DE69435010T2

DE69435010T2 - Verfahren und stoffe für die behandlung von individuen, die infiziert sind mit intrazellulär infektiösen agentien

Info

Publication number: DE69435010T2
Application number: DE1994635010
Authority: DE
Original assignee: HIPLER PARTNERS LLP; Leland Stanford Junior University
Current assignee: HIPLER PARTNERS LLP; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-04-20
Filing date: 1994-04-20
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2014-04-21
Also published as: EP0695347A4; DE69435010D1; EP0695347B1; KR960701988A; CA2161095A1; CN1079830C; CN1128043A; US5738852A; US5962320A; JPH08509606A; AU6816194A; EP0695347A1; WO1994024267A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Materialien zur Verwendung bei Methoden für die Verhütung neuer Infektionen, Heilung bestehender Infektionen und Behandlung chronischer Infektionen, die durch intrazelluläre infektiöse Agenzien verursacht sind. Die Methoden umfassen die Anwendung der Gentherapie, um die Interaktion zwischen Liganden zu verstärken, die die T-Zellaktivierung kostimulieren. Spezifischer betrifft diese Erfindung Materialien zur Verwendung bei Methoden der Gentherapie, bei denen Gene, die ein Antigen von einem infektiösen Agens codieren, und Liganden, die die T-Zellaktivierung kostimulieren, in den Zellen des Wirtstiers gemeinsam exprimiert werden, um eine chronische Infektion zu verhüten oder zu behandeln. Diese Methode stimuliert oder verstärkt Immunantworten auf Antigene von infektiösen Agenzien durch Verstärkung der Antigen-spezifischen T-Zellantwort und bietet dadurch einen Schutz gegen eine Neuinfektion oder die Beendigung einer chronischen Infektion.
Hintergrund der Erfindung
Viele infektiöse Agenzien sind dazu fähig, eine Infektion und Erkrankung in einem Wirtsorganismus zu verursachen; zu Beispielen solcher infektiöser Agenzien zählen Protozoen, Pilze, Bakterien, Viren und sogar Würmer. Von diesen infektiösen Agenzien stellen jene, die mit einem Mechanismus ausgestattet sind, um intrazellulär zu agieren, die wesentlichste Herausforderung für die Verhütung und Behandlung dar. Dies trifft insbesondere dort zu, wo der Wirt des intrazellulären infektiösen Agens ein Säuger ist, etwa ein Mensch.
Säuger besitzen ein komplexes Immunsystem, das mehrere verschiedene Mechanismen zur Abwehr eines Befalls durch ein infektiöses Agens zur Verfügung hat. Un ter normalen Umständen funktioniert das Immunsystem dahingehend, das infektiöse Agens schließlich aus dem System des Sängerwirts zu beseitigen. Die meisten Infektionen sind selbstbeschänkend, da das Immunsystem des Säugers im Allgemeinen zur Beseitigung der infektiösen Agenzien in der Lage ist. Probleme entstehen jedoch, wenn das Immunsystem hierzu nicht fähig ist oder nicht auf das Vorhandensein eines infektiösen Agens reagiert. Bei diesem Szenario können Infektionen chronisch werden und können für viele Jahre oder sogar die Lebenszeit des infizieren Menschen oder Tiers anhalten, was oftmals zu einer ernsthaften Erkrankung führt.
Herkömmlicherweise setzen standardmäßige Impfstoffe das Immunsystem einem Fremdantigen aus, wie etwa solchen der infektiösen Agentien, um eine Antigenspezifische Immunantwort hervorzurufen. Die Immunantwort ist meisten humoral und nicht zellulär, das heißt, sie führt zur Produktion von Antikörpern, doch nicht einer T-Zell-basierten Immunität, wie unten erörtert. Eine wirksame Impfung verhindert eine Infektion oder modifiziert Erkrankungen, die aus der Infektion resultieren, welche wiederum durch das infektiöse Agens, gegen das sich der Impfstoff richtet, verursacht sind.
Immunantworten, die neutralisierende Antikörper hervorrufen, sind zur Verhütung von Infektionen mit bestimmten Viren ausreichend. Murphy et al. (1990). Somit kann eine Infektion durch diese Viren durch Impfung mit Antigenen verhütet werden, die neutralisierende Antikörper hervorrufen. Gegen einige Viren und nicht-virale infektiöse Agenzien können jedoch entweder keine neutralisierenden Antikörper hervorgerufen werden, oder sind, falls hervorgerufen, unzureichend, um eine Infektion und/oder die Weiterentwicklung einer Erkrankung zu verhindern.
Zwei herkömmliche Impfstoffarten bestehen in abgetöteten Viren und abgeschwächten Lebend-Viren. Abgetötete Viren bestehen entweder aus ganzen Virionen oder anderen infektiösen Agenzien, deren Infektivität inaktiviert worden ist. Diese Impfstoffe können auch aus antigenen Untereinheiten oder Bestandteilen der Virionen oder anderen infektiösen Agenzien bestehen. Diese Impfstoffe werden durch parenterale Inokulation oder durch Exposition an Schleimhautmembranen verabreicht. Abgeschwächte Lebend-Impfstoffe bestehen aus Lebend-Virus oder anderen infektiösen Agenzien mit genetisch veränderter Virulenz. Wenn für die Beimpfung verwendet, verursachen diese Impfstoffe eine mildere Form der Erkrankung, oder überhaupt keine Erkrankung.
Ein dritter Impfansatz ist untersucht und experimentell angewendet worden, befindet sich jedoch noch nicht in der klinischen Anwendung. Dieser Ansatz besteht in der Ausnutzung von Lebend-Agenzien, wie etwa Viren oder Bakterien, als Vektoren, um Impfantigene von heterologen infektiösen Agenzien zu exprimieren. Ein Gen oder eine Nukleotidsequenz, die für das Antigen codiert, wird durch den Vektor exprimiert und, wenn bei der Impfung verwendet, exponiert dann den Wirt an das Antigen. Eine Immunantwort auf das Antigen soll erwartetermaßen den Wirt vor dem infektiösen Agens, von dem das Antigen stammte, schützen.
Zu Beispielen für abgetötete Impfstoffe zählen Tetanus-Toxoid, Influenza-Virus-Untereinheit, Tollwut-, Polio- und HBV. Zu Beispielen der lebend abgeschwächten Impfstoffe zählen Salmonella typhi Ty 21-a und Lebend-Impfstoffe für Polio-, Masern-, Röteln-, Mumps-, Pocken- und Gelbfieber-Viren. Beispiele der zur Exprimierung von heterologen Impfstoff-Antigenen verwendeten Lebend-Vektoren zählen das Vaccinia-Virus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und der S. typhi Ty 21-a-Stamm.
Zu Beispielen für chronische Infektionen in Verbindung mit einer signifikanten Morbidität und einem frühen Tod zählen die beiden humanen Hepatitis-Viren, Hepatitis B-Virus (HBV) und Hepatitis C-Virus (HCV), die eine chronische Hepatitis, Zirrhose und Leberkrebs verursachen. Eine HBV Infektion beim Menschen verläuft sehr ähnlich zu Infektionen, die durch die eng verwandten Hepadnaviren bei bestimmten Tieren verursacht werden, einschließlich des Erdhörnchen-Hepatitis-Virus (GSHV), welches die Beechey-Erdhörnchen infiziert, Biber-(woodchuck)-Hepatitis-Virus (WHV), welches Biber infiziert, und Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV), welches Enten infiziert. Robinson, in Virology. 2. Aufl., Hrsg. B. Fields, Raven Press, New York, S. 2137–2169 (1990).
Zu weiteren Beispielen für chronische Infektionen beim Menschen, die durch virale infektiöse Agenzien verursacht sind, zählen solche, die durch die humanen Retroviren hervorgerufen werden: humane Immundefizienz-Viren (HIV-1 und HIV-2), die das Erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS) verursachen; und humane T-lymphotrope Viren (HTLV-1 und HTL-2), die T-Zell-Leukämie und Myelopathien verursachen. Viele weitere Infektionen, wie etwa humane Herpes-Viren, einschließlich des Herpes simplex-Virus (HSV) Typ 1 und Typ 2, Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Varicella zoster-Virus (VZV) und humanen Herpes-Virus 6 (HHV-6) werden nicht durch Wirtsmechanismen ausgeschaltet, sondern werden vielmehr chronisch und können in diesem Stadium eine Erkrankung verursachen. Eine chronische Infektion mit humanen Papilloma-Viren ist mit einem Gebärmutterhalskarzinom verbunden. Zahlreiche weitere Viren und weitere infektiöse Agenzien replizieren intrazellulär und können chronisch werden, wenn Wirts-Abwehrmechanismen darin versagen, sie zu eliminieren. Zu diesen zählen pathogene Protozoen (z.B. Pneumocystis carinii, Trypanosoma, Leishmania, Malaria und Toxoplasma gondii), Bakterien (z.B. Mykobakterien, Salmonellen und Listerien) und Pilze (z.B. Candida und Aspergillus).
Eine Behandlung chronischer Virusinfektionen, die einen signifikanten klinischen Nutzen ergeben hat, ist zum Großteil deshalb nicht erfolgreich gewesen, weil solche Behandlungen darin versagen, die Infektion zu beendigen oder das Virus zu beseitigen. Zu den bisherigen Behandlungen zählen die Verabreichung kleiner chemischer Verbindungen, wie etwa Nukleosid-Analoga oder biologisch aktive Proteine, wie etwa Interferone. Diese Behandlungen hemmen die Virus-Replikation, beseitigen aber weder das Virus aus den Zellen noch die Virus-infizierten Zellen selbst und können zu einer begrenzten Verbesserung der Erkrankung lediglich während der Verabreichung führen. Ungünstigerweise verstärken sich virale Infektionen oftmals, wenn die Verabreichung des Arzneistoffs abgesetzt wird.
Zu häufigen antiviralen Behandlungen zählen Nukleosid-Analoga, wie etwa Azidothymidin (AZT), Didesoxyinosin (DDI) und Didesoxyzytodin (DDC) für eine chronische HIV-Infektion und das assoziierte AIDS, und Adeninarabinosid (araA) für eine HBV-Infektion und assoziierte Lebererkrankung. Interferone unterdrücken in ähnlicher Weise das HBV und HCV während der Therapie einer chronischen Infektion, doch kehrt das Virus üblicherweise auf Vorbehandlungs-Niveaus zurück und wird die Erkrankung verstärkt, wenn die Therapie abgesetzt wird.
Ein wichtiger Mechanismus, der durch das Säuger-Immunsystem zur Kontrolle und schließlichen Beseitigung von bestehenden Infektionen durch intrazelluläre infektiöse Agenzien ausgenützt wird, ist die aktivierte zelluläre Immunantwort durch Aktivierung bestimmter T-Zellen. Die T-Zellaktivierung führt zu einer zytotoxischen T-Lymphozyten-(CTL)-Antwort, die auf virale (oder andere intrazelluläre infektiöse Agenzien) Antigene auf der infizierten Zelloberfläche und die Beseitigung der infizierten Zellen gerichtet ist. Guilhot et al., J. Virol., 66: 2670–2678 (1992). Dies führt schließlich zur Beseitigung der infizierten Zellen und des infektiösen Agens innerhalb der infizierten Zellen. Für eine allgemeine Diskussion der Immunantworten auf virale infektiöse Agenzien, siehe Whitton et al., in Virology, 2. Aufl., Hrsg. B. Fields, Raven Press, New York, S. 369–381 (1990); und Roitt, Essential Immunology, 7. Aufl. (1991).
Eine Aktivierung von T-Zellen erfolgt, wenn der T-Zellrezeptor (TCR) einen ternären Komplex mit einem Antigenpeptid, komplexiert mit einem Selbst-MHC-(Haupthistokompatibilitäts-Komplex)-Molekül an der Oberfläche professioneller Antigenpräsentierender Zellen (APC), bildet. Zu professionellen APCs zählen Makrophagen und aktivierte B-Zellen. Townsend et al., Cell, 44: 959–968 (1986); Townsend et al., Ann. Rev. Immunol., 2: 601–624 (1989); Bjorkman et al., Nature, 329:512–518 (1987); und Jardetsky et al., Nature, 353: 326–329 (1991). Der ternäre Komplex ermöglicht, dass ein kostimulatorisches Signal zwischen den Zeilen wandert. Die Aktivierung der T-Zellen erfordert nicht nur die Erkennung des Antigenpeptid-MHC-Komplexes durch den TCR, sondern auch die Interaktion von "kostimulatorischen Faktoren", die an der Oberfläche der APCs lokalisiert sind, mit spezifischen Molekülen an der Oberfläche der T-Zellen, dem "kostimulatorischen Liganden". Freeman et al., J. Exp. Med., 174:625–691 (1991). Wie hierin verwendet, zählen zu kostimulatorischen Faktoren auf APCs, ohne darauf beschränkt zu sein, das B7-1-Protein, welches spezifisch an CD28- und CTL-4-Proteine auf der Oberfläche von T-Zellen bindet, und die B7-2- und B7-3-Proteine, die CTLA-4 in der T-Zellaktivierung binden. Boussiotis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11059–11063 (1993). B7-Liganden werden ausschließlich durch professionelle APCs exprimiert. Freeman et al., J. Exp. Med., 174:625–631 (1991); Razi-Wolf et al. (1992); und Larsen et al. (1992). Die Interaktion von CD28 und B7-1 ist als für die T-Zellaktivierung wesentlich nachgewiesen worden. Jenkins et al., J. Immunol. 140:3324–3330 (1988); Linsley et al. (1990); Linsley et al., J. Exp. Med., 173:721–730 (1991); Gimmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6575–6579 (1991); Jenkins et al., J. Immunol., 147:2461–2466 (1991); und Harding et al. (1992).
Eines der auf den APCs zu findenden kostimulatorischen Moleküle ist das B7-Protein, welches der Ligand für das T-Zell-Oberflächen-Differenzierungsantigen CD28 ist. Die B7-Expression, die typischerweise durch professionelle APCs bewirkt wird, ist als von entscheidender Wichtigkeit für die Aktivierung naiver T-Zellen befunden worden. Larsen et al., J. Exp. Med., 176.:1215–1220 (1992). Andere Studien haben gezeigt, dass eine direkte Beziehung zwischen dem Anstieg der funktionellen Aktivität der T-Zelle und dem Anstieg der B7-Expression besteht. Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4210–4214 (1992). T-Zellen werden anergisch, wenn sie auf Antigenpeptide auf Zellen stoßen, denen der kostimulatorische Ligand, für den CD28 ein Rezeptor ist, fehlt. Harding et al., Nature, 356:607–609 (1992). Chen et al., Cell, 71:1093–1102 (1992) fanden heraus, dass eine erhöhte T-Zell-Kostimulierung durch die CD28- und CTLA-4-Rezeptoren einen therapeutischen Nutzen in der Schaffung einer Immunität gegen Tumoren, die virale Antigene exprimieren, aufweist.
Virale Antigene können in infizierten Zellen abgebaut werden, wenn spezifische virale Antigenpeptid-Fragmente, die MHC Klasse I-Moleküle binden, an der Zelloberfläche präsentiert werden, wo sie als Ziele für MHC-restringierte CTL dienen. Whitton et al. (1990). Allerdings sind die meisten infizierten Zellen in viral infizierten Wirten keine professionellen APCs, die kostimulatorische Proteine exprimieren. Außerdem rufen infizierte Zellen, denen kostimulatorische Moleküle wie B7-1, B7-2, B7-3 fehlen, möglicherweise keine wirksame zelluläre Immunantwort hervor. Sind diese Mechanismen inadäquat und versagen sie darin, das Agens zu beseitigen, so können Infektionen fortbestehen und chronisch werden.
Einige immunologische Mechanismen, wie etwa CTL-Antworten, die an der Auflösung einer bestehenden Infektion, die durch ein intrazelluläres infektiöses Agens verursacht ist, beteiligt sind, können ebenfalls eine Rolle in der Verhütung neuer Infektionen spielen. Dagegen erscheinen andere immunologische Mechanismen, wie z.B. ein neutralisierender Antikörper, eindeutig als wichtiger zur Verhütung bestimm ter viraler Infektionen als zur Auflösung einer bestehenden Infektion. Im Falle der neutralisierenden Antikörper können Antikörper, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind, auf eine Neutralisierung der Infektivität des Virus durch Fördern der viralen Aggregation und schließliches Entfernen des Virus aus dem Blutstrom hinwirken. Virale Infektionen, die typischerweise durch einen Virus-neutralisierenden Antikörper blockiert werden, können ebenfalls durch Immunisierung mit Antigenen verhütet werden, die dieselben neutralisierenden Antikörper hervorrufen. Für andere intrazelluläre infektiöse Agenzien kann jedoch kein neutralisierender Antikörper hervorgerufen werden, bzw. ist dieser, wenn er hervorgerufen wurde, als Schutz unzureichend. Nichts desto trotz kann ein Schutz durch die Einführung eines geeigneten immunisierenden Agens verliehen werden. In solchen Fällen scheinen zelluläre Immunmechanismen die Fähigkeit des immunisierenden Agens, Schutz gegen eine Infektion zu bieten, zu fördern. Damit die Immunantwort zu einem Schutz führt, muss das immunisierende Agens eine starke und anhaltende CTL-Antwort hervorrufen. Murphy et al., in Virology, 2. Aufl., Hrsg. B. Fields, Raven Press, New York, S. 469–502 (1990).
Somit besteht ein Bedarf nach einer Methode zur Verstärkung der Immunantwort auf intrazelluläre infektiöse Agenzien, wie etwa Viren, durch Hervorrufung einer starken CTL-Antwort. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Materialien zur Verwendung bei Methoden bereit, die der Verstärkung der Immunantwort eines Individuums auf ein intrazelluläres infektiöses Agens, wie etwa ein Virus, Protozoe, Pilz oder Bakterium, dienen. Die Materialien umfassen Vektoren, die für einen kostimulatorischen Faktor für die T-Zellaktivierung (im folgenden "kostimulatorischer Faktor") und ein "Zielantigen" von dem infektiösen Agens codieren. Der Vektor wird, entweder als ein Polynukleotid oder verpackt in ein Virus-Assembly, entweder direkt an das zu behandelnde Individuum verabreicht, oder alternativ in eine Zelle inseriert, die dann dem zu behandelnden Individuum verabreicht wird. Die Verabreichung der genetischen Information, die den kostimulatorischen Faktor und das Zielantigen codiert, verstärkt die Immunantwort, indem unter anderem die Generierung von CTLs hervorgerufen wird, die auf Zellen gerichtet sind, die mit dem infektiösen Agens, von dem das Zielantigen stammt, infiziert sind.
Demgemäß besteht eine Ausführungsform der Erfindung in einem rekombinanten Polynukleotid, umfassend eine Region, die für einen kostimulatorischen Faktor codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, und außerdem umfassend eine Region, die für ein Zielantigen, oder ein Fragment des Antigens, das eine Immunantwort stimulieren oder verstärken kann, codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist. Die Expression des kostimulatorischen Faktors und Zielantigen-Polypeptids in einem Individuum verleiht dem Individuum eine zumindest teilweise Immunität gegen ein intrazelluläres infektiöses Agens, das natürlicherweise für das Zielantigen-Polypeptid codiert. Das rekombinante Polynukleotid kann sich aus einem viralen Vektor oder anderen Vektoren zusammensetzen, wie nachstehend beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch ein Paar von koexprimierbaren Vektoren nach Anspruch 2. Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Polynukleotid, umfassend eine Region, die für einen kostimulatorischen Faktor codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, und mit einem rekombinanten Polynukleotid transformiert ist, zusammengesetzt aus einer Region, die für ein Zielantigen-Polypeptid codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist. Die Expression des kostimulatorischen Faktors und des Zielantigen-Polypeptids in dem Individuum verleiht eine zumindest teilweise Immunität gegen ein intrazelluläres infektiöses Agens, welches das Zielantigen-Polypeptid natürlicherweise codiert.
Das rekombinante Polypeptid, umfassend eine Region, die für einen kostimulatorischen Faktor codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, und mit einem rekombinanten Polynukleotid, umfassend eine Region, die für ein Zielantigen-Polypeptid codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, kann einem Individuum in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Es kann die Verminderung eines physischen Symptoms, die assoziiert ist mit einer Antwort auf eine Infektion durch ein intrazelluläres Pathogen, das natürlicherweise das Zielantigen codiert, bestimmt werden.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einer Methode der Verwendung der oben beschriebenen rekombinanten Polynukleotide zum Transformieren einer Wirtszelle mit dem Polynukleotid. Weitere Aspekte der Erfindung werden aus den unabhängigen Ansprüchen erkennbar werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt eine Linienzeichnung zweier Virus-Vektoren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die entscheidende Rolle der kostimulatorischen Faktoren besteht in der Erzeugung von Zellen, die die gewünschten Zielantigene exprimieren, wie etwa virale Antigene, d.h. wirksame APCs, um die T-Zellaktivierung zu erleichtern. Durch Schaffung eines Systems, welches einen kostimulatorischen Faktor (oder einen funktionellen Abschnitt davon) gleichzeitig mit einem Zielantigen exprimiert, führt die resultierende Antwort zur Eliminierung der infizierten Wirtszellen und zu einem stärkeren Schutz der uninfizierten Wirtszellen gegen neue Infektionen.
Die Erfindung lehrt, dass eine Immuntherapie, die in ein Individuum eine genetische Information einführt, die für die funktionellen Abschnitte eines kostimulatorischen Faktors und ein Zielantigen codiert, zur Aktivierung und/oder Verstärkung der Immunantwort eines infizierten Säugerwirts verwendet werden kann. Die Verstärkung umfasst eine zelluläre Antwort auf Infektionen, die durch das intrazelluläre infektiöse Agens, von dem das Zielantigen abgeleitet ist, verursacht ist, und eine induzierte schützende Immunantwort in uninfizierten Zellen, um eine neue Infektion durch das infektiöse Agens zu verhindern.
Die folgenden, hierin verwendeten Begriffe sind wie folgt definiert.
Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine innerhalb der Definition von Polypeptid enthalten. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Post-Expressions-Modifikationen des Polypeptids oder schließt diese aus, wie zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und ähnliches. Innerhalb der Definition enthalten sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürlicher Aminosäuren etc.), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, als auch weitere im Fachgebiet bekannte Modifikationen, die sowohl natürlich vorkommend als auch nicht-natürlich vorkommend sind.
"Transformation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von der für die Insertion angewendeten Methode, zum Beispiel die direkte Aufnahme, Transduktion, F-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynukleotid kann als ein nicht-integrierter Vektor, zum Beispiel ein Plasmid, erhalten bleiben oder kann alternativ in das Wirtszellgenom integriert werden.
"Behandlung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Prophylaxe und/oder Therapie. Die Wirksamkeit einer Behandlung kann durch die Linderung einer oder mehrere Symptome bestimmt werden, die normalerweise mit einer durch ein intrazelluläres Pathogen verursachten Erkrankung assoziiert sind.
"Intrazelluläres Pathogen", bezieht sich auf ein Agens, das zur Verursachung eines krankhaften Zustands in einem anfälligen Individuum fähig ist, wobei ein Teil oder der gesamte replikative Zyklus des Pathogens innerhalb der Zellen eines infizierten Individuums erfolgt. Zu intrazellulären Pathogenen zählen zum Beispiel Protozoen, Pilze, Bakterien und Viren.
"Helferzellen" oder "T_H-Zellen" stellen eine funktionelle Subklasse der T-Zellen dar, die in der Generierung zytotoxischer T-Zellen hilfreich sein können und mit B-Zellen in der Produktion einer Antikörperreaktion kooperieren. Helferzellen erkennen gewöhnlich ein mit Klasse II-MHC-Molekülen assoziiertes Antigen.
Ein "Antigen-spezifischer T-Zellklon" setzt sich aus den Nachkommen einer einzelnen Zelle zusammen; die Zellen bei diesem Typ von Klon sind von demselben Phänotyp und werden alle auf dasselbe Antigen zielgerichtet. Methoden zur Präparierung von Antigen-spezifischen T-Zellklonen sind im Fachgebiet bekannt.
Der Ausdruck "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf eine replizierbare Einheit von DNA oder RNA in einer Form, die in eine Zielzelle durch Transformation, Elektroporation, Transduktion oder virale Infektion einführbar ist, und die für die Expression einer heterologen strukturellen Codierungssequenz codiert, zum Beispiel ein Zytokin, welches in mRNA transkribiert und in Protein unter der Kontrolle von Elementen mit einer regulatorischen Rolle in der Genexpression translatiert wird. Solche Vektoren werden vorzugsweise auch entsprechende Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen enthalten, einschließlich Initiationssequenzen, die an die Codierungssequenz operativ geknüpft sind.
"Rekombinant", wie hierin verwendet, meint, dass eine bestimmte DNA-Sequenz das Produkt verschiedener Kombinationen aus Klonierungs-, Restriktions- und Ligationsschritten ist, was zu einem Konstrukt mit einer strukturellen Codierungssequenz führt, die von in natürlichen Systemen zu findenden homologen Sequenzen unterscheidbar ist. Allgemein können DNA Sequenzen, die für die strukturelle Codierungssequenz codieren, zum Beispiel Zytokine, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotid-Linkern, oder aus einer Reihe von Oligonukleotiden, zusammengesetzt werden, um ein synthetisches Gen zu erhalten, welches in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimierbar ist. Solche Sequenzen werden vorzugsweise in der Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt, der nicht unterbrochen ist durch interne nicht-translatierte Sequenzen, oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, könnte ebenfalls verwendet werden. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' von dem offenen Leserahmen vorhanden sein, wo solche Sequenzen die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht beeinträchtigen.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und andere solcher Begriffe, die Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zelllinien, die als unizelluläre Entitäten kultiviert werden, bezeichnen, beziehen sich auf Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-Polynukleotide verwendet werden können oder worden sind, und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert worden ist. Es ist selbstverständlich, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle hinsichtlich der Morphologie oder des genomischen oder gesamten DNA-Komplements nicht notwendigerweise völlig identisch zu dem ursprünglichen Elter aufgrund natürlicher, zufälliger oder willkürlicher Mutation sein muss.
Eine CTL ist "zytolytisch spezifisch für" Zellen, die Antigene exprimieren, wenn die CTL zur selektiven Erkennung und Lysierung der Zellen, die das Antigen tragen, fähig ist. Eine CTL ist "zytolytisch reaktiv gegen" Zellen, die Antigene exprimieren, wenn die CTL zum Lysieren der Zellen, die das Antigen tragen, fähig ist, unabhängig von seiner Fähigkeit zur selektiven Erkennung solcher Zellen.
"Antigen-spezifische Expression" bezieht sich auf die Expression, die erfolgt, wenn die T-Zelle ihr kognates Antigen erkennt.
"Kognates Antigen" bezieht sich auf ein Antigen, von dem ein Peptid, wenn mit einem MHC-Molekül assoziiert, einen Liganden bildet, der an eine Lymphyozyte bindet, die es erkennt und das Auslösen von Signalen für die Effektorfunktion der Zelle und/oder für die Proliferation verursacht.
"Zielantigen" bezieht sich auf ein Antigen, das bei Expression in einer Zelle eine CTL-Antwort hervorrufen kann, die auf Zellen gerichtet ist, die jenes Antigen exprimieren.
Ein "Agretop" ist jener Abschnitt eines Antigens oder antigenen Fragments, welcher ihm die Bindung an ein MHC-Molekül ermöglicht.
Eine "aktivierte Lymphozyte" ist eine solche, die als Folge der Bindung eines kognaten Antigenpeptids: MHC-Moleküls in einer Menge Polypeptid-stimulatorische Fakto ren (einschließlich zum Beispiel von Zytokinen) produziert, die relativ zu der Lymphozyte ohne den gebundenen Liganden erhöht ist.
Eine "Transkriptions-regulatorische Region" umfasst all jene Elemente, die für die Transkription erforderlich sind, und kann Elemente umfassen, die für die Regulation und Zell-spezifische Transkription erforderlich sind. Somit umfasst eine transkriptionell regulatorische Region zumindest die Promotorsequenz und kann auch weitere regulatorische Sequenzen, wie etwa Enhancer, und Transkriptionsfaktor-bindende Stellen umfassen.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, worin die derart beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen die Funktion in ihrer vorgesehenen Weise erlaubt. Zum Beispiel ist ein Promotor operativ an eine Codierungssequenz geknüpft, wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst.
Der Begriff "rekombinantes" Polynukleotid oder Nukleinsäure bezieht sich auf eine solche, die nicht natürlich vorkommt, oder die durch die künstliche Kombination zweier ansonsten separater Segmente der Sequenz erhalten wird. Diese künstliche Kombination wird oftmals entweder durch chemische Synthesemethoden oder durch die künstliche Manipulation isolierter Segmente der Nukleinsäuren, z.B. durch genmanipulatorische Techniken, erzielt. Dies wird üblicherweise vorgenommen, um ein Codon durch ein redundantes Codon zu ersetzen, das für dieselbe oder eine konservative Aminosäure codiert, wobei typischerweise eine Sequenz-Erkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird dies vorgenommen, um Nukleinsäure-Segmente mit erwünschten Funktionen miteinander zu verbinden, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzielen.
"Regulatorische Sequenzen" bezieht sich auf solche Sequenzen, die normalerweise mit der Codierungssequenz eines Locus assoziiert sind (zum Beispiel innerhalb von 50 kb), die die Expression des Gens (einschließlich der Transkription des Gens, und Translation, Splicing, Stabilität oder ähnliches der Messenger-RNA) beeinflussen. Zu regulatorischen Sequenzen zählen unter anderem Promotoren, Enhancer, Spleißstellen und Polyadenylierungsstellen.
Der "Sense-Strang" einer Nukleinsäure enthält die Sequenz, die Sequenzhomologie zu der der kognaten mRNA aufweist. Der "Anti-Sense-Strang" enthält eine Sequenz, die zu der des "Sense-Strangs" komplementär ist.
Ein "Individuum", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Vertebraten, insbesondere Mitglieder der Säuger-Spezies, und umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Haustiere, Sporttiere und Primaten, einschließlich des Menschen.
"Immunisierung" bezieht sich auf das Verleihen eines Zustands der Immunität einem Individuum durch Verabreichung eines therapeutischen oder prophylaktischen Mittels.
Mit "Immunität" ist eine Verminderung und/oder Verhütung eines oder mehrerer physischer Symptome in Verbindung mit einer Reaktion auf eine Infektion durch das Pathogen, von dem das Zielantigen hergeleitet wurde, gemeint.
Eine "Immunantwort" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff besteht in der Entwicklung in dem Wirt einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort auf das intrazelluläre infektiöse Agens, das für das Zielantigen codiert. Üblicherweise umfasst eine solche Reaktion das Individuum, das CTLs und/oder B-Zellen und/oder eine Vielfalt von Klassen der T-Zellen produziert, die spezifisch auf die APCs, die das Zielantigen exprimieren, gerichtet sind.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" einer Zusammensetzung ist eine Dosis, die ausreicht, um eine Immunantwort zu induzieren und/oder Immunität gegen ein intrazelluläres infektiöses Agens, das natürlicherweise für das Zielantigen codiert, zu verleihen.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie anwenden, die innerhalb der Fachkenntnisse des Gebiets liegen. Solche Techniken sind in der Literatur umfassend erläutert. Siehe z.B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Zweite Auflage (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait, Hrsg., 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, Hrsg., 1987), die Reihe METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.M. Miller und M.P. Calos, Hrsg. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg.); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith, und K. Struhl, Hrsg. 1987); und CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach und W. Strober, Hrsg. 1991).
APCs, die ein Zielantigen exprimieren und zur Stimulierung einer T-Zellanwort, vorzugsweise einer CTL-Antwort, fähig sind, werden entweder in vivo oder in vitro durch die Insertion eines oder mehrerer rekombinanter Polynukleotide geschaffen, die eine Sequenz enthalten, die für mindestens einen kostimulatorischen Faktor und mindestens ein Zielantigen-Polypeptid codiert, so dass der/die kostimulatorische(n) Faktor(en) und das/die Zielantigen-Polypeptid(e) innerhalb der Empfänger-Wirtszelle exprimiert werden.
Der kostimulatorische Faktor, der von dem rekombinanten Polynukleotid exprimiert wird, wird wenigstens einen Abschnitt des Proteins enthalten, der ausreichend ist, um die Bindung der Zelle, die den kostimulatorischen Faktor exprimiert, an ihren kostimulatorischen Liganden zu ermöglichen. Methoden zur Bestimmung dieser Bindung sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Linsley et al., die eine Verfahrensweise beschreiben, bei der die zu testenden Zellen mit ⁵¹CR markiert werden und dann sowohl mit CD28⁺- als auch CD28^--CHO-Zellen inkubiert werden, und dann die Adäsion der markierten Zellen an den CHO-Zellen durch die ⁵¹CR-Freisetzung bestimmt wird. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5031–5035 (1990). Die extrazellulären Domänen und Transmembran-Domänen der kostimulatorischen Faktoren sind üblicherweise in dem Polypeptid enthalten, und in bevorzugten Ausführungsformen ist der gesamte kostimulatorische Faktor codiert. Die Sequenzen für die Polynukleotide, die für kostimulatorische Faktoren codieren, und die funktionellen Domänen sind bekannt und sind beschrieben beispielsweise bei Linsley et al. (1990) (Mensch) und Freeman et al., J. Immunol., 143:2714–2722 (1989) (Maus).
Das Zielantigen-Polypeptid, das von dem rekombinanten Polynukleotid exprimiert wird, besteht in dem gesamten oder einem Fragment eines Zielantigens, das in dem pathogenen intrazellulären Mikroorganismus natürlich codiert ist, gegen den eine erhöhte oder verstärkte Immunantwort gewünscht ist, und das sich aus ein oder mehreren Agretopen von jenem Mikroorganismus zusammensetzt. Zielantigene sind vorzugsweise von Viren, und insbesondere Viren, die zu chronischen Infektionen führen, zum Beispiel den Hepadnaviren (einschließlich HBV), den Lentiviren (einschließlich HIV), Herpesviren (einschließlich HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV und HHV-6) und den Flaviviren/Pestiviren (einschließlich HCV). Ebenfalls umfasst als Viren, die chronische virale Infektionen verursachen, sind humane Retroviren, zum Beispiel humane T-lymphotrope Viren (HTLV-1 und HTLV-2), die T-Zell-Leukämie und Myelopathien verursachen. Zu weiteren Organismen, die chronische Infektionen verursachen, zählen zum Beispiel pathogene Protozoen (z.B. Pneumocystis carinii, Trypanosoma, Malaria und Toxoplasma gondii), Bakterien (z.B. Mykobakterien, Salmonellen und Listerien) und Pilze (z.B. Candida und Aspergillus).
Die Nukleotidsequenzen einer Anzahl dieser Viren, einschließlich verschiedener Spezies, Stämme und Isolate, sind im Fachgebiet bekannt. Für Überblicke, siehe: Robinson (1990) (Hepadnaviridae); Levy, Microbiological Reviews, 57:183–289 (1993) (HIV); und Choo et al., Seminars in Liver Disease, 12:279–288 (1992)(HCV). Besonders geeignete Zielantigene sind solche, die eine T-Zellantwort, und insbesondere eine CTL-Antwort während der Infektion, induzieren. Diese können zum Beispiel vom HBV das Core-Antigen, das E-Antigen und das Oberflächenantigen (HBsAg) umfassen. Polynukleotidsequenzen für HbsAg, einschließlich der pre-S1, pre-S2 und S-Regionen von einer Vielfalt von Oberflächenantigen-Subtypen, sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Okamoto et al., J. Gen. Virol., 67:1383–1389 (1986); Genbank-Zugriffsnummern D00329 und D00330. Die Polynukleotidsequenzen, die für HIV Glykoprotein gp160 und andere antigene HIV-Regionen codieren, sind im Fachgebiet bekannt. Lautenberger et al., Nature, 313:277–284 (1985); Starcich et al., Cell. 45:637–648 (1986); Wiley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5038–5042 (1986); und Modrow et al., J. Virol., 61:570–578 (1987).
Es befindet sich innerhalb des Rahmens der Erfindung, Nukleotide aufzunehmen, die für zwei oder mehr Zielantigen-Polypeptide codieren, die fusioniert sein können oder auch nicht. Die beiden Zielantigen-Polypeptide können von demselben pathogenen intrazellulären Mikroorganismus sein, oder, wenn eine Verstärkung der Immunantwort auf mehr als einen Mikroorganismus erwünscht ist, können von verschiedenen Mikroorganismen sein.
Die Sequenzen, die für den kostimulatorischen Faktor und das Zielantigen-Polypeptid codieren, sind an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft. Transkriptionskontrollregionen sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel Regionen, die aus den folgenden isoliert sind: der humanen Cytomegalovirus (HCMV) IE94-Promotorregion (Boshart et al., Cell. 41:521–530 (1985)); dem humanen IL-2 Gen (Fujita et al., Cell. 46:401–407 (1986)); dem humanen IFN-γ-Gen (Ciccarone et al., J. Immunol., 144:725–730 (1990)); dem humanen IL-3-Gen (Shoemaker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9650–9654 (1990)); dem humanen IL-4-Gen (Arai et al., J. Immunol., 142:274–282 (1989)); dem humanen Lymphotoxin-Gen (Nedwin et al., Nuci. Acids. Res., 13:6361–6373 (1985)); dem humanen Granulozyten-Makrophagen-CSF-(GM-CSF)-Gen(Miyatake et al., EMBO J., 4:2561–2568 (1985)); dem humanen Perforin-Gen (Lictenheld et al., J. Immunol., 143:4267–4274 (1989)); dem humanen 519-Gen (Manning et al., J. Immunol., 148:4036–4042 (1992)); dem humanen Granzym B-(CTLA-1)-Gen (Haddad et al., Gene, 87:265–271 (1990)); dem humanen CTLA-4-Gen (Harper et al., J. Immunol., 147:1397–1044 (1991)); dem humanen CGL-2-Gen (Heusel et al., J. Biol. Chem., 266:6152–6158 (1991)); dem humanen Granzym-H-Gen (Haddad et al., Int. Immunol., 3:57–66 (1990)); dem humanen IL-2-Rezeptor, α-Ketten-Gen (Cross et al., Cell, 49:47–56 (1987)); dem murinen T-Zell-Aktivierungs-3-(TCA-3)-Gen (Wilson et al., J. Immunol., 141:1563–1570 (1988)); und dem humanen CD69-Gen.
Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung sind die Transkriptionskontrollregionen Hybride. Zum Beispiel können Enhancer-Regionen (z.B. von der HCMV-IE-Transkriptionskontrollregion und/oder von der SV40 frühen Promotorregion) stromaufwärts der Transkriptionskontrollregionen inseriert werden. Alternativ, oder zusätzlich, können multimere Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (z.B. NF-AT und/oder NFKB) in oder stromaufwärts der Transkriptionskontrollregionen inseriert werden, wobei die Stromaufwärts-Region des einen mit der proximalen Region des anderen kombiniert wird. Sekretionssignale können ebenfalls aufgenommen werden, wo geeignet, ob nun von einem nativen Protein oder von anderen sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, die dem Protein die Durchquerung und/oder Logierung in Zellmembranen erlaubt, wodurch es seine funktionelle Topologie erreichen oder aus der Zelle sekretiert werden kann.
Außerdem ist es nützlich, in die rekombinanten Polynukleotide einen positiven Marker aufzunehmen, der die Selektion von Zellen ermöglicht, die das rekombinante Polynukleotid tragen. Der positive selektierbare Marker kann ein Gen sein, welches auf die Einführung in die Wirtszelle hin einen dominanten Phänotyp exprimiert, der die positive Selektion von Zellen erlaubt, die das Gen tragen. Gene dieses Typs sind im Fachgebiet bekannt und umfassen unter anderem das Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen (hph), welches eine Resistenz gegen Hygromycin B verleiht, das Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen (neo oder aph) von Tn5, welches für die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 codiert, das Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Gen, das Adenosindeaminase-Gen (ADA) und das Multi-Drug-Resistenz-(MDR)-Gen.
Die Sequenzen, die für den kostimulatorischen Faktor und das/die Zielantigen-Polypeptid(e) codieren, können auf separaten Polynukleotiden liegen, befinden sich aber vorzugsweise auf demselben Polynukleotid. Diese codierenden Sequenzen können auch unter der Kontrolle separater Transkriptionskontrollsequenzen sein, oder unter der Kontrolle derselben Transkriptionskontrollsequenz.
Über die Transkriptionskontrollregionen hinaus liegen bei einigen Ausführungsformen die Polynukleotide, die für den kostimulatorischen Faktor und das/die Zielantigen(e) codieren, in der Form rekombinanter Expressionsvektoren vor.
Techniken für die Nukleinsäure-Manipulation sind allgemein beschrieben zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989), Ausubel et al. (1987); und in Annual Reviews of Biochemistry, 61:131–156 (1992). Die zur Anwendung dieser Techniken nützlichen Reagenzien, wie etwa Restriktionsenzyme und ähnliches, sind im Fachgebiet breit bekannt und kommerziell beziehbar von einer Reihe von Händlern.
Die großen Mengen an Polynukleotiden, die zur Schaffung der Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle produziert werden. Die natürlichen oder synthetischen Polynukleotid-Fragmente, die für ein gewünschtes Fragment codieren, können in rekombinante Nukleinsäure-Konstrukte eingebaut, typischerweise Polynukleotid-Konstrukte, die zur Einführung und Replikation in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle fähig sind. Üblicherweise werden die Konstrukte zur Replikation in einem einzelligen Wirt geeignet sein, wie etwa Hefe oder Bakterien, doch können auch zur Einführung, mit und ohne Integration innerhalb des Genoms, in kultivierte Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryotische Zelllinien vorgesehen sein. Die Reinigung der mittels der Methoden der vorliegenden Erfindung produzierten Nukleinsäuren ist beschrieben z.B. bei Sambrook et al. (1989).
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotide können auch zum Teil oder insgesamt mittels chemischer Synthese produziert werden, z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode, wie beschrieben von Beaucage und Carruthers, Tetra. Letts., 22:1859–1862 (1981) oder der Triester-Methode gemäß der Methode, die beschrieben ist bei Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981), die auf handelsüblichen automatisierten Oligonukleotid-Synthetisiergeräten vorgenommen werden können. Ein doppelsträngiges Fragment kann aus dem einzelsträngigen Produkt der chemischen Synthese entweder durch Synthetisieren des komplementären Strangs und Vereinigen der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Addieren des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer entsprechenden Primersequenz erhalten werden.
Polynukleotid-Konstrukte, die zur Einführung in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle für die Replikation hergestellt werden, werden typischerweise ein durch den Wirt zu erkennendes Replikationssystem umfassen, einschließlich des angestrebten rekombinanten Polynukleotid-Fragments, das für das gewünschte Polynukleotid codiert. Solche Vektoren können mit Hilfe standardmäßiger rekombinato rischer Techniken präpariert werden, die im Fachgebiet wohl bekannt sind und erörtert sind zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987).
Vorzugsweise wird das Polynukleotid-Konstrukt während der Klonierungsphase einen selektierbaren Marker enthalten, ein Gen, das für ein Protein codiert, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Das Vorhandensein dieses Gens gewährleitstet das Wachstum lediglich jener Wirtszellen, die die Inserte exprimieren. Typische Selektionsgene codieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere toxische Substanzen verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat etc.; (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren, oder (c) entscheidende Nährstoffe liefern, die aus den komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bacilli codiert. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers wird von der Wirtszelle abhängen, wobei geeignete Marker für verschiedene Wirte im Fachgebiet wohl bekannt sind.
Die rekombinanten Polynukleotide, die für den kostimulatorischen Faktor und das Zielantigen-Polypeptid codieren, können in Individuen in mehreren Weisen eingeführt werden. Zum Beispiel können die Polynukleotide ex vivo in eine Wirtszelle, zum Beispiel dendritische Zellen, oder Zellen aus einer Hautbiopsie, eingeführt werden. Die Zellen, die das rekombinante Polynukleotid enthalten, können zur Verleihung von Immunität an Individuen verwendet werden. Die Zellen werden üblicherweise durch Infusion verabreicht, wobei jede Infusion in einem Bereich von mindestens 10⁶ bis 10¹⁰ Zellen/m², bevorzugt im Bereich von mindestens 10⁷ bis 10⁹ Zellen/m², enthält. Die Klone können durch eine einzelne Infusion oder durch mehrfache Infusionen über einen Zeitbereich verabreicht werden. Da jedoch zu erwarten steht, dass verschiedene Individuen hinsichtlich ihrer Ansprechbarkeit variieren, werden die Art und Menge der infundierten Zellen, als auch die Anzahl der Infusionen und der Zeitbereich, über den mehrfache Infusionen gegeben werden, durch den betreuenden Arzt oder Veterinär bestimmt und können anhand einer routinemäßigen Untersuchung festgelegt werden.
Die Polynukleotide, die für den kostimulatorischen Faktor und das Zielantigen-Polypeptid codieren, können in die gewünschte Zelle ex vivo mittels im Fachgebiet bekannter Methoden eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel der Transformation, Elektroporation, Lipofektion und Transduktion, einschließlich der Verwendung von Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren und insbesondere unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden des retroviralen Gentransfers.
Verschiedene Infektionstechniken sind entwickelt worden, die rekombinante infektiöse Viruspartikel für den Gentransfer nützen. Dies stellt einen bevorzugten Ansatz für die vorliegende Erfindung dar. Zu den viralen Vektoren, die in dieser Weise verwendet worden sind, zählen Virusvektoren, die abgeleitet sind von Affenvirus 40 (SV40; Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:158 (1985)), Adenoviren (Karlsson et al., EMBO J., 5:2377 (1986)), AAV (Carter, Current Opinion in Biotechnology 1992, 3:533–539) und Retroviren (Coffin, bei Weiss et al. (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Aufl., Bd. 2, Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1985, S. 17–71). Somit gibt es zahlreiche Gentransfer- und Expressionsmethoden, die aber im Wesentlichen darin funktionell sind, genetisches Material in Säugerzellen einzuführen und dort zu exprimieren. Mehrere der obigen Techniken sind zur Transduzierung hämatopoetischer oder lymphoider Zellen verwendet worden, einschließlich der Calciumphosphat-Transfektion (Berman et al. (1984)), Protoplast-Fusion (Deans et al. (1984)), Elektroporation (Cann et al., Oncogene, 3:123 (1988)) und Infektion mit rekombinantem Adenovirus (Karlsson et al. (1986)); Reuther et al., Mol. Cell. Biol., 6:123 (1986); AAV (Carter (1985)) und Retrovirus-Vektoren (Overell et al., Oncogene 4:1425 (1989)).
Retrovirale Vektoren bieten eine hoch effiziente Methode für den Gentransfer in eukaryotische Zellen, welches die bevorzugte Methode für die Übertragung der Polynukleotide der Erfindung ist. Darüber hinaus findet die retrovirale Integration in einer kontrollierten Weise statt und führt zu der stabilen Integration einer oder einiger Kopien der neuen genetischen Information pro Zelle.
Retroviren stellen eine Klasse von Viren dar, die unter Verwendung einer Virus-codierten, RNA-gerichtete DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase replizieren, um ein virales RNA-Genom zum Erhalt eines doppelsträngigen DNA-Intermediats zu replizieren, welches in die chromosomale DNA einer Vogel- oder Säuger-Wirtszelle aufgenommen wird. Die meisten retroviralen Vektoren stammen von murinen Retro viren. Zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung adaptierbare Retroviren können jedoch von jeglicher Vogel- oder Säugerzell-Quelle stammen. Diese Retroviren sind vorzugsweise amphotrop, was bedeutet, dass sie zur Infizierung von Wirtszellen eines breiten Wirtsbereichs von mehreren Spezies, einschließlich des Menschen, fähig sind.
Ein charakteristisches Merkmal der retroviralen Genome (und der wie hierin beschrieben verwendeten retroviralen Vektoren) ist das retrovirale Long Terminal Repeat, oder LTR, was eine untranslatierte Region von etwa 600 Basenpaaren ist, die in geringfügig variierenden Formen an den 5'- und 3'-Enden des retroviralen Genoms zu finden ist. Wenn in DNA als einem Provirus eingebaut, umfasst die retrovirale LTR eine kurze Direct-Repeat-Sequenz an jedem Ende und Signale für die Transkriptionsinitiation durch RNA-Polymerase II und die 3'-Spaltung und Polyadenylierung der RNA-Transkripte. Das LTR enthält alle weiteren cis-agierenden Sequenzen, die für die virale Replikation erforderlich sind.
Ein "Provirus" bezieht sich auf das DNA-reverse Transkript eines Retrovirus, welches in die chromosomale DNA in einer geeigneten Wirtszelle, oder eine klonierte Kopie davon, oder eine klonierte Kopie von nicht-integrierten intermediären Formen der retroviralen DNA, stabil integriert ist. Die Forward-Transkription des Provirus und der Zusammenbau zu einem infizierten Virus erfolgt in der Gegenwart eines entsprechenden Helfer-Virus oder in eine Zelllinie, die entsprechende Sequenzen enthält, die eine Einkapselung ohne gleichzeitige Produktion eines kontaminierenden Helfer-Virus ermöglichen. Mann et al. beschreiben die Entwicklung von "Verpackungs"-Zelllinien (z.B. Ψ2) die zur Erzeugung von Helfer-freien Vorräten an rekombinantem Retrovirus verwendet werden können. Cell, 33:153 (1983).
Verpackungszelllinien enthalten integrierte retrovirale Genome, denen Sequenzen fehlen, die in cis für die Verkapselung erforderlich sind, doch die alle erforderlichen Genprodukte in trans liefern, um intakte Virionen zu produzieren. Die von dem integrierten mutierten Provirus transkribierte RNA kann nicht selbst verpackt werden, doch können diese Zellen die RNA verkapseln, die von einem rekombinanten, in dieselbe Zelle eingeführten Retrovirus transkribiert wird. Die resultierenden Viruspartikel sind infektiös, doch Replikations-defekt, was sie zu nützlichen Vektoren macht, die zur Erzeugung von infektiösem Virus nach Einführung in eine Zelle unfähig sind, der die komplementäre genetische Information, um die Verkapselung zu ermöglichen, fehlt.
Die Verkapselung in eine Zelllinie, die trans-agierende Elemente beherbergt, welche für eine ecotrope Virushülle (z.B. Ψ2) codieren, liefert ecotrope (beschränkter Wirtsbereich) Virusnachkommen. Alternativ liefert der Zusammenbau zu einer Zelllinie, die amphotrope Verpackungsgene enthält (z.B. PA317, ATCC CRL 9078) amphotrope Virusnachkommen. Miller und Buttimore, Mol. Cell. Biol., 6:2895 (1986). Diese Verpackungszelllinien liefern die erforderlichen retroviralen Gag-, Pol- und Env-Proteine in trans. Diese Strategie führt zur Produktion von retroviralen Partikeln, die hochgradig infektiös für Säugerzellen sind und zugleich zur weiteren Replikation, nachdem sie sich in das Genom der Zielzelle integriert haben, unfähig sind. Das Produkt des Env-Gens ist für die Bindung des Retrovirus an virale Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzelle verantwortlich und bestimmt daher den Wirtsbereich des Retrovirus. Die PA317-Zellen produzieren retrovirale Partikel mit einem amphotropen Hüllprotein, welches Zellen von humanem Ursprung und dem anderer Spezies transduzieren kann. Andere Verpackungszelllinien produzieren Partikel mit ecotropen Hüllproteinen, die zur Transduktion lediglich von Mäuse- und Rattenzellen fähig sind.
Zahlreiche retrovirale Vektor-Konstrukte sind erfolgreich verwendet worden, um viele Fremdgene zu exprimieren (siehe z.B. Coffin (1985)). Retrovirale Vektoren mit inserierten Sequenzen sind generell funktionell, und einige Sequenzen, die durchwegs inhibitorisch für die retrovirale Infektion sind, sind identifiziert worden. Funktionelle Polyadenylierungsmotive hemmen die retrovirale Replikation, indem sie die retrovirale RNA-Synthese blockieren, und es gibt eine obere Größenbeschränkung von etwa 11 kb der Sequenz, die in retrovirale Partikel verpackt werden kann; allerdings wurde das Vorhandensein mehrfacher interner Promotoren, die ursprünglich als problematisch erachtet wurden, als in verschiedenen retroviralen Konstrukten gut toleriert befunden. Coffin (1985); und Overell et al., Mol. Cell. Biol., 8:1803 (1983).
Viele Genprodukte sind in retroviralen Vektoren exprimiert worden. Dies kann entweder durch Platzieren der zu exprimierenden Sequenzen unter die Transkriptionskontrolle des in das retrovirale LTR eingebauten Promotors oder durch Platzieren der Sequenzen unter die Kontrolle eines zwischen die LTRs inserierten heterologen Promotors erreicht werden. Letztere Strategie liefert einen Weg, um ein dominantes selektierbares Markergen in dem Vektor gleichzeitig zu exprimieren und somit die Selektion von Zellen zu ermöglichen, die spezifische Vektorsequenzen exprimieren.
Die rekombinanten Polynukleotide, die den kostimulatorischen Faktor und das Ziel antigen-Polypeptid codieren, können in das zu behandelnde und/oder immunisierende Individuum direkt eingeführt werden. Die Polynukleotide der Erfindung können dem zu behandelnden Individuum direkt verabreicht werden. Bei dieser Methode ist es bevorzugt, dass das Polynukleotid sowohl den kostimulatorischen Faktor als auch das Zielantigen-Polypeptid codiert. Außerdem ist es bevorzugt, dass das Polynukleotid in der Form eines Expressionsvektors vorliegt.
Die Polynukleotide werden mit geeigneten Exzipienten gemischt und dem Individuum mittels irgendeiner im Fachgebiet bekannten geeigneten Methode verabreicht, einschließlich zum Beispiel parenteral (umfassend beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intramuskulär und subkutan), durch Ingestion, Lipofektion und transdermal. Geeignete Exzipienten sind im Fachgebiet bekannt und können von der Art des Individuums abhängen, dem die Polynukleotide verabreicht werden, als auch von dem Verabreichungsweg. Die Menge an dem Individuum zu verabreichendem Polynukleotid ist eine ausreichende Menge, um dem immunisierten Individuum Immunität zu verleihen. Diese Menge wird von dem zu behandelnden Individuum abhängen und wird durch den Arzt oder Veterinär, der die Behandlung verabreicht, bestimmt. Die zu verabreichende Menge als auch die Dauer der Verabreichung (vor oder nach Infektion) und die Anzahl der Dosen, ob nun einzelne oder vielfache, werden mittels routinemäßiger Methoden bestimmt, die den Fachleuten des Gebiets bekannt sind.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Polynukleotide der Erfindung in Virionen verkapselt und wird das Individuum mit dem verkapselten Polynukleotid behandelt. Die verwendeten Virionen können irgendwelche von jenen sein, die im Fachgebiet als für gentherapeutische Verfahrensweisen geeignet bekannt sind, von denen mehrere oben für die Einführung der Polynukleotide in eine Zelle ex vivo erörtert sind. Der Verabreichungsweg hängt von dem verwendeten Virion ab und kann zum Beispiel solche umfassen, die oben für die Verabreichung von nicht-verkapselten Polynukleotiden aufgelistet sind. Die Virionen werden in einem geeigneten Exzipienten präpariert und dem Individuum verabreicht. Die zu verabreichende Menge als auch die Dauer der Verabreichung (vor oder nach der Infektion) und die Anzahl der Dosen, ob nun einzelne oder mehrfache, werden durch den verabreichenden Arzt oder Veterinär bestimmt und sind mittels routinemäßiger Methoden bestimmbar, die den Fachleuten des Gebiets bekannt sind.
Die nachstehend angegebenen Beispiele sind als eine weitere Richtlinie für den ausführenden Fachmann des Gebiets mit üblicher Sachkenntnis bereitgestellt und sollen in keinster Weise als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden.
Beispiel 1
Design eines Expressionsvektors, der für ein B7-Polypeptid und ein GSVH c-Polypetid als ein virales Zielantigen-Polypeptid codiert
Die chronische Erdhörnchen-Hepatitis-Virus-(GSVH)-Infektion von Beechey-Erdhörnchen stellt ein Modellsystem für eine HBV-Infektion beim Menschen dar. (Vergl. Seeger et al., J. Virol., 51:367–375 (1984)). Das vorliegende Beispiel beschreibt ein retrovirales Vektor-Konstrukt für die Expression des B7-Gens und eines Gens, das für das c-Antigen (cAg) von GSVH codiert.
Das Vektor-Konstrukt verwendet den auf Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MMLV) basierten Replikations-inkompetenten Vektor pMV-7 (Ausubel et al. (1989); und Kirschmeier et al., DNA, 7:219–225 (1988)). pMV-7 enthält ein Neomycin-resistentes Gen unter der Kontrolle des HSV-Thymidinkinase-(TK)-Promotors, wodurch die Selektion in Gewebekultur von Zellen möglich ist, die den Vektor enthalten.
As GSHV c-Gen, das die Precore-Sequenz enthält, wird als eine Polynukleotid-Sequenz verwendet, die für ein Zielantigen codiert. Das GSVH c-Gen wird aus dem viralen Genom (EMBC/Genbank Zugriffsnummer K02715) mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert. Marion et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2941–2945 (1980) und Seeger (1984). Das isolierte GSHV c-Gen wird dann in den pMV-7-Vektor unter der Kontrolle des MMLV LTR eingeführt.
Humane B7 cDNA (EMBL/Genbank Zugriffsnummer M27533) wird als cDNA, amplifiziert durch PCR von der B7 mRNA der humanen Raji B-Zelllinie unter Verwendung von Primern amplifiziert, die aus der veröffentlichten cDNA-Sequenz designed sind. Freeman (1989). cDNA, die für das B7-1-Gen codiert, wurde in denselben Vektor wie das GSVH c-Gen unter der Kontrolle durch den CMV Immediate Early-Promotor eingeführt. Gaballe et al., J. Virol., 62:3334–3340 (1988).
Das pMV-7-basierte Vektor-Konstrukt, das für das B7-Polypeptid und cAg-Polypeptid codiert, wurde in eine retrovirale Verpackungszelllinie, psi-2, transfiziert. Miller et al., Mol. Cell. Biol., 6:2895-2902 (1986). Die transfizierten Zellen wurden dann durch Zucht in einem Kulturmedium, das Neomycin enthielt, selektioniert. Replikationsinkompetenter Retrovirus mit einer amphotropen Hülle, wie durch die in der Neomycin-Kultur gezüchteten Zellen produziert, wurde in dem Kulturmedium gefunden.
Beispiel 2
Design eines Expressionsvektors, der für ein B7-Polypeptid und GSVH GSHsAg-Polypeptid als einem viralen Zielantigen-Polypeptid codiert
Das Konstrukt wird wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass das GSVH-Polynukleotid, das für das Erdhörnchen-Hepatitis-Oberflächenantigen (GSHsAg), einschließlich der pre-S1, pre-S2 und S-Regionen, codiert, für das substituiert wird, das für GSVH cAg codiert. Die Polynukleotidsequenz, die für die zuvor genannten S-Regionen codiert, ist beschrieben bei Seeger et al. (1984).
Beispiel 3
Verwendung eines Vektors, der für B7-Polypeptid und GSHsAg codiert, um uninfizierten Individuen Immunität gegen GSHV zu verleihen
Eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die sich aus einem infektiösen retroviralen Vektor, verpackt in eine amphotrope Hülle (10⁷ Gewebekultur-infektiöse Einheiten) zusammensetzt, enthaltend Polynukleotidsequenzen, die für ein B7-Polypeptid und ein GSHsAg-Polypeptid codieren, wird einem uninfizierten und GSHV-anfälligen Beechey-Erdhörnchen parenteral verabreicht. Seeger et al. (1984). Der Vektor ist von der Konstruktion, die in Beispiel 2 beschrieben ist. Ein "uninfiziertes" GSHV-anfälliges Erdhörnchen weist keinen nachweisbaren Serumantikörper gegen Erdhörnchen-Hepatitis-Virus-Core-Antigen (Anti-GSHcAg) oder Antikörper gegen Erdhörnchen-Hepatitis-Virus-Oberflächenantigen (Anti-GSHsAg) auf. Die parenterale Verabreichung eines retroviralen Vektors, der das B7-Gen und GSHV-Gen enthält, führt zu einer Serum-Anti-GSHsAg-Reaktion und einer CTL-Reaktion, die auf Zellen gerichtet ist, die GSHsAg exprimieren.
Die duale Reaktion, d.h. Serum und CTL, verleiht dem uninfizierten Erdhörnchen eine zumindest teilweise Immunität gegen eine zukünftige Infektion durch GSHV.
Beispiel 4
Verwendung eines Vektors, der für B7-Polypeptid und GSHsAg-Polypeptid codiert, für die Behandlung einer chronischen Virus-Infektion
Zwei verschiedene Methoden können zur Verabreichung von Polynukleotiden, die für ein B7-Polypeptid und ein virales Zielantigen codieren, an Tiere, die chronisch mit GSHV infiziert sind, zur Behandlung einer Infektion verabreicht werden.
Übertraqung des Vektors, der für das B7-Polypeptid und GSHsAg-Polypeptid codiert, direkt in einen infizierten Säuger
Ein infektiöser retroviraler Vektor, der in eine amphotrope Hülle verpackt ist und für ein B7-Polypeptid und ein GSHcAg-Polypeptid codiert, wird wie in Beispiel 1 konstruiert. Der Vektor wird in einer therapeutisch wirksamen Menge einem chronisch mit GSHV infizierten Erdhörnchen parenteral verabreicht.
Die Wirkung der Expression der Polypeptide aus dem retroviralen Vektor auf die Immunantwort durch das Erdhörnchen, einschließlich einer CTL-Reaktion, die auf Zellen gerichtet ist, die GSHcAg exprimieren, wird überwacht. Außerdem wird die Wirkung auf die Chronizität der Erkrankung, einschließlich des Vorhandenseins von viraler DNA, des Vorhandenseins von GSHsAg und der pathogenen Effekte in Verbindung mit der Krankheit überwacht. Eine Minderung der physischen Symptomologie und/oder von GSHsAg und/oder von GVSH DNA in dem behandelten Individuum ist für eine Linderung und/oder Beendigung von durch GSHV verursachten chronischen Erkrankung indikativ.
Behandlung eines infizierten Säugers mit Zellen, die ex vivo mit einem Vektor transfiziert sind, der für B7-Polypeptid und GSHcAg codiert
Fibroblastenzellen, die aus einer Hautbiopsie des infizierten Individuums isoliert sind, werden in Kultur gezüchtet und werden mit einem retroviralen Vektor transfiziert, der für ein B7-Polypeptid und ein GSHcAg-Polypeptid codiert. Der Vektor ist wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert. Infizierte (transduzierte) Zellen werden dann durch Züchten der Zellen in einem Kulturmedium, das Neomycin enthält, selektioiniert. Die GSHcAg exprimierenden Zellen werden unter Anwendung der Fluoreszenzfärbung (IFA) mit Anti-HBc- und B7-Proteinexpression unter Anwendung von ELISA mit Anti-B7-monoklonalem Antikörper (mAb) identifiziert. Eine therapeutisch wirksame Menge der autologen Zellen, die GSHcAg und B7 exprimieren, wird in das GSHV-infizierte Erdhörnchen intravenös infundiert.
Die Wirkung der Expression der Polypeptide von den retroviralen Vektoren in den implantierten Zellen auf die Immunantwort durch das Erdhörnchen, einschließlich einer CTL-Reaktion, die auf Zellen gerichtet ist, die GSHcAg exprimieren, wird überwacht. Außerdem wird die Wirkung auf die Chronizität der Erkrankung, einschließlich des Vorhandenseins von viraler DNA, des Vorhandenseins von GSHsAg und der pathogenen Effekte in Verbindung mit der Erkrankung überwacht. Eine Minderung der physischen Symptomologie und/oder von GSHsAg und/oder von GVSH DNA in dem behandelten Individuum ist für eine Linderung und/oder Beendigung der durch GSHV verursachten chronischen Erkrankung indikativ.
Beispiel 5
Konstruktion von retroviralen Vektoren zur Expression von B7 und HBS
1 zeigt rekombinante retrovirale Vektoren für den Nachweis der Verstärkung der Immunantwort auf Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBS) durch die Coexpression mit B7-1 in Zellen in vivo. Retrovirale Vektor-pMV-7-DNA wurde zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren 907 verwendet, bei denen die HBS-Codierungssequenz bei dem Polylinker von pMV-7 inseriert ist; und rekombinanter Vektor 1016 mit der HBS-Codierungssequenz, einem Cap-unabhängigen Translationselement (CITE) des Enzephalomyokarditis-Virus (EMC) und der Codierungssequenz für murines B7-1, die alle in demselben Leserahmen inseriert sind bei dem Polylinker von pMV-7. Jeder rekombinante Vektor wurde zur Transfizierung mittels der Calciumphosphat-DNA-Methode einer murinen Balb/c-Verpackungszellinie verwendet, und Zellen, die die jeweiligen Vektoren enthielten, wurden durch Zucht in Zellkulturmedium, das Neomycin enthielt, selektioniert. Die Verpackungs-Zellpopulation, die daraufhin Neomycin-selektioniert war, den rekombinanten Vektor 907 zu enthalten, und jene, die auf den rekombinanten Vektor 1016 selektioniert war, setzten Virus frei, das anhand der Fähigkeit analysiert werden konnte, Balb/c 3T3-Zellen eine Neomycin-Resistenz zu verleihen. Neomycin-resistente Balb/c 3T3-Zellen, die mit rekombinantem Virus 907 infiziert waren, wurden mittels ELISA als HBS freisetzend nachgewiesen. Neomycin-resistente Balb/c 3T3-Zellen, die mit rekombinantem Virus 1016 infiziert waren, wurden als HBS exprimierend wie oben und das B7-1-Protein mittels FACS-Analyse unter Verwendung von monoklonalem Antikörper zu dem B7-1-Protein nachgewiesen. Zellen (2 × 10⁷) von dem jeweiligen Typ und nicht-transfizierte Balb/c 3T3-Zellen wurden jeweils in separate Gruppen von 10 Balb/c-Mäusen auf dem intraperitonealen Wege zur Untersuchung der Immunantwort auf HBS geimpft. Das mittels ELISA gemessene Anti-HBS, die Proliferation von Milzzellen, die in vitro an HBS exponiert worden waren, und die zytotoxische Aktivität der Milzzellen mittels der Chrom 51-Freisetzung aus Balb/c 3T3-Zellen, die HBS expri mieren, wurden bei 5 Mäusen aus jeder Gruppe bei 2 Wochen und 5 Mäusen aus jeder Gruppe bei 4 Wochen nach Beimpfung untersucht. In 1 steht LTR für die Long Terminal Repeats des retroviralen Vektors, steht TK für den Thymidinkinase-Promotor des Herpes simplex-Virus, steht Neo für ein Gen, das Neomycin-Resistenz verleiht.
Obschon die vorangegangene Erfindung in einiger Ausführlichkeit anhand von Veranschaulichung und Beispiel zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es für Fachleute des Gebiets offensichtlich sein, dass bestimmte Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können. Daher sollten die Beispiele nicht als Beschränkung der Erfindung, die durch die Ansprüche im Anhang wiedergegeben ist, verstanden sein.

Claims

Rekombinantes Polynukleotid, umfassend eine Region, die für einen kostimulatorischen Faktor für die T-Zellaktivierung codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, und eine Region, die für ein Zielantigen, oder ein Fragment des Antigens, das eine Immunantwort stimulieren oder verstärken kann, codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist.
Koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden, wobei ein Polynukleotid eine Region umfasst, die für einen kostimulatorischen Faktor codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist, und ein anderer eine Region umfasst, die für ein Zielantigen, oder ein Fragment eines Antigens, das eine Immunantwort stimulieren oder verstärken kann, codiert, welche an eine Transkriptionskontrollregion operativ geknüpft ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei der kostimulatorische Faktor B7 ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei der kostimulatorische Faktor B7-1, B7-2 oder B7-3 ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein Paar von Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei die Expression des kostimulatorischen Faktors und des Zielantigens in einem Individuum dem Individuum eine zumindest teilweise Immunität gegen ein intrazelluläres infektiöses Agens, welches das Zielantigen-Polypeptid natürlicherweise codiert, verleiht.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei das Zielantigen von einem infektiösen Agens ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei das Zielantigen in einem Virus natürlich codiert ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei das Zielantigen in einem Hepatitis-Virus, einem Retrovirus, einem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder einem Hepatitis C-Virus (HCV) natürlich codiert ist.
Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2, wobei das Zielantigen in einer Protozoe, einem Pilz, einem Bakterium oder einem parasitären Agens natürlich codiert ist.
Vektor, umfassend ein rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden nach Anspruch 2.
Vektor nach Anspruch 10, welcher ein viraler Vektor ist.
Wirtszelle, in die ein rekombinantes Polynukleotid, oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, oder ein Vektor, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, eingeführt worden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, worin das/die Polynukleotid(e) oder der Vektor ex vivo eingeführt worden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, die zur direkter Einführung in ein zu behandelndes oder immunisierendes Individuum geeignet ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, worin die Einführung durch Transformation vorgenommen wurde.
Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Polynukleotid, oder ein koexprimierbares Paar von rekombinanten Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, und einen geeigneten Exzipienten.
Polynukleotid, oder Paar von Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, ein Vektor, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, oder eine Zellen, wie in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert, zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung oder prophylaktischen Behandlung eines Individuums durch Therapie.
Verwendung eines Polynukleotids, oder Paars von Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, eines Vektors, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, oder einer Zelle, wie in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Verhüten oder Heilen einer Infektion oder Behandeln einer chronischen Infektion, wobei die Infektion durch ein intrazelluläres infektiöses Agens verursacht ist.
Verwendung nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer Infektion durch ein intrazelluläres Pathogen, das das Zielantigen natürlich codiert.
Verwendung eines Polynukleotids, oder Paars von Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, eines Vektors, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, oder einer Zelle, wie in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer Infektion durch ein Virus, Protozoe, Pilz oder Bakterium.
Verwendung eines Polynukleotids, oder Paars von Polynulkleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, eines Vektors, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, oder einer Wirtszelle, wie in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert, oder eines Polynukleotids (oder Paars von Polynukleotiden), die wenigstens für die funktionellen Abschnitte eines kostimulatorischen Faktors und eines Zielantigens codieren, für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Individuums auf eine Infektion, die durch ein infektiöses Agens, welches das Zielantigen aufweist, verursacht ist.
In vitro-Methode der Transformation, welche Methode das Transformieren einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Polynukleotid, oder Paar von Polynukleotiden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, oder einem Vektor, wie in Anspruch 10 oder 11 definiert, umfasst.