KR100825984B1 - 조사된 인간 ｂ형 간염 표면 항원을 발현하는 암세포를이용하여 종양을 치료하는 방법 및 상기 암세포를 포함하는종양치료용 약학적 조성물 - Google Patents
조사된 인간 ｂ형 간염 표면 항원을 발현하는 암세포를이용하여 종양을 치료하는 방법 및 상기 암세포를 포함하는종양치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 종양 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 종양 세포는 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실되어 있고, 상기 종양 세포는 유전자 조작되어 B 형 간염 표면 항원을 발현하는 것이고, 상기 종양과 상기 종양 세포는 동일한 형태인 방법 및 상기 종양 세포를 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
신장암 세포, HBsAg, 종양 백신
Description
도 1와 2는 각각 pMX-HBsAg-IRES-puro로 형질전환된 신장암 세포주로부터 발현된 인간 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 그 유전자를 나타내는 도면이다.
도 3은 pMX-HBsAg-IRES-puro의 벡터 지도를 나타내는 도면이다.
본 발명은 조사된 인간 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)을 발현하는 암세포를 이용하여 종양을 치료하는 방법 및 상기 암세포를 포함하는 종양치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
종양 특이적 항원이 존재할 것으로 추정됨에도 불구하고, 종양 세포에 대한 효과적이고 자발적인 면역은 거의 관찰되지 않고 있다. 이는 종양 세포와 관련되는 면역 회피 기작이 있기 때문인 것으로 여겨진다. 상기 면역 회피 기작으로 예를 들면, 종양 세포에서의 MHC 1 발현의 하향 조절, 항원성 상실 변이체, 면역 억제성 사이토카인의 생산이 제안되었다 (Gabrilovich D, Pisarev V. Curr Drug Targets 2003;4:525; Piemonti L, Zerbi A, Di Carlo V. Drugs Today (Barc) 2003;39:701). 활성 항종양 면역을 자극하기 위하여, 조사된 종양 백신, 종양 세포와 병원체의 혼합 접종, 수지상 세포 (DC)에 기초한 백신접종 및 사이토카인과의 병용요법 등이 임상적으로 적용되었다 (Baral R. Indian J Exp Biol 2005;43:389.;Morisaki T, Matsumoto K, Onishi H, et al. Hum Cell 2003;16:175.;Yannelli JR, Wroblewski JM. Vaccine 2004;23:97).
신장암 세포 (renal cell carcinoma: 이하 RENCA 라고도 한다)는 화학 및 방사선 요법에 저항성이며, 후기 단계에서 자주 검출된다. 현재 신장암 치료를 위하여 선택할 수 있는 한가지 방법은 신장의 많은 부분을 절제하는 신장 절제술이다. 면역치료법은 가망성이 있는 방법이기는 하나, 초기의 임상 시험 결과는 만족스럽지 못하다(Dillman R, Barth N, VanderMolen L, et al. Cancer Biother Radiopharm 2004;19:570; Tani K, Azuma M, Nakazaki Y, et al. Mol Ther 2004;10:799; Volk J, Sel S, Ganser A, Schoffski P. Curr Drug Targets 2002;3:401). 신장암 세포에 대한 항종양 면역을 생산하기 위하여 사용된 다양한 전략중에서, 자가 종양 백신이 독성이 낮은 치료법으로 알려져 있으며, 가장 흔한 부작용은 주사 부위에서의 국부적 홍반, 국부 통증, 및 열이다. 그러나, 준비하는데 시간이 많이 소요되어 종양백신을 준비하는 동안 종양성장이 더 빨리 진행될 수 있기 때문에, 종양 세포 백신은 충분한 수의 종양세포가 이용가능하지 않다는 단점이 있다 (Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:3539).
종양 세포와는 대조적으로, 대부분의 바이러스는 세포성 면역의 강력한 유도자이다 (Qiu SJ, Lu L, Qiao C, et al. J Cancer Res Clin Oncol 2005;131:429; Restifo NP, Surman DR, Zheng H, Palese P, Rosenberg SA, Garcia-Sastre A. Virology 1998;249:89). 인간 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)에 대한 면역성이 만성 HBV 감염 후의 간암 치료에 이용된 바 있다. HBsAg 백신 접종의 효능은 고도로 면역억제된 암환자에서도 유지된다 (Chisari FV. Rous-Whipple Am J Pathol 2000;156:1117). 더욱이, HBsAg-특이적 반응은 흑색종 펩티드에 대한 인 비트로 T 세포 반응과 연관되어 있고, 일반적 면역능을 증진시킨다 (Smithers M, O'Connell K, MacFadyen S, et al. Cancer Immunol Immunother 2003;52:41).
종래 미국특허 제5,637,483호 및 제5,904,920호에는 GM-CSF를 발현하는 종양 세포를 감마선과 같은 방사선으로 조사하여 증식능을 상실시켜 얻어지는 종양 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, HBsAg를 발현하는 종양세포를 이용하여 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법은 개시된 바 없다.
본 발명의 목적은 방사선 조사되고 HBsAg를 발현하는 종양세포를 이용하여 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 방사선 조사되고 HBsAg를 발현하는 종양세포를 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 종양 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법으로서,
상기 종양 세포는 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실되어 있고, 상기 종양 세포는 유전자 조작되어 B 형 간염 표면 항원을 발현하는 것이고, 상기 종양과 상기 종양 세포는 동일한 형태인 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 종양 세포는 B 형 간염 표면 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "B 형 간염 표면 항원 (HBsAg)"이란 B 형 간염 바이러스의 표면 항원으로서 인체 내에서 B 형 간염 바이러스에 대한 면역반응을 유발하는 것을 말한다. B 형 간염 표면 항원 (HBsAg)은 당업계에 널리 알려져 있으며, NCBI 젠뱅크 허가번호 X01587의 서열을 갖는 것일 수 있다 (Fujiyama,A. et. al., J. Nucleic Acids Res. 11 (13), 4601-4610 (1983)). 본 발명에 사용될 수 있는 방사선은 예를 들면, 자외선 및 감마선과 같이 세포를 불활성화시켜 증식능을 상실시킬 수 있는 것이며, 바람직하게는 감마선이다. 방사선 처리의 시간 및 조건 등은 당업자에 의하여 용이하게 설정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 예들 들면, 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 상기 레트로바이러스 벡터는 도 3의 벡터 지도를 갖는, pMX-IRES-puro 벡터의 Xho1 및 BamH1 부위에 NCBI 젠뱅크 허가번호 X01587의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 pMX-HBsAg-IRES-puro일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 레트로바이러스 벡터는 5' LTR 및 3' LTR을 더 포함할 수 있고, 완전 한 gag, env, 또는 pol 유전자가 결여되어 있고 기능적 선택 마커가 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 레트로바이러스는 plat:E 세포 중에서 패키징될 수 있다. 그외 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는, 종래 알려진 것으로서 HBsAg를 세포 표면에 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 흑색종 또는 암종일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 암종은 신장암, 폐암, 직장암, 유방암 및 전립선암으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 신장암이다.
본 발명에 있어서, 상기 종양 세포는 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실되어 있으나 B 형 간염 표면 항원을 발현하도록 유전자 조작이 되어 있지 않은 상기 종양과 동일한 형태의 종양세포와 조합되어 투여될 수 있다. B 형 간염 표면 항원을 발현하는 상기 종양 세포와 B 형 간염 표면 항원을 발현하지 않는 상기 종양 세포의 비율은 1: 1-5 일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 치료하고자 하는 암의 종류 및 환자의 상태를 등을 고려하여 선택할 수 있다. 이와 같이 두 종류의 종양세포를 혼합하여 투여함으로써, 종양의 치료 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 있어서, 종양 세포를 포유동물에 투여하는 것은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 정맥 내, 피하 또는 근육 내에 주사함으로써 투여될 수 있다. "치료학적으로 유용한"이란 용어는 포유동물 중의 종양의 억제, 퇴화 (regression), 부분적 또는 완전한 제거를 유도하는 양을 의미하며 당업자에 의하여 용이하게 조정될 있다. 상기 용어는 기존 종양의 크기, 능력, 성장속도 또는 모양의 임의의 감소를 의도한 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명의 종양 세포를 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물 내에서 전신적 면역반응을 유도하여 상기 종양 세포를 치료하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 포유동물은 임의의 포유동물이 될 수 있으나, 예를 들면 인간을 포함한 영장류 및 설치류가 포함된다. 포유동물은 바람직하게는, 인간, 생쥐, 돼지 및 소와 같은 가축이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 포유동물은 바람직하게는, B 형 간염 표면 항원으로 면역접종되어 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 포유동물은 B 형 간염 표면 항원으로 면역 접종되어 그 혈액 중에 B 형 간염 표면 항원에 대한 항체를 보유하고 있는 것이다.
본 발명은 또한 B 형 간염 표면 항원을 발현하는 종양 세포를 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실된 종양 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 종양 세포는 B 형 간염 표면 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있는 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 종양 세포 내에서 B 형 간염 표면 항원을 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들면 레트로바이러스 벡터가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스 벡터는 도 3의 벡터 지도를 갖는, pMX-IRES-puro 벡터의 Xho1 및 BamH1 부위에 NCBI 젠뱅크 허가번호 X01587의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 pMX-HBsAg-IRES-puro이다.
본 발명의 약학적 조성물이 사용될 수 있는 상기 종양은 흑색종 또는 암종일 수 있다. 상기 암종은 신장암, 폐암, 직장암, 유방암 및 전립선암으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 신장암이다. 본 발명의 방법에 대하여 설명된 용어와 동일한 것으로 본 발명의 약학적 조성물에서 별도로 설명되지 않은 것은 상기한 방법란에서 설명한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 조성물을 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 있다. 상기 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태를 갖는 것이다.
본 발명의 조성물은 1 x 106세포/kg 내지 5 x 106세포/kg의 양으로 개체에 투여될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 투여량은 치료하고자 하는 포유동물의 종류 및 종양의 상태 등을 고려하여 적절하게 조정할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 포유동물은 임의의 포유동물이 될 수 있으나, 예를 들면 인간을 포함한 영장류 및 설치류가 포함된다. 포유동물은 바람직하게는, 인간, 생쥐, 돼지 및 소와 같은 가축이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 포유동물은 바람직하게는, B 형 간염 표면 항원으로 면역접종되어 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 포유동물은 B 형 간염 표면 항원으로 면역 접종되어 그 혈액 중에 B 형 간염 표면 항원에 대한 항체를 보유하고 있는 것이다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 통상적인 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 멸균 수용액 등의 액제 및 주사제의 형태일 수 있으며, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양(예 : 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
실시예
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
(1) 생쥐 및 세포주
BALB/c 생쥐 (암컷, 6주 내지 8주령)는 Samtago (Kwangju, Korea)로부터 구입하였다. 상기 생쥐를 습도 (55±5%), 빛 (12/12h 빛/암), 및 온도 (22±1℃)로 조절된 동물 사육장에서 특정 병원균이 없는 조건 하 (specific pathogen-free conditions)에서 유지하였다. 상기 사육장 내의 공기는 박테리아 및 바이러스를 배제시키는 HEPA 필터 시스템으로 여과하였다. 생쥐를 생쥐 먹이 및 물을 자유롭게 먹도록 하였다. 모든 실험 과정은 NIH 및 헬싱키 선언의 가이드라인에 따랐고, 동물의 사용 및 관리에 관한 한국가톨릭대학교 위원회에 의하여 승인되었다. RENCA 신장 아데노암종 세포주 (renal adenocarcinoma) (BALB/c와 동종)를 10% FCS 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 중에 유지하였다. 바이러스 패키징을 위하여, 외생의 (ecotropic) 패키징 세포주 Plat-E를 도쿄 대학의 Dr. Toshio Kitamura 박사로부터 기증받았으며, 10% FCS, 1㎍/ml 퓨로마이신, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 중에 유지하였다.
실시예
1: 플라스미드 제조 및 플라스미드
트란스펙션
681-bp 길의 HBsAg 유전자를 플라스미드 pBRHBadr72 (Japan Health Sciences Foundation, Tokyo, Japan) (Nucleic Acid Research, 11, 4601-4610, 1983) 중의 전장 B 형 간염 바이러스 게놈으로부터 5'-CACCATGGAGAACACAACATCAGGATT-3' (포워드: 서열번호 1) 및 5'-TTAAATGTATACCCAAAGACAAA-3' (리버스: 서열번호 2)를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 증폭하고, 레트로바이러스 벡터 pMX-IRES-puro (도쿄 대학의 Dr. Toshio Kitamura로부터 제공받음)의 Xho1 및 BamH1 부위에 삽입하였다. 도 3은 pMX-HBsAg-IRES-puro의 벡터 지도를 나타내는 도면이다 . 상기 재조합 플라스미드 (pMX-HBsAg-IRES-puro) 또는 빈 플라스미드 (pMX-IRES-puro)를 Fugene 6 (Boehringer Mannheim, German)를 사용하여 Plat-E 세포에 트란스펙션하였다. Plat-E 세포에 대하여는 원용에 의하여 그 전체 내용이 본 명세서에 포함되어지는, Morita S, Kojima T, Kitamura T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther 2000;7:1063에 개시되어 있다.
실시예
2: 레트로바이러스 유전자 전달 및 안정한 세포주
Plat-E에 트란스펙션한 후 48 시간 후, 수집된 상등액을 상기 RENCA 세포 배양물에 첨가하여 유전자 전달이 되도록 하였다. HBsAg를 안정적으로 발현하는 상기 세포주를 선발하고 1 ㎍/ml 퓨로마이신을 포함하는 배양 배지 중에서 성장시켰다.
실시예
3: 백신접종 및 종양 유도 전략
재조합 HBsAg (1㎍ i.p. injection, Hepavax; Green Cross Vaccine, Yongin, Korea) 또는 비히클로 능동 면역접종한 후, 종양 접종 전까지 매 3일마다 부스터 주사를 하였다. 상기 단백질 백신 접종을 한 1주일 후, 50-Gy 137Cs 방사능 원 하에서 안정적으로 발현하는 RENCA 세포주를 조사하여 증식능을 상실시켜, 종양 백신을 준비하고, 상기 종양 백신을 생쥐 당 5 내지 10x104 종양 세포의 용량으로 생쥐에 피내 (intradermally)로 주사하였다.
상기 단백질을 면역접종한 2 주일 후, 생쥐 당 1 내지 5x106 종양 세포를 생쥐의 복부에 피하로 접종하였다. 생쥐에서 생성되는 항-HBsAg 항체를, 절삭 값 (ㅍcutoff value) 0.115 O.D. 및 최대 값 4.0 O.D을 갖는 EnzygnostTM HBsAg5.0 (Dade Boehringer, Marburg, Germany)를 사용하여 검출하였다.
결과
RENCA 세포주를 pMX-HBsAg-IRES-puro로 형질전환하여 HBsAg를 발현하는 RENCA 세포주를 생성하였다. HBsAg를 발현하는 RENCA 세포주로부터 얻어진 HBsAg 단백질 및 게놈 DNA를 ELISA 및 PCR를 사용하여 분석하였다 (도.1 및 2). 재조합 HBsAg는 상기 형질전환된 RENCA 세포에서 안정하게 발현되었으며, 상기 재조합 HBsAg는 이하 추후의 모든 실험에 사용하였다. pMX-HBsAg-IRES-puro로 형질전환된 RENCA를 이하 RENCA/HBS라고 한다. 도 1과 2는 각각 pMX-HBsAg-IRES-puro로 형질전환된 신장암 세포주로부터 발현된 인간 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 그 유전자를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, pMX-HBsAg-IRES-puro 및 pMX-HBsAg-IRES-puro로 형질전환된 신장암 세포주의 HBsAg 유전자로부터 증폭된 DNA 산물은 681bp이었다.
상기 종양 백신접종을 조사하기 전에, 본 발명자들은 HBsAg 면역접종의 항종양 활성을 조사하였다. RENCA/HBS 세포는 HBsAg 면역접종에 완전히 민감하였으나, 다른 모든 그룹은 종양을 생성하였다 (표 1 참조).
표 1. rHBsAg 백신접종이 RENCA 또는 RENCA/HBS 챌린지 후에 종양 형성에 미치는 영향
| rHBsAg 백신접종 | 종양백신접종 (PBS만 접종) | 종양 챌린지 (106) | 생쥐에서 종양의 발생빈도 |
| - | PBS | RENCA | 10/10 |
| - | PBS | RENCA/HBS | 10/10 |
| + | PBS | RENCA | 10/10 |
| + | PBS | RENCA/HBS | 0/10 |
이는 HBsAg 백신접종이 HBsAg-발현하는 암세포에 대항하는 특이적인 항종양 면역을 유도한다는 것을 의미한다. 그러나, 신장 세포 암종의 관점에서, 항종양 면역은 HBsAg 특이적 면역반응만을 부스팅함으로써 달성되지 않는다.
종양 백신을 준비하기 위하여, RENCA/HBS 및 RENCA 세포를 방사선 조사하여 살아 있는 암 백신으로부터 더 악성의 표현형이 부여되는 위험을 회피하도록 하였다. 인간 HBsAg 면역을 모사하기 위하여, HBsAg 백신접종 후에 생쥐에 조사된 RENCA (105 세포) 또는 조사된 RENCA 혼합물 (5x104 RENCA/HBS 및 5x104 RENCA)를 투여하고, 다음으로 106 RENCA 세포를 주사하여 종양을 유도하였다. 예기치 않게, RENCA 및 RENCA 혼합물 모두가 상기 생쥐에서 RENCA-유도된 종양 형성을 예방하였다 (표 2).
표 2. HBsAg 면역접종과 연계된 종양 백신이 RENCA에 의한 종양 형성에 미치는 영향
| rHBsAg 백신접종 | 종양백신접종 | 종양 챌린지 (106) | 생쥐에서 종양의 발생빈도 |
| + | RENCA(105) | RENCA | 0/5 |
| + | RENCA/HBS(5x104)+RENCA(5x104) | RENCA | 0/5 |
Dranoff 등은 GM-CSF로 형질전환되고 방사선 조사된 B16 흑색종 세포에서 비슷한 효과를 보고한 바 있다 (Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:3539). 그러나, Dranoff 등의 종양 챌린지는 종양 백신접종에 사용된 양과 동등하였으며, RENCA 백신의 과용량의 비특이적 활성으로부터 GM-CSF로 형질전환된 RENCA 백신접종의 상대적 앙종양 활성을 구분할 수 없었다 (Kerkmann-Tucek A, Banat GA, Cochlovius B, Zoller M. Int J Cancer 1998;77:114). 훨씬 더 많은 종양 부하 (5x106 세포)에서, 표 2에 나타낸 바와 같이, 더 낮은 종양 부하가 RENCA 백신접종만으로 극복될 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 RENCA/HBS의 종양 백신접종 효과를 RENCA의 그것으로부터 구분할 수 있었다. 본 발명자들은 추후의 실험에서 챌린지를 5x106 RENCA 세포로 증가시키고 상기 종양 백신을 5x104 세포로 감소시킴으로써 최적화된 처리 비율을 사용하였다.
RENCA/HBS 백신접종이 RENCA/HBS 종양 부하에 미치는 영향을 또한 조사하였다. HBsAg 백신접종과 함께, RENCA/HBS는 RENCA/HBS 챌린지 후의 종양 형성을 지연시켰다 (표 3 참조).
표 3. 최적화된 용량에서의 HBaAg 면역접종과 연계된 종양 백신접종이 RENCA 또는 RENCA/HBS에 의한 종양 형성에 미치는 영향
| rHBaAg 백신접종 | 종양백신접종 (5x104) | 종양 챌린지 (5x106) | 생쥐에서 종양의 발생빈도 |
| + | PBS | RENCA/HBS | 2/6 |
| - | RENCA/HBS | RENCA/HBS | 4/6 |
| + | RENCA/HBS | RENCA/HBS | 0/6 |
| - | PBS | RENCA | 10/10 |
| + | RENCA | RENCA | 10/10 |
| + | 1/2RENCA/HBS+ 1/2RENCA | RENCA | 4/10 |
HBsAg 백신접종 후 RENCA/HBS 종양 백신의 접종은 동일한 종양 부하 (RENCA/HBS)를 성공적으로 억제하였다. 다음으로, 본 발명자들은 RENCA/HBS 종양 백신 접종이 RENCA 만에 대항하는 항종양 활성을 유도하는지를 조사하였다. 본 발명자들은 생쥐에 최적화된 치료 용량으로 RENCA/HBS 종양 백신를 접종하였고, HBsAg를 발현하지 않는 RENCA 종양세포를 주입하였다. 그 결과, RENCA/HBS 종양 백신은 RENCA에 의하여 매개된 종양을 유의하게 감소시켰으나, RENCA 종양 백신은 종양에 영향을 미치지 않았다 (표 3 참조).
토의
신장암세포 (renal carcinoma cell)는 면역원성이 약하여 종양연관 항원 (tumor-associated antigen)을 제거하는 것으로 알려져 왔다. MHC, B7.1 또는 사이토카인-트란스펙션된 신장암세포를 이용한 임상 실험 및 종래 연구는 면역원성이 약하다는 가정을 강화시켰다 (Marti WR, Oertli D, Meko JB, Norton JA, Tsung K. J Immunol Methods 1997;200:191; Hodge JW, Abrams S, Schlom J, Kantor JA. Cancer Res 1994;54:5552; Simons JW, Jaffee EM, Weber CE, et al. Cancer Res 1997;57:1537). 대조적으로, 고용량의 신장암세포 백신접종은 종양형성을 예방하였으며, 이는 신장암 세포가 잠재적인 면역원성을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이었다. 그러나, 임상적으로, 종양 성장은 아주 빠르기 때문에, 환자에게 사용하기 위하여 충분한 맞춤형 자가 종양 백신을 준비하는 것은 어렵다. 그러므로, 훨씬 낮은 종양 백신접종 용량을 갖는 항원-펄스된 수지상 세포 및 사이토카인 유전자 형질전환된 종양 세포와 같은 더욱 효율적인 종양 백신접종 전략이 요구되고 있다.
본 발명의 방법은 다음과 같은 기작에 의하여 작용하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 이러한 특정한 이론에 한정되는 것은 아니다. 첫째, 입자성 HBsAg 항원은 일부 추정의 신장암 세포 연관 항원에 대항하는 특이적 면역 반응을 촉진할 수 있다. 재조합 HBsAg 백신접종은 RENCA/HBS 종양 백신의 면역학적 인지를 개선시킬 수 있고, 이는 개체가 RENCA 챌린지를 받을 때 일부 추정의 종양 항원에 대한 항종양 면역원성을 유도할 수 있다. HBsAg에 의한 항종양 면역의 이 구경꾼 활성화 (bystander activation)로 인하여, 본 발명의 방법은 환자가 HBsAg에 대하여 지속적인 면역성을 유지하고 있을 때 신장암 세포를 치료하기 위한 아주 유용한 전략이다. 둘째, HBsAg는 일반적 면역능을 증진시켜, 신장암 세포에 대한 항종양 면역에 기여할 수 있다. 종양에 의하여 유도된 면역억제는 신장암 세포에서 국부적으로 시작한다 (Riccobon A, Gunelli R, Ridolfi R, et al. Cancer Invest 2004;22:871). T 세포 수용체 제타 및 엡실론 쇄 및 p561ck 티로신 키나제와 같은 신호 활성화 분자는 신장암 환자의 종양 조직 근처 또는 말단 혈액의 림프구에 비하여 종양을 투과하는 림프구 (tumor-infiltrating lymphocyte)에서 낮은 수준으로 발현되었다. 더욱이, 신장암 환자는 다양한 면역 결함을 갖고, 이에 의하여 질병이 진행됨에 따라 심각한 합병증을 발생한다 (Elsasser-Beile U, Gierschner D, Welchner T, Wetterauer U. Anticancer Res 2003;23:433;Gratama JW, Zea AH, Bolhuis RL, Ochoa AC. Cancer Immunol Immunother 1999;48:263.l; Shabtai M, Ye H, Kono K, et al. Urol Oncol 2003;21:27). 이것이 HBsAg에 의하여 일반적 면역능을 증진시킴으로써 신장암의 진행을 억제할 수 있다는 본 발명의 방법과 연관될 수 있다. HBsAg는 일반적 면역능을 증진시키고, 결과적으로 조사되고 HBsAg를 발현하는 신장 암 세포는 개체의 증진된 면역체계가 HBsAg 뿐만 아니라 근처의 신장암 항원을 인지할 수 있도록 하는 것으로 여겨진다.
요약하면, 개체에 HBsAg 및 조사된 HBsAg를 발현하는 신장암 세포를 백신접종하는 것은 추정의 종양 백신에 대한 특이적 면역반응을 촉진하거나 일반적 면역능을 증진시켜 면역억제된 신장암 환자에서 전체적인 항종양 면역을 개선시킨다.
본 발명의 방법에 따르면, 조사되고 HBsAg를 발현하는 암세포 특히 신장암 세포를 이용하여 포유동물 중의 종양을 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물에 따르면, 포유동물 중의 종양을 효과적으로 치료할 수 있다.
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- B 형 간염 표면 항원을 발현하는 종양 세포를 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실된 종양 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 종양 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 종양 세포는 B 형 간염 표면 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있는 것인 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 도 3의 벡터 지도를 갖는, pMX-IRES-puro 벡터의 Xho1 및 BamH1 부위에 NCBI 젠뱅크 허가번호 X01587의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 pMX-HBsAg-IRES-puro (기탁번호 KCCM-10744P)인 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 종양은 흑색종 또는 암종인 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 암종은 신장암, 폐암, 직장암, 유방암 및 전립선암으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 치료학적으로 효과적인 양의 종양 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 종양 세포는 방사선 조사에 의하여 증식능이 상실되어 있고, 상기 종양 세포는 유전자 조작되어 B 형 간염 표면 항원을 발현하는 것이고, 상기 종양과 상기 종양 세포는 동일한 형태이고, 상기 포유 동물은 B 형 간염 표면 항원으로 면역접종되어 B 형 간염 표면 항원에 대한 항체를 생산하는 인간을 제외한 포유동물인 것을 특징으로 하는, 포유동물 중의 종양을 치료하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 포유 동물은 B 형 간염 표면 항원으로 면역접종되어 B 형 간염 표면 항원에 대한 항체를 생산하는 포유동물인 포유동물의 종양 치료용 약학적 조성물.
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