DE60128070T2

DE60128070T2 - Impfstoff spezifisch gegen nierentumore, gerichtet gegen das antigen g-250 des nierentumors

Info

Publication number: DE60128070T2
Application number: DE60128070T
Authority: DE
Inventors: Arie Los Angeles BELLDEGRUN; Cho-Lea Torrance TSO
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2000-02-14
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: DE60128070D1; US20100129313A1; ATE360430T1; AU2001236967A1; US20160376556A1; US9409965B2; US20180371411A1; US10035981B2; US7572891B2; EP1255554A2; US8741306B2; EP1255554A4; US20150010587A1; ES2286104T3; WO2001060317A3; EP1255554B1; US20020058041A1; WO2001060317A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Onkologie. Speziell gewährt die vorliegende Erfindung neuartige Impfstoffe zur Verwendung bei der Behandlung von klarzelligen Nierenkarzinomen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das klarzellige Nierenkarzinom (RCC), das oftmals auch bezeichnet wird als Nierenkrebs, "hypernephrom" oder Adenkarzinom der Niere macht etwa 85% aller primären renalen Neoplasmen aus. Jährlich werden näherungsweise 25.000 neue Fälle mit 10.000 Todesfällen in den Vereinigten Staaten diagnostiziert. Bedauerlicherweise bleibt die Prognose von Patienten mit rekurrierenden oder metastatischen klarzelligen Nierenkarzinom gering. Die Chemotherapie und Radiotherapie haben bei dieser Erkrankung keine oder eine nur geringe Wirkung und es gibt keinerlei Standard-Chemotherapie, hormonelle oder immunologische Programme bei rekurrierendem oder metastatischem Nierenkrebs.
Die im Allgemeinen zum Einsatz gelangenden Programme der Chemotherapie umfassen die Verwendung von Vinblastinsulfat mit oder ohne Verwendung von Nitrosoharnstoffen. Interferone sind mit sehr begrenztem Erfolg angewendet worden. Interleukin 2 (Aldesleukin) ist für die Behandlung ausgewählter Patienten mit metastatischem klarzelligen Nierenkarzinom anerkannt. Bei 255 Patienten ist eine Gesamt-Ansprechrate von 15% festgestellt worden, die jedoch sowohl von schweren Nebenreaktionen begleitet war als auch einigen behandlungsbedingten Todesfällen. Andere Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung befinden sich bestenfalls im Untersuchungsstadium.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gewährt eine neue Vorgehensweise für die Behandlung von klarzelligen Nierenkarzinomen. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung die Entdeckung, dass ein chimäres Molekül, das einen granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) gebunden an dem nierenkrebsspezifischen Antigen G250 aufweist, ein hochwirksames "Vakzin" liefert, welches zu einer Immunantwort führt, die direkt gegen klarzelligen Nierenkrebs gerichtet ist. Dieses chimäre Molekül kann als ein traditionelles Vakzin oder bei adoptiven immuntherapeutischen Anwendungen eingesetzt werden. Nucleinsäuren, die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein codieren, können als bloße DNA-Vakzine verwendet werden oder können verwendet werden, um eine Zelle in ein adoptives immuntherapeutisches Behandlungsprogramm zu transfizieren.
Die vorliegende Erfindung gewährt daher in einer der Ausführungsformen ein Konstrukt, welches ein nierenkrebsspezifisches Antigen G250 gebunden an einen granulozytenmokrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist. Der GM-CSF ist bevorzugt ein Human-GM-CSF oder ein biologisch aktives Fragment und/oder Mutant davon. Ähnlich ist das G250-Antigen bevorzugt ein Human-G250-Antigen. In einer der bevorzugten Ausführungsformen ist das G250-Antigen kovalent an dem GM-CSF gebunden (direkt oder über einen Linker). Bevorzugte Linker werden durch die Nucleotidsequenz gcggcg codiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind das G250-Antigen und der GM-CSF Komponenten eines Fusionsproteins (chemisch aufgebaut oder rekombinant exprimiert). In derartigen Fusionsproteinen sind das G250-Antigen und der GM-CSF direkt verbunden oder mehr bevorzugt über einen Peptid-Linker einer Länge im Bereich von 2 bis etwa 50 und mehr bevorzugt von etwa 2 bis etwa 20 und am meisten bevorzugt von etwa 2 bis etwa 10 Aminosäuren gebunden. Einer der bevorzugten Peptid- Linker ist -Arg-Arg-. Einer, der besonders bevorzugt ist, hat die SEQ ID Nr. 1 (ausgenommen das His₆-Tag).
In einer anderen Ausführungsform gewährt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, welche die hierin beschriebenen chimären Moleküle aufweist, sowie ein pharmazeutisch duldbares Streckmittel oder einen solchen Exizipienten.
Ebenfalls gewährt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure (z.B. eine DNA oder eine RNA), die ein Fusionsprotein codiert, welches ein nierenkrebsspezifisches Antigen G250 gebunden an dem granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist. Das G250 ist vorzugsweise ein Human-G250 (oder ein antigenes Fragment oder ein krebsspezifisches Epitop davon). In ähnlicher Weise ist der GM-CSF bevorzugt ein Human-GM-CSF oder ein biologisch wirksames Fragment davon. In einer der bevorzugten Ausführungsformen codiert die Nucleinsäure ein Fusionsprotein, worin das G250-Antigen und der GM-CSF direkt gebunden oder mehr bevorzugt über einen Peptidlinker einer Länge im Bereich von 2 bis etwa 50 und mehr bevorzugt von etwa 2 bis etwa 20 und am meisten bevorzugt von etwa 2 bis etwa 10 Aminosäuren gebunden sind. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nucleinsäure vorzugsweise einen Linker codieren, bei dem es sich um einen -Arg-Arg- handelt. Eine der bevorzugten Nucleinsäuren ist die Nucleinsäure SEQ ID Nr.: 2. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure eine Nucleinsäure, die das Polypeptid von SEQ ID Nr.: 1 codiert. Die Nucleinsäure ist bevorzugt eine Expressionskassette, und in bestimmten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure in einem Vektor vorhanden (z.B. einen Baculovirus-Vektor).
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls eine Wirtszelle, die mit einer oder mit mehreren der Nucleinsäuren transfiziert ist, wie sie hierin beschrieben wurden. Bevorzugt ist die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle und am meisten bevorzugt eine Insektenzelle.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls Verfahren zum Herstellen eines Antitumorvakzins. Die Verfahren umfassen bevorzugt ein Inkultumehmen einer mit einer Nucleinsäure transfizierten Zelle, die ein chimäres GM-CSF-G250-chimäres Molekül unter Bedingungen codiert, unter denen die Nucleinsäure ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein exprimiert, sowie das Gewinnen des Fusionsproteins. Wiederum ist die Zelle vorzugsweise eine eukaryotische Zelle und mehr bevorzugt eine Insektenzelle (z.B. ein SF9).
In einer anderen Ausführungsform gewährt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen das G250-nierenspezifische Antigen und/oder eine Zelle, die das G250-nierenspezifische Antigen zeigt und/oder irgendeine Krebszelle, die ein G250-Antigen exprimiert und/oder eine Antigen-Kreuzreaktion mit einem G250-Antigen. Die Verfahren umfassen das Aktivieren einer Zelle des Immunsystems mit einem Konstrukt, welches ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250) gebunden an einen granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist, wodurch das Aktivieren eine Immunreaktion gewährt, die sich gegen das G250-Antigen richtet. In einigen Ausführungsformen umfasst das Aktivieren das Kontaktieren eines Antigens, das eine Zelle darstellt (z.B. ein Monozyt oder eine dendritische Zelle), mit dem Konstrukt (chimäres Molekül). In bestimmten Ausführungsformen ist die aktivierte Zelle ein zytotoxisches T-Lymphozyt (CTL) oder ein tumorinfiltrierendes Lymphozyt usw. Das Aktivieren kann auch das Kontaktieren eines Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) oder einen tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit dem Konstrukt umfassen.
Das Kontaktieren kann in vivo oder ex vivo (z.B. in vitro) stattfinden. In zahlreichen Ausführungsformen umfasst das Aktivieren das Laden eines Antigens, das eine Zelle darstellt (APC), mit einem ein G250 aufweisenden Polypeptid. Die Aktivierung kann auch das Transfizieren einer Zelle (z.B. ein PBL, ein APC, ein TIL, eine klarzellige Nierentumorzelle usw.) mit einer Nucleinsäure umfassen, die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein codiert. Das Verfahren kann ferner das Infundieren von Zellen (z.B. zytotoxische T-Lymphozyten) zurück in den Säuger umfassen.
In einer noch anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Hemmen der Proliferation oder des Wachstums einer transformierten (z.B. neoplastischen) Nierenzelle gewährt. Das Verfahren umfasst das Aktivieren einer Zelle des Immunsystems mit einem Konstrukt, das ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250) gebunden an dem granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist, wodurch das Aktivieren eine Immunreaktion vermittelt, die gegen das G250-Antigen gerichtet ist und die Immunreaktion das Wachstum oder die Proliferation einer transformierten Nierenzelle hemmt. In einer der bevorzugten Ausführungsformen ist die transformierte Nierenzelle eine klarzellige Nierenkrebszelle (z.B. ein massiver Tumor, ein disperser Tumor oder eine metastatische Zelle). Das Aktivieren kann das Kontaktieren eines Antigens, das eine Zelle darstellt (z.B. eine dendritische Zelle) mit dem Konstrukt umfassen. In die aktivierte Zelle einbezogen können beispielsweise die Folgenden sein, ohne auf diese beschränkt zu sein: ein zytotoxisches T-Lymphozyt (CTL), ein tumorinfiltrierendes Lymphozyt (TIL) usw. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Aktivieren das Injizieren (oder das Verabreichen auf andere Weise) an einem Vertreter der Säuger ein oder mehrere der Folgenden: ein Polypeptid, welches ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist: dendritische Zellen, gepulst mit einem GM-CSF-G250-Fusionsprotein; ein Gentherapie-Konstrukt (z.B. Adenvirus, "Gutless"-Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus, Adeno-assoziiertes Virus, Vakciniavirus usw.), welches eine Nucleinsäure aufweist, die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein codiert, einen ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimierenden Dendriten, eine Tumorzelle (z.B. RCC), die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimiert, einen Fibroblast, der ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimiert, eine nackte GM-CSF-G250-DNA, ein Transfektionsreagenz (z.B. ein kationisches Lipid, ein Dendrimer, ein Liposom usw., die eine Nucleinsäure enthalten oder mit dieser komplex gebunden sind, die ein GM-CSF-G250-Polypeptid codiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Aktivieren das Aktivieren isolierter Dendritzellen/PMBCs. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Aktivieren das Kontaktieren (in vivo oder ex vivo) eines Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) oder eines tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit dem Konstrukt. Die peripheren Blutzellen und/oder dendritischen Zellen und/oder Monozyten werden vorzugsweise in den Patienten infundiert.
Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem ein Verfahren zum Hemmen der Proliferation oder des Wachstums einer transformierten Nierenzelle, die ein G250-Antigen trägt. Das Verfahren umfasst das Entfernen einer Immunzelle aus einem Wirt eines Vertreters der Säuger; das Aktivieren der Immunzelle durch Kontaktieren der Zelle mit einem Protein, das ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250) gebunden an dem granulozytenmakrophargenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder ein Fragment davon aufweist; wahlweise das Expandieren der aktivierten Zelle; und das Infundieren der aktivierten Zelle in einen Organismus, der eine transformierte Nierenzelle enthält, die ein G250-Antigen trägt. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Aktivieren das Kontaktieren der Zelle mit einem oder mehreren der Folgenden: mit einem Polypeptid, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist; mit dendritischen Zellen, gepulst mit einem GM-CSF-G250-Fusionsprotein; ein Gentherapie-Konstrukt (z.B. Adenvirus, "Gutless"-Adenovirus, Retrovirus, Lantivirus, Adeno-assoziiertes Virus, Vakzinvirus usw.), welches eine Nucleinsäure aufweist, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein codiert, ein Dendrit, der ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimiert, eine Tumorzelle (z.B. RCC), die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimiert, einen Fibroblast, der ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein exprimiert, eine GM-CSF-G250-nackte DNA, ein Transfektionsreagenz (z.B. kationisches Lipid, Dendrimer, Liposom usw., die eine Nucleinsäure enthalten oder komplex gebunden sind mit dieser, die ein GM-CSF-G250-Polypeptid codiert). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Aktivieren das Aktivieren isolierter dendritischer Zellen/PMBCs. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Aktivieren das Kontaktieren (in vivo oder ex vivo) eines Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) oder eines tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit diesem Konstrukt. Die Zellen des peripheren Bluts und/oder dendritische Zellen und/oder Monozyten werden vorzugsweise in den Patienten infundiert. Das Entfernen kann das Isolieren und Inkultumehmen von Lymphozyten und/oder Monozyten aus peripherem Blut und/oder dendritischen Zellen aus dem Wirt des Vertreters der Säuger umfassen. Die Infusion kann das Infundieren der kultivierten Zellen oder aktivierter Zellen umfassen, die unter Verwendung der kultivierten Zellen erzeugt wurden, und zwar in den Wirt, aus welchem die Immunzellen entnommen wurden.
In einer noch anderen Ausführungsform gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten, der einen klarzelligen Nierenkrebs hat. Das Verfahren umfasst das Sensibilisieren von antigenpräsentierenden Zellen (z.B. PBMCs, dendritische Zellen usw.) in vitro mit einer zur Sensibilisierung wirksamen Menge eines chimären Fusionsproteins, welches ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250) gebunden an dem granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist; und das Verabreichen an einen Patienten, der klarzelligen Nierenkrebs hat oder Metastasen, einer therapeutisch wirksamen Menge der das sensibilisierte Antigen präsentierenden Zellen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die das Antigen präsentierenden Zellen in Bezug auf die Person autolog oder allogen mit angepasster MHC. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Sensibilisieren das Kontaktieren von Lymphozyten oder Monozyten des peripheren Bluts oder von dendritischen Zellen mit G250-GM-CSF-Fusionsprotein. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Sensibilisieren das Kontaktieren von PBL, TIL, Monozyten, dendritischen Zellen mit einem G250-GM-CSF-Polypeptid und/oder das Transfektieren dendritischer Zellen, APC, RCC, Fibroblasten, mit einer Nucleinsäure, die das chimäre Fusionsprotein codiert.
DEFINITIONEN
Der Begriff "G250-GM-CSF" bezieht sich auf chimäres Molekül, welches ein nierenkrebsspezifisches Antigen G250 gebunden an einem granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor aufweist. Bei der Bindung kann es sich um eine chemische Konjugation (direkt oder über einen Linker) handeln, oder das chimäre Molekül kann ein Fusionsprotein sein (rekombinant exprimiert oder zusammengesetzt durch Kondensation der zwei betreffenden Moleküle). Die Bezeichnung "G250-GM-CSF" umfasst Ausführungsformen, wo das G250 und der GM-CSF terminal gebunden sind oder an einer inneren Stelle und umfasst die Bindung des G250-Moleküls entweder an dem Amino-Terminus oder Carboxyl-Terminus des GM-CSF. Darüber hinaus kann der Begriff chimäre Moleküle umfassen, die Fragmente oder Mutanten von G250 aufweisen, wobei die G250-Fragmente das Epitop erhalten, welches durch Antikörper erkannt wird, die speziell auf klarzellige Karzinoms zielen, die das G250-Antigen tragen. In ähnlicher Weise kann der Begriff chimäre Moleküle umfassen, welche Fragmente oder Mutanten von GM-CSF aufweisen, wo der GM-CSF die biologische Wirksamkeit des nativen GM-CSF bewahrt (z.B. durch Rezeptoren erkannt wird, welche den nativen GM-CSF erkennen, und/oder ähnliche mitogene Aktivität zeigt, usw.).
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Polymer von Aminosäure-Resten zu bezeichnen. Die Begriffe gelten für Aminosäure-Polymere, bei denen ein oder mehrere Aminosäure-Reste ein künstliches chemisches Analog einer entsprechenden, in der Natur auftretenden Aminosäure sind, sowie natürlich auftretende Aminosäure-Polymere. In den Begriff einbezogen sind auch Varianten der traditionellen Peptidbindung, welche die Aminosäuren vereint, die das Polypeptid aufbauen.
Die Begriffe "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotid" oder grammatikalische Äquivalente beziehen sich hierin auf 'mindestens zwei miteinander kovalent gebundener Nucleotide. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise einsträngig oder doppelsträngig und wird in der Regel Phosphodiester-Bindungen enthalten, obgleich in einigen Fällen, wie nachfolgend ausgeführt wird, Nucleinsäure-Analoga einbezogen sind, die andere Grundgerüste haben können, aufweisend beispielsweise Phosphoramid (Beaucage et al. (1993), Tetrahedron 49(10):1925) und Fundstellen hierin; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsingeret al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; and Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), Phosphorthioat (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; und US-Paten-5 644 048 ), Phosphordithioat (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321, O-Methylphophoroamidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides und Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), und Peptid-Nucleinsäure-Gerüste und Bindungen (siehe Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Andere analoge Nucleinsäuren schließen solche mit positiven Grundgerüsten ein (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097); nichtionische Grundgerüste ( US-P-5 386 023 , 5 637 684 , 5 602 240 , 5 216 141 und 4 469 863 ; Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsingeret al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) sowie Non-ribose-Grundgerüste, einschließlich solche, wie sie beschrieben wurden in den US-P-5 235 033 und 5 034 506 , und in den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui und P. Dan Cook. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbocyklische Zucker enthalten, sind ebenfalls in die Definition von Nucleinsäuren einbezogen (siehe Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. S. 169–176). Mehrere Nucleinsäuren wurden beschrieben in Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, S. 35. Diese Modifikationen des Ribosephosphat-Grundgerüsts können zur Erleichterung der Hinzufügung weiterer Teile vorgenommen werden, wie beispielsweise Etikette oder um die Stabilität und Halbwertzeit derartiger Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
Der Begriff "Immunzelle" bezieht sich auf eine Zelle, die zur direkten oder indirekten Teilnahme an einer Immunantwort in der Lage ist. Immunzellen schließen T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen, zytotoxische T-Zellen, turmorinfiltrierende Lymphozyten usw. ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Aktivieren" (z.B. Aktivieren einer Zelle oder Aktivieren einer Immunantwort) eine direkte Aktivierung durch Kontakt mit dem Konstrukt oder durch indirekte Aktivierung durch Kontakt mit dem Konstrukt oder antigenen Fragment über ein Antigenpräsentierende Zelle (z.B. eine dendritische Zelle) ein.
Ein "Fusionsprotein" bezeichnet ein Polypeptid, das durch Vereinen der zwei oder mehreren Polypeptide über eine Peptidbindung gebildet wird, die zwischen dem Amino-Terminus des einen Polypeptids und dem Carboxyl-Terminus des anderen Polypeptids gebildet wird. Das Fusionsprotein kann durch chemisches Koppeln der aufbauenden Polypeptide gebildet werden oder kann als ein einzelnes Polypeptid von einer Nucleinsäuresequenz ausgedrückt werden, die ein einzelnes aufbauendes Fusionsprotein codiert. Ein einzelnes Fusionsprotein ist ein Fusionsprotein, das über ein einzelnes aufbauendes Polypeptid-Gerlist verfügt.
Ein "Spacer" oder "Linker", wie hierin in Verbindung mit einem Fusionsprotein verwendet, bedeutet ein Peptid, das die Proteine vereint, die das Fusionsprotein ausmacht. Im Allgemeinen hat ein Spacer keine biologische Aktivität außer das Vereinen der Proteine oder die Bewahrung eines gewissen Mindesabstandes oder anderer räumlicher Beziehungen zwischen ihnen. Die einen Teil eines Spacers bildenden Aminosäure lassen sich auch so auswählen, dass eine bestimmte Eigenschaft des Moleküls beeinflusst wird, wie beispielsweise das Falten, die Nettoladung oder die Hydrophobizität des Moleküls.
Ein "Spacer" oder "Linker", wie hierin in Verbindung mit einem chemisch konjugierten chimären Molekül verwendet, bezeichnet jedes beliebige Molekül, welches die aufbauenden Moleküle des chemisch konjugierten chimären Moleküls verknüpft/verbindet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht eine RT-PCR-Analyse von RCC-Tumorzellen:
2 veranschaulicht eine FACS-Analyse von dendritischen Zellen, deriviert von anhaftenden PBMC-Kulturen.
3 veranschaulicht die Hinaufregulation von HLA-Antigen in dendritischen Zellen durch GM-CSF-G250-Fusionsprotein.
4 veranschaulicht die Cytotoxizität von Masse-PMBC, moduliert durch G250-GM-CSF-Fusionsprotein (Patient 1).
5 veranschaulicht die Cytotoxizität von Masse-PBMC, moduliert durch GM-cSF/G250-Fusionsprotein (Patient 2).
6A, 6B und 6C veranschaulichen die Expression und Reinigung von GM-CSF-G250-Fusionsprotein, wobei 6A ein immunohistochemisches Anfärben für G250- und GM-CSF-Expression mit Anti-G250 und Anti-GM-CSF-Antikörpern-Sf-9-Zellen infektiert mit und ohne Fusionsgen rekombinantem Baculovirus in 100-facher Vergrößerung. 6B zeigt eine Western-Blot-Analyse von 6xHis-markierten GM-CSF-G250-Fusionsprotein, eluiert aus einer Ni-NTA-Affinitätssäule unter Verwendung von Anti-GM-CSF-Antikörper (L = Laden, BT = Durchbruch, W = Wäsche). 6C zeigt ein mit Coomassiv-Blau gefärbtes SDS-PAGE von Fusionsprotein, eluiert aus einer Ni-NTA-Affinitätssäule (Spur 1) und weiter gereinigt mit SP-Sepharose/FPLC (Spur 2 und Spur 3).
7A und 7B zeigen einen Vergleich der funktionellen Aktivität von rekombinantem GM-CSF und gereinigtem GM-CSF-G250-Fusionsprotein. Die GM-CSF-Aktivität wurde unter Verwendung der GM-CSF-abhängigen Human-Zelllinie, TF-1 gemessen. Die TF-1-Zellen (2 × 104/Mulde/ml) wurden in Gegenwart von seriell verdünnter Menge von (7A) rekombinantem GM-CSF kultiviert oder (7B) wie angegeben vom GM-CSF-G250-Fusionsprotein gereinigt. Nach 5-tägigen Inkubation wurden die Kulturen mit 0,1 mCi tritiiertem Thymidin für weitere 12 Stunden gepulst. Die Kulturen wurden sodann geerntet und das eingebaute Thymidin durch Szintilationszählen gemessen.
8A, 8B und 8C zeigen die immunmodulatorischen Wirkungen von Fusionsprotein auf dendritische Zellen. 8A zeigt eine Zweifarben-durchflusszytometrische Analyse dendritischer Zellen, die aufgezogen sind in GM-CSF (800 U/ml) plus IL-4 (1.000 U/ml) oder Fusionsprotein (FP) plus IL-4. Die Zellen wurden mit FITC und PS-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmarkern von DC wie angegeben markiert. Die Zellen, die größer waren als Lymphozyten wurden selektiv gesperrt, und negative Kontrollen entsprachen dem Markieren mit einem Isotyp-angepassten Kontroll-Antikörper. Diese Analyse ist repräsentativ für 5 DC-Kulturen. 8B zeigt eine durchflusszytometrische Analyse von HLA-Antigenen von DC, aufgezogen in GM-CSF plus IL-4 oder Fusionsprotein plus IL-4. Mit primärem Antikörper (HLA Klasse I oder Klasse II) markierte Zellen und FITC-konjugierte sekundäre Antikörper. Diese Analyse ist repräsentativ für vier verschiedene DC, deriviert von vier RCC-Patienten. 8C zeigt eine zweifarbige durchflusszytometrische Analyse von DC, exprimiert CD83⁺ CD19^-, die unter den angegebenen Bedingungen kultiviert wurden. Die Daten bedeuten ein Triplikat; Säulen, SD. Diese Analyse ist repräsentativ für vier verschiedene DC, deriviert von vier RCC-Patienten.
9 zeigt einen Zeitverlauf der Cytokin-mRNA-Expression in PBMC, das mit einem GM-CSF-G250-Fusionsprotein (FP) (2,7 mg/107 Zellen) für unterschiedliche Zeitdauer entsprechend den Angaben behandelt und anschließend für die halbquantitative RT-PCR-Analyse geerntet wurde. Die 32P-markierten PCR-Produkte wurden mit Hilfe der Elektrophorese durch ein 7%iges Acrylamid-Gel getrennt. Die Gele wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Es wurde ein titrierter Standard aus verdünnten RNA-Proben extrahiert aus PBMC, behandelt mit FP für 24 Stunden hergesellt.
10A, 10B und 10C zeigen das Wachstum und die Cytotoxizitätsprofile von patientenderivierter PBMC, stimuliert mit GM-CSF-G250-Fusionsprotein. 10A zeigt die Wachstumsausdehnung von PBMC (Patient #1), induziert durch verschiedene immunmodulatorische Strategien entsprechend den Angaben. Es wurden Zellkulturen mit FP am Tag 0, Tag 6, Tag 12 und Tag 18 stimuliert. Das Kulturmedium wurde wöchentlich ausgewechselt, wobei jedoch das Volumen konstant gehalten wurde. Die Zellzählungen wurden am Tag 20 vorgenommen. Die Expansion wurde berechnet durch Division der abschließenden Zellzahlen pro ml mit Zellzahlen pro ml beimpft am Tag 0 (3 × 105 Zellen/ml). Die Daten sind Mittelwerte des Triplikats; Säulen, SD. Diese Analyse ist repräsentativ für vier verschiedene PBMC-Kulturen, deriviert von vier RCC-Patienten, die ein ähnliches Wachstumsprofil zegten. 10B zeigt die Cytotoxizität von PBMC (Patient #1) gegen autologe normale Nierenzellen, primäre Tumorzellen und Lymphknoten-derivierte Tumorzellen. Die Cytotoxizität wurde ermittelt mit Hilfe eines 18-h 51 Cr-Freisetzungsassays am Tag 21. Die tötende Wirksamkeit wurde ausgedrückt in Form von lytischen Einheiten pro 106 Effektorzellen. Die lytischen Einheiten sind als die Zahl von Effektorzellen definiert, die zum Induzieren von 30% Lyse in der Lage sind. Die spontane Freisetzung für ein Tumortarget betrug < 20% der maximalen Freisetzung. Die Daten sind Mittelwerte des Triplikats; Säulen, SD. 10C zeigt die Hemmung der Cytotoxizität gegen autologe LN-Tumorzellen durch Antikörper, spezifisch auf T-Zellen und HLA-Antigene. Die Tumor-Targetzellen oder PBMC wurden vorbehandelt mit dem entsprechenden Antikörper entsprechend den Angaben vor dem Cytotoxizitätsassay. Daten, Mittelwerte des Triplikats; Säulen, SD. D; hat quantitative RT-PCR-Analyse von G250-mRNA-Expression durch normale Niere, primären Tumor und LN-derivierten Tumor vom Patienten #1.
11A und 11B zeigen Fusionsprotein, induziert, G250-markiert und MHC-beschränkte T-Zellenimmunität. 11A zeigt Cytotoxizität von PBMC gegen autologe und allogene Tumortargets entsprechend den Angaben. PBMC-Kulturen wurden vorbehandelt mit IL4 (1.000 U/ml) und FP (0,34 mg/ml) oder IL-4 und GM-CSF (800 U/ml) für eine Woche und anschließend restimuliert mit IL-2 und FP oder IL-2 und GM-CSF wöchentlich. Die Cytotoxizität wurde bestimmt durch 18-h 51 Cr-Freisetzungsassay am Tage 35. Die Cytotoxizität gegen autologen Tumortarget wurde gemessen in Gegenwart von Isotyp-Kontrollantikörper oder Antikörpern, die für HLA-Klasse I, HLA-Klasse II, CD3, CD4 oder CD8 spezifisch sind. Daten, Mittelwerte des Triplikats; Säulen, SD. 11B zeigt eine phänotypische Analyse von FP-moduliertem PBMC, die Antitumorwirksamkeit exprimiert.
12 zeigt eine Karte des Vektors pCEP4/GMCSF-G250, worin das rekombinante Gen zwischen KpnI und XhoI insertiert ist.
13 – Digestion und Elektrophorese von pCEP4/GMCSF-G250 Spur 1; pCEP4/GMCSF-G250. Spur 2: pCEP4/GMCSF-G250 degeriert mit KpnI und XhoI. M: Molekulargewicht-Marker (1 kb PLUS DNA Leiter (Gibco)).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung gewährt ein neuartiges Vorgehen für die Behandlung (z.B. Milderung der Symptome) eines klarzelligen Nierenkarzinoms oder irgendeiner Krebsart, das ein G250-Antigen exprimiert (z.B. Zervixkarzinom) oder das eine Antigen-Kreuzreaktion mit G250 exprimiert. Speziell nutzt die vorliegende Erfindung ein chimäres Molekül, das ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250) gebunden an einem granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist. Ohne an eine spezielle Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass dieses chimäre Molekül zu zwei Arten von Aktivität führt. Die Vakzination mit fortgeschrittenem klarzelligen Nierenkarzinom unter Verwendung eines chimären G250-GM-CSF-Moleküls führt zu einer Aktivierung der dendritischen Zellen (DC) des Patienten, bei denen es sich um die stärksten ein Antigen präsentierenden Zellen handelt. Die dendritischen Zellen nehmen den GM-CSF auf, z.B. über den GM-CSF-Rezeptor, und das gebundene G250-Antigen wird über seine Bindung an dem GM-CSF co-transportiert. Die dendritischen Zellen verarbeiten das G250-Antigen und präsentieren das G250-Peptid auf HLA Klasse I, welches dann G250-spezifische zytotoxische T-Zellen (CD3⁺ CD8⁺) aktiviert, die in der Lage sind, G250-positive Nierenkrebszellen zu lysieren.
Zusätzlich oder alternativ wird das G250-Peptid auf HLA Klasse II-Zellen präsentiert, die G250-spezifische T-Helferzellen aktivieren, die dann die tötende Wirksamkeit von CTL's aktivieren oder aufrechterhalten.
In bestimmten Ausführungsformen kann eine Nucleinsäure, die ein G250-GM-CSF-Konstrukt codiert, als "nacktes DNA"-Vakzin verabreicht werden. Bei dieser Vorgehensweise wird eine Nucleinsäure, die ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein codiert, in den Organismus/Patienten z.B. intramuskulär injiziert. Die Nucleinsäure wird im Inneren des Organismus exprimiert und führt zu der Erzeugung eines G250-GM-CSF-Fusionsproteins, welches dann entsprechend der vorstehenden Beschreibung eine gegen das klarzellige Nierenkarzinom gerichtete Immunanwort auslöst.
In einer anderen Ausführungsform können die chimären G250-GM-CSF-Moleküle in einer Adoptiv-Immuntherapie zur Anwendung gelangen. In diesem Fall wird das chimäre Molekül (Fusionsprotein) oder eine Nucleinsäure, die das chimäre Molekül codiert, verwendet, um Lymphozyten (z.B. T-Zellen) ex vivo zu aktivieren. Die aktivierten Lymphozyten werden gegebenenfalls ex vivo expandiert und anschließend zurück in den Patienten re-infundiert, wo sie G250-positive Tumorzellen (z.B. Zellen von klarzelligem Nierentumor oder von einem Cervixkarzinom) speziell angreifen und lysieren.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen nutzt die vorliegende Erfindung eine oder mehrere der folgenden Formulierungen:

1. Ein Polypeptid, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist;
2. dendritische oder andere Zellen, gepulst mit einem Polypeptid, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist;
3. GM-CSF-G250-codierende Nucleinsäuren in einem "Gentherapie"-Vektor (z.B. Adenvirus, "Gutless"-Adenovirus, Retrovirus, Lantivirus, Adeno-assoziiertes Virus, Vaccinia-Virus usw.);
4. dendritische Zellen, transfiziert mit einer GM-CSF-G250-codierenden Nucleinsäure (z.B. über ein rekombinantes Virus, Plasmid-DNA-Transfektion, u.dgl.);
5. Tumorzellen (z.B. RCC-Zellen), die eine Nucleinsäure aufweisen, die ein Polypeptid codiert, welches ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist;
7. eine Nucleinsäure, die ein GM-CSF-G250 (z.B. "nackte DNA") codiert, und
8. eine Nucleinsäure, die ein Polypeptid codiert, das einen GM-CSF-G230-Komplex gebunden mit einem Transfektionsmittel aufweist (z.B. DMRIE/DOPE-Lipid, Dendrimere usw.).

Jede dieser Formulierungen kann direkt an einen Organismus verabreicht werden (z.B. an einen Vertreter der Säuger, der einen Krebs hat, welcher ein G250-Antigen exprimiert oder eine Antigen-Kreuzreaktion zu einem G250-Antigen) oder kann in Verbindung mit einer adoptiven Immuntherapie verwendet werden. In der letzteren Vorgehensweise werden in der adoptiven Immuntherapie bevorzugt Zellen genutzt, die von peripherem Blut deriviert sind (z.B. Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL's), oder Zellen, die von einem Tumor deriviert sind (z.B. tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL's)). Die Verabreichung der Formulierung führt zu einer Aktivierung und Ausbreitung von G250-markierten zytotoxischen T-Zellen in PBMC- oder TIL-Kulturen. Eine Infusion der G250-markierten CTL's in den Patienten führt zu der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer G250-gerichteten Immunantwort.
Die vorstehend identifizierten Formulierungen lassen sich auch direkt an einem Vertreter der Säuger in einer "in vivo"-Vakzination verabreichen. Auf diese Weise können beispielsweise GM-CSF-G250-Polypeptide oder solche Polypeptide codierende Nucleinsäure an den Organismus als "traditionelle" Vakzine verabreicht werden. Die anderen, vorstehend identifizierten immunogenen Formulierungen sind jedoch ebenfalls in hohem Maße in vivo wirksam und können ebenfalls an einen Organismus als "Vakzin" "direkt" verabreicht werden. Damit können beispielsweise dendritische Zellen, gepulst mit einem GM-CSF-G250-Fusionsprotein, dendritische oder andere Zellen, transfiziert mit einer Nucleinsäure, die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein codiert, Gentherapie-Vektoren, die ein GM-CSF-G250-Polypeptid codieren, insgesamt an einem Organismus verabreicht werden, wo sie eine Population von G250-gerichteten zytotoxischen T-Zellen induzieren und aufrechterhalten.
Eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung bestand darin, dass die G250-GM-CSF-chimären Moleküle beispielsweise bei Anwendung in vivo als ein Vakzin oder in einer adoptiven immuntherapeutischen Form eine besonders heftige Immunreaktion erzeugen, die speziell auf klarzellige Nierenkarzinome gerichtet ist. Die Vorgehensweise führt zu dem Tod oder zur Hemmung neoplastischer Nierenzellen unabhängig davon, ob sie verteilt (z.B. motile metastatische Zellen) sind oder aggregiert sind (z.B. in einem massiven Tumor). Diese Methoden können die Verabreichung anderer Mittel begleiten (z.B. immunmodulatorische oder zytotoxische Mittel, wie beispielsweise Cytokine oder Medikamente).
Es gilt als selbstverständlich, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung keine vollständige Tumoreliminierung von Bedeutung zeigen müssen (z.B. eine "Heilung"). Selbst eine geringfügige Verminderung der Wachstumgeschwindigkeit eines Tumors und/oder die Ausbreitung metastatischer oder anderer neoplastischer Zellen kann eine klinisch relevante Verbesserung der Qualität und/oder der Lebensdauer sein. Selbstverständlich ist auf Grund der hohen Wirksamkeit, die beobachtet wurde, zu erwarten, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung ein signifikantes oder vollständiges Maß an Remission speziell dann bieten können, wenn sie in Verbindung mit anderen Behandlungsformen zur Anwendung gelangen (z.B. Chirurgie, Chemotherapie, Interleukin-Therapie, TGFβ- oder IL-10-Antisense-Therapie usw.).
I. G250-GMCSF-CHIMÄRE MOLEKÜLE UND DEREN EXPRESSION
In der vorliegenden Erfindung wird ein chimäres Molekül genutzt, welches ein G250-nierenkrebsspezifisches Antigen gebunden an einem granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist, um eine zellvermittelte Immunantwort gerichtet auf klarzellige Nierenkrebszellen zu induzieren. In einem chimären Molekül werden zwei oder mehrere Moleküle, die in ihrem nativen Zustand separat bestehen, miteinander unter Erzeugung eines einzelnen Moleküls verbunden, das über die gewünschte Funktionalität aller seiner aufbauenden Moleküle verfügt. In diesem Fall sind die aufbauenden Moleküle das G250-Antigen bzw. der GM-CSF. Das G250 stellt ein Epitop bereit, das präsentiert wird (z.B. den T-Zellen) und zur Aktivierung und Expansion solcher Zellen führt sowie zu der Bildung von zytotoxischen Zellen (z.B. zytotoxische T-Lymphozyten, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL's) usw.), die auf Tumorzellen gerichtet sind, die das G250-Antigen tragen. Der GM-CSF wirkt sowohl zur Stimulation von Komponenten des Immunsystems (z.B. Monozyten, dendritische Zellen, NK, PMN, PBMC usw.) als auch zur Vermittlung der Aufnahme des assoziierten G250-Antigens durch dendritische Zellen. Darüber hinaus kann der GM-CSF speziell in adoptiven immuntherapeutischen Maßnahmen als ein Adjuvans wirken.
Die Bindung des G250-Antigens an den GM-CSF kann direkt erfolgen (z.B. als eine kovalente Bindung) oder kann indirekt erfolgen (z.B. über einen Linker). Darüber hinaus können das G250-Antigen und die GM-CSF-Proteine über eine chemische Modifikation der Proteine gebunden sein oder sie können als ein rekombinantes Fusionsprotein exprimiert sein. Detaillierte Methoden zum Erzeugen der einzelnen Komponenten und des chimären Moleküls werden nachfolgend ausgeführt.
Das G250-nierentumorspezifische Antigen ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe beispielsweise den Oosterwijk et al. (1996) Molecular characterization of the Renal Cell Carcinomaassociated antigen G250, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 37: 461; Uemura et al., (1994) Internal Image Anti-Idiotype Antibodies Related to Renal-Cell Carcinoma-Associated Antigen G250, Int. J. Cancer, 56: 609–614). Die G250-Nucleinsäuresequenz ist für die Öffentlichkeit verfügbar (siehe beispielsweise die GenBank, Hinterlegungsnummer X66839).
In ähnlicher Weise ist die Nucleinsäuresequenz von GM-CSF (z.B. Human-GM-CSF) der Fachwelt gut bekannt (siehe beispielsweise GenBank, Hinterlegungsnummer E02287).
Unter Anwendung der bekannten Sequenzinformation können Nucleinsäuren, die G250, GM-CSF oder einen chimären G250-GM-CSF codieren, unter Anwendung von Standardmethoden erzeugt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Beispielsweise kann/können Nucleinsäure(n) geklont oder amplifiziert werden mit Hilfe von in vitro-Methoden, wie beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Ligasekettenreaktion (LCR), dem transkriptionsbasierten Amplifikationssystem (TAS), das selbsterhaltende Sequenz-Replikationssystem (SSR) usw. Dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ist eine große Vielzahl von Methoden des Klonen und der in vitro-Amplifikation bekannt.
Beispiele für diese Methoden und Arbeitsanweisungen, die ausreichend sind, um den Fachmann über die vielfältigen Vorgehensweisen des Klonen zu unterrichten finden sich bei Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laborstory Manual (2. Ausgabe.), Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Herausg., aktuelle Protokolle, ein gemeinsames Unternehmen zwischen Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., (1994, ergänzt) (Ausubel); Cashion et al., in der US-P-5 017 478 und Carr in dem EP-P-0 246 864.
Beispiele für Methoden, die zur Unterweisung von Personen hinlänglich sind, die auf dem Gebiet der in vitro-Amplifikationsmethoden Erfahrungen haben, finden sich bei Berger, Sambrook und Ausubel sowie bei Mullis et al., (1987) in der US-P-4 683 202 ; PCR Protokoll A Guide to Methods and Applications (Inns et al. Herausg.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Inns); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990) C&EN 36–47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81–94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science, 241: 1077–1080; Van Brunt (1990) Biotechnology, 8: 291–294; Wu and Wallace, (1989)Gene, 4: 560; und Barringer et al. (1990) Gene, 89: 117.
Darüber hinaus wird in Beispiel 1 das Klonieren und die Expression eines GM-CSF-G250-Fusionsgens beschrieben. Obgleich das Klonieren und die Expression eines rekombinanten Fusionsproteins veranschaulicht sind, wird davon ausgegangen, dass die G250- und GM-CSF-Proteine erworben werden können und/oder rekombinant exprimiert werden können und anschließend entsprechend der nachfolgenden Beschreibung chemisch gekoppelt werden können.
Die G250- und GM-CSF-Moleküle können miteinander in jeder beliebigen Reihenfolge vereint werden. Damit lässt sich das G250 entweder mit dem Amino-Terminus oder dem Carboxy-Terminus des GM-CSF verbinden. Wo die Moleküle chemisch konjugiert sind, müssen sie nicht über ihren Enden miteinander verbunden sein und können an jeder beliebigen zugänglichen terminalen oder inneren Stelle verbunden werden.
Das G250 und der GM-CSF können in einer beliebigen Reihe von Möglichkeiten verbunden werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Im typischen Fall sind das G250 und der GM-CSF entweder direkt oder über einen Linker (Spacer) konjugiert. Da es sich in einer der Ausführungsformen bei beiden Molekülen um Polypeptide handelt, wird die rekombinante Exprimierung des chimären Moleküls als ein Einketten-Fusionsprotein bevorzugt, das gegebenenfalls einen Peptid-Spacer zwischen dem GM-CSF und dem G250 enthält.
Möglichkeiten zum chemischen Konjugieren von Molekülen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Polypeptide enthalten im typischen Fall eine Vielzahl funktioneller Gruppen, z.B. Carbonsäure(COOH^-)-Gruppen oder freie Amin(NH₂)-Gruppen, die zur Reaktion mit einer geeigneten funktionellen Gruppe an einem Effektormolekül verfügbar sind, um den Effektor daran zu binden.
Alternativ können das G250 und/oder der GM-CSF derivatisiert werden, um zusätzliche reaktive funktionelle Gruppen zu exponieren oder zu binden. Die Derivatisierung kann die Bindung einer beliebigen Reihe von Linker-Molekülen umfassen, wie sie beispielsweise verfügbar sind bei Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.
Ein "Linker", wie er hierin verwendet wird, ist ein Molekül, das zum Verbinden des G250 und des GM-CSF verwendet wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Linker zur Erzeugung kovalenter Bindungen sowohl des G250 als auch des GM-CSF in der Lage. Geeignete Linker sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und schließen beispielsweise geradkettige oder verzweigte Kohlenstoff-Linker ein, heterocyclische Kohlenstoff-Linker oder Peptid-Linker, ohne auf diese beschränkt zu sein. In bestimmten Ausführungsformen können die Linker mit Aminosäuren verbunden sein, die über ihre Seitengruppen (z.B. über eine Disulfid-Brücke zu Cystein) ein G250 und/oder GM-CSF aufweisen. Allerdings werden die Linker in einer bevorzugten Ausführungsform mit dem α-Kohlenstoff-Amino- und Carboxyl-Gruppen der terminalen Aminosäuren verbunden. Der Linker kann bifunktionell sein, kann eine funktionelle Gruppe aufweisen, die mit einem Substituenten an dem G250 reaktionsfähig ist, und eine andere funktionelle Gruppe, die mit einem Substituenten an dem GM-CSF reaktionsfähig ist. Alternativ lassen sich G250 und/oder der GM-CSF so derivatisieren, dass sie mit einem "monofunktionellen" Linker reagieren (siehe hierzu beispielsweise die US-P-4 671 958 und 4 659 839 bezüglich der Prozeduren zur Erzeugung von reaktionsfähigen Gruppen an Peptiden).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die chimären Moleküle der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine. Das Fusionsprotein kann auf chemischem Wege synthetisch dargestellt werden, indem Standardmethoden der chemischen Peptidsynthese zur Anwendung gelangen oder indem sie mehr bevorzugt rekombinant exprimiert werden. Wo beide Moleküle relativ kurz sind, kann das chimäre Molekül synthetisch als ein einzelnes angrenzendes Polypeptid dargestellt werden. Eine bevorzugte Methode zur chemischen Synthese der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ist die Synthese in der festen Phase, worin die T-terminale Aminosäure der Sequenz an einem unlöslichen Träger gebunden wird, gefolgt von einer sequentiellen Hinzufügung der verbleibenden Aminosäure in der Sequenz. Methoden für die Synthese in fester Phase wurden beschrieben von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; S.. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2156 (1963), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die chimären Fusionsproteine in der vorliegenden Erfindung synthetisch unter Anwendung der Methode der rekombinanten DNA dargestellt. In der Regel umfasst dieses das Erzeugen einer DNA-Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, das Einsetzen der DNA in eine Expressionskassette unter der Kontrolle eines speziellen Promotors, das Exprimieren des Proteins in einen Wirt, das Isolieren des exprimierten Proteins und nach Erfordernis das Renaturieren des Proteins.
Die das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung (GM-CSF-G250) codierende DNA kann mit Hilfe jeder geeigneten Methode hergestellt werden und einschließlich beispielsweise dem Klonieren und der Restriktion geeigneter Sequenzen oder mit Hilfe der direkten chemischen Synthese nach Methoden, wie beispielsweise die Phosphotriester-Methode von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979); die Phosphodiester-Methode von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979); die Diethylphoramidit-Methode von Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859–1862 (1981) und die Methode mit Hilfe eines festen Trägers nach der US-P-4 458 066 .
Die chemische Synthese erzeugt ein einsträngiges Oligonucleotid. Dieses lässt sich in eine doppelsträngige DNA mit Hilfe der Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz umwandeln oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase unter Verwendung des einzelnen Stranges als ein Template. Der Fachmann wird erkennen, dass, obgleich sich die chemische Synthese der DNA auf Sequenzen von etwa 100 Basen beschränkt, durch Ligation kürzerer Sequenzen längere Sequenzen erhalten werden können.
Alternativ lassen sich Subsequenzen klonieren und die entsprechenden Subsequenzen unter Anwendung von Restriktionsenzymen abspalten. Die Fragmente können anschließend unter Erzeugung der gewünschten DNA-Sequenz ligiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zum DNA-Codieren von Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung Methoden der DNA-Amplifikation angewendet, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie in den Beispielen 1 und 2 veranschaulicht ist. So wird beispielsweise GM-CSF unter Verwendung von Primer amplifiziert, die EcoRI- und NotI-Stellen (3' bzw. 5') einführen, wobei G250-cDNA mit Primern amplifiziert wird, die NotI und His-stop-GbL II (5' bzw. 3') einführen. Die Amplifikationsprodukte sind legiert (GM-CSF-NotI-G250-His-stop-Bgl II).
Die in Beispiel 1 veranschaulichten Konstrukte führen einen Linker (gcggcg) zwischen den Nucleinsäuren, die G250 und GM-CSF codieren, ein. Die Linkersequenz wird verwendet, um GM-CSF und G250 um einen ausreichenden Abstand voneinander zu trennen und zu gewährleisten, dass in einer bevorzugten Ausführungsform jede Domäne richtig in die sekundären und tertiären Strukturen eingefaltet wird. Bevorzugt zeigen Peptidlinkersequenzen, die eine flexible verlängerte Konformation annehmen, keine Neigung zum Entwickeln einer geordneten sekundären Struktur, die mit den funktionellen GM-CSF- und G250-Domänen in Wechselwirkung treten könnte. Typische Aminsäuren in flexiblen Proteinregionen schließen Gly, Asn und Ser ein. Man könnte von nahezu jeder beliebigen Permutation von Aminosäuresequenzen, die Gly, Asn und Ser enthalten, erwarten, dass sie die vorgenannten Kriterien für eine Linkersequenz erfüllen. In der Linkersequenz können andere, nahezu neutrale Aminosäuren, wie beispielsweise Thr und Ala, ebenfalls verwendet werden. Damit sind zusätzlich zu denen in Beispiel 1 veranschaulichten Aminosäuresequenzen als Linker für GM-CSF und G250 nützlich, die den Gly₄ SerGly₅ Ser-Linker (SEQ ID Nr.: 3) einschließen, der in der US-P-5 108 910 verwendet wird, oder eine Reihe von vier (Ala Gly Ser)-Resten (SEQ ID Nr.: 4) usw. Noch andere Aminosäuresequenzen, die als Linker zur Anwendung gelangen können, wurden offenbart von Maratea et al. (1985), Gene 40: 39–46; Murphy et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 8258–62; US-P-4 935 233 und US-P-4 751 180 .
Die Länge der Peptidlinkersequenz kann variieren, ohne die biologische Wirksamkeit des Fusionsproteins wesentlich zu beeinträchtigen. In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Peptidlinkersequenz einer Länge von etwa 2 Aminosäuren verwendet, um für eine geeignete Trennung funktioneller Proteindomänen zu sorgen, obgleich auch längere Linkersequenzen verwendet werden könnten. Die Linkersequenz kann eine Länge von 1 bis 50 Aminosäure haben. In den am meisten bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung hat die Linkersequenz eine Länge von etwa 1 bis 20 Aminosäuren. In den hierin offenbarten speziellen Ausführungsformen hat die Linkersequenz von etwa 2 bis etwa 15 und vorteilhaft von etwa 2 bis etwa 10 Aminosäuren. Peptidlinkersequenzen sind in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise erforderlich.
Im Allgemeinen wird der Spacer keine andere spezielle biologische Wirksamkeit haben als diejenige, die Proteine zu vereinen oder einen gewissen Mindestabstand zu bewahren oder andere räumliche Beziehungen zwischen ihnen. Allerdings lassen sich die aufbauenden Aminosäuren des Spacers so auswählen, dass eine bestimmte Eigenschaft des Moleküls, wie beispielsweise das Falten, die Nettoladung oder die Hydrophobizität, beeinflusst werden.
Wo angestrebt wird, entweder das G250 oder GM-CSF oder das G250-GM-CSF-Fusionsprotein rekombinant zu exprimieren, werden die Nucleinsäuresequenzen, die das gewünschte Protein codieren, im typischen Fall funktionsfähig mit geeigneten transkriptionellen oder translationellen regulatorischen Elementen verknüpft. Die regulatorischen Elemente schließen im typischen Fall einen Transkriptionspromotor ein, eine wahlweise Operatorsequenz zum Kontrollieren der Transkription, eine Sequenz, die geeignete mRNA-ribosomale Bindungsstellen codiert, Sequenzen, die die Terminierung der Transkription und der Translation kontrollieren. Die Fähigkeit, sich in einem Wirt zu replizieren, die normalerweise durch einen Ursprung der Replikation übertragen wird, und eine Auswahl eines Gens zur Erleichterung der Erkennung von Transformanten können zusätzlich mit einbezogen werden.
Die Nucleinsäuresequenzen, die Fusionsproteine codieren, lassen sich in einer Vielzahl von Wirtszellen exprimieren, einschließlich E. coli und andere bakterielle Wirte sowie eukaryotische Wirtszellen, einschließlich Hefe-, Insektenzellen (z.B. SF9-Zellen) und verschiedene andere eukaryotische Zellen, wie beispielsweise die COS-, CHO- und HeLa-Zelllinien sowie Muelom-Zelllinien, ohne auf diese beschränkt zu sein. Das rekombinante Proteingen wird funktionsfähig mit entsprechenden Expressions-Kontrollsequenzen für den jeweiligen Wirt verknüpft. Bei E. coli schließt dieses einen Promotor ein, wie beispielsweise den T7, trp oder Lambda-Promotoren, eine Ribosom-bindende Stelle und bevorzugt ein Transkriptionsterminationssignal. Bei eukaryotischen Zellen schließen die Kontrollsequenzen einen Promotor und bevorzugt einen Enhancer ein, der von Immunoglobulin-Genen, SV40, Cytomegalovirus usw. deriviert ist, sowie eine Polyadenylierungssequenz, wobei ein Spleiß-Donator und Akzeptorsequenzen einbezogen sein können. In einer der besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das GM-CSF-G250-Fusionsgen in ein Polyhedrin-Genlocus-basierenden Baculovirus-Transfervektor insertiert (z.B. pVL 1393, verfügbar bei PharMingen) und in Insektenzellen exprimiert (z.B. SF9-Zellen).
Die Plasmide der Erfindung können in die gewählte Wirtszelle mit Hilfe gut bekannter Methoden transferiert werden, wie beispielsweise mit Hilfe einer Calciumchlorid-Transformation für E. coli und einer Calciumphosphat-Behandlung oder Elektroporation für Mammalia-Zellen. Die mit Hilfe der Plasmide transformierten Zellen lassen sich anhand der Widerstandsfähigkeit gegenüber Antibiotika auswählen, die durch Gene vermittelt wird, die auf den Plasmiden enthalten sind, wie beispielsweise die amp-, gpt-, neo- und hyg-Gene.
Sobald die rekombinanten Fusionsproteine exprimiert sind, können sie nach Standardprozeduren, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt werden, einschließlich Ausfällung mit Amoniumsulfat, his-Anhang-Fang, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese u.dgl. (siehe allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology, Bd. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Bevorzugt sind weitgehend reine Zusammensetzungen mit mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität und für pharmazeutische Anwendungen mit 98 bis 99% oder mehr Homogenität, die am meisten bevorzugt sind. Die Polypeptide können, sobald sie gereinigt sind, teilweise oder auf Homogenität, anschließend therapeutisch genutzt werden.
Für den Fachmann auf dem Gebiet gilt als selbstverständlich, dass nach der chemischen Synthese eine biologische Expression oder Reinigung des G250, GM-CSF oder GM-CSF-G250-Proteins eine Konformation besitzen kann, die sich von den nativen Konformationen des/der Polypeptids/Polypeptide wesentlich unterscheidet. In diesem Fall kann es erforderlich sein, das Polypeptid zu Denaturieren und zu Reduzieren und anschließend das Polypeptid zu einer Rückfaltung in die bevorzugte Konformation hinein zu bringen. Methoden des Reduzieren und Denaturieren von Proteinen und des Einleiten einer Rückfaltung sind für den Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt (siehe Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065–14070; Kreitman und Pastan, (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581–585; und Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263–270). Debinski et al. beschrieben beispielsweise die Denaturierung und Reduktion von Einschlusskörperproteinen in Guanidin-DTE. Das Protein wird anschließend in einem Redox-Puffer einer Rückfaltung unterzogen, der oxidiertes Glutathion und L-Arginin enthält.
Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, das Modifikationen an den GM-CSF-G250- oder GM-CSF-G250-Proteinen vorgenommen werden können, ohne deren biologische Wirksamkeit zu vermindern. Einige Modifikationen können zur Erleichterung des Klonieren, der Expression oder des Einbaus der aufbauenden Moleküle in ein Fusionsprotein vorgenommen werden. Derartige Modifikationen sind für den Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und schließen beispielsweise ein an dem Amino-Terminus zur Schaffung einer Startstelle eine Methionin-Einfügung ein oder zusätzliche Aminosäuren, die an jedem Terminus eingesetzt werden, um bequem angeordnete Restriktionsstellen oder Stoppcodon zu schaffen. Die rekombinante Expression eines GM-CSF-G250-Fusionsproteins ist in Beispiel 1 veranschaulicht.
II. IN VIVO-PROTEIN-VAKZINATION
Immungene Zusammensetzung (z.B. Vakzine) werden bevorzugt aus den G250-GM-CSF-Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung hergestellt. Die immunogenen Zusammensetzungen schließen Vakzine ein, die als Injektionslösungen, als flüssige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen angesetzt werden können. Der/Die aktive immunogene Bestandteil oder Bestandteile lassen sich mit pharmazeutisch duldbaren Exzipienten mischen, die damit kompatibel sind. Derartige Exzipienten sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen Wasser ein, Salzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol und Kombinationen davon, ohne darauf beschränkt zu sein. Die immunogenen Zusammensetzungen und Vakzine können ferner Hilfssubstanzen enthalten, wie beispielsweise Benetzungsmittel oder Emulgierungshilfen, pH-Puffermittel oder Adjuvantien, um deren Wirksamkeit zu erhöhen.
Die immunogenen G250-GM-CSF-Zusammensetzung lassen parenteral verabreichen, durch Injektion subkutan, intervenös, intradermal, intratumural oder intramuskulär. Alternativ können die immunogenen Zusammensetzunge, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, in einer Weise formuliert und zugeführt werden, um eine Immunantwort an den mucosalen Oberflächen hervorzurufen. So lässt sich die immunogene Zusammensetzung mucosalen Oberflächen beispielsweise auf nasalen oder oralen (intragestrischen) Wegen verabreichen. Alternativ können andere Verabreichungsarten wünschenswert sein, einschließlich Suppositorien und orale Formulierungen. Bei Suppositorien können Bindemittel und Trägersubstanzen einbezogen werden, wie beispielsweise Polyalkylenglykole oder Triglyzeride. Derartige Suppositorien können aus Mischungen erzeugt werden, die den/die aktiven immunogenen Bestandteil/Bestandteile im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10% und bevorzugt etwa 1 bis 2% enthalten. Orale Formulierungen können normalerweise eingesetzte Trägersubstanzen enthalten, wie beispielsweise pharmazeutische Qualitäten von Sachariden, Cellulose und Magnesiumcarbonat. Diese Zusammensetzungen können in Form von Lösungen vorliegen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern und können etwa 1 bis 95% des/der Wirkstoffes/Wirkstoffe enthalten und bevorzugt etwa 20 bis etwa 75%.
Die immunogenen Präparate und Vakzine werden in einer solchen Weise verabreicht, die mit der Dosierungsform kompatibel ist, und zwar in einer solchen Menge, die therapeutisch wirksam ist, immunogen und schützend. Die Menge, die verabreicht werden soll, hängt von dem zu behandelnden Patienten ab, einschließlich beispielsweise von dem Vermögen des Immunsystems des betroffenen, Antikörper synthetisch zu erzeugen, und nach Erfordernis, um eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen. Die genaue Menge, die für den zu verabreichenden Wirkstoff erforderlich ist, hängt von der Einschätzung des behandelnden Arztes ab. Allerdings lassen sich geeignete Dosierungsbereiche mühelos durch den erfahrenen Fachmann bestimmen und können in der Größenordnung von Mikrogramm bis Milligramm aktiver Bestandteil/aktive Bestandteile pro Vakzination betragen. Die antigenen Präparate der vorliegenden Erfindung können entweder in Einzeldosierungen oder Mehrfachdosierungen einer wirksamen Menge verabreicht werden. Wirksame Mengen der Zusammensetzungen der Erfindung können von 0,01 bis 1.000 μg/ml pro Dosierung und mehr bevorzugt von 0,1 bis 500 μg/ml pro Dosierung und am meisten bevorzugt von 10 bis 300 μg/ml pro Dosierung variieren.
Geeignete Therapiepläne für die Erstverabreichung und für Verstärkungsdosierungen sind ebenfalls variabel, können jedoch eine Erstverabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verstärkungsverabreichungen einschließen. Die Dosierung kann auch von dem Darreichungsweg abhängen und wird entsprechend der Größe des Wirts variieren.
Die Konzentration des Wirkstoffes (chimäres Protein) in einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung beträgt in der Regel etwa 1 bis 95%.
Die Immunogenitätsstärke kann deutlich verbessert werden, wenn die Antigene mit Adjuvantien gemeinsam verabreicht werden. Obgleich die GM-CSF-Komponente des chimären Moleküls selbst als ein Adjuvans wirken kann, lassen sich genauso gut andere Adjuvantien verwenden. Adjuvantien erhöhe die Immunogenitätsstärke eines Antigens, sind aber nichtnotwendigerweise von sich aus immunogen. Adjuvantien können wirken, indem sie das Antigen örtlich in der Nähe der Verabreichungsstelle halten, um ein Depoteffekt zur Erleichterung einer langsamen, verzögerten Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems zu bewirken. Ebenfalls können Adjuvantien Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot anziehen und derartige Zellen stimulieren, um Immunreaktionen hervorzurufen.
Immunstimulatorische Mittel oder Adjuvantien sind seit vielen Jahren zur Verbesserung der Immunreaktionen des Wirts angewendet worden, wie beispielsweise Vakzine. Intrinsische Adjuvantien, wie beispielsweise Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Komponenten der getöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Vakzine verwendet werden. Extrinsische Adjuvantien sind Immunmodulatoren, die zur Verstärkung der Immunreaktionen des Wirts formuliert werden. So sind derartige Adjuvantien identifiziert worden, die die Immunreaktion auf Antigene verstärken, die parenteral zugeführt werden. Einige dieser Adjuvantien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, wodurch sie sich zur Verwendung bei Menschen und zahlreichen Tieren ungeeignet machen. So werden eigentlich lediglich Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gemeinsam üblicherweise bezeichnet als Alaun) routinemäßig als Adjuvantien in Human- und Veterinär-Impfstoffen verwendet.
Die Wirksamkeit von Alaun zur Erhöhung der Antikörperreaktionen auf Diphtherie und Tetanus-Toxoide ist wohl etabliert und es ist ein HBsAg-Vakzin mit Alaun als Adjuvans zusammengebracht worden.
Es kann eine große Reihe von extrinsischen Adjuvantien starke Immunreaktionen auf Antigene provozieren. Diese schließen Saponine ein, die komplex mit Membranprotein-Antigenen gebunden sind (immunstimulierende Komplexe), Pluronik-Polymere mit Mineralöl, getötete Mykobakterten in Mineralöl, Freund'sches Adjuvans (unvollständig), bakterielle Produkte, wie beispielsweise Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS) sowie Lipid A und Liposomen.
Um wirksame humorale Immunreaktionen (HIR) einzuleiten sowie zellvermittelte Immunität (CMI), werden oftmals Immungene in Adjuvantien emulgiert. Viele Adjuvantien sind toxisch, erzeugen Granuloms, akute und chronische Entzündungen (Freund'sches komplettes Adjuvans, FCA), Cytolyse (Saponine und Pluronik-Polymere) und Pyrogenität, Arthritis und Uveitis anterior (LPS und MDP). Obgleich FCA ein hervorragendes Adjuvans ist und in der Forschung breite Anwendung findet, ist es zur Verwendung in Human- oder Veterinärtmpfstoffen wegen seiner Toxizität nicht lizenziert.
III. IN VIVO-DNA-VAKZINATION
In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden in die DNA-Vakzine Nucleinsäure eingebaut, die ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein codieren. Die Fähigkeit von direkt injizierter DNA, die ein antigenes Protein codiert, um eine schützende Immunreaktion hervorzurufen, ist zahlreichen experimentellen Systemen demonstriert worden (siehe hierzu z.B. Conry et al. (1994) Cancer Res., 54: 1164–1168; Cox et al. (1993) Virol, 67: 5664–5667; Davis et al. (1993) Hum. Mole. Genet., 2: 1847–1851; Sedegah et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 9866–9870; Montgomery et al. (1993) DNA Cell Bio., 12: 777–783; Ulmer et al. (1993) Science, 259: 1745–1749; Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 4156–4160; Xiang et al. (1994) Virology, 199: 132–140 usw.).
Die Vakzination durch direktes Injizieren von DNA, die ein antigenes Protein codiert, um eine Immun-Schutzreaktion hervorzurufen, erzeugt oftmals zellvermittelte und humorale Reaktionen. Darüber hinaus ist bei Mäusen darüber berichtet worden, dass reproduzierbare Immunreaktionen auf DNA, die verschiedene Antigene codiert, überwiegend für die Lebensdauer des Tieren bedauert (siehe z.B. Yankauckas et al. (1993) DNA Cell Biol., 12: 771–776).
Wie vorstehend ausgeführt, sind DNA-Vakzine der Fachwelt bekannt (siehe auch die US-P-5 589 466 und 5 593 971 , die PCT/US90/01515 , die PCT/US93/02338 , die PCT/US93/048131 , die PCT/US94/00899 sowie die hierin angeführten Patentanmeldungen. Zusätzlich zu den Protokollen für die Zuführung, wie sie in diesen Patentanmeldungen beschrieben sind, wurden alternative Methoden der Zuführung von DNA in den US-P-4 945 050 und 5 036 006 beschrieben.
Unter Anwendung der Technologie des DNA-Vakzins wird Plasmid-(oder eine andere Vektor)-DNA, in die eine Sequenz einbezogen ist, die ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein codiert, das funktionsfähig mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die für eine Genexpression erforderlich sind, an Individuen verabreicht (z.B. Human-Patienten, Nonhuman-Mammalia usw.). Die Zellen des Individuums nehmen die verabreichte DNA auf und die codierende Sequenz wird exprimiert. Das auf diese Weise erzeugte Antigen wird ein Target, gegen das eine Immunreaktion gerichtet ist. In dem vorliegenden Fall gewährt die gegen die Antigenkomponente des chimären Moleküls gerichtete Immunreaktion den prophylaktischen oder therapeutischen Nutzen für die klarzelligen Nierenkarzinome des Individuums.
Die Vakzine der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden verabreicht werden, einschließlich zahlreiche verschiedene Mittel zum Verabreichen von Substanzen an Gewebe. Die veröffentlichte Literatur enthält mehrere Übersichtsbeiträge, in denen Aspekte der Technologie des DNA-Vakzins beschrieben wurden, und es werden einige der zahlreichen Berichte von Ergebnissen zitiert, die unter Anwendung der Technologie erhalten wurden (siehe z.B. McDonnel und Askari (1996) New Engl. J. Med. 334(1): 42–45; Robinson (1995) Can. Med. Assoc. J. 152(10): 1629–1632; Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmac. 17(2): 79–83; Pardoll und Beckerleg (1995) Immunity 3: 165–169; und Spooner et al. (1995) Gene Therapy 2: 173–180.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die G250-GM-CSF-codierende Sequenz in ein Plasmid (oder in einen anderen Vektor) insertiert, welches anschließend in einer Vakzinzusammensetzung verwendet wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist die G250-GM-CSF-codierende Sequenz funktionsfähig mit regulatorischen Elementen verknüpft, die für die Expression des Konstruktes in eukaryotischen Zellen erforderlich sind. Regulatorische Elemente für eine DNA-Expression schließen einen Promotor ein und ein Polyadenylierungssignal, ohne auf diese beschränkt zu sein. Darüber hinaus können andere Elemente, wie beispielsweise eine Kozak-Region in das genetische Konstrukt einbezogen sein. Die Start- und Terminationssignale sind regulatorische Elemente, die oftmals als Bestandteil der codierenden Sequenz betrachtet werden, dieses aber nichtnotwendigerweise sind. In bevorzugten Ausführungsformen schließen die codierenden Sequenzen genetischer Konstrukte der vorliegenden Erfindung funktionelle Start- und Terminationssignale ein.
Beispiele für Promotoren, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbar sind und speziell in der Erzeugung eines genetischen Vakzins für Menschen schließen Promotoren von Simian-Virus 40 (SV40) ein, Promotor von Mammatumorvirus der Maus (MMTV), Promotor von Immunschwächevirus (HIV), wie beispielsweise den Promotor von HIV Long Terminal Repeat (LTR), Moloney-Virus, ALV, Cytomegalo-Virus (CMV), wie beispielsweise der CMV-unmittelbar frühe Promotor, Epstein Barr-Virus (EBV), Rous Sarcom-Virus (RSV) sowie Promotoren von Human-Genen, wie beispielsweise Human-Actin, Human-Myosin, Human-Hämoglobin, Human-Muskelkreatin und Human-Metalothionein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Beispiele für Polyadenylierungssignale, die für die Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, speziell für die Erzeugung eines genetischen Vakzins für Menschen schließen die SV40-Polyadenylierungssignale ein und die LTR-Polyadenylierungssignale, ohne auf diese beschränkt zu sein. Speziell das SV40-Polyadenylierungssignal, das sich in pCEP4-Plasmid (Invitrogen, San Diege, Kalif.) befindet und als das SV40-Polyadenylierungssignal bezeichnet wird, kann verwendet werden.
Zusätzlich zu den regulatorischen Elementen, die für die DNA-Expression erforderlich sind, können auch andere Elemente in das DNA-Molekül einbezogen sein. Derartige zusätzliche Elemente schließen Enhancer ein. Die Enhancer können aus der Gruppe ausgewählt werden, einschließlich Human-Actin, Human-Myosin, Human-Hämoglobin, Human-Muskelkreatin und virale Enhancer, wie beispielsweise solche von CMV, RSV und EBV, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Einführen von genetischem Material in die Zellen eines Individuums, um Immunreaktionen gegen klarzellige Nierenkarzinome zu induzieren. Die Methoden umfassen die Schritte des Verabreichen von DNA, die eine codierende Sequenz für ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein einbezogen ist, das funktionsfähig mit regulatorischen Elementen verknüpf ist, die für die Expression erforderlich sind, an das Gewebe. Die DNA kann in Gegenwart von Adjuvantien oder anderen Substanzen verabreicht werden, die über die Fähigkeit der Förderung der DNA-Aufnahme verfügen oder Zellen des Immunsystems zu der Impfstelle rekrutieren. Es sollte als selbstverständlich gelten, dass in bevorzugten Ausführungsformen die DNA-Transkriptioneinheit selbst in der Wirtszelle durch Transkriptionsfaktoren exprimiert wird, die von der Wirtszelle bereitgestellt werden oder durch eine DNA-transkriptionelle Einheit bereitgestellt werden. Die DNA-Transkriptionseinheit kann Nucleinsäuren aufweisen, die Proteine codieren, die zur Stimulierung der Immunreaktion dienen, wie beispielsweise ein Cytokin, Proteine, die als ein Adjuvans dienen, und Proteine, die als ein Rezeptor wirken.
Vektoren, die das auf Nucleinsäure basierende Vakzin der Erfindung enthalten, können in den gewünschten Wirt mit Hilfe von Methoden eingeführt werden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Ausfällung, Lipofektionlyposomfusion, Verwendung einer Genpistole oder eines DNA-Vektortransporters (siehe z.B. Wu et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 963–967; Wu und Wu (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621–14624). Der Patient kann intramuskulär, intranasal, intraperitoneal, subkutan, intradermal, topisch oder mit Hilfe einer Genpistole geimpft werden.
Der Patient kann auch über einen mucosalen Weg geimpft werden. Die DNA-Transkriptionseinheit kann einer mucosalen Oberfläche mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden verabreicht werden, einschließlich Spülung, DNA-enthaltene Nasentropfen, Inhalationen, Suppositorien oder mit Hilfe von in Mikrokügelchen verkapselter DNA. Beispielsweise kann die DNA-Transkriptionseinheit über eine respiratorische mucosale Oberfläche verabreicht werden, wie beispielsweise Tracheen, oder in irgendeine beliebige Oberfläche, einschließlich Zunge oder Schleimhaut.
Die DNA-Transkriptionseinheiten werden bevorzugt in einem Medium verabreicht, d.h. einem Adjuvans, das eine die DNA-Aufnahme und -Expression-fördernde Wirkung hat. Vorzugsweise ist ein pharmazeutisch duldbares, inertes Medium als ein Adjuvans zum Einführen der DNA-Transkriptionseinheit in den Patienten geeignet. Eines der Beispiele für ein geeignetes Adjuvans ist Alaun (Aluminiumoxid-Gel), obgleich auch eine physiologische Kochsalzlösung akzeptabel ist. Andere mögliche Adjuvantien schließen organische Moleküle ein, wie beispielsweise Squalene, Iscome, organische Öle und Fette.
Ein Immunoeffektor kann gemeinsam mit der G250-GM-CSF-Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung exprimiert werden und verstärkt dadurch die Immunreaktion auf das Antigen. Eine Immunsäure, die den Immuneffektor codiert, lässt sich in einer separaten DNA-Transkriptionseinheit verabreichen, die funktionsfähig mit einem geeigneten DNA-Promotor verknüpft ist, oder der Immuneffektor kann alternativ in eine DNA-Transkriptionseinheit einbezogen werden, die eine Nucleinsäure aufweist, die das G250-GM-CSF-Konstrukt codiert, das funktionsfähig mit einem oder mehreren DNA-Promotoren verknüpft ist. Andere Ausführungsformen enthalten zwei oder mehrere derartige Immuneffektoren, die funktionsfähig mit einem oder mehreren Promotoren verknüpft sind. Die Nucleinsäure kann aus einem aufbauenden Polymer bestehen, das sowohl das chimäre Protein als auch den Immuneffektor codiert, oder kann aus unabhängigen Nucleinsäure-Segmenten bestehen, die einzeln das chimäre Molekül bzw. den Immuneffektor codieren. In dem letzteren Fall kann die Nucleinsäure in einem der Vektoren insertiert werden oder die unabhängige Nucleinsäure-Segmente lassen sich in die separaten Vektoren einsetzen. Die Nucleinsäure, die den Immuneffektor und das chimäre Molekül codiert, kann entweder funktionsfähig mit dem gleichen DNA-Promotor verknüpft sein oder funktionsfähig mit separaten DNA-Promotoren verknüpft sein. Das Hinzufügen eines solchen Immuneffektors ist auf dem Fachgebiet bekannt. Alternativ können lösliche Immuneffektor-Proteine (Cytokine, Monokin, Interferone usw.) direkt in den Patienten in Verbindung mit der G250-GM-CSF-DNA verabreicht werden.
Beispiele für Immuneffektoren schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Interferon-α, Interferon-γ, Interferon-β, Interferon-θ, Interferon-τ, Tumomekrosefaktor-α, Tumomekrosefaktor-β, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-12, Interleukin 15, B7-1-T-Zellen-co-stimmulatorisches Molekül, B7-2-T-Zellen-co-stimulatorisches Molekül, Immun-Zelladhäsionsmolekül (ICAM)-1, T-Zell-co-stimulatorisches Molekül, granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor und Kombinationen davon.
Bei der Aufnahme mit Hilfe einer Zelle kann das/die genetische(n) Konstrukt/Konstrukte in der Zelle als ein funktionierendes extrakromosomales Molekül vorhanden bleiben und/oder sich die chromosomale DNA der Zelle integrieren. Die DNA kann in die Zellen eingeführt werden, wo sie als ein separates genetisches Material verbleibt, z.B. in Form eines Plasmids oder mehrerer Plasmide. Alternativ kann lineare DNA, die sich in das Chromosom integrieren kann, in die Zelle eingeführt werden. Wenn eine DNA in die Zelle eingeführt wird, können Reagenzien zugegeben werden, die die DNA-Integration in die Chromosomen fördern. DNA-Sequenzen, die zur Unterstützung der Integration nützlich sind, können auch in das DNA-Molekül einbezogen werden. Alternativ kann eine RNA der Zelle verabreicht werden. Es gilt ebenfalls als selbstverständlich, das genetische Konstrukt als ein lineares Minichromosom bereitzustellen, einschließlich ein Centromer, Telomere und ein Replikationsstart. Gen-Konstrukte können Teil des genetischen Materials in abgeschwächten lebenden Mikroorganismen oder rekombinanten mikrobiellen Vektoren bleiben, die in Zellen leben. Gen-Konstrukte können Teil von Genomen von rekombinanten viralen Vakzinen sein, wo das genetische Material entweder sich in das Chromosom der Zelle integriert oder extrachromosomal bleibt.
Genetische Konstrukte können mit einem Säuger-Replikationsstart bereitgestellt werden, um das Konstrukt extrachromosomal zu halten und mehrfache Kopien des Konstruktes in der Zelle zu erzeugen. So enthalten beispielsweise Plasmide pCEP4 und pREP4 von Invitrogen (San Diege, Kalif.) den Epstein-Barr-Virus-Replikationsstart und eine nucleare Antigen-EBNA-1-codierende Region, die ohne Integration eine episomale Replikation mit hoher Kopie erzeugt.
Ein zusätzliches Element kann hinzugefügt werden, das als ein Target für die Zellzerstörung dient, wenn es wünschenswert ist, Zellen zu eliminieren, die das genetische Konstrukt aus irgendeinem Grund aufnehmen. Ein Herpes-Tymidinkinase (tk)-Gen in einer exprimierbaren Form kann in das genetische Konstrukt einbezogen werden. Es kann das Medikament Gangcyclovir dem Individuum verabreicht werden, wobei dieses Medikament ein selektives Abtöten einer beliebigen Zelle hervorrufen wird, die tk erzeugt, womit ein Mittel für die selektive Zerstörung von Zellen mit dem G250-GM-CSF-Nucleinsäurekonstrukt bereitgestellt wird.
Um die Proteinerzeugung auf ein Maximum zu bringen, können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die sich für eine Genexpression in den Zellen gut eignen, in die das Konstrukt verabreicht worden ist. Darüber hinaus können Codone ausgewählt werden, die am Wirksamsten in die Zelle transkribiert werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kann DNA-Konstrukte erzeugen, die in den Zellen funktionell sind.
Die Konzentration der Dosierung ist bevorzugt ausreichend, um eine wirksame Immunreaktion hervorzurufen. Die Dosierung der rekombinanten Vektoren, die verabreicht sind, wird von den Eigenschaften der zum Einsatz gelangenden Formulierung abhängen, z.B. von ihrer in vivo-Plasmahalbwertzeit, von der Konzentration der rekombinanten Vektoren in der Formulierung, von dem Darreichungsweg, von der Stelle und der Geschwindigkeit der Dosierung, von der klinischen Toleranz seitens des Patienten u.dgl., was ebenfalls im Erfahrungsbereich des Fachmanns auf dem Gebiet liegt. Es können unterschiedliche Dosierungen in einer Reihe von Impfungen genutzt werden, wobei der Arzt eine Anfangsimpfung verabreichen kann und anschließend mit relativ kleineren Dosierungen die rekombinanten Vektoren oder andere Booster verstärken wird.
Der bevorzugte Dosierungsbereich liegt zwischen etwa 30 μg bis etwa 1 mg DNA und mehr bevorzugt zwischen etwa 50 μg bis 500 μg. Geringere Dosierungen können zur Anwendung gelangen, wenn die Plasmid-Expression und Impfung optimiert sind. Die Dosierungen können bei Erwachsenen im Gegensatz zu Aufwachsenden oder Kindern differieren. Der Impfung folgen vorzugsweise Booster.
IV. ADOPTIVE IMMUNTHERAPIE
Die adoptive Immuntherapie bezeichnet eine therapeutische Vorgehensweise zur Behandlung von Krebs oder infektiösen Erkrankungen, bei denen Immunzellen an einem Wirt mit dem Ziel verabreicht werden, dass die Zellen entweder direkt oder indirekt eine spezifische Immunität vermitteln, d.h. eine gegen Tumorzellen gerichtete Immunreaktion bewirken. In bevorzugten Ausführungsformen führt die Immunreaktion zu einer Hemmung von Tumor- und/oder metastatischem Zellwachstum und/oder -Proliferation und am meisten bevorzugt zu einem Tod von neoplastischen Zellen und/oder zur Resorption. Die Immunzellen können von einem unterschiedlichen Organismus/Wirt (exogene Immunzellen) abgeleitet sein oder können Zellen sein, die von dem Organismus des Patienten erhalten werden (autologe Immunzellen).
Die Immunzellen werden im typischen Fall in vitro durch ein spezielles Antigen (in diesem Fall G250) aktiviert, gegebenenfalls expandiert und anschließend zurück in den Quellorganismus (z.B. den Patienten) reinfundiert. Die Methoden der Ausführung der adoptiven Immuntherapie sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt (siehe hierzu beispielsweise die US-P-5 081 029; 5 985 270; 5 830 464; 5 776 451; 5 229 115; 690 915 u.dgl.).
In bevorzugten Ausführungsformen gelten zahheiche Modalitäten der adoptiven Immuntherapie als mit einbezogen, z.B. wie sie vorstehend beschrieben wurden. In einer der Ausführungsformen werden dendritische Zellen (z.B. isoliert aus dem Patienten oder autologe dendritische Zellen) mit G250- oder dem G250-GM-CSF-chimären Molekül gepulst und anschließend in den Patienten zurückinjiziert, wo sie vorhanden waren und Immunzellen in vivo aktivieren. Zusätzlich oder alternativ können die dendritischen Zellen mit Nucleinsäuren transfektiert werden, welche das G250-GM-CSF-Fusionsprotein codieren, und werden anschließend in einem Patienten zurück eingeführt.
In einer anderen Ausführungsform werden modifizierte makrophagen- oder dendritische Zellen (Antigen-präsentierende Zellen) mit G250-GM-CSF-Fusionsproteinen gepulst oder mit Nucleinsäuren transfektiert, die ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein codieren, und werden anschließend verwendet, um Lymphozyten des peripheren Bluts zu stimulieren oder TIL in Kultur und aktivieren G250-markierte CTL's, die sodann in den Patienten infundiert werden.
In ähnlicher Weise werden Fibroblasten und andere APC's oder Tumorzellen (z.B. RCC's) mit einer Nucleinsäure transfektiert, die ein G250-GM-CSF exprimiert, und werden verwendet, um Tumorzellen oder PBL ex vivo zu aktivieren und gegen CTL-gerichtetes G250 zu erzeugen, das anschließend in einen Patienten infundiert wird.
In ähnlicher Weise schließen zahlreiche "Transfektionsmittel" ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Gen-Therapievektoren (z.B. Adenvirus, "Gutless"-Adenovirus, Retrovirus, Lantivirus, Adenassoziiertes Virus, Vaccinia-Virus usw.), kationische Lipide, Liposome, Dendrimere u.dgl., die Nucleinsäure enthalten oder mit dieser komplex gebunden sind, die ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein codiert, den PBL's oder Tumorzellen (z.B. RCC's) ex vivo zur Erzeugung von G250 gerichteten DTL's verabreicht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Tumorzellen (z.B. RCC-Zellen) transfektiert zum Exprimieren eines G250-GM-CSF-Proteins verwendet, um ein serienmäßiges Vakzin bereitzustellen, das gegen Tumore wirksam ist, die ein G250-Antigen oder ein Antigen exprimieren, das mit G250 zur Kreuzreaktion fähig ist.
Unter Anwendung der hierin gebotenen Lehren lassen sich mühelos andere therapeutische Möglichkeiten zur Nutzung von G250-GM-CSF-Polypeptiden oder G250-GM-CSF-Nucleinsäuren entwickeln.
Wie vorstehend ausgeführt, werden in einer der Ausführungsformen die Immunzellen deriviert von Lymphozyten des peripheren Bluts oder TIL's (z.B. deriviert von einer Tumor/Tumor-Suspension). Lymphozyten, die für die in vitro-Aktivierung verwendet werden, schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: T-Lymphozyten verschiedene Antigen-präsentierende Zellen (z.B. Monozyten, dendritische Zellen, B-Zellen usw.) u.dgl. Die Aktivierung kann ein Kontaktieren einer Antigenpräsentierenden Zelle mit dem/den chimären Molekülen) der vorliegenden Erfindung umfassen, die dann das G250-Antigen (oder ein Fragment davon) präsentiert, z.B. auf HLA-Klasse I-Molekülen und/oder auf HLA-Klasse II-Molekülen, und/oder kann das Kontaktieren einer Zelle (z.B. T-Lymphozyten) direkt mit dem chimären Molekül umfassen. Die Antigen-präsentierenden Zellen (APC's) schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen, die vorzugsweise durch Erzeugung in vitro aus Stammzellen und Nachkommenschaft-Zellen von menschlichem periphären Blut oder Knochenmark erhalten werden, wie beschrieben wurde von Inaba et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1693–1702.
Die Aktivierung von Immunzellen kann eine Reihe von Formen annehmen. Diese schließen die direkte Zugabe des chimären Moleküls zu Lymphozyten des periphären Bluts (PBL's), oder Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL's) in Kultur ein, das Beladen von Antigen-präsentierenden Zellen (z.B. Monozyten, dendritische Zellen usw.) mit dem chimären Molekül in Kultur, Transfektion von Antigenpräsentierenden Zellen oder PBL's mit einer Nucleinsäure, die das GM-CSF-G250-chimäre Fusionsprotein codiert u.dgl., ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die APC kann aus einer Vielzahl verschiedener Methoden erhalten werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. In einem bevorzugten Aspekt werden Human-makrophagen und/oder dendritische Zellen verwendet, die von Human-Blutspendem erhalten werden. Beispielsweise lassen sich PBL's (z.B. T-Zellen) wie folgt erhalten, ohne darauf beschränkt zu sein:
Es werden näherungsweise 200 ml heparinisiertes Venenblut durch Venenpunktion entnommen und PBL durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation isoliert und näherungsweise 1 bis 5 × 10⁸ PBL erhalten, was von der Lymphozytenzahl des/der Spender abhängt. Die PBL werden in Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und mit näherungsweise 2 × 10⁵ pro ml in RPMI 1640-Medium suspendiert, das 10% gepooltes, wärmeinaktiviertes normales Humanserum enthält; dieses Medium wird bezeichnet als "komplettes Medium".
In ähnlicher Weise werden andere Zellen (z.B. mononucleare Zellen) von peripherem Blut eines Patienten isoliert (bevorzugt von dem zu behandelnden Patienten), und zwar mit Hilfe der Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation, und werden auf Gewebekulturschalen geimpft, die mit dem eigenen Serum des Patienten vorbeschichtet waren oder mit anderem AB+-Humanserum. Die Zellen werden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und die nichtanhaftenden Zellen mit Hilfe der Pipette entfernt. Zu den anhaftenden Zellen, die in der Schale zurückgelassen werden, wird kaltes (4°C) 1 mMol EDTA in Phosphat-gepufferter Salzlösung zugegeben und die Schalen für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Zellen werden geerntet, mit dem RPMI-Puffer gewaschen und in RPMI-Puffer suspendiert. Eine erhöhte Zahl von Makrophagen lässt sich erhalten, indem man bei 37°C mit makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) inkubiert, wobei erhöhte Zahlen von dendritischen Zellen erhalten werden können, indem man mit granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) entsprechend der detaillierten Beschreibung von Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693–1702, inkubiert und mehr bevorzugt indem man den G250-GM-CSF-chimären Molekülen der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls IL-4) inkubiert.
Die Zellen (z.B. APC's) werden durch Kontaktieren/Inkubieren mit dem chimären Molekül sensibilisiert. In einigen Ausführungsformen lässt sich die Sensibilisierung durch Kontaktieren der APC's mit Wärmeschockprotein(en) (hsp) erhöhen, die nichtkovalent an dem chimären Molekül gebunden sind. Es ist nachgewiesen worden, dass hsp's, die nichtkovalent an antigenen Molekülen gebunden sind, die APC-Sensibilisierung in Anwendungen der adoptiven Immuntherapie erhöhen können (siehe hierzu die US-P-5 885 270).
In einer der bevorzugten Ausführungsformen, wie sie beispielsweise in den Beispielen hierin beschrieben werden, wird G250-GM-CSF-Fusionsprotein (mit wahlweise IL-4) in die PBMC des Patienten ex vivo eingeführt und anschließend für 7 Tage bei 37°C kultiviert. Die Kultur wird wöchentlich mit IL-2 und Fusionsprotein restimuliert, z.B. für 4 bis 5 Zyklen, bis die Kultur eine Antitumorwirksamkeit gegen autologe Nierentumorzellen zeigt, die G250 zeigen. Die CTL's werden sodann zurück in den Patienten reinfundiert.
Zur Reinfusion werden die Zellen dreimal gewaschen und in einem physiologischen Medium und bevorzugt einem sterilen Medium bei einer bequemen Konzentration (z.B. 1 × 10⁷ pro ml) zur Infektion in einen Patienten resuspendiert. Die Zellsuspension wird sodann filtriert, z.B. durch sterile 110 Mesh und in Fenwall-Transferpacks gegeben. Die Proben der Zellen werden auf Vorhandensein von Mikroorganismen, einschließlich Fungi, aerobe und anaerobe Bakterien und Mycoplasma, getestet. Eine Probe der Zellen wird gegebenenfalls zum immunologischen Testen zurückbehalten, um die Erzeugung einer spezifischen Immunität nachzuweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden vor Gebrauch in der Immuntherapie die stimulierten Lymphozyten auf zellvermittelte Immunreaktivität gegen Tumorzellen, die das G250-Antigen tragen, getestet. Die PBL/TIL können nach der Stimulation mit den chimären Molekülen der vorliegenden Erfindung in Bezug auf Zelloberflächen-Expression von T- und B-Zellmarkern mit Hilfe der Immunofluoreszensanalyse unter Verwendung von mit Fluoreszein konjugierten monoklonalen Antikörpern auf T- und B-Zell-Antigene untersucht werden. Die Expression bekannter T-Zellmarker, wie beispielsweise die CD-4- und CD-8-Antigene, bestätigen die Identität der aktivierten Lymphozyten als T-Zellen.
Die aktivierten Zellen (z.B. aktivierte T-Zellen) werden sodann gegebenenfalls auf Reaktivität gegen G250 getestet. Dieses könnte mit Hilfe einer beliebigen Reihe mehrerer Methoden erfolgen, die auf dem Fachgebiet zur Assay-Analyse spezifischer zeltvermittelter Immunität bekannt sind. Beispielsweise kann ein Assay auf Cytotoxizität, bei dem die Fähigkeit der stimulierten T-Zellen zum Töten von Tumorzellen, die das G250-Antigen tragen, in vitro gemessen wird, durch Inkubieren der Lymphozyten mit G250-tragenden Tumorzellen erfolgen, die einen Marker enthalten (z.B. Cr51-markierte Zellen) und indem die Cr51-Freigabe bei Lyse gemessen wird. Derartige Assays sind bereits beschrieben worden (siehe beispielsweise Zarling et al., (1986) J. Immunol. 136: 4669). Die aktivierten PBL ließen sich auch auf T-Helferzellaktivität testen, indem deren Fähigkeit zur Proliferation gemessen wird, wie durch H³-Thymidin-Inkorporation, gefolgt von einer Stimulation und zeigt, und/oder indem deren Fähigkeit zur Erzeugung von Lymphokinen gemessen wird, wie beispielsweise IL-2 oder Interferon bei Stimulation, und zwar in Abwesenheit von exogenem IL-2. Andere Assays auf spezifische zellvermittelte Immunität sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie beispielsweise die Leukozyten-Adhäsions-Hemm-Assays (Thomson, D. M. P. (Herausg.), 1982, Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic Press, New York), die ebenfalls zur Anwendung gelangen können.
Die Impfung der aktivierten Zellen erfolgt bevorzugt über eine systemische Verabreichung. Die Zellen lassen sich intervenös durch einen zentralvenösen Katheter oder in die große Bauchvene verabreichen. Innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung liegen weitere Verabreichungsmethoden (z.B. die direkte Infusion in eine Arterie). Es werden näherungsweise IX 10⁸-Zellen anfänglich infundiert und der Rest im Verlaufe mehrerer Stunden danach. Bei einigen Therapieplänen können die Patienten gegebenenfalls zusätzlich eine geeignete Dosierung eines biologischen Reaktionsmodifikators erhalten, einschließlich die Cytokine IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF oder andere Cytokin-Wachstumsfaktoren, Antisense-TGFβ, Antisense IL-10, u.dgl., ohne auf diese beschränkt zu sein. So kann bei einigen Patienten rekombinante Human-IL-2 verwendet werden und wird intravenös alle 8 Stunden beginnend zum Zeitpunkt der T-Zellinfusion infundiert. Die Injektionen von IL-2 erfolgen bevorzugt mit Dosierungen von 10.000 bis 100.000 Einheiten/kg Körpergewicht, wie sie zuvor bei Krebspatienten verwendet wurden (Rosenberg et al., (1985) N. Engt. J. Med. 313: 1485). Die IL-2-Infusion kann für mehrere Tage nach Infusion der aktivierten T-Zellen fortgesetzt werden, wenn diese vom Patienten toleriert wird.
Eine Behandlung durch Impfung von beispielsweise aktivierten T-Zellen, lässt sich allein oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Protokollen anwenden, einschließlich die Verabreichung von IL-2 (wie vorstehend beschrieben), anderer Chemotherapeutika (z.B. Doxirubicin, Vinblastine, Vincristine usw.), Radiotherapie, Chirurgie u.dgl., ohne auf diese beschränkt zu sein.
Wie vorstehend ausgeführt, können die Zellen gegebenenfalls in Kultur expandiert werden. Diese Expansion kann durch wiederholte Stimulation der T-Zellen mit dem G250-GM-CSF-Konstrukt der vorliegenden Erfindung mit oder ohne IL-2 oder durch Aufziehen in einem Medium erfolgen, das IL-2 allein enthält. Andere Methoden der T-Zell-Kultivierung (beispielsweise mit anderen Lymphokinen, Wachstumsfaktoren oder anderen bioaktiven Molekülen) liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass Antikörper oder deren abgeleitete Moleküle, welche die Tp67- oder Tp44-Antigene auf T-Zellen erkennen, die Proliferation aktivierter T-Zellen unterstützen (Ledbetter et al., (1985), J. Immunol. 135: 2331) und können während der in vitro-Aktivierung zur Erhöhung der Proliferation verwendet werden. Von Interferon hat sich gezeigt, dass es die Erzeugung cytotozischer T-Zellen unterstützt (Zarling et al., (1978) Immunol. 121: 2002) und kann bei der in vitro-Aktivierung verwendet werden, um die Erzeugung von cytotozischen T-Zellen gegen G250-tragende Krebszellen zu unterstützen.
Die vorstehend ausgeführte Beschreibung detailliert mehre verschiedene Methoden zur Isolation, Aktivierung und Expansion von PBL. Die vorliegende Erfindung gewährt jedoch für die Verwendung von G250-GM-CSF-Konstrukten in verschiedenen Formen und Modifikationen und Anpassungen an die Verfahren, um diese Variationen aufzunehmen. Damit liegen derartige Modifikationen der verschiedenen Vorgehensweisen der adoptiven Immuntherapie unter Nutzung der G250-GM-CSF-Konstrukte im Schutzumfang der Erfindung.
V. GENTRANSFER FÜR SYSTEMISCHE THERAPIE ODER FÜR ADOPTIVE IMMUNTHERAPIE
Zusätzlich zur Verwendung des chimären GM-CSF-G250-Proteins zur Aktivierung in der adoptiven Immuntherapie können Zellen (z.B. APC's, PBL's, Fibroblasten, TIL's' oder RCC-Tumorzellen) mit einem Vektor transfektiert werden, der das chimäre Molekül exprimiert und können zur adoptiven Immuntherapie und/oder Vakzintherapie verwendet werden.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen wird/werden die Nucleinsäure(n), welche die GM-CSF-G250-chimären Fusionsproteine codiert/codieren, in Gentherapievektoren kloniert, die in Bezug auf die transfzierten Zellen (wie beispielsweise Human- oder andere Säugerzellen) in vitro und/oder in vivo kompetent sind.
Es sind mehrere verschiedene Vorgehensweisen zum Einführen von Nucleinsäure in Zellen in vivo, ex vivo und in vitro angewendet worden. Diese schließen Genzuführung auf Lipid- oder Liposombasis ein ( WO 96/18372 ; WO 93/24640 ; Mannino und Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682–691; Rose US-P-5 279 833 ; WO 91/06309 ; und Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7414) und Replikation-defektive retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotid-Sequenz als Teil des retroviralen Genoms ernten (siehe beispielsweise Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res. 4: 43, und Cometta et al. (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215).
Für eine Übersicht über die Prozeduren der Gentherapie, siehe beispielsweise bei Anderson, Science (1992) 256: 808–813; Nabel und Felgner (1993) TIBTECH 11: 211–217; Mitani und Caskey (1993) TIBTECH 11: 162–166; Mulligan (1993) Science, 926–932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167–175; Miller (1992) Nature 357: 455–460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149–1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35–36; Kremer and Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51 (1) 31–44; Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Böhm (eds) Springer-Verlag, Heidelberg Deutschland und Yu et al., (1994) Gene Therapy, 1:13–26.
Retrovirale Vektoren, die breite Anwendung finden, schließen solche ein, die auf das murine Leukämie-Virus basieren (MuLV), Leukämie-Virus des Affen-Immunschwäche-Virus (SIV), Human-Immunschwäche-Virus (HIV), Alphavirus und Kombinationen davon (siehe beispielsweise Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731–2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635–1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58–59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374–2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220–2224 (1991); Wong-Staal et al, PCTIUS94/05700, und Rosenburg und Fauci (1993) in Fundamental Immunology, 3. Ausgabe, Paul (Herausg.) Raven Press, Ltd., New York und die darin enthaltenden Fundstellen sowie Yu et al. (1994) Gene Therapy, supra; US-P-6 008 535 , u.dgl.).
Die Vektoren werden gegebenenfalls als Pseudotyp behandelt, um den Wirtsbereich des Vektors auf Zellen zu erweitern, der durch den Retrovirus entsprechend dem Vektor nicht infiziert werden kann. Beispielsweise ist das Hüll-Glykoprotein (VSV-G) des vesiculären Stomatitis-Virus zum Aufbau VSV-G-pseudotypischen HIV-Vektoren verwendet worden, die hämatopoietische Stammzellen infizieren können (Naldini et al. (1996) Science 272:263 und Akkina et al. (1996) J Virol 70:2581).
Die Adeno-assoziierten Virus (AAV)-basierenden Vektoren wurden ebenfalls verwendet, um Zellen mit Target-Nucleinsäuren zu transduzieren, z.B. in der in vitro-Erzeugung von Nucleinsäuren und Peptiden sowie bei den in vivo- und ex vivo-Prozeduren der Gentherapie. Siehe hierzu West et al. (1987) Virology 160:38–47; Carter et al. (1989) US-P-4 797 368 ; Carter et al. WO 93/24641 (1993); für eine Übersicht der AAV-Vektoren. Der Aufbau rekombinanter AAV-Vektoren wurde in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich Lebkowski, US-P-5 173 414 ; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251–3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4: 2072–2081; Hermonat und Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466–6470; McLaughlin et al. (1988) und Samulski et al. (1989) J. Virol., 63:03822–3828. Zelllinien, die transformiert werden können durch rAAV, schließen solche ein, die beschrieben worden sind von Lebkowski et al. (1988) W. Cell. Biol., 8:3988–3996. Andere geeignete virale Vektoren schließen Herpes-Virus, Lentivirus und Vaccinia-Virus ein.
Zusätzlich zu den viralen Vektoren sind eine Reihe von nichtviralen Transfektionsmethoden verfügbar. Diese Methoden schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Methoden der Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion, Liposomen, kationische Lipid-Komplexe, Wasser-Öl-Emulsionen, Polyethylenimine und Dendrimere.
Liposome wurden erstmals 1965 als ein Modell für Zellmembranen beschrieben und fanden rasch Anwendung bei der Zuführung von Substanzen zu Zellen. Liposomen schließen DNA mit Hilfe eines von zwei Mechanismen ein, was zu deren Klassifikation entweder als kathionische Liposomen oder als pH-empfindliche Liposomen geführt hat. Kationische Liposomen sind positiv geladene Liposomen, die mit den negativ geladenen DNA-Molekülen unter Erzeugung eines stabilen Komplexes in Wechselwirkung treten. Kationische Liposomen bestehen im typischen Fall aus einem positiv geladenen Lipid und einem Co-Lipid.
Üblicherweise zur Anwendung kommende Co-Lipide schließen Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleylphosphatidylcholin (DOPC) ein. Co-Lipide, die auch als Helfer-Lipide bezeichnet werden, werden in den meisten Fällen zur Stabilisierung eines Liposom-Komplexes benötigt. Es steht eine Vielzahl positiv geladener Lipid-Formulierungen kommerziell zur Verfügung, wobei zahlreiche andere sich in der Entwicklung befinden. Zwei der am häufigsten genannten kationischen Lipide sind Lipofectamin und Lipofectin. Lipofectin ist ein kommerziell verfügbares kationisches Lipid, von dem erstmals von Feigner 1987 berichtet wurde, dass es Gene den Zellen in Kultur zuführt. Bei Lipofectin handelt es sich um eine Mischung von N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und DOPE.
DNA und Lipofectin oder Lipofectamin treten spontan unter Erzeugung von Komplexen in Wechselwirkung, die einen Ladungswirkungsgrad von 100% haben. Mit anderen Worten, sind weitgehend alle DNA mit dem Lipid-Komplex gebunden unter der Voraussetzung, dass genügend Lipid verfügbar ist. Es wird angenommen, dass die negative Ladung des DNA-Moleküls mit den positiv geladenen Gruppen des DOTMA in Wechselwirkung steht. Das Verhältnis von Lipid:DNA und die Lipid-Gesamtkonzentrationen, die zur Erzeugung dieser Komplexe verwendet werden, sind außerordentlich wichtig für einen wirksamen Gentransfer und variieren in Abhängigkeit von der Anwendung. Lipofectin ist zur Zuführung von linearer DNA, Plasmid-DNA und RNA zu einer Vielzahl von Zellen in Kultur verwendet werden. Kurz nach seiner Einführung wurde gezeigt, dass Lipofectin zur Zuführung von Genen in vivo verwendet werden könnte. Nach intravenöser Verabreichung von Lipofectin-DNA-Komplexen zeigten sowohl die Lunge als auch die Leber eine ausgeprägte Affinität zur Aufnahme dieser Komplexe und zur Transgen-Expression. Die Injektion dieser Komplexe in andere Gewebe hatte variierende Ergebnisse zur Folge und war zum größten Teil weniger wirksam als ein Lipofectin-vermittelter Gentransfer entweder in die Lunge oder die Leber.
PH-empfindliche oder negativ geladene Liposome schließen eher DNA als ein Komplex damit ein. Da sowohl die DNA als auch das Lipid ähnlich geladen sind, tritt eher eine Abstoßung ein als eine Komplexbildung. Dennoch gelingt es einigen DNA, im Inneren des wässrigen Innenraums dieser Liposome eingeschlossen zu werden. In einigen Fällen werden diese Liposome durch einen geringen pH-Wert destabilisiert, woher der Begriff pH-empfindlich kommt. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind kationische Liposome sehr viel wirksamer bei der Genzuführung sowohl in vivo als auch in vitro gewesen als pH-empfindliche Liposome. PH-empfindliche Liposome verfügen über das Potential, bei der in vivo-DNA-Zuführung sehr viel wirksamer zu sein als ihre kationischen Gegenspieler, so dass sie in der Lage sein müssten, dieses auch mit verringerter Toxizität und Störung aus dem Serumprotein zu sein.
In einer anderen Vorgehensweise wurden Dendrimere, die mit der DNA komplex gebunden sind, zur Transfektion von Zellen verwendet. Derartige Dendrimere schließen "Starburst"-Dendrimere und verschiedene Dendrimer-Polykationen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Bei den Dendrimer-Polykationen handelt es sich um dreidimensionale, oligomere und/oder polymere Verbindungen hoher Ordnung, wie sie im typischen Fall auf einem Kernmolekül gebildet werden oder auf einem vorgesehenen Initiator durch reintemative Reaktionsfolgen, indem die Oligomere und/oder Polymere addiert werden und eine Außenseite geschaffen wird, die positiv geladen ist. Diese Dendrimere können entsprechend den Offenbarungen in den PCT/US83/02052 und US-P-4 507 466 ; 4 558 120 ; 4 568 737 ; 4 587 329 ; 4 631 337 ; 4 694 064 ; 4 713 975 ; 4 737 550 ; 4 871 779 ; 4 857 599 hergestellt werden.
Im typischen Fall weisen die Dendrimer-Polykationen ein Kernmolekül auf, auf dem Polymere angelagert sind. Die Polymere können Oligomere sein oder Polymere, welche terminale Gruppen aufweisen, die zur Aufnahme einer positiven Ladung in der Lage sind. Geeignete Kernmoleküle weisen mindestens zwei reaktionsfähige Reste auf, die sich zum Binden des Kernmoleküls an den Oligomeren und/oder Polymeren nutzen lassen. Beispiele für die reaktionsfähigen Reste sind Hydroxyl, Ester, Amino, Imino, Imido, Halogenid, Carboxyl, Carboxyhalogenid, Maleinimid, Dithiopyridyl und Sulfhydryl u.a. Bevorzugte Kernmoleküle sind Ammoniak, tris-(2-Amihnoethel)amin, Lysin, Omithin, Pentaerythrit und Ethylendiamin, u.a. Kombinationen dieser Reste sind ebenfalls geeignet, wie auch andere reaktionsfähige Reste.
Oligomere und Polymere, die für die Herstellung der Dendrimer-Polikationen der Erfindung geeignet sind, sind pharmazeutisch duldbare Oligomere und/oder Polymere, die im Körper gut aufgenommen werden. Beispiele für diese sind Polyamidoamine, die von der Reaktion eines Alkylesters einer α,β-ethylenisch ungesättigten Carbonsäure oder eines α,β-ethylenisch ungesättigten Amids deriviert sind, und ein Alkylenpolyamin oder ein Polyalkylenpolyamin u.a. Bevorzugt sind Methylacrylat und Ethylendiamin. Das Polymer ist vorzugsweise an dem Kernmolekül kovalent gebunden.
Die terminalen Gruppen, die an den Oligomeren und/oder Polymeren gebunden sein können, sollten in der Lage sein, eine positive Ladung aufzunehmen. Beispiele für diese sind Azole und primäre, sekundäre, tertiäre und quatemäre aliphatische und aromatische Amine und Azole, die mit S oder O substituiert sein können, Guanidinium und Kombinationen davon. Die terminalen kationischen Gruppen sind bevorzugt in kovalenter Form an den Oligomeren und/oder Polymeren gebunden. Bevorzugte terminale kationische Gruppen sind Amine und Guanidinium. Allerdings lassen sich auch andere nutzen. Die terminalen kationischen Gruppen können in einem Anteil von etwa 10 bis 100% aller terminaler Gruppen des Oligomers und/oder Polymers vorliegen und mehr bevorzugt mit etwa 50 bis 100%.
Das Dentrimer-Polykation kann außerdem 0% bis etwa 90% terminale reaktionsfähige Reste außer den kationischen Gruppen aufweisen. Geeignete terminale reaktionsfähige Reste außer den terminalen kationischen Gruppen sind Hydroxyl, Cyrano, Carboxyl, Sulfhydryl, Amid und Thioether u.a. sowie Kombinationen davon. Allerdings lassen sich auch andere nutzen.
Das Dentrimer-Polykation ist in der Regel und vorzugsweise in nichtkovalenter Form mit dem Polynucleotid gebunden. Dieses ermöglicht eine leichte Dissoziation einen Zerfall der Zusammensetzung, sobald es in die Zellen eingeführt worden ist. Ein typisches Dendrimer-Polykation, das zur Verwendung hierin geeignet ist, hat eine relative Molekülmasse im Bereich von etwa 2.000 bis 1.000.000 Da und mehr bevorzugt etwa 5.000 bis 500.000 Da. Allerdings sind andere relative Molekülmassen ebenfalls geeignet. Bevorzugte Dendrimer-Polykationen haben einen hydrodynamischen Radius von etwa 11 bis 60 Å und mehr bevorzugt etwa 15 bis 55 A. Allerdings sind auch andere ebenfalls geeignet. Verfahren für die Herstellung und Anwendung von Dendrimeren in der Gentherapie sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und wurden detailliert beispielsweise in der US-P-5 661 025 beschrieben.
Sofern geeignet, lassen sich zwei oder mehrere Typen von Vektoren gemeinsam verwenden. Beispielsweise kann ein Plasmid-Vektor in Verbindung mit Liposomen zur Anwendung gelangen. Im Fall von nichtviralen Vektoren kann Nucleinsäure in die nichtviralen Vektoren mit Hilfe irgendeiner geeigneten Maßnahme eingebaut werden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Bei Plasmiden umfasst dieses im typischen Fall eine Ligation des Konstruktes in die geeignete Restriktionsstelle. Bei Vektoren, wie beispielsweise Liposomen, Wasser-Öl-Emulsionen, Polyethylenaminen und Dendrimeren können der Vektor und das Konstrukt durch Mischen unter geeigneten Bedingungen zusammengebracht werden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.
VI. VERABREICHUNG VON GM-CSF-G250 MIT ANDEREN MITTELN
In verschiedenen Ausführungsformen können die GM-CSF-G250-Fusionsproteine oder Nucleinsäuren, die die GM-CSF-G250-Fusionsproteine codieren, in Verbindung mit anderen Mitteln verabreicht werden. Derartige andere Mittel schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: verschiedene chemotherapeutische Mittel (z.B. Doxirubicin und Derivate, Taxol und Derivate, Vinblastin, Vincristin, Camptothecin-Derivate u.dgl., verschiedene Cytokine (z.B. IL-2, IL-7, IL-12, IFN usw.), verschiedene Cytotoxine (z.B. Pseudomonas-exotoxin und Derivate, Diphthertn-toxin und Derivate, Ricin und Derivate, Abrin und Derivate, Thymidinkinase und Derivate), Antisense-Moleküle (z.B. Antisense IL-10, TGF-β usw.), Antikörper gegen verschiedene Wachstumsfaktoren/Rezeptoren (z.B. Anti-VEGF, Anti-EGFR, Anti-IL-8, Anti-FGF usw.) u.dgl. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch als eine Ergänzung für Chirurgie und/oder Strahlentherapie zur Anwendung gelangen.
VII. KITS
Es werden Kits der Erfindung bereitgestellt, in die Materialien/Reagenzien einbezogen sind, die für die Vakzination unter Verwendung eines Polypeptid-Antigens (GM-CSF-G250-Polypeptid) und/oder DNA-Vakzination und/oder adoptive Immuntherapie verwendbar sind. Kits, die für eine GM-CSF-G250-Polypeptid-Vakzinierung optimiert sind, weisen bevorzugt einen Behälter auf, in dem sich ein GM-CSF-G250-chimäres Molekül befindet. Das Molekül kann in Lösung bereitgestellt sein, in Suspension oder als ein Pulver (z.B. lyophilisiert). Das GM-CSF-G250 kann mit einem geeigneten pharmazeutisch duldbaren Exzipienten und/oder einer Adjuvans abgepackt sein, z.B. in Form einer Einheitsdosierung.
In ähnlicher Form weisen Kits, die für eine DNA-Vakzination eines Konstruktes optimiert sind, das ein GM-CSF-G250-Polypeptid codiert, vorzugsweise einen Behälter auf, in dem sich eine GM-CSF-G250-Nucleinsäure (z.B. eine DNA) befindet. Wie bei dem Polypeptid kann die Nucleinsäure in Lösung bereitgestellt sein, in Suspension oder als ein Pulver (z.B. lyophilisiert). Die GM-SCSF-G250-Nucleinsäure kann mit einem geeigneten pharmazeutisch duldbaren Exzipienten oder ein/mehreren förderlichen Mitteln abgepackt sein, z.B. in Form einer Einheitsdosierung. Das Kit kann ferner Reagenzien und/oder Mittel einschließen, um die Zuführung der Nucleinsäure zu dem Patienten zu erleichtern (z.B. einem Menschen oder einem Vertreter der Säuger).
Die Kits, die für die adoptive Immuntherapie optimiert sind, schließen im typischen Fall einen Behälter ein, der ein chimäres GM-CSF-G250-Polypeptid enthält, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Kits können wahlweise eine Nucleinsäure enthalten (z.B. einen Vektor), die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein für ex vivo-Transfektion von Zellen codiert. Derartige Kits können auch wahlweise verschiedene Zelllinien (z.B. RCC) und/oder Reagenzien (z.B. IL-2) zur Erleichterung der Expansion aktivierter Zellen enthalten.
In die Kits können wahlweise zusätzliche Reagenzien einbezogen sein (z.B. Puffer, Medikamente, Cytokine, Zellen/Zelllinie, Zellkulturmedien usw.) und/oder Mittel (z.B: Spritzen, biolistische Vorrichtungen usw.) für die Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Zusätzlich können in die Kits Materialien zur Anweisung einbezogen sein, die Hinweise (d.h. Protokolle) für die Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung enthalten. Derartige typische hinweisende Materialien lehren die Anwendung der GM-CSF-G250-chimären Moleküle (oder der diese codierenden Nucleinsäure) als Vakzine, DNA-Vakzine oder Mittel für die adoptive Immuntherapie bei der Behandlung von klarzelligen Nierenkrebserkrankungen. Obgleich die instruktiven Materialien im typischen Fall schriftliche oder gedruckte Hinweise enthalten, sind sie auf diese nicht beschränkt. In die vorliegende Erfindung als einbezogen gilt jedes Medium, das zum Speichern derartige Instruktionen und deren Vermittlung an einen Endanwender in der Lage ist. Dieses schließt elektronische Speichermedien ein (z.B. Magnetplatten, Bänder, Kassetten, Chips), optische Medien (z.B. CD-ROM) u.dgl., ohne auf diese beschränkt zu sein. In diese Medien können Adressen von Intemetseiten einbezogen sein, die derartige instruktive Materialien anbieten.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung, nicht jedoch zur Beschränkung der beanspruchten Erfindung.
BEISPIEL 1
KLONIEREN UND EXPRESSION VON GM-CSF- UND G250-FUSIONSPROTEIN
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren, die Expression und Reinigung eines GM-CSF-G250-Fusionsproteins.
KLONIEREN VON HUMAN-GM-CSF-G250-FUSIONSGEN
Es wurde eine Human-GM-CSF-cDNA (0,8 kb) einer vollen Länge von dem Plasmid p91023(B)-Vektor (Wong et al. (1985) Science 228: 810–815) mit Eco RI Restriktionsendonuclease abgespalten. Eco RI (5') und Not I-Stellen (3') wurden in die GM-CSF cDNA mit Hilfe von PCR (0.4 kb) unter Anwendung eines ersten Primers insertiert: gcgggaattc(atg)tggctgcagagc (5' GM-CSF Eco RI underlined, SEQ ID Nr.:5) und eines zweiten Primers: gagggaggcgcgcgc(ctc)ctggactggctc (3' GM-CSF Not I underlined, um das Stoppcodon, SEQ ID Nr.:6) zu entfernen.
Die NotI (5') und His-Stopp-Gb1 II (3')-Stellen wurden in voller Länge der G250-cDNA (1,6 kg) mit Hilfe der PCR unter Verwendung der folgenden Primer eingeführt: 5' G250 (NotI):
gagggagcggcc(gct)cccctgtgcccc (Entfernung für Startcodon, SEQ ID Nr.:7), 3' G250-His-Stoppcodon-Bgl II: (1) gcagagatct(cta)atggtgatgtatggtgggctccagtctcggcracctc (SEQ ID Nr.: 8; Klammer = Stopp letzte, zweite underline = 8 His), (2) ggagagatct(cta)atgatgatgatgatgatgatgatgggctccagtctcggctacctct (SEQ ID Nr.: 9, Klammer-Stopp letzte, zweite underline = 8 His).
Die Fragmente wurden unter Erzeugung von M-CSF-NotI-G250-His-Stopp-Bgl II wie folgt ligiert:
5' (gag)ggcggcc(gct)cccctgtgcccc (Rest von GM-CSF-G250) (SEQ ID Nr.: 10); worin (gag) die letzte von GM-CSF ist und (gct) die erste von G250 ist.
Das 250-Fusionsgen wurde insertiert in den Polyhedrin-gen-locus-base-baculovirus-Transfervektor pVL 1393 (PharMingen). Insbesondere wurde das Plasmid pVL 1393 mit Eco RI und Bgl II-Restriktionsendonuclease getrennt und das Eco R1-GM-CSF-G250-his-Stopp-Bgl II-Konstrukt in den Schnittvektor insertiert.
Insektenzellen (sf8-Zellen) wurden unter Verwendung des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen) transfiziert. Dieses umfasste eine Co-Transfektion von lirearisierter BaculoGold-Virus-DNA und rekombinanter Plasmid-DNA, die ein GM-CSF-G250-Fusionsgen enthielt, in die Insektenzellen (sf8-Zellen). Die rekombinanten Baculovieren wurden amplifiziert und die Plaques zur Messung des Virus assayiert.
Das G250-GM-CSF-Protein wurde entsprechend den Protokollen gereinigt, die in der PharMigen-Bedienungsanweisung, 4. Ausgabe, Juli 1997, Seite 41, mitgeliefert wurden. Es wurden kurz Mikrokügelchen durch Resuspendieren der Ni-NTA-Agaroseperlen hergestellt. Es wurden 2 ml Perlen in die 10ml-Chromatographiesäule gegossen (Bindung näherungsweise 7,5 bis 15 mg von 6 × His-Fusionsprotein). Diese Perlen ließ man in der Säule absetzen und ließ das Ethanol-Konservierungsmittel ab. Die Perlen wurden sodann mit 6 × His-Waschpuffer (Kat. # 21472A, PharMigen) mit 7,5 ml 6 × His-Waschpuffer zweimal gewaschen.
Es wurde ein Zelllysat-Präparat durch Resuspendieren eines Zellpellets in eiskaltem Insektenzellen-Lösepuffer (Kat. # 21425A, PharMigen) hergestellt, der einen rekonstituierten Proteasehemmer-Cocktail enthielt (Kat. # 21426Z, PharMigen). Die Zellen wurden auf Eis für 45 Minuten unter Verwendung von 1 ml Lysepuffer pro 2 × 10⁷-Zellen lysiert. Das Lysat wurde in ein sauberes Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 U/min für 30 Minuten zentrifugiert oder durch ein 0,22μm-Filter filtriert. Der Überstand wurde für die Säule aufgehoben und das Pellet verworfen. Es wurden 150 um Lysat für ein SDS-PAGE-Gel oder Western-Blot und die Bestimmung der Protein-Konzentration aufgehoben.
Das Lysat wurde zu äquilibriert Ni-NTA-Agaroseperlen für die Reinigung mit Hilfe einer Affinitätssäule zugegeben. Der Überstand wurde langsam geladen oder die Perlen in einem konischen 15ml-Röhrchen mit dem Lysat für 1 Stunde bei 4°C gebunden. Die Durchlauffraktion wurde aufbewahrt.
Die Säule wurde mit 10 bis 15 ml 6 × His-Waschpuffer (Kat. # 21472A, PharMigen) gewaschen, wonach man die Säule ohne zu trocknen ablaufen ließ. Der Waschschritt wurde solange wiederholt, bis die Wäsche A₂₈₀ weniger als 0,01 (näherungsweise 4 Wäschen) betrug.
Sodann wurde das Fusionsprotein mit Imidazol eluiert. Verkürzt wurden 4,5 ml des 6 × His-Elutionspuffers (Kat. # 21476A, PharMigen) einschließlich Imidazol wie folgt zugegeben:

I. 0,1 Mol Imidazol mit 6 × His-Elutionspuffer;
II. 0,2 Mol Imidazol mit 6 × His-Elutionspuffer;
III. 0,3 Mol Imidazol mit 6 × His-Elutionspuffer;
IV. 0,4 Mol Imidazol mit 6 × His-Elutionspuffer;
V. 0,5 Mol Imidazor mit 6 × His-Elutionspuffer.

Die Elutionsgeschwindigkeit wurde bei einer Rate aufrechterhalten, die kleiner oder gleich 1 ml pro Minute betrug. Die eluierten Fraktionen wurden aufgenommen (200 μl).
Nach der Analyse mit SDS-PAGE-Gel und Western-Blot wurden die reinen und korrigierten Fraktionen aufgenommen und gepoolt, dialysiert gegen PBS und die Ni-NTA-Reinigung nochmals wiederholt.
Nach der Analyse mit SDS-PAGE-Gel und Western-Blot wurden die reinen und korrigierten Fraktionen nochmals aufgenommen und gepoolt, und gegen PBS dialysiert. Eine weitere Reinigung wurde auf einer Q-Sepharosesäule ausgeführt. Es wurden 1,0 ml der Säule mit 50 mMol NaCl-Puffer X (20 mMol Hepes, 1 mMol EDTA, 20% Glyzerin und 0,5 mMol PMSF) äquilibriert. Die Proteinprobe wurde auf die Säule geladen und die Durchlauffraktion aufgenommen.
Es wurde eine weitere Reinigung auf einer SP-Sepharosesäule ausgeführt. Es wurden 1,0 ml SP-Sepharosesäule mit 50 mMol NaCl-Puffer X (20 mMol Hepes, 1 mMol EDTA, 20% Glyzerin und 0,5 mMol PMSF) geladen. Die Proteinprobe wurde auf die Säule geladen und die Durchlauffraktion aufgenommen und aufbewahrt. Die Säule wurde mit dem Gradienten-Salzpuffer (50 mMol NaCl-Puffer X – 1.000 mMol-Fraktion mit 5,0 ml und 0,1 ml) eluiert. Die Flution erfolgte mit 1.000 mMol NaCl-Puffer X.
Die korrigierten Fraktionen wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert.
1 veranschaulicht eine RT-PCR-Analyse von RCC-Tumorzellen. 2 veranschaulicht eine FACS-Analyse von dendritischen Zellen, die von anhaftenden PBMC-Kulturen genommen wurden.
3 veranschaulicht die Hochregulierung von HLA-Antigen und in dendritischen Zellen mit Hilfe des GM-CSF-G250-Fusionsproteins. 4 veranschaulicht die Cytotoxizität von Masse-PMBC, moduliert durch G250-GM-CSF-Fusionsprotein (Patient 1). Tabelle 1 zeigt eine phänotypische Modulation von Massemonozyten von peripherem Blut durch GM-CSF-G250-Fusionsrotein IL-4 und IL-2 Patient #1).

Phänotyp Anhang 7 Anhang 21

CD3⁺ CD56^- 60 94

CD3^- CD56⁺ 10 3

CD3⁺ CD8⁺ 21 25

CD3⁺ CD4⁺ 40 68

CD3⁺ TcR⁺ 54 90

CD3⁺ CD25⁺ 10 25

Tabelle 2 zeigt eine phänotypische Modulation von Massemonozyten des peripheren Bluts mit Hilfe des GM-CSF-G250-Fusionsroteins IL-4 I-

Phänotyp Anhang 7 Anhang 21 Anhang 42

CD³⁺ CD56^- 70 90 100

CD3^- CD56⁺ 13 1 0

CD³⁺ CD8⁺ 21 22 17

CD3⁺ CD4⁺ 48 74 86

CD³⁺ TcR⁺ 62 91 97

CD3⁺ CD25⁺ 10 28 16
BEISPIEL 2
INDUKTION VON G250-MARKIERTER UND T-ZELL-VERMITTELTER ANTITUMORAKTIVITÄT GEGEN KLARZELLIGES NIERENKARZINOM UNTER VERWENDUNG EINES CHIMÄREN FUSIONSPROTEINS, BESTEHEND AUS G250 UND GRANULOZYTEN-MONOZYTEN-KOLONIE-STIMULIERENDEN FAKTOR
Die Immuntherapie, die auf die Induktion einer T-Zell-vermittelten Antitumorreaktion in Patienten mit klarzelligem Nierenkarzinom (RCC) zielt, ist vielversprechend. Von uns wird hierin eine neuartige RCC-Vakzinationsstrategie beschrieben, mit der die gleichzeitige Zuführung von Dual-Immunaktivatoren möglich ist: G250: ein umfangreich exprimiertes RCC-assoziiertes Antigen; und granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF): ein immunmodulatorischer Faktor für ein Antigen-präsentierende Zellen (APC). Das G250-GM-CSF-Fusionsgen wurde aufgebaut und in SF-9-Zellen unter Anwendung eines Baculovirus-Expressionsvektorsystems exprimiert. Das 66kDa-Fusionsoprotein (FP) wurde anschließend über eine 6 × His-Ni-NTA-Affnitätssäule und ein SP-Sepharose/FPLC gereinigt. Das gereinigte FP besaß GM-CSF-Bioaktivität vergleichbar mit der von rekombinanten GM-CSF bei Test in einer GM-CSF-abhängigen Zelllinie. Bei Vereinigung mit IL-4 (1.000 U/ml), induzierte FP (0,34 mg/ml) eine Differenzierung von Monozyten (CD14⁺) in dendritische Zellen (DC), die einen für APC charakteristischen Oberflächenmarker exprimieren. Die Aufwärtsregulierung von reifen DC (CD83+CD19-) (17% gegenüber 6%) mit verstärkter HLA-Klasse I und -Klasse II-Antigen-Expression wurde in DC aufgezogenen FP gegenüber DC detektiert, das mit rekombinantem GM-CSF aufgezogen war. Die Behandlung von PBMC mit FP allein (2,7 mg/10⁷ Zellen) unterstützte sowohl Th₁ als auch Th₂-Cytokin-mRNA-Expression (IL-2, IL-4, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α). Im Vergleich zu verschiedenen Strategien der Immunmanipulation in langfristigen Kulturen von Masse-PBMC induzierten Zellen, die mit FP (0,34 mg/ml) plus IL-4 (1.000 U/min) für eine Woche behandelt und anschließend mit FP plus IL-2 (20I U/ml) restimuliert wurden, das größte Wachstum von T-Zellen, die T-Zellrezeptor (TcR) exprimiert. Darüber hinaus wurde unter einer solchen immunmodulatorischen Manipulation RCC-spezifische Cytotoxizität, die durch Anti-HLA-Klasse I, Anti-CD3 und Anti-CD8-Antikörper geblockt werden könnte, in vier von sechs getesteten PMBC-Kulturen nachgewiesen. In einem der getesteten Patienten wurde eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber Lymphknoten (LN), deriviert von RCC-Target, im Vergleich zu derjenigen gegenüber primären Tumortargets festgestellt, die einer achtfach höheren G250-Expression in LN-Tumor im Vergleich zu primärem Tumor entsprach. Der Austausch von FP gegen rekombinanten GM-CSF setzte die Auswahl von RCC-spezifischen Killerzellen vollständig außer Kraft. Alle mit FP modulierten PBMC-Kulturen mit Antitumoraktivität zeigten eine aufwärtsregulierte CD3⁺ CD4⁺-Zellpopulation. Diese Ergebnisse zeigen, dass GM-CSF-G250-FP ein starker Immunstimulant mit der Fähigkeit zur Aktivierung von immunmodulatorischem DC und zum Induzieren einer T-Helferzellengestützten, G250-markierten und CD8⁺-vermittelten Antitumorantwort ist. Diese Ergebnisse haben bedeutende Auswirkungen auf die Verwendung von GM-CSF-G250-FP als ein Tumorvakzin für die Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Nierenkrebs.
EINFÜHRUNG
Metastatische klarzelliges Nierenkarzinom (mRCC) stellt wegen seiner Beständigkeit gegenüber konventionellen Therapiearten, wie beispielsweise Chemotherapie und Strahlentherapie (Figlin (1999) J. Urol. 61: 381–387) eine therapeutische Herausforderung dar. Im letzten Jahrzehnt hat es bedeutende Fortschritte in der Behandlung von mRCC seit der FDA-Genehmigung von Interleukin-2 (IL-2) 1992 gegeben. Es ist offenkundig geworden, dass die Immuntherapie in der Lage ist, in ausgewählten RCC-Patienten dauerhafte Remissionen zu erzeugen, wobei jedoch die insgesamten Ansprechraten der Immuntherapie bestenfalls bei näherungsweise 25% (Fisher et al. (1997) Cancer J. Sci. Amer., 3: S. 70) auf Kosten messbarer Toxizitäten des Patienten bleiben. Die neuere Identifikation von MHC-eingeschränkten Tumorassoziierten Antigenen (TAA) und das Verständnis der bedeutenden Rolle immunmodulatorischer dendritischer Zellen (DC) haben die logische Grundlage für die Entwicklung von Tumorvakzinen für die Krebstherapie geliefert (Wang et al. (1999) J. Mol. Med., 77:640–655; Xu et al. (2000) Trends in Biotech. 18: 167–172). Es sind zahlreiche Krebs-Vakzinstrategien entwickelt und sowohl in Tiermodellen als auch in Human-Versuchsreihen mit vielversprechenden Ergebnissen entwickelt und getestet worden. Diese schließen Peptid-basierende Vakzine ein ((Rosenberg et al. (1999) J. Immunol., 163:1690-1695; Parkhurst et al. (1996) J. Immunol., 157: 2539–2548), dendritische zell(DC)-basierende Vakzine (Yang et al. (2000)J. Immunol., 164: 4204–4211; Condon et al. (1996) Nature Med., 2:1122-1128; Zhou et al. (1996) Human Gene Ther., 10: 2719–2724; Nestle et al. (1998) Nature Med., 4: 328–332; Mulders et al. (1999) Clin. Cancer Res., 5:445–454), rekombinante Viren/DNA/RNA-basierende Vakzine (Ulmer et al. (1998) J Virol., 72: 5648–5653; Ying et al. (1999) Nature Med., 5: 823–827; Liu (1998) Nature Med., 4: 515–519), und genmodifizierte Tumorzellen (Mach et al. (1999) Cancer Res., 60: 3239–3246). Trotz der Tatsache, dass man RCC für einen relative immunogenen Tumor handelt, sind keine RCC-assoziierte Antigene identifiziert worden und in Verbindung mit einer bedeutsamen Grundlage für die Entwicklung eines auf Nierenkrebs zielenden Tumorvakzins charakterisiert worden (Gaugler et al. (1996) Immunogenetics, 44:323–330; Brändle et al. (1996) J. Exp. Med., 183:2501–2508; Brossart et al. (1998) Cancer Res., 58: 732–736).
Vor kurzem ist das erste umfangreich exprimierte RCC-Tumor-assoziierte Antigen, das HLA-A2-restringierte CTL-Epitope enthält, identifiziert und aus einer RCC-Zelllinie coloniert worden (Grabmaier et al. (2000) Intl. J. Cancer, 85: 865–870; Vissers et al. (1999) Cancer Res., 59:5554–5559). Dieses RCC-assoziierte Transmembranprotein, bezeichnet als G250, hat sich als identisch zu WN/CAIX erwiesen, ein in Cervicalkrebs-exprimiertes TAA (Opavsky et al. (1996) Genomics, 33: 480–487). Ein immunhistochemisches Anfärben mit mAbG250 ergab, dass mehr als 75% primärer und metastatischer RCC G250 exprimierten, während eine nur geringe bis zu keiner Expression in normaler Niere detektiert wurde ((Grabmaier et al. (2000) Intl. J. Cancer, 85: 865–870). Darüber hinaus wurde eine G250-Expression in nahezu allen klarzelligen Nierenkrebserkrankungen der Niere gefunden und die häufigsten RCC-Varianten, die eine weitere Grundlage für die Verwendung von G250 als ein bedeutendes Immuntarget für die Antikrebstherapie gewährt. Eine Antigenpräsentation ist ein entscheidender erster Schritt für eine auf Vakzin basierende Immuntherapie. Wir haben daher hypothetisch zugrunde gelegt, dass ein chimäres Protein, dass aus G250 und GM-CSF besteht, ein immunmodulatorischer Faktor für die Erzeugung von funktioneller DC ist und die Vakzinkapazität im Vergleich zu der Verwendung beider Mittel allein verbessern würde. Es sind mehrere chimäre Fusionsproteine, die GM-CSF enthalten, veröffentlicht worden und haben eine Vielzahl komplexer biologischer Wirkungen in Abhängigkeit von ihren Fusionskomponenten gezeigt (Hall et al. (1999) Leukemia, 13: 629–633; Tripathi et al. (1999) Hybridoma 18: 193–202; Battaglia et al. (2000) Exp. Hematol., 28: 490–498; Batova et al. (1999) Clin. Cancer Res., 5: 4259–4263). GM-CSF ist als ein Wachstumsfaktor gut charakterisiert worden, welche die Proliferation und die Reifung von Myeloid-Progenitorzellen induziert (Rill et al. (1995) J. Leukocyte Biol. 58: 634–642). Es erhöht die natürliche Macrophagen- und granulozyten Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen (Parhar et al. (1992) Europ. Cytokine Network, 3: 299–306). Die Funktion von GM-CSF als ein Schlüsselfaktor für die Differenzierung von DC untermauert weiter seine Adjuvans-Bedeutung in der immunbasierenden Vakzintherapie (Jonuleit et al. (1996) Archives of Dermatological Res. 289:.1–8). Ein direkter Beweis für die Adjuvans-Wirkungen von GM-CSF in der Vakzin-basierenden Immuntherapie ist in Tiermodellen nachgewiesen worden. Die Immunisierung mit Tomorpeptid auf Stellen auf der Haut, die epidermales DC enthielten, die neuerdings duch Vorbehandlung mit DNA-codierendem GM-CSF hervorgegangen ist, beleuchtet die antigenspezifische T-Zellreaktion, während eine Peptid-Immunisierung einer Kontrollstelle der Haut keine Immunreaktion zeigte ((Bowne et al. (1999) Cytokines Cellu. Mol Ther., 5: 217–225). In ähnlicher Weise zeigte eine Behandlung eines etablierten Tumors mit einem hybridisierten Zellvakzin, das durch Verschmelzen von GM-CSF-genmodifizierter DC mit Melanomzellen erzeugt wurde, eine größere therapeutische Wirksamkeit im Vergleich zu der Behandlung mit hybridisiertem Vakzin, das mit nichtmodifizierter DC erzeugt wurde (Cao et al. (1999) Immunol., 97: 616–625). Eine erste Phase I-Reihe demontrierte ferner, dass eine systemische Injektion von GM-CSF und IL-4 zum Induzieren einer Tumorregression und einer stabilen Reaktion der Erkrankung in Patienten mit fortgeschrittenem RCC und Prostatakrebs in der Lage war (Roth et al. (2000) Cancer Res., 60:1934–1941). In ähnlicher Weise induzierte eine Vakzination von Patienten mit bestrahlten autologem RCC oder Melanomzellen, die auf Abgabe von Human-GM-CSF bearbeitet waren, ebenfalls eine starke Antitumorimmunität (32 Simons et al. (1997) Cancer Res. 57: 1537–1546; Soiffer et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 5: 13141–13146).
In diesem Beispiel beschreiben wir eine Strategie zur Erzeugung von Fusionsproteinen (SP), die aus G250 und GM-CSF bestehen. Darüber hinaus haben wir die Möglichkeit der Verwendung dieses nichtviralen und nichtzellulären RCC-Tumorvakzins als ein Immunstimulant für die in vitro-Modulation von DC und Induktion von G250-markierter Antitumorreaktion in PBMC-Kuituren getestet, die von Patienten mit fortgeschrittenem Nierenkrebs entnommen waren.
MATERIALIEN UND METHODEN
KLONIEREN VON GM-CSF-G250-FUSIONSGEN IN PVL 1393-VEKTOR
Das Plasmid p91023(B)-GM-CSF (Wong et al. (1985) Science 228: 810–815) wurde mit EcoR I digeriert und das 0,8kb-Fragment, das die volle Länge von GM-CSF-cDNA enthielt, zur Erzeugung des 0,4kb-GM-CSF-Fragments verwendet, welches das' flankiert von einer EcoR I-Stelle an der 5'-Seite und eine Not I-Stelle an der 3'-Seite enthielt, die das GM-CSF-Stoppcodon durch DNA-PCR ersetzt. Das GM-CSF-Fragment von dem PCR-Produkt wurde in die EcoR I und Bgl II-Stellen vom Polyhedrin-gen-locusbasierendem Baculovirus-Transfervektor pVL1393 (Pharmigen, San Diego, CA). subkloniert. In ähnlicher Weise wurde pBM20CMVG250 Osterwick (2000) Int. J. Cancer, 85: A65–A70) verwendet, um die volle Länge von G250-cDNA (1,6 kb), die eine Not I-Stelle gefolgt von einem 6 Nucleotid-Linker enthielt, der mit 2 Arginine mit Hilfe der PCR in der 5'-flankierenden Region des G250 codiert nach der Entfernung seines Startcodons verwendet. Die 3'-flankierende Region von G250 wurde so konzipiert, dass sie 6 Histidine, gefolgt von dem Stoppcodon und der Gb1 II-Stelle codiert. Das G250-Fragment wurde einer Gel-Reinigung unterzogen. Sowohl der Vektor pVL1393, der bereits den GM-CSF enthielt, als auch die G250-PCR-amplifizierten Fragmente wurden mit Not I und BgI II herausgeschnitten. Das G250-Fragment und der Vektor wurden ligiert für 3 Stunden bei 16°C und später transformiert und auf LB-Platten aufgezogen. Die Kolonien, die das korrigierte Plasmid enthielten, wurden mit Hilfe der Ultrazentrifugation mit Cäsiumchlorid, aufschwimmend, gereinigt. Das Plasmid wurde mit einer Reihe verschiedener Restriktionsenzyme zur Verifikation der Plasmide getrennt. Die Plasmid-Klone wurden weiter auf Histidin-Tag unter Anwendung des "Perkin Elmer" verifiziert.
ERZEUGUNG UND REINIGUNG VON FUSIONSPROTEIN
Es wurde der rekombinante Baculovirus, der His-markiertes GM-CSF-G250-Fusionsgen enthielt, durch Co-Transfektion von 0,5 mg BaculoGold-DNA (modifizierte AcNPV-Baculovirus-DNA) (Pharmigen, San Diego, CA) und 5 mg pVL1393/GM-CSF-G250 in Sf9-Zellen (Spodoptera frugiperda) erzeugt. Die Viren wurden weiter bei geringem MOI (< 1) in adhärierenden S19-Insektenzellen amplifiziert und die Titer des Virus mit Hilfe des Plaqueassays bestimmt. Die Expression von GM-CSF-G250-FP in Sf9-Zellen wurde mit Hilfe der immunozytochemischen Analyse unter Verwendung von Anti-G250 mAb, Anti-GM-CSF-Antikörper (Genezyme, Cambridge, MA) und irrelevanter Ab bestimmt. Als negative Kontrolle für die FP-Expression und Analyse wurden Sf9-Zellen infiziert mit pVL1392-XyIE-rekombinantem Virus (Pharmigen) und nichtinfizierten Sf9-Zellen verwendet. Die Viren, die für die Proteinerzeugung verwendet wurden, wurden isoliert und aus einem einzelnen Plaque ampliflziert. Das Zell-Lysat wurde hergestellt aus den Sf9-Zellen, infiziert mit Viren bei MOI von 5 für drei Tage mit Insektenzell-Lysepuffer, der einen Proteasehemmer-Cocktail enthielt (Pharmigen, San Diego, CA). Das filtrierte Lysat (0,22 mm Filter) wurde auf eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule mit hoher Affinität für 6 × His (Qiagen, Santa Clarita) gegeben. Nach umfangreichem Waschen der Säule (50 mMol Na-Phosphat, 300 mMol NaCl, 10% Glyzerin, pH 8,0) wurde das Fusionsprotein schrittweise in der Säule (50 mMol Na-Phosphat, 300 mMol NaCl, 10% Glyzerin, pH 6,0) durch Erhöhen der Konzentration von Imidazol von 0,1 Mol bis 0,05 Mol eluiert. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4°C ausgeführt. Die Fraktionen wurden mit Hilfe des Western-Blots unter Verwendung von Anti-GM-CSF-Antikörper analysiert. Die Peak-Fraktionen wurden vereint, dialysiert und erneut auf eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule zur wiederholten Reinigung gegeben. Es wurden Fraktionen, die FP enthielten gepoolt, dialysiert und weiter auf eine FPLC-Säule gegeben, die SP-Sepharose Highperformance enthielt (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Das Fusionsprotein wurde mit einem zunehmenden Salzgradienten von 50 mMol bis 1 Mol NaCl in Puffer X (20 mMol Tris, 1 mMol EDTA, 10% Glyzerin) eluiert und die FP-enthaltenden Fraktionen gepoolt, dialysiert und durch ein 0,2 m Filter sterilisiert. Die Coomassie-Blau- und Silberanfarbungen wurden verwendet, um die Reinheit des GM-CSF-G250-Fusionsproteins zu messen. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Bio-Rad Dc-Protein-Assays (Bio Rad, Hercules, CA 94547) bestimmt.
GM-CSF-ABHÄNGIGES PROLIFERATIONSASSAY
Die biologische Aktivität der GM-SF-Komponente des FP wurde ermittelt, indem die Proliferation vom GM-SF-abhängigen TF-Zellen gemessen wurde (Kitamura et al. (1989) J. Cellu. Physiol., 140: 323–334), und zwar in Gegenwart von FP. Es wurden TF-1-Zellen in 96-Muldenplatten in dreifachem Kulturmedium beimpft (RPMI-Medium + 10% FRS) bei einer Konzentration von 2 × 10⁴-Zellen/Mulde, die eine titrierte Konzentration von FP oder die entsprechende Menge von rekombinanten GM-CSF (rh-GM-CSF) enthielten. Die Kulturen wurden für 5 Tage inkubiert und 3H-Thymidin (0,1 mCi/Mulde) 12 Stunden vor der Ernte zugegeben. Das eingebaute ³H-Thymidin wurde mit Hilfe des Szintilationszählens mit einem β-Zähler gemessen.
PHÄNOTYPISCHE ANALYSE DES DC MIT HILFE EINES FLUORESZENS-AKTIVIERTEN ZELLSORTIERENS (FACS)
Es wurde der Phänotyp des sowohl aus adhärierender als auch Masse-PBMC-erzeugter DC mit Hilfe eines zweifarbigen Immunofluoreszens-Anfärbens entsprechend der Beschreibung von Hinkel et al. (2000) J. Immunother., 23: 83–93) bestimmt. Sowohl adhärierende PBMC als auch nichtfraktionierte Masse-PBMC wurden mit 1.000 U/ml von IL-4 entweder plus GM-CSF (800 U/ml) oder FP (0,34 mg/ml) für 7 Tage aufgezogen und die Identität von DC bestimmt. Die Zellkulturen (1 × 10⁵-Zellen) wurden resuspendiert in 50 ml FACS-Puffer (PBS, 2% neugeborenes Kälberserum, 0,1% Natriumazid) und mit 10 ml entsprechendem Fluorescein-Isothiocyana (FITC) oder Phycoerythrin (PE), markiert mit monoklonalen Antikörpern für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach dem Anfärben wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 200 ml FACS-Puffer plus 200 ml Paraformaldehyd (2%) resuspendiert. Es wurden fünf von Zehntausend Ereignissen pro Probe auf einem Becton-Dickinson FACScan II-Durchflusszytometer aufgenommen, der gleichzeitig Vorwärtsstreuung (FSC und Seitenstreuung (SSC) aufnahm sowie FL1 (FITC) als auch FL2 (PE)-Daten und unter Nutzung der CellQuest-Software (Becton-Dickinson, San Jose, CA) analysierte.
Die Einstellungen für alle Parameter wurden zu Beginn der Studie optimiert und wärend der gesamten nachfolgenden Analysen konstant gehalten. Die DC-Population in Masse-PBNC-Kultur wurde auf der Grundlage ihrer Größe und Granularität ausgeblendet. In allen Proben wurde die Lage der Quadrantenkursoren bestimmt, indem sie auf die Proben gesetzt wurden, die mit dem entsprechenden Isotyp des Kontroll-Antikörpers gefärbt waren. Die folgenden Antikörper wurden zur Charakterisierung des PC-Phänotyps eingesetzt: Anti-CD86 (B7-2; PharMingen, San-Diego, CA), Anti-CD40 (Caltag, Burlingame, CA), Anti-HLA Klasse I (W6/32, ATCC HB95), Anti-HLA-DR (Immunocytometry System; Becton Dickinson, Mountain View, CA), Anti-CD14 (Catlag laboratories, San Francisco, CA) und Isotype-Kontrolle IgG1/IgG2a (Reckton Dickinson).
Der CD83⁺-Oberflächenmarker wurde verwendet, um die Reifung von DC zu unterstreichen. Um DC ((CD83⁺ CD19^-) von aktivierten B-Zellen (CD83⁺ CD19⁺) zu unterscheiden, wurde ein duales Anfärben unter Nutzung von CD19FITC und CD83PE (Immunotch, Marseille, Frankreich) ausgeführt.
HALBQUANTITATIVE REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR)-ANALYSE VON CYTOKIN PROFIL IN PBMC
Die gesamte RNA wurde aus PBMC, behandelt mit FP (2,7 mg/10⁷ Zellen) für unterschiedliche Zeitabstände bis zu 4 Stunden bei 37°C unter Anwendung der sauren Guanidin-Isothiocyanat-Phenolchloroform-Extraktion extrahiert. Die reverse Transkription von Messenger-RNA in cDNA wurde durch Inkubieren von titrierter RNA mit AMV-reverser Transkriptase Primer-oligo (dT), dNTP und RNAse-Hemmer bei 42°C für 1 Stunde ausgeführt. Es wurden jeweils 1 ml jeder cDNA-Probe unter Einsatz der PCR in einem Gesamtvolumen von 25 ml, (30 ng [³²P]-5'-Oligonucleotid, 100 ng 3'-Oligonucleotid-Primer, 2,5 ml modifizierter 10X-PCR-Puffer, 1,25 Einheiten Taq-Polymerase amplifiziert und zweifach mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 25 ml) autoklaviert. Die PCR-Mischung wurde für 25 Zyklen in einen DNA-Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) amplifiziert. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierung für 1 Minute bei 94°C und einer Wärmebehandlung/Extension für 2 Minuten bei 65°C. Die 32P-markierten PCR-Produkte wurden sodann direkt über Acrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht und anschließend durch Excision der Bande und anschließenden Szintilationszählen quantifiziert.
Die Signalintensivität jedes amplifizierten Produktes wurde auf seine entsprechende β-Actin-mRNA-Expression als eine interne Kontrolle für die quantitative Bestimmung der Expressionsmengen kalibriert. Zusätzlich wurde durch quantitative Analyse durch reihenweise Verdünnung von mRNA ((1:3, 1:10, 1:30 und 1:300) und Co-Amplifikation von β-Actin und GM-CSF-mRNA aufgeklärt. Die Sequenzen der Oligonucleotid-Primerpaare waren die Folgenden: β-Actin: 5'-CAA CTC CAT CAT GAA GTG TGA C-3' (SEQ ID NO:11), 3'-CCA CAC GGA GTA CTT GCG CTC-5' (SEQ ID NO:12); GM-CSF: 5'-CCA TGA TGG CCA GCC ACT AC-3' (SEQ ID NO: 13), 3'-CTT GTT TCA TGA GAG AGC AGC-5' (SEQ ID NO:14), TNF-α: 5'-TCT CGA ACC CCG AGT GAC AA-3' (SEQ ID NO: 15), 3'-TAC GAC GGC AAG GAT TAC ATC-5' (SEQ ID NO:16); IFN-γ: 5'-ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TT-3' (SEQ ID NO:17), 3'-ATG CTC TTC GAC CTC GAA ACA GCA T-5' (SEQ ID NO:18); IL-2: 5'-GGA ATT AAT AAT TAC AAG AAT CCC-3' (SEQ ID NO:19), 3'-GTT TCA GAT CCC CTT TAG TTC CAG-5' (SEQ ID NO:20); IL-4: 5'- CTT CCC CCT CTG TTC TTC CT, 3' TTC CTG TCG AGC CGT TTC AG-3' (SEQ ID NO:21).
IMMUNMODULATION VON PBMC FÜR FUSIONSPROTEIN

Es wurde frisch isoliertes PBMC von Patienten mit RCC, die G250 exprimieren, in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% autologem Serum in Kultur genommen. Es wurden verschiedene Ablauffolgen der immunmodulatorischen Protokolle von PBMC-Kurturen mit FP entsprechend der Beschreibung in Tabelle 3 und 10 ausgeführt. Das Aufziehen von PBMC wurde durch Zellenzählen bestimmt und die zytolytische Aktivität von PBMC auf unterschiedlichen Targets in einem verlängerten, 18-stündigen Chrom-51 (51 Cr)-Freisetzungsassay analysiert. Es wurden Fünftausen 51 Cr-markierte Targetzellen in eine 96-Mulden-Mikrotiterplatte beimpft (Costar, Cambridge, MA) und mit PBMC gemischt und lieferten mehrere E/T-Verhältnisse (40.1, 20:1, 10:1 und 5:1). Die Cytotoxizität wurde als lytische Einheiten (LU) pro 10⁶-Effektorzellen ausgedrückt, wobei eine lytische Einheit definiert ist als die Zahl der Effektorzellen, die 30% Lyse induziert. Die T-Zell-vermittelte und RCC-spezifische Cytotoxizität wurde mit Hilfe von Blocking-Assays bestätigt, worin markierte autologe Tumorzellen vorbehandelt wurden mit Antihuman-Leukozytenantigen HLA) Klasse I, Klasse II, oder PBMC wurde vorbehandelt mit Anti-CD3, Anti-CD4, Anti-CD8 oder einem Isotyp-Kontrollantikörper (Becton Dickinson) für 30 Minuten bei 4°C, bevor die Zugabe von Zellen zu den Kulturplatten der Cytotoxizität erfolgte. Die spontane Freisetzung aller Targets war gleich oder kleiner als 20% der maximalen Freisetzung von 51-Cr-Freigabe. Die folgenden Targetzellen wurden verwendet: autologe normale Nierenzellen (G250-), autologe RCC-Tumorzellen (G250+), allogene RCC-Zellen (G250+), allogene Prostatazellen (CL-1) und Human-Fibroblasten (hFb). TABELLE 3: PÄNOTYPISCHE MODULATION VON MASSE-PBMC DURCH FUSIONSPROTEIN FP

Phänotyp	vorkultiviert	IL-2	IL-2 + FP	IL-2 + IL-4 + FP IL-2 + PF	FP IL-2 + PF	FP + IL-4 IL-2 + PF
CD56⁺ CD3^-	25	13	11	4	9	1
CD56^- CD3	46	47	70	84	88	94
CD4⁺ DC8	31	28	39	42	66	46
CD4⁺ CD8⁺	3	10	20	29	4	28
CD4^- CD8⁺	22	24	31	24	22	25
CD3⁺ TcR⁺	40	45	72	69	79	96
CD3⁺ CD25⁺	19	43	61	54	17	86

ERGEBNISSE
ERZEUGUNG VON GM-CSF-G250-FUSIONSPROTEIN AUS MIT BACULOVIRUS-INFIZIERTEN SF-9-ZELLEN
Die Technologie der Baculovirus-Expression und das 6 × His-Affinitätsreinigungssystem wurden entsprechend der vorstehenden Beschreibung zur Erzeugung von GM-CSF-G250-FP angewendet. Der Erfolg des Genklonierens und der Erzeugung von rekombinantem Baculovirus wurde mit Hilfe eines immunhistochemischen Anfärben fon Viren verifiziert, die mit Sf9-Zellen infiziert waren, indem Anti-GM-CSF und Anti-G250 verwendet wurden. Es wurde eine reichliche G250- und GM-CSF-Proteinexpression in Sf9-Zellen nachgewiesen, die mit GM-CSF-G250-rekombinanten Baculoviren infiziert waren (6A, oberes und mittleres Feld), während keine Expression von GM-CSF oder G250 in nichtinfizierten Zellen nachgewiesen wurde (6A, oberes Feld) oder in Zellen, die mit pVL1392-XylE-rekombinanten Viren infiziert waren (Daten nicht gezeigt). Die Western-Blot-Analyse wurde angewendet, um die Wirksamkeit von 6 × His-Affinitäts-Tag in FP für Ni²⁺-NTA-Agarose zu bewerten. Ein erwartetes 66kDa-Band, das mit Anti-GM-CSF detektiert wurde, erschien in den von Nr. 5 bis Nr. 25 mit der Peak-Konzentration bei Fraktion 15 bis 19 (6B) aufgenommenen Fraktionen. Die Proteinreinheit wurde durch erneuten Durchlauf positiver Fraktionen durch Ni²⁺-NTa-Agarosesäule verbessert und einer FPLC unter Verwendung einer SP-Sepharosesäurel unterworfen. Ein größeres einzelnes 66kDa-Band wurde in der SDS-PAGE-Analyse angefärbt mit Coomassi-Blau (6C) nachgewiesen.
GEREINIGTES G-CSF-G250-FUSIONSPROTEIN MIT ERHALTENER GM-CSF-BIOAKTIVITÄT
Um zu bestimmen, ob die Bioaktivität des GM-CSF in dem gereinigten FP bewahrt bleibt, wurde das FP auf seine Fähigkeit analysiert, die Proliferation einer GM-CSF-abhängigen Zelllinie, TF-1, zu halten. Reihenverdünnungen von FP wurden ausgeführt, um den wirksamen Konzentrationsbereich abzutasten. Die Versuche wurden parallel mit rekombinanten GM-CSF ausgeführt. Die Ergebnisse aus dem ³H-Thymidin-Inkorporationsassay, dass das FP TF-1-Zellwachstum mit einer zweiphasigen, dosisabhängigen Form stimulieren könnte (7B). Durch Vergleich mit rekombinantem GM-CSF (7A) wurde eine vergleichbare Bioaktivität in Gegenwart von FP mit äquivalenten Konzentration von GM-CSF im Bereich zwischen 0 und 6,71 ng/ml (= 0 bis 30,2 ng/ml FP) ermittelt. In Gegenwart von höheren Konzentrationen als 30,2 ng/ml FP war die Wachstumseinleitung von TF-1 durch FP um das 1,3-fache größer als die Wachstumseinleitung durch rekombinanten GM-CSF (7A, 7B).
IMMUNMODULATORISCHE WIRKUNG VON FUSIONSPROTEIN AUF ANTIGEN-PRASENTIERENDE ZELLEN IN PBMC-KULTUR
Um festzustellen, wie das FP die Entwicklung von DC beeinflussen würde, wurden von Patienten mit RCC derivierte PBMC in Gegenwart von FP (0,34 mg/ml) plus IL-4 (1.000 U/ml) für 7 Tage in Kultur genommen und mit denen verglichen, die in GM-CSF (800 U/ml) plus IL-4 kultiviert wurden. Die FACS-Analyse ergab einen hohen Prozentanteil großer Granulozyten, die B7-2⁺ exprimierten, CD40⁺ und HLA-Dr⁺, und zwar unter beiden Bedingungen, während CD14⁺-Zellen vernachlässigbar waren (8A). Jedoch wurden im Vergleich mit dendritischen Zellen, die mit rekombinanten Cytokinen kultiviert wurden, eine verstärkte Expression sowohl von HLA Klasse I (mittlere relative lineare Fluoreszensintensität = 4830 gegenüber 3215) als auch HLA Klasse 11 (6890 gegenüber 6290) in den FP-modulierten DC-Kulturen nachgewiesen (8B). Zusätzlich gab es eine dreifache Zunahme von reifen DC (CD83⁺ CD19^-) in FP-modulierten PC-Kulturen (8C). Diese Beobachtung stand in Übereinstimmung mit mehreren Masse-PBMC-Kulturen, die von RCC-Patienten (n = 3) und gesunden Spender (n = 2) abgenommen wurden. In ähnlicher Weise wurde ein FP-vermitteltes immunmodulatorisches Profil auch an konventionellen adhärierenden DC-Kulturen bestimmt (Daten nicht gezeigt). Eine geringere Wirksamkeit der DC-Differenzierung wurde dann beobachtet, wenn DC in Gegenwart von FP allein ohne IL-4 kultiviert wurde. Eine Mischung von CD14⁺ und CD14B7^-2⁺-Zellpopulation wurde am Tag 7 ermittelt (Daten nicht gezeigt).
FUSIONSPROTEIN INDUZIERT AKTIVIERUNG VON CYTOKIN-GENEN IN PBMC
Um zu identifizieren, ob das Fusionsprotein einen direkten Einfluss auf die Regulierung von Cytokin-Genen in PBMC hat, wurden frisch isolierte PBMC-Zellen, abgenommen von RCC-Patienten, mit FP allein (2,7 mg/10⁷-Zellen) behandelt. Die Kinetik der Cytokingen-Aktivierung wurde mit Hilfe der Analyse der multiplen Cytokin-mRNA-Expression in Abhängigkeit von der Zeit entsprechend der Darstellung in 9 verfolgt. Im Vergleich zu unbehandeltem PBMC verstärkte die Behandlung von nichtkultiviertem PBMC mit FP allmählich die Expression von GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-2, mRNA mit dem Peak-Niveau bei 24 Stunden nach der Behandlung mit Ausnahme von IL-4. Der Peak, der IL-4-Expression wurde 6 Stunden nach der Behandlung detektiert (9).
FUSIONSPROTEIN INDUZIERT T-ZELLEN-VERMITTELTE UND G250-GERICHTETE IMMUNREAKTION IN PBMC-KULTUREN
Es wurden fünf immunmodulatorische Protokolle mit un ohne FP getestet und in PMBC-Kuluren verglichen. Diese Kulturbedingungen schlossen ein: 1) IL-2 allein (40 ILJ/ml), 2) IL-2 + FP (0,34 mg/ml)(re-stimuliert wöchentlich), 3) IL-2 + IL-4 (1.000 U/ml) + FP für eine Woche und anschließender Re-Stimulation mit FP + IL-2, 4) FP allein für eine Woche mit anschließender Re-Stimulation mit FP + IL-2 sowie 5) FP + IL-4 für eine Woche mit anschließender Re-Stimulation mit IL-2 + FP. Wie in 10 dargestellt (Patient #1), zeigte unter zahlreichen immunmodulatorischen Behandlungen, die getestet wurden, die Bedingung mit vorbehandelter PBMC mit FP + IL-4 für eine Woche und anschließender Re-Stimulation mit IL-2 (40 IU/ml) und FP wöchentlich die höchste Wachstumsexpansion (6,0-fach) (10A). Ein ähnliches Wachstumprofil mit verstärkter Wachstumsaktivität unter dieser speziellen Bedingung wurde in anderen 3 PBMC-Kulturen ermittelt, die von Patienten mit RCC abgenommen wurden. In einem speziellen Patienten (Patient #1), der einen positiven Lympfknoten (LN) hatte, wurde eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber LN-deriviertem Tumortarget in allen vier Ff-modulierten PBMC-Kulturen (3 Zyklen Re-Stimulation) im Vergleich zu der Cytotoxizität gegenüber primärem Tumorgarget (10B) nachgewiesen. Bemerkenserterweise entspricht diese erhöhte Aktivität des Tötens einer 8-fachen Zunahme der G250-mRNA-Expression in LN aus einem RCC-Tumor, was mit Hilfe einer halbquantitativen RT-PCR bestimmt wurde im Vergleich zu primären RCC-Zellen (10C). Wenn LN-Tumor-Targetzellen mit Anti-HLA Klasse I (77%) vorbehandelt wurden oder alternativ Effektoren mit Anti-CD3 (66%) oder Anti-CD8 (55%) vor dem Assay vorbehandelt wurden, war die RCC-gerichtete Cytotoxizität deutlich verringert. Während die Anti-HLA Klasse 11 (33%) oder Anti-CD4 (33%)-Behandlung lediglich zu einer geringeren Hemmung der Cytotoxizität (10C) führen konnte, wurde dennoch eine geringere Wachstumsexpansion (1,8-fach) unter der Bedingung nachgewiesen, dass mit FP allein für eine Woche vorbehandeltes PBMC und re-stimuliert mit IL-2 + FP die höchste Cytotoxizität sowohl gegenüber primäres als auch LN-deriviertes RCC-Target im Vergleich zu anderen getesteten Bedingungen nachgewiesen wurde (10B).
Um die phänotypische Identität von FP-moduliertem PBMC zu identifizieren, das eine Antitumoraktivität besitzt, wurde eine phänotypische Analyse an dem Tag ausgeführt, an dem die Cytotoxizität bestimmt wurde. Eine merkliche erhöhte T-Zellpopulation (70 bis 94%), die T-Zeltrezeptor exprimiert (72 bis 96%) wurde in allen Ff-stimulierten PBMC-Kulturen im Vergleich zu vorbehandeltem PBMC (46%) oder mit IL-2 allein in Kultur genommenem PBMC (47%) (Tabelle 3) nachgewiesen. Bemerkenswerterweise wurde festgestellt, dass die T-Zellpopulation, die den meisten IL-2-Rezeptor (CD3⁺ CD25⁺) (86%) exprimiert, unter der Bedingung vorbehandelter Zellen mit FP + IL-4 vor der Re-Stimulation mit Il-2 und FP auftritt. Dieses entspricht ebenfalls der größten Wachstumsexpansion in der T-Zellpopulation im Vergleich zu allen anderen getesteten immunmodulatorischen Protokollen (10A). Dementsprechend zeigte PBMC, dass mit FP für eine Woche vorbehandelt wurde, eine minimale T-Zellpopulation, die den IL-Rezeptor exprimiert (19%) und zeigte die kleinste Wachstumsexpansion (Tabelle 3 und 10A).
AUSTAUSCH VON FP GEGEN GM-CSF SETZT DIE SELEKTION VON RCC-GERICHTETEN ZYTOTOXISCHEN T-ZELLEN AUßER KRAFT
Um zu bestätigen, dass die Komponente von G250 in dem FP die bestimmende Größe für die Wachstumsselektion von CTL gegen RCC ist, wurde mit PBMC ein Cytotoxizitäts-Assay ausgeführt, das in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 für eine Woche in Kultur genommen wurde und anschließend kontinuierlich mit IL-2 und GM-CSF (800 U/ml) re-stimuliert wurde. In allen getesteten PBMC-Kulturen wurde eine minimale Cytotoxizität gegen autologes RCC ohne FP-Stimulation bestimmt. Während die entsprechenden PBMC-Kulturen, die FP stimuliert waren, eine NHC-restringierte T-Zell-vermittelte Cytotoxizität gegen autologes RCC zeigten (11A), die hohe Mengen an G250 exprimierten (Daten nicht gezeigt), wurde eine überwiegende CD3⁺ CD4⁺-Zellpopulation in allen drei FP-modulierten PBMC-Kulturen nachgewiesen (68%, 74% und 66%), die Antitumoraktivität exprimierten, wenn mit CD3⁺ CD8⁺-Zellpopulation verglichen wurde (25%, 22% und 30%) (11B). Darüber hinaus wurde sowohl Th1 und Th2-Cytokin-mRNA in diesen FP-modulierten PBMC-Kulturen nachgewiesen, in die GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-2 und IL-4 einbezogen waren (Daten nicht gezeigt).
DISKUSSION
Das Nierenkarzimon (RCC) ist auf eine Immuntherapie ansprechbar. Allerdings nimmt man an, dass bisher kein immunbasierendes Behandlungsprotokoll entwickelt worden ist, das eine wirksame Eradikation von Tumorschädigungen in der Mehrzahl von Patienten zeigt. Es wird angenommen, dass Mittel der Immunstrategie, der Typ von Immunaktivatoren, der verwendet wird, die Methode der Verabreichung und der Immunstatus vor der Behandlung der Patienten insgesamt die eigentliche Immunreaktion in Krebspatienten beeinflussen können, die mit einer immunbasierenden Therapie behandelt werden. Daher ist ein bedeutendes Thema für ein wirksames Krebsvakzin die Entwicklung einer starken Adjuvans, die sowohl die Induktion als auch die Verstärkung einer Immunreaktion mit Antitumoraktivität erleichtern kann. Um dieses zu erreichen, haben wir ein chimäres Konstrukt vorgeschlagen, das aus G250 und GM-CSF besteht. Der Nachweis der G250-Expression in Sf9-Zellen und die GM-CSF-Bioaktivität in dem gereinigen 66kDa-Band des Proteinmoleküls bestätigte die Wirksamkeit des Gen-Konstruktes und die Wirksamkeit der ausgewählten Protein-Reinigungsmethode.
Die Antigen-Präsentation durch DC ist nicht nur für die Induktion primärer Immunreaktionen von Bedeutung, sondern auch wichtig für die Regulierung des Typs der T-Zell-vermittelten Immunreaktion (Banchereau et al. (2000) Ann. Rev. Immunol., 18: 767–811). Wir haben vor kurzem eine nichtfraktioniertes Masse-PBMC-Kultursystem für die Untersuchung der Reifung und der immunmodulatorischen Funktion von CD14⁺-derivierter DC und der Wechselwirkung zwischen der DC und den gleichzeitig kultivierten Lymphozyten entwickelt (Hinkel et al. (2000) J. Immunother., 23: 83–93). Unter Anwendung dieses Systems kann eine Antigen-Beladung während der ersten Kulturperiode von PBMC in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 vorgenommen werden, wenn unreife DC-Monozyten aufgenommen und ein Tumorantigen bearbeiten können. So haben wir bereits nachgewiesen, dass DC-modulierte, gleichzeitig in Kultur genommene Lymphozyten in Masse-PBMC-Kultur weiter zu CTL durch wiederholte Stimulation mit geringer Dosis IL-2 und RCC-Tumorlysat expandiert werden können. In ähnlicher Weise induzierte die direkte Behandlung von Masse-PBMC mit IL-4 unf FP nicht nur die Differenzierung von CD14⁺-Zellen in DC, sondern erhöhte auch die Reifung von DC im Vergleich zu DC, das in IL-4 und GM-CSF erzeugt wurde. Dieses legt nahe, dass der signalgebende Weg in der DC-Reifung durch FP-Stimulation induziert werden kann (Rescigno et al. (1998) J. Exp. Med., 188: 2175–2180). Darüber hinaus wurde im Vergleich zu rekombinanten GM-CSF eine aufwärtsregulierte HLA-Antigenexpression auf FP-moduliertem PC ermittelt, was darauf hinweist, dass DC's zum Internalisieren, Bearbeiten und Präsentieren von FP durch HLA-Antigene in DC in der Lage sind. Ob das G250 durch APC über eine GM-CSF-Rezeptorinternalisierung oder über die G250-Komponente aufgenommen wurde, bleibt noch nachzuweisen.
Es hat den Anschein, dass eine Präinkubation von PBMC mit FP und IL-4 vor dem Exponieren von IL-2 eine bessere Effektorexpansion erleichtert. Dieses lässt sich erklären, wenn exogenes IL-4 das FP für die Mobilisierung der DC-Differenzierung und -Reifung und nachfolgende Präsentation der Antigen-Paptide zu den umgebenden Immunzellen in Synergie bringen könnte. Obgleich sich eine erfolgreiche CTL-Selektion durch andere getestete immunmodulatorische Protokolle mit FP erreichen ließe, war die Wachstumsexpanstion von CTL nicht günstig. Dieses lässt sich z.T. in Verbindung bringen mit einer "verzögerten" DC-Diffenzierung unter der suboptimalen Konzentration von IL-4 (Hinweis: LFP kann eine IL-4-Sekretion durch PBMC induzieren). Darüber hinaus führt eine Vorexponierung von IL-2 an Non-Antigen-stimulierter PBMC normalerweise zur Expansion von nichtspezifischen Lymphokin-aktivierten Killerzellen mit kurzfristiger Tötungswirksamkeit (Roussel et al. (1990) Clin. Exp. Immunol., 82: 416421). Recently, Huang et al. (1994) Science, 264: 961–965). Vor kurzem haben Huang et al. (1994) Science, 264: 961–965, demonstriert, dass sogar "immunogene" Tumore, wie beispielsweise solche, die zur Exprimierung von Co-Stimulatorischen Molekülen modifiziert wurden, bei der Stimulation des Immunsystems versagen, sofern nicht funktionelles APC verfügbar ist, um die Antigene zu bearbeiten und zu präsentieren. Es hat damit den Anschein, dass die wirksamste Antikrebs-Vakzinationsstrategie auf eine Manipulation von verstärkendem T-Zell-Präming auf dem Niveau des APC in Patienten gerichtet werden sollte.
Dass der Austausch von FP durch eine äquivalente Dosis von rekombinanten GM-CSF die Selektion und Ausbreitung von RCC-spezifischer CTL außer Kraft setzt, legt nahe, dass eine Aktivierung und Ausbreitung von CTL antigen(G250)-abhängig ist. Während der GM-CSF als ein wirksames Adjuvans für die Antigenpräsentation und Amplifikation von T-Zellaktivität gedient hat, einschließlich der Cytokin-Reaktion (Mach et al. (1999) Cancer Res., 60: 3239–3246; Pulendran et al. (1999) Proc. Natl. Acad Sci., USA, 96:1036–1041), wird dennoch FP induzierte, G250-gerichtete Antitumoraktivität hauptsächlich über CD8⁺ T-Zellen vermittelt, eine vorherrschende Aufwärtsregulierung von CD4⁺ T-Zellen, die in den meisten Kulturen nachgewiesen wurde. Die FP-vermittelte Th1- und Th2-Cytokin-Freisetzung und Verstärkung von HLA Klasse II-Expression in DC-Zellen legt ferner nahe, dass eine FP-vermittelte Antitumorimmunität beim Präming sowohl von CD4⁺ als CD8⁺-T-Zellen spezifisch für G250 beteilt ist. Die Rolle von CD4⁺-T-Helferzellen in dieser Reaktion kann zurückgeführt werden auf eine Bereitstellung von regulatorischen Signalen, die für dieses Präming von MHC Klasse I restringierter CD8⁺ CTL erforderlich sind (Mach et al. (1999) Cancer Res., 60: 3239–3246).
Untersuchungen, bei denen die Wirksamkeit verschiedener Formulierungen von Tumorvakzinen parallel verglichen wurden, demonstrierten, dass die Verwendung von DC, transfiziert mit DNA, die auf TAA-codiert, einer Paptid-gepulsten DC und einem nackten DNA-basierenden Vakzin zum Darstellen sowohl der Antigen-spezifischen CD8- als auch CD4-T-Zellreaktion überlegen ist (Yang et al. (1999) Intl. J. Cancer, 83: 532–540). Diese Beobachtung zeigt, dass via computervorhergesagte Peptide nicht auf natürlichem Weg bearbeitet und auf der Tumorzelloberfläche für eine Erkennung durch Peptid präsentiert werden könnten, das mit T-Zellen reaktionsfähig ist. So könnten einige in vitro mit Peptid reaktionsfähige T-Zellen lediglich Peptid-gepulste Zelltargets lösen, nicht jedoch Tumorzellen, die das gesamte Tumorantigen exprimieren (Vissers et al. (1999) Cancer Res., 59:5554–5559; Rammensee et al. (1993) Annual Rev. Immunol., 11: 213–244). In ähnlicher Weise könnte ein Peptid-basierendes Vakzin wirksam die Expansion von Vakzin-spezifischen T-Zellen in PBMC von Krebspatienten hervorrufen., jedoch war eine solche Reaktion nicht von einer klinischen Tumorregression begleitet (Lee et al. (1999) J lmmunol., 163: 6292–6300). Daher kann eine Immunisierung mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt des gesamten G250-Antigens den Vorteil gegenüber den Peptiden für die Präsentation von mehrfachen oder unidentifizierten Epitopen in Verbindung mit MHC Klasse I- und Klasse II-Molekillen durch APC haben. Auf der Grundlage dieser Möglichkeit und der Spezifizität des GM-CSF-G250-Fusionsproteins in der Aktivierung von G250 reaktiven T-Zellen mit Antitumoraktivität zeigen unsere Daten, dass eine Vakzination mit GM-CSF-G250-FP eine therapeutische Auswirkung bei der Behandlung des fortgeschrittenen Nierenkrebses vermittelt.
BEISPIEL 3
ERZEUGUNG DES MAMMALIA-EXPRESSIONSVEKTORS PCEPE-GMCSF-G250
I) AMPLIFIKATION DES REKOMBINANTEN GENS GMCSF-G250 OHNE DEN HIS-ANHANG UND KLONIEREN IN PGEM-T
pVL1393-GMCSF-G250 (His-Anhang) wurde ein Templeat in einer PCR-Reaktion verwendet, die unter Verwendung von Primern ausgeführt, die zur Einführung eines KpnI vor dem Startcodon des GMCSF (5'-Primer) und einer XhoI-Stelle nach dem Stoppcodon (3'-Primer) konzipiet sind. Zusätzlich war der 3'-Primer dazu vorgesehen, die Poly-Histidin-codierende Sequenz, die zuvor zur Detektion und zu Reinigungszwecken eingeführt worden war, zu eliminieren. Ein Hochleistungs-Amplifikationssystem (Expand High Fidelity System, Boehringer- Mannheim) wurde verwendet, um Mutationen in dem PCR-Produkt zu vermeiden, die direkt in den pGEM-T-Vektor (Promega) kloniert waren, ein bequemer Vektor für weitere Schritte des Sequenzierens und Klonieren, woraus pGEM-GMCSF-G250 resultiert. Ein komplettes Sequenzieren des GMCSF-G250-Gens ergab keine Mutation und das erwartete Fehlen der Polyhistidin-codierenden Sequenz.
II) KLONIEREN DES GMCSF-G250 IN DEN MAMMALIA-EXPRESSIONSVEKTOR PCEP4
Der pCEP4 ist ein episomaler Mammalia-Expressionsvektor, der den Cytomegalovirus (CMV) sofort anfangs des Enhancer/Promotors für Transkription rekombinanter Gene auf hohem Niveau nutzt, die in die mehrfachen Klonierungsstellen insertiert sind und führt außerdem das Hyglomycin B-Widerstandsgen für eine stabile Selektion in transfizierten Zellen. Das Subklonieren von GMCSF-G250 in den pCEP4 wurde mit einer Digerierung von Vektoren pGEMT-GMCSG-G250 und pCEP4 mit Restriktionsenzymen KpnI und XhoI und einer weiteren Gelreinigung und Ligation des resultieren, linearisierten pCEP4 und GMCSF-G250 ausgeführt. Das neuartige Plasmid-pCEP4-GMCSF-G250 (12) enthielt erwartungsgemäß das rekombinante Gen in der richtigen Orientierung. Eine große "Sall-Digerierung von pCEP4-GMCSF-G250 setzte die komplette Expressionskassette CMV-Promotor-Gen-Polyadenolyrungssignal (3,7 kb, 13) frei, die in den E1- und E3-deletierten Adenvirus oder "Gutless"-Adenovirus-Gerüst für die Erzeugung des Fusiongen-rekombinanten Adenvirus kloniert werden kann. Diese Fusionsgen-rekombinanten Viren können als eine Virusform verwendet werden, um Patienten direkt oder alternativ auf infizierte RCC-Zellen oder DC zur Erzeugung von Nierenkrebs-Vakzin für die direkte Immunisierung von Patienten verwendet werden. Alternativ lassen definierte RCC-Zelllinien stabil mit pCEP4-GMCSF-G250 transfizieren und als RCC-Tumorvakzin verwenden. Diese verschiedenen Typen von G250-GM-CSF-Vakzinformulierungen können auch als eine in vitro-Immunstimulanz für die Aktivierung und Ausbreitung von G250-gerichteter CTL von PBMC- oder TIL-Kulturen verwendet werden, die von Patienten mit RCC abgenommen sind, wonach diese CTL in die Patienten als eine adoptive Immuntherapie reinfundiert werden.
SEQUENZLISTING
SEQ ID NR.: 1 G250-GM-CSF AMINOSÄURE-SEQUENZ
Fusionsprotein, exprimiert durch GM-CSF-Genfragment (Hinterlegungsnummer # E02287) verknüpft mit der G250-Gensequenz (Hinterlegungsnummer # X66839) über 6 Nucleotide, die auf Arginin (R) codieren:
SEQ ID NR.: 2 G250-GM-CSF NUCLEICSAURESEQUENZ
Expressionskassette von GM-CSF-Genfragment (Hintelegungsnummer # E02287) verbunden mit G250-Gen (Hinterlegungsnummer # X66839) über 6 Nucleotid-Linker (GCGGCC) und markiert mit 18 Nucleotiden, die auf 6 Histidin codieren:

Claims

Konstrukt, aufweisend ein nierenkrebsspezifisches Antigen G250, gebunden an einem Granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF).
Konstrukt nach Anspruch 1, worin der GM-CSF ein Human-GM-CSF ist.
Konstrukt nach Anspruch 1, worin das G250-Antigen ein Human-G250-Antigen ist.
Konstrukt nach Anspruch 1, worin das G250-Antigen kovalent gebunden ist an dem GM-CSF und das G250-Antigen über einem Linker gekoppelt ist an dem GM-CSF, kodiert durch die Nucleotidsequenz gcggcg.
Zusammensetzung, aufweisend ein G250-nierenkrebsspezifisches Antigen, gebunden an einem Granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), sowie ein pharmazeutisch duldbares Streckmittel oder einen Exzipienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, ferner aufweisend ein Adjuvans.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das G250-Antigen kovalent an dem GM-CSF gebunden ist.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das G250-Antigen und der GM-CSF Komponenten eines Fusionsproteins sind.
Nucleinsäure, kodierend ein Fusionsprotein, das ein nierenkrebsspezifisches Antigen G250 gebunden an dem Granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäure in einer Expressionskassette vorliegt.
Nucleinsäure nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäure in einem Vektor vorliegt.
Nucleinsäure nach Anspruch 12, wobei der Vektor ein baculoviraler Vektor ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Nucleinsäure nach Anspruch 9, wobei der GM-CSF und das G250-Antigen ein Human-GM-CSF bzw. ein Human-G250 ist.
Konstrukt nach Anspruch 1, Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Nucleinsäure nach Anspruch 9, wobei das G250-Antigen und der GM-CSF über einen Peptid-Linker mit einer Länge im Bereich von 2 bis etwa 20 Aminosäuren verbunden sind.
Konstrukt, Zusammensetzung oder Nucleinsäure nach Anspruch 15, wobei der Peptid-Linker -Arg-Arg- ist.
Konstrukt oder Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Nucleinsäure nach Anspruch 16, wobei das Konstrukt die Sequenz der SEQ ID NO: 1 hat, das Fusionsprotein die Sequenz die SEQ ID NO: 1 hat oder die Nucleinsäure das Polypeptid der SEQ ID NO: 1 kodiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 16, wobei die Nucleinsäure die Nucleinsäure der SEQ ID NO: 2 aufweist.
Wirtszelle, transfektiert mit einer Nucleinsäure, die die Nucleinsäure nach Anspruch 9 aufweist.
Wirtszelle nach Anspruch 19, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 19, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Verfahren zum Herstellen eines Antitumorvakzins, welches Verfahren die Schritte umfasst: Inkulturnehmen einer mit einer Nucleinsäure transfektierten Zelle, aufweisend die Nucleinsäure nach Anspruch 9, unter Bedingungen, unter denen die Nucleinsäure ein G250-GM-CSF-Fusionsprotein exprimiert; und Gewinnen des Fusionsproteins.
Verfahren nach Anspruch 22, bei welchem die Zelle eine Insektenzelle ist.
Verwendung eines Konstrukts, aufweisend ein nierenkrebsspezifisches Antigen (G250), gebunden an einem Granulozytenmakrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), in der Herstellung eines Medikaments zum Auslösen einer Immunantwort gegen das nierenspezifische Antigen G250 oder einer Zelle, die das nierenspezifische Antigen G250 zeigt, indem eine Zelle des Immunsystems mit dem Konstrukt aktiviert wird.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Immunantwort das Wachstum oder die Proliferation einer transformierten Nierenzelle hemmt.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die transformierte Nierenzelle eine Zelle des klarzelligen Nierenkarzinoms ist.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei die transformierte Nierenzelle eine metastatische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Aktivierung das Kontaktieren einer antigenpräsentierenden Zelle mit dem Konstrukt umfasst.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die antigenpräsentierende Zelle eine dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die aktivierte Zelle ein cytotoxischer T-Lymphozyt (CTL) ist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren eine systemische Verabreichung des Konstrukts umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Aktivieren das Injizieren eines Säugers mit einer DNA umfasst, aufweisend eine Expressionskassette, die eine das Konstrukt kodierende Nucleinsäure aufweist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das Aktivieren das Injizieren des Konstruktes in einem Säuger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei der Säuger ein Säuger ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Menschen, einem Primaten außer dem Menschen, einem Nagetier, einem Schwein, einem Hasen, einem Hund, einer Katze, einem Pferd und einem Rind.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei der Säuger ein Mensch mit der Diagnose eines klarzelligen Nierenkarzinoms oder eines Zervixkarzinoms ist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Kontaktieren einer Zelle umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL), einer dendritischen Zelle und einem tumorinfiltrierenden Lymphozyt (TIL), mit dem Konstrukt.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Beladen einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) mit einem Polypeptid umfasst, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Beladen einer dendritischen Zelle (DC) mit einem Polypeptid umfasst, das ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein aufweist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Einführen einer Nucleinsäure in einen Säuger umfasst, wobei die Nucleinsäure ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei das Aktivieren das Einführen einer Nucleinsäure in das Muskelgewebe des Säugers umfasst und wobei die Nucleinsäure ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Injizieren einer Nucleinsäure in einen Säuger umfasst, wobei die Nucleinsäure ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, ferner umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einem immunmodulatorischem Cytokin oder Medikament.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Aktivieren das Transfektieren einer Zelle mit einer Nucleinsäure umfasst, die ein GM-CSF-G250-Fusionsprotein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer dendritischen Zelle (DC), einem Lymphozyt des peripheren Blutes (PBL), einer antigenpräsentierenden Zelle (APC), einem tumorinfiltrierenden Lymphozyt (TIL), einem Fibroblast, einer Zelle eines Zervixkarzinoms und einer Tumorzelle eines klarzelligen Nierenkarzinoms.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei das Transfektieren durch Verwendung eines Mittels erfolgt, welches eine Zelle transfektiert, wobei das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem viralen Vektor, einem Lipid, einem Liposom, einem Dendrimer und einem kationischen Lipid.
Verwendung eines Proteins, aufweisend ein für Nierenzellenkarzinom spezifisches Antigen (G250), gebunden an einem Granulozytenmakrophagenioloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) oder einem Fragment davon, in der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Proliferation oder des Wachstums einer transformierten Nierenzelle, die ein G250-Antigen trägt, wobei das Hemmen herbeigeführt wird, indem eine Immunzelle von einem Mammalia-Wirt entnommen wird, diese Immunzelle durch Kontaktieren der Zelle mit dem Protein aktiviert wird, wahlweise das Expandieren der aktivierten Zelle; und Infundieren der aktivierten Zelle in einen Organismus, der eine ein G250-Antigen tragende transformierte Nierenzelle enthält.
Verwendung nach Anspruch 46, wobei die Entnahme die Abnahme von Lymphozyten des peripheren Blutes oder TIL's von dem Mammalia-Wirt umfasst.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei das Infundieren das Infundieren der aktivierten Zellen in den Wirt umfasst, von dem Immunzellen entnommen worden sind.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die Immunzelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer dendritischen Zelle, einer antigenpräsentierenden Zelle, einem B-Lymphozyt, einer T-Zelle und einem tumorinfiltrierenden Lymphozyt.