ES2268695T3 - Adenovirus recombinantes defectivos con una gen iva2 inactivado. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS VECTORES VIRALES DERIVADOS DE LOS ADENOVIRUS, SU PREPARACION Y SU UTILIZACION EN TERAPIA GENICA. SE REFIERE EN PARTICULAR A ANEDORIVUS RECOMBINANTES DEFECTIVOS EN LOS QUE EL GEN IVA2 AL MENOS ESTA INACTIVO.
Description
Adenovirus recombinantes defectivos con un gen
IVa2 inactivado.
La presente invención trata sobre nuevos
vectores virales, su preparación y su utilización en terapia génica.
Trata, asimismo, sobre las preparaciones farmacéuticas que
contienen dichos vectores virales. Más especialmente, la presente
invención trata sobre los adenovirus recombinantes como vectores
para terapia génica.
La terapia génica consiste en corregir una
deficiencia o una anomalía (mutación, expresión aberrante, etc.)
mediante la introducción de una información genética dentro de la
célula o del órgano afectado. Esta información genética puede ser
introducida, ya sea in vitro dentro de una célula extraída
del órgano, siendo la célula modificada reintroducida, entonces,
dentro del organismo, o directamente in vivo en el tejido
apropiado. En este segundo caso, existen diferentes técnicas, entre
las cuales diversas técnicas de transfección que implican complejos
de ADN y de \DeltaEAE-dextrano (Pagano et
al., J. Virol. 1 (1967)891), de ADN y de proteínas
nucleares (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), de
ADN y de lípidos (Felgner et al., PNAS 84 (1987)7413),
el empleo de liposomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255
(1980)10431), etc. Más recientemente, ha aparecido el empleo
de virus como vectores para la transferencia de genes como una
alternativa prometedora a las técnicas físicas de transfección. En
este aspecto, diferentes virus han sido probados por su capacidad
para infectar ciertas poblaciones celulares. En particular los
retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), el virus VHS, los virus
adeno-asociados y los adenovirus.
Entre estos virus, los adenovirus presentan
ciertas propiedades interesantes para la utilización en terapia
génica. En particular, contienen un espectro de huésped
suficientemente amplio, son capaces de infectar a células
quiescentes, no se integran en el genoma de la célula infectada y no
han sido asociados, a día de hoy, a patologías importantes en el
hombre. Los adenovirus son virus de ADN de doble cadena lineal de un
tamaño de 36 kb aproximadamente. Su genoma consta de,
especialmente, una secuencia repetida invertida (SRI) en su extremo,
una secuencia de encapsidación, genes precoces y genes tardíos
(véase figura 1). Los genes precoces principales son los genes E1
(E1a y E1b), E2, E3 y E4. Los genes tardíos principales son los
genes de L1 a L5.
Teniendo en cuenta las propiedades de los
adenovirus mencionados anteriormente, estos ya han sido utilizados
para la transferencia de genes in vivo. A este efecto, han
sido preparados diferentes vectores derivados de los adenovirus,
incorporando diferentes genes (\beta-gal, OTC,
a-1AT, citocinas, etc.). En cada una de estas
construcciones, el adenovirus ha sido modificado de manera que sea
incapaz de replicarse en la célula infectada. Así, las
construcciones descritas en el caso anterior, son adenovirus
delecionados en las regiones E1 (E1a o E1b) y, ocasionalmente, E3
al nivel en el cual se insertan las secuencias de ADN heterólogo
(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195;
Gosh-Choudhury et al., Gene 50
(1986)161). No obstante, los vectores descritos en el caso
anterior presentan numerosos inconvenientes que limitan su
explotación en terapia génica. Especialmente, todos estos vectores
constan de numerosos genes virales, de los cuales la expresión in
vivo no es deseable en el ámbito de la terapia génica. Además,
estos vectores no permiten la incorporación de fragmentos de ADN de
gran tamaño, que pueden ser necesarios para ciertas
aplicaciones.
La presente invención permite remediar estos
inconvenientes. La presente invención describe, de hecho, nuevos
adenovirus recombinantes utilizables en terapia génica,
particularmente en la transferencia y expresión de genes in
vivo. En particular, los adenovirus de la invención permiten una
transferencia eficaz y una expresión duradera in vivo de un
gen de interés, a la vez que se limita el riesgo de producción de
proteínas virales, de transmisión de virus, de patogenicidad,
etc.
La presente invención consiste, más
especialmente, en la construcción de adenovirus recombinantes en los
que al menos un gen viral en particular, denominado IVa2, ha
perdido su función. El gen IVa2 es un pequeño gen situado en la
región 5' del genoma del adenovirus. Se solapa, en parte, con el
extremo del gen E2B en particular, lo que hace que su manipulación
sea delicada. El gen IVa2 parece jugar un papel como activador de la
transcripción de genes tardíos en el ciclo replicativo del
adenovirus. Su presencia permite o favorece, entonces, la expresión
de proteínas del virus necesarias para la formación de partículas
virales.
La solicitante ya ha demostrado que es posible
inactivar este gen en el genoma del adenovirus. La solicitante, por
otra parte, ha demostrado que esta inactivación no afecta a las
propiedades del adenovirus como vector de terapia génica, a saber,
su alto poder de infección de las células, especialmente humanas, y
su capacidad para transferir eficazmente un gen de interés a dichas
células. Además, con respecto a los vectores del caso anterior, los
vectores descritos en la presente invención poseen una capacidad
mejorada de incorporación de genes de interés, como resultado de la
inactivación por deleción del gen IVa2 y, sobre todo, son claramente
menos inmunogénicos cuando la expresión de genes tardíos presentes
ocasionalmente en los adenovirus recombinantes, según la invención,
está considerablemente disminuida, véase suprimida.
Los vectores de la invención son por lo tanto
especialmente ventajosos, puesto que permiten la incorporación de
genes de interés de gran tamaño (superior a 8 kb y pueden alcanzar
más de 11 kb) sin afectar especialmente los valores obtenidos y que
poseen muy pocas regiones virales expresadas, lo que reduce de forma
marcada, o incluso suprime, el riesgo inherente a la utilización de
virus como vectores en terapia génica, como la inmunogenicidad, la
patogenicidad, la transmisión, la replicación, la recombinación,
etc. La presente invención proporciona así, vectores virales
especialmente adaptados a la transferencia y expresión in
vivo de secuencias deseadas de ADN.
Un primer objetivo de esta invención se refiere
pues a un adenovirus recombinante defectivo en el cual el gen IVa2,
como mínimo, está inactivado.
Los adenovirus se denominan defectivos, puesto
que son incapaces de replicarse de manera autónoma en las células
infectadas. Generalmente, el genoma de los adenovirus, según la
presente invención, está desprovisto, como mínimo, de las
secuencias necesarias para la replicación de dicho virus en la
célula infectada. Estas regiones pueden ser eliminadas
(completamente o en parte), o convertidas en no funcionales, o
sustituidas por otras secuencias, especialmente por una secuencia
heteróloga de ácidos nucleicos.
Como se indica anteriormente, la solicitante ha
demostrado ya, que es posible inactivar el gen IVa2 en el genoma
del adenovirus sin afectar a las propiedades investigadas de este
virus. Más especialmente, para la preparación de los vectores de la
invención, el gen IVa2 puede inactivarse mediante diferentes
técnicas conocidas por los expertos en la materia y, especialmente,
mediante supresión, sustitución, deleción o adición de una o varias
bases. Dichas modificaciones pueden obtenerse in vitro (sobre
ADN aislado) o in situ, por ejemplo, mediante técnicas de
ingeniería genética, o incluso mediante tratamiento con agentes
mutagénicos. La o las citadas modificaciones genéticas pueden estar
localizadas en la parte codificante del gen, o fuera de la región
codificante y, por ejemplo, en las regiones responsables de la
expresión o de la regulación transcripcional de dichos genes. La
inactivación del gen puede entonces manifestarse por la producción
de una proteína inactiva debido a modificaciones estructurales o
conformacionales, por la ausencia de producción, por la producción
de una proteína con actividad alterada o incluso por la producción
de la proteína natural a un nivel atenuado o según el modo de
regulación deseado.
Entre los agentes mutágenos útiles para la
inactivación se pueden citar, por ejemplo, los agentes físicos,
tales como las radiaciones energéticas (rayos X, \gamma, ultra
violeta, etc.), o los agentes químicos capaces de reaccionar con
diferentes grupos funcionales de bases del ADN y por ejemplo, los
agentes alquilantes [sulfato de etilmetano (SEM),
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
óxido de 1-N-nitroquinoleína (ONQ)],
los agentes bialquilantes, los agentes intercalantes, etc.
Las modificaciones genéticas pueden obtenerse,
asimismo, mediante disrupción génica, por ejemplo, según el
protocolo descrito inicialmente por Rothstein [Meth. Enzymol.
101 (1983)202]. En ese caso, toda la secuencia
codificante, o una parte, se modifica, preferentemente para permitir
el reemplazo, mediante recombinación homóloga, de la secuencia
genómica por una secuencia no funcional o mutada.
Preferentemente, en los adenovirus de la
invención, el gen IVa2 se inactiva mediante mutación o deleción de
una o varias bases. De una forma aún más preferente, el gen IVa2 se
inactiva mediante deleción total o parcial.
Más especialmente, se entiende por deleción toda
supresión de todo o parte del gen considerado. Puede tratarse,
especialmente, de toda o parte de la región codificante de dicho
gen, o de toda o parte de la región promotora de la transcripción
de dicho gen. La supresión puede llevarse a cabo mediante digestión
con enzimas de restricción apropiados y posterior ligación, según
las técnicas clásicas de biología molecular, como se ilustra en los
ejemplos.
De forma especialmente preferida, la
inactivación de los genes se realiza de tal manera que sólo afecta
al gen considerado y no a los demás genes virales, especialmente a
los genes vecinos. Además, ciertas alteraciones, tales como las
mutaciones puntuales, pueden ser corregidas o atenuadas de forma
natural mediante mecanismos celulares, se prefiere especialmente
que la inactivación sea perfectamente estable segregacionalmente o
no reversible.
Según un modo especialmente ventajoso, en los
adenovirus recombinantes de la presente invención, el gen IVa2 se
inactiva mediante deleción de un fragmento
BssHII-BstEII que va del nucleótido 4106 al
nucleótido 5186, en la secuencia del adenovirus Ad5. Esta secuencia
es accesible en la literatura y, asimismo, en las bases de datos
(véase especialmente Genebank nº M73260).
Los adenovirus recombinantes según la invención
constan, de forma ventajosa, de las secuencias ITR y de una región
que permite la encapsidación.
Las secuencias repetidas invertidas (ITR)
constituyen el origen de replicación de los adenovirus. Se localizan
en los extremos 3' y 5' del genoma viral (véase figura 1), de donde
pueden obtenerse fácilmente según las técnicas clásicas de biología
molecular conocidas por los expertos en la materia. La secuencia
nucleótidica de las secuencias ITR de los adenovirus humanos
(concretamente los serotipos Ad2 y Ad5) está descrita en la
literatura, así como los adenovirus caninos (en particular CAV1 y
CAV2). Con relación al adenovirus Ad5, por ejemplo, la secuencia ITR
5' corresponde a la región que comprende los nucleótidos 1 a 103 del
genoma.
La secuencia de encapsidación (asimismo
denominada secuencia Psi) es necesaria para la encapsidación del
genoma viral. Esta región debe pues estar presente para permitir la
preparación de adenovirus recombinantes defectivos según la
invención. La secuencia de encapsidación se localiza en el genoma
del adenovirus, entre el ITR 5' y el gen E1 (véase figura 1). Puede
obtenerse o sintetizarse artificialmente mediante las técnicas
clásicas de biología molecular. La secuencia nucleotídica de la
secuencia de encapsidación de los adenovirus humanos (concretamente
los serotipos Ad2 y Ad5) se halla en la literatura, así como los
adenovirus caninos (especialmente CAV1 y CAV2). Con relación al
adenovirus Ad5, por ejemplo, una secuencia de encapsidación
funcional se halla comprendida entre los nucleótidos 194 y 358 del
genoma.
En un primer modo particular de realización, los
adenovirus recombinantes de la invención contienen una deleción
total o parcial en los genes E1 y IVa2.
En otro modo particular de realización, los
adenovirus recombinantes de la invención contienen una deleción
total o parcial en los genes E4 y IVa2.
Siempre según un modo preferido de realización,
los adenovirus recombinantes de la invención contienen una deleción
total o parcial en los genes E1, IVa2 y E3.
En una variante especialmente ventajosa, los
adenovirus recombinantes de la invención contienen una deleción
total o parcial en los genes E1, IVa2 y E4.
Los adenovirus recombinantes según la invención
que poseen propiedades particularmente atractivas para la
utilización en terapia génica son los que contienen una deleción
total o parcial en los genes E1, IVa2, E3, E4 y ocasionalmente L5.
Estos vectores combinan, además de las propiedades de infección, la
seguridad y la capacidad muy elevada de transferencia de genes.
De forma ventajosa, los adenovirus recombinantes
de la invención además constan de una secuencia heteróloga de
ácidos nucleicos, cuya transferencia o expresión en una célula,
órgano u organismo, ha sido investigada.
Especialmente, la secuencia heteróloga de ADN
puede constar de uno o varios genes terapéuticos o uno o varios
genes que codifican péptidos antigénicos.
Los genes terapéuticos que pueden ser
transferidos así, son todos aquellos genes en los que la
transcripción y ocasionalmente la traducción en la célula diana
generan productos que poseen un efecto terapéutico.
Pueden tratarse, especialmente, de genes que
codifican productos proteicos que tengan un efecto terapéutico. El
producto proteico codificado así, puede ser una proteína, un
péptido, un aminoácido, etc. Este producto proteico puede ser
homólogo a la célula diana (es decir, un producto que se encuentra
normalmente expresado en la célula diana cuando esta no presenta
ninguna patología). En ese caso, la expresión de una proteína
permite, por ejemplo, paliar una expresión insuficiente en la
célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa
debido a una modificación, o asimismo sobreexpresar dicha proteína.
El gen terapéutico puede codificar asimismo un mutante de una
proteína celular, que tenga una estabilidad aumentada, una actividad
modificada, etc. El producto proteico puede, asimismo, ser homólogo
a la célula diana. En ese caso, una proteína expresada puede, por
ejemplo, completar o aportar una actividad deficiente en la célula,
permitiéndole luchar contra una patología.
Entre los productos terapéuticos en el sentido
de la presente invención, pueden citarse más especialmente los
enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas:
interleucinas, interferones, TNF, etc. (FR 9203120), los factores
de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF,
bFGF, NT3, NT5, etc.; las apolipoproteínas: Apoya, ApoAIV, ApoE,
etc. (FR 93 05125), la distrofina o una minidistrofina (FR 9111947),
los genes supresores de tumores: p53, Rb, Rap1A, DCC,
k-rev, etc. (FR 93 04745), los genes que codifican
para factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX,
etc., los genes suicidas: Timidin cinasa, citosín deaminasa,
etc.
El gen terapéutico puede ser asimismo, un gen o
una secuencia antisentido, en la que la expresión en la célula
diana permite controlar la expresión de genes o la transcripción de
ARNm celulares. Tales secuencias pueden transcribirse, en la célula
diana, por ejemplo a ARN complementarios de ARNm celulares y así
bloquear su traducción a proteína, según la técnica descrita en la
patente EP 140 308.
Como se indica anteriormente, la secuencia
heteróloga de ADN puede constar asimismo de uno o varios genes que
codifican un péptido antigénico, capaces de generar una respuesta
inmunitaria en el hombre. En este modo particular de puesta en
práctica, la invención permite pues, la realización de vacunas que
permiten inmunizar al hombre, especialmente contra microorganismos
o virus. Puede tratarse especialmente de péptidos antigénicos
específicos del virus del epstein barr, del virus HIV, del virus de
la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la pseudorabia, incluso
específicos de tumores (EP 259 212).
Generalmente, la secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos consta asimismo de una región promotora funcional de la
transcripción en la célula infectada. Puede tratarse de una región
promotora responsable de la expresión del gen considerado de forma
natural cuando este es susceptible de funcionar en la célula
infectada. Puede tratarse asimismo de regiones de origen diferente
(responsables de la expresión de otras proteínas o incluso
sintéticas). Especialmente, puede tratarse de secuencias promotoras
de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede tratarse de
secuencias promotoras obtenidas del genoma de la célula que se desea
infectar. Del mismo modo, puede tratarse de secuencias promotoras
obtenidas del genoma de un virus, incluyendo el adenovirus
utilizado. En este aspecto, se pueden citar, por ejemplo, los
promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas
regiones promotoras pueden modificarse mediante adición de
secuencias de activación, de regulación, o que permitan una
expresión específica de tejido o mayoritaria. Además, cuando el
ácido nucleico heterólogo no consta de secuencias promotoras, puede
ser insertado en el genoma del virus defectivo posterior a una
secuencia de ese tipo.
Además, la secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos puede constar asimismo, especialmente anterior al gen
terapéutico, de una secuencia señal que dirija el producto
terapéutico sintetizado a las vías de secreción de la célula diana.
Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del
producto terapéutico, pero puede tratarse asimismo de cualquier otra
secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial.
Siempre de forma especialmente ventajosa, los
vectores de la invención poseen además un gen E3 funcional bajo
control de un promotor heterólogo. Más preferiblemente, los vectores
poseen una parte del gen E3 que permite la expresión de la proteína
gp19K. Esta proteína permite además, evitar que el vector
adenovírico sea objeto de una reacción inmunitaria que (i) limitaría
su acción y (ii) podría tener efectos secundarios indeseables.
Los adenovirus recombinantes según la invención
pueden tener orígenes diversos. Existen además, diferentes
serotipos de adenovirus, en los que la estructura y las propiedades
varían algo, pero que presentan una organización genética
comparable. Por lo tanto, las directrices descritas en la presente
solicitud pueden ser fácilmente reproducidas por los expertos en la
materia para todo tipo de adenovirus.
Más especialmente, los adenovirus de la
invención pueden ser de origen humano, animal, o mixto (humano y
animal).
Con relación a los adenovirus de origen humano,
se prefiere utilizar aquellos clasificados en el grupo C. De forma
más preferida, entre los diferentes serotipos de adenovirus humanos,
se prefiere utilizar, en el ámbito de la presente invención, los
adenovirus de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5).
Como se indica anteriormente, los adenovirus de
la invención pueden ser asimismo de origen animal, o estar formados
por secuencias obtenidas de adenovirus de origen animal. La
solicitante ha demostrado, en efecto, que los adenovirus de origen
animal son capaces de infectar las células humanas con una gran
eficacia y que son incapaces de propagarse en las células humanas,
en las que han sido probadas (véase solicitud FR 93 05954). La
solicitante ha demostrado asimismo que los adenovirus de origen
animal no están, de ninguna manera, complementados en trans por
adenovirus de origen humano, lo que elimina todo riesgo de
recombinación y de propagación in vivo, en presencia de un
adenovirus humano, pudiendo conducir a la formación de una partícula
infecciosa. La utilización de adenovirus o de regiones de
adenovirus de origen animal es por lo tanto especialmente ventajosa,
ya que los riesgos inherentes a la utilización de virus como
vectores en terapia génica son todavía inferiores.
Los adenovirus de origen animal utilizables en
el ámbito de la presente invención pueden ser de origen canino,
bovino, murino, (ejemplo: Mav1, Beard et al., Virology 75
(1990)81), ovino, porcino, aviar, incluso de simio (ejemplo:
SAV). Más especialmente, entre los virus aviares, se pueden citar
los serotipos 1 a 10 accesibles al ATCC, como, por ejemplo, las
cepas Phelps (ATCC VR-828), Fontes (ATCC
VR-280), P7-A (ATCC
VR-827), IBH-2A (ATCC
VR-828), J2-A (ATCC
VR-829), T8-A (ATCC
VR-830), K-11 (ATCC
VR-921), incluso las cepas referenciadas ATCC
VR-831 a 835. Entre los adenovirus bovinos, se
pueden utilizar los diferentes serotipos conocidos y especialmente
aquellos disponibles en ATCC (tipos 1 a 8) bajo las referencias ATCC
VR-313, 314, 639-642, 768 y 769. Se
pueden citar asimismo, los adenovirus murinos FL (ATCC
VR-550) y E20308 (ATCC VR-528), el
adenovirus ovino tipo 5 (ATCC VR-1343) o tipo 6
(ATCC VR-1340), el adenovirus porcino 5359, o los
adenovirus de simio como, especialmente, los adenovirus
referenciados en el ATCC con los números
VR-591-594, 941-943,
195-203, etc.
Preferentemente, de entre los diferentes
adenovirus de origen animal, en el ámbito de la invención se
utilizan adenovirus o regiones de adenovirus de origen canino y,
especialmente, todas las cepas de adenovirus CAV2 [cepa manhattan o
A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Los adenovirus
caninos han sido objeto de numerosos estudios estructurales. Así,
los mapas de restricción completos de los adenovirus CAV1 y CAV2 han
sido descritos en casos anteriores (Spibey et al., J. Gen.
Virol. 70 (1989)165) y los genes E1a, E3, así como las
secuencias ITR, han sido clonadas y secuenciadas (véase
especialmente Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné,
Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Los adenovirus recombinantes defectivos según la
invención pueden prepararse de diferentes maneras.
Un primer método consiste en transfectar el ADN
del virus recombinante defectivo preparado in vitro (ya sea
mediante ligación o en forma de plásmido) en una línea celular
competente, es decir que lleva todas las funciones necesarias para
la complementación del virus defectivo en trans. Estas funciones se
integran preferentemente en el genoma de la célula, lo que reduce
el riesgo de recombinación y confiere una estabilidad aumentada a la
línea celular. La preparación de dichas líneas celulares se describe
en los ejemplos.
Una segunda aproximación consiste en
cotransfectar, en una línea celular apropiada, el ADN del virus
recombinante defectivo preparado in vitro (ya sea mediante
ligación o en forma de plásmido) y el ADN de uno o varios virus o
plásmidos ayudantes. Según este método, no es necesario disponer de
una línea celular competente capaz de complementar todas las
funciones defectivas del adenovirus recombinante. Una parte de estas
funciones se complementa, en efecto, por el o los virus ayudantes.
Este o estos virus ayudantes son defectivos por sí mismos. La
preparación de adenovirus recombinantes defectivos de la invención
según este método se ilustra, asimismo, en los ejemplos.
En este aspecto, la presente solicitud describe,
asimismo, la construcción de plásmidos que contienen la región 5'
del genoma del adenovirus Ad5 modificada (plásmidos pCO1 y pCO2).
Estos plásmidos son especialmente útiles para la construcción de
adenovirus recombinantes defectivos como vectores de terapia génica.
Así, el plásmido pCO1 contiene la región 5' del genoma del
adenovirus, desde el ITR 5' hasta el nucleótido 6316, con una
deleción de la región comprendida entre los nucleótidos
382-3446, que corresponde al gen E1. Este plásmido
es especialmente ventajoso, ya que contiene, con respecto a los
otros plásmidos de este tipo descritos en el caso anterior, una
deleción mayor a nivel del gen E1, que ofrece más capacidad de
clonaje y, sobre todo, menos riesgo de recombinación. El plásmido
pCO2 deriva del plásmido pCO1 por deleción de una región
suplementaria comprendida entre los nucleótidos
4106-5186 y que corresponde a una parte del gen
Iva2. Esta deleción contiene la ventaja de no afectar al gen E2. El
plásmido pCO6 deriva del plásmido pCO1 por inserción de un codón de
finalización en la fase de lectura del gen Iva2. Los plásmidos
pCO1, pCO2 y pCO6 contienen además, una zona de clonaje múltiple
que permite la incorporación de una secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos de interés. La construcción resultante puede utilizarse a
continuación para preparar los adenovirus recombinantes defectivos
para cotransfección con un ADN que corresponde a la región 3' del
genoma del adenovirus en una línea celular competente. En lo que
concierne a lo último, puede obtenerse del genoma de un virus
salvaje, o de un virus defectivo por sí mismo, como Add1324, que
está delecionado en la región E3: Add1808, que está delecionado de
la región E4 (Weinberg et al., J. Virol. 57
(1986)833), etc. (véase ejemplos). Entre las líneas celulares
utilizables, se puede citar especialmente la línea de riñón
embrionaria humana 293, las células KB, las células Hela, MDCK, GHK,
etc. y, de forma más general, toda línea celular que complementa
para la o las regiones delecionadas (véase ejemplos).
A continuación, los virus recombinantes que se
han multiplicado se recuperan, purifican y amplifican según las
técnicas clásicas de virología.
El plásmido pCO1 permite así la construcción de
adenovirus recombinantes defectivos que contienen una deleción a
nivel del gen E1 y que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446.
El plásmido pCO2 permite la construcción de
adenovirus recombinantes defectivos que contienen una deleción a
nivel del gen E1 y que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446 y
una deleción a nivel del gen Iva2, que va del nucleótido 4106 al
nucleótido 5186.
El plásmido pCO2 permite la construcción de
adenovirus recombinantes defectivos que contienen una deleción a
nivel del gen E1 y que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446 y en
el que el gen Iva2 ha sido inactivado mediante inserción de un
codón de finalización en su fase de lectura, a nivel del sitio Sph1,
que corresponde a la base 5141 del adenovirus Ad5.
La presente invención describe, asimismo, una
serie de plásmidos que permiten la construcción de líneas celulares
que transcomplementan los adenovirus recombinantes defectivos.
Concretamente el plásmido pAC5, que posee el gen Iva2 bajo control
de su propio promotor y los plásmidos
pGY37-TK-Iva2 y
pGY37-CMV-Iva2, que contienen el
gen Iva2 bajo control, respectivamente, de los promotores TK y CMV.
Estos plásmidos tienen, asimismo, las secuencias EBNA1/OriP, que les
permiten replicarse en las células eucariotas. Estos plásmidos
permiten así la construcción de líneas celulares que
transcomplementan los adenovirus recombinantes defectivos para el
gen Iva2 sin tener necesidad de utilizar el virus ayudante.
La presente invención se refiere asimismo a toda
composición farmacéutica que comprenda uno o varios adenovirus
recombinantes defectivos como los que se describen anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser
formuladas en vista de una administración por vía tópica, oral,
parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intraocular, transdérmica, etc.
De forma preferente, la composición farmacéutica
contiene los excipientes farmacéuticamente aceptables para una
formulación inyectable. Puede tratarse, en particular, de soluciones
salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro sódico, potásico,
cálcico o magnésico, etc., o de mezclas de tales sales), estériles,
isotónicas, o de composiciones secas, especialmente liofilizadas
que, por adición según el caso de agua esterilizada o suero
fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.
Las dosis de virus utilizadas para la inyección
pueden adaptarse en función de diferentes parámetros y,
especialmente, en función del modo de administración utilizado, de
la patología que concierna, del gen que se exprese o incluso de la
duración del tratamiento investigado. De forma general, los
adenovirus recombinantes según la invención se formulan y se
administran en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y
10^{14} ufp y preferiblemente de 10^{6} a 10^{10} ufp. El
término ufp ("unidad formadora de placa") corresponde al poder
infectante de una solución de virus y se determina mediante
infección de un cultivo celular apropiado y medición, generalmente
tras 5 días, del número de placas de células infectadas. Las
técnicas de determinación de ufp de una solución viral están bien
documentadas en la literatura.
Según la secuencia heteróloga de ADN insertado,
los adenovirus de la invención pueden utilizarse para el tratamiento
o la prevención de numerosas patologías, incluyendo la enfermedades
genéticas (distrofia, fibrosis quística, etc.), las enfermedades
neurodegenerativas (alzheimer, parkinson, ELA, etc.), los cánceres,
las patologías asociadas a los defectos de la coagulación o a las
dislipoproteinemias, las patologías asociadas a infecciones virales
(hepatitis, SIDA, etc.), etc.
\newpage
La presente invención se describe de forma más
completa con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben
considerarse como ilustrativos y no limitantes.
Figura 1: Organización genética del adenovirus
Ad5. La secuencia completa de Ad5 está disponible en las bases de
datos y permite seleccionar o crear, a los expertos en la materia,
todos los sitios de restricción y de esta forma aislar toda región
del genoma.
Figura 2: Mapa de restricción del adenovirus
CAV2 cepa Manhattan (Spibey et al, como se menciona
anteriormente).
Figura 3: Mapa de restricción del fragmento
HindIII contenido en el plásmido pCO1.
Figura 4: Mapa de restricción del fragmento
HindIII contenido en el plásmido pCO2.
Figura 5: Construcción y representación del
plásmido pPY32.
Figura 6: Representación del plásmido pPY55.
Figura 7: Construcción del plásmido pE4Gal.
Figura 8: Mapa de restricción del fragmento
Hind3 contenido en el plásmido pCO6.
Figura 9: Mapa de restricción del plásmido
pAC2.
Figura 9: Mapa de restricción del plásmido
pAC2.
Figura 10: Mapa de restricción del plásmido
pAC5.
Figura 11: Mapa de restricción del plásmido
pGY37-TK-Iva2.
Figura 12: Mapa de restricción del plásmido
pGY37-CMV-Iva2.
Los métodos utilizados clásicamente en biología
molecular, tales como las extracciones preparativas de ADN
plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de
cloruro de cesio, la electroforesis en geles de agarosa o de
acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución,
la extracción de proteínas mediante fenol o mediante
fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio
salino mediante etanol o isopropanol, la transformación en
Escherichia coli, etc. son bien conocidos por los expertos en
la materia y se describen ampliamente en la literatura [Maniatis T.
et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel
F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley&Sons, New York, 1987].
Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de
la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research
Laboratories).
Para las ligaciones, los fragmentos de ADN
pueden estar separados según su tamaño, mediante electroforesis en
geles de agarosa o de acrilamida, extraídos con fenol o mediante una
mezcla de fenol-cloroformo, precipitados en etanol,
incubados a continuación en presencia de la ligasa de ADN del fago
T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor.
El relleno de los extremos 5' prominentes puede
ser efectuado mediante el fragmento de Klenow de la Polimerasa I de
ADN de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del
proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se lleva a
cabo en presencia de la Polimerasa del fago T4 de ADN (Biolabs),
utilizado según las recomendaciones del fabricante. La destrucción
de los extremos 5' prominentes se lleva a cabo mediante un
tratamiento adaptado para la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro mediante
oligodeoxinucleótidos sintéticos puede llevarse a cabo mediante el
método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res.
13 (1985)8749-8764] que utiliza el
equipo distribuido por Amersham.
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN
mediante la técnica denominada PCR [Reacción en Cadena catalizada
por Polimerasa, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985)
1350-1354; Mullis K.B. y Faloona F.A., Meth. Enzym.
155 (1987) 335-350] puede llevarse a cabo
mediante la utilización de un "ciclador térmico de ADN" (Perkin
Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.
\newpage
La verificación de las secuencias nucleotídicas
puede llevarse a cabo mediante el método desarrollado por Sanger
et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-5467] que utiliza el equipo distribuido por
Amersham.
En los ejemplos que siguen, las líneas celulares
siguientes han sido o pueden ser utilizadas:
- Línea de riñón embrionario humano 293 (Graham
et al., J. Gen. Virol. 36 (1977)59). Esta línea
contiene particularmente, integrada en su genoma, la región 5' del
genoma del adenovirus humano Ad5 (12%).
- Línea de células humanas KB: extraída de un
carcinoma epidérmico humano, esta línea es accesible en la ATCC
(ref.CCL17), así como las condiciones que permiten su cultivo.
- Línea de células humanas Hela: extraída de un
carcinoma epidérmico humano, esta línea es accesible en la ATCC
(ref.CCL2), así como las condiciones que permiten su cultivo.
- Línea de células caninas MDCK: Las condiciones
de cultivo de las células MDCK han sido descritas especialmente por
Macatney et al., Science 44 (1988)9.
- Línea de células gm DBP6 (Brough et
al., Virology 190 (1992) 624). Esta línea está
constituida por células Hela que contienen el gen E2 de adenovirus
bajo control del LTR de MMTV.
El fragmento EcoRI-XbaI que
corresponde al extremo 5' del genoma del adenovirus Ad5 ha sido
clonado inicialmente entre los sitios EcoRI y XbaI del vector
pIC19H. Así se genera el plásmido pCA. El plásmido pCA se ha
cortado, a continuación, por HinfI, sus extremos 5' prominentes se
han rellenado por el fragmento de klenow de la polimerasa I de ADN
de E. coli, después ha sido cortado por EcoRI. El fragmento
así generado del plásmido pCA, que contiene el extremo 5' del
genoma del adenovirus Ad5 ha sido clonado, a continuación, entre los
sitios EcoRI y SmaI del vector pIC20H (Marsh et al., Gene
32 (1984)481). Esto genera el plásmido pCB. El
plásmido pCB ha sido cortado, a continuación, por EcoRI, sus
extremos 5' prominentes han sido rellenados por el fragmento de
klenow de la polimerasa I de ADN de E. coli, después ha sido
cortado por BamHI. El fragmento así generado del plásmido pCB, que
contiene el extremo 5' del genoma del adenovirus Ad5 ha sido
clonado, a continuación, entre los sitios NruI y BgIII del vector
pIC20H. Esto genera el plásmido pCE, del que una característica
interesante es que posee los 382 primeros pares de bases del
adenovirus Ad5 seguidos de un sitio múltiple de clonaje.
El fragmento Sau3A (3346)-SstI
(3645)-NarI (5519) del genoma del adenovirus Ad5 ha
sido clonado inicialmente entre los sitios ClaI y BamHI del vector
pIC20H, lo que genera el plásmido pPY53. El fragmento
SalI-TaqI del plásmido pPY53 preparado a partir de
un contexto dam-, que contiene la región del genoma del adenovirus
Ad5 comprendida entre los sitios Sau3A (3346) y TaqI (5207) ha sido
clonado, a continuación, entre los sitios SalI y ClaI del vector
pIC20H, lo que genera el plásmido pCA'. El fragmento TaqI
(5207)-NarI(5519) del genoma del adenovirus
Ad5 preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento
SalI-TaqI del plásmido pCA' han sido ligados y
clonados, a continuación, entre los sitios SalI y NarI del vector
pIC20H. Esto genera el plásmido pCC'. El fragmento
NarI(5519)-NruI(6316) del genoma del
adenovirus Ad5 preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento
SalI- NarI del plásmido pCC'. han sido ligados y clonados, a
continuación, entre los sitios SalI y NruI del vector pIC20R. Esto
genera el plásmido pCD'.
Una digestión parcial mediante XhoI seguida de
una digestión completa mediante SalI del plásmido pCD' genera un
fragmento de restricción que contiene la secuencia del adenovirus
Ad5, del sitio Sau3A (3446) al sitio NruI (6316). Este fragmento ha
sido clonado en el sitio SalI del plásmido pCE. Esto genera el
plásmido pCO1 (figura 3), que contiene la región 5' del adenovirus
Ad5 hasta el sitio HinfI (382), un sitio múltiple de clonaje y el
fragmento Sau3A (3446)- NruI (6316) del adenovirus Ad5.
El fragmento BssHII-BstEII que
corresponde al fragmento BssHII(4106) - BstEII(5186)
del genoma del adenovirus Ad5 ha sido inicialmente suprimido del
plásmido pCA'. Esto genera el plásmido pCB'', del que una
característica interesante es que posee una deleción de una parte
de la secuencia del gen Iva2. El fragmento TaqI
(5207)-NarI(5519) del genoma del adenovirus
Ad5 preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento
SalI-TaqI del plásmido pCB" han sido ligados y
clonados, a continuación, entre los sitios SalI y NarI del vector
pIC20H. Esto genera el plásmido pCC". El fragmento NarI
(5519)-NruI (6316) del genoma del adenovirus Ad5
preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento SalI- NarI
del plásmido pCC'' han sido ligados y clonados, a continuación,
entre los sitios SalI y NruI del vector pIC20R. Esto genera el
plásmido pCD0''.
Una digestión parcial mediante XhoI seguida de
una digestión completa mediante SalI del plásmido pCD'' genera un
fragmento de restricción que contiene la secuencia del adenovirus
Ad5, del sitio Sau3A (3446) al sitio NruI (6316), en la que el
fragmento BssHII(4106)-BstEII(5186) ha
sido delecionado. Este fragmento ha sido clonado en el sitio SalI
del plásmido pCE. Esto genera el plásmido pCO2 (figura 4), que
contiene la parte 5' del adenovirus Ad5 hasta el sitio HinfI (382),
un sitio múltiple de clonaje y el fragmento Sau3A
(3446)-NruI (6316) del adenovirus Ad5, en el que el
fragmento BssHII(4106)-BstEII(5186) ha
sido delecionado.
Este ejemplo describe la construcción de un
adenovirus recombinante defectivo que contiene una deleción en la
región E1 que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446. Este
adenovirus es especialmente ventajoso puesto que comprende una
deleción mayor a nivel del gen E1, ofreciendo más capacidad de
clonaje y, sobretodo, menos riesgo de recombinación.
Este adenovirus recombinante se ha obtenido
mediante recombinación in vivo, mediante cotransfección de
células 293, en presencia de fosfato cálcico, del ADN del virus
AdRSV\betagal digerido por ClaI y del plásmido pCO1 digerido por
XmnI. A continuación, se recolectan las células, se lisan mediante
tres ciclos de congelación-descongelación en su
sobrenadante, posteriormente se centrifugan a 4000 rpm durante 10
minutos. El sobrenadante obtenido así se amplifica a continuación en
cultivo celular fresco. Entonces se purifican los virus a partir de
placas y se analiza su ADN según el método de Hirt (precipitado). A
continuación se preparan los stocks de virus en gradiente de cloruro
de cesio.
Este ejemplo describe la construcción de un
adenovirus recombinante defectivo que contiene una deleción en la
región E1 que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446, más una
deleción en la región Iva2. Este adenovirus es especialmente
ventajoso puesto que, con relación al adenovirus descrito en el
ejemplo 3, contiene una deleción a nivel del gen Iva2, que ofrece
más capacidad de clonaje y, sobre todo, menos riesgo de producción
de proteínas virales in vivo.
El adenovirus recombinante ha sido preparado
según los cinco protocolos siguientes:
(a) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante ClaI y el plásmido pCO2 digerido mediante XmnI han sido
cotransfectados a las células E1^{+} (293 o 293 E4) en presencia
de fosfato cálcico, para permitir la recombinación in
vivo.
(b) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante ClaI y mediante XcaI y el plásmido pCO2 digerido mediante
XmnI han sido cotransfectados a las células E1^{+} (293 o 293 E4)
en presencia de fosfato cálcico, para permitir la recombinación
in vivo.
(c) el ADN del virus AdRSV\betagal y el
plásmido pCO2 ambos digeridos mediante XcaI son ligados in
vitro, inicialmente, después la construcción resultante se
transfecta a las células E1^{+} (293 o 293 E4) en presencia de
fosfato cálcico.
\newpage
(d) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante Cla1, el ADN del plásmido pCO2 digerido mediante XmnI y el
ADN del virus ayudante pAC2 han sido cotransfectados a las células
E1^{+} (293 o 293 E4) en presencia de fosfato cálcico.
(e) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante ClaI, el ADN del plásmido pCO6 digerido mediante XmnI y el
ADN del virus ayudante pAC2 han sido cotransfectados a las células
E1^{+} (293 o 293 E4) en presencia de fosfato cálcico.
(Los plásmidos pAC2 y pCO6 se describen en el
ejemplo 7).
A continuación, los virus producidos se
amplifican y purifican como en el ejemplo 3.
En los clones celulares que expresan la región
Iva2 del adenovirus Ad5, el adenovirus
\DeltaE1-\DeltaIVa2 ha podido ser preparado
según los dos protocolos siguientes:
(a) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante ClaI y el ADN del plásmido pCO2 digerido mediante Xmn1 han
sido cotransfectados a las células en presencia de fosfato
cálcico.
(b) el ADN del virus AdRSV\betagal digerido
mediante ClaI y el ADN del plásmido pCO6 digerido mediante Xmn1 han
sido cotransfectados a las células en presencia de fosfato
cálcico.
Este ejemplo describe la construcción de un
adenovirus recombinante defectivo que contiene una deleción en la
región E1 que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446, una deleción
en el gen Iva2 y una deleción en el gen E3. Este adenovirus es
especialmente ventajoso puesto que, con relación al adenovirus
descrito en el ejemplo 4, contiene una deleción a nivel de la región
E3, que ofrece más capacidad de clonaje.
El adenovirus recombinante ha sido preparado
según los tres protocolos siguientes:
(a) el ADN del virus Add1324 digerido mediante
ClaI y el plásmido pCO2 digerido mediante XmnI han sido
cotransfectados a las células 293 en presencia de fosfato cálcico,
para permitir la recombinación in vivo.
(b) el ADN del virus Add1324 digerido mediante
ClaI y mediante XcaI y el plásmido pCO2 digerido mediante XmnI han
sido cotransfectados a las células 293 en presencia de fosfato
cálcico, para permitir la recombinación in vivo.
(c) el ADN del virus Add1324 y el plásmido pCO2
ambos digeridos mediante XcaI son ligados in vitro,
inicialmente, después la construcción resultante se transfecta a
las células 293 en presencia de fosfato cálcico.
A continuación, los virus producidos se
amplifican y purifican como en el ejemplo 3.
Este ejemplo describe la preparación de
adenovirus recombinantes defectivos según la invención, en los que
el genoma esta delecionado en los genes Iva2, E1, E3 y E4.
Primeramente, estos adenovirus poseen una capacidad de
incorporación de genes heterólogos importante. Además, estos
vectores presentan una seguridad elevada debido a la deleción de la
región Iva2 y de la región E4. Esta última, en efecto, está
implicada en la regulación de la expresión de genes tardíos, en el
procesado de los ARN premensajeros tardíos, en la supresión de la
expresión de proteínas de la célula huésped y en la eficacia de la
replicación del ADN viral. Estos vectores poseen por lo tanto un
ruido de fondo de transcripción y una expresión de genes virales muy
reducido. Finalmente, de manera especialmente ventajosa, estos
vectores pueden producirse en valores elevados.
La región 3' de un genoma viral, delecionado en
las regiones E3 y E4 (véase sección B), o solamente en la región
E4, como en el caso del virus dl808, dl1004, dl1007 o dl1010
descritos por G. Ketner, por ejemplo (J. Of Virology, 63
(1989)631). Según otra alternativa, la región 3' puede
contener deleciones en varias regiones y, por ejemplo, en las
regiones E3 y E4, como las construidas in vitro y presentadas
en el virus, como se describe a continuación, a partir del plásmido
pPY55.
El fragmento AvrII-BcII del
plásmido pFG144 [F.L. Graham et al. EMBO J. 8 (1989)
2077-2085], que corresponde al extremo 3' del
genoma del adenovirus Ad5 ha sido clonado inicialmente entre los
sitios XbaI y BamHI del vector pIC19H, preparado a partir de un
contexto dam-. Esto genera el plásmido pPY23. Una característica
interesante del plásmido pPY23 es que el sitio Sa1I que proviene
del sitio múltiple de clonaje del vector PIC19H permanece único y
que se localiza al lado del extremo 3' del genoma del adenovirus
Ad5. El fragmento HaeIII-SalI del plásmido pPy23 que
contiene el extremo 3' del genoma del adenovirus Ad5, a partir del
sitio HaeIII localizado en la posición 35614, ha sido clonado
inicialmente entre los sitios EcoRV y XhoI del vector pIC20H, lo que
genera el plásmido pPY29. Una característica interesante de este
plásmido es que los sitios XbaI y ClaI que provienen del sitio
múltiple de clonaje del vector pIC20H se localizan al lado de la
unión EcoRV/HaeIII resultante de la clonación. Además, está unión
modifica el contexto nucleotídico inmediatamente adyacente al sitio
ClaI que ha devenido ahora metilable en un contexto dam^{+}. El
fragmento XbaI(30470)-MaeII(32811) del
genoma del adenovirus Ad5 ha sido clonado inicialmente entre los
sitios XbaI y laI del plásmido pPY29 preparado a partir de un
contexto dam-, lo que genera el plásmido pPY30. El fragmento SstI
del plásmido pPY30, que corresponde a la secuencia del genoma del
adenovirus Ad5 del sitio SstI en posición 30556 hasta el extremo 3'
ha sido clonado inicialmente entre los sitios SstI del vector
pIC20H, lo que genera el plásmido pPY31, del que se provee un mapa
de restricción del inserto localizado entre los sitios HindIII en la
Figura 5.
El plásmido pPY32 ha sido obtenido tras
digestión parcial del plásmido pPY31 mediante Bg1II, seguido de una
digestión total mediante BamHI y posterior religación. El plásmido
pPY32 corresponde así, a la deleción del genoma del adenovirus Ad5
situado entre el sitio BamHI del plásmido pPY31 y el sitio Bg1II
localizado en la posición 30818. Se provee un mapa de restricción
del inserto localizado entre los sitios HindIII del plásmido pPY32
en la Figura 5. Una característica del plásmido pPY32 es que posee
sitios Sa1I y XbaI únicos.
El fragmento
BamHI(21562)-XbaI(28592) del genoma
del adenovirus Ad5 ha sido clonado inicialmente entre los sitios
BamHI y XbaI del vector p1C19H, preparado a partir de un contexto
dam-, lo que genera el plásmido pPY17. Este plásmido contiene así
un fragmento HindIII (26328)-Bg1II(28133) del
genoma del adenovirus Ad5, que puede ser clonado entre los sitios
HindIII y Bg1II del vector p1C20R, para generar el plásmido pPY34.
Una característica de este plásmido es que el sitio BamHI que
proviene del sitio múltiple de clonaje se localiza en la proximidad
inmediata del sitio HindIII(26328) del genoma del adenovirus
Ad5.
El fragmento
BamHI(21562)-HindIII(26328) del genoma
del adenovirus Ad5 proveniente del plásmido pPY17 ha sido clonado
inicialmente entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido pPY34, lo
que genera el plásmido pPY39. El fragmento
BamHI-XbaI del plásmido pPY39 preparado a partir de
un contexto dam-, contiene la región del genoma del adenovirus Ad5,
comprendido entre los sitios BamHI(21562) y
Bg1II(28133), ha sido clonado, a continuación entre los
sitios BamHI y XbaI del vector pIC19H preparado a partir de un
contexto dam-. Esto genera el plásmido pPY47, del que una
característica interesante es que el sitio Sa1I que proviene del
sitio múltiple de clonaje se localiza en la proximidad del sitio
HindIII (figura 6).
El fragmento Sa1I-XbaI del
plásmido pPY47 preparado a partir de un contexto dam- y que contiene
la región del genoma del adenovirus Ad5 que va del sitio
BamHI(21562) hasta el sitio Bg1II(28133), ha sido
clonado entre los sitios Sa1I y XbaI del plásmido pPY32, lo que
genera el plásmido pPY55. Este plásmido es se puede utilizar
directamente para la obtención de adenovirus recombinantes
delecionados, como mínimo, en la región E3 (deleción entre los
sitios Bg1II localizados en las posiciones 28133 y 30818 del genoma
del adenovirus Ad5) y en la región E4 en toda su integridad
(deleción entre los sitios MaeII(32811) y
HaeIII(35614) del genoma del adenovirus Ad5 (figura 6).
Para ello, se ha construido un plásmido con las
ITR de unión de Ad5, la secuencia de encapsidación, el gen E4 bajo
control de su propio promotor y, como gen heterólogo, el gen LacZ
bajo control del promotor LTR del virus RSV (figura 7). Este
plásmido, denominado pE4Gal ha sido obtenido mediante clonación y
ligación de los fragmentos siguientes (véase figura 7):
- fragmento HindIII-SacII
obtenido del plásmido pFG144 (Graham et al, EMBO J.8
(1989)2077). Este fragmento contiene las secuencias ITR del
Ad5 en cabeza-cola y la secuencia de encapsidación:
fragmento
HindIII(34920)-SacII(352).
- fragmento del Ad5 comprendido entre los sitios
SacII (localizado a nivel del par de bases 3827) y PstI (localizado
a nivel del par de bases 4245);
- fragmento de pSP 72 (Promega) comprendido
entre los sitios PstI(pb 32) y Sa1I (pb34);
- fragmento XhoI-XbaI del
plásmido pAdLTR Ga1lX descrito en
Stratford-Perricaudet et al (JCI
90(1992)626). Este fragmento contiene el gen LacZ bajo
control del LTR del virus RSV.
- fragmento XbaI (pb 40)-NdeI
(pb 2379) del plásmido pSP 72;
- fragmento NdeI (pb
31089)-HindIII(34930) del Ad5. Este fragmento
localizado en el extremo 3' del genoma del Ad5 contiene la región E4
bajo control de su propio promotor. Ha sido clonado a nivel de los
sitios NdeI (2379) del plásmido pSP 72 y HindIII del primer
fragmento.
Este plásmido ha sido obtenido mediante clonaje
de los diferentes fragmentos en las regiones indicadas del plásmido
pSP 72. Se entiende fragmentos equivalentes.
Los adenovirus se obtienen mediante
recombinación in vivo, según las estrategias siguientes:
(i) El ADN del virus Ad-dl324
(Thimmappaya et al., Cell 31 (1982)543) y el plásmido
pPY55, ambos digeridos mediante BamHI, son inicialmente ligados
in vitro, después cotransfectados con el plásmido pE4Gal a
las células 293.
(ii) El ADN del virus Ad-dl324
digerido mediante EcoRI y el plásmido pPY55 digerido mediante BamHI
son cotransfectados, con el plásmido pE4Gal, a las células 293.
(iii) El ADN del virus Ad5 y el plásmido pPY55,
ambos digeridos mediante BamHI, se someten a ligación y
posteriormente son cotransfectados, con el plásmido pE4Gal, a las
células 293.
(iv) El ADN del virus Ad5 digerido mediante
EcoRI y el plásmido pPY55 digerido mediante BamHI son
cotransfectados, con el plásmido pE4Gal, a las células 293.
Las estrategias (i) y (ii) permiten generar un
adenovirus recombinante delecionado para las regiones E1, E3 y E4;
las estrategias (iii) y (iv) permiten generar un adenovirus
recombinante delecionado para las regiones E3 y E4. Además, es
asimismo posible utilizar una línea celular derivada de una línea
que expresa la región E1, por ejemplo, la línea 293 y expresando
asimismo al menos las fases abiertas ORF6 y RF6/7 de la región E4
del adenovirus Ad5 (véase FR 93 08596). La utilización de tales
líneas permite evitar el empleo del plásmido pE4Gal.
Este adenovirus ha sido obtenido mediante
recombinación, tras la cotransfección en las células 293 del
plásmido pCO2 (ejemplo 2) y la región 3' de un adenovirus
delecionado al menos para la región E4 y, por ejemplo, el adenovirus
obtenido tras la utilización del plásmido pPY55 (véase. Sección
A).
Tras la cotransfección con fosfato cálcico, se
obtienen las células, se lisan mediante tres ciclos de
congelación-descongelación en su sobrenadante,
posteriormente se centrifugan a 4000 rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante obtenido así se amplifica, a continuación, en cultivo
celular fresco. Entonces, se purifican los virus a partir de placas
y se analiza su ADN según el método de Hirt (precipitado). A
continuación se preparan los stocks de virus en gradiente de cloruro
de cesio.
El fragmento Mun1-Nru1 del
plásmido pCO1 contiene las secuencias del genoma del adenovirus Ad5
que va de las bases 3924 a 6316 y especialmente el gen Iva2 (bases
4094 a 5719) ha sido clonado entre los sitios Mun1 y Nru1 del vector
comercial pSL1180. Esto genera el plásmido pGY38.
La secuencia nucleotídica siguiente y su cadena
complementaria han sido sintetizadas artificialmente mediante las
técnicas clásicas de biología molecular:
| 5'- CCT TAG CCC GGG CTA AGG CAT G-3' | (SEQ ID nº1) |
\newpage
Cada una de las cadenas posee un sitio de
restricción Sph1 en su extremo 3'. Está secuencia ha sido clonada en
el sitio Sph1 del plásmido pGY38: introduce un codón de finalización
en la región codificante del gen Iva2, en el sitio Sph1 que
corresponde a la base 5141 del adenovirus Ad5. Esto genera el
plásmido pGY39. En este plásmido, el gen Iva2 así modificado se
inactiva: codifica una proteína inactiva que corresponde a los 102
primeros aminoácidos de la proteína Iva2 salvaje.
El fragmento Mun1-Nru1 del
plásmido pGY39 ha sido clonado entre los sitios Mun1 y Nru1 del
plásmido pCO1. Esto genera el plásmido pCO6 (figura 8) que contiene
el extremo 5' del adenovirus Ad5 hasta el sitio Hinfl (382), un
sitio múltiple de clonaje, el fragmento Sau3A
(3446)-Sph1 (5141) del adenovirus Ad5, el
oligonucleótido que aporta un codón de finalización en la secuencia
codificante del gen Iva2 y el fragmento Sph1 (5141)- Nru1 (6316) del
adenovirus Ad5.
Los fragmentos siguientes han sido clonados:
- fragmento Hind3 (34930)-Sac2
(357) obtenidos del plásmido pFG144 (Graham et al, EMBO J. 8,
1989, 2027), este fragmento contiene las secuencias ITR del
adenovirus Ad5 en posición cabeza-cola y la
secuencia de encapsidación,
- fragmento del adenovirus Ad5 comprendido entre
los sitios Sac2 (localizado a nivel de la base 3827 en el Ad5) y
Pst1 (localizado a nivel de la base 4245).
Posteriormente, el plásmido pSPITR ha sido
obtenido por ligación de los fragmentos entre los sitios Hind3 y
Pst1 del plásmido comercial pSP72.
El fragmento Dra1-Nru1 del
plásmido pCO1, que contiene las secuencias del genoma del adenovirus
Ad5 que va de las bases 4029 a 6316 y, especialmente el gen Iva2 y
su promotor, ha sido clonado en el sitio EcoRV del vector pIC20H
(Ref. J. L. Marsh et al (1984) Gene, 32,
481-485). Esto genera el plásmido pAC1. El fragmento
Bgl2-BamH1 del plásmido pAC1 ha sido clonado en el
sitio BamH1 del plásmido pSPITR, lo que genera el plásmido pAC2
(figura 9).
El fragmento EcoR1-Xba1 del
plásmido comercial pMEP4 (Invitrogen) ha sido ligado entre los
sitios EcoR1 y Xba1 del plásmido pAC1. Esto genera el plásmido pAC3,
del que una característica es que contiene las secuencias
EBNA1-OriP y el gen Iva2.
El fragmento Sal1-Xho1 del
plásmido comercial pMSCV ha sido clonado en el sitio Sal1 del vector
pIC20H. Esto genera el plásmido pAC4 que contiene el gen Néo. El
fragmento Xba1-Nru1 del plásmido pAC3 ha sido
clonado entre los sitios Xba1 y Nru1 del plásmido pAC4. Esto genera
el plásmido pAC5 (figura 10), del que una característica importante
es que posee el gen Néo y el gen Iva2 bajo control de su propio
promotor. Además, este plásmido puede replicarse en las células
eucariotas ya que contiene las secuencias EBNA1/OriP.
La secuencia nucleotídica siguiente y su cadena
complementaria han sido sintetizadas artificialmente mediante las
técnicas clásicas de biología molecular:
| 5'-TCG ACG GAT CCC TTA AGG TGG ACG CCG CCA CCA TGG AAA CCA GAG GGC GAA GAC | |
| CGG CAG C-3' | (SEQ ID nº2) |
Contiene un sitio de restricción para Sa1I en su
extremo 5' y un sitio de restricción para Eco47III en su extremo 3'.
Está secuencia ha sido insertada en el plásmido pAC1 entre el sitio
Sa1I y el sitio Eco47III del inicio del gen Iva2 que corresponde a
la base de la secuencia del adenovirus Ad5. Esto genera el plásmido
pGY32, del que una característica importante es que posee un sitio
múltiple de clonaje (BamH1, Afl2, Hinc2) sobre un consenso Kozak
frente la ATG del gen Iva2. Además, en esta construcción, el intrón
del gen Iva2 ha sido suprimido.
El fragmento BamH1
(-110)-Hinc2(+35) del promotor TK del plásmido pX4B
(B. Wasylyk et al, N.A.R. (1987), 15, 13, 5490) y un sitio
múltiple de clonaje limitado por los sitios Sa1I y BamH1, han sido
ligados y después clonados entre los sitios Sa1I y Hinc2 del
plásmido pGY32. Esto genera el plásmido pGY33-TK,
del que una característica importante es que posee el gen Iva2
desprovisto de intrón bajo control del promotor TK.
Los fragmentos siguientes han sido preparados y
después ligados:
- el fragmento Xba1-Pvu1 del
plásmido comercial pMEP4 (5,5kb), este fragmento contiene las
secuencias EBNA1/oriP y el extremo 5' del gen de resistencia a la
ampicilina,
- el fragmento Pvu1-AlwN1 del
plásmido comercial pMEP4 (0,8 kb), este fragmento contiene el
extremo 3' del gen de resistencia a la ampicilina y una parte del
origen de replicación,
- el fragmento Xba1 y AlwN1 del plásmido pIC20H
(0,8 kb), este fragmento contiene el fin del origen de
replicación.
Esto genera el plásmido pGY34 que contiene las
secuencias EBNA1/oriP.
El fragmento BamH1 del plásmido comercial pUT614
(cayla) ha sido clonado en el sitio BamH1 del vector pIC20H. Esto
genera el plásmido pPY9 que contiene el gen Zéo. El fragmento
Xba1-EcoRV del plásmido pPY9 ha sido clonado entre
los sitios Xba1 y Nru1 del vector pIC20R, lo que genera el plásmido
pGY35. El fragmento Xba1 del plásmido pGY35 preparado a partir de un
contexto dam- ha sido clonado, a continuación, en el sitio Xba1 del
plásmido pGY34. Esto genera el plásmido pGY36.
El fragmento Bgl2-Sap1 del
plásmido pGY33-TK ha sido clonado entre los sitios
Bgl2 y Sap1 del plásmido pGY36. Esto genera el plásmido
pGY37-TK-Iva2 (figura 11), del que
una característica importante es que posee el gen Zéo y el gen
Iva2, sin intrón, bajo control del promotor TK. Además, este
plásmido puede replicarse en células eucariotas, ya que contiene las
secuencias EBNA1/oriP.
El fragmento Bgl2-Afl2 del
plásmido comercial pCI (Promega) ha sido clonado entre los sitios
BamH1 y Afl2 del plásmido pGY32. Esto genera el plásmido
pGY33-CMV, del que una característica interesante es
que contiene el gen Iva2 desprovisto de intrón, bajo control del
promotor CMV.
El fragmento Bgl2-Sap1 del
plásmido pGY33-CMV ha sido clonado entre los sitios
Bgl2 y Sap1 del plásmido pGY36. Esto genera el plásmido
pGY37-CMV-Iva2 (figura 12), del que
una característica importante es que posee el gen Zéo y el gen
Iva2, sin intrón, bajo control del promotor CMV. Además, este
plásmido puede replicarse en células eucariotas, ya que contiene las
secuencias EBNA1/oriP.
Diferentes tipos de líneas celulares que
transcomplementan la función Iva2 han sido construidas en las
células E1^{+} (células 293 o 293 E4)
(a) el plásmido pAC5 ha sido transfectado en las
células 293 en presencia de fosfato cálcico, los clones celulares
que contienen el plásmido replicativo pAC5 han sido seleccionados en
presencia de geneticina (Sigma, 400 \mug/ml).
(b) el plásmido
pGY37-TK-Iva2 ha sido transfectado
en las células en presencia de fosfato cálcico, los clones celulares
que contienen el plásmido replicativo
pGY37-TK-Iva2 han sido seleccionados
en presencia de pleomicina (Cayla, 15 \mug/ml para las células 293
y 30 \mug/ml para las células 293 E4).
(c) el plásmido
pGY37-CMV-Iva2 ha sido transfectado
en las células en presencia de fosfato cálcico, los clones celulares
que contienen el plásmido replicativo
pGY37-CMV-Iva2 han sido
seleccionados en presencia de pleomicina (Cayla, 15 \mug/ml para
las células 293 y 30 \mug/ml para las células 293 E4).
De forma más precisa, en cada uno de estos tres
casos, las células en recipientes de 5 cm de diámetro, han sido
transfectadas con 1 a 5 mg de plásmido en presencia de fosfato
cálcico. Tras la transfección de las células, estas se lavan,
después se añade el medio de cultivo (MEM, Sigma) suplementado con
suero bovino fetal (7% final) y las células se incuban durante 24
horas. Al día siguiente se seleccionan las células en presencia de
gentamicina o pleomicina. Se cambia la gentamicina o pleomicina los
tres días y los clones seleccionables aparecen tras aproximadamente
tres semanas. Cuando todas las células no transfectadas mueren se
observa que sólo las células transfectadas generan clones
celulares. Cuando los clones celulares son lo suficientemente
grandes para ser visibles a simple vista, se transfieren
individualmente a los pocillos de cultivo de una placa de cultivo
de "24 pocillos". A continuación, cada clon se amplifica
progresivamente, en presencia de geneticina o pleomicina, primero en
los pocillos de una placa de cultivo de "12 pocillos", después
de "6 pocillos" para ser, a continuación, amplificada en
frascos de cultivo celular.
Por ejemplo, el adenovirus
\DeltaE1-\DeltaIVa2-\DeltaE4
ha podido ser preparado según los dos protocolos siguientes:
(a) el ADN de un virus
\DeltaE1-\DeltaE4 digerido mediante Cla1 (por
ejemplo AdRSV\betagaldl1004, AdRSV\betagaldl1007 o
AdRSV\betagaldl1014 descritos en "Efficient dual
transcomplementation of adenovirus E1 and E4 regions from a
293-derived cell line expressing a minimal E4
functional unit" de P.YEH et al., J. Virology, publicado),
el ADN del plásmido pCO2 digerido mediante Xmn1 y el ADN del virus
ayudante pAC2 han sido cotransfectados en las células 293E4 en
presencia de fosfato cálcico.
(b) el ADN de un virus
\DeltaE1-\DeltaE4 digerido mediante Cla1, el ADN
del plásmido pCO6 digerido mediante Xmn1 y el ADN del virus ayudante
pAC2 han sido cotransfectados en las células 293E4 en presencia de
fosfato cálcico.
En los clones celulares que expresan las
regiones Iva2 y E4 del adenovirus Ad5 y resistentes a la pleomicina,
el adenovirus
\DeltaE1-\DeltaIVa2-\DeltaE4
ha podido ser preparado según los dos protocolos siguientes:
(a) el ADN de un virus
\DeltaE1-\DeltaE4 digerido mediante Cla1, el ADN
del plásmido pCO2 digerido mediante Xmn1 han sido cotransfectados en
las células en presencia de fosfato cálcico.
(b) el ADN de un virus
\DeltaE1-\DeltaE4 digerido mediante Cla1, el ADN
del plásmido pCO6 digerido mediante Xmn1 han sido cotransfectados en
las células en presencia de fosfato cálcico.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- DEPOSITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: RHONE POULENC PORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20, Avenida Raymond Aron
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ANTHONY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 40.91.69.22
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (1) 40.91.72.96
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vectores virales y utilización en terapia génica
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº:
1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTAGCCCG GGCTAAGGCA TG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NUM: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque el gen Iva2, como mínimo, está
inactivado.
2. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 1 que se caracteriza porque el gen Iva2 está
inactivado mediante mutación o deleción de una o varias bases.
3. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 2 que se caracteriza porque el gen Iva2 está
inactivado mediante deleción parcial.
4. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 3 que se caracteriza porque el gen Iva2 está
inactivado mediante deleción de un fragmento que va del nucleótido
4106 al nucleótido 5186.
5. Adenovirus recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores que se caracteriza porque
consta de una secuencia heteróloga de ácidos nucleicos.
6. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E1 y Iva2.
7. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción a nivel del gen E1,
que va del nucleótido 382 al nucleótido 3446 y una deleción a nivel
del gen Iva2, que va del nucleótido 4106 al nucleótido 5186.
8. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E4 e Iva2.
9. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E1, Iva2 y E3.
10. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E1, Iva2 y E4.
11. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E1, Iva2, E3 y E4.
12. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción total o parcial de los
genes E1, Iva2, E3, L5 y E4.
13. Adenovirus según alguna de las
reivindicaciones anteriores que se caracteriza porque es de
origen humano, animal o mixto.
14. Adenovirus según la reivindicación 13 que se
caracteriza porque los adenovirus de origen humano se escogen
entre los clasificados en el grupo C, de preferencia entre los
adenovirus de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5).
15. Adenovirus según la reivindicación 13 que se
caracteriza porque los adenovirus de origen animal se escogen
entre los adenovirus de origen canino, bovino, murino, ovino,
porcino, aviar y de simio.
16. Adenovirus según alguna de las
reivindicaciones anteriores que se caracteriza porque además
consta de una parte del gen E3 que codifica la proteína gp19K bajo
control de un promotor heterólogo.
17. Adenovirus según la reivindicación 5 que se
caracteriza porque la secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos consta de un gen terapéutico o un gen que codifica
péptidos antigénicos.
18. Adenovirus según la reivindicación 5 que se
caracteriza porque la secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos consta de igual forma de una región promotora de la
transcripción funcional en la célula, el órgano u organismo
infectado.
19. Adenovirus según la reivindicación 5 que se
caracteriza porque la secuencia heteróloga de ácidos
nucleicos consta además de una secuencia de secreción.
20. Adenovirus recombinante defectivo que se
caracteriza porque consta de las ITR y de una región de
encapsidación y porque contiene una deleción que va del nucleótido
382 al nucleótido 3446.
21. Composición farmacéutica que consta, como
mínimo, de un adenovirus recombinante defectivo según una de las
reivindicaciones 1 a 20.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 21 que consta de un excipiente farmacéuticamente
aceptable para una formulación inyectable.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR9411511A FR2724945B1 (fr) | 1994-09-27 | 1994-09-27 | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
| FR9411511 | 1994-09-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2268695T3 true ES2268695T3 (es) | 2007-03-16 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95932050T Expired - Lifetime ES2268695T3 (es) | 1994-09-27 | 1995-09-22 | Adenovirus recombinantes defectivos con una gen iva2 inactivado. |
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