DE69627527T2

DE69627527T2 - Allogene parakrine cytokine tumor impfstoffe

Info

Publication number: DE69627527T2
Application number: DE69627527T
Authority: DE
Inventors: M. Elizabeth JAFFEE; M. Drew PARDOLL; I. Hyam LEVITSKY
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: AU1355697A; JP2000502711A; WO1997024132A1; ES2191784T3; EP0869803B1; ATE237338T1; EP0869803A1; DE69627527D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Krebs unter Verwendung allogener Tumorzelllinien, i. e. Tumorzelllinien, die genetisch nicht gleich wie die des Wirtes sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Mittel zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Verwendung einer allogeen pankreatischen Tumorzelllinie. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pankreatische Tumorzelllinie, ein Verfahren und ein Medium, um eine solche Zelllinie zu erhalten, und eine Zusammensetzung, die Zellen einer gereinigten pankreatischen Tumorzelllinie enthält.
Hintergrund der Erfindung
Es ist allgemein anerkannt, dass menschliche Tumorzellen mehrfache spezifische Veränderungen im zellulären Genom aufweisen, die für ihren malignen Phänotyp verantwortlich sind. Diese Veränderungen beeinflussen die Expression oder Funktion von Genen, die das Zellwachstum und die Differenzierung steuern. Beispielsweise werden diese Mutationen typischerweise beobachtet in Onkogenen oder positiven Effektoren der zellulären Transformation, wie ras, und in Tumorsuppresor-Genen (oder rezessiven Onkogenen), die negative Wachstumsregulatoren codieren, deren Funktionsverlust zur Expression eines transformierten Phänotyps führt, wie p53, Rb1, DCC, MCC, NF1 und WT1.
Mutationen wurden in allen üblichen menschlichen Tumoren festgestellt, einschließlich pankreatischer und colorektaler Karzinome. Derzeit ist das am häufigsten bei menschlichem Krebs identifizierte Onkogen ein transformierendes ras-Gen (i. e. eine mutierte Version von H-ras, K-ras oder N-ras, die ein Protein mit einer veränderten Aminosäure an einer der kritischen Positionen 12, 13 und 61 codiert). Wie Barbacid, Ann. Rev. Biochem., 56, 779–827 (1987), berichtet, wurde ein ras-Onkogen beobachtet in Karzinomen von Blase, Brust, Kolon, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Bauch speicheldrüse, Rektum und Magen; in hämatopoetischen Tumoren lymphoider und myeloider Abstammung; in Tumoren mesenchymalen Ursprungs, wie Fibrosarkomen und Rhabdomyosarkomen; und in anderen Tumoren, darunter Melanome, Teratokarzinome, Neuroblastome und Gliome. Insbesondere wurde eine ras-Mutation bei mehr als 90% der Patienten mit Adenokarzinom des Pankreas identifiziert, wie von Bos, Cancer Research, 49, 4682–4689 (1989), beschrieben.
Tumoren des Pankreas sind außerordentlich maligne und führen im Allgemeinen zum Tod. Tatsächlich ist Bauchspeicheldrüsenkrebs die fünfthäufigste Ursache für Krebstod in den USA. Die derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten haben keinen oder nur geringen Nutzen für Patienten mit inoperablen Tumoren (i. e. regional fortgeschrittener oder metastatischer Krebs) gezeigt. Auch bei Patienten mit lokalisierter Krankheit, die reseziert werden kann, zeigt die adjuvante Therapie des Standes der Technik mit Bestrahlung und Chemotherapie nur bescheidenen Erfolg und diesen um den Preis signifikanter Toxizität der Behandlung. Mehr als 71% der Krebspatienten, die sich einer adjuvanten Therapie unterziehen, sterben schließlich an der wieder auftretenden Krankheit. Aus diesem Grund sind wirksamere Behandlungen für Krebs erforderlich und insbesondere für fortgeschrittenen sowie begrenzten Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Immuntherapie ist ein potentieller therapeutischer Ansatz für die Krebsbehandlung. Immuntherapie basiert auf der Annahme, dass das Versagen des Immunsystems beim Bekämpfen von spontan auftretenden Tumoren damit in Beziehung steht, dass das Immunsystem nicht in der Lage ist, auf Tumorantigene angemessen zu reagieren. In einem funktionierenden Immunsystem werden Tumorantigene an der Zelloberfläche im Kontext der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse I- und -Klasse II-Moleküle verarbeitet und exprimiert, die beim Menschen auch als „Humanleukozyten-assoziierte" (HLA) Moleküle bezeichnet werden. Wenn sie mit Antigenen komplexiert sind, werden die MHC Klasse I- und II-Moleküle von CD8⁺ bzw. CD4⁺ T-Zellen erkannt. Dieses Erkennen erzeugt einen Satz von sekundären Zellsignalen und die parakrine Freisetzung spezifischer Zytokine oder löslicher so genannter Immunmodulatoren (biological response modifiers), die Wechselwirkungen zwischen Zellen vermitteln und die Abwehr des Wirts zur Bekämpfung der Krankheit stimulieren. Die Freisetzung von Zytokinen führt dann zur Proliferation von antigenspezifischen T-Zellen.
Die aktive Immuntherapie beinhaltet also das Injizieren von Tumorzellen, typischerweise in der Nachbarschaft eines Tumors, um entweder eine neue oder eine verstärkte systemische Immunantwort zu erzeugen. Die Fähigkeit dieses immuntherapeutischen Ansatzes zur Erhöhung einer systemischen T-Zell-Antwort gegen einen Tumor wurde früher geoffenbart, siehe beispielsweise u. a. WO 92/05262, Fearon et al., Cell, 60, 397–403 (1990), und Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3539–3543 (1993). Die injizierten Tumorzellen werden üblicherweise verändert, um ihre Immunogenität zu erhöhen, wie durch Vermischen mit nicht-spezifischen Adjuvantien oder durch genetische Modifikation der Zellen, um Zytokine oder andere immun-co-stimulierende Moleküle zu exprimieren. Die verwendeten Tumorzellen können autolog sein, i. e. vom selben Wirt erhalten sein, der behandelt wird. Alternativ können die Tumorzellen MHC-angepasst oder von einem anderen Wirt erhalten sein, der die gleichen oder zumindest einige der gleichen MHC-Komplex-Moleküle hat.
Aus verschiedenen Gründen ziehen klinische Forscher die Verwendung autologer gegenüber MHC-angepassten Tumorzellen vor und vice versa. Autologe Zellen werden vorgezogen, da der Tumor jedes Patienten einen einzigartigen Satz von Tumorantigenen exprimiert, der sich von jenen unterscheiden kann, die sich an histologisch ähnlichen, MHC-angepassten Tumorzellen eines anderen Patienten finden, siehe z. B. Kawakami et al., J. Immunol., 148, 638–643 (1992); Darrow et al., J. Immunol., 142, 3329–3335 (1989); und Hom et al., J. Immunother., 10, 153–164 (1991). Studien, welche humane Melanom-Antigene untersuchen, bestätigen, dass alle derzeit identifizierten humanen Tumorantigene mindestens 50% der Tumoren der Patienten gemeinsam sind, unabhängig davon, ob der gleiche MHC-Typ auch gemeinsam ist oder nicht. Die Verwendung von Zellen aus einem eigenen Tumor des Patienten umgeht die Notwendigkeit der Anpassung von Tumor- oder MHC-Antigenen.
Im Vergleich dazu werden MHC-angepasste Tumorzellen bevorzugt, da die Verwendung autologer Tumorzell-Vakzine erfordert, dass jeder Patient operiert wird, um eine Probe seines Tumors für die Vakzinproduktion zu erhalten. Die in vitro-Expansion frischer humaner Tumorexplantate, die für die Produktion autologer Tumorzell-Vakzine erforderlich ist, ist arbeitsintensiv, technisch aufwändig und häufig für die meisten histologischen Typen von menschlichen Tumoren unmöglich, und das selbst mit hoch spezialisierten Forschungseinrichtungen. Außerdem ist die Herstellung eines Vakzins aus dem Tumor eines jeden Patienten ziemlich teuer. Es besteht außerdem eine ziemlich hohe Wahrscheinlichkeit, dass nach längerem Durchgang autologer Zellen in Kultur sich die antigene Zusammensetzung solcher Zellen im Verhältnis zum Primärtumor, von dem die Zelllinie stammt, verändert, wodurch die Zellen als Vakzin unwirksam werden. Während solche Änderungen bei allen etablierten Zelllinien unvermeidlich sind, wird es hinsichtlich der Verwendung autologer Zellen als Tumorvakzin erforderlich sein, von jeder anfangs isolierten Zelllinie für jeden Patienten, der unter Verwendung dieses Ansatzes behandelt wird, einen gefrorenen Vorrat zu halten.
Basierend auf diesen mit der Verwendung autologer und MHC-angepasster Zellen als Tumorvakzine verbundenen Nachteilen haben andere Forscher versucht, alternative Tumorvakzine zu finden, wie Jaffee et al., Seminars in Oncology, 22. 81–91 (1995), berichten. Die neueren Ergebnisse von Huang et al., Science, 264, 961–965 (1994), sind für diesen Vorschlag relevant. Vor dieser Studie basierten Tumorvakzin-Strategien nämlich auf der Annahme, dass die impfenden Tumorzellen als die Antigen-präsentierende Zellen (APCs) fungieren, die die Tumorantigene auf ihren MHC-Klasse I- und II-Molekülen präsentieren und direkt den T-Zell-Arm der Immunantwort aktivieren. Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse von Huang et al., dass anstelle der impfenden Tumorzellen die professionellen APCs des Wirts den T-Zell-Arm der Immunantwort anregen. Die Tumorvakzinzellen sezernieren ein Zytokin, wie GM-CSF, und rekrutieren vom Knochenmark abgeleitete APCs zur Region des Tumors (siehe z. B. Jaffee et al., Cancer Res., 53, 2221–2226 (1993)). Die vom Knochenmark abgeleiteten APCs nehmen das gesamte Zellprotein des Tumors für die Verarbeitung auf und präsentieren dann das antigene Peptid auf ihren MHC Klasse I- und 11-Molekülen. Auf diese Art initiieren die APCs sowohl die CD4+ als auch die CD8+ T-Zell-Arme des Immunsystems, was eine systemische Immunantwort gegen den Tumor erzeugt, die für die antigenen Epithope des Wirtstumors spezifisch ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Verwendung autologer oder MHC-angepasster Tumorzellen bei der Krebsbehandlung unnötig sein kann.
Andere Ergebnisse legen nahe, dass der Transfer allogener MHC-Gene (i. e. Gene von einem genetisch unähnlichen Individuum derselben Spezies) die Tumor-Immunogenität erhöhen kann. Speziell führte in manchen Fällen die Zurückweisung von Tumoren, die allogene MHC Klasse I-Moleküle exprimieren, zu erhöhter systemischer Immunantwort gegen anschließenden Challenge mit dem unmodifizierten pa rentalen Tumor, wie in Jaffee et al., supra, und Huang et al., supra, berichtet wird. Dies scheint ein Beispiel für das allgemeine Phänomen zu sein, das von Itaya et al., Cancer Res., 47, 3136–3140 (1987), als „Xenogenisierung“ bezeichnet wird, wo die Wirksamkeit von Tumorvakzin dadurch erhöht wird, dass in die Tumorzelle Gene eingeführt werden, die Fremd-Antigene codieren.
Es besteht also Bedarf an einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, insbesondere zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die nicht auf der Verwendung autologer oder MHC-angepasster Tumorzellen beruht und die Schwierigkeiten und Nachteile vermeidet, die mit deren Verwendung verbunden sind. Die vorliegende Erfindung stellt eine solche pharmazeutische Zusammensetzung bereit sowie Komponenten, die zur Durchführung des Verfahrens erforderlich sind. Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfinderische Merkmale werden anhand der Beschreibung der Erfindung, die hier dargelegt ist, offensichtlich.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung einer Tumorzelllinie, wie sie in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 3 definiert ist, die resultierende pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs vor. Eine solche Verwendung umfasst die Schritte:

a) Erhalten einer Tumorzelllinie,
b) Modifizieren der Tumorzelllinie, um sie zur Produktion eines im Vergleich zur unmodifizierten Tumorzelllinie erhöhten Zytokin-Levels zu befähigen.

Die hergestellte und die Tumorzelllinie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung kann einem Säuger verabreicht werden, der mindestens einen Tumor hat, der vom selben Typ ist wie jener Tumor, von dem die Tumorzelllinie erhalten wurde. Die Tumorzelllinie ist allogen und nicht zum Wirt MHC-angepasst. Insbesondere sieht die vorliegenden Erfindung ein Mittel zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Verwendung einer allogenen pankreatischen Tumorzelllinie vor. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pankreatische Tumorzelllinie bereit, ein Verfahren und ein Medium, um eine solche Tumorzelllinie zu erhalten, und eine Zusammensetzung, die Zellen einer gereinigten pankreatischen Tumorzelllinie enthält, wie in den unabhängigen Ansprüchen 13, 14, 19, 20 bzw. 22 spezifiziert.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Krebs
Das erfindungsgemäße Mittel kann zur Behandlung von Krebs verwendet werden. „Krebsbehandlung“ gemäß dieser Erfindung umfasst die Verabreichung der Tumorzelllinien, wie hier dargelegt, an einen Wirt, um eine therapeutische Reaktion zu bewirken. Insbesondere ist eine therapeutische Reaktion eine systemische Immunantwort (i. e. eine T-Zell-Antwort) auf Tumorantigene. Eine solche Antwort kann durch Überwachen der Abschwächung des Tumorwachstums und/oder der Tumorregression überprüft werden. „Tumorwachstum“ schließt eine Zunahme der Tumorgröße und/oder der Anzahl der Tumoren ein. „Tumorregression“ schließt eine Reduktion der Tumormasse ein.
„Krebs“ gemäß dieser Erfindung schließt ein: Krebsarten, insbesondere jene, die vom Epithel ausgehen, die durch anormale Zellproliferation und das Fehlen von Kontaktinhibition gekennzeichnet sind, was durch Tumorbildung gezeigt werden kann. Der Ausdruck umfasst in Tumoren lokalisierten Krebs sowie Krebs, der nicht in Tumoren lokalisiert ist, wie beispielsweise Krebszellen, die sich von einem Tumor lokal durch Invasion ausbreiten. Erfindungsgemäß kann also auf die Behandlung jedweder Krebsart abgezielt werden. Beispielsweise kann der Ansatz vorzugsweise in verschiedenen klinischen Szenarien angewendet werden, darunter, aber nicht darauf eingeschränkt, lokale adjuvante Therapie für resezierten Krebs und lokale Steuerung des Tumorwachstums, wie Karzinome von Blase, Brust, Kolon, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Bauchspeicheldrüse, Rektum und Magen. Das Verfahren kann auch vorzugsweise zur Behandlung verwendet werden, wenn der Tumor ein Sarkom ist (z. B. ein Fibrosarkom oder Rhabdosarkom), ein hämatopoetischer Tumor lymphoider oder myeloider Abstammung oder ein anderer Tumor, darunter, aber nicht darauf eingeschränkt, Melanom, Teratokarzinom, Neuroblastom oder Gliom.
Vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Mittel verwendet werden, um Bauchspeicheldrüsenkrebs zu behandeln. Die vorliegende Erfindung bietet also auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs, deren Herstellung die Schritte beinhaltet:

a) Erhalten einer pankreatischen Tumorzelllinie,
b) Modifizieren der Tumorzelllinie, um sie zur Produktion eines im Verhältnis zur unmodifizierten Tumorzelllinie erhöhten Zytokin-Levels zu befähigen.

Die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Tumorzelllinie kann einem Säuger verabreicht werden, der mindestens einen Pankreastumor hat, wobei die Tumorzelllinie allogen und nicht MHC-angepasst zum Wirt ist.
Die Krebsbehandlung kann wirksam unter Verwendung einer großen Anzahl verschiedener Wirte durchgeführt werden, beispielsweise verschiedener eukaryotischer Wirte, vorzugsweise Säuger, einschließlich, aber nicht darauf eingeschränkt, Nagetiere, Affen, Schimpansen, feline Wirte, kanine Wirte, Ungulaten (wie Wiederkäuer oder Schwein) sowie insbesondere menschliche Wirte.
Tumorzelllinie
Wie hier beschrieben, umfasst eine „Tumorzelllinie“ Zellen, die ursprünglich von einem Tumor abgeleitet wurden. Solche Zellen haben typischerweise eine Änderung in vivo erfahren, so dass sie theoretisch endloses Wachstum in Kultur zeigen, i. e. anders als primäre Zellen, die nur für eine begrenzte Zeitdauer kultiviert werden können. Außerdem können solche Zellen vorzugsweise Tumoren bilden, nachdem sie einem dafür empfänglichen Lebewesen injiziert wurden.
Gemäß der Erfindung kann eine Tumorzelllinie von jedwedem Tumor abgeleitet sein, z. B. einem Karzinom von Blase, Brust, Kolon, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Bauchspeicheldrüse, Rektum und Magen; einem hämatopoetischen Tumor lymphoider oder myeloider Abstammung; einem Tumor mesenchymalen Ursprungs, wie Fibrosarkom oder Rhabdomyosarkom; oder einem anderen Tumor, darunter Melanom, Teratokarzinom, Neuroblastom oder Gliom. Vorzugsweise ist die Tumorzelllinie von einem Pankreastumor abgeleitet.
Eine zur Behandlung von Krebs verwendete Tumorzelllinie kann durch jedes geeignete Mittel erhalten werden, wird aber vorzugsweise nach einem allgemeinen Verfahren erhalten, das die Schritte beinhaltet:

a) Erhalten einer Probe eines Tumors von einem Säugetier-Wirt,
b) Bildung einer Einzell-Suspension aus der Tumorprobe,
c) Pelletieren der Tumorzellen und
d) Plattieren der Tumorzellen.

Spezifischer kann eine Probe eines Tumors typischerweise während einer Operation erhalten werden. Die Tumorprobe kann anschließend unter Verwendung steriler Techniken und auf eine solche Weise, dass Gewebeschäden minimal gehalten werden, gehandhabt und manipuliert werden. Die Gewebeprobe kann in einem sterilen Behälter auf Eis gebracht und in eine Labor-Laminar-Flow-Haube bewegt werden. Der Teil des Tumors, der für die Isolierung von Tumorzelllinien verwendet werden soll, kann in kleine Stücke zerkleinert werden; der Rest des Tumors kann bei –70°C gelagert werden. Die Tumorstücke können dann unter Verwendung einer Lösung von Collagenase I zu Einzell-Suspensionen verdaut werden. Dieser Verdau kann bei Raumtemperatur oder bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Verdau bei 37°C unter Schütteln der Mischung, z. B. in einem Schüttelinkubator, durchgeführt.
Die Einzell-Suspension wird dann pelletiert, und die Pellets können in einem kleinen Volumen Gewebekulturmedium resuspendiert werden. Die resuspendierten Zellen können in Gewebekulturmedium inokuliert werden, das für das Wachstum der Zellen in Kultur geeignet ist, bei einer Dichte von etwa 2·10⁵ Tumorzellen/ml. Vorzugsweise ist das Medium eines, das für die Unterstützung des Wachstums vieler Arten von Zellkulturen im großen Umfang anwendbar ist, wie ein Medium, welches ein Bicarbonat-Puffersystem und verschiedene Aminosäuren und Vitamine verwendet. Optimal ist das Medium RPMI-1640. Das Medium kann nach Bedarf verschiedene weitere Faktoren enthalten, beispielsweise wenn das für das Wachstum von Tumorzellen oder für das Halten der Tumorzellen in einem undifferenzierten Zustand erforderlich ist.
Die Kulturen können in Gegenwart von etwa 5–7% CO₂ auf etwa 35–40°C gehalten werden. Die Tumorzellkulturen können nach Bedarf zugeführt und rekultiviert werden, i. e. typischerweise alle 1–10 Tage. Die Tumorzellen können auch einer differentiellen Trypsinisierung unterworfen werden, um andere Zellen (z. B. Stromazellen), die die Primärtumorkulturen überwachsen können, zu entfernen. Vorzugsweise erfolgt eine solche differentielle Trypsinisierung ungefähr alle 5–10 Tage.
Wenn es scheint, dass eine im Wesentlichen reine Kultur der Tumorzellen erhalten wurde, können nach Bedarf verschiedene Tests durchgeführt werden, um die relative Reinheit der Kulturen zu bestimmen und die resultierenden Tumorzelllinien zu charakterisieren. Beispielsweise kann die Existenz bestimmter genetischer Sequenzen in der Zelllinie oder bestimmter phänotypischer Züge, wie hier weiter beschrieben, untersucht werden.
Das Verfahren zur Isolierung einer Tumorzelllinie kann vorzugsweise zur Isolierung einer pankreatischen Tumorzelllinie verwendet werden. Eine solche pankreatische Tumorzelllinie kann ebenso zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs verwendet werden, und sie kann erhalten werden durch:

a) Erhalten einer Probe eines Pankreastumors eines Säugers,
b) Bilden einer Einzell-Suspension aus der Tumorprobe,
c) Pelletieren der Tumorzellen und
d) Plattieren der Tumorzellen.

Die vorliegende Erfindung stellt also eine im Wesentlichen gereinigte Tumorzelllinie bereit, insbesondere eine im Wesentlichen gereinigte pankreatische Tumorzelllinie.
Als Teil des Isolierungsverfahrens werden die Pankreastumorzellen zweckmäßigerweise in Wachstumsmedium plattiert, welches für das Kultivieren von Pankreastumorzellen optimiert ist. Vorzugsweise ist dieses Medium RPMI-1640. Optimalerweise enthält dieses Medium weiter fötales Serum, Insulin und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren 1 und 2. Vorzugsweise ist das fötale Serum ein fötales Rinderserum, und es wird in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 30%, bevorzugter etwa 10 bis etwa 25% und optimal etwa 20% eingebracht. Das Insulin ist vorzugsweise Humaninsulin und wird in das Medium in einer Konzentration von etwa 0,02 bis etwa 2,0 U/ml, bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 1,0 U/ml und optimalerweise etwa 0,2 U/ml eingebracht. Die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2 können jeweils vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 0,1 μg/ml, bevorzugter 0,005 bis etwa 0,05 μg/ml, optimalerweise etwa 0,01 μg/ml in das Medium eingebracht werden.
Das Medium und die Mediumkomponenten sind leicht verfügbar und können beispielsweise von kommerziellen Lieferanten erhalten werden. Solche kommerzielle Lieferanten sind, ohne darauf eingeschränkt zu sein, beispielsweise: JRH Biosciences (Lenexa, KS), Gibco BRL (Gaithersberg, MD), Hyclone Labs. (Logan, UT), Sigma Biosciences (St. Louis, MO), Cell Sys. Corp. (Kirkland, WA), Intergen Co. (Purchase, N. Y.), Eli Lilly and Co. (Indianapolis, IN), Biofluids, Inc. (Rockville, MD) und andere Lieferanten, die ähnliche Produkte erzeugen.
Vorzugsweise enthält die Tumorzelllinie (die zweckmäßigerweise eine Pankreastumorzelllinie ist) eine Mutation in einem Onkogen oder Tumorsuppressor-Gen, so dass die onkogene Natur der Tumorzelllinie und ihre Ableitung von einem Wirtstumor bestätigt werden kann. Die Mutation kann in jedem Onkogen oder Tumorsuppressor-Gen auftreten, darunter, aber nicht darauf eingeschränkt, trk, ks3, hst, ras, myc, p53, mas, Rb1, DCC, MCC, NF1 und WT1. Optimalerweise enthält die Tumorzelllinie eine ras-Mutation. Vorzugsweise befindet sich die Mutation im Codon 12, 13 oder 61 von einem der ras-Gene H-ras, K-ras und N-ras. Optimalerweise befindet sich die Mutation im Codon 12 eines ras-Gens, vorzugsweise Codon 12 eines K-ras-Gens.
Die Verwendung einer durch eine ras-Mutation charakterisierten Tumorzelllinie ist von Vorteil, da die Mutationen, die ein ras-Gen onkogen machen, charakterisiert wurden, wie z. B. Bos, supra, und Barbacid, supra, berichten. Das bedeutet, dass Peptide, welche Aminosäureveränderungen inkorporieren, von denen bekannt ist, dass sie zu einem ras-Onkoprotein führen, leicht synthetisiert werden können und dass sie als Ziele cytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) evaluiert werden können. Die Immunreaktionen des Wirts auf diese Peptide können sowohl vor als auch nach der Impfung geprüft werden.
Die Tumorzelllinie, die vorzugsweise eine pankreatische Zelllinie ist, kann durch ein weiteres Merkmal charakterisiert werden, das die Tumorzellen von anderen Zellen unterscheidet und das beispielsweise zur Überwachung des Überlebens der Zelle in vitro oder in vivo verwendet werden kann. Beispiele für ein solches Merkmal sind u. a. Antikörper-Anfärbung für ein spezielles Protein, das zweckmäßigerweise ein Zelloberflächenprotein ist. Vorzugsweise zeigen die erfindungsgemäßen pankreatischen Tumorzelllinien bei histochemischer Anfärbung unter Verwendung eines gegen Cytokeratin gerichteten Antikörpers eine Cytokeratin-Anfärbung. Folglich stellt die vorliegende Erfindung bevorzugte pankreatische Tumorzelllinien bereit, darunter, aber nicht darauf eingeschränkt: Panc 4.14.93, Panc 1.28.94, Panc 6.3.94, Panc 8.13.94, Panc 9.6.94, Panc 12.1.94, Panc 2.3.95, Panc 4.3.95, Panc 4.21.95, Panc 5.4.95 und insbesondere Panc 10.5.92.
Zytokin
Für die Behandlung von Krebs in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wurde die Tumorzelllinie (z. B. die Pankreastumorzelllinie) vorzugsweise modifiziert, um die Tumorzelllinie zur Produktion eines erhöhten Zytokin-Levels, verglichen mit der unmodifizierten Tumorzelllinie oder der parentalen Tumorzelllinie, von der die modifizierte Tumorzelllinie abgeleitet ist, zu befähigen. Wie der Ausdruck von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, ist ein „Zytokin“ jedwedes immunpotenzierende Protein (einschließlich eines modifizierten Proteins, wie Glykoprotein), welches die Reaktionsfähigkeit des Immunsystems eines Wirts auf einen in dem Wirt vorhandenen Tumor erhöht. Vorzugsweise ist das Zytokin nicht selbst für den Wirt immunogen und potenziert die Immunität durch Aktivieren oder Erhöhen der Aktivität von Zellen des Immunsystems.
Wie hier verwendet, umfasst Zytokin solche Proteine wie Interferone (z. B. IFN_α, IFN_β und IFN_γ), Interleukine (z. B. IL-1 bis IL-11), Tumornekrosefaktoren (z. B. TNF_α und TNF_β), Erythropoetin (EPO), Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF) und Granulozyten-Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (GM-CSF). Vorzugsweise ist das Zytokin GM-CSF aus irgendeiner Quelle, optimalerweise ist das Zytokin muriner oder humaner GM-CSF.
„Modifizieren“ einer Tumorzelllinie gemäß dieser Erfindung beinhaltet, dass der Tumorzelllinie ein Vektor bereitgestellt wird, der in der Lage ist, erhöhte Expression eines Zytokins von Interesse zu verleihen. Ein „Vektor“ umfasst ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Virus oder anderes Vehikel, das eine oder mehrere heterologe oder rekombinante DNA-Sequenzen enthält, z. B. ein Zytokin-Gen oder eine Zytokin codierende Sequenz von Interesse, unter der Kontrolle eines funktionalen Promotors und möglicherweise auch eines Enhancers, und in der Lage ist, als Vektor zu fungieren, wie der Ausdruck von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden wird. Geeignete virale Vektoren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: Simianes Virus 40, Bovines Papilloma-Virus, Epstein-Barr-Virus, Adenovirus, Herpesvirus, Vakziniavirus, Moloney murines Leukämie-Virus, Harvey murines Sarkomvirus, Murines Mammatumorvirus und Rous-Sarkomvirus.
Die Bezeichnung eines Vektors oder anderer DNA-Sequenzen als „rekombinant“ bezieht sich nur auf die Verknüpfung von DNA-Sequenzen, die nicht typischerweise verbunden sind, wenn sie aus der Natur isoliert werden. Ein „Gen“ ist jedwede Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein entstehendes mRMA-Molekül codiert. Während ein Gen codierende Sequenzen plus nicht-codierende (z. B. regulatorische) Sequenzen umfasst, schließt eine „codierende Sequenz“ keine nicht-codierende DNA ein. Ein „Promotor“ ist eine DNA-Sequenz, welche die Bindung von RNA-Polymease steuert und dabei die RNA-Synthese fördert. „Enhancer“ sind cis wirkende Elemente von DNA, welche die Transkription benachbarter Gene stimulieren oder hemmen. Ein Enhancer, der die Transkription hemmt, wird auch als „Silencer“ bezeichnet. Enhancer unterscheiden sich von DNA-Bindungsstellen hinsichtlich sequenzspezifischer DNA-Bindungsproteine; die nur im Promotor gefunden werden (die auch „Promotorelemente“ genannt werden), darin, dass Enhancer in jeder Orientierung fungieren können und über Distanzen von bis zu mehreren Kilobasenpaaren (kb), selbst von einer Position stromab einer transkribierten Region.
Es kann jeder geeignete Vektor verwendet werden, der zum Einführen von Nukleinsäuren in eukaryotische Tumorzellen geeignet ist, spezieller in Tier-Tumorzellen, wie Säugetier-, z. B. menschliche, Tumorzellen. Vorzugsweise ist der Vektor mit der Tumorzelle kompatibel, beispielsweise ist er in der Lage, die Expression des Zytokin-Gens oder der Zytokin codierenden Sequenz zu vermitteln, und wird in der Tumorzelle stabil oder relativ stabil gehalten. Zweckmäßigerweise enthält der Vektor einen Replikationsursprung. Vorzugsweise enthält der Vektor auch eine so genannte „Marker“-Funktion, durch die der Vektor identifiziert und selektioniert werden kann (z. B. ein Antibiotikaresistenz-Gen). Wenn eine Zytokin codierende Sequenz transferiert wird (i. e. im Gegensatz zu einem Zytokin-Gen, das seinen eigenen Promotor hat), enthält der Vektor optimalerweise auch einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz zu steuern, und der mit der codierenden Sequenz operabel verknüpft ist. Eine codierende Sequenz ist mit einem Promotor „operabel verknüpft“ (z. B. wenn die codierende Sequenz und der Promotor zusammen ein natives oder rekombinantes Zytokin-Gen darstellen), wenn der Promotor in der Lage ist, die Transkription der codierenden Sequenz zu steuern.
Wie hier verwendet, umfasst Zytokin-„Gen“ oder Zytokin „codierende Sequenz“ genomische oder cDNA-Zytokin-Sequenzen, größere und kleinere Sequenzen und Mutationen davon, entweder aus der Natur isoliert oder im Ganzen oder teilweise synthetisiert, solange das Gen oder die codierende Sequenz in der Lage ist, ein Protein zu exprimieren bzw. in ein Protein exprimiert zu werden, welches die charakteristische Funktion des Zytokins hat, i. e. die Fähigkeit zur Stimulierung der Immun-Antwort des Wirts. Die Mittel zur Modifizierung von Genen oder codierenden Sequenzen sind auf dem Gebiet gut bekannt und können auch mittels kommerziell erhältlicher Kits geschaffen werden (z. B. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). Das Zytokin-Gen oder die Zytokin codierende Sequenz kann aus jeder geeigneten Quelle stammen, beispielsweise von irgendeiner Säugetierspezies, wie dem Menschen, isoliert sein. Vorzugsweise enthält das Zytokin-Gen oder die Zytokin codierende Sequenz jedoch eine GM-CSF-Sequenz, insbesondere ein humanes oder murines GM-CSF-Gen oder eine codierende Sequenz, einschließlich einer humanen oder murinen GM-CSF-cDNA-Sequenz (z. B. wie von Cantrell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 6250–6254 (1985), beschrieben).
In den erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren sind vorzugsweise alle geeigneten Transkriptions-, Translations- und Processing-Signale (z. B. Spleiß- und Polyadenylierungs-Signale) korrekt auf dem Vektor angeordnet, so dass das Zytokin-Gen oder die codierende Sequenz in den Tumorzellen, in die eingeführt wird, geeignet transkribiert und translatiert wird. Die Handhabung solcher Signale zur Sicherstellung der geeigneten Expression in Wirtszellen gehört zu den Kenntnissen und Fähigkeiten des Durchschnittsfachmannes. Während ein Zytokin-Gen von seinem eigenen Promotor gesteuert wird (i. e. operabel mit ihm verknüpft ist), kann zur Steuerung der Expression der Zytokin codierenden Sequenz ein anderer Promotor verwendet werden, darunter ein konstitutiver Promotor, wie beispielsweise der adenovirale Typ 2 (Ad2) oder Typ 5 (Ad5) starke späte Promotor (major late promoter, MLP) und dreiteilige Leader, der Cytomegalovirus (CMV) unmittelbar frühe Promotor/Enhancer, die Rous-Sarkomvirus langen terminalen Wiederholungen (RSV-LTR) und andere.
Alternativ kann ein gewebespezifischer Promotor (i. e. ein Promotor, der vorzugsweise in einem gegebenen Gewebe aktiviert wird und zur Expression eines Genproduktes in dem Gewebe, wo er aktiviert ist, führt) in dem Vektor verwendet werden. Solche Promotoren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: Elastase I-Gen-Kontrollregion, die in azinösen Pankreaszellen aktiv ist, wie von Swift et al., Cell, 38, 639–646 (1984), und MacDonald, Hepatology, 7, 425–515 (1987), be schrieben; die Insulin-Gen-Kontrollregion, die in pankreatischen Beta-Zellen aktiv ist, wie von Hanahan, Nature, 315, 115–122 (1985), beschrieben; der Hepatozyten-spezifische Promotor für Albumin oder α₁-Antitrypsin, von Frain et al., Mol. Cell. Biol., 10, 991–999 (1990), und Ciliberto et al., Cell, 41, 531–540 (1985), beschrieben; und die Albumin- und α₁-Antitrypsin-Gen-Kontrollregionen, die beide in Leber aktiv sind, wie von Pinkert et al., Genes and Devel., 1, 268–276 (1987), und Kelsey et al., Genes and Devel., 1, 161–171 (1987), beschrieben.
Ähnlich kann ein tumorspezifischer Promotor, wie das carcinoembryonales Antigen für Kolon-Karzinom, beschrieben von Schrewe et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738–2748 (1990), in dem Vektor verwendet werden. Entlang derselben Linien können Promotoren, die an unterschiedlichen Entwicklungsstufen selektiv aktiviert werden (z. B. Globingene werden in Embryonen und Erwachsenen unterschiedlich transkribiert) für die Gentherapie bestimmter Krebsarten verwendet werden.
Eine andere Option ist die Verwendung eines induzierbaren Promotors, wie des IL-8 Promotors, der auf TNF anspricht, oder des 6–16-Promotors, der auf Interferone anspricht, oder die Verwendung anderer ähnlicher Promotoren, die auf andere Zytokine oder andere Faktoren ansprechen, die in einem Wirt vorhanden sind oder exogen verabreicht werden können. Die Verwendung eines Zytokin-induzierbaren Promotors hat den zusätzlichen Vorteil, das autoinduzierbare Expression eines Zytokin-Gens ermöglicht wird. Gemäß dieser Erfindung kann jeder Promotor durch Mutagenese verändert werden, solange er die gewünschte Bindungsfähigkeit und Promotorstärke hat.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Zytokin wie oben definiert codiert, und der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Krebsbehandlung verwendet werden kann. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der eine GM-CSF codierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Vorzugsweise stellt die vorliegende Erfindung den als pcDNA 1/Neo bezeichneten Vektor bereit, der hier weiter beschrieben wird.
Erfindungsgemäß kann der rekombinante Vektor verwendet werden, um ein Zytokin-Gen oder eine Zytokin codierende Sequenz in vitro in eine Zelle zu transferieren, die vorzugsweise eine Zelle einer etablierten Tumorzelllinie ist, insbesondere einer pankreatischen Tumorzelllinie. Für den Transfer eines Vektors in Zellen in vitro können verschiedene Methoden angewendet werden. Solche Methoden umfassen beispielsweise Elektroporation, Membranfusion mit Liposomen, Hochgeschwindigkeits-Bombardement mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calciumphosphat-DNA-Präzipitat, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Infektion mit modifizierten viralen Nukleinsäuren, direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen und dergleichen. Andere Methoden stehen zur Verfügung und sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt also eine im Wesentlichen gereinigte Tumorzelllinie bereit, wobei die Zelllinie modifiziert wurde, um sie zur Produktion eines, verglichen mit der unmodifizierten Tumorzelllinie, erhöhten Levels eines Zytokins (vorzugsweise GM-CSF) zu befähigen.
Der von der modifizierten Tumorzelle produzierte Zytokin-Level ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung für das Erreichen einer immunstimulierenden Reaktion wichtig. Vorzugsweise produziert die modifizierte (z. B. transfizierte oder transformierte) Tumorzelllinie einen Zytokin-Level, der erhöht ist gegenüber dem bei der unmodifizierten (i. e. parentalen) Tumorzelllinie beobachteten. Bevorzugter produziert die modifizierte Zelllinie einen Zytokin-Level, der zu einer Zytokinsekretion von mehr als 35 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden führt.
Verabreichung der modifizierten Tumorzelllinie
Die „Verabreichung“ modifizierter Zellen der Tumorzelllinie an einen Säuger als Wirt bezieht sich auf die tatsächliche physische Einführung der modifizierten (i. e. Zytokin produzierenden) Tumorzellen in den Wirt. Erfindungsgemäß wird jedwede Methode des Einführens der modifizierten Tumorzellen in den Wirt in Betracht gezogen; das Verfahren hängt nicht von irgendwelchen speziellen Mitteln des Einführens ab und ist nicht so auszulegen. Mittel der Einführung sind den Fachleuten bekannt und werden hier auch als Beispiele angeführt.
Vorzugsweise wird die modifizierte Tumorzelllinie einem Wirt verabreicht, der mindestens einen Tumor (i. e. der Wirt kann mehr als einen Tumor haben) hat, der vom gleichen Typ ist wie der, von dem die Zelllinie erhalten wurde. „Gleicher Tumortyp“ umfasst Tumoren, die histologisch ähnlich sind, i. e. ähnlich hinsichtlich der Struktur und der Eigenschaften des behandelten Gewebes/Organs. Obwohl davon ausgegangen wird, dass die verabreichte Tumorzelllinie einige Antigene (z. B. Tumor-Antigene oder MHC-Antigene) mit dem Wirtstumor gemeinsam haben kann, ist es für die Zwecke dieser Erfindung nicht erforderlich, dass die verabreichte Tumorzelle und der Tumor des Wirts MHC-Antigene gemeinsam haben. Obwohl Tumor-Antigene zwischen der verabreichten Tumorzelllinie und dem Wirtstumor unterschiedlich sein können, wird es vorgezogen, dass genügend Gemeinsamkeit vorliegt, dass die Verabreichung der Tumorzelllinie eine systemische (i. e. eine T-Zell-vermittelte) Reaktion gegen den Wirtstumor bewirkt. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung die Verabreichung einer Tumorzelllinie, die zum Wirt allogen (i. e. genetisch unähnlich) ist und die nicht MHC-angepasst zum Wirt ist. Erfindungsgemäß ist eine Tumorzelllinie „nicht MHC-angepasst“ zu einem Wirt, wenn sie keine MHC-Antigene mit dem Wirt gemeinsam hat oder wenn sie keines der MHC-Antigene mit dem Wirt gemeinsam hat, die typischerweise MHC-angepasst sind, wenn Tumorzellvakzine (z. B. MHC Klasse I Antigene, insbesondere HLA-A2) verwendet werden.
Da die vorliegende Erfindung die parakrine Abgabe von Zytokinen an Tumoren in vivo vorsieht, wird die genetisch modifizierte Tumorzelllinie (z. B. die modifizierte pankreatische Tumorzelllinie) vorzugsweise in unmittelbarer Nähe des zu behandelnden Tumors verabreicht. Unter „unmittelbarer Nähe“ wird eine solche Distanz verstanden, dass das von der modifizierten Tumorzelle freigesetzte Zytokin in der Lage ist, seine therapeutische Wirkung auf einen Wirtszellentumor zu entfalten. Optimalerweise wird die modifizierte Tumorzelllinie nicht direkt in den Tumor selbst injiziert.
Vorzugsweise wird die modifizierte Tumorzelllinie (z. B. die modifizierte pankreatische Tumorzelllinie) vor der Verabreichung bestrahlt, um Zellreplikation und mögliche Tumorbildung in vivo zu verhindern. Für die Bestrahlung von Tumorzellen werden die Tumorzellen typischerweise in eine Gewebekulturplatte plattiert und bei Raumtemperatur unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle bestrahlt. Vorzugsweise werden die Zellen mit einer Dosisleistung von etwa 50 bis etwa 200 rad/min, bevorzugter etwa 120 bis etwa 140 rad/min, bestrahlt. Vorzugsweise werden die Zellen mit einer Gesamtdosis bestrahlt, die ausreichend ist, um die Mehrzahl der Zellen, i. e. vorzugsweise etwa 100% der Zellen, an der Proliferation in vitro zu hindern. Zweckmäßigerweise werden die Zellen also mit einer Gesamtdosis von etwa 10 000 bis 20 000 rad, optimal etwa 15 000 rad, bestrahlt.
Außerdem wird die modifizierte Tumorzelllinie (z. B. die transfizierte pankreatische Tumorzelllinie) optimalerweise vor der Verabreichung behandelt, um ihre Immunogenität zu erhöhen. Vorzugsweise beinhaltet diese Behandlung, wir hier beschrieben wird, weitere genetische Manipulation, wie beispielsweise das Einführen anderer Zytokine oder immun-co-stimulierender Funktionen oder beispielsweise das Vermischen mit nicht-spezifischen Adjuvantien, einschließlich, aber nicht darauf eingeschränkt, komplettes oder inkomplettes Freund-Adjuvans, aus bakteriellen und mycobakteriellen Zellwandkomponenten bestehende Emulsionen und dergleichen.
Methoden der Verwendung
Die allogenen Tumorzelllinien, insbesondere die allogenen pankreatischen Tumorzelllinien, können zum Impfen von Patienten mit histologisch ähnlichen Tumoren verwendet werden, um eine systemische Immunantwort gegen den eigenen Tumor des Patienten zu bewirken.
Um die Verabreichung zu vereinfachen, kann mit einer modifizierten allogenen Tumorzelllinie (i. e. einer modifizierten allogenen pankreatischen Tumorzelllinie) eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Implantat gemacht werden, die/das sich für die Verabreichung in vivo eignet, mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln, die außerdem pharmazeutisch unbedenklich sein können. Die Mittel zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung oder eines Implantates wurden auf dem Gebiet beschrieben, siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Mack, Hg. (1980). Wo dies passend ist, kann eine Tumorzelllinie zu einer Zubereitung in fester, halbfester, flüssiger oder gasförmiger Form, wie Tablette, Kapsel, Pulver, Körner, Salbe, Lösung, Suppositorium, Injektion, Inhalationsmittel oder Aerosol, auf die übliche Art für den jeweiligen Verabreichungsweg formuliert werden. Auf dem Gebiet bekannte Mittel können verwendet werden, um die Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung, ehe sie das Zielgewebe oder Zielorgan erreicht, zu verhindern oder zu minimieren, oder um die Freisetzung der Zusammensetzung zu einem bestimmten Zeitpunkt sicherzustellen. Vorzugsweise wird jedoch eine pharmazeutisch unbedenkliche Form verwendet, welche die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nicht unwirksam macht. Zweckmäßigerweise kann also mit einer modifizierten allogenen Tumorzelllinie (i. e. einer modifizierten allogenen pankreati schen Tumorzelllinie) eine pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt werden, die eine physiologische Salzlösung, vorzugsweise „Hank's Balanced“ Salzlösung, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt also eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger und eine Tumorzelllinie enthält. Vorzugsweise stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger und eine pankreatische Tumorzelllinie umfasst, insbesondere eine solche, worin die Tumorzelllinie Panc 10.5.92 ist, und speziell eine solche, worin die Tumorzelllinie, wie Panc 10.5.92, modifiziert wurde, um einen erhöhten Level an Zytokin, optimal GM-CSF, zu produzieren.
In pharmazeutischen Dosierungsformen kann eine Zusammensetzung allein oder in geeigneter Assoziation sowie in Kombination mit anderen pharmazeutischen Wirkstoffen und Behandlungsmethoden verwendet werden. Beispielsweise kann bei der Anwendung eines erfindungsgemäßen Mittels zur Behandlung von Krebs, insbesondere zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs, eine solche Behandlung zusammen mit anderen Mitteln der Behandlung von Krebs, insbesondere Bauchspeicheldrüsenkrebs, verwendet werden, z. B. chirurgische Entfernung, Bestrahlung, Chemotherapie und dergleichen.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedenen Wegen und an verschiedenen Stellen im Körper eines Säugers, insbesondere eines Menschen, abgegeben werden, um eine spezielle Wirkung zu erzielen. Obwohl mehr als ein Verabreichungsweg verwendet werden kann, wird der Fachmann erkennen, dass ein spezieller Weg eine direktere und wirksamere Reaktion als ein anderer bieten kann. Eine lokale oder systemische Abgabe kann durch Verabreichung erfolgen, umfassend Aufbringen oder Instillation der Formulierung in Körperöffnungen, Inhalation oder Einblasen eines Aerosols, oder parenterales Einführen, einschließlich intramuskulärer, intravenöser, intraportaler, intrahepatischer, peritonealer, subkutaner oder intradermaler Verabreichung. Vorzugsweise kann die Abgabe durch intradermale Verabreichung erreicht werden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in Einheitsdosierungsformen bereitgestellt werden, wo jede Dosierungseinheit, beispielsweise ein Teelöffel voll, eine Tablette, Lösung oder Suppositorium, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Wirkstoffen enthält. Der Ausdruck „Einheitsdosierungsform“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierungen für menschliche und tierische Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthält, und zwar allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, berechnet in einer ausreichenden Menge, um den gewünschten Effekt zu erzielen, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel, wo dies geeignet ist. Die Spezifizierungen für die neuen Einheitsdosierungsformen der vorliegenden Erfindung hängen von der mit der pharmazeutischen Zusammensetzung in dem speziellen Wirt verbundenen speziellen Pharmakodynamik zusammen.
Vorzugsweise ist eine ausreichende Anzahl der modifizierten Tumorzellen in der Zusammensetzung vorhanden und wird in den Wirt eingeführt, so dass die Expression von Zytokin durch die Wirtszelle und die anschließende Rekrutierung von APCs zur Tumorstelle zu einer stärkeren Immunantwort auf den vorhandenen Wirtstumor führt, als sie ansonsten in Abwesenheit einer solchen Behandlung erreicht würde, wie weiter hier erörtert. Folglich sollte die Menge an Wirtszellen, die verabreicht wird, den Verabreichungsweg berücksichtigen und so sein, dass eine ausreichende Anzahl von Tumorzellen eingeführt wird, so dass die gewünschte therapeutische (i. e. immunpotenzierende) Reaktion erreicht wird. Außerdem kann die Menge jedes Wirkstoffes, die in den hier beschriebenen Zusammensetzungen enthalten ist (z. B. die Menge pro zu kontaktierender Zelle oder die Menge pro Körpergewicht) in verschiedenen Anwendungen variieren. Im Allgemeinen sollte die Konzentration der modifizierten Tumorzellen vorzugsweise ausreichend sein, um mindestens etwa 1·10⁶ bis etwa 1·10⁹ Tumorzellen, bevorzugter etwa 1·10⁷ bis etwa 5·10⁸ Tumorzellen bereitzustellen, obwohl jede geeignete Menge entweder darüber, z. B. größer als 5·10⁸ Zellen, oder darunter, z. B. weniger als 1·10⁷ Zellen, verwendet werden kann.
Diese Werte geben eine allgemeine Richtlinie für den Bereich jeder Komponente, der von einem Praktiker nach dem Optimieren des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Durchführung der Erfindung verwendet werden kann. Das Anführen solcher Bereiche schließt keinesfalls die Verwendung einer größeren oder kleineren Menge einer Komponente aus, wie das in einer speziellen Anwendung gerechtfertigt sein mag.
Beispielsweise können die tatsächliche Dosis und das Schema in Abhängigkeit davon variieren, ob die Zusammensetzungen in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder in Abhängigkeit von interindividuellen Unterschieden hinsichtlich der Pharmakokinetik, der Verfügbarkeit des Wirkstoffes und des Metabolismus. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht die notwendigen Anpassungen gemäß den Anforderungen der speziellen Situation vornehmen. Außerdem kann die wirksame Menge der Zusammensetzungen weiter durch Analogie mit anderen Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie das Wachstum von Krebszellen, insbesondere Pankreaskrebszellen, hemmen, entsprechend bestimmt werden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet kennt auch Mittel zur Überwachung einer therapeutischen Reaktion (i. e. systemische Immunantwort) nach Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Insbesondere kann die therapeutische Reaktion dadurch überprüft werden, dass die Abschwächung des Tumorwachstums und/oder die Tumorregression überwacht wird. Die Abschwächung des Tumorwachstums oder die Tumorregression als Reaktion auf die Behandlung kann unter Verwendung verschiedener Endpunkte überwacht werden, die den Fachleuten bekannt sind, darunter beispielsweise die Zahl der Tumoren, die Tumormasse oder Tumorgröße oder die Reduktion/Verhinderung von Metastasen. Diese beschriebenen Methoden sind keinesfalls eine erschöpfende Aufzählung, und weitere Methoden, die für eine spezifische Anwendung geeignet sind, werden für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein.
Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, sollen aber keinesfalls als Einschränkung ihres Umfangs gesehen werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zum Erhalten und Kultivieren der allogenen Tumorzelllinien dieser Erfindung.
Es wurden 11 allogene pankreatische Tumorzelllinien von Patienten entwickelt, die sich am Johns Hopkins Hospital einer Pankreatoduodenektomie unterzogen. Diese Zelllinien wurden aus frischen humanen Bauchspeicheldrüsentumorexplantaten erzeugt, die zum Zeitpunkt der chirurgischen Resektion gewonnen wurden. Unmittelbar nach der Tumorresektion wurde die Probe auf Eis in einen sterilen Behälter gebracht und in eine Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube in einem Labor gebracht. Alle folgenden Manipulationen erfolgten unter Anwendung von sterilen Gewebekultur-Standardtechniken und unter Verwendung von Medien und Reagenzien von verschiedenen kommerziellen Lieferanten (z. B. JRH Biosciences (Lenexa, KS), Gibco BRL (Gaithersberg, MD), Hyclone Labs. (Logan, UT), Sigma Biosciences (St. Louis, MO), Cell Sys. Corp. (Kirkland, WA), Intergen Co. (Purchase, N. Y.), Eli Lilly and Co. (Indianapolis, IN), Biofluids, Inc. (Rockville, MD) und anderen Lieferanten, die ähnliche Produkte herstellen).
Der Teil des Tumors, der für die Isolierung von Tumorzelllinien verwendet werden sollte, wurde in kleine Stücke geschnitten, die etwa einige Millimeter Durchmesser hatten. Die Stücke wurden in eine etwa 15 mg Collagenase I enthaltende Lösung gebracht und bei 37°C in einem Schüttelinkubator zu Einzell-Suspensionen verdaut. Die Pankreastumorzellsuspensionen wurden dann 5minütiger Schwerkraft-Zentrifugierung ausgesetzt, um die Zellen zu pelletieren. Die Pellets wurden resuspendiert und plattiert durch Inokulieren in ein 25 cm² Gewebekulturgefäß mit etwa 1 bis 2·10⁶ lebensfähigen Zellen in RPMI-1640-Medium, das 20% fetales Rinderserum, 100 Einheiten (U) Humaninsulin pro 500 ml Medium und jeweils 5 μg Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 und 2 pro 500 ml Medium enthielt. Die Kulturen wurden in 25 cm² Gewebekulturgefäße gebracht und bei etwa 37°C in befeuchteten Inkubatoren mit etwa 5 bis 7% CO₂ inkubiert.
Primärzellkulturen wurden alle 5 bis 10 Tage einer differentiellen Trypsinisierung unterworfen, um die Hauptmenge der Stromazellen zu entfernen, die normalerweise Primärpankreastumorkulturen überwachsen. Es wurden verschiedene Tests herangezogen, um die resultierenden Tumorzelllinien zu charakterisieren und zu prüfen, ob maligne Epithelzellen vorhanden waren, im Vergleich zu Stromazellen und nichtmalignen Epithelzellen. Es wurde histochemische Anfärbung unter Verwendung von gegen Cytokeratin gerichteten Antikörpern durchgeführt, um Zellen epithelialen Ursprungs von Zellen mesenchymalen Ursprungs zu unterscheiden. Alle elf erhaltenen Tumorzelllinien wurden durch Cytokeratin-Anfärbung als primär oder ausschließlich aus Epithelzellen bestehend charakterisiert, wie in Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 1: Cytokeratin-Anfärbung von pankreatischen Zelllinien
Es wurden auch alle erzeugten Tumorzelllinien hinsichtlich der Beibehaltung der gleichen ras-Mutation bewertet, die in der ursprünglichen Tumorprobe vor der in vitro Kultur beobachtet wurde, um den malignen Ursprung der Zelllinie sowie die genetische Stabilität der Zelllinie in Kultur zu bestätigen. Wie die Tabelle 1 zeigt, wurde bestätigt, dass alle diese Linien eine ras-Mutation hatten, die mit der des ursprünglichen Tumors, von dem die Tumorzelllinie abgeleitet wurde, identisch war. In den Tumorzelllinien vorhandene Codon 12-Mutationen führten zu einer Asp→Gly-Umwandlung und Codon 13-Modifikationen führten zu einer Ser→Gly-Umwandlung im codierten ras-Onkoprotein. Außerdem wurde beobachtet, dass alle Tumorzelllinien hohe Level an MHC-Klasse I-Antigenen exprimierten. Zwei der vier Linien (i. e. Panc 10.5.92 und Panc 9.6.94) exprimieren auch erhöhte Level an MHC-Klasse II-Antigenen. Die pankreatischen Tumorzelllinien werden leicht in Kultur vermehrt und haben Verdopplungszeiten von etwa 72 Stunden.
Die in diesem Beispiel zur Ableitung von allogenen pankreatischen Tumorzelllinien verwendeten Verfahren können ebenso verwendet werden, um andere Arten allogener Tumorzelllinien zu erzeugen und zu isolieren.
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert das Verfahren der Modifizierung der allogenen Tumorzelllinien der vorliegenden Erfindung, um eine erhöhte Menge Zytokin zu produzieren. Da das Zytokin Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) bei der Erzeugung einer systemischen Reaktion gegen den Tumor in präklinischen Tumormodellen potentiell wirkungsvoller ist als andere Zytokine (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3539–3542 (1993)), wurde die im Beispiel 1 beschriebene Panc-Zelllinie 10.5.92 als repräsentativ für die allogenen Tumorzelllinien verwendet und modifiziert, um GM-CSF zu sezernieren.
Um dies zu erreichen, wurde ein rekombinantes, humanes GM-CSF-Gen in pcDNA 1/Neo kloniert. Alle Klonierungsreaktionen und DNA-Manipulationen wurden unter Verwendung von Methoden durchgeführt, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind und die auf dem Gebiet beschrieben wurden, z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)). In diesen Reaktionen verwendete Enzyme wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten (z. B. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA; Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN; etc.) und gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet.
Das Plasmid pcDNA 1/Neo enthält die humanes GM-CSF-Zytokin codierende Sequenz unter der Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors und das Neomycin-Resistenzgen, ebenfalls von einem separaten CMV-Promotor kontrolliert. Der CMV-Promotor wurde verwendet, weil er in der Lage ist, in den meisten eukaryotischen Zellen einen relativ hohen Level der Genexpression zu steuern (Boshart et al., Cell, 41, 521–530 (1985)). Anfängliche Studien unter Verwendung dieses Vektors für den Gentransfer zu einer humanen Melanomzelllinie bestätigen, dass nach Selektion hinsichtlich der Neomycin-Resistenz sezernierte Level an GM-CSF von mehr als 35 ng/106 Zellen/24 Stunden erreicht wurden. Diese anfänglichen Studien zeigen, dass das Plasmid pcDNA 1/Neo funktional ist. Zudem ist das die Dosis GM-CSF, die er forderlich ist, um in Mausmodellen geeignete Antitumor-Immunantworten zu erzeugen. Verdünnungsexperimente unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Tumorzellen, die mit einem ein GM-CSF-Gen tragenden retroviralen Vektor transduziert waren oder nicht, bestätigen, dass in dem B16-F10 Tumorsystem eine GM-CSF-Sekretion unterhalb von 35 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden eine potente Antitumorimmunität, die bei Leveln der Sekretion oberhalb dieses Schwellenwertes beobachtet wird, nicht erzeugen kann. Diese Feststellungen unterstreichen, dass es wichtig ist, dass hohe und aufrechterhaltene GM-CSF-Level direkt am Ort der impfenden Tumorzellen freigegeben werden, welche die Quelle des relevanten Tumorantigens sind.
Die Panc-Linie 10.5.92 wurde mit pcDNA 1/Neo durch Elektroporation transfiziert und anschließend durch limitierende Verdünnung kloniert. GM-CSF-Level wurden mittels ELISA bestimmt und mittels eines Bioassay unter Verwendung von GM-CSF-abhängigen TF-1-Zellen bestätigt (Kitamura et al., Blood, 73, 375–380 (1989)). Der für die resultierende transfizierte pankreatische Tumorzelllinie beobachtete Level der GM-CSF-Sekretion ist etwa 90 ng/10⁶ Tumorzellen/24 Stunden. Eine Bestrahlung der transfizierten Tumorzellen verhindert ihre Replikation, erlaubt aber, dass die Zellen GM-CSF sezernieren und bis zu einer Woche in Kultur metabolisch aktiv bleiben. Die Bestrahlung erfolgte unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle mit einer Dosisleistung von etwa 120–140 rad/min zur Abgabe einer Gesamtdosis von etwa 15000 rad.
Die in diesem Beispiel verwendeten Verfahren können auch herangezogen werden, um andere Tumorzelllinien zu erzeugen, die zur Produktion erhöhter Zytokinmengen befähigt sind und die ähnlich als Vakzine verwendet werden können.
Beispiel 3
Dieses Beispiel erläutert weitere Studien bezüglich der Verabreichung von GM-CSF an einen Wirt.
Weitere Studien bestätigen, dass die GM-CSF-Sekretion zur bekannten parakrinen Physiologie dieses Zytokins parallel sein muss. Insbesondere muss die Sekretion an der Stelle der relevanten Antigene (i. e. der Tumorzellen) sein, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, und hohe Level müssen mehrere Tage aufrechterhalten werden (Dranoff et al., supra; Golumbek et al., Cancer Research, 53, 1–4 (1993)).
Es scheint jedoch, dass die Tumorzelle selbst nicht die Quelle der GM-CSF-Sekretion sein muss (Golumbek et al., supra). Es können immunologischer Schutz und histologische Infiltrate erzeugt werden, die jenen ähnlich sind, die man bei retroviral transduzierten, Zytokin exprimierenden Tumorzellen sehen kann, wenn GM-CSF langsam aus bioabbaubaren Polymeren freigesetzt wird, die mit der Tumorzelle coinjiziert wurden. Außerdem kann immunologischer Schutz gegen beide Tumoren erzeugt werden, wenn ein zweiter, nicht kreuzreagierender Tumor mit einem GM-CSF sezernierenden Tumor co-injiziert wird. Das einfache Injizieren von löslichem GM-CSF zusammen mit Tumorzellen bietet jedoch nicht die aufrechterhaltenen lokalen Level dieses Zytokins und erzeugt keine systemische Immunität (Golumbek et al., supra). Es wurde also die Wirksamkeit der Verwendung einer allogenen Tumorzelle, die nicht zu dem Wirt MHC-angepasst war, für die Abgabe von Zytokin in vivo untersucht.
In murinen Modellen wurde gezeigt, dass die Antitumorimmunität, die durch die Abgabe von GM-CSF durch allogene Bystander-Tumorzellen erzeugt wurde, jener vergleichbar ist, die erreicht wird, wenn GM-CSF durch die Ziel-Tumorzelle selbst abgegeben wird. Speziell wurden in diesen Experimenten BALB/c-Mäuse subkutan mit bestrahlten CT26-Kolonkarzinomzellen geimpft, wobei GM-CSF durch retroviral transduzierte CT26-Zellen oder durch retroviral transduzierte B16-F10-Zellen abgegeben wurde. Zwei Wochen später wurden die Mäuse erneutem Challenge mit Injektionen vom Wildtyp-Stamm CT26 unterworfen. Die CT26-Tumorzelllinie hat intrinsische Immunogenität; es wurde jedoch ein größeres Ausmaß des Schutzes beobachtet, wenn GM-CSF an der Vakzinationsstelle sezerniert wurde, entweder durch die syngenen oder die allogenen Tumoren. Obwohl unklar ist, in welchem Ausmaß oder durch welchen Mechanismus die allogenen Tumorzellen die Antitumorimmunität erhöhen können, legen diese Daten dringend nahe, dass die allogene Abgabe von GM-CSF mindestens so wirksam wie die autologe Tumor-Abgabe sein dürfte.
Beispiel 4
Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Verabreichung der genetisch modifizierten allogenen Tumorzelllinien dieser Erfindung an einen Wirt.
Es werden Tumorzelllinien erhalten und verwendet, die GM-CSF-Level sezernieren, die größer als 35 ng/10⁶ Tumorzellen/24 Stunden sind. Die modifizierten Tumorzellen werden durch Trypsinisierung aus den Gewebekulturbehältern geerntet. Die Zellen werden unter Verwendung normaler Kochsalzlösung gewaschen, pelletiert und in „Hank's balanced“ Salzlösung oder einer anderen Salzlösung, die für das Einführen in vivo geeignet ist, resuspendiert. Die Zellen werden in einer Konzentration von etwa 1·10⁷ bis etwa 1·10¹⁰ Tumorzellen/ml resuspendiert, optimalerweise in einer Konzentration von etwa 1·10⁸ bis etwa 5·10⁹ Tumorzellen/ml. Etwa 0,1 ml dieser Resuspensionsmischung werden als Vakzin verwendet. Es werden also vorzugsweise etwa 1·10⁶ bis etwa 1·10⁹ Tumorzellen injiziert, optimalerweise etwa 1·10⁷ bis etwa 5·10⁸ Tumorzellen in toto. Während die modifizierten Tumorzellen bei der Maus subkutan injiziert werden, werden die Zellen bei Menschen vorzugsweise intradermal injiziert. Die Injektionen erfolgen vorzugsweise in der Nachbarschaft des Tumors; optimalerweise werden die Vakzine nicht direkt in den Tumor selbst injiziert. Die Mengen an Tumorzellen, die für die Vakzination bei Menschen verwendet werden, sind etwa 10 mal größer als die bei der Vakzination der Maus verwendeten Mengen.
Vor dem Injizieren können die modifizierten Tumorzellen beispielsweise unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle, wie im Beispiel 2 beschrieben, bestrahlt werden, um die Replikation der modifizierten Tumorzellen in vivo zu verhindern. Die modifizierten Tumorzellen können auch verändert werden, um ihre Immunogenität zu erhöhen. Beispielsweise können die Zellen weiter genetisch manipuliert werden (z. B. durch Inserieren anderer Zytokin- oder immunstimulierender Nukleinsäuresequenzen), oder sie können mit nichtspezifischen Adjuvantien vermischt werden (z. B. komplettes oder inkomplettes Freund-Adjuvans, aus bakteriellen und mycobakteriellen Zellwandkomponenten bestehende Emulsionen etc.).
Die Erfindung kann bei Säugern verwendet werden, insbesondere bei Menschen, die verschiedene Tumoren haben, beispielsweise ein Karzinom von Blase, Brust, Kolon, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Pankreas, Rektum oder Magen; einen hämatopoetischen Tumor lymphoider oder myeloider Abstammung; einen Tumor mesenchymalen Ursprungs, wie ein Fibrosarkom oder Rhabdomyosarkom; oder einen anderen Tumor, einschließlich Melanom, Teratokarzinom, Neuroblastom oder Gliom. Vorzugsweise kann die Erfindung zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs verwendet werden. Es wird auch davon ausgegangen, dass der Patient vor oder zusätzlich (i. e. gleichzeitig oder unmittelbar anschließend) zur Immuntherapie, wie hier beschrieben, mit irgendeiner Anzahl von Verfahren, wie sie zur Behandlung von Krebs verwendet werden, beispielsweise chirurgische Resektion, Bestrahlung, Chemotherapie und dergleichen, behandelt werden kann.
Obwohl diese Erfindung unter Betonung bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, ist für Durchschnittsfachleute offensichtlich, dass Variationen der bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können und dass beabsichtigt ist, dass die Erfindung anders als hier speziell beschrieben ausgeführt werden kann. Folglich umfasst diese Erfindung alle Modifikationen, die vom Umfang der Erfindung, wie sie durch die folgenden Ansprüche definiert ist, umfasst werden.

Claims

Verwendung einer Tumorzelllinie, die von einem Primärtumor erhalten wurde, die von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt wurde und die so modifiziert wurde, dass sie einen im Verhältnis zu der unmodifizierten Tumorzelllinie erhöhten Level eines Zytokins bildet, bei der Herstellung eines Arzneimittels oder Implantats zur Behandlung von Krebs in einem Säuger, der mindestens einen Tumor des gleichen Tumor-Typs wie der aufweist, von welchem die Tumorzelllinie erhalten wurde, wobei die Tumorzelllinie allogen und nicht MHC-angepasst zum Säuger ist.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach Anspruch 1, wobei die Tumorzelllinie von einem Primärtumor erhalten wurde durch: (a) Erhalten einer Auswahl von Tumorzellen aus einem Primärtumor eines Säugers, (b) Bilden einer Einzell-Suspension aus der Auswahl von Tumorzellen, (c) Pelletieren der Tumorzellen der Einzell-Suspension und (d) Ausplattieren der pelletierten Tumorzellen.
Verwendung einer pankreatischen Tumorzelllinie, die von einem pankreatischen Primärtumor erhalten wurde, die von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt wurde und die so modifiziert wurde, dass sie einen im Verhältnis zu der unmodifizierten Tumorzelllinie erhöhten Level eines Zytokins bildet, bei der Herstellung eines Arzneimittels oder Implantates zur Behandlung von Pankreaskrebs in einem Säuger, der mindestens einen Tumor des gleichen Tumor-Typs wie der Tumor aufweist, von welchem die Tumorzelllinie erhalten wurde, wobei die Tumorzelllinie allogen und nicht MHC-angepasst zum Säuger ist.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach Anspruch 3, wobei die pankreatische Tumorzelllinie aus einem pankreatischen Primärtumor erhalten wurde durch: (a) Erhalten einer Auswahl von Tumorzellen aus einem pankreatischen Primärtumor eines Säugers, (b) Bilden einer Einzell-Suspension aus der Auswahl von Tumorzellen, (c) Pelletieren der Tumorzellen der Einzell-Suspension und (d) Ausplattieren der pelletierten Tumorzellen.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Tumorzelllinie dem Säuger in vivo in enger Nähe zu dem mindestens einen Tumor verabreicht wird, der von dem Gleichen Tumor-Typ wie der ist, von welchem die Tumorzelllinie erhalten wurde.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Tumorzelllinie bestrahlt wird, bevor sie dem Säuger verabreicht wird.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Tumorzelllinie behandelt wird, um ihre Immunogenität zu erhöhen, bevor sie dem Säuger verabreicht wird.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach Anspruch 7, wobei die Tumorzelllinie durch genetische Manipulation oder mittels eines Zusatzes mit einem Hilfsmittel behandelt wird, bevor sie dem Säuger verabreicht wird.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Tumorzelllinie eine Mutation in einem Oncogen oder Tumorsuppressor-Gen umfasst.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach Anspruch 9, wobei die Mutation in einem ras-Gen liegt.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach Anspruch 10, wobei die Tumorzelllinie eine Mutation im Kodon 12, 13 oder 61 des H-ras, K-ras oder N-ras umfasst und Zelloberflächen-Zytokeratine und MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Antigene exprimiert.
Verwendung einer Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Zytokin GM-CSF ist.
Aufgereinigte pankreatische Tumorzelllinie, die von einem pankreatischen Primärtumor stammt und die von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt ist.
Aufgereinigte pankreatische Tumorzelllinie, die von einem pankreatischen Primärtumor stammt und die erhältlich ist durch: (a) Erhalten einer Auswahl von Tumorzellen aus einem pankreatischen Primärtumor eines Säugers, (b) Bilden einer Einzell-Suspension aus der Auswahl von Tumorzellen, (c) Pelletieren der Tumorzellen der Einzell-Suspension und (d) Ausplattieren der pelletierten Tumorzellen in einem Wachstumsmedium, das fötales Serum, Insulin und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren 1 und 2 umfasst, wobei die aufgereinigte pankreatische Tumorzelllinie von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt wird.
Pankreatische Tumorzelllinie nach Anspruch 14, wobei das Wachstumsmedium fötales Serum, Insulin in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 1,0 U/ml, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml umfasst.
Pankreatische Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 13–15, wobei die pankreatische Tumorzelllinie so modifiziert wurde, dass sie einen im Vergleich zu der unmodifizierten pankreatischen Tumorzelllinie erhöhten Level eines Zytokins bildet.
Pankreatische Tumorzelllinie nach Anspruch 16, wobei das Zytokin GM-CSF ist.
Pankreatische Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 13–17, wobei die pankreatische Tumorzelllinie eine Mutation im Kodon 12, 13 oder 61 des N-ras, K-ras oder N-ras umfasst und Zelloberflächen-Zytokeratine und MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Antigene exprimiert.
Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und Zellen der pankreatischen Tumorzelllinie nach einem der Ansprüche 13–18.
Verfahren zum Erhalten einer pankreatischen Tumorzelllinie, die von einem pankreatischen Primärtumor stammt und die von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Verwenden einer Auswahl von Tumorzellen, die von einem pankreatischen Primärtumor eines Säugers erhalten wurden, (b) Bilden einer Einzell-Suspension aus der Auswahl von Tumorzellen, (c) Pelletieren der Tumorzellen der Einzell-Suspension und (d) Ausplattieren der Tumorzellen in einem Wachstumsmedium, umfassend fötales Serum, Insulin und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren 1 und 2, woraufhin eine pankreatische Tumorzelllinie erhalten wird, die von einem pankreatischen Primärtumor stammt und von Stroma- und nicht karzinomatösen Epithelzellen gereinigt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Wachstumsmedium Insulin in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 1,0 U/ml, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml umfasst.
Wachstumsmedium zum Kultivieren pankreatischer Primärtumorzellen, umfassend Insulin in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 1,0 U/ml, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 in einer Konzentration von ungefähr 0,005 bis 0,05 μg/ml.