DE69916581T2

DE69916581T2 - Eine universelle immunmodulatorische cytokin-expressierende zelllinie in wartestelling. entsprechende zusammensetzungen und methoden ihrer herstellung und verwendungen

Info

Publication number: DE69916581T2
Application number: DE69916581T
Authority: DE
Inventors: I. Hyam LEVITSKY; Ivan Borrello
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: JP4303887B2; AU741602B2; US20110287058A1; DE69916581D1; EP1053301B1; ATE264911T1; US8012469B2; ES2218994T3; US20080260758A1; EP1053301A1; US20060140922A1; US7390483B2; AU2576499A; CA2318372C; KR20010074426A; WO1999038954A1; US20020037282A1; US6464973B1; JP2002501741A; CA2318372A1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der ebenfalls anhängigen vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 60/073,405, welche am 2. Februar 1998 eingereicht wurde.
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine universelle immunmodulatorische Zytokin-exprimierende Bystander-Zelllinie, eine Zusammensetzung, welche eine solche Zelllinie und ein Krebsantigen umfasst, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zelllinie und ein Verfahren zur Verwendung einer solchen Zusammensetzung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Krebsimmuntherapie ist eine therapeutische Behandlung von Krebs. Sie basiert auf der Voraussetzung, dass das Versagen des Immunsystems, spontan auftretende Tumore abzustoßen, mit dem Versagen des Immunsystems, in geeigneter Weise auf Tumorantigene zu antworten, zusammenhängt. In einem funktionierenden Immunsystem werden Tumorantigene verarbeitet und auf der Zelloberfläche in Zusammenhang mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) Klasse I- und II-Molekülen exprimiert, welche in Menschen auch als "humane Leukocyten-assoziierte" (human leukocyte associated, HLA) Moleküle bezeichnet werden. Wenn sie mit Antigenen komplexiert sind, werden die MHC Klasse I- und II-Moleküle von CD8⁺ bzw. CD4⁺ T-Zellen erkannt. Diese Erkennung erzeugt eine Reihe sekundärer zellulärer Signale und die parakrine Freisetzung von spezifischen Zytokinen oder löslichen sog. "biologischen Antwort-Modifizierern" ("biological response modifiers"), welche Interaktionen zwischen Zellen vermitteln und die Wirtsabwehr zur erfolgreichen Bekämpfung von Krankheit stimulieren. Die Freisetzung von Zytokinen resultiert dann in der Proliferation von Antigen-spezifischen T-Zellen.
Die aktive Immuntherapie umfasst die Injektion von Krebs- oder Tumorzellen, um entweder eine neue oder eine verstärkte systemische Immunantwort zu erzeugen. Die verwendeten Tumorzellen können autolog sein, d. h. von dem zu behandelnden Wirt abgeleitet sein, oder allogen, d. h. von einem anderen als dem zu behandelnden Wirt stammen. Solch eine Strategie wird als ein "Impfstoff" bezeichnet, was die Verwendung einer antigenen Quelle wie z. B. einer intakten Krebs- oder Tumorzelle zur Stimulation einer Immunantwort gegen einen bestehenden metastasierten Krebs bedeutet – nicht die prophylaktische Immunisierung.
Die Verwendung von autologen Tumorzellen als "Impfstoffe", um die Antitumor-Immunität zu erhöhen, wurde umfangreich untersucht (Oettgen et al., in Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., Herausgeber (Lippincott, Philadelphia, PA), S. 87–119 (1991)). Obwohl einige wenige Patienten von autologen Krebsimpfstoffen profitiert zu haben scheinen, hat deren Verwendung nur teilweise oder kurzlebige Resultate erbracht. Folglich wurden zahlreiche Versuche unternommen, um die Effizienz von Krebsimpfstoffen zu verbessern. Solche Versuche schließen die Bestrahlung und/oder chemische Modifikation ein, die Infektion von autologen Tumorzellen mit Virus vor der Reinjektion in den Patienten und die Transfektion/Transduktion der Tumorzellen mit Genen, welche für immunologisch relevante Moleküle wie z. B. Zytokine oder T-Zell cosimulierende Moleküle kodieren, ein. Diese Versuche, welche anfangs in murinen Tumormodellen unternommen wurden, haben die Fähigkeit zum Primen systemischer Immunantworten, welche fähig sind, die Abstoßung von mikrometastasierten Tumoren an entfernten Stellen zu vermitteln, gezeigt. Die Analyse der Mechanismen der Antitumor-Immunantworten, welche durch solche Vakzinierungen erzeugt wurden, hat die Wichtigkeit des T-Zellarmes des Immunsystems in der Tumorabstoßung unterbewertet. Nichtspezifische Immunstimulanzien wurden ebenfalls verwendet, jedoch wurde nur eine geringe Verbesserung erzielt.
Auf der klinischen Ebene umfasst die Transfektion/Transduktion von Tumorzellen mit Genen, welche für immunologisch relevante Moleküle kodieren, die Tumorresektion, die Kultivierung von aus dem Tumor isolierten Zellen, die Transfektion/Transduktion der kultivierten Tumorzellen mit einem für ein immunologisch relevantes Molekül kodierenden Gen wie z. B. ein Zytokin, z. B. GM-CSF, die Bestrahlung der transfizierten/transduzierten Tumorzellen und die Verabreichung der bestrahlten Tumorzellen an den Patienten. Von Tumorzellen, welche genetisch modifiziert wurden, um verschiedene Faktoren wie z. B. IL-4, IL-2, IFN-γ, TNF-α, G-CSF, JE, IL-7 und IL-6 zu exprimieren, wurde gezeigt, dass sie zur Abstoßung der genetisch modifizierten Zellen in syngenen Wirten führen (Tepper et al., Cell 57: 503–512 (1989); Li et al., Mol. Immunol. 27: 131–1337 (1990); Golumbek et al., Science 254: 713–716 (1991); Fearon et al., Cell 60: 397–403 (1990), Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172: 1217–1224 (1990); Gansbacher et al., Cancer Res. 50: 7820– 7825 (1990); Watanabe et al., PNAS USA 86: 9456–9460 (1989); Asher et al., J. Immunol. 146: 3227–3234 (1991); Blankenstein et al., J. Exp. Med. 173: 1047–1052 (1991); Teng et al., PNAS USA 88: 3535–3539 (1991); Colombo et al., J. Exp. Med. 173: 889–897 (1991); Rollins et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3125–3131 (1991); Hock et al., J. Exp. Med. 174: 1291–1298 (1991); Aoki et al., PNAS USA 89: 3850–3854 (1992); Porgador et al., Cancer Res. 52: 3679–3686 (1992)). Für die systemische Immunität wurde gezeigt, dass sie mit Zellen, welche IL-4, IL-2, IFN-γ, TNF-α, JE, IL-7 oder IL-6 exprimieren, zunimmt (Golumbek et al. (1991), s. oben; Porgador et al. (1992), s. oben).
Verschiedene Studien, welche bestrahlte Zytokin-transduzierte autologe Tumorzellen vergleichen, haben gezeigt, dass GM-CSF-transduzierte autologe Tumorzellen die stärksten Induzierer von lang anhaltender, spezifischer Tumorimmunität sind (Dranoff et al., PNAS USA 90: 3539–3543 (1993); siehe auch Asher et al., J. Immunol. 146: 3327– 3334 (1990); Sanda et al., J. of Urology 151: 622–628 (1994); Simons et al., Cancer Research 57: 1537–1546 (1997)). Die Effizienz von GM-CSF-transduzierten Impfstoffen wurde in präklinischen Modellen für Melanom, Lymphom und Krebse der Lunge, des Kolons, der Niere und der Prostata gezeigt (Dranoff et al. (1990), s. oben; Golumbek et al. (1991), s. oben; Sanda et al. (1994) s. oben; Jaffee et al., J. Immunother. 18: 1–9 (1995); Caducci et al., Cancer (Phila.) 75: 2013–2020 (1995); Vieweg et al., Cancer Res. 54: 1760–1765 (1994); Jaffee et al., J. Immunother. 19: 1–8 (1996); Levitsky et al., J. Immunol. 156: 3858–3865 (1996)). An dem Ort der Impfung aktiviert GM-CSF lokal (parakrin) Antigen-präsentierende Zellen (antigen-presenting cells, APCs), einschließlich dendritischer Zellen und Makrophagen. Die APCs primen anschließend CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, welche Tumor-assoziierte Antigene an Orten der Metastasierung erkennen, wodurch sie eine systemische Antitumorimmunität vermitteln.
Es wurde eine Anzahl von Phase-I-klinischen Studien in Patienten mit metastasiertem Krebs durchgeführt. An der Johns Hopkins Universität wurden Patienten mit metasta siertem Nierenzellkarzinom entweder mit unmodifizierten bestrahlten autologen Tumorzellen oder mit bestrahlten autologen Tumorzellen, welche transduziert wurden, um GM-CSF zu sezernieren, behandelt. Die gemessenen Immunitätsparameter waren vergleichbar mit dem, was in den Mausmodellen beobachtet wurde, und die Randomisierung erlaubte eine klare Darstellung der Rolle von GM-CSF als ein molekulares Adjuvans. Eine spätere Studie der Behandlung von Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs mit autologen GM-CSF-transduzierten Tumorzellen erweiterte diese Beobachtungen. In Gang befindlich ist eine Studie am Dana Farber Krebsinstitut, in welcher Patienten mit metastasiertem Melanom mit autologen GM-CSF-transduzierten Tumorzellen behandelt werden.
Die Pilotstudien an der Johns Hopkins Universität und dem Dana Farber Krebsinstitut und anderswo haben Unterstützung bereit gestellt für die Verwendung von bestrahlten, Zytokin-transduzierten autologen Tumorimpfstoffen als ein therapeutisches Behandlungsverfahren. Für viele Malignitäten werden große Zahlen von autologen Tumorzellen bei der Vorstellung vor der Chirurgie oder Chemotherapie-induzierten Remission leicht erhalten. Für Krankheiten wie z. B. akute oder chronische Leukämien, Lymphom und Kolonkarzinom, können durchaus 5 × 10⁹ Tumorzellen erhalten werden und mit Hilfe von derzeit verwandten Methoden in den meisten Krebsbehandlungszentren gelagert werden. Der Bedarf an in vitro-Kulturen zur Ermöglichung des Gentransfer und die Unfähigkeit, reproduzierbare und einheitlich hohe Mengen an GM-CSF-Produktion durch solche Prozeduren zu erhalten, limitiert jedoch diesen therapeutischen Ansatz.
Um dieses Problem zu umgehen, haben eine Zahl von Forschem Studien zur Immunisierung mit bestrahlten, GM-CSF-transfizierten allogenen Tumorzelllinien durchgeführt, wie z. B. in der Behandlung von Prostata- und Pankreaskrebs. Die diesem Ansatz zugrunde liegenden Gedankengänge sind, dass das relevante Tumorantigen(e) zwischen der immunisierenden allogenen Tumorzelllinie und dem Tumor des Patienten, welcher immunisiert werden soll, geteilt wird. Angesichts der Tatsache, dass die relevanten Tumorantigene in den meisten dieser Systeme noch nicht definiert wurden, bleibt diese Annahme noch unbewiesen.
Angesichts des oben Gesagten wären Materialien und Verfahren, welche den Bedarf an in vitro-Kultur zum Zweck des Gentransfers von autologen Tumorzellen vermeiden wür den und welche eine reproduzierbare und einheitliche Produktion von immunmodulatorischem Zytokin, z. B. GM-CSF, erlauben würde, höchst wünschenswert. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Materialien und Verfahren zur Verfügung zu stellen. Diese und andere Gegenstände und Vorteile werden aus der detaillierten Beschreibung, welche hierin zur Verfügung gestellt wird, ersichtlich werden.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine universelle immunmodulatorische Zytokinexprimierende Bystander-Zelllinie zur Verfügung. Die universelle Bystander-Zelllinie ist eine humane Zelllinie, welcher entweder natürlicherweise die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse I (MHC-I) und die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse II (MHC-II) fehlen oder welche so modifiziert ist, dass ihr die MCH-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen. Zusätzlich ist die universelle Bystander-Zelllinie durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, modifiziert. Vorzugsweise ist das immunmodulatorische Zytokin der Granulocyten-Makophagen Kolonie-stimulierende Faktor (granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF). Die universelle Bystander-Zelllinie exprimiert vorzugsweise wenigstens etwa 500 ng, bevorzugter wenigstens etwa 1000 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std.. Alternativ und ebenfalls bevorzugt ist das immunmodulatorische Zytokin Interleukin 2 (IL-2). Vorzugsweise ist die humane Zelllinie gekennzeichnet durch die Abwesenheit von B-Lymphocyten-Makern von Immunglobulin, einem Epstein-Barr-Virus (EBV)-Genom und einem assoziierten nukleären Antigen und Rezeptoren für EBV. Eine bevorzugte humane Zelllinie ist eine, welche aus einer Blastenkrise der Chronischen Myeloischen Leukämie stammt. Ein Beispiel für eine bevorzugte Zelllinie ist K562. Vorzugsweise wächst die universelle Bystander-Zelllinie in definiertem, d. h. serumfreiem, Medium. Der Promotor, mit welchem die ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist, ist vorzugsweise ein Cytomegalovirus-Promotor. Vorzugsweise umfasst die universelle Bystander-Zelllinie weiterhin eine Nukleinsäuresequenz kodierend für Hygromycinresistenz, welche funktionell mit einem Promotor verbunden ist und welche durch Wachstum in Kulturmedium, welches wenigstens etwa 400 μg/ml Hygromycin umfasst, vorzugsweise gefolgt von Wachstum in Kulturmedium, welches wenigstens etwa 1000 μg/ml Hygromycin umfasst, selektiert wird.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird eine Zusammensetzung, welche die universelle Bystander-Zelllinie und ein Krebsantigen umfasst. Ein Verfahren zur Herstellung einer universellen immunmodulatorischen Zytokin-exprimierenden Bystander-Zelllinie wird ebenfalls zur Verfügung gestellt, ebenso wie ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort gegenüber einem Krebs in einem humanen Patienten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Balkendiagramm, in welchem ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std. versus der Zelllinie dargestellt wird.
2A ist ein Schaubild der Anzahl versus der relativen Fluoreszenz für die MHC-I-Antigenexpression.
2B ist ein Schaubild der Anzahl versus der relativen Fluoreszenz für MHC-II-Antigenexpression.
3 stellt ein Diagramm des Prozentanteils (%) lebender Zeller (Trypan Blau negativ) versus der Tage nach der Bestrahlung dar.
4 stellt ein Diagramm des % tumorfreien Überlebens versus der Tage nach der Tumorchallenge dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf der Beobachtung begründet, dass, in Zusammenhang mit einem Krebsimpfstoff, die Krebszelle selber nicht direkt ein immunmodulatorisches Zytokin wie z. B. GM-CSF produzieren muss, um eine Immunantwort gegen die Krebszelle zu stimulieren. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf der überraschenden und unerwarteten Entdeckung begründet, dass eine universelle Bystander-Zelllinie, welche lokal ein immunmodulatorisches Zytokin wie z. B. GM-CSF in noch nie da gewesenen hohen Konzentrationen produziert, hergestellt werden kann. Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft insofern als durch die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche die universelle Bystander-Zelle und ein autologes Krebsantigen, z. B. eine autologe Tumorzelle enthält, an einen Patienten, die parakrine Produktion eines immunmodulatorischen Zytokins wie z. B. GM-CSF, eine adäquate Rekrutierung von APCs und ein erfolgreiches Primen gegen die Krebsantigene erreicht werden, wodurch die Notwendigkeit zur Kultivierung und Transduktion autologer Tumorzellen für jeden einzelnen Patienten und der Kampf mit variablen und häufig ineffizienten Transduktionseffizienzen umgangen wird.
Angesichts des oben Gesagten stellt die vorliegende Erfindung eine universelle, immunmodulatorische Zytokin-produzierende Bystander-Zelllinie zur Verfügung. Die Zelllinie ist eine Säuger-Zelllinie, vorzugsweise eine humane Zelllinie, welcher natürlicherweise die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse I (MHC-I) und die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse II (MHC-II) fehlen, oder welche so modifiziert ist, dass ihr die MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen. Theoretisch kann jede Säugetierzelllinie, vorzugsweise humane Zelllinie, welche fähig ist zur parakrinen Produktion eines immunmodulatorischen Zytokins, verwendet werden. Die humane Zelllinie ist vorzugsweise gekennzeichnet durch die Abwesenheit von B-Lymphozyten-Markern von Immunglobulin, einem Epstein-Barr-Virus (EBV)-Genom und einem assoziierten nukleären Antigen und Rezeptoren für EBV. Eine bevorzugte humane Zelllinie ist eine, welche aus einer Blastenkrise der Chronischen Myeloischen Leukämie stammt. Ein Beispiel für eine bevorzugte humane Zelllinie ist K562 (ATCC CCL-243; Lozzio et al., Blood 45(3): 321– 334 (1975; Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421–431 (1976)). Die universelle Bystander-Zelllinie wächst vorzugsweise in definiertem, d. h. serumfreiem, Medium. Zusätzlich wächst die universelle Bystander-Zelllinie vorzugsweise in Suspension.
Zellen, welchen die MHC-I-Antigene fehlen, können durch Stören der Expression und/oder des Transports der α-Kette erhalten werden. Zellen, welchen MHC-II-Antigene fehlen, können durch Stören der Expression und/oder des Transportes der α- und β-Ketten erhalten werden. Die Inaktivierung von MHC-I- und -II-Antigenen kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,574,205). Zum Beispiel kann eine "dominant Negative" erzeugt werden. Ein einziges modifiziertes β₂-Mikroglobulingen, dessen Proteinprodukt mit MHC-I-Molekülen effektiv Komplexe bildet und als ein Köder fungiert, wodurch die Insertion der MHC-I-Antigene in die Membran verhindert wird, kann überexprimiert werden. Ein ähnlicher Ansatz kann im Hinblick auf MHC-II-Antigene verwendet werden, durch Überexpression modifizierter Gene, welche defekte α- oder β-Untereinheiten kodieren, die mit den Untereinheiten der Wirtszellen Komplexe bilden und diese nicht-funktionell machen. Transfektion, retrovirale Infektion oder homologe Rekombination können verwendet werden, um die Expression von modifizierten MHC- oder β₂-Mikroglobulingenen oder die Inaktivierung von Genen zu erreichen.
Die Konzentrationen an MHC-I-Antigen auf der Zelloberfläche können durch Einführen einer Sequenz, welche für das adenovirale E19-Protein kodiert, durch Transfektion oder retrovirale Infektion in die Zellen reduziert werden. Das Protein bildet Komplexe spezifisch mit MHC-I-Antigenen in dem rauen endoplasmatischen Reticulum, was den normalen Transport von MHC-I-Molekülen zur Plasmamembran verhindert (Andersson et al., Cell 43: 215–222 (1985), Pabo et al., Advances in Cancer Research 42: 151–163 (1989)).
Zusätzlich dazu, dass ihr die MHC-I- und MHC-II-Antigene fehlen oder dass sie so modifiziert ist, dass die MHC-I- und MHC-II-Antigene fehlen, ist die Säugerzelllinie, vorzugsweise humane Zelllinie, durch das Einführen eines Nukleinsäuremoleküls modifiziert, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist.
Mit "modifiziert" ist das zur Verfügung Stellen eines Nukleinsäuremoleküls, z. B. eines Vektors, welches eine für ein Zytokin kodierende Nukleinsäure umfasst, das entweder nicht in der Zelllinie exprimiert wird oder als ein Ergebnis des zur Verfügung Stellens des Nukleinsäuremoleküls nun in einer höheren Konzentration exprimiert wird, gemeint. Ein "Vektor" umfasst ein DNA-Molekül, wie z. B. ein Plasmid, ein Virus oder ein anderes Vehikel, welches eine oder mehrere heterologe oder rekombinate DNA-Sequenzen, z. B. ein Zytokingen oder eine für ein Zytokin kodierende Sequenz von Interesse unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors und möglicherweise auch eines Enhancer enthält, und welches fähig ist, als ein Vektor zu fungieren, wie dieser Begriff von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden wird.
Jeder geeignete Vektor kann verwendet werden, welcher geeignet ist für das Einführen von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen, oder insbesondere Tierzellen wie beispiels weise Säugerzellen, z. B. humane Zellen. Vorzugsweise ist der Vektor kompatibel mit den Zellen, z. B. ist er fähig, die Expression des Zytokingens oder der kodierenden Sequenz zu vermitteln und wird in der Zelle stabil aufrechterhalten oder relativ stabil aufrechterhalten. Wünschenswerterweise umfasst der Vektor einen Replikationsursprung. Wenn eine ein Zytokin kodierende Sequenz transferiert wird (d. h. im Gegensatz zu einem Zytokingen, welches seinen eigenen Promotor besitzt), enthält der Vektor optimalerweise außerdem einen Promotor, welcher fähig ist, die Expression der kodierenden Sequenz zu vermitteln und welcher funktionell mit der kodierenden Sequenz verbunden ist. Eine kodierende Sequenz ist "funktionell verbunden" mit einem Promotor (z. B. wenn sowohl die kodierende Sequenz als auch der Promotor zusammen ein natives oder rekombinantes Zytokingen bilden), wenn der Promotor im Stand ist, die Transkription der kodierenden Sequenz zu dirigieren.
Geeignete virale Vektoren beinhalten, sind jedoch auf diese limitiert, das Simian Virus 40, das bovine Papillom-Virus, das Epstein-Barr-Virus, das Adenovirus, das Herpesvirus, das Vacciniavirus, das Moloney-murine Leukämievirus, das Harvey-murine Sarcomvirus, das murine Brusttumorvirus und das Rous Sarcom-Virus. Jedes Plasmid, welches für die Verwendung in einem Eukaryonten, insbesondere einem Säuger, z. B. einem Menschen, geeignet ist, kann in dem Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wünschenswerterweise umfasst das Plasmid einen Promotor, wie z. B. den Cytomegalovirus-Promotor, einen Replikationsursprung, wie z. B. den SV40-Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker, wie z. B. eine Antibiotikumresistenz und sorgt für mRNA mit Poly A-Schwänzen. Ein bevorzugtes Beispiel eines Plasmides ist pCEP4 (siehe Beispiel 1).
Die Bezeichnung eines Vektors oder einer anderen DNA-Sequenz als "rekombinant" gibt lediglich die Verbindung von DNA-Sequenzen an, welche nicht typischerweise verbunden vorliegen, wenn sie aus der Natur isoliert werden. Ein "Gen" ist jede Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein oder ein naszierendes (nascent) mRNA-Molekül kodiert. Während ein Gen kodierende Sequenzen und nicht-kodierende (z. B. regulatorische) Sequenzen umfasst, beinhaltet eine "kodierende Sequenz" keine nicht-kodierende DNA. Ein "Promotor" ist eine DNA-Sequenz, welche die Bindung der RNA-Polymerase vermittelt und dadurch die RNA-Synthese fördert. "Enhancer" sind cis-agierende (cis-acting) Elemente der DNA, welche die Transkription benachbarter Gene stimulieren o der inhibieren. Ein Enhancer, welcher die Transkription inhibiert, wird auch als ein "Silencer" bezeichnet. Enhancer unterscheiden sich von DNA-Bindungsstellen für sequenzspezifische DNA-bindende Proteine, welche nur in dem Promotor zu finden sind (welche auch als "Promotorelemente" bezeichnet werden) dadurch, dass Enhancer in jeder Orientierung funktionieren können und über Distanzen von bis zu mehreren Kilobasenpaaren (kb), sogar von einer Position stromabwärts einer transkribierten Region aus.
Wie hierin verwendet, beinhaltet ein Zytokin"gen" oder eine Zytokin"-kodierende Sequenz" genomische Sequenzen oder cDNA-Sequenzen von Zytokinen, größere oder kleinere Sequenzen und Mutationen davon, egal ob sie aus der Natur isoliert oder ganz oder teilweise synthetisiert wurden, solange das Gen oder die kodierende Sequenz ein Protein exprimieren kann, welches die charakteristische Funktion des Zytokins aufweist, d. h. die Fähigkeit, die Immunantwort des Wirtes zu stimulieren. Die Mittel zur Modifizierung von Genen oder kodierenden Sequenzen sind auf dem Gebiet wohlbekannt und können außerdem durch kommerziell erhältliche Kits (z. B. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA) erreicht werden. Das Zytokingen oder die ein Zytokin kodierende Sequenz kann von jeder geeigneten Quelle stammen, beispielsweise einer Säugerspezies wie z. B. einem Menschen. Vorzugsweise jedoch umfasst das Zytokingen oder die kodierende Sequenz eine GM-CSF-Sequenz, insbesondere ein humanes GM-CSF-Gen oder GM-CSF-kodierende Sequenz, einschließlich einer humanen GM-CSF cDNA-Sequenz (z. B. wie durch Cantrell et al., PNAS USA 82: 6250–6254 (1985) beschrieben).
Vorzugsweise sind alle passenden Transkriptions-, Translations- und Prozessierungssignale (z. B. Splicing- und Polyadenylierungssignale) korrekt auf dem Vektor angeordnet, so dass das Zytokingen oder die das Zytokingen kodierende Sequenz in der Zelle, in welche es eingeführt wird, in geeigneter Weise transkribiert und translatiert wird. Die Manipulation solcher Signale, um die geeignete Expression in Wirtszellen sicher zu stellen, liegt im Bereich der Kenntnis und der Expertise des durchschnittlichen Fachmanns. Während ein Zytokingen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors steht (d. h. funktionell mit seinem eigenen Promotor verbunden ist), kann ein anderer Promotor, einschließlich eines konstitutiven Promotors wie z. B. dem adenoviralen Typ 2 (Ad2) oder Typ 5 (Ad5) starken späten Promotor (major late promoter, MLP) und dem Tripartitlea der, dem Cytomegalovirus (CMV) sofortigen frühen Promotor/Enhancer (immediate early promoter/enhancer), der langen terminalen Wiederholung (long terminal repeat) des Rous Sarcom-Virus (RSV-LTR) und weiteren Promotoren, verwendet werden, um die Expression der das Zytokin kodierenden Sequenz zu kontrollieren. Der CMV-Promotor ist ein bevorzugter Promotor.
Alternativ kann ein gewebespezifischer Promotor (d. h. ein Promotor, welcher präferentiell in einem bestimmen Gewebe aktiviert wird und die Expression eines Genproduktes in dem Gewebe, in welchem er aktiviert wird, zur Folge hat) in dem Vektor verwendet werden. Solche Promotor beinhalten, sind jedoch nicht auf diese limitiert, die Kontrollregion des Elastase I-Gens, welche in pankreatischen Azinuszellen aktiv ist, wie durch Swift et al., Cell 38: 639–646 (1984) und MacDonald, Hepatology 7: 425–515 (1987) beschrieben; die Kontrollregion des Insulingens, welche in pankreatischen Betazellen aktiv ist, wie durch Hanahan, Nature 315: 115–122 (1985) beschrieben; den Hepatocytenspezifischen Promotor für Albumin oder α₁-Antitrypsin, beschrieben durch Frain et al., Mol. Cell. Biol. 10: 991–999 (1990) und Ciliberto et al., Cell 41: 531–540 (1985); und die Kontrollregionen des Albumin- und Alpha₁-Antitrypsingens, welche beide in der Leber aktiv sind, wie durch Pinkert et al., Genes and Devel. 1: 268–276 (1987) und Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161–171 (1987) beschrieben.
Ebenso kann ein Tumor-spezifischer Promotor wie z. B. das carcinoembryonale Antigen für Kolonkarzinom, beschrieben durch Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10: 2738–2748 (1990), in dem Vektor verwendet werden. Auf ähnliche Weise können Promotoren, welche selektiv in verschiedenen Entwicklungsstadien aktiviert werden (z. B. werden Globingene in Embryos und Erwachsenen differentiell transkribiert) für die Gentherapie von bestimmten Krebsarten verwendet werden.
Eine weitere Option ist die Verwendung eines induzierbaren Promotors wie z. B. des IL-8-Promotors, welcher ansprechendempfindlich ist gegenüber TNF, oder des 6-16-Promotors, welcher ansprechempfindlich ist gegenüber Interferonen, oder die Verwendung anderer ähnlicher Promotoren, welche gegenüber anderen Zytokinen oder anderen Faktoren, welche in einem Wirt vorhanden sind oder exogen verabreicht werden können, ansprechempfindlich sind. Die Verwendung eines Zytokin-induzierbaren Promotors hat den zusätzlichen Vorteil, dass er die auto-induzierbare Expression eines Zyto kingens erlaubt. Gemäß der Erfindung kann jeder Promotor durch Mutagenese verändert werden, solange er die gewünschte Bindungsfähigkeit hat und die gewünschte Promotorenstärke.
Verschiedene Verfahren können angewendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül, z. B. einen Vektor, in vitro in eine Zelle einzuführen. Beispielsweise beinhalten solche Verfahren Elektroporation, Membranfusion mit Liposomen, Hochgeschwindigkeitsbeschuss mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, die Inkubation mit Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitat, die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, die Infektion mit modifizierten viralen Nukleinsäuren, die direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen und dergleichen. Weitere Verfahren sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Wenn die universelle Bystander-Zelllinie in Zusammenhang mit der Krebsimmuntherapie verwendet werden soll, ist das immunmodulatorische Zytokin eines, welches eine Immunantwort gegen eine Krebszelle oder ein Krebsantigen stimuliert, d. h. gegen jedes Protein, Kohlenhydrat oder andere Komponente, welche fähig ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Ein inhibitorisches Zytokin oder ein Zytokin, welches das Primen verhindert, kann in Zusammenhang mit der Krebsimmuntherapie nicht verwendet werden. Während des Nukleinsäuremolekül vorzugsweise ein einzelnes immunmodulatorisches Zytokin kodiert, kann das Nukleinsäuremolekül zwei oder mehr immunmodulatorische Zytokine kodieren, wie z. B. Zytokine, welche synergistisch wirken.
Beispiele für geeignete immunmodulatorische Zytokine beinhalten Interferone (z. B. IFNα, IFNβ und IFNγ), Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 und IL-12), Tumornekrosefaktoren (z. B. TNFα, TNFβ), Erythropoietin (EPO), FLT-3-Ligand, Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Granulocyten Koloniestimulierender Faktor (G-CSF) und Granulocyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF). Das am meisten bevorzugte immunmodulatorische Zytokin ist GM-CSF, beispielsweise humanes GM-CSF. Ein alternativ bevorzugtes immunmodulatorisches Zytokin ist IL-2.
Wünschenswerterweise exprimiert die universelle Bystander-Zelllinie noch nie da gewesen hohe Konzentrationen an immunmodulatorischem Zytokin, welches vorzugsweise GM-CSF ist. Vorzugsweise exprimiert die universelle Bystander-Zelllinie wenigstens et wa 500 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std.. Bevorzugter exprimiert die universelle Bystander-Zelllinie wenigstens etwa 1000 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std..
Zum Zwecke der Identifikation und Selektion umfasst das Nukleinsäuremolekül, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, die operativ mit einem Promotor verbunden ist, weiterhin vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, welche für einen selektierbaren Marker kodiert, funktionell verbunden mit einem Promotor. Vorzugsweise ist der selektierbare Marker ein Antibiotikum-Resistenzgen, wie z. B. Hygromycinresistenz. Wenn der selektierbare Marker Hygromycinresistenz ist, wird die universelle Bystander-Zelllinie vorzugsweise durch Wachstum in einem Kulturmedium, welches wenigstens etwa 400 μg/ml Hygromycin, bevorzugter wenigstens 1000 μg/ml Hygromycin umfasst, selektiert.
Zusätzlich zu dem oben Genannten stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, welche die oben beschriebene universelle Bystander-Zelllinie und ein Krebsantigen umfasst. Das Krebsantigen kann eine Krebszelle oder ein Krebszelloberflächenantigen sein, wie z. B. eines, das rekombinant produziert wurde oder immunpräzipitiert wurde. Vorzugsweise ist das Krebsantigen eine Krebszelle, deren Isolierung und Kultivierung im Bereich des Könnens eines Fachmannes auf dem Gebiet liegt (siehe z. B. WO 97/24132, insbesondere Beispiel 4). Ein Zelloberflächenantigen kann anstelle einer Zelle verwendet werden, wenn das Zelloberflächenantigen identifiziert und charakterisiert wurde und von ihm festgestellt wurde, dass es eine Antikrebs-Immunantwort induziert. In diesem Zusammenhang kann die universelle Bystander-Zelllinie genetisch modifiziert sein, um ein Krebsantigen zu exprimieren. Zum Beispiel kann die Bystander-Zelllinie genetisch modifiziert sein, um MAGE für die Behandlung von Melanom zu exprimieren, ras für die Behandlung von Pankreaskrebs und BCR-ABL für die Behandlung von Chronischer Myelogener Leukämie.
Eine Zusammensetzung oder ein Implantat, welches für die in vivo-Verabreichung geeignet ist, kann geeignete Träger und Verdünnungsmittel enthalten, welche weiterhin pharmazeutisch annehmbar sein können. Die Mittel zur Herstellung solch einer Zusammensetzung oder Implantates wurden auf dem Gebiet beschrieben, siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Edition, Mack, Herausgeber (1989). Die Verwen dung einer ausgeglichenen Salzlösung, wie z. B. Hanks' Balanced Salt Solution ist in der Zusammensetzung bevorzugt.
In pharmazeutischen Dosierungsformen kann eine Zusammensetzung alleine verwendet werden oder in geeigneter Verdünnung, so wie auch in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in Einheit-Dosierungsform zur Verfügung gestellt werden, wobei jede Dosiseinheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung, allein oder in geeigneter Kombination mit weiteren aktiven Agenzien enthält. Der Begriff "Einheit-Dosierungsform" (unit dosage form) wie hierin verwendet, bezieht sich auf physisch getrennte Einheiten, welche als Einheitsdosierungen für Menschen und andere Säugerindividuen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, allein oder in Verbindung mit einem weiteren aktiven Agens enthält, und die Menge berechnet ist als eine Menge, welche ausreichend ist, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel, wo dies geeignet ist. Die Spezifikationen für die neuen Einheit-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind abhängig von den jeweiligen Pharmakodynamiken, welche mit der pharmazeutischen Zusammensetzung in dem jeweiligen Wirt assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer universellen immunmodulatorischen Zytokin-exprimierenden Bystander-Zelllinie zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (i) das Erhalten einer Säugerzelllinie, vorzugsweise einer humanen Zelllinie, welche keine MHC-I-Antigen und MHC-II-Antigene exprimiert, (ii) das Modifizieren der Säugerzelllinie, vorzugsweise humanen Zelllinie durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz, welche funktionell mit einem Promotor verbunden ist, sowie eine für einen selektierbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, in die Säugerzelllinie, vorzugsweise humane Zelllinie und (iii) Verwenden des selektierbaren Markers, um Zellen zu isolieren, welche wenigstens etwa 500 ng des genannten immunmodulatorischen Zytokins/10⁶ Zellen/24 Std. produzieren. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren (i) das Erhalten einer Säugerzelllinie, vorzugsweise humanen Zellli nie, (ii) das Modifizieren der Säugerzelllinie, vorzugsweise humanen Zelllinie, so dass sie keine MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene exprimiert, (iii) weiterhin das Modifizieren der Säugerzelllinie, vorzugsweise humanen Zelllinie durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist und eine für einen selektierbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, in die Säugerzelllinie, vorzugsweise humane Zelllinie; und (iv) die Verwendung des selektierbaren Markers, um Zellen zu isolieren, welche wenigstens etwa 500 ng des genannten immunmodulatorischen Zytokins/10⁶ Zellen/24 Std. produzieren.
Das Nukleinsäuremolekül, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokinkodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist und eine Nukleinsäuresequenz kodierend für einen selektierbaren Marker, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, kann jedes Nukleinsäuremolekül sein, welches für den Gentransfer wie oben beschrieben geeignet ist. Der retrovirale MFG-Vektor, welcher in dem US-Patent Nr. 5,637,483 beschrieben wird, erlaubt das rasche Screenen einer großen Zahl von potentiellen Immunmodulatoren auf systemische Immunitätseffekte und die Bewertung der Aktivität von komplexen Kombinationen von Molekülen. Er stellt außerdem einen hohen Titer und eine starke Genexpression zur Verfügung. Andere retrovirale Vektoren, welche verwendet werden können, beinhalten pLJ, pEm und αSGC (siehe US-Patent Nr. 5,637,483, insbesondere Beispiel 12). Jedes immunmodulatorische Zytokin, welches eine Antitumor-Immunantwort stimuliert, kann verwendet werden (siehe US-Patent Nr. 5,637,483 für Assays). Das am meisten bevorzugte immunmodulatorische Zytokin ist GM-CSF. Ein alternativ bevorzugtes immunmodulatorisches Zytokin ist IL-2. Während jeder selektierbaren Marker verwendet werden kann, ist der selektierbare Marker vorzugsweise ein antibiotisches Resistenzgen, wie z. B. Hygromycinresistenz, in welchem Falle die modifizierte Säugerzelllinie, vorzugsweise humane Zelllinie, in Kulturmedium kultiviert wird, welches wenigstens etwa 400 μg Hygromycin/ml Kulturmedium enthält. Bevorzugter wird die modifizierte Säuger-, vorzugsweise humane, Zelllinie anschließend in Kulturmedium kultiviert, welches wenigstens etwa 1000 μg Hygromycin/ml Kulturmedium enthält. Das Kulturmedium ist vorzugsweise definiert, d. h. serumfrei. Ein bevorzugter Promotor für die Expression des immunmodulatorischen Zytokins in dem Verfahren ist ein Cytomegalovirus-Promotor.
Weiterhin wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort gegenüber einem Krebs in einem Säugerpatienten, vorzugsweise einem humanen Patienten, zur Verfügung gestellt. Wünschenswerterweise bewirkt das Verfahren eine systemische Immunantwort, d. h. eine T-Zell-Antwort, gegenüber dem Krebs. Das Verfahren umfasst die Verabreichung der oben beschriebenen Zusammensetzung an den Patienten, wobei die universelle Bystander-Zelllinie von einer Säugerzelllinie, vorzugsweise einer humanen Zelllinie, abgeleitet ist, das Krebsantigen ein Antigen des Krebses in dem Patienten ist und die Zusammensetzung Proliferations-inkompetent gemacht worden ist, wie z. B. durch Bestrahlung. Bei Verabreichung der Zusammensetzung wird eine Immunantwort gegen den Krebs stimuliert.
"Verabreichen" bedeutet die tatsächliche physische Einführung der Zusammensetzung in den Wirt. Jegliche Verfahren zur Einführung der Zusammensetzung in den Wirt sind gemäß der Erfindung vorgesehen; das Verfahren ist nicht von irgendwelchen bestimmten Mitteln zur Einführung abhängig und soll nicht so aufgefasst werden. Mittel zur Einführung sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und werden außerdem hierin erläutert.
Jeder geeignete Verabreichungsweg kann verwendet werden. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung subkutan oder intratumoral verabreicht. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass, obwohl mehr als ein Weg für die Verabreichung verwendet werden kann, ein bestimmter Weg eine direktere und effizientere Reaktion als ein anderer Weg zur Verfügung stellen kann. Eine lokale oder systemische Abgabe kann durch die Verabreichungsformen umfassend die Applikation oder Instillation der Formulierung in Körperhöhlen, die Inhalation oder Insufflation eines Aerosols oder durch parenterale Verabreichung, welche die intramuskuläre, intravenöse, intraportale, intrahepatische, peritoneale, subkutane oder intradermale Verabreichung einschließt, erreicht werden. Für den Fall, dass der Tumor in dem zentralen Nervensystem auftritt, muss die Zusammensetzung intratumoral verabreicht werden, da es in dem zentralen Nervensystem für das Immunsystem kein Priming gibt.
Wünschenswerterweise stammt das immunmodulatorische Zytokin von einem Menschen, obwohl ein Zytokin von einer nicht-humanen Quelle verwendet werden kann, wenn es im Wesentlichen homolog zu dem humanen Zytokin ist und von ihm gezeigt wurde, dass es eine ähnliche Aktivität zeigt. Vorzugsweise ist das Krebsantigen eine Zelle des Krebses, welcher behandelt werden soll, d. h. eine autologe Krebszelle. Wenn die Zusammensetzung durch Bestrahlung Proliferations-inkompetent gemacht wird, werden die universellen Bystander-Zellen und die Krebszellen typischerweise auf einer Gewebskulturplatte ausplattiert und bei Raumtemperatur unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle bestrahlt. Vorzugsweise werden die Zellen mit einer Dosisrate von etwa 50 bis etwa 200 rad/min bestrahlt, bevorzugter mit einer Dosisrate von etwa 120 bis etwa 140 rad/min. Vorzugsweise werden die Zellen mit einer Gesamtdosis bestrahlt, welche ausreicht, um die Mehrzahl der Zellen, d. h. vorzugsweise etwa 100% der Zellen, daran zu hindern, in vitro zu proliferieren. Folglich werden die Zellen wünschenswerterweise mit einer Gesamtdosis von etwa 10000 bis 20000 rad, optimalerweise mit etwa 15000 rad bestrahlt.
Darüber hinaus wird das Krebsantigen, z. B. eine Zelle des zu behandelnden Krebses, d. h. eine autologe Krebszelle, optimalerweise vor der Verabreichung behandelt, um deren Immunogenität zu verstärken. Vorzugsweise umfasst diese Behandlung wie hierin beschrieben weiterhin eine genetische Manipulation wie z. B. die Einführung weiterer Zytokin- oder Immun-costimmulatorischer Funktionen oder, z. B., die Mischung mit nicht-spezifischen Adjuvanzien, einschließlich, jedoch nicht darauf limitiert, Freud'sches komplettes oder Freud'sches inkomplettes Adjuvans, Emulsionen bestehend aus bakteriellen und mycobakteriellen Zellwandbestandteilen und dergleichen.
Im Allgemeinen sollte die Konzentration der autologen Krebszellen ausreichen, um APCs an die Stelle zu rekrutieren und in einer stärkeren Immunantwort gegenüber dem zu behandelnden Krebs resultieren, als die Immunantwort, die sich anderenfalls bei der Abwesenheit einer solchen Behandlung ergeben würde. Vorzugsweise werden wenigstens ab etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ Krebszellen verwendet, bevorzugter ab etwa 1 × 10⁷ bis etwa 5 × 10⁸ Krebszellen. Jedoch können mehr oder weniger Zellen verwendet werden, abhängig von dem Weg der Verabreichung und der Anwesenheit weiterer aktiver Agenzien; etc.
Das Verhältnis von Bystander-Zellen zu autologen Krebszellen in einer bestimmten Verabreichung sollte so sein, dass ein Nutzen aufgrund der Anwesenheit der immunmodu latorischen Zytokin-produzierenden Bystander-Zelle realisiert wird. Was die GM-CSF produzierenden Bystander-Zellen angeht, sollte das Verhältnis von Bystander-Zellen zu autologen Krebszellen in einer bestimmten Verabreichung derart sein, dass wenigstens 36 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std. produziert werden. Die Antikrebsimmunität nimmt ab, wenn die Menge an GM-CSF geringer als diese Menge ist. Zytokinkonzentrationen oberhalb dieser Menge verstärken die Effizienz nicht weiter. Zusätzlich zu dem Schwellenwert von GM-CSF sollte das Verhältnis von Bystander-Zellen zu autologen Krebszellen nicht größer als 1 : 1 sein; anderenfalls wird die Gesamteffizienz der Immunantwort beeinträchtigt. Geeignete Verhältnisse von Bystander-Zellen zu isolierten Krebsantigenen können gleichermaßen unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Gebiet bestimmt werden.
Dem Fachmann auf dem Gebiet sind außerdem Mittel bekannt, um eine therapeutische (d. h. systemische Immun-)Antwort bei Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu verfolgen. Insbesondere kann die therapeutische Antwort durch Kontrollieren der Attenuierung des Tumorwachstums und/oder der Tumorregression bestimmt werden. Die Attenuierung des Tumorwachstums oder die Tumorregression in Antwort auf die Behandlung kann unter Verwendung mehrerer Endpunkte, welche den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich von z. B. der Anzahl von Tumoren, der Tumormasse oder -größe oder der Reduktion/Verhinderung von Metastasen, kontrolliert werden. Die beschriebenen Verfahren sind keinesfalls inklusive, und weitere Verfahren passend zu der spezifischen Anwendung werden für den Fachmann offensichtlich sein.
Jede Krebsart kann in Übereinstimmung mit dem vorliegenden erfinderischen Verfahren behandelt werden. Ein "Krebs" wie hierin verwendet beinhaltet Krebse, insbesondere solche epithelialen Ursprungs, welche gekennzeichnet sind durch anomale zelluläre Proliferation und die Abwesenheit von Kontaktinhibition, was durch Tumorbildung in Erscheinung treten kann. Der Begriff umfasst Krebs, welcher in Tumoren lokalisiert ist, ebenso wie Krebs, welcher nicht in Tumoren lokalisiert ist, wie z. B. Krebszellen, welche sich von einem Tumor ausgehend lokal inversiv ausdehnen. Folglich ist das Verfahren anwendbar als eine lokale Adjuvanztherapie für resizierte Krebse ebenso wie als lokale Kontrollmittel für das Tumorwachstum, wie z. B. Karzinome der Blase, der Brust, des Kolons, der Niere, der Leber, der Lunge, der Ovarien, des Pankreas, des Enddarms und Magens, sowie als Behandlung eines Sarkoms, z. B. Fibrosarkoms oder Rhabdosarkoms, eines hematopoetischen Tumors der lymphoiden oder myeloiden Linie oder andere Tumore, einschließlich, jedoch nicht auf diese limitiert, Melanom, Teratokarzinom, Neuroblastom oder Gliom.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann mit weiteren Verfahren der Krebsbehandlung kombiniert werden. Beispiele für solche Verfahren beinhalten die Bestrahlung, Chirurgie und Chemotherapie. Zusätzlich kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung für nicht-humane Säuger angepasst werden, z. B. durch Verwenden einer nicht-humanen Säugerzelllinie, um die universelle Bystander-Zelllinie zu erzeugen und einer nicht-humanen Säugerquelle eines immunmodulatorischen Zytokins.
Die ein immunmodulatorisches Zytokin exprimierende Bystander-Zelllinie gemäß der Erfindung kann ebenso verwendet werden, um Autoimmunkrankheiten, z. B. rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose; etc. zu unterdrücken. Zusätzlich kann die Bystander-Zelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber einer Infektionskrankheit wie z. B. HIV-Infektion, Aids und Malaria; etc., Graft versus Host-Krankheit (graft vs. host rejection) und Transplantatsabstoßung zu verstärken.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen deren Umfang nicht limitieren.
Beispiel 1
Das Beispiel beschreibt die Herstellung einer universellen immunmodulatorischen Zytokin-exprimierenden Bystander-Zelllinie.
Das humane GM-CSF-Gen wurde mittels PCR aus humanem peripherem Blut kloniert. Das PCR-Produkt wurde in die HindIII-Not I-Schnittstellen in den Vektor pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, welcher den humanen CMV-Promotor verwendet und außerdem Hygromycinresistenz als einen selektierbaren Marker kodiert. Der EBNA-1- Anteil diese Konstruktes wurde durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen ClaI und AvrII ausgeschnitten.
Das linearisierte Plasmid wurde verwendet, um die humane Zelllinie K562 zu elektroporieren. Arznei-resistente Zellen wurden am Anfang in Anwesenheit von Hygromycin mit einer Konzentration von 400 μg/ml selektiert. Nachdem stabile Transfektanten erhalten wurden, wurde die Massenkultur (bulk culture) unter Verwendung eines ELISA-Assays im Hinblick auf die Produktion von humanem GM-CSF bewertet. Die GM-CSF-produzierende Massenkultur wurde anschließend mit zunehmenden Konzentrationen an Hygromycin bis zu einer maximalen Dosis von 1200 μg/ml selektiert. Zellen, welche gegen die hohe Dosis Hygromycin resistent waren, wurden in Anwesenheit von 1200 μg/ml Hygromycin subkloniert. Individuelle Subklone wurden expandiert und anschließend auf die Quantität an GM-CSF, welche pro Millionen Zellen pro 24 Stunden produziert wurden, durch ELISA unter Verwendung des R & D Quantikine Kits (R & D, Minneapolis, MN) getestet. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, welche ein Balkendiagramm von ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std. versus der Zelllinie darstellt. Die Subklone von K562 produzierten über 1000 ng/10⁶ Zellen/24 Std.. Subklone, welche die höchsten Mengen an GM-CSF auf einer pro Zelle-Basis produzierten, wurden anschließend für die Kultivierung in 100% AIM-V-Medium (Life Technologies/GIBCO, Gaithersburg, MD) in Abwesenheit jeglichen fötalen bovinen Serums angepasst. Die Zellen produzierten weiterhin für wenigstens vier Tage nach der Bestrahlung GM-CSF.
Die resultierenden Zellpopulationen wurden bezüglich der Expression von HLA Klasse I und HLA Klasse II-Molekülen charakterisiert. GM-CSF-exprimierende K562-Zellen und Zellen, welche von einer humanen Prostatakarzinom-Zelllinie (erhalten von einem Patienten und immortalisiert; Pro 22, Johns Hopkins University, Baltimore MD) erhalten wurden, wurden entweder in Medium allein oder in Medium, welches mit humanem rekombinantem IFNγ (100 Einheiten/ml × 24 Std.) angereichert wurde, kultiviert. Die Zellen wurden mit den primären monoklonalen Antikörpern W632 (anti-human Klasse I schwere Kette), L243 (anti-human Klasse II) oder mAb14.4.4 (anti-Maus I-E^d, ein Isotypenpassender irrelevanter Kontrollantikörper) gefärbt. Die Zellen wurden dann mit dem sekundären Antikörper Ziege-anti-Maus-IgG2aFITC (Caltag, Burlingame, CA) gefärbt. Zehntausend gewertete Ereignisse (gated events) wurden mit Hilfe eines FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) gezählt, und die Daten wurden unter Verwendung der CeIIQuest-Software analysiert. Die Unterschiede in der Expression von MHC-I und MHC-II-Antigenen zwischen den GM-CSF-exprimierenden K562-Zellen und den Pro 22-Zellen sind in 2A bzw. 2B gezeigt, welche Graphen der Zählung versus der relativen Fluoreszenz darstellen.
Die resultierenden Zellpopulationen wurden außerdem aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung charakterisiert. GM-CSF-exprimierende K562-Zellen wurden entweder mit 10000 oder mit 15000 rad durch einen Cäsiumgammastrahler bestrahlt und anschließend wurden jeweils 2,5 × 10⁶ Zellen in 15 ml Medium in Kultur genommen. Die Zellen wurden gezählt und der Prozentanteil der Trypan Blau-negativen Zellen wurde festgehalten. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt, welche eine grafische Darstellung der % lebenden Zellen (Trypan Blau negativ) versus der Tage nach der Bestrahlung ist.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt das Verhältnis von universellen Bystander-Zellen zu autologen Tumorzellen, wie es in einer Zusammensetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll.
Eine Zusammensetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung muss eine ausreichende Anzahl von Bystander-Zellen enthalten, um sicherzustellen, dass wenigstens 36 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std. produziert wird. Zusätzlich darf das Verhältnis von Bystander-Zellen zu Tumorzellen nicht größer als 1 : 1 sein; anderenfalls wird die Gesamteffizienz der Immunantwort beeinträchtigt.
BALB/c-Mäusen wurden 1 × 10⁵ lebende A20 Wild-Typzellen (NCI, Bethesda, MD) am Tag Null intravenös injiziert. Fünf Tage später wurden die Mäuse subkutan mit der Zusammensetzung wie in 4 angegeben, welches eine grafische Darstellung des % tumorfreien Überlebens versus Tage nach der Tumorchallenge ist, immunisiert. Allogene Bystander-Zellen wurden von einem C3H (H-2k) Lymphom, welches mit einem Retrovirus (MFG) kodierend für Maus GM-CSF transduziert wurde, abgeleitet, welches 100 ng/10⁶ Zellen/24 Std. produzierte. A20-Zellen wurden mit demselben Konstrukt transdu ziert, was in 130 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std. resultierte. Die in sämtlichen Zusammensetzungen verwendeten Zellen wurden vor der Injektion mit 5000 rad bestrahlt.
Wie in 4 gezeigt, produzieren Subklone von GM-CSF-produzierenden K562-Zellen über 1000 ng/10⁶ Zellen/24 Std.. Die Verwendung solcher Subklone ermöglicht die Verwendung von so geringen Zahlen wie eine Bystander-Zelle pro 10 autologe Tumorzellen, mit einem klaren Sicherheitsspielraum oberhalb des GM-CSF-Schwellenwertes von 36 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Std., durch Erzielen von 100 ng/10⁶ Zellen/24 Std..

Claims

Eine universelle Bystander-Zelllinie, (i) welche eine humane Zelllinie ist, (ii) welcher natürlicherweise die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse I (MHC-I) und die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse II (MHC-II) fehlen, oder welche so modifiziert ist, dass ihr die MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen, und (iii) welche modifiziert ist durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für Granulocyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden-Faktor (GM-CSF) kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, wobei die genannte universelle Bystander-Zelllinie wenigstens 500 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Stunden exprimiert.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß Anspruch 1, wobei die genannte humane Zelllinie charakterisiert ist durch die Abwesenheit von B-Lymphocyten-Markern von Immunglobulin, einem Epstein-Barr-Virus(EBV)-Genom und einem assoziierten nukleären Antigen und Rezeptoren für EBF.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß Anspruch 1, wobei die genannte humane Zelllinie abgeleitet ist von einer Blastenkrise der Chronischen Myeloischen Leukämie.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß Anspruch 1, wobei die genannte humane Zelllinie K562 ist.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welche wenigstens 1000 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Stunden exprimiert.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, welche in definiertem Medium wächst.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der genannte Promotor ein Cytomegalovirus-Promotor ist.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das genannte Nukleinsäuremolekül weiterhin eine für Hygromycin-Resistenz kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell verbunden ist mit einem Promotor, umfasst, und die genannte universelle Bystander-Zelllinie durch Wachstum in einem Kulturmedium, das wenigstens 400 μg/ml Hygromycin umfasst, selektiert wird.
Die universelle Bystander-Zelllinie gemäß Anspruch 8, wobei die genannte universelle Bystander-Zelllinie durch Wachstum in einem Kulturmedium, welches wenigstens 1000 μg/ml Hygromycin umfasst, selektiert wird.
Eine Zusammensetzung umfassend: (a) eine universelle Bystander-Zelllinie, (i) welche eine humane Zelllinie ist, (ii) welcher natürlicherweise die MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen, oder welche so modifiziert ist, dass ihr die MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen, und (iii) welche modifiziert ist durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für ein immunmodulatorisches Zytokin kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, die funktionell verbunden ist mit einem Promotor, und (b) ein Krebsantigen.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei das genannte immunmodulatorische Zytokin Interleukin-2 (IL-2) ist.
Eine Zusammensetzung, welche die universelle Bystander-Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 und ein Krebsantigen umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung einer universellen GM-CSF-exprimierenden Bystander-Zelllinie, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Erhalten einer humane Zelllinie, welcher die MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen; (ii) Modifizieren der genannten humanen Zelllinie durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für GM-CSF kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist und eine für einen selektierbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, in die genannte humane Zelllinie; und (iii) Verwendendes selektierbaren Markers, um Zellen zu isolieren, welche wenigstens 500 ng des genannten GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Stunden produzieren.
Ein Verfahren zur Herstellung einer universellen GM-CSF-exprimierenden Bystander-Zelllinie, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Erhalten einer humane Zelllinie; (ii) Modifizieren der genannten humanen Zelllinie, so dass ihr MHC-I-Antigene und MHC-II-Antigene fehlen; (iii) weiterhin Modifizieren der genannten humanen Zelllinie durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine für GM-CSF kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist und eine für einen selektierbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz, die funktionell mit einem Promotor verbunden ist, umfasst, in die genannte humane Zelllinie; und (iv) Verwenden des selektierbaren Markers, um Zellen zu isolieren, welche wenigstens 500 ng GM-CSF/10⁶ Zellen/24 Stunden produzieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei der genannte selektierbare Marker Hygromycin-Resistenz ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die modifizierte humane Zelllinie in Kulturmedium kultiviert wird, welches wenigstens 400 μg Hygromycin/ml Kulturmedium umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die modifizierte humane Zelllinie anschließend in Kulturmedium kultiviert wird, welches wenigstens 1000 μg Hygromycin/ml Kulturmedium umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das genannte Kulturmedium definiert ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei der Promotor, mit welchem die für GM-CSF kodierende Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist, ein Cytomegalovirus-Promotor ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Herstellung eines Medikamentes für die Stimulierung einer Immunantwort gegen einen Krebs in einem humanen Patienten, wobei die genannte Zusammensetzung ein Krebsantigen umfasst, welches ein Antigen des genannten Krebses des genannten Patienten ist und wobei die genannte Zusammensetzung weiterhin bestrahlt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 20, wobei das genannte Krebsantigen eine Zelle des genannten Krebses ist.