 100% de identidad) con una secuencia de aminoacido que codifica una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C.

"identidad", con respecto a las secuencias de aminoacido o de polinucleotido, se refiere al porcentaje de restos o bases que son identicos en las dos secuencias cuando las secuencias estan optimamente alineadas. Si, en el alineamiento optimo, una posicion en una primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, las secuencias muestran identidad con respecto a dicha posicion. La proporcion de identidad entre dos secuencias (o "por ciento de identidad de secuencias") se mide como una relacion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias con respecto al tamafo de las secuencias (es decir, por ciento de identidad de secuencias = (numero de posiciones identicas/numero total de posiciones9 x 100). Se conocen un cierto numero de algoritmos matematicos para la rapida obtencion del alineamiento optimo y para el calculo de la identidad entre dos o mas secuencias y se encuentran incorporados en un cierto numero de programas de softtare disponibles. Los ejemplos de dichos programas incluyen los programas MATCHBOX, MULTAiN, GCG, FASTA, y ROBUST para el analisis de secuencias de aminoacidos, y los programas

SiM, GAP, NAP, LAP2, GAP2, y PiPMAKER para secuencias de nucleotidos. Los programas para analisis de softtare preferidos tanto para analisis de secuencias de aminoacidos como de polinucleotidos, incluyen los programas ALiGN, CLUSTALW (por ejemplo, la version 1.6 y posteriores versiones del mismo), y BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ, y posteriores versiones de los mismos).

Como alternativa, la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina de fibra adenovirica puede ser suficientemente similar a una secuencia de acido nucleico que codifica la proteina de fibra adenovirica del subgrupo C como para hibridarse bajo condiciones de restriccion al menos moderada, preferiblemente alta, y retener la actividad biologica. Los ejemplos de condiciones de restriccion moderadas incluyen la incubacion durante una noche a 37oC en una solucion que comprende formamida al 20%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), 5x solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmon cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1xSSC a aproximadamente 3750oC, o condiciones substancialmente similares, por ejemplo, las condiciones moderadamente restrictivas descritas en Sambrook y otros, en Molecula Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Net York, (1984). Las condiciones de alta restriccion son condiciones que usan, por ejemplo, (1) baja fuerza ionica y alta temperatura para el lavado, tal como cloruro sodico 0,015 M/citrato sodico 0,0015 M/dodecil sulfato sodico (SDS) al 0,1% a 50oC, (2) uso de un agente desnaturalizante durante la hibridacion, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albumina de suero bovino (BSA) al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona (PVP) al 1%/tampon de fosfato sodico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sodico 750 mM, citrato sodico 75 mM a 42oC, o (3) uso de formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato sodico 0,075 M), fosfato sodico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sodico al 0,1%, 5x solucion de Denharth, ADN de esperma de salmon tratado por ultrasonidos (50 mg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42oC, con lavados a (i) 42oC en 2xSSC, (ii) a 55oC en formamida al 50%, y (iii) a 55oC en 0,1xSSC (preferiblemente en combinacion con EDTA).

Por otra parte, el vector adenovirico no necesita comprender una proteina de fibra entera en la que la secuencia de aminoacido sea 80% o mas identica a una secuencia de aminoacido de un proteina de fibra adenovirica intacta que se una a CAR, por ejemplo, una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. En una realizacion separada, el vector adenovirico puede comprender una proteina de fibra adenovirica quimerica, comprendiendo al menos una porcion de la cual una secuencia de aminoacido que sea nativa para el genoma del vector adenovirico o una secuencia de aminoacido que sea 80% o mas identica a una secuencia de aminoacido que codifique una proteina de fibra adenovirica del adenovirus del no subgrupo C (por ejemplo, un adenovirus del mismo subgrupo y, opcionalmente, serotipo) como el genoma del vector adenovirico. A este respecto, la proteina de fibra adenovirica quimerica, comprende igualmente una secuencia de aminoacido de una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. A fin de ilustrar, pero no limitar el ambito de la invencion, puede construirse un vector adenovirico del serotipo 35 (o del serotipo 41) que comprenda una fibra adenovirica que tenga una region de cola, tallo, y boton. La region de cola de fibra adenovirica es nativa con respecto al vector adenovirico, mientras que las regiones de tallo y boton son regiones de fibra adenoviricas del serotipo 5. Como alternativa, la fibra adenovirica comprende regiones de cola y tallo adenoviricas del serotipo 35 y un boton de fibra adenovirica del serotipo 5. Ademas, la proteina de fibra quimerica puede modificarse tal como se describe en la presente invencion para, por ejemplo, incrementar la antigenicidad, modular la tropicidad, y/o mostrar epitopos antigenicos sobre la superficie virica.

El serotipo 41 antivirico comprende dos tipos distintos de proteina de fibra, una proteina de fibra larga y una proteina de fibra corta, incorporadas dentro de la capsida virica. De acuerdo con ello, una o ambas de las proteinas de fibra de vectores adenoviricos del serotipo 41 pueden modificarse tal como se describe en la presente invencion. Por ejemplo, la proteina de fibra adenovirica larga del serotipo 41, la cual se une a CAR, puede retenerse en tanto que la fibra corta adenovirica del serotipo 41 es reemplazada con una proteina de fibra adenovirica del serotipo 5 o del serotipo 2. Como alternativa, la fibra corta puede manipularse geneticamente para que sea una fibra adenovirica quimerica del serotipo 41 o del serotipo 5, tal como se ha descrito anteriormente. Ademas, la fibra corta puede manipularse geneticamente para que incluya un ligando, tal como un ligando que contiene RDG, para tipos de celulas diana especificas. Los vectores adenoviricos del serotipo 41 proporcionan opciones unicas en el contexto del procedimiento de la invencion con respecto al incremento de la inmunogenicidad del vector, al tiempo que retiene el tropismo nativo. Esto puede llevarse a cabo no solamente intercambiando la proteina de fibra corta con otra proteina de fibra o creando una proteina de fibra quimerica, sino tambien modificando la proteina de fibra para crear una proteina antigenofibra adenovirica quimerica, mediante la cual la proteina antigenofibra quimerica provoca una respuesta inmune al antigeno.

Ademas de la diferencia(s) en los mecanismos de entrada virica, los vectores adenoviricos del no subgrupo C y del subgrupo C difieren en cuanto a sus genomas respectivos. Por ejemplo, la region E3 del adenovirus del serotipo 35 comprende al menos dos secuencias de codificacion adicionales que la region E3 del adenovirus del serotipo 5 (vease, por ejemplo, Vogels, y otros, J. Virol., vol. 77, (no, 15), pags. 82638271, (2003)). Las secuencias de codificacion unicas del adenovirus del no subgrupo C (que no comparte un adenovirus del subgrupo 5) pueden igualmente ser responsables de la atenuacion de la regulacion de una reaccion inmune de un mamifero a un antigeno codificado. El producto(s) del gen codificado por la region del gen temprano E1A, las regiones del gen temprano retardado E1B, E2, E3, y E4, o las regiones tardias L1L5 del genoma adenovirico, pueden inducir a la celula huesped a producir factores que enmascaren el antigeno codificado, alterar el entorno celular para prevenir o distorsionar la presentacion del antigeno a las celulas efectoras inmunes, estimular la produccion de inmunorepresores, inhibir la

produccion de inmunoestimulantes, etc. Para crear vectores adenoviricos del no subgrupo C para la induccion de una respuesta inmune en un mamifero contra un antigeno codificado, el vector adenovirico puede transformarsele en deficiente en una o mas funciones del gen de las regiones tempranas o tardias del genoma adenovirico, por ejemplo, mediante la escision o reemplazo de las regiones del gen relevantes. Como alternativa, una o mas regiones del genoma del vector adenovirico (por ejemplo, las regiones E1A, E1B, E2A, E3, E4, L1, L2, L3, L4, y/o L5) pueden reemplazarse por las regiones correspondientes procedentes de un genoma de adenovirus del subgrupo C (preferiblemente, un genoma adenovirico del serotipo 5). Un constructo de vector adenovirico preferido (por ejemplo, para desarrollo de una vacuna) comprende un genoma de vector adenovirico del no subgrupo C (por ejemplo, un genoma de vector adenovirico del serotipo 35 o del serotipo 41), en el que la region E3 y/o E4 del genoma adenovirico ha sido reemplazada con la region(es) correspondiente de un genoma adenovirico del serotipo 5. No obstante, la capacidad de ciertos vectores adenoviricos del no subgrupo C para evadir la inmunidad preexistente y atenuar la regulacion de una respuesta inmune contra productos transgenicos, puede ser ventajoso al margen del desarrollo de vacunas, para el suministro de una secuencia de acido nucleico exogena, por ejemplo, al ojo, oido interior, nodulos linfaticos, cerebro, y corazon, para tratar o prevenir trastornos biologicos.

El vector adenovirico de la invencion puede ser competente para replicacion. Por ejemplo, el vector adenovirico puede tener una mutacion (por ejemplo, una deleccion, una insercion, o una substitucion) en el genoma adenovirico que no inhiba la replicacion virica en las celulas huespedes. No obstante, preferiblemente, el vector adenovirico es deficiente en la replicacion. Por "deficiente en la replicacion", se entiende que el vector adenovirico comprende un genoma adenovirico que carece de al menos de una funcion del gen esencial para la replicacion (es decir, de manera tal que el vector adenovirico no se replica en celulas huespedes tipicas, especialmente aquellas en un paciente humano que podrian ser infectadas por el vector adenovirico en el trascurso del procedimiento de la invencion). Una deficiencia en un gen, funcion del gen, o gen o region genomica, tal como se usa en la presente invencion, se define como una deleccion de suficiente material genetico del genoma virico como para deteriorar o borrar la funcion del gen cuya secuencia de acido nucleico ha sido eliminada totalmente o en parte. Aunque se prefiere la deleccion del material genetico, la mutacion de material genetico mediante la adicion o substitucion es tambien apropiada para la interrupcion de la funcion del gen. Las funciones del gen esenciales para la replicacion son aquellas funciones del gen que se requieren para la replicacion (por ejemplo, propagacion) y estan codificadas, por ejemplo, por las regiones tempranas adenoviricas (por ejemplo, las regiones E1, E2, y E4), las regiones tardias (por ejemplo, las regiones L1L5), los genes implicados en la encapsidacion virica (por ejemplo, el gen iVa2), y los ARNs asociados a virus (por ejemplo, VARNA1 y/o VARNA2). Mas preferiblemente, el vector adenovirico deficiente para la replicacion comprende un genoma adenovirico deficiente en al menos una funcion del gen esencial para la replicacion de una o mas regiones del genoma adenovirico. Preferiblemente, el vector adenovirico es deficiente en al menos una funcion del gen de la region E1A, la region E1B, o la region E4 del genoma adenovirico requerido para replicacion virica (denominado vector adenovirico deficiente en E1 o deficiente en E4). Ademas de una deficiencia en la region E1, el adenovirus recombinante puede tener igualmente una mutacion en el promotor tardio principal (MLP), tal como se divulga en la Solicitud de Patente internacional WO 00/00628. Lo mas preferiblemente, el vector adenovirico es deficiente en al menos una funcion del gen esencial para la replicacion (de manera deseable, todas las funciones esenciales para la replicacion) de la region E1 y al menos una funcion de la region E3 no esencial (por ejemplo, una deleccion Xbai de la region E3) (denominada un vector adenovirico deficiente en E1/E3). Con respecto a la region E1, el vector adenovirico puede ser deficiente en toda o en parte de la region E1A y en toda o parte de la region E1B. A fin de ilustrar, pero no limitar esta realizacion, un vector adenovirico del serotipo 35 puede comprender una deleccion E1 de los nucleotidos 570 a 3484. Cuando el vector adenovirico es deficiente en al menos una funcion del gen esencial para la replicacion en unicamente una region del genoma adenovirico (por ejemplo, un vector adenovirico deficiente en E1 o E1/E3), al vector adenovirico se le refiere como "individualmente deficiente para la replicacion".

El vector adenovirico de la invencion puede ser "multiplemente deficiente para la replicacion", lo cual significa que el vector adenovirico es deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion en cada una de dos o mas regiones del genoma adenovirico. Por ejemplo, el vector adenovirico deficiente en E1 o deficiente en E1/E3 anteriormente mencionado, puede ser ademas deficiente en al menos una funcion del gen esencial para la replicacion de la region E4 (denominado un vector adenovirico deficiente en E1/E4 o E1/E3/E4), y/o la region E2 (denominado un vector adenovirico deficiente en E1/E2 o E1/E2A/E3), preferiblemente la region E2A (denominado un vector adenovirico deficiente en E1/E2A o E1/E2A/E3).

Mediante la eliminacion de todo o parte de, por ejemplo, las regiones E1, E3, y E4 del genoma adenovirico, el vector adenovirico resultante es capaz de aceptar insertos de secuencias de acido nucleico exogenas al tiempo que retiene la capacidad para ser encapsidado dentro de capsidas adenoviricas. La secuencia de acido nucleico puede estar posicionada en la region E1, la region e3, o la region E4 del genoma adenovirico. Realmente, la secuencia de acido nucleico puede insertarse en cualquier sitio dentro del genoma adenovirico siempre y cuando que la posicion no evite la expresion de la secuencia del acido nucleico o interfiera con la encapsidacion del vector adenovirico. El vector adenovirico puede, igualmente, comprender multiples (es decir, dos o mas) secuencias de acido nucleico que codifiquen el mismo antigeno. Como alternativa, el vector adenovirico puede comprender multiples secuencias de acido nucleico que codifican dos o mas antigenos diferentes. Cada secuencia de acido nucleico puede estar ligada de manera operable al mismo promotor, o a diferentes promotores, dependiendo del perfil de expresion deseado por el experto en manipulacion, y puede insertarse en la misma region del genoma adenovirico (por ejemplo, la region E4) o en diferentes regiones del genoma adenovirico.

El vector adenovirico, cuando se multiplica como deficiente para la replicacion, especialmente en funciones del gen esenciales para la replicacion de las regiones E1 y E4, incluye, preferiblemente, una secuencia espaciadora a fin de proporcionar el crecimiento virico en una linea de celulas complementaria similar a la lograda mediante vectores adenoviricos individualmente deficientes para la replicacion, particularmente un vector adenovirico deficiente en E1. La secuencia espaciadora puede contener cualquier secuencia o secuencias de nucleotido que tengan una longitud deseada, tales como secuencias de al menos aproximadamenter 15 pares de bases (por ejemplo, entre aproximadamente 15 pares de bases y aproximadamente 12.000 pares de bases), preferiblemente aproximadamente 100 pares de bases hasta aproximadamente 10,000 pares de bases, mas preferiblemente aproximadamente 500 pares de bases hasta aproximadamente 8,000 pares de bases, incluso mas preferiblemente aproximadamente 1.500 pares de bases hasta aproximadamente 6.000 pares de bases, y lo mas preferiblemente aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente 3.000 pares de bases de longitud. La secuencia del elemento espaciador puede ser de codificacion o de no codificacion y nativa o no nativa con respecto al genoma adenovirico, pero no restaura la funcion esencial para la replicacion a la region deficiente. Preferiblemente, el elemento espaciador esta localizado en la region E4 del genoma adenovirico. El uso de un espaciador en un vector adenovirico esta descrito en la Patente de EE.UU.

5.851.806.

Se ha observado que, al menos un vector adenovirico deficiente en E4 expresa un transgen a altas proporciones durante una cantidad de tiempo limitada in vivo y que la persistencia de expresion de un transgen en al menos un vector adenovirico deficiente en E4, puede modularse mediante la accion de un factor transactuante, tal como HSV iCP0, Ad pTP, CMViE2, CMViE86, HiV tat, HTLVtax, HBVX, AAV Rep 78, el factor celular procedente de la linea de celulas de osteosarcoma U205 que funciona como el HSV iCP0, o el factor celular en celulas PC12 que esta inducido por el factor de crecimiento de nervios, entre otros, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 6.225.113, la Publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. 2002/0031823 A1, y la Solicitud de Patente internacional WO 00/34496. A la vista de lo anterior, un vector adenovirico multiplemente deficiente (por ejemplo, el al menos vector adenovirico deficiente en E4), o un segundo vector de expresion, comprende, de manera deseable, una secuencia de acido nucleico que codifica una factor transactuante que modula la persistencia de expresion de la secuencia de acido nucleico. La expresion persistente de ADN antigenico puede ser deseada cuando se genera inmunotolerancia.

El vector adenovirico puede ser deficiente en funciones del gen esenciales para la replicacion de unicamente las regiones tempranas del genoma adenovirico, de unicamente la regiones tardias del genoma adenovirico, y de tanto las regiones tempranas como tardias del genoma adenovirico. igualmente, el vector adenovirico puede tener esencialmente eliminado el genoma adenovirico entero, en cuyo caso, se prefiere que al menos o bien las repeticiones terminales invertidas (iTRs) viricas y uno o mas promotores o bien las iTRs y una sefal de encapsidacion, se dejen intactas (es decir, un amplicon adenovirico). En una realizacion, el vector adenovirico de la invencion comprende un genoma adenovirico que carece de secuencias de acido nucleico nativas, las cuales codifican proteinaas adenoviricas. Los elementos genomicos adenoviricos requeridos para la replicacion y encapsidacion del genoma adenovirico dentro de proteinas capsidas adenoviricas pueden ser retenidos. Los vectores adenoviricos minimos que carecen de secuencias de codificacion de proteina adenovirica se denominan vectores adenoviricos "dependientes del ayudante", y frecuentemente requieren complementacion mediante adenovirus ayudante para una eficaz propagacion. Los vectores adenoviricos deficientes para la replicacion adecuados, incluyendo los vectores adenoviricos multiplemente deficientes para la replicacion, estan descritos en las Patentes de EE.UU. 5.837.511; 5.851.806; 5.994.106; 6.127.175; y 6.482.616; las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de EE.UU. 2001/0043922 A1, 2002/0004040 A1, 2002/0031831 A1, y 2002/0110545 A1, y las Solicitudes de Patentes internacionales WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826, y WO 03/022311. De manera ideal, el vector adenovirico deficiente para la replicacion esta presente en una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, substancialmente libre de contaminacion por adenovirus competente para la replicacion (RCA) (por ejemplo, la composicion farmaceutica comprende menos de aproximadamente 1% de contaminacion por RCA). Lo mas deseablemente, la composicion esta libre de RCA. Las composiciones y productos de vectores adenoviricos que estan libres de RCA, estan descritos en la Patente de EE.UU. 5.944.106, la Publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. 2002/0110545 A1,y la Solicitud de Patente internacional WO 95/34671.

Si el vector adenovirico no es deficiente para la replicacion, de manera ideal el vector se manipula a fin de limitar la replicacion del vector dentro de un tejido diana. Por ejemplo, el vector adenovirico puede ser un vector adenovirico de replicacion condicional, el cual esta manipulado geneticamente con el fin replicarse bajo condiciones predeterminadas por el manipulador experto. Por ejemplo, las funciones del gen esenciales para la replicacion, por ejemplo, funciones del gen codificadas por las regiones tempranas adenoviricas, pueden ligarse de manera operable a una secuencia de control de transcripcion inducible, represible, o especifica del tejido, por ejemplo, promotor. En esta realizacion, la replicacion requiere la presencia o ausencia de de factores especificos que interactuen con la secuencia de control de transcripcion. En el tratamiento de una enfermedad autoinmune, puede ser ventajoso el controlar la replicacion del vector adenovirico, por ejemplo, en nudulos linfaticos, para obtener la produccion continua de antigeno y el control de la produccion de celulas inmunes. Los vectores adenoviricos de replicacion condicional estan descritos ademas en la Patente de EE.UU. 5.998.205.

El vector adenovirico del procedimiento de la invencion comprende una proteina de fibra adenovirica, en la que la secuencia de aminoacido de la proteina de fibra adenovirica es 80% o mas identica a la de una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C. Las proteinas de recubrimiento del vector adenovirico, incluyendo la proteina de fibra

del vector adenovirico, pueden modificarse para potenciar o reducir la inmunogenicidad, ampliar o restringir el tropismo del vector, y/o mostrar uno o mas antigenos sobre la superficie virica, mediante la eliminacion y/o insercion de aminoacidos. Por ejemplo, el vector adenovirico puede comprender una proteina de recubrimiento quimerica que comprende una secuencia de aminoacido no nativa que se une a un substrato (es decir, un ligando). La secuencia de aminoacido no nativa de la proteina de recubrimiento adenovirica quimerica permite que un vector adenovirico que comprende la proteina de recubrimiento adenovirica quimerica se una y, de manera deseable, infecte celulas huespedes no infectadas de manera natural por el adenovirus correspondiente sin la secuencia de aminoacido no nativo (es decir, celulas huespedes no infectadas por el adenovirus de tipo salvaje correspondiente), se unan a celulas huespedes infectadas de manera natural por el adenovirus correspondiente con mayor afinidad que el adenovirus correspondiente sin la secuencia de aminoacido no nativa, o se unan a celulas diana particulares con mayor afinidad que las celulas no diana. Por "unirse preferencialmente" se entiende que la secuencia de aminoacido no nativa se une a un receptor, tal como, por ejemplo, integrina av

A3, con al menos aproximadamente 3 veces mas afinidad (por ejemplo, al menos aproximadamente 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 35 veces, 45 veces, o 50 veces mas afinidad) que el ligando no nativo se une a un receptor diferente, tal como, por ejemplo, integrina avA1.

De manera deseable, el vector adenovirico comprende una proteina de recubrimiento quimerica que comprende una secuencia de aminoacido no nativa que confiere a la proteina de recubrimiento quimerica la capacidad para unirse a una celula inmune mas eficazmente que una proteina de recubrimiento adenovirica de tipo salvaje. En particular, el vector adenovirico puede comprender una proteina de fibra adenovirica quimerica que comprende una secuencia de aminoacido no nativa que facilita la fijacion del vector adenovirico por celulas inmunes, preferiblemente celulas que presentan antigeno, tales como celulas dendriticas, monocitos, y macrofagos. En una realizacion preferida, el vector adenovirico comprende una proteina de fibra quimerica que comprende una secuencia de aminoacido (por ejemplo, una secuencia de aminoacido no nativa) que comprende un motivo RGD que incluye, pero sin limitarse a ellas, CRGDC (SEC iD NO:1), CXCRGDCXC (SEC iD NO:2), en la que X representa cualquier aminoacido, y CDCRGDCFC (SEC iD NO:3), que incrementa la eficacia de transduccion de un vector adenovirico dentro de celulas dendriticas. El motivo RGD, o cualquier ligando de secuencia de aminoacido no nativa, preferiblemente se inserta dentro de la region boton de fibra adenovirica, de manera ideal en una helice expuesta del boton adenovirico, tal como la helice Hi. igualmente, puede adjuntarse una secuencia de aminoacido no nativa al Cterminal de la proteina de fibra adenovirica, opcionalmente mediante una secuencia espaciadora.

En los casos en que las celulas dendriticas tienen la celula diana deseada, la secuencia de aminoacido no nativa puede reconocer una proteina que tipicamente se encuentra sobre superficies de celulas dendriticas tales como proteinas de adhesion, receptores quimiocina, receptores complemento, proteinas de coestimulacion, receptores citocina, moleculas que presentan alto nivel de antigeno, proteinas "homing", proteinas marcadoras, receptores para la fijacion de antigeno, proteinas sefal, receptores de virus, etc. Los ejemplos de dichos sitios potenciales de union de ligandos en celulas dendriticas incluyen integrinas avA3, integrinas avA5, 2A1, receptores 7TM, CD1, CD11a, CD11b, CD11c, CD21, CD24, CD32, CD4, CD40, variantes CD44, CD46, CD49d, CD50, CD54, CD58, CD64, ASPGR, CD80, CD83, CD86, Ecadherina, integrinas, M342, MHCi, MHCii, MiDC8, MMR, OX62, p200MR6, p55, S 100, TNFR, etc. Preferiblemente, en los casos en que las celulas dendriticas estan identificadas como una diana, el ligando reconoce la proteina de superficie de celula CD40, tal como, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo (bi)especifico CD40 o un dominio obtenido de l polipeptido CD40L.

En el caso en que los macrofagos sean la diana deseada, la secuencia de aminoacido no nativa puede reconocer una proteina que tipicamente se encuentra sobre superficies de celulas del macrofago, tales como receptores fosfatidilserina, receptores vitronectina, integrinas, receptores de adhesion, receptores implicados en la transduccion de sefal y/o inflamacion, marcadores, receptores para induccion de citocinas, o receptores sobreregulados tras exposicion por patogenos, miembros de la superfamilia rica en cisteina del receptor purificador (SRCR) del grupo B, receptores de union del acido sialico, miembros de la familia del receptor Fc, moleculas de superficie B71 y B72, receptores de linfocitos, receptores de leucocitos, moleculas que presentan antigenos, y similares. Los ejemplos de proteinas diana de superficie de macrofagos adecuadas incluyen, pero sin limitarse a las mismas, proteoglicanos de sulfato de heparina, integrinas avA3, integrinas avA5, B71, B72, CD11c, CD13, CD16, CD163, CD1a, CD22, CD23, CD29, CD32, CD33, CD36, CD44, CD45, CD49e, CD52, CD53, CD54, CD71, CD87, CD9, CD98, receptores ig, proteinas del receptor Fc (por ejemplo, subtipos de Fca, Fcy, FcE , etc.), receptor b de foliato, HLA Clase i, Sialoadhesina, siglec5, y el receptor2 tipo campana (TLR2).

En el caso en que las celulas B sean la diana deseada, el ligando puede reconocer una proteina que tipicamente se encuentra sobre superficies de celula B, tales como integrinas y otras moleculas de adhesion, receptores complemento, receptores de interleuquina, receptores de fagocitos, receptores de inmunoglobulinas, marcadores de activacion, receptores de transferrina, miembros de la superfamilia rica en cisteina del receptor purificador (SRCR), receptores del factor de crecimiento, selectinas, moleculas MHC, receptores de TNF, y factores asociados a TNFR. Los ejemplos de proteinas de superficie de celula B tipicos incluyen Aglucano, receptor de antigeno de celula B (BAC), B72, receptor de celula B (BCR), receptor C3d, CD1, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD35, CD40, CD5, CD6, CD69, CD71, dimero CD79a/CD79b, CD95, endoglina, antigeno Fas, receptores ig humanos, proteinas del receptor Fc (por ejemplo, subtipos de Fca, Fcg, FcE, etc.), igM, gp200MR6, receptor de la hormona del crecimiento (GHR), iCAM1, iLT2, CD85, moleculas MHC clase i y ii, receptor del factor de crecimiento de transformacion (TGFR), integrina a4A7, e integrina avA3,

En otra realizacion, el vector adenovirico comprende una proteina de recubrimiento de virus quimerica no selectiva para un tipo especifico de celula eucariotica. La proteina de recubrimiento quimerica difiere de la proteina de recubrimiento de tipo salvaje por una insercion de una secuencia de aminoacido no nativa dentro, o en lugar, de una secuencia de proteina de recubrimiento interna, o por la union de una secuencia de aminoacido no nativa al No Cterminal de la proteina de recubrimiento. Por ejemplo, un ligando que comprende aproximadamente cinco a aproximadamente nueve restos de lisina (preferiblemente, siete restos de lisina) esta unido al Cterminal de la proteina de fibra adenovirica mediante una secuencia espaciadora de no codificacion. En esta realizacion, la proteina de recubrimiento de virus quimerica se une de manera eficaz a un intervalo mas amplio de celulas eucarioticas que un recubrimiento de virus de tipo salvaje, tal como se describe en la Patente de EE.UU. 6.465.253 y la Solicitud de Patente internacional WO 97/20051. Se prefiere un vector adenovirico de este tipo a fin de asegurar la extensa produccion del antigeno.

La capacidad de un vector adenovirico para reconocer una celula huesped potencial puede modularse sin manipulacion genetica de la proteina de recubrimiento, es decir, a traves del uso de una molecula biespecifica. Por ejemplo, mediante el acomplejamiento de un adenovirus con una molecula biespecifica que comprende un dominio de union de base penton y un dominio que se une de manera selectiva a un sitio de union de superficie de celula particular, se facilita la identificacion del sitio diana del vector adenovirico para un tipo de celula particular. igualmente, puede conjugarse un antigeno a la superficie de la particula adenovirica a traves de medios no geneticos.

Una secuencia de aminoacido no nativa puede conjugarse a cualquiera de las proteinas de recubrimiento adenoviricas para formar una proteina de recubrimiento adenovirica quimerica. De acuerdo con ello, por ejemplo, una secuencia de aminoacido no nativa puede conjugarse con, insertarse en, o unirse a una proteina de fibra, una proteina de base penton, una proteina hexon, proteinas iX, Vi, o iiia, etc. Las secuencias de dichas proteinas, y procedimientos para el uso de las mismas en proteinas recombinantes, son bien conocidas en la tecnica (veanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 5.543.328; 5.559.099; 5.712.136; 5.731.190; 5.756.086; 5.770.442; 5.486.782; 5.962.311; 5.965.541; 5.846.782; 6.057.155; 6.127.525; 6.153.435; 6.329.190; 6.453.314; 6.465.253; 6.576.456; 6.649.407; 6.740.525, y las Solicitudes de Patentes internacionales WO 96/07734, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07877, WO 98/07865, WO 98/40509, WO 98/54346, WO 00/15823, y WO 01/589940). La proteina de recubrimiento adenovirica quimerica puede generarse usando tecnicas de ADN recombinante convencionales conocidas en la tecnica y descritas en la presente invencion. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina de recubrimiento adenovirica quimerica esta localizada dentro del genoma adenovirico y esta ligada de manera operable a un promotor que regula la expresion de la proteina de recubrimiento en un adenovirus de tipo salvaje. Como alternativa, la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina de recubrimiento adenovirica quimerica esta localizada dentro del genoma adenovirico y es parte de una caja de expresion que comprende los elementos geneticos requeridos para la expresion eficaz de la proteina de recubrimiento quimerica (por ejemplo, una secuencia de control de expresion heterologa tal como se describe en la presente invencion).

La porcion de proteina de recubrimiento de la proteina de recubrimiento adenovirica quimerica puede ser una proteina de recubrimiento de longitud total la cual tiene adjuntado el dominio ligando, o puede estar truncada, por ejemplo, internamente o en el C y/o Nterminal. No obstante estar modificada (incluyendo la presencia del aminoacido no nativo), la proteina de recubrimiento quimerica es capaz, preferiblemente, de incorporar dentro una capsida adenovirica. En el caso de la secuencia de aminoacido no nativa este unida a la proteina de fibra, preferiblemente esta no molesta la interaccion entre proteinas viricas o monomeros de fibras. Asi, la secuencia de aminoacido no nativa preferiblemente no es por si misma un dominio de oligomerizacion, ya que como tal puede interactuar negativamente con el dominio de trimerizacion de la fibra adenovirica. Preferiblemente, la secuencia de aminoacido no nativa se agrega a la proteina virion, y se incorpora de una manera tal que esta facilmente expuesta a un substrato, receptor de superficie de celula, o celula inmune (por ejemplo, en el No Cterminal de la proteina adenovirica, unida a un resto enfrentado a un substrato, posicionado sobre un espaciador peptido, etc.) con el fin de exponer lo maximo posible la secuencia de aminoacido no nativa. De manera ideal, la secuencia de aminoacido no nativa se incorpora dentro de una proteina de fibra adenovirica en el Cterminal de la proteina de fibra (y unida mediante un espaciador)

o incorporada dentro de una helice expuesta (por ejemplo, la helice Hi) de la fibra, a fin de crear una proteina de recubrimiento quimerica. En el caso en que la secuencia de aminoacido no nativa esta unida a, o reemplace a una porcion de base penton, preferiblemente esta esta dentro de las regiones hipervariables a fin de asegurar que esta en contacto con el substrato. En el caso en que la secuencia de aminoacido no nativa esta unida al hexon, preferiblemente esta esta dentro de una region hipervariable (Miksza y otros, J. Virol., vol. 70, (no. 3), pags. 18361844, (1996)). En el caso en que el aminoacido no nativo esta unido o reemplaza a una porcion de piX, preferiblemente esta esta dentro del Cterminal de piX. El uso de una secuencia espaciadora para extender la secuencia de aminoacido no nativa mas alla de la superficie de la particula adenovirica, puede ser ventajoso dado que la secuencia de aminoacido no nativa puede estar mas disponible para la union a un receptor, y puede reducirse cualquier interaccion esterica entre la secuencia de aminoacido no nativa y los monomeros de fibra adenoviricos.

Aunque preferiblemente se usa un vector adenovirico del no subgrupo C en la invencion para evitar la inmunidad existente e incrementar la persistencia del vector en el mamifero, el vector adenovirico comprende una fibra adenovirica que entra en las celulas huespedes a traves de la union CAR (por ejemplo, una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C) para provocar una respuesta inmune contra el antigeno codificado. A tal fin, la proteina de fibra adenovirica puede comprender una secuencia de aminoacido no nativa que da como resultado una inmunogenicidad incrementada (antigenicidad) del vector adenovirico en comparacion con un vector adenovirico que es el mismo,

excepto por la presencia de la secuencia de aminoacido no nativa en la proteina de fibra adenovirica. Por ejemplo, una secuencia de aminoacido no nativa que comprende un motivo RGD puede insertarse dentro de la proteina de fibra adenovirica, lo cual potencia la inmunogenicidad de la proteina en un mamifero. Por ejemplo, una secuencia de aminoacido no nativa que comprende CRGDC (SEC iD NO:1) puede insertarse dentro o adjuntarse a la proteina de fibra adenovirica. Otras secuencias de aminoacido no nativas que contienen RGD adecuadas incluyen pero sin limitarse a ellas, CXCRGDCXC (SEC iD NO:2), en la que X puede ser cualquier aminoacido, y CDCRGDCFC (SEC iD NO: 3). La proteina de fibra adenovirica (u otra proteina de recubrimiento adenovirica) puede igualmente modificarse por medios no geneticos para incrementar el efecto adyuvante de la particula virica.

Si se desea, la union nativa de proteinas de recubrimiento adenovircas a un receptor de superficie de celula puede interrumpirse, reduciendose, de esta forma, la transduccion de celulas huespedes. En esta realizacion, los sitios de union nativos localizados sobre las proteinas de recubrimiento adenoviricas que median la entrada de la celula, por ejemplo, la fibra y/o la base penton, estan ausentes o interrumpidas. Se estima que dos o mas de las proteinas de recubrimiento adenoviricas median en la union a superficies de celulas (por ejemplo, la fibra y base penton). Puede usarse cualquier tecnica adecuada para alterar la union nativa a una celula huesped (por ejemplo, la union al receptor de virus Coxsackie y adenovirus (CAR)). Por ejemplo, el aprovechamiento de las diferentes longitudes de fibras puede llevarse a cabo para separar la union nativa de las celulas mediante la adicion de una secuencia de union a la base penton o boton de fibra. Esta adicion puede realizarse o bien directamente o bien indirectamente a traves de una secuencia de union biespecifica o multiespecifica. Como alternativa, la proteina de fibra adenovirica puede modificarse para reducir el numero de aminoacidos en el tallo de la fibra, creandose, de esta forma, una fibra "de tallo corto" (tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 5.962.311).

Como alternativa, los restos de acido nucleico asociados con la union del substrato nativo pueden mutarse (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente internacional WO 00/15823; Einfeld y otros, J. Virol., vol. 75, (no. 23), pags. 1128411291, (2001); y van Beusechem y otros, J. Virol., vol. 76, (no. 6), pags. 27532762, (2002)), de manera tal que el vector adenovirico que incorpora los restos de acido nucleico mutados es menos capaz de unir su substrato nativo. Por ejemplo, los adenovirus de serotipos 2 y 5 transducen celulas mediante la union de la proteina de fibra adenovirica a CAR y la union de proteinas penton a integrinas localizadas sobre la superficie de la celula. El vector adenovirico puede carecer de union de receptor nativo, por ejemplo, a CAR y/o mostrar union nativa reducida a integrinas mediante la eliminacion o interrupcion del CAR nativo y/o los sitios de union de integrina (por ejemplo, la secuencia RGD localizada en la base penton adenovirica). igualmente, puede reducirse o separarse la union nativa de proteinas de fibra adenoviricas del subgrupo B2 a CD46. La eliminacion o mutacion de sitios de union nativos puede reducir de manera significativa la union nativa (es decir, una proteina de fibra adenovirica quimerica modificada se une a un receptor de superficie de celula nativa con al menos aproximadamente 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, o 100 veces menos afinidad que una proteina de fibra adenovirica no modificada del mismo serotipo).

Preferiblemente, el vector adenovirico comprende una proteina de recubrimiento quimerica (por ejemplo, una fibra adenovirica quimerica, hexon, o proteina piX) que comprende una secuencia de aminoacido que codifica un antigeno. Los antigenos son presentados a las celulas efectoras inmunes por celulas que presentan antigenos en dos formatos reconocibles. Los antigenos capturados y recogidos por celulas que presentan antigenos son procesados y presentados sobre la superficie de la celula por complejos de histocompatibilidad mayor ii (MHC ii). Los antigenos presentados por MHC ii estimulan las celulas ayudantes e, indirectamente, las celulas citotoxicas T, asi como la respuesta inmune humoral mediada por celulas B. El antigeno codificado por la secuencia de acido nucleico del vector adenovirico esta expresada dentro de la celula y esta presentada sobre el antigeno que presenta la superficie de celula asociada con MHC i, lo cual activa las celulas citotoxicas T. De acuerdo con ello, la invencion contempla un procedimiento bidentado de presentacion de antigenos al sistema inmune mediante el suministro de epitopos antigenicos sobre la superficie virica y la produccion de antigenos intracelularmente, dando como resultado una respuesta inmune potenciada en comparacion con la generada por la presentacion de antigeno MHC i o MHC ii unicamente. Los procedimientos para provocar una respuesta inmune mediada por MHC i y MHC ii estan descritos adicionalmente en la Solicitud de Patente internacional WO 01/58478.

Las modificaciones adecuadas a un vector adenovirico se encuentran descritas en las Patentes de EE.UU. 5.543.328; 5.559.099; 5.712.136; 5.731.190; 5.756.086; 5.770.442; 5.846.782; 5.871.727; 5.885.808; 5.922.315; 5.962.311; 5.965.541; 6.057.155; 6.127.525; 6.153.435; 6.329.190; 6.455.314; 6.465.253; 6.576.456; 6.649.407; y 6.740.525; las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de EE.UU. 2001/0047081 A1, 2002/0099024 A1, 2002/0151027 A1,2003/0022355 A1, y 2003/0099619 A1, y las Solicitudes de Patentes internacionales WO 96/07734, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/40509, WO 98/54346, WO 00/15823, WO 01/58940, y WO 01/92549.

La invencion proporciona ademas un vector adenovirico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX adenovirica ligada de manera operable a una secuencia de control de expresion heterologa. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico codifica una proteina piX adenovirica de tipo salvaje, algunos ejemplos de las cuales estan establecidos en la SEC iD Nos: 410; sin embargo, la invencion no esta limitada a estas secuencias a modo de ejemplos. Realmente, las secuencias geneticas pueden variar entre diferentes cepas, y esta ambito natural de variacion alelica esta incluida dentro del ambito de la invencion. De acuerdo con ello, la secuencia de acido nucleico codifica, preferiblemente, una proteina piX que es al menos aproximadamente 75% homologa a al

menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410 y preferiblemente es al menos aproximadamente 80% homologa a al menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410 (por ejemplo, al menos aproximadamente 85% homologa a al menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410); mas preferiblemente la secuencia de acido nucleico codifica una proteina piX que es al menos aproximadamente 90% homologa a al menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410 (tal como al menos aproximadamente 95% homologa a al menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410), y lo mas preferiblemente la secuencia de acido nucleico codifica una proteina piX que es al menos aproximadamente 97% homologa a al menos aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de una de las SEC iD NOs: 410. Preferiblemente, la homologia se extiende a al menos 25 aminoacidos contiguos, tal como al menos aproximadamente 50 aminoacidos contiguos. La determinacion del grado de homologia, incluyendo la posibilidad de espacios, puede llevarse a cabo usando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la tecnica (por ejemplo, el procedimiento de Clustal o J. Hein usando la tabla de pesos de restos PAM100 o PAM250, BLASTp, etc.). La secuencia de acido nucleico que codifica la proteina piX puede obtenerse a partir de cualquier fuente, por ejemplo, aislada a partir de la naturaleza, generado sinteticamente, aislada a partir de un organismo manipulado geneticamente, y similares. Aunque se prefiere que la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina piX adenovirica este localizada en el genoma adenovirico, la secuencia de acido nucleico puede introducirse dentro de una linea de celulas complementaria adecuada (por ejemplo, sobre un plasmido) conjuntamente con el vector adenovirico.

La secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX adenovirica esta ligada de manera operable a una secuencia de control de expresion heterologa. Una "secuencia de control de expresion" es cualquier secuencia de acido nucleico que promueve, potencia, o controla la expresion (tipicamente y preferiblemente la transcripcion) de otra secuencia de acido nucleico. Tipicamente y preferiblemente, la secuencia de control de expresion comprende ADN de doble hebra. Como alternativa, la secuencia de control de expresion comprende ARN de doble hebra, un hibrido ARNADN, o nucleotidos generados sinteticamente. Preferiblemente, la secuencia de control de expresion comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de acido nucleico que funciona dirigiendo la union de ARN polimerasa y, de esta forma, promueve la transcripcion de la secuencia de acido nucleico ligada de manera operable (por ejemplo, una secuencia promotora o porcion de la misma). Como alternativa, la secuencia de control de expresion comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de acido nucleico que funciona dirigiendo el corte y empalme de la secuencia de acido nucleico ligada de manera operable dentro de una molecula de ARNm transcrita a partir de una secuencia de control de expresion mas arriba (por ejemplo, una secuencia aceptante de corte y empalme). Una secuencia de acido nucleico esta "ligada de manera operable" a una secuencia de control de expresion cuando la secuencia de control de expresion es capaz de promover, potenciar, o controlar la expresion (tipicamente y preferiblemente la transcripcion) de dicha secuencia de acido nucleico.

La secuencia de control de expresion es "heterologa" dado que la secuencia de control de expresion es diferente de,

o esta en una posicion relativa diferente, del promotor ligado de manera operable a la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina piX en un adenovirus de tipo salvaje. Preferiblemente, la secuencia de control de expresion heterologa no se obtiene a partir de, o procede de, o se basa en un promotor de piX adenovirico que se produce de manera natural. Una secuencia de control de expresion se "obtiene" a partir de una fuente cuando esta se aisla a partir de dicha fuente. Una secuencia de control de expresion "procede" de una fuente cuando esta comprende una secuencia aislada a partir de una fuente pero modificada de cualquier manera adecuada (por ejemplo, mediante mutacion u otra modificacion de la secuencia). Una secuencia de control de expresion se "basa en" una fuente cuando su secuencia es altamente homologa con la fuente pero se ha obtenido a traves de procedimientos de sintesis (por ejemplo, sintesis de polinucleotidos, evolucion dirigida, etc.). Por "producirse de manera natural" se entiende que la secuencia de control de expresion esta codificada por una secuencia de acido nucleico que puede encontrarse en la naturaleza y no ha sido modificada sinteticamente. Sin embargo, no obstante lo anterior, la secuencia de control de expresion heterologa puede encontrarse de manera natural en adenovirus, pero localizada en una posicion normativa con respecto a la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina piX. Por ejemplo, en una realizacion, un vector adenovirico deficiente en E1/E4 puede comprender una caja de expresion (por ejemplo, una secuencia de acido nucleico que codifica un antigeno) posicionada en la region E4 eliminada del genoma adenovirico. En consecuencia, como un resultado de la eliminacion de la region E1, el promotor E1A esta posicionado directamente mas arriba de la secuencia de acido nucleico que codifica la piX, de manera tal que la expresion de piX esta regulada por el promotor E1A. El ligado de manera operable de la secuencia de control de expresion heterologa a la secuencia de acido nucleico que codifica la piX puede llevarse a cabo usando cualquier tecnica de ADN recombinante conocida en la tecnica, tales como las descritas en Sambrook y otros, supra.

Preferiblemente, la secuencia de control de expresion heterologa es un promotor heterologo. Un "promotor" es una secuencia de ADN que dirige la union de ARN polimerasa y, en consecuencia, promueve la sintesis de ARN. Cualquier promotor (es decir, tanto aislado de la naturaleza como producido mediante ADN recombinante o tecnicas de sintesis) puede usarse de acuerdo con la invencion para proporcionar la transcripcion de la secuencia de acido nucleico. Preferiblemente, el promotor es capaz de dirigir la transcripcion en una celula eucariotica (de manera deseable mamifera). El funcionamiento del promotor puede ser alterado por la presencia de uno o mas potenciadores (por ejemplo, el potenciador temprano inmediato CMV) y/o silenciadores.

Preferiblemente, la invencion usa un promotor virico. Los promotores viricos adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, promotores de citomegalovirus (CMV), tal como el promotor tempranoinmediato CMV, pro

motores obtenidos del virus de la inmunodeficiencia humana (ViH), tal como el promotor de repeticion terminal largo del ViH, promotores del virus del sarcoma de Rous (RSV), tal como la repeticion terminal larga del RSV, promotores del virus del tumor mamario de raton (MMTV), promotores HSV, tal como el promotor Lap2 o el promotor timidina quinasa del herpes (Wagner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 78, pags. 144145, (1981), promotores obtenidos de SV40 o virus de Epstein Barr, un promotor virico adenoasociado, tal como el promotor p5, y similares. Preferiblemente, el promotor virico es un promotor p5 del virus adenoasociado de SEC iD NO: 11.

El promotor heterologo no necesita ser un promotor virico. Por ejemplo, el promotor heterologo puede ser un promotor celular, es decir, un promotor que impulsa la expresion de de una proteina celular.los promotores celulares preferidos para uso en la invencion dependeran del perfil de expresion deseado para producir la proteina(s) codificada por la secuencia de acido nucleico. En un aspecto, el promotor celular es, preferiblemente, un promotor constitutivo que actua en una diversidad de tipos de celulas. Los promotores constitutivos adecuados pueden impulsar la expresion de genes que codifican factores de transcripcion, genes consecutivos o genes estructurales comunes a celulas eucarioticas. Por ejemplo, el factor de transcripcion Ying Yang 1 (YY1) (tambien denominado como NMP1, NFE1, y UCRBP) es un factor de transcripcion nuclear omnipresente que es un componente intrinseco de la matriz nuclear (Guo y otros, PNAS, vol. 92, pags. 1052510530, (1995)). El JEM1 (tambien conocido como HGMW y BLZF1; Tong y otros, Leukemia, vol. 12, (no. 11), pags. 17331740, (1998), y Tong y otros, Genomics, vol. 69, (no. 3), pags. 380390, (2000)), un promotor omnipresente, especificamente UbC (Marinovic y otros, J. Biol. Chem., vol. 277, (no. 19), pags. 1667316681, (2002)), un promotor de Aactina, tal como el obtenido de pollo, y similares, son apropiados para uso en el procedimiento de la invencion.

Muchos de los promotores descritos anteriormente son promotores constitutivos. En lugar de ser un promotor constitutivo, el promotor heterologo puede ser un promotor regulable, es decir, que esta sobreregulado y/o atenuada laregulacion en respuesta a sefales apropiadas. El uso de una secuencia de control de expresion o de promotor regulable que es particularmente aplicable al desarrollo de vacunas de ADN como proteinas antigenicas, incluyendo antigenos viricos y parasitos, son frecuentemente toxicos para las lineas de celulas que complementan. En una realizacion, las secuencias reguladoras ligadas de manera operable a la secuencia de acido nucleico que codifica la piX, incluye componentes del sistema de expresion de tetraciclina, por ejemplo, sitios de operador tet. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico que codifica la piX esta ligada de manera operable a un promotor que esta ligado de manera operable a uno o mas sitios de operador tet. Un vector adenovirico que comprende una caja de expresion de este tipo, puede propagarse en una linea de celulas de complemento, tal como la 293ORF6 descrita, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 5.994.106 y la Solicitud de Patente internacional WO 95/34671, la cual comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina represora tet. Mediante la introduccion de la proteina represora tet en la linea de celulas de complemento, se inhibe la produccion de piX y la propagacion se desarrolla sin ninguna toxicidad de la celula asociada. Los sistemas de promotores regulables heterologos adecuados incluyen igualmente, pero sin limitarse a ellos, el promotor iL8, el sistema de promotor inducible de metalotionina, el sistema de expresion lacZYA bacteriano, y el sistema T7 polimerasa. Ademas, pueden usarse promotores que estan selectivamente activados en diferentes fases del desarrollo (por ejemplo, los genes globina son transcritos de manera diferencial a partir de promotores asociados a globina en embriones y adultos). La secuencia de promotor heterologa puede contener por lo menos una secuencia reguladora heterologa que responde a la regulacion mediante un agente exogeno. Las secuencias reguladoras responden preferiblemente a agentes exogenos tales como, pero sin limitarse a ellos, farmacos, hormonas, u otros productos de genes.

Como alternativa, la secuencia de control de expresion heterologa puede ser un potenciador heterologo. Un potenciador es cualquier secuencia de polinucleotido con actuacion cis que promueve, induce, o controla de cualquier otra forma (por ejemplo, inhibe) la expresion (preferiblemente, la transcripcion) de una o mas secuencias de acido nucleico ligadas de manera operativa. A un potenciador que inhibe la transcripcion se le denomina tambien un "silenciador". El potenciador puede funcionar o bien en una orientacion directa o bien inversa con respecto a la secuencia de acido nucleico (por ejemplo, desde una posicion "mas abajo" de la secuencia de acido nucleico ligada de manera operativa) y sobre una distancia relativamente larga (por ejemplo, varios kilobases (kb)) a partir de una secuencia de acido nucleico ligada de manera operativa. De acuerdo con ello, el potenciador heterologo puede ser cualquier secuencia de acido nucleico que funcione para inducir, promover, o controlar la expresion en cualquier orientacion y/o a diversas distancias a partir de la secuencia de acido nucleico ligada de manera operable. Por el contrario, un promotor operara en una secuencia de manera especifica, tipicamente en la misma orientacion y mas arriba de la secuencia de acido nucleico, y de una manera mas localizada.

La secuencia de control de expresion heterologa puede comprender o bien un promotor heterologo o un potenciador heterologo, o bien puede construirse una secuencia de control de expresion hibrida que comprenda tanto un promotor heterologo como un potenciador heterologo, o porciones funcionales de los mismos. De acuerdo con la invencion, una "porcion funcional" es cualquier porcion de una secuencia de control de expresion que promueva, potencie,

o controle de manera medible la expresion (tipicamente, la transcripcion) de un acido nucleico ligado de manera operativa. Dicha regulacion de la expresion puede medirse mediante la deteccion de ARN o proteina mediante cualquier tecnica adecuada, conociendose varias de las mismas en la tecnica. Los ejemplos de dichas tecnicas incluyen analisis Northem (vease, por ejemplo, Sambrook y otros, supra, y McMaster y Carmichel, PNAS, vol. 74, pags. 48354838, (1997)), RTPCR (vease, por ejemplo, Patente de EE.UU. 5.601.820, y Zaheer y otros, Neurochem. Res., vol. 20, pags. 14571463, (1995)), procedimientos de hibridacion in situ (veanse, por ejemplo, Patentes de EE.UU.

5.760.340 y 5.506.098), tecnicas mediadas por anticuerpos (veanse, por ejemplo, Patentes de EE.UU. 4.367.110,

4.452.901, y 6.054.467), y ensayos de promotores que usan sistemas de genes informadores tales como el gen luciferasa (vease, por ejemplo, Taira y otros, Gene, vol. 263, pags. 285292, (2001)). En Sambrook y otros, supra, se encuentran detallados otros sistemas de expresion eucarioticos en general.

En otra realizacion de la invencion, la secuencia de control de expresion heterologa puede ser una secuencia de acido nucleico antirepresora. Un "antirepresor" es una secuencia de acido nucleico de actuacion cis que funciona para contrarrestar la expresion del gen, pero que no es en si misma una secuencia promotora. Puede usarse cualquier secuencia antirepresora adecuada en el contexto de la invencion. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico antirepresora se obtiene a partir de, se basa en, o procede de una bacteria o mamifero (vease, por ejemplo, Kataks y otros, Nat. Biotechnol., vol. 21, (no. 5), pags. 5538, (2003)).

Sea cual fuera la secuencia de control de expresion heterologa elegida, esta preferiblemente desregula la expresion de la secuencia de acido nucleico que codifica la piX del promotor ligado de manera operable a una secuencia de acido nucleico que codifica la proteina piX en un adenovirus de tipo salvaje. Tal como se ha expuesto en la presente invencion, los vectores adenoviricos frecuentemente se hacen deficientes para la replicacion mediante la deleccion de toda o parte de la region E1 del genoma adenovirico. Sin embargo, la deleccion de la region E1 se ha mostrado que atenua la regulacion de la expresion de piX, dando como resultado particulas adenoviricas que son inestables a altas temperaturas (es decir, "termolabiles") (vease, por ejemplo, GhoshChoudhury y otros, supra). Los vectores adenoviricos termolabiles no pueden encapsidar genomas de longitud total (vease, por ejemplo, Caravokyri y otros, supra). Se ha encontrado que la alteracion de la expresion de piX mediante la liberacion del gen piX a partir de sus mecanismos de control de expresion endogenos, produce vectores adenoviricos que son mas estables a altas temperaturas (es decir, "termoestables"), en comparacion con vectores adenoviricos deficientes en la proteina piX (por ejemplo, como un resultado de la deleccion de la region E1). Como tal, la termoestabilidad conferida mediante la restauracion de la expresion de piX incrementa la eficacia del virus rescatado a partir del ADN plasmido. igualmente, la termoestabilidad confiere estabilidad potenciada de genomas adenoviricos, incrementandose, de esta forma, la capacidad de encapsidacion del vector adenovirico.

La invencion proporciona ademas un procedimiento para la potenciacion de la estabilidad y/o la capacidad de encapsidacion de un vector adenovirico. El procedimiento comprende: (a) introduccion de un vector adenovirico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una poteina piX adenovirica ligada de manera operable a una secuencia de control de expresion heterologa dentro de una celula, y la propagacion del vector adenovirico, en el que la estabilidad y/o la capacidad de encapsidacion del vector adenovirico esta potenciada en comparacion con un vector adenovirico que carece de una secuencia de acido nucleico que codifica la piX ligada de manera operable a una secuencia de control de expresion heterologa. La estabilidad del vector adenovirico puede determinarse usando cualquier procedimiento conocido, tal como el ensayo de termoestabilidad descrito en los Ejemplos. En una realizacion preferida del procedimiento de la invencion, la capacidad de encapsidacion del vector adenovirico se potencia de manera tal que es aproximadamente 95% o mas (por ejemplo, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, o aproximadamente 98%) de un genoma adenovirico de tipo salvaje correspondiente. Mas preferiblemente, la capacidad de encapsidacion del vector adenovirico es aproximadamente 99% (por ejemplo, aproximadamente 99%, aproximadamente 99,5%, o aproximadamente 99,8%) o mas de un genoma adenovirico de tipo salvaje correspondiente. Lo mas preferiblemente, la capacidad de encapsidacion del vector adenovirico es aproximadamente 100% o mas (por ejemplo, aproximadamente 100,5%, aproximadamente 105%, o aproximadamente 108%) o mas de un genoma adenovirico de tipo salvaje correspondiente.

Aunque la estabilidad y/o eficacia de encapsidacion del vector adenovirico puede potenciarse mediante el ligamiento de manera operable de una secuencia de acido nucleico que codifica la piX a una secuencia de control de expresion heterologa, la estabilidad y/o eficacia de encapsidacion del vector adenovirico puede potenciarse igualmente mediante la modificacion de la secuencia de acido nucleico que codifica la piX, de manera tal que la actividad de la proteina piX se incrementa en comparacion con una proteina piX codificada por una secuencia de acido nucleico sin modificar. En esta realizacion, la secuencia de acido nucleico que codifica la piX esta ligada de manera operable a un promotor de piX de tipo salvaje. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico se muta de manera tal que la proteina piX contiene una eliminacion, substitucion, o adicion de uno o mas aminoacidos. La secuencia de acido nucleico que codifica la piX puede mutarse de cualquier manera adecuada, siempre y cuando que la actividad de la proteina piX se incremente en comparacion con una proteina piX codificada por una secuencia de acido nucleico sin modificar. La actividad de la proteina piX puede medirse usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo los ensayos de viabilidad y estabilidad de virus descritos en los Ejemplos.

El vector adenovirico de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un antigeno, el cual esta expresado en el mamifero para inducir una respuesta inmune. Un "antigeno" es una molecula que inicia una respuesta inmune en un mamifero. Una "respuesta inmune" puede implicar, por ejemplo, la produccion de anticuerpo y/o la activacion de de celulas efectoras inmunes. Un antigeno en el contexto de la invencion, puede comprender cualquier subunidad de cualquier molecula proteinacea, incluyendo una proteina o peptido de origen virico, bacteriano, parasitico, fungico, protozoario, prion, celular, o extracelular, que de manera ideal provoque una respuesta inmune en un mamifero, preferiblemente dando lugar a inmunidad protectora. El antigeno puede ser, igualmente, un autoantigeno, es decir, una proteina autologa que el cuerpo ha identificado de manera equivocada como un invasor extrafo.

En una realizacion, el antigeno es un antigeno virico. El antigeno puede aislarse a partir de cualquier virus incluyendo, pero sin limitarse a ellos, un virus procedente de cualquiera de las familias viricas siguientes: Arenaviridae, Arterivirus, Astroviridae, Baculoviridae, badanavirus, Barnaviridade, Birnaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Capillovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Circoviridae, Closterovirus, Comoviridae, Coronaviridae (por ejemplo, Coronavirus, tal como virus del sindrome respiratorio agudo severo (SARS)), Corticoviridae, Cystoviridae, Deltavirus, Dianthovirus, Enamovirus, Filoviridae (por ejemplo, virus de Marburg y virus del Ebola (por ejemplo, cepa del Zaire, Reston, Costa de Marfil, o Sudan)), Flaviviridae (por ejemplo, virus de la Hepatitis C, virus 1 del Dengue, virus 2 del Dengue, virus 3 del Dengue, y virus 4 del Dengue), Hepadnaviridae (por ejemplo, virus de la Hepatitis B), Herpesviridae (por ejemplo, virus del Herpes humano 1, 2, 3, 4, 5, y 6, y Citomegalovirus), Hypoviridae, Iridoviridae, Leviviridae, Lipothrixviridae, Microviridae, Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de influenza A y B), Papovaviridae, Paramyxoviridae (por ejemplo, sarampion, parotiditis, y virus sincitial respiratorio humano), Parvoviridae, Picomaviridae (por ejemplo, virus de la polio, rinovirus, hepatovirus, y virus aftoso), Poxviridae (por ejemplo, virus vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, rotavirus), Retroviridae (por ejemplo, lentivirus, tal como virus de la inmunodeficiencia humana (ViH) 1 y ViH 2), Rhabdoviridae, y Totiviridae. Preferiblemente, al menos un antigeno del procedimiento de la invencion es un antigeno retrovirico. El antigeno retrovirico puede ser, por ejemplo, un antigeno del HiV, tal como la totalidad o parte de las proteinas gag, env, o pol. Cualquier grupo de ViH es apropiado para la seleccion de antigeno, incluyendo los grupos A, B, C, MN, y similares. igualmente preferible, al menos un antigeno codificado por el vector adenovirico, es un antigeno de coronavirus, tal como un antigeno del virus SARS. Los antigenos del virus SARS adecuados para el procedimiento de la invencion incluyen, por ejemplo, toda o parte de la proteina E, la proteina M, y la proteina espicular del virus SARS. Los antigenos viricos adecuados incluyen tambien toda o parte de la proteina M del Dengue, la proteina E del Dengue, la D1NS1 del Dengue, la D1NS2 del Dengue, y la D1NS3 del Dengue. Los peptidos antigenicos especificamente mencionados en la presente invencion son meramente a modo de ejemplo, puesto que puede usarse cualquier proteina virica en el contexto de la invencion.

El antigeno puede ser un antigeno parasito tal como, pero sin limitarse a ellos, un antigeno Sporozoan. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico puede codificar un antigeno Plasmodian, tal como todo o parte de una proteina Circunmsporozoita, una proteina de superficie Esporozoita, un antigeno en fase higado, una proteina asociada a la membrana apical, o una proteina de superficie Merozoita.

Como alternativa o ademas, al menos un antigeno codificado por el vector adenovirico es un antigeno bacteriano. El antigeno puede originarse a partir de cualquier bacterio, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Halobacterium, Heliobacter, Hyphomicrobium, Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirilium, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus, y Treponema. En una realizacion preferida, al menos un antigeno codificado por la secuencia de acido nucleico es un antigeno Pseudomonas o un antigeno Heliobacter.

Es de resaltar que no se requiere una proteina bacteriana o virica intacta, entera, para producir una respuesta inmune. Realmente, la mayoria de los epitopos antigenicos son de tamafo relativamente pequefo y, en consecuencia, pueden ser suficientes fragmentos de proteina para exposicion al sistema inmune del mamifero. Ademas, puede generarse una proteina de fusion entre dos o mas epitopos antigenicos de uno o mas antigenos. Por ejemplo, todo o parte de la gp120 o gp160 del ViH puede fusionarse con todo o parte de la proteina pol del ViH para generar una respuesta inmune mas completa contra el patogeno ViH comparada con la generada por un epitopo unico. El suministro de proteinas de fusion mediante vector adenovirico a un mamifero permite la exposicion de un sistema inmune a multiples antigenos y, en consecuencia, hace posible una composicion de una unica vacuna para proporcionar inmunidad contra multiples patogenos.

La secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno no esta limitada a un tipo de secuencia de acido nucleico o de ningun origen particular. La secuencia de acido nucleico puede ser ADN recombinante, puede ser ADN genomico, puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADN de epitopos antigenicos potenciales, o puede generarse de manera sintetica. La secuencia de acido nucleico puede estar presente como parte de una caja de expresion, la cual adicionalmente comprende los elementos geneticos requeridos para la eficaz expresion de la secuencia de acido ncleico y la produccion del antigeno codificado. De manera ideal, la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno esta ligada de manera operable a un promotor y a una secuencia de poliadenilacion, tal como se describe en la presente invencion. Para uso en el procedimiento de la invencion, puede seleccionarse un promotor comprobando la compatibilidad de su patron particular de actividad con el patron deseado y la proporcion de expresion del antigeno(s). Por ejemplo, el vector adenovirico puede comprender dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican diferentes antigenos y estan ligadas de manera operable a diferentes promotores que muestran distintos perfiles de expresion. Por ejemplo, se selecciona un primer promotor para mediar en un pico inicial de produccion de antigeno, cebando, de esta forma, al sistema inmune contra un antigeno codificado. Para impulsar la produccion del mismo o diferente antigeno, se selecciona un segundo promotor de manera tal que se producen picos de expresion varios dias despues de la del primer promotor, "reforzando", de esta forma, el sistema inmune contra el antigeno. Como alternativa, puede construirse un promotor hibrido que combine los aspectos deseables de multiples promotores. Por ejemplo, un promotor hibrido de CMVRSV que combine el impetu inicial de actividad del promotor de CMV con la proporcion de alto mantenimiento de actividad del promotor de RSV es especialmente preferido para uso en muchas realizaciones del procedimiento de la invencion. Dado que los antigenos pueden ser toxicos para las celulas

eucarioticas, puede ser ventajoso el modificar el promotor a fin de disminuir la actividad en la complementacion de lineas de celulas usadas para propagar el vector adenovirico.

A fin de optimizar la produccion de proteina, preferiblemente la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno comprende, ademas, un sitio de poliadenilacion despues de la secuencia de codificacion de la secuencia de acido nucleico. Puede usarse cualquier secuencia de poliadenilacion adecuada, incluyendo una secuencia optimizada sintetica, asi como la secuencia de poliadenilacion de BGH (Hormona del Crecimiento Bovino), virus polioma, TK (Timidina Quinasa), EBV (virus de Epstein Barr), y los papilomavirus, incluyendo papilomavirus humanos y BPV (Virus de Papiloma Bovino). Una secuencia de poliadenilacion preferida es la secuencia de poliadenilacion SV40 (Virus del Sarcoma Humano 40). igualmente, preferiblemente todas las sefales de transcripcion convenientes (y sefales de traduccion, en los casos apropiados) estan correctamente dispuestas, de manera tal que la secuencia de acido nucleico esta convenientemente expresada en las celulas dentro de las cuales se han introducido. Si se desea, la secuencia de acido nucleico puede incorporar igualmente sitios de corte y empalme (es decir, sitios aceptores de corte y empalme y donantes de corte y empalme) con el fin de facilitar la produccion de ARNm.

Si la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno codifica una proteina o peptido tratada o secretada, o una proteina que actua intracelularmente, preferiblemente la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno comprende, ademas, las secuencias apropiadas para tratamiento, secrecion, localizacion intracelular, y similares. La secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno puede estar ligada de manera operable a una secuencia sefal, la cual identifica una proteina a la maquinaria celular para la secrecion. Las secuencias sefal apropiadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias lider para cadenas pesadas de inmunoglobulina y citocinas (vease, por ejemplo, Ladunga, Currents Opinions in Biotechnology, vol. 11, pags. 1318, (2000)). Otras modificaciones de proteinas pueden ser requeridas para secretar una proteina a partir de una celula huesped, las cuales pueden determinarse usando tecnicas de laboratorio convencionales. La preparacion de constructos de expresion que codifican antigenos y secuencias sefal estan descritas adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 6.500.641. Los procedimientos de secrecion de proteinas no secretables estan descritos adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 6.472.176, y la Solicitud de Patente internacional WO 02/48377.

La proteina del antigeno codificada por la secuencia de acido nucleico del vector adenovirico puede igualmente modificarse para atacar o incorporar el antigeno sobre la superficie de la celula huesped. A este respecto, el antigeno puede comprender un anclaje de membrana, tal como un anclaje gpi, para conjugacion sobre la superficie de la celula. Puede fusionarse al antigeno un dominio transmembrana para incorporar una terminacion de la proteina del antigeno dentro de la membrana de la celula. Otras estrategias para presentar peptidos sobre una superficie de celula son conocidas en la tecnica y apropiadas para uso en el contexto de la invencion.

En el procedimiento de la invencion, el vector adenovirico se administra preferiblemente a un mamifero (por ejemplo, un humano), en el que la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno esta expresada para inducir una respuesta inmune contra el antigeno. La respuesta inmune puede ser una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune mediada por celula, o, de manera deseable, una combinacion de inmunidad humoral y mediada por celula. De manera ideal, la respuesta inmune proporciona proteccion tras la subsiguiente exposicion con el patogeno que comprende el antigeno. Sin embargo, no se requiere inmunidad protectora en el contexto de la invencion. La administracion del vector adenovirico de la invencion puede usarse igualmente para crear tolerancia inmune para disminuir la severidad de, por ejemplo, enfermedades autoinmunes tales como lupus, psoriasis, y artritis. El procedimiento de la invencion puede usarse ademas para la produccion y recoleccion de anticuerpos.

Para potenciar la respuesta inmune generada contra el antigeno, el vector adenovirico, o un gen diferente que transfiere el vector administrado al mamifero, puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica un estimulador inmune, tal como una citocina, una quimiocina, o un acompafante. La citocina incluye, por ejemplo, Factor Estimulante de Colonias Macrofagas (por ejemplo, GMCSF), interferon Alfa (iFNa), interferon Beta (iFNA), interferon gamma (iFNy), interleuquinas (iL1, iL2, iL4, iL5, iL6, iL8, iL10, iL12, iL13, iL15, iL16, e iL18), la familia TNF de proteinas, Molecula de Adhesion intercelular1 (iCAM1), Antigeno3 Asociado a la Funcion Linfocito (LFA3), B71, B72, ligando tirosina quinasa 3 relacionado con FMS (Flt3L), peptido intestinal vasoactivo (ViP), y ligando CD40. Las quimiocinas incluyen, por ejemplo, quimiocina1 de atraccion de Celula B (BCA1), Fractalcina, proteina de Actividad Estimuladora del Crecimiento de Melanoma (MGSA), quimiocina 1 de Hemofiltrado CC (HCC1), interleuquina 8 (iL8), quimioatraedor alfa de celula T estimulado por interferon (iTAC), Linfotactina, Proteina Quimiotactica Monocita 1 (MCP1), Proteina Quimiotactica Monocita 2 (MCP2), Proteina Quimiotactica Monocita 3 (MCP3), Proteina Quimiotactica Monocita 4 (MCP4), Quimiocina obtenida de Macrofago (MDC), una proteina inflamatoria macrofaga (MiP), Factor de Plaqueta 4 (PF4), RANTES, BRAK, eotaxina, exodo 13, y similares. Las acompafantes incluyen, por ejemplo, las proteina de choque termico Hsp170, Hsc70, y Hsp40. Las citocinas y quimiocinas se encuentran generalmente descritas en la tecnica, incluyendo el catalogo de invivogen (2002)., San Diego, CA.

La invencion puede comprender la administracion de vectores adenoviricos multiples al mamifero, comprendiendo cada vector adenovirico una o mas secuencias de acido nucleico que codifican uno o mas antigenos y/o inmunomoduladores. Si el vector adenovirico comprende mas de una secuencia de acido nucleico exogena, pueden ligarse de manera operable dos o mas secuencias de acido nucleico al mismo promotor (por ejemplo, para formar una secuencia bicistronica), pueden ligarse de modo operable dos o mas secuencias de acido nucleico para separar promotores

del mismo tipo (por ejemplo, el promotor CMV), o pueden ligarse de modo operable dos o mas secuencias de acido nucleico para separar diferentes promotores (por ejemplo, el promotor CMV y el promotor Aactina). Los vectores adenoviricos multiples pueden incluir dos o mas constructos de vector adenovirico que codifican diferentes antigenos, diferentes epitopos de la misma proteina antigenica, la misma proteina antigenica obtenida de diferentes especies o grupos de microorganismos, antigenos procedentes de microorganismos diferentes, y similares. Es de sefalar que, en algunas realizaciones, la administracion de un "coctel" de vectores adenoviricos que codifican diferentes antigenos o diferentes epitopos del mismo antigeno, puede proporcionar una respuesta inmune mas eficaz que la administracion de un unico clon de vector adenovirico a un mamifero.

igualmente, la administracion del vector adenovirico que codifica un antigeno puede ser un componente de un regimen multietapa para la induccion de una respuesta inmune en un mamifero. En particular, el procedimiento de la invencion puede representar una cola de un regimen de inmunizacion de cebado y de refuerzo. En consecuencia, el procedimiento de la invencion puede comprender la administracion al mamifero de un vector de transferencia de gen de cebado que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un antigeno antes de la administracion del vector adenovirico. El antigeno codificado por el vector de transferencia de gen de cebado puede ser el mismo o diferente del antigeno del vector adenovirico. A continuacion, el vector adenovirico se administra para reforzar la respuesta inmune a un patogeno dado. Puede suministrarse mas de una composicion de refuerzo que comprende el vector adenovirico en cualquier intervalo de tiempo adecuado (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas, 16 semanas, o mas despues del cebado), para mantener la inmunidad.

Puede usarse cualquier vector de transferencia de gen como un vector de transferencia de gen de cebado, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, un plasmido, un retrovirus, un virus adenoasociado, un virus vacuna, un virus herpes,

o un adenovirus. De manera ideal, el vector de transferencia de gen de cebado es un plasmido o un vector adenovirico. Como alternativa, puede cebarse o reforzarse una respuesta inmune mediante la administracion del propio antigeno, por ejemplo, una proteina antigenica, patogeno inactivado, y similares.

Puede usarse cualquier via de administracion para suministrar el vector adenovirico al mamifero. Realmente, aunque puede usarse mas de una via para administrar el vector adenovirico, una via particular puede proporcionar una reaccion mas inmediata y mas eficaz que otra via. Preferiblemente, el vector adenovirico se administra via inyeccion intramuscular. igualmente, puede aplicarse una dosis de vector adenovirico o instilarse dentro de cavidades corporales, absorberse a traves de la piel (por ejemplo, via parche transdermico), inhalado, ingerido, aplicado topicamente al tejido, o administrado parenteralmente via, por ejemplo, de administracion intravenosa, peritoneal, o intraarterial.

El vector adenovirico puede administrarse en o sobre un dispositivo que permita la liberacion controlada o sostenida, tal como una esponja, mallas biocompatibles, deposito mecanico, o implante mecanico. Los implantes (vease, por ejemplo, Patente de EE.UU. 5.443.505), dispositivos (vease, por ejemplo, Patente de EE.UU. 4.863.457), tal como un dispositivo implantable, por ejemplo, un deposito mecanico o un implante o un dispositivo que comprende una composicion polimera, son particularmente utiles para la administracion del vector adenovirico. igualmente, el vector adenovirico puede administrarse en la forma de formulaciones de liberacion sostenida (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.378.475) que comprenden, por ejemplo, espuma de gel, acido hialuronico, gelatina, sulfato de condroitina, un polifosfoester, tal como bis2hidroxietiltereftalato (BHET) y/o un acido polilacticoglicolico.

La dosis de vector adenovirico administrada al mamifero dependera de un cierto numero de factores, incluyendo el tamafo de un tejido diana, la extension de cualquier efecto secundario, la via particular de administracion, y similares. La dosis ideal comprende una "cantidad eficaz" de vector adenovirico, es decir, una dosis de vector adenovirico que provoque una respuesta inmune deseada en el mamifero. La respuesta inmune deseada puede implicar la produccion de anticuerpos, proteccion tras la subsiguiente exposicion, inmuno tolerancia, activacion de celulas inmunes, y similares. De manera deseable, una dosis unica de vector adenovirico comprende al menos aproximadamente 1x105 particulas (la cual se denomina igualmente como unidades de particulas) del vector adenovirico. Preferiblemente, la dosis es al menos aproximadamente de 1x106 particulas (por ejemplo, aproximadamente 1x1061x1012 particulas), mas preferiblemente al menos aproximadamente 1x107 particulas, mas preferiblemente al menos aproximadamente 1x108 particulas (por ejemplo, aproximadamente 1x1081x1011 particulas), y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 1x109 particulas (por ejemplo, aproximadamente 1x1091x1010 particulas) del vector adenovirico. Como alternativa, la dosis comprende no mas de aproximadamente 1x1014 particulas, preferiblemente no mas de aproximadamente 1x1013 particulas, incluso mas preferiblemente no mas de aproximadamente 1x1012 particulas, incluso mas preferiblemente no mas de aproximadamente 1x1011 particulas, y lo mas preferiblemente no mas de aproximadamente 1x1010 particulas (por ejemplo, no mas de aproximadamente 1x109 particulas). En otras palabras, una dosis unica de vector adenovirico puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 1x106 unidades de particulas (up), 2x106 up, 4x106 up, 1x107 up, 2x107 up, 4x107 up, 1x108 up, 2x108 up, 4x108 up, 1x109 up, 2x109 up, 4x109 up, 1x1010 up, 2x1010 up, 4x1010 up, 1x1011 up, 2x1011 up, 4x1011 up, 1x1012 up, 2x1012 up, o 4x1012 up del vector adenovirico.

De manera deseable, el vector adenoviricose se administra en una composicion, preferiblemente una composicion aceptable fisiologicamente (por ejemplo, aceptable farmaceuticamente), la cual comprende un vehiculo, preferiblemente un vehiculo aceptable fisiologicamente (por ejemplo, farmaceuticamente) y el vector(es) adenovirico. Puede usarse cualquier vehiculo adecuado dentro del contexto de la invencion, y dichos vehiculos son bien conocidos en la

tecnica. La eleccion del vehiculo estara determinada, en parte, por el sitio particular al cual ha de administrarse la composicion y el procedimiento particular usado para administrar la composicion. De manera ideal, en el contexto de vectores adenoviricos, preferiblemente la composicion esta libre de adenovirus competentes para replicacion.

Las formulaciones adecuadas para la composicion incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones esteriles isotonicas, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, y bacterioestaticos, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores, y conservantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases sellados unidosis o multidosis, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en un estado criodesecado (liofilizado) que requiera unicamente la adicion del vehiculo liquido esteril, por ejemplo, agua, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones extemporaneas a partir de polvos esteriles, granulos, y comprimidos del tipo previamente descrito. Preferiblemente, el vehiculo es una solucion salina tamponada. Mas preferiblemente, el vector de expresion para uso en el procedimiento de la invencion se administra en una composicion formulada para proteger al vector de expresion de dafos antes de la administracion. Por ejemplo, la composicion puede formularse para reducir perdidas del vector adenovirico sobre los dispositivos usados para preparar, almacenar, o administrar el vector de expresion, tales como articulos de vidrio, jeringuillas, o agujas. La composicion puede formularse para disminuir la sensibilidad a la luz y/o la sensibilidad a la temperatura del vector de expresion. A tal fin, la composicion comprende preferiblemente un vehiculo liquido aceptable farmaceuticamente, tal como, por ejemplo, los descritos anteriormente, y un agente estabilizante seleccionado entre el grupo que consiste en polisorbato 80, Larginina, polivinilpirrolidona, trehalosa, y combinaciones de los mismos. El uso de una combinacion de este tipo ampliara la vida media del vector, facilita la administracion, e incrementa la eficacia del procedimiento de la invencion. Las formulaciones para composiciones que contienen vector adenovirico se encuentran descritas ademas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 6.225.289, 6.514.943, la Publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2003/4153065 A1, y la Solicitud de Patente internacional WO 00/34444. igualmente, puede formularse una composicion para potenciar la eficacia de transduccion. Ademas, un experto normal en la tecnica apreciara que el vector adenovirico puede presentarse en una composicion con otros agentes terapeuticos o biologicamente activos. Por ejemplo, factores que controlan la inflamacion, tal como ibuprofeno o esteroides, pueden ser parte de la composicion para reducir el hinchamiento e inflamacion asociados con la administracion in vivo del vector virico. Pueden administrarse estimuladores del sistema inmune para potenciar cualquier respuesta inmune al antigeno. Pueden estar presentes antibioticos, por ejemplo, microbicidas y fungicidas, para tratar la infeccion existente y/o reducir el riesgo de futura infeccion, tal como infeccion asociada con procedimientos de transferencia de genes.

La construccion de vectores adenoviricos es bien conocida en la tecnica. Los vectores adenoviricos pueden construirse y/o purificarse usando los procedimientos establecidos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 5.965.358, 6.168.941, 6.329.200, 6.383.795, 6.440.728, 6.447.995, y 6.475.757, y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de EE.UU. Nos. 2003/0203469 A1 y 2003/0203480 A1, y las Solicitudes de Patentes internacionales WO 98/53087, WO 98/56937, WO 99/15686, WO 99/54441, WO 00/12765, WO 01/77304, y WO 02/29388, asi como otras referencias identificadas en la presente invencion. Un vector adenovirico deficiente para replicacion puede propagarse en una linea de celulas de complementacion, la cual complementa las funciones del gen para el cual el vector adenovirico es deficiente. De manera deseable, la linea de celulas de complementacion comprende, integrada dentro del genoma celular, secuencias de acido nucleico adenovirico que codifican funciones del gen requeridas para la propagacion adenovirica. La fuente de las secuencias de acido nucleico adenovirico en la linea de celulas de complementacion puede ser un adenovirus del mismo subgrupo y/o serotipo del vector adenovirico. Por ejemplo, un vector adenovirico del serotipo 35 deficiente en E1 puede propagarse en una linea de celulas de complementacion que comprende las secuencias de codificacion de E1 de un adenovirus del serotipo 35. Preferiblemente, la linea de celulas de complementacion, la cual permite la propagacion de un vector adenovirico deficiente para replicacion de la invencion, complementa especificamente aquellas funciones que estan perdidas del vector adenovirico deficiente para replicacion de interes. Preferiblemente, una linea de celulas de este tipo contiene el gen(es) de complementacion de una manera no solapada con el fin de minimizar, sino eliminar, la posibilidad de recombinacion del vector proporcionando un vector adenovirico competente para replicacion, tal como se divulga en la Patente de EE.UU. 5.994.106. Sin embargo, el genoma celular no necesita comprender secuencias de acido nucleico, cuyos productos del gen complementen todas las deficiencias de un vector adenovirico deficiente para la replicacion. Una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion que faltan en un vector adenovirico deficiente para la replicacion, pueden ser suministradas por un virus ayudante , por ejemplo, un vector adenovirico que suministra en forma trans una o mas funciones del gen esenciales requeridas para la replicacion del vector adenovirico deseado. El virus ayudante esta frecuentemente manipulado geneticamente para prevenir la encapsidacion de virus ayudantes infecciosos. Por ejemplo, una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1 del genoma adenovirico son proporcionadas por la celula, en tanto que una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1 del genoma adenovirico son proporcionadas por un virus ayudante.

igualmente, es posible propagar vectores adenoviricos del no subgrupo C en lineas de celulas de complementacion disefadas para vectores adenoviricos del grupo C deficientes para replicacion. Realmente, se ha descubierto que los vectores adenoviricos del no subgrupo C deficientes para replicacion pueden propagarse en lineas de celulas de complementacion generadas usando secuencias de codificacion de adenovirus del subgrupo C. Este descubrimiento fue inesperado a la vista de las diferencias substanciales entre los adenovirus del no subgrupo C y los adenovirus

del subgrupo C, tal como se ejemplifica por la relativamente pequefa cantidad de similitud entre productos de genes E1A y E1B de adenovirus del no subgrupo C y adenovirus del subgrupo C.

A este respecto, la invencion proporciona un procedimiento de produccion de un vector adenovirico. El procedimiento comprende la introduccion de un vector adenovirico (por ejemplo, un vector adenovirico del serotipo 41 o un vector adenovirico del serotipo 35) dentro de una celula. El vector adenovirico comprende un genoma adenovirico deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1A del genoma adenovirico y una

o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1B del genoma adenovirico que codifica la proteina E1B de 55K. El vector adenovirico puede comprender ademas deficiencias tales como las descritas en la presente invencion (por ejemplo, deficiencias en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E4). Preferiblemente, el vector adenovirico es deficiente en todas las funciones del gen esenciales de las regiones E1A y E1B del genoma adenovirico. Las secuencias que codifican la region E1A y E1B del adenovirus del serotipo 35 y del serotipo 41 son conocidas en la tecnica y pueden ser eliminadas o mutadas para interrumpir el funcionamiento de los productos de genes codificados. Por ejemplo, la secuencia de codificacion de E1B de 55K del adenovirus del serotipo 35 esta localizada aproximadamente a 19163400 nucleotidos del genoma adenovirico del serotipo 35. La secuencia del genoma adenovirico del serotipo 41 se encuentra disponible en GenBank como No. de Acceso M18289.La secuencia de acido nucleico de codificacion de la proteina E1B de 55K esta localizada aproximadamente a 17313149 nucleotidos del genoma adenovirico del serotipo 41.

La celula del procedimiento de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico adenovirica del subgrupo C que codifica la una o mas funciones del gen esenciales de la region E1 que son deficientes en el vector adenovirico (por ejemplo, la celula produce los productos del gen E1A adenovirico del subgrupo C esenciales y al menos la proteina de 55K codificada por la E1B que no es producida por el vector adenovirico), asi como una secuencia de acido nucleico adenovirica del subgrupo C que codifica funciones del gen esenciales de otras regiones que son deficientes en el vector adenovirico. La celula comprende ademas el marco de lectura abierto 6 (ORF6) de una region E4 adenovirica del subgrupo C. Un ejemplo de linea de celulas apropiada para uso en el procedimiento de la invencion es una linea de celulas 293 que comprende el ORF6 de E4 adenovirico, tal como la linea de celulas 293ORF6 descrita por Brough y otros, en Journal of Virology, vol. 70, (no. 9), pags. 64976501, (1996). Como alternativa o ademas, la celula comprende el ORF3 de una region E4 adenovirica del subgrupo C. Es de resaltar que las funciones del gen esenciales no necesitan estar codificadas por una unica secuencia de acido nucleico, pero pueden estar codificadas por multiples secuencias de acido nucleico que trabajan en comun para suministrar las funciones requeridas del gen esenciales para replicacion. igualmente, pueden proporcionarse una o mas funciones del gen esenciales para replicacion en forma trans mediante otro vector de transferencia del gen, por ejemplo, un plasmido o virus ayudante. La celula del procedimiento de la invencion no comprende secuencias de acido nucleico del no subgrupo C que codifiquen alguna o todas las funciones del gen esenciales deficientes en el vector adenovirico. El procedimiento comprende ademas la propagacion del vector adenovirico, el cual puede aislarse y formularse en una composicion para administracion a un mamifero.

Aunque el procedimiento de produccion de un vector adenovirico esta descrito en la presente invencion con respecto de vectores adenoviricos del serotipo 35 y vectores adenoviricos del serotipo 41, una celula que produzca productos del gen del ORF6 (y/o ORF3) de E1A, E1B, y E4 del subgrupo C (preferiblemente del serotipo 5), puede soportar la replicacion de vectores adenoviricos de cualquier subgrupo (subgrupo A, subgrupo B, subgrupo C, subgrupo D, subgrupo E, y subgrupo F) que comprenda deficiencias en las regiones E1A y, opcionalmente E1B, del genoma adenovirico. El uso de un sistema que comprende vectores adenoviricos del no subgrupo C y celulas que comprenden secuencias de acido nucleico adenovirico del subgrupo C disminuye la probabilidad de producir stocks de vector adenovirico que comprende la contaminacion de adenovirus competentes para replicacion (RCA).

igualmente, la invencion proporciona una composicion, preferiblemente una composicion farmaceutica, que comprende un vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 que comprende un genoma adenovirico deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para replicacion de la region E1A del genoma adenovirico y la region E1B del genoma adenovirico que codifica la proteina E1B de 55K. La composicion comprende ademas un vehiculo (por ejemplo, un vehiculo aceptable farmaceuticamente o fisiologicamente). De manera ideal, la composicion comprende al menos aproximadamente 1x105 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 intactas (por ejemplo, al menos aproximadamente 1x1051x1012 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35), al menos aproximadamente 1x106 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 (por ejemplo, al menos aproximadamente 1x1061x1011 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35, preferiblemente al menos aproximadamente 1x107 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35),

o al menos aproximadamente 1x108 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 (por ejemplo, al menos aproximadamente 1x1081x1010 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35, preferiblemente aproximadamente 1x109 particulas de vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35). El vector adenovirico del serotipo 41 o del serotipo 35 deficiente para replicacion puede comprender cualquiera de las caracteristicas descritas anteriormente con respecto a vectores adenoviricos, incluyendo deficiencias en las funciones esenciales para replicacion codificadas por otras regiones del genoma adenovirico. Los procedimientos de generacion de vectores adenoviricos del no subgrupo C estan descritos ademas en las Patentes de EE.UU. 5.837.511 y 5.849.561, y las Solicitudes de Patentes internacionales WO97/12986 yWO 98/53087.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invencion pero, por supuesto, no beberian considerarse en ningun modo limitativos de su ambito.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la generacion de un vector adenovirico eliminada la E1 basado en un adenovirus del subgrupo F.

Se construyo el genoma completo de un vector adenovirico del serotipo 41 (Ad41) deseado se construyo en forma de un plasmido unico. En primer lugar, se construyo el genoma adenovirico de tipo salvaje de Ad41 de longitud total en forma de plasmido. El genoma adenovirico de Ad41 de tipo salvaje se recombino dentro de un plasmido pequefo mediante el procedimiento AdRescue. En resumen, el plasmido pequefo (es decir, el "plasmido receptor"), pAd41RSQ.BN, se construyo mediante diversas etapas de subclonacion. Las secuencias del genoma Ad41 correspondientes a las primeras 405 bp del genoma adenovirico Ad41 de tipo salvaje se amplificaron mediante reaccion de cadena de la polimerasa (PCR) y clonado con TOPO (invitrogen) dentro de pCR2.1TOPO para crear pCR2.1TOPO.Ad41izquierdo. El extremo izquierdo del genoma adenovirico Ad41 se subclono mediante clonacion por digestion de restriccion Xhoi dentro de pKSii para crear el plasmido pKSiiAd41(1405)izquierdo. El fragmento EcoRi/Pmei procedente de pKSiiAd35(14(1446)izquierdo.Cos (vease Ejemplo 2) conteniendo un sitio lambda cos y lac iq, se subclono dentro de pKSiiAd41(1405)izquierdo digerido con EcoTi/Pmei, para crear el plasmido pKSiiAd41(1405)izquierdo.iqCos. Las secuencias genomicas de Ad41 correspondientes al extremo terminal derecho de 440 bp se amplificaron mediante PCR, se clono con TOPO dentro de pCR2.1TOPO y se subclono mediante digestion de restriccion Xbai dentro de pKSiiAd41(1405)izquierdo.iqCos para crear el plasmido pKSiiAd41(1405)izquierdo.iqCos.Ad41(440bp)Derecho. A continuacion, se clono una caja de seleccion positiva/negativa, BN (descrita por McVey, Journal of Virology, vol. 76, pags. 36703677, (2002)), entre las secuencias genomicas del extremo Ad41 izquierdo y las secuencias genomicas del extremo Derecho en el sitio Saii para generar pKSAd41RSQ.BN. Finalmente, se reemplazo la estructura principal del plasmido pBluescript con un origen de replicacion de ADN p15A y la estructura principal del plasmido de resistencia a la kanamicina para generar el pAd41RSQ.BN. El genoma de longitud total de tipo salvaje de Ad35 se rescato dentro de la forma plasmida mediante recombinacion de homologos con pAd41RSQ.BN. Los E. coli Rec+ se cotransformaron con ADN de tipo salvaje de Ad41 y pAD41RSQ.BN linealizado con Stai. Los plasmidos recombinantes con el genoma Ad41 de longitud completa reemplazando la caja de seleccion BN, se identificaron mediante seleccion de farmaco de bacterias y analisis de enzima de restriccion de ADN plasmido miniprep. Se identificaron dos plasmidos, pAC4116 y pAC4113B., Las celulas 293ORF6 se transfectaron con estos plasmidos. Se observo efecto citopatico (cpe), indicativo de propagacion virica, 6 dias despues de la transfeccion. La pasada del lisado de transfeccion dio como resultado en cpe de celulas 293ORF6 recientes de una manera dependiente de la dosis. El analisis por PCR verifico la presencia del vector adenovirico Ad341y la ausencia de secuencias de nucleotidos del vector adenovirico del serotipo 5 (Ad5) en los vectores adenoviricos resultantes. La transfeccion de celulas 293 con pAC4116 y pAC4113B no dio como resultado pce.

Para construir el genoma completo de un adenovector Ad41 eliminada la E1 que expreso la proteina fluorescente verde (GFP), se recombino pAC4113B con plasmidos lanzadera As41, los cuales contienen 5058 bp lo mas a la izquierda de Ad41 y la caja de seleccion BN se inserto junto a la union de deleccion de los nucleotidos 3613164. El plasmido base resultante, pAC4113BE1 (BNot), se recombino en E. coli con un plasmido lanzadera Ad41, especificamente el pAD41E1(GFP)dpme que contiene, en lugar de la caja de expresion BN, una caja de expresion polyA promotorpotenciador de CMVGFPhormona del crecimiento bovino (BGH). El plasmido del genoma adenovector eliminada la E1 (que carece de los nucleotidos 360 a 31649) de Ad41 resultante, pAC4113B1(f), se digirio con Pmei y se transfecto en celulas 293ORF6 (descritas, por ejemplo, en la Solicitud de Patente internacional WO 95/34671 y por Brough y otros, en Journal of Virology, vol. 70, (no. 9), pags. 64976501, (1996)). Las agrupaciones de celulas positivas a GFP fueren evidentes 5 dias despues de la transfeccion. La pasada del lisado de celulas transfectadas sobre celulas 293ORF6 recientes dio como resultado la aparicion de muchas agrupaciones de celulas positivas a GFP, de acuerdo con la aparicion con la formacion de placas de adenovirus tempranas. Las posteriores pasadas del lisado de infeccion por celulas 293ORF5 recientes dio como resultado un gran numero de celulas positivas a GFP individuales 24 horas despues de la infeccion y muchas agrupaciones de celulas positivas a GFP 5 dias despues de la infeccion. La presencia del vector adenovirico Ad41 se confirmo mediante PCR, y la ausencia de secuencias de acido nucleico Ad5 se confirmo mediante PCR.

Este ejemplo ilustra un procedimiento de construccion de un vector adenovirico, del subgrupo F, serotipo 41, deficiente en todas las funciones del gen esenciales de la region E1 del genoma adenovirico. El vector adenovirico se propago en celulas 293ORF6 para crear un stock de vectores adenoviricos Ad41.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la generacion de un vector adenovirico eliminada la E1 basado en un adenovirus del subgrupo B.

El genoma completo de un vector adenovirico del serotipo 35 (Ad35) deseado se construyo en forma de un plasmido unico. En primer lugar, se construyo el genoma adenovirico de tipo salvaje de Ad35 de longitud total en forma de

plasmido. El genoma adenovirico de Ad35 de tipo salvaje se recombino dentro de un plasmido pequefo mediante el procedimiento AdRescue. En resumen, el plasmido pequefo (es decir, el "plasmido receptor"), pAd35RSQ.BN, se construyo mediante diversas etapas de subclonacion. Las secuencias genomicas de Ad35 correspondientes a las primeras 446 bp del genoma adenovirico Ad35 de tipo salvaje se amplificaron mediante PCR y clonado con TOPO (invitrogen) dentro de pCR2.1TOPO para crear pCR2.1TOPO.Ad35izquierdo. El extremo izquierdo de Ad35 y la secuencia genomica se subclonaron mediante clonacion de digestionrestriccion Xhol dentro de pKSii para crear el plasmido pKSiiAd35(1446)izquierdo. El fragmento Asci procedente de la serie pACE de GenVec de plasmidos (McVey y otros, Journal of Virology, vol. 76, (no. 8), pag. 3670, (2002)) conteniendo un sitio lambda cos y lac iq, se subclono dentro de pKSiiAd35(1446)izquierdo digerido con Asci/Paci, para obtener el plasmido pKSiiAd35(1446)izquierdo.iqCos. Las secuencias genomicas de Ad35 correspondientes al extremo terminal derecho de 440 bp se amplificaron mediante PCR y subclonaron mediante digestionrestriccion Xbai dentro de pKSiiAd35(1446)izquierdo.iqCos para crear el plasmido pKSiiAd35(1446)izquierdo.iqCos.Ad35(440bp)Derecho. A continuacion, se clono la caja de seleccion BN entre las secuencias del genoma Ad35 izquierdo y derecho junto al sitio Saii para generar pKSAd35RSQ.BN. Finalmente, se reemplazo la estructura principal del plasmido pBluescript con un origen de replicacion de ADN p15A y la estructura principal del plasmido de resistencia a la kanamicina para obtener el pAd35RSQ.BN. El genoma de Ad35 de longitud total de tipo salvaje se rescato dentro de la forma plasmida mediante recombinacion de homologos con pAd35RSQ.BN. Los E. coli Rec+ se cotransformaron con ADN de tipo salvaje de Ad35 y pAD35RSQ.BN linealizado con Stai. Los plasmidos recombinantes con el genoma Ad35 de longitud completa reemplazando la caja de seleccion BN, se identificaron mediante seleccion de farmaco de bacterias y analisis de enzima de restriccion de ADN plasmido miniprep. Dicho plasmido se identifico como pAC356, La celulas 293ORF6 se transfectaron con este plasmido, observandose efecto citopatico (cpe) 2 dias despues de la transfeccion. La pasada del lisado de transfeccion dio como resultado el cpe de celulas 293ORF6 recientes de una manera dependiente de la dosis. El analisis por PCR verifico la presencia del vector adenovirico Ad35 y la ausencia de ADN de Ad5.

Se construyo un plasmido conteniendo el genoma completo de un vector adenovirico Ad35 eliminada la E1 que expreso la proteina fluorescente verde (GFP), pAC356E1(f) mediante procedimientos similares al descrito en el Ejemplo 1. El plasmido, conteniendo una deleccion de las secuencias del nucleotido Ad35 447 a 3417, se digirio con Pmei y se transfecto dentro de celulas 293ORF6. Las agrupaciones de celulas positivas a GFP fueron evidentes a los 3 dias despues de la transfeccion. La pasada del lisado de celulas transfectadas sobre 1x106 celulas 293ORF6 recientes dio como resultado la transduccion de las celulas mediante GFP y la aparicion de citopatosis de una manera dependiente de la dosis. La infeccion con 50 1l de lisado de transfeccion dio como resultado cerca de un 100% de celulas positivas a GFP y aproximadamente 70% de las celulas produjeron un efecto citopatico aproximadamente 24 despues de la infeccion. Esto es compatible con el lisado de transfeccion que tiene un titulo infeccioso de al menos 2x107 unidades de transduccion de GFP por ml, correspondiente a una multiplicidad de infeccion de 1 unidad de transduccion de GFP por celula. La infeccion con 450 1l dio como resultado un 100% de celulas positivas a GFP y aproximadamente 95% de las celulas produjeron un efecto citopatico a las 24 horas despues de la infeccion. La presencia del vector adenovirico Ad35 se confirmo mediante PCR, y la ausencia de ADN de Ad5 se confirmo mediante PCR.

Este ejemplo ilustra un procedimiento de construccion de un vector adenovirico, del subgrupo B, serotipo 35, deficiente en todas las funciones del gen esenciales de la region E1 del genoma adenovirico. El vector adenovirico se propago en celulas 293ORF6 para crear un stock de vectores adenoviricos Ad35.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la generacion de un vector adenovirico eliminada la E1/E3 basado en un adenovirus del subgrupo B.

El Ad35 (GenBank Acceso #AY1284640) tiene cinco sitios Xbai en los nucleotidos 23698, 27240, 27924, 28735 y 29726. Mediante digestion con Xbai parcial de Ad35, ligamiento y encapsidacion in vitro de pAC35E1 ("Caja BN", expuesta anteriormente), se genero una deleccion de E3 (Xbai) en el virus Ad35 que abarca 2486 bp de secuencias contenidas entre los nucleotidos 27241 y 29726. Esta deleccion por Xbai de E3 elimina secuencias de de acido nucleico que codifican las proteinas 15K, 18,5K, y 20,3K de E3. La caja BN en la region E1 se reemplazo con una caja de expresion que contiene un promotor CMV que impulsa la expresion de gp140dCFidv12(B) de ViH para crear pAC35E1(RL.CMVint.gp140B.SV40)E3(Xba). Las celulas 293ORF6 se transfectaron con este plasmido y se observo un efecto ciropatico a la primera pasada despues de la transfeccion. El vector Ad35gp140(B).E3(Xba) se expandio sobre una pasada adicional y la presencia del vector se confirmo mediante PCR y analisis de transferencia de Western de la expresion gp140(B). La deleccion de las regiones E1 y E3 se verifico mediante analisis por PCR que fueren especificos tanto para el transgen como para las delecciones. El lisado de virus de celula procedente de la segunda pasada despues de la transfeccion se uso para inocular una placa reciente de 293 celulas. Los extractos de proteinas se prepararon a partir de las celulas infectadas a las 24 horas despues de la infeccion, se electroforetizaron mediante un gel SDSPGE al 7,5%, se mancharon en una membrana de PVDF, y se sondaron con un anticuerpo antiViH. La proteina gp140 se detecto en los extractos de proteina.

Este ejemplo ilustra un procedimiento de construccion de un vector adenovirico del subgrupo B, deficiente en todas las funciones del gen esenciales de la region E1 del genoma adenovirico y deficiente en la region E3 del genoma adenovirico.

Ejemplo 4

Se generaron dos delecciones de la region E4 del genoma adenovirico Ad35, cada una en combinacion con una deleccion de la region E1 del genoma adenovirico Ad35. A este respecto, una caja de expresion que comprende un promotor CMV que controla la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica tanto gp140dCFidV12(B), luciferasa, fosfatasa alcalina secretada, betagalactosidasa, como betaglucoronidasa, se inserto dentro de una deleccion de la region E1 del genoma Ad35 tal como se describe en la presente invencion. La primera deleccion E4, Ad35E4(dORF26), se construyo mediante la generacion de una deleccion de 1749 bp a partir de un sitio endonucleasa de restriccion Nrui junto al nucleotido 32011 (vease GenBank Acceso #AY128640), que esta localizado en las secuencias de no codificacion entre el gen de fibra y la region E4, a un sitio Smai junto al nucleotido 33760 (vease GenBank Acceso#AY128640), que esta localizado dentro de las secuencias de codificacion para la proteina Ad35 E4 ORF2. La proteina Ad35 ORF2 no comparte homologias con la proteina Ad5 E4 ORF2. La segunda deleccion E4, Ad35E4(dORF16), se construyo mediante la generacion de una deleccion diana de 2408 bp, lo cual elimino todas las secuencias de codificacion de E4 desde el sitio Nrui descrito anteriormente hasta la primera adenina (A) en el nucleotido 34419 (vease GenBank Acceso #AY128640), en el codon ATG del Ad35 E4 ORF1.

Los plasmidos genomicos del vector Ad35 que contienen las delecciones E1 y E4 se transfectaron dentro de celulas 293ORF6. La posterior pasada en serie de los lisados de transfeccion demostro que los vectores adenoviricos eliminadas las E1/E4 fueron viables independientemente de la deleccion de E4 y el transgen expresado a partir de la region E1. Mediante una o dos pasadas despues de la transfeccion, el 100% de las celulas experimento un efecto citopatico, inducido por el crecimiento y difusion de los vectores Ad35 eliminadas la E1/E4. La presencia de cada vector se determino mediante analisis por PCR. La deleccion de las regiones E1 y E4 en cada vector se verifico mediante analisis por PCR, el cual identifico igualmente de manera positiva la presencia del transgen.

Este ejemplo ilustra un procedimiento de construccion de un vector adenovirico del subgrupo B, deficiente en todas las funciones del gen esenciales de la region E1 y la region E4 del genoma adenovirico.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la generacion de un vector adenovirico eliminada la E1 basado en un adenovirus del subgrupo B que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX ligada de manera operable a un promotor heterologo.

Los vectores de Ad35 eliminada la E1 que codifican Agalactosidasa (Lacz), Aglucuronidasa (GUS), o la proteina de envoltura de ViH gp140dCFidV12(B) (gp140B) cada una de ellas ligada de manera operable a un promotor CMV, se construyeron tal como se ha descrito anteriormente y se propagaron en celulas 293ORF6.La liberacion con exito de vectores Ad35 se define como la induccion de efectos citopaticos (cpe) dentro de las 48 horas de la primera pasada despues de la transfeccion inicial del ADN plasmido en celulas 293ORF6. Los vectores de Ad35 que codifican Lacz, GUS, o gp140B de ViH no se liberaron. Los genes Lacz, GUS, y gp140B se liberaron satisfactoriamente dentro de vectores de Ad35 eliminada la E1 y eliminadas las E1/E4.

Para determinar la estabilidad de los vectores de Ad35 que codifican Lacz, GUS, y gp140B, se llevo a cabo un ensayo de termoestabilidad. Con tal fin, se propagaron vectores de Ad35 eliminada la E1 en celulas 293ORF6 y se purificaron mediante centrifugacion por gradiente isopicnico (tres gradientes secuenciales de cloruro de cesio), se dializaron frente a cuatro intercambios de Tampon de Formulacion Final (FFB), y se almacenaron a 80oC.Los vectores se descongelaron sobre hielo y se diluyeron hasta aproximadamente 1x1011 unidades de particula (pu)/ml (una dilucion minima de 1:10) con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada en hielo, para diluir el agente estabilizante en el FFB. Las muestras de vector diluido se pusieron a 48oC, se retiraron del bafo de agua, y se estabilizaron mediante dilucion a igual volumen con PBS y suero bovino fetal al 10%. Las muestras se ensayaron para determinar la infectividad en un ensayo de formacion de foco fluorescente mediante deteccion inmunofluorescente indirecta de la proteina hexon en celulas infectadas.

Los resultados de este analisis demostraron que los vectores de Ad35 eliminada la E1 fueron termolabiles (vease Figura 1). Para confirmar la observacion de fenotipo termolabil, se analizo una preparacion purificada de un vector teromolabil mediante cromatografia de fase inversa y espectroscopia de masas (MS). Con tal fin, se fraccionaron aproximadamente 1x1011 particulas de adenovirus tipo 35 de tipo salvaje y de vector de Ad35 eliminada la E1 sobre una columna C4 (Phenomenex, Torrance, CA) y se recolectaron para posterior analisis mediante MS. Despues de liofilizar las fracciones, las muestras se reconstituyeron en acido trifluoroacetico al 0,1%, acetonitrilo al 50%, y acido sinapinico al 1% (Matriz MALDi). Un microlitro de la muestra reconstituida mas la matriz se colocaron sobre una placa diana MALDi y se dejaron secar. El analisis mediante espectrocopia de masas (MS) se llevo a cabo usando un espectrometro de MS Voyager DEPro MALDi (Applied Biosystems, Foster City, CA). La abundancia de proteina iX se normalizo a la abundancia de hexon (las fracciones fueron concomitantes). Se observaron dos picos (vease Figura 2): un pico a 14,1 kDa/z que corresponde a la proteina iX individualmente cargada y un pico a 7 kDa/z que corresponde a la proteina iX doblemente cargada. La proteina iX fue significativamente menos abundante en el vector de Ad35 eliminada la E1 que la cantidad en el control de virus de tipo salvaje de Ad35 (vease Figura 2).

5 El promotor p5 (SEC iD NO: 11) del virus adenoasociado (AAV), se introdujo dentro vectores 3' de Ad35 eliminada la E1 de la caja de expresion CMV (vease Figura 3), lo cual produjo un fenotipo teromestable (vease Figura 1). Ademas, la introduccion del promotor p5 dio como resultado la liberacion con buen exito del vector de Ad35 eliminada la E1 que expreso la gp140(B) del gen de ViH. Se obtuvieron altos rendimientos viricos de hasta 40.000 particulas/celula despues de purificacion mediante tres gradientes de cloruro de cesio.

10 Este ejemplo demuestra la termoestabilidad de un vector adenovirico eliminada la E1 basado en un adenovirus del subgrupo B que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX ligada de manera operable a un promotor heterologo.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la capacidad de encapsidacion potenciada de un vector adenovirico de Ad35 eliminada la

15 E1 que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX ligada de manera operable a un promotor heterologo.

Diversos vectores de Ad35 con tamafos de genomas del 99,8% o inferior al tamafo del genoma del Ad35 de tipo salvaje cumplen el criterio para la liberacion y propagacion con exito tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Estos vectores incluyen (a) vectores eliminada la E1, (b) vectores adenoviricos eliminada la E1 que contienen una caja de 20 expresion posicionada en la region eliminada E1 tanto en la orientacion 5'3' como en la 3'5' con respecto a la direccion de transcripcion de E1, (c) vectores adenoviricos que comprenden el ligando RGD conjugado a la helice Hi o al Cterminal de la proteina de fibra, y (d) vectores adenoviricos que comprenden una proteina de fibra Ad35/Ad5 quimerica. Los vectores de Ad35 con tamafos de genoma mas largos no se liberaron satisfactoriamente, tal como se demuestra mediante la reordenacion genetica de los genomas despues de transfeccion y pasada. Los resultados

25 de estos analisis se establecen en la Tabla 1 a continuacion.

Tabla 1 5

Vector: Tamafo del genoma % de tipo salvaje (34794 nucleotidos) Estabilidad genetica

Ad35.nuii: 33.025 94,92% Si

Ad35(3326)F(5K): 33.594 96,55% Si

Ad35.f: 33.736 96,96% Si

Ad35.(3326f).F(HiGRGD): 33.745 96,99% Si

Ad35.(3326).F(CRGD): 33.757 97,02% Si

Ad35.f3326: 33.828 97,22% Si

Ad35(3326f)F(5S.5K): 34.392 98,84% Si

Ad35(3326f).F(5S): 34.419 98,92% Si

Ad35.S: 34.561 99,33% Si

Ad35(3418gp140B.ori2)F(5K): 34.581 99,39% Si

Ad35(3326gp1408.ori2).F(5K): 34.668 99,64% Si

Ad35.L: 34.721 99,79% Si

Ad35.G: 34.774 99,94% No

Ad35.gp140B: 34.776 99,95% No

Ad35.gp140B.F(HiRGD): 34.799 100,01% No

Ad35.gp140B.F(Hi3G4CRGD): 34.856 100,18% No

Ad35.gp140B.F(C5GS4CRGD): 34.868 100,21% No

50 Tabla 1 (Cont.)

Ad35.gp140A: 34.938 100,41% No

Ad35.Z: 36.075 103,68% No

independientemente del tamafo del genoma, los vectores de Ad35 eliminada la E1, fueron termolabiles (vease Figura 1). Para confirmar la observacion de fenotipo termolabil, se analizo una preparacion purificada de un vector de genoma pequefo eliminada la E1, Ad35.f, mediante SDSPAGE. Especificamente, se cargaron 2,5x1010 particulas de Ad35 de tipo salvaje y de Ad35.f sobre un gel de acrilamida con un 412% de gradiente bajo condiciones de desnaturalizacion (las muestras se trataron previamente con SDS y DTT a 100oC durante 10 minutos). Despues de cromatografia a 180V durante aproximadamente una hora, el gel se tifo con el kit de tefido de plata PlusOneTM de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, Piscatatay, NJ). igualmente, el vectorAd35.f se analizo mediante cromatografia de fase inversa con espectroscopia de masas tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. La proteina iX se detecto en este sector, pero fue significativamente menos abundante que la cantidad en el control de virus de tipo salvaje Ad35 (veanse Figuras 2 y 4).

Para mejorar la termoestabilidad, el promotor p5 del virus adenoasociado (AAV) (SEC iD NO: 11) se introdujo dentro de un vector de Ad35 eliminada la E1 3' de la caja de expresion (vease Figura 3). El vector resultante, Ad35P5, comprendia un tamafo de genoma que fue 100,43% del genoma de Ad35 de tipo salvaje, y se comprobo para determinar su termoestabilidad tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. El vector Ad35P5 mostro termoestabilidad (vease Figura 1), y fue liberado de manera eficaz. Se obtuvieron altos rendimientos viricos de hasta 40.000 particulas/celula despues de purificacion a traves de tres gradientes de cloruro de cesio.

Este ejemplo demuestra la capacidad de encapsidacion incrementada y termoestabilidad de un vector adenovirico de Ad35 eliminada la E1 que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina piX ligada de manera operable a un promotor heterologo.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe el efecto de delecciones de la E1 proximas al gen de piX sobre la estabilidad virica en un vector adenovirico de Ad41.

Se construyeron vectores adenoviricos de Ad41 eliminada la E1 conteniendo una caja de expresion que comprende el gen de codificacion de la proteina fluorescente verde (GFP) bajo el control de un potenciador/promotor CMV, mediante recombinacion de homologos en E. coli usando procedimientos conocidos en la tecnica. Se generaron cuatro delecciones de la E1 diferentes, y la caja CMVGFP se posiciono en la region E1 eliminada tanto en una orientacion de izquierda a derecha como de derecha a izquierda. Los vectores adenoviricos se ensayaron para determinar su liberacion, propagacion, y estabilidad tal como se describe en la presente invencion. Los resultados de este analisis se establecen en la Tabla 2.

La union de la deleccion sobre el lado izquierdo de la region E1 no tuvo efecto sobre la liberacion, expansion, o estabilidad genetica del genoma del vector Ad41. Por el contrario, la union de la deleccion sobre el lado derecho de la region E1 afecto a la liberacion y estabilidad genetica de los vectores. Fundamentalmente, los vectores de Ad41 eliminados en el nucleotido 3100 fueron liberados de manera eficaz tal como se evidencia por la aparicion de efecto citopatico durante la primera y segunda pasadas despues de la transfeccion del plasmido genomico dentro de celulas 293ORF6 (vease Tabla 2, lineas 1 y 5). De manera similar, los genomas de Ad41 con la union de la deleccion del nucleotido 3100 fueron geneticamente estables , tal como se confirmo mediante analisis por PCR de la region de la caja de expresion, a traves de la segunda pasada despues de la transfeccion (vease Tabla 2, lineas 1 y 5) y a traves de una tercera pasada despues de la transfeccion (datos no mostrados). Por el contrario, los vectores Ad41 con una union de deleccion del lado derecho en el nucleotido 3165 (es decir, 65 nucleotidos mas proximos al codon iniciador de la proteina iX) no fueron viables o geneticamente estables. Los vectores Ad41 que comprenden la caja de expresion CMV en la orientacion de derecha a izquierda (es decir, el potenciador CMV colindante con la region del gen de proteina iX) fueron liberados de manera eficaz, pero estos vectores fueron geneticamente inestables en la region de la E1 eliminada que contiene la caja de expresion (vease Tabla 2, lineas 2 y 3). Un vector Ad45 que contenia la misma deleccion de la E1 pero conteniendo la caja de expresion CMV en la orientacion de izquierda a derecha (es decir, el potenciador CMV colindante con el potenciador residual E1A) no pudo ser liberado (vease Tabla 2, linea 4). De acuerdo con ello, la union de deleccion del nucleotido 3100 no afecto significativamente la funcion del vector Ad41. La union de deleccion del nucleotido 3165 afecto a la viabilidad del genoma del vector, lo cual podria haber sido parcialmente compensado por la presencia del potenciador CMV bidireccional proximo al gen de la proteina iX.

Tabla 2

Coordinados

izquierda: Derecha Orientacion de la caja CMV cpe PCR (P2) N

1: 480 3100 Derecha a izquierda + + 5

2: 480 3165 Derecha a izquierda + �
2

3: 360 3165 Derecha a izquierda + � 2

4: 360 3165 izquierda a derecha n.a. 1

5: 360 3100 Derecha a izquierda + +
5

N = numero de vectores Ad41 ensayados; � = deleccion; n.a. = no aplicable

Este ejemplo demuestra que un vector adenovirico del subgrupo F que contenia una deleccion proxima a la secuencia del acido nucleico que codifica la piX tiene viabilidad y estabilidad genetica reducida.

5 Todas las referencias, incluyendo publicaciones, solicitudes de patentes, y patentes, citadas en la presente invencion, se incorporan por referencia en la misma medida que si cada referencia hubiera sido individualmente y especificamente indiada para ser incorporada por referencia y fueran establecidas en su totalidad en la presente invencion.

El uso de los terminos "un" y "uno" y "el" y referencias similares en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las reivindicaciones que siguen mas adelante) han de considerarse que abarcan 10 tanto el singular como el plural, salvo que se indique lo contrario en la presente invencion o claramente esten en contradiccion con el contexto. Los terminos ""comprende", "tiene", "incluye", y "contiene" han de considerarse como terminos en toda su extension (es decir, significando "incluye, pero no limitado a") salvo que se indique lo contrario. La mencion de intervalos de valores en la presente invencion esta destinada unicamente a servir como un procedimiento abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que entra dentro del intervalo, salvo que se 15 indique lo contrario en la presente invencion, y cada valor separado se incorpora dentro de la memoria descriptiva como si estuviera individualmente mencionado en la presente invencion. Todos los procedimientos descritos en la presente invencion pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado salvo que se indique lo contrario en la presente invencion o de alguna otra forma entre en contradiccion claramente con el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente inven

20 cion, esta destinado unicamente a iluminar mejor la invencion y no plantea una limitacion sobre el ambito de la invencion, salvo que se reivindique de otra forma. Ninguna parte del lenguaje de la memoria descriptiva deberia considerarse como indicativo de ningun elemento no reivindicado como esencial para la practica de la invencion.

Las realizaciones preferidas de la esta invencion estan descritas en la presente invencion, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invencion. Tras la lectura de la descripcion anterior, pueden resultar

25 obvias para los expertos normales en la tecnica variaciones de las realizaciones preferidas. Los autores de la presente invencion esperan que los tecnicos expertos usen dichas variaciones segun sea lo apropiado.

LiSTADO DE SECUENCiAS �110� GALL, Jason G. D. WiCKHAM, Thomas J. ENRiGHT, William J.

5 BROUGH, Douglas E. ZUBER, Mohammed KiNG, C. Richter

�120� VACUNAS A BASE DE VECTOR ADENOViRiCO 10 �130� 229796

�150� US 60/490.106 �151� 25072003 15 �160� 11

�170� Patentln version 3.2

20 �210� 1 �211� 5 �212� PRT �213� Artificial

25 �220� �223� Sintetica

�400� 1

30 �210� 2 �211� 9 �212� PRT �213� Artificial

35 �220� �223� Sintetica �220� �221� DiVERSAS CARACTERiSTiCAS �222� (2)..(2) �223� "Xaa" puede ser cualquier aminoacido

�220� �221� DiVERSAS CARACTERiSTiCAS �222� (8)..(8) �223� "Xaa" puede ser cualquier aminoacido

10 �400� 2

�210� 3

15 �211� 9 �212� PRT �213� Artificial

�220� 20 �223� Sintetica

�400� 3

�210� 4

25 �211� 144 �212� PRT �213� Adenovirus

�400� 4

1 5

�210� 5 �211� 125 �212� PRT

5 �213� Adenovirus

�400� 5

10 �210� 6 �211� 125 �212� PRT �213� Adenovirus

�400� 6 �210� 7 �211� 140 �212� PRT �213� Adenovirus

�400� 7 �210� 8 �211� 140 �212� PRT �213� Adenovirus

�400� 8 �210� 9 �211� 132 �212� PRT �213� Adenovirus

�400� 9 �400� 10 �400� 11

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un vector adenovirico del no subgrupo C en la fabricacion de una composicion farmaceutica para la induccion de una respuesta inmune en un mamifero, en el que (a) el vector adenovirico del no subgrupo C comprende una proteina de fibra adenovirica que comprende una secuencia de aminoacido que comprende 80% o mas de identidad con una secuencia de aminoacido de una proteina de fibra adenovirica del subgrupo C, (b) la proteina de fibra adenovirica se une a un virus Coxsackie y al receptor de adenovirus (CAR), y (c) el vector adenovirico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica un antigeno el cual es expresado en el mamifero para inducir una respuesta inmune.
2.

El uso de la reivindicacion 1, en el que el vector adenovirico es un vector adenovirico del subgrupo B o un vector adenovirico del subgrupo F.
3.

El uso de la reivindicacion 2, en el que el vector adenovirico es un vector adenovirico del serotipo 35.
4.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13, en el que la proteina de fibra adenovirica del subgrupo C es una proteina de fibra adenovirica del serotipo 5.
5.

El uso de la reivindicacion 4, en el que la proteina de fibra adenovirica comprende un dominio tallo de una proteina de fibra adenovirica del serotipo 5 y un dominio boton de una proteina de fibra del serotipo 5.
6.

El uso de la reivindicacion 5, en el que la proteina de fibra adenovirica comprende un dominio tallo de una proteina de fibra adenovirica del serotipo 5, un dominio cola de una proteina de fibra del serotipo 35, y un dominio boton de una proteina de fibra del serotipo 5.
7.

El uso de la reivindicacion 2, en el que el vector adenovirico es un vector adenovirico del serotipo 41.
8.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 17, en el que el vector adenovirico comprende un genoma adenovirico que es deficiente en una o mas funciones del gen esenciales para la replicacion de la region E1 y/o la region E4 del genoma adenovirico.
9.

El uso de la reivindicacion 8, en el que la secuencia de acido nucleico que codifica el antigeno esta posicionada en la region E1 o la region E4 del genoma adenovirico.
10.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 19, en el que el vector de transferencia del gen de cebado que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un antigeno, es para ser administrada al mamifero antes de administrar al mamifero el vector adenovirico.
11.

El uso de la reivindicacion 10, en el que el vector de transferencia del gen de cebado comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un primer antigeno, el vector adenovirico comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un segundo antigeno, y el primer antigeno y el segundo antigeno son el mismo antigeno.
12.

El uso de la reivindicacion 10, en el que el vector de transferencia del gen de cebado comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un primer antigeno, el vector adenovirico comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un segundo antigeno, y el primer antigeno y el segundo antigeno son diferentes.
13.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1012, en el que el vector de transferencia del gen de cebado es un vector adenovirico.
14.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 113, en el que multiples vectores adenoviricos, comprendiendo cada vector adenovirico una o mas secuencias de acido nucleico que codifican uno o mas antigenos, son para ser administrados al mamifero.
15.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 114, en el que el vector adenovirico comprende una proteina de recubrimiento quimerica que comprende una secuencia de aminoacido no nativa que codifica un antigeno.
16.

El uso de la reivindicacion 15, en el que al menos un antigeno esta presente mediante complejos de histocompatibilidad principal tipo i (MHC i) y al menos un antigeno esta presente mediante complejos MHC ii.
17.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 116, en el que el vector adenovirico comprende unas secuencias de acido nucleico nativas que carecen de genoma adenovirico que codifican proteinas adenoviricas.
18.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 817, en el que una secuencia espaciadora esta posicionada en la region E4 del genoma adenovirico.
19.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 118, en el que el vector adenovirico comprende multiples secuencias de acido nucleico que codifican diferentes antigenos.
20.

El uso de la reivindicacion 19, en el que dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican antigenos dife

rentes estan ligadas de manera operable a diferentes promotores. 34
21.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 118, en el que el vector adenovirico comprende multiples secuencias de acido nucleico que codifican el mismo antigeno.
22.

El uso de la reivindicacion 21, en el que dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican el mismo antigeno estan ligadas de manera operable a diferentes promotores.
23.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 122, en el que el vector adenovirico comprende una proteina de recubrimiento quimerica que comprende una secuencia de aminoacido no nativa, y en la que la secuencia de aminoacido no nativa comprende un motivo RGD.

Fi ura 1

iempo de incubaci6n a 488C min Fi ura 2 Fi ura 3