DE69731756T2

DE69731756T2 - Melanomzellinien, welche immundominante melanomantigene teilen und verfahren zu deren anwendung

Info

Publication number: DE69731756T2
Application number: DE69731756T
Authority: DE
Inventors: M. Drew PARDOLL; M. Elizabeth JAFFEE; Adam Adler; L. Suzanne TOPALIAN; A. Steven ROSENBERG
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-04
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: WO1998006746A3; AU3889997A; JP2014012738A; CA2263503A1; US6187306B1; CA2263503C; JP2008044969A; ATE283069T1; JP2012001548A; JP2016106137A; WO1998006746A2; EP0929318A2; JP2001517206A; EP0929318B1; DE69731756D1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von oder den Schutz gegen Melanom unter Verwendung einer oder mehrerer Melanom-Tumorzellinien als einem Impfstoff, die mehrere geteilte immundominante Melanomantigene exprimieren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung einer allogenen Melanomzellinie als einem Impfstoff. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Melanomzellinie, die geteilte immundominante Melanomantigene exprimiert, und eine Zusammensetzung, die Zellen der Melanomzellinie umfaßt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wird im allgemeinen angenommen, daß Tumorzellen mehrere spezielle Veränderungen in dem Zellgenom, das für ihren krebsartigen Phänotyp verantwortlich ist, enthalten. Diese Veränderungen beeinflussen die Expression oder Funktion von Genen, die das Zellwachstum und -differenzierung kontrollieren. Beispielsweise werden diese Mutationen typischerweise in Onkogenen oder positiven Effektoren der Zelltransformation, wie ras, und in Tumorsuppressionsgenen (oder rezessiven Onkogenen), die negative Wachstumsregulatoren codieren, beobachtet, wobei der Verlust der Funktion davon zur Expression eines transformierten Phänotyps führt. Solche rezessiven Onkogene umfassen p53, p21, Rb1, DCC, MCC, NFI und WTI.
Die Immuntherapie ist ein wirksamer therapeutischer Ansatz zur Behandlung von Krebs. Die Immuntherapie basiert auf der Voraussetzung, daß das Versagen des Immunsystems, spontan entstehende Tumore abzustoßen, mit dem Versagen des Immunsystems, gebührend auf Tumorantigene zu reagieren, verbunden ist. In einem funktionierenden Immunsystem werden Tumorantigene verarbeitet und auf der Zell oberfläche im Rahmen der Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Moleküle der Klasse I und II exprimiert, die bei Menschen auch „menschliche Leukozyten-assoziierte"-(HLA)-Moleküle genannt werden. Komplexe von MHC-Molekülen der Klasse I und II mit Antigenpeptiden werden von CD8⁺- bzw. CD4⁺-T-Zellen erkannt. Diese Erkennung erzeugt eine Reihe von sekundären Zellsignalen und die parakrine Freisetzung von spezifischen Zytokinen oder löslichen sogenannten „Biological Response Modifiers", die Wechselbeziehungen zwischen Zellen vermitteln und die Wirtsabwehr stimulieren, um die Krankheit zu bekämpfen. Die Freisetzung von Zytokinen führt dann zur Vermehrung von Antigen-spezifischen T-Zellen.
Daher involviert die aktive Immuntherapie die Injektion von Tumorzellen, um entweder eine neue oder eine verbesserte systemische Immunantwort zu erzeugen. Die Fähigkeit dieses immuntherapeutischen Ansatzes, eine systemische T-Zellenreaktion gegen einen Tumor zu verstärken, ist vorher offenbart worden, siehe beispielsweise unter anderem Internationale Anmeldung WO 92/05262, Fearon et al., Cell, 60, 397–403 (1990) und Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3539–43 (1993). Die injizierten Tumorzellen werden normalerweise verändert, um ihre Immunogenität zu verstärken, wie durch Beimischung mit nicht-spezifischen Hilfsmitteln oder durch genetische Modifikation der Zellen, um Zytokine zu exprimieren, oder anderen immuncostimulierenden Molekülen. Die eingesetzten Tumorzellen können autolog sein, d. h. aus demselben Wirt stammen, wenn er behandelt wird. Wechselweise können die Tumorzellen MHC-angepaßt sein, oder aus einem anderen Wirt mit denselben oder mindestens einigen von denselben MHC-Komplexmolekülen stammen.
Die meisten Ganzzellen-Krebsimpfstoffe werden unter Verwendung der eigenen Tumorzellen des Patienten hergestellt. Es gibt zwei Gründe für die Verwendung solcher autologen Impfstoffe. Erstens ist, basierend auf den Ergebnissen mit Maustumoren, vorher davon ausgegangen worden, daß jeder Tumor Tumor-assoziierte Antigene (TAA) exprimiert, die für jeden Tumor des Patienten einzigartig sind. Da zweitens die T-Zellerkennung sowohl von dem MHC-Genpaar als auch von dem speziellen Antigen abhängt, umgeht die Verwendung von Zellen aus einem eigenen Tumor des Patienten jede Notwendigkeit zur Anpassung von Tumor- oder MHC-Antigenen.
Jedoch ist die in vitro-Expansion von frischen humanen Tumorexplantaten, die zur Herstellung von autologen Tumorzellimpfstoffen notwendig sind, arbeitsintensiv, technisch anspruchsvoll und häufig für die meisten histologischen Typen von humanen Tumoren selbst mit hoch spezialisierten Forschungseinrichtungen unmöglich. Außerdem ist die Herstellung eines Impfstoffes aus dem Tumor jedes Patienten sehr kostspielig. Es gibt ebenso eine wesentliche Wahrscheinlichkeit, daß sich nach dem ausgedehnten Durchgang von autologen Zellen in Kultur die antigene Zusammensetzung von solchen Zellen in bezug auf den primären Tumor, aus dem die Zellinie stammt, verändern wird, was die Zellen als einen Impfstoff unwirksam macht. Während diese Veränderung mit allen bestehenden Zellinien in bezug auf die Verwendung von autologen Zellen als einem Tumorimpfstoff häufig ist, wird es möglicherweise die Aufrechterhaltung von Gefrierstämmen von jeder zu Anfang isolierten Zellinie für jeden Patienten, der unter Verwendung dieses Ansatzes behandelt wird, erfordern.
Die neuesten Ergebnisse von Huang et al., Science, 264, 961–65 (1994), sind für die Behandlung von Krebs unter Verwendung von Impfstoffen relevant. Vor der Studie von Huang et al. basierten die Tumorimpfstoff-Strategien auf dem Verständnis, daß die Impftumorzellen als die Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) fungieren, die die Tumorantigene auf ihren MHC-Molekülen der Klasse I und II darstellen und direkt den T-Zellarm der Immunantwort aktivieren. Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse von Huang et al., daß die professionellen APCs des Wirts eher als die Impftumorzellen den T-Zellarm der Immunantwort immunologisch aktivieren. In der Studie von Huang et al. ziehen die Tumorimpfstoffzellen, die das Zytokin GM-CSF ausscheiden, den Bereich der Tumorknochenmarks-abgeleiteten APCs heran. Die Knochenmark-abgeleiteten APCs nehmen das gesamte Zellprotein des Tumors zur Verarbeitung auf, und präsentieren dann das/die Antigenpeptid(e) auf seinen/ihren MHC-Molekülen der Klasse I und II. In dieser Weise aktivieren die APCs sowohl die CD4⁺- als auch die CD8⁺-T-Zellarme des Immunsystems, was zur Erzeugung einer systemischen Antitumor-Immunantwort führt, die für die Antigenepitope des Wirtstumors spezifisch sind. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß es nicht not wendig sein muß, autologe oder MHC-angepaßte Tumorzellen bei der Krebsbehandlung zu verwenden.
Es ist ebenso als relevant für die Verwendung von Tumorimpfstoffen bestätigt worden, daß T-Zellen der kritische Mediator der systemischen Antitumorimmunität sind, die durch Tumorimpfstoffe induziert wird (untersucht von Pardoll, Trends in Pharmacological Sciences, 14, 202–08 (1993)). Daher erfordert die Herstellung eines universellen Tumorimpfstoffes, d. h. einem Impfstoff, der auf die Mehrheit von Patienten mit einem speziellen Typ an Krebs anwendbar ist, das Wissen über die Existenz von geteilten immundominanten Tumorantigenen, die durch die T-Zellen erkannt werden. Gegenwärtig sind die geteilten immundominanten Tumorantigene, die durch die T-Zellen erkannt werden, in nur einem humanem Krebs, Melanom, identifiziert worden. Melanom ist ein malignes Neoplasma, abgeleitet von Zellen, die zur Bildung von Melanin fähig sind, und kann in der Haut von jedem Teil des Körpers, in den Augen oder weniger gewöhnlich in der Schleimhaut der Geschlechtsorgane, After, Mundhöhle oder anderen Stellen auftreten. Melanome metastasieren weit verbreitet, und die regionalen Lymphknoten, Leber, Lungen und Gehirn sind wahrscheinlich involviert. Primäres malignes Melanom der Haut ist die führende Ursache für den Tod von allen Krankheiten, die in der Haut entstehen. Es wird angenommen, daß das metastatische Melanom gegen die Behandlung resistent ist. Tatsächlich umfaßt das effektivste Einzelmittel zur Behandlung von disseminiertem Melanom, Dacarbazin (Dimethyltriazenoimidazolcarboxamid oder DTIC) ein teilweises Nachlassen in nur 20% der Fälle und eine vollständige Reaktion in weniger als 5% der Fälle (Fitzpatrick et al., „Malignant Melanoma of the Skin", In Harrisons's Principles of Internal Medicine, Braunwald et al., Hrsg., elfte Auflage (McGraw-Hill Book Company: NY, 1987) 1595–97).
Die geteilten immundominanten Melanomantigene, die durch T-Zellen erkannt werden, fallen in zwei Kategorien. Eine Kategorie von Antigenen umfaßt Proteine, die in Melanomzellen hergestellt werden, und nicht in irgendwelchen anderen reifen Geweben, mit Ausnahme von Testis, hergestellt werden. Diese sogenannten tumorspezifischen geteilten Antigene umfassen die Antigene der MAGE-Familie, MAGE-1 und MAGE-3. Von diesen zwei Antigenen scheint MAGE-3 verbreiteter hergestellt und immundominanter als MAGE-1 zu sein. MAGE-3 wird ebenso in anderen nicht-melanotischen Tumoren, wie kleinzelligem Lungenkarzinom (SCLC), nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (Nicht-SCLC), Plattenzellkarzinom des Kopfes und Nackens (SCCHN), Dickdarmkarzinom und Brustkrebs, hergestellt. Ebenso wird MAGE-1 in Brustkrebs, Glioblastom, Neuroblastom, SCLC und medullärem Karzinom der Schilddrüse hergestellt. Die andere Kategorie von geteilten Melanomantigenen umfaßt spezifische Differenzierungsantigene der Melanozytabstammung. Diese Abstammungs-spezifischen Differenzierungsantigene werden in Melanozyten und ihrem malignen Gegenpart, Melanom, hergestellt und werden in keinen anderen Zellen oder Geweben, die bis heute identifiziert sind, hergestellt. Diese Differenzierungsantigene umfassen MART-1/Melan-A, Tyrosinase, GP75 und GP100. Diese Melanomantigene sowie andere Antigene (beispielsweise kürzlich identifizierte tumorspezifische mutierte Antigene, die als geteilt nachgewiesen werden können oder nicht) werden außerdem in Tabelle 1 beschrieben. Es ist ebenso wahrscheinlich, daß weitere geteilte immundominante Melanome identifiziert werden.
Tabelle 1. Melanomantigene, die durch T-Zellen erkannt werden
I. Melanozyt-abstammende spezifische Differenzierungsantigene

gp100
MART-1/Melan-A
TRP1 (gp75)
Tyrosinase

II. Tumorspezifische geteilte Antigene

MAGE-1
MAGE-3
BAGE
GAGE-1,2
GnT-V
p15

III. Tumorspezifische mutierte Antigene

b-Catenin
MUM-1
CDK 4

Das Wissen über diese geteilten Melanomantigene würde das Potential bereitstellen, entweder eine einzelne Melanomzellinie, die alle exprimiert, oder eine Mehrheit der geteilten Melanomantigene oder eine Reihe von Melanomzellinien, die zusammen alle exprimieren, oder eine Mehrheit von diesen Antigenen zu identifizieren. Wenn solche Melanomzellinien identifiziert werden könnten, würden diese Zellinien, wenn sie als ein Impfstoff eingesetzt werden würden, mindestens eines teilen und in den meisten Fällen mehrere Antigene mit Melanomen aus so gut wie jedem Patienten mit Melanom teilen. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von solchen Zellinien bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, insbesondere Melanom, bereit, die nicht auf die Verwendung von autologen oder MHC-angepaßten Tumorzellen angewiesen ist, und die die Schwierigkeiten und Unzulänglichkeiten, die mit einer solchen Verwendung verbunden sind, vermeidet. Diese und andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfinderische Merkmale werden aus der nachstehenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird die Verwendung einer modifizierten Melanomzelle bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder dem Schutz gegen Melanom in einem Säugerwirt bereitgestellt, wobei die modifizierte Melanomzelle:

(a) mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimiert;
(b) zum Produzieren eines erhöhten Niveaus an Zytokin in bezug auf eine nicht-modifizierte Melanomzelle fähig ist; und
(c) zum Säugerwirt allogen ist.

Die Melanomzelle ist nicht notwendigerweise an den Wirt MHC-angepaßt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Eine modifizierte Melanomzelle zur Verwendung in der Erfindung kann durch (a) Erhalten einer Melanomzellinie, die mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimiert; und (b) Modifizieren der Melanomzelle, um sie zum Produzieren eines erhöhten Niveaus an Zytokin in bezug auf die nicht-modifizierte Melanomzellinie fähig zu machen, erhalten werden. Die so erhaltenen modifizierten Zellen werden einem Säugerwirt, der das Melanom aufweist oder in bezug auf die Entwicklung eines Melanoms gefährdet ist, verabreicht. Das verabreichte Melanom ist nicht notwendigerweise an den Wirt MHC-angepaßt.
Melanom
Die Verwendung gemäß der Erfindung kann eingesetzt werden, um Melanom zu behandeln oder davor zu schützen. Das „Behandeln von Melanom" gemäß der Erfindung umfaßt das Verabreichen der hierin dargestellten Melanomzellinien einem Wirt für den Zweck, eine therapeutische Antwort zu bewirken. Diese Behandlung kann zusammen mit anderen Mitteln zur Behandlung von Melanom durchgeführt werden (beispielsweise chirurgische Entfernung einer primären Läsion). Insbesondere ist eine therapeutische Antwort eine systemische Immunantwort (beispielsweise eine T-Zell-Antwort) auf Melanomantigene, wie hierin weiter beschrieben. Eine solche Antwort kann durch Beobachten der Abschwächung des Melanomwachstums und/oder der Melanomregression bewertet werden. Das „Melanomwachstum" umfaßt eine Erhöhung der Melanomgröße und/oder der Anzahl von Melanomen. Die „Melanomregression" umfaßt eine Verringerung der Melanommasse. Der „Schutz gegen Melanom" gemäß der Erfindung umfaßt das Verabreichen der hierin dargestellten Melanommzellinien einem anfälligen Wirt (beispielsweise Wirte mit schlechter Toleranz für Sonnenlicht, (Patienten mit fehlgebildeten Nävi oder großen angeborenen melanozytischen Nävi, Patienten, die der Resektion einer primären Melanomläsion unterliegen, usw.) für den Zweck der Verhinderung der Bildung eines neuen Melanoms.
Das „Melanom" gemäß der Erfindung umfaßt maligne Tumoren, die aus Melanozyten in der Haut oder anderen Stellen entstehen, und die dunkle Pigmente enthalten können. Der Ausdruck umfaßt beispielsweise derartige Krebsarten, die in primären Tumoren lokalisiert sind, sowie Melanomzellen, die nicht in Tumoren lokalisiert sind, die sich von einem Tumor lokal durch Invasion von benachbartem Gewebe erstrecken und die metastasieren.
Die Verwendung gemäß der Erfindung zur Behandlung von oder zum Schutz gegen Melanom kann effektiv unter Verwendung einer breiten Vielzahl von unterschiedlichen Wirten durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Verfahren bei verschiedenen Tierwirten eingesetzt werden, aber wird vorzugsweise bei Säugerwirten eingesetzt, einschließlich Nagetieren, Affen, Schimpansen, Katzen, Hunden, Huftieren (wie Wiederkäuern oder Schweinen) sowie insbesondere humanen Wirten, ist aber nicht darauf beschränkt.
Melanomzellinie
Wie hierin beschrieben, umfaßt eine „Melanomzellinie" Zellen, die anfangs aus einem Melanom abgeleitet wurden. Eine Melanomzellinie kann aus irgendeinem Melanom abgeleitet werden. Diese Zellen unterliegen typischerweise einigen Veränderungen, wie daß sie theoretisch ein unbestimmtes Wachstum in der Kultur aufweisen, d. h. im Gegensatz zu den nicht-krebsartigen Zellen, die nur für einen begrenzten Zeitraum kultiviert werden können.
Eine Melanomzellinie, die in der Erfindung eingesetzt wird, kann durch irgendein Mittel erhalten werden, aber wird vorzugsweise durch ein Verfahren erhalten, umfassend die Schritte (a) des Erhaltens einer Probe eines Melanoms aus einem Säugerwirt, (b) des Bildens einer Einzelsuspension aus der Melanomprobe, (c) des Pelletierens der Melanomzellen, (d) des Überführens der Melanomzellen in Gewebekultur unter Verwendung der sterilen Standardkulturtechnik, und (e) des Haltens der Melanomzellen in Gewebekultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Melanomzellen ermöglichen, wie hierin weiter beschrieben.
Spezieller wird die Probe eines Melanoms typischerweise zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs erhalten. Die Melanomprobe wird im wesentlichen unter Verwendung steriler Techniken und in einer solchen Weise, daß Gewebeschäden minimiert werden, behandelt und manipuliert. Die Gewebeprobe wird vorzugsweise auf Eis in einem sterilen Behälter gelegt und in eine Laborlaminarströmungsbox übertragen. Der Anteil des Melanoms, der zur Isolation einer Melanomzellinie eingesetzt werden soll, wird aus der Probe entfernt, und der Rest des Melanoms wird vorzugsweise bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise –70°C, gelagert.
Unter Verwendung einer Einzellsuspension wird die Suspension durch enzymatisches Aufschließen der Zellen vorzugsweise über Nacht gebildet. Beispielsweise wird die Probe in einer Lösung suspendiert, die Kollagenase enthält. Die Lösung kann ebenso DNAse und/oder Hyaluronidase enthalten. Das Zellkulturmedium kann eingesetzt werden, um das Aufschließen durchzuführen. Die resultierende Einzelzellsuspension wird pelletiert, und die Pellets werden in einem kleinen Volumen an Gewebekulturmedium resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden dann vorzugsweise in das Gewebekulturmedium geimpft, das für das Wachstum der Zellen in Kultur bei einer Dichte von etwa 5 × 10⁵ Tumorzellen/ml geeignet ist.
Abwechselnd wird die frische Tumorprobe in kleine Stücke zerschnitten, die direkt in die Kultur gegeben werden. Dieses andere bevorzugte Verfahren zur Isolierung einer Melanomzellinie umfaßt die Schritte (a) Erhalten einer Probe von Melanom aus einem Säugerwirt, (b) Zerschneiden der Probe, um Fragmente davon zu erhalten, (c) Überführen der Fragmente des frischen Tumors in die Gewebekultur und (d) Halten der Melanomzellen in Gewebekultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen ermöglichen.
Ungeachtet der verwendeten Mittel, um die Melanomzellen in die Gewebekultur zu übertragen (und alle Mittel können eingesetzt werden, wie einem Fachmann bekannt ist), können die Kulturen, wenn einmal übertragen, bei etwa 35 bis 40°C in der Gegenwart von 5 bis 8% CO₂ gehalten werden. Vorzugsweise ist das Medium, das für das Zellwachstum eingesetzt wird, eines, das einen breiten Anwendungsbereich zur Unterstützung des Wachstums von vielen Typen an Zellkulturen aufweist, beispielsweise ein Medium, das ein Bicarbonatpuffersystem und verschiedene Aminosäuren und Vitamine nutzt. Optimalerweise ist das Medium RPMI-1640-Medium, das wünschenswerterweise mit Rinderserum (beispielsweise fetalem Rinderserum) vorzugs weise bei einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 20% angereichert worden ist. Das Medium kann verschiedene zusätzliche Faktoren, wenn notwendig, enthalten, beispielsweise wenn sie für das Wachstum der Melanomzellen oder zur Aufrechterhaltung der Melanomzellen in einem undifferenzierten Zustand erforderlich sind. Das Medium und die Mediumkomponenten sind ohne weiteres erhältlich und können beispielsweise von kommerziellen Lieferanten erhalten werden. Die Tumorzellkulturen können zugeführt und rekultiviert werden, wenn notwendig, beispielsweise typischerweise alle 1 bis 10 Tage. Die Tumorzellen können ebenso der Differenzialtrypsinisierung unterzogen werden, um andere Zellen (beispielsweise Stromazellen) zu entfernen, die die primären Tumorkulturen überwachsen können. Ebenso kann die Unterdrückung der Fibroblastüberwachsung durch Anreichern des Kulturmediums mit Choleratoxin (beispielsweise 10 ng/ml) erreicht werden.
Wenn anscheinend eine im wesentlichen gereinigte Kultur der Melanomzellen erhalten worden ist (wie beispielsweise durch das Aussehen oder Wachstumsverhalten der Kulturen beurteilt), können verschiedene Tests, wenn notwendig oder wünschenswert, durchgeführt werden, um die Reinheit der Kulturen zu bestätigen. Beispielsweise kann dies durch Flußzytometrie oder Immunozytologie bestätigt werden, um die Expression von Melanom-assoziierten Proteinen oder Gangliosiden zu bestätigen. Dies wird unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt, die ohne weiteres erhältlich und dem Fachmann bekannt sind.
Geteilte Immundominante Melanomantigene
Tests können an Zellen der Melanomzellinie durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Melanomzellinie geteilte immundominante Antigene produziert (d. h. „exprimiert"). Gemäß der Erfindung exprimiert die Melanomzellinie mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen, wie hierin beschrieben, oder wie später identifiziert. Der Ausdruck „geteilt" bezieht sich auf die Tatsache, daß die Antigene, die für einen speziellen Tumor eines Individuums einzigartig sind, nicht für einen allgemein anwendbaren Impfstoff nützlich sind; eher sind Antigene erforderlich, die von mehreren (d. h. mehr als einem) speziellen Tumortypen gemeinsam genutzt werden. Der Ausdruck „immundominant" bezieht sich auf die Tatsache, daß aus Gründen der Verarbeitung, Bindung an MHC oder anderem, bestimmte Antigene fähig sind, effizienter durch T-Zellen von geimpften Wirten erkannt zu werden.
Insbesondere wird vorzugsweise gemäß der Erfindung bestätigt, daß Tumorinfiltrierende Lymphozyten die Melanomzellinie von mehr als einem Patienten und optimalerweise mehr als drei Patienten erkennen. Außerdem werden die RNA-Expression und/oder Proteinproduktion von geteilten immundominanten Melanomantigenen wünschenswerterweise unter Verwendung von Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind und hierin weiter beschrieben werden (beispielsweise PCR-basierende Assays, Northern- und Western-Assays, andere Immunassays und dergleichen), beurteilt.
Gemäß der Erfindung werden die geteilten immundominanten Melanomantigene vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Melanozyten-spezifischen Differenzierungsantigenen und Tumor-spezifischen geteilten Antigenen, wie hierin definiert, oder die zu einem späteren Zeitpunkt identifiziert werden, ausgewählt. Insbesondere umfassen wünschenswerterweise die geteilten immundominanten Melanomantigene ein oder mehrere Melanozyten-spezifische Differenzierungsantigene und ein oder mehrere Tumor-spezifische geteilte Antigene. Optimalerweise exprimiert die Melanomzellinie mindestens drei geteilte immundominante Melanomantigene. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die geteilten immundominanten Melanomantigene aus der Gruppe, bestehend aus MAGE-1-, MAGE-3-, MART-1/Melan-A-, Tyrosinase-, gp75-, gp100-, BAGE-, GAGE-1-, GAGE-2-, GnT-V- und p15-Antigenen, ausgewählt.
Die Melanomzellinie kann ebenso Tumor-spezifische mutierte Antigene umfassen. Beispielsweise können die Melanomzellinien vorzugsweise das b-Catenin-tumorspezifische mutierte Antigen umfassen. Ebenso können die Melanomzellinien vorzugsweise das MUM-1-tumorspezifische mutierte Antigen umfassen. Ebenso können die Melanomzellinien das CDK4-tumorspezifische mutierte Antigen umfassen.
Vorzugsweise zeigt die Melanomzellinie, die als ein Impfstoff in der Erfindung eingesetzt wird, eine stabile Produktion von geteilten immundominanten Melanomantige nen mit fortlaufendem Durchgang. Insbesondere exprimiert vorzugsweise die Melanomzellinie das MAGE-3-Antigen zusammen mit einem anderen geteilten immundominanten Melanomantigen. Wünschenswerterweise exprimiert die Melanomzellinie zwei geteilte immundominante Antigene, die aus der Gruppe, bestehend aus MAGE-3-, Tyrosinase-, MART-1/Melan-A-, gp75- und gp100-Antigenen, ausgewählt werden. Noch bevorzugter exprimiert die Melanomzellinie drei geteilte immundominante Antigene, die aus der Gruppe, bestehend aus MAGE-3-, Tyrosinase-, MART-1/Melan-A, gp75- und gp100-Antigenen, ausgewählt werden. Wünschenswerterweise exprimiert die Melanomzellinie vier geteilte immundominante Antigene, die aus der Gruppe, bestehend aus MAGE-3-, Tyrosinase-, MART-1/Melan-A, gp75- und gp100-Antigenen ausgewählt werden. Optimalerweise exprimiert die Melanomzellinie die MAGE-3-, Tyrosinase-, MART-1/Melan-A-, gp75- und gp100-Antigene. Insbesondere ist die Melanomzellinie, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet wird, vorzugsweise 526-MEL oder 624-MEL.
Zytokin
In der vorliegenden Erfindung ist die Melanomzellinie modifiziert worden, um sie zum Produzieren eines erhöhten Niveaus an Zytokin in bezug auf die nicht-modifzierte Melanomzellinie fähig zu machen. Ein „Zytokin" ist, wie dieser Ausdruck von einem Fachmann verstanden wird, irgendein immunmodulierendes Protein (einschließlich ein modifiziertes Protein, wie ein Glykoprotein), das die Reaktionsfähigkeit eines Wirtsimmunsystems für ein Melanom, das in dem Wirt vorliegt, verstärkt. Vorzugsweise ist das Zytokin selbst nicht immunogen für den Wirt, und verstärkt die Immunität durch Aktivieren oder Verstärken der Aktivität von Zellen des Immunsystems.
Wie hierin verwendet, umfaßt ein Zytokin solche Proteine wie Interferone, Interleukine (beispielsweise IL-1 bis IL-17), Tumornekrosefaktor (TNF), Erythropoietin (EPO), Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (M-CSF), Granulozyten-Kolonie-Stimulierungsfaktor (G-CSF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF), ist aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Zytokin GM-CSF.
„Modifizieren" einer Melanomzellinie gemäß der Erfindung umfaßt die Übertragung von genetischem Material, das zum Verleihen von erhöhter Expression eines Zytokins von Interesse fähig ist. Das genetische Material kann in der Form von nackter DNA oder einem „Vektor" vorliegen, umfassend ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Virus oder anderes Vehikel, das ein oder mehrere heterologe oder rekombinante DNA-Sequenzen enthält, beispielsweise ein Zytokin-Gen oder Zytokin-Codierungssequenz von Interesse unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors und möglicherweise ebenso eines Enhancers, und das fähig ist, als Vektor zu fungieren, wie der Ausdruck von einem Fachmann verstanden wird. Geeignete Virusvektoren umfassen Affenvirus 40, Rinder-Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus, Adenovirus, Herpesvirus, Pockenvirus, Moloney-Maus-Leukämie-Virus, Harvey-Maus-Sarkom-Virus und Rous-Sarcom-Virus, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Bezug auf einen Vektor oder andere DNA-Sequenzen als „rekombinant" bestätigt nur die Verknüpfung von DNA-Sequenzen, die typischerweise nicht verbunden sind, wie aus der Natur isoliert. Ein „Gen" ist irgendeine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein naszierendes mRNA-Molekül codiert. Während ein Gen Co dierungsequenzen plus irgendwelche nicht-codierende (beispielsweise Regulationssequenzen) umfaßt, umfaßt eine „Codierungssequenz" keine nicht-codierende DNA. Ein „Promotor" ist eine DNA-Sequenz, die die Bindung von RNA-Polymerase lenkt und dadurch die RNA-Synthese beschleunigt. „Enhancer" sind cis-agierende Elemente von DNA, die die Transkription von benachbarten Genen stimulieren oder inhibieren. Ein Enhancer, der die Transkription inhibiert, wird auch „Silencer" genannt. Enhancer unterscheiden sich von den DNA-Bindungsstellen für Sequenz-spezifische DNA-Bindungsproteine, die nur in dem Promotor gefunden werden (die auch „Promotorelemente" genannt werden), indem Enhancer in jede Richtung und über Abstände von mehreren Kilobasenpaaren (kb), selbst von einer Stellung stromabwärts einer transkribierten Region, fungieren können.
Ein beliebiger geeigneter Vektor kann eingesetzt werden, der zum Einbringen von Nukleinsäuren in eukaryontische Melanomzellen, oder bevorzugter, tierische Melanomzellen, wie Säuger, beispielsweise humane Melanomzellen, geeignet ist. Vorzugsweise ist der Vektor mit der Melanomzelle kompatibel, ist beispielsweise zum Verleihen der Expression des Zytokin-Gens oder -Codierungssequenz fähig, und wird in der Melanomzelle stabil aufrechterhalten oder relativ stabil aufrechterhalten. Wünschenswerterweise umfaßt der Vektor einen Replikationsursprung. Vorzugsweise umfaßt der Vektor ebenso eine sogenannte „Markerfunktion", durch die der Vektor identifiziert und ausgewählt werden kann (beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen). Wenn eine Zytokin-Codierungssequenz (im Gegensatz zu einem Zytokin-Gen mit ihrem eigenen Promotor) übertragen wird, enthält der Vektor optimalerweise ebenso einen Promotor, der zum Antreiben der Expression der Codierungssequenz fähig ist, und der mit der Codierungssequenz operativ verbunden wird. Eine Codierungssequenz wird mit einem Promotor „operativ verbunden" (beispielsweise wenn sowohl die Codierungssequenz als auch der Promotor zusammen ein natives oder rekombinantes Zytokin-Gen bilden), wenn der Promotor zum Lenken der Transkription der Codierungssequenz fähig ist.
Wie hierin verwendet, umfaßt das „Zytokin-Gen" oder die „Codierungssequenz" Zytokin-Genom- oder cDNA-Sequenzen, größere und kleinere Sequenzen und Mutationen davon, ob isoliert aus der Natur oder synthetisiert im gesamten oder teilweise, solange die Gen- oder Codierungssequenz zum Exprimieren fähig ist oder zum Exprimieren zu einem Protein mit der charakteristischen Funktion des Zytokins fähig ist, d. h. der Fähigkeit, die Wirtsimmunantwort zu stimulieren. Die Mittel zum Modifizieren von Gen- oder Codierungssequenzen sind in der Technik allgemein bekannt, und können ebenso mittels den kommerziell erhältlichen Kits erreicht werden (beispielsweise New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). Die Zytokin-Gen oder -Codierungssequenz kann von einer geeigneten Quelle sein, beispielsweise isoliert aus einer Säugerspezies, wie dem Menschen. Vorzugsweise umfaßt die Zytokin-Gen oder -Codierungssequenz jedoch eine GM-CSF-Sequenz, insbesondere eine humane oder murine GM-CSF-Gen- oder Codierungssequenz, einschließlich einer humanen oder murinen GM-CSF-cDNa-Sequenz (beispielsweise wie von Cantrell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 6250 bis 54 (1985) beschrieben).
Bei den rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise alle richtigen Transkriptions-, Translations- und Verarbeitungssignale (beispielsweise Splicing- und Polyadenylierungssignale) korrekt auf dem Vektor angeordnet, so daß die Zytokin-Gen oder -Codierungssequenz geeignet in den Melanomzellen, in die sie eingebracht wird, transkribiert und translatiert wird. Die Manipulation solcher Signale, um die entsprechende Expression in den Wirtszellen zu gewährleisten, liegt innerhalb des Wissens und der Fachkenntnisse eines Fachmanns. Während ein Zytokin-Gen durch (d. h. operativ verbunden an) seinen eigenen Promotor kontrolliert wird, kann ein anderer Promotor, einschließlich einem konstitutivem Promotor wie beispielsweise Adenovirus Typ 2-(Ad2)- oder Typ 5-(Ad5)-Major-Late-Promoter (MLP) und dreiteiliger Leader, Zytomegalievirus-(CMV)-Intermediate-Early-Promoter/Enhancer, Rous-Sarkom-Virus-Long-Terminal-Repeat (RSV-LTR) und andere, eingesetzt werden, um die Expression der Zytokin-Codierungssequenz zu erzielen.
Abwechselnd kann ein Gewebe-spezifischer Promotor (d. h. ein Promotor, der vorwiegend in einem gegebenen Gewebe aktiviert wird und zur Expression eines Genproduktes in dem Gewebe führt, wo es aktiviert wird) in dem Vektor verwendet werden. Solche Promotoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die Elastase I-Genkontrollregion, die in Pankreas-Azinuszellen aktiv ist, wie von Swift et al., Cell, 38, 639–46 (1984) und MacDonald, Hepatology, 7, 425–515 (1987) beschrieben; die Insulin-Genkontrollregion, die in Pankreas-Betazellen aktiv ist, wie von Hanahan, Nature, 315, 115–22 (1985) beschrieben; den Hepatozyt-spezifischen Promotor für Albumin oder Alpha-1-Antitrypsin, beschrieben von Frain et al., Mol. Cell. Biol., 10, 991–99 (1990) und Ciliberto et al., Cell, 41, 531–40 (1985); und die Albumin- und Alpha-1-Antitrypsin-Genkontrollregionen, die beide in der Leber aktiv sind, wie von Pinkert et al., Genes and Devel., 1, 268–76 (1987) und Kelsey et al., Genes and Devel., 1, 161–71 (1987) beschrieben.
Ebenso kann ein Melanom-spezifischer Promotor, verwandt mit dem karzinoembryonalen Antigen für Dickdarmkrebs, beschrieben von Schrewe et al., Mol. Cell. Biol., 10, 2738–48 (1990), in dem Vektor verwendet werden. Entlang derselben Zellinien können Promotoren, die bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien selektiv aktiviert werden (beispielsweise werden Globingene bei Embryos und Erwachsenen unterschiedlich transkribiert), zur Gentherapie von bestimmten Typen von Krebs eingesetzt werden.
Eine andere Option ist, einen induzierbaren Promotor zu verwenden, wie den IL-8-Promotor, der auf TNF reagiert, oder den 6-16-Promotor, der auf Interferone reagiert, oder andere ähnliche Promotoren zu verwenden, die auf andere Zytokine oder andere Faktoren, die in einem Wirt vorhanden sind, reagieren, oder der exogen verabreicht werden kann. Die Verwendung eines Zytokin-induzierbaren Promotors weist den zusätzlichen Vorteil der selbstinduzierbaren Expression eines Zytokin-Gens auf. Gemäß der Erfindung kann irgendein Promotor durch Mutagenese verändert werden, so lange er die gewünschte Bindungsfähigkeit und Promotorstärke aufweist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die ein Zytokin codiert, wie oben definiert, und der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die ein humanes GM-CSF codiert. Daher stellt vorzugsweise die vorliegende Erfindung den Vektor bereit, der als pcDNA3/Neo-GM-CSF bezeichnet wird, wie hierin weiter beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung kann die nackte DNA oder der rekombinante Vektor eingesetzt werden, um eine Zytokin-Gen oder -Codierungssequenz zu einer Zelle in vitro zu überführen, die vorzugsweise eine Zelle einer bestehenden Melanomzellinie ist. Verschiedene Verfahren können zum Zuführen von neuem genetischem Material zu Zellen in vitro eingesetzt werden. Beispielsweise umfassen solche Verfahren Elektroporation, Membranfusion mit Liposomen, Hochgeschwindigkeitsbombardierung mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calciumphosphat-DNA-Niederschlag, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Infektion mit modifizierten Virusnukleinsäuren, direkte Mikroinjektion in Einzelzellen und dergleichen. Andere Verfahren sind verfügbar und sind dem Fachmann bekannt. Daher stellt die vorliegende Erfindung eine im wesentlichen gereinigte Melanomzellinie bereit, worin die Zellinie modifiziert worden ist, um sie zum Produzieren eines erhöhten Niveaus an Zytokin (vorzugsweise GM-CSF) in bezug auf die nicht-modifizierte Melanomzellinie fähig zu machen.
Das Niveau an Zytokin, das durch die modifizierte Melanomzelle prodziert wird, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Zweck der Erhaltung einer immunstimulierenden Antwort wichtig. Vorzugsweise produziert die modifizierte (beispielsweise transfizierte oder transformierte) Melanomzellinie ein Niveau an Zytokin, das das Beobachtete für die nicht-modifizierte (d. h. parentale) Melanomzellinie übersteigt. Noch bevorzugter stellt die modifizierte Melanomzellinie ein Niveau an Zytokin bereit, das zur Zytokinsekretion von mehr als 36 ng/10⁶ Zellen/Tag führt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso die Behandlung von oder den Schutz gegen Melanom, wobei das Zytokin nicht durch die verabreichten Melanomzellen, aber durch einige andere Mittel bereitgestellt wird. Diese Ausführungsform umfaßt bloß (a) das Erhalten einer Melanomzellinie, die mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimiert, und (b) das Verabreichen der Melanomzellinie einem Säugerwirt, der Melanom aufweist oder in bezug auf die Entwicklung eines Melanoms gefährdet ist. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird die Melanomzellinie vor der Verabreichung nicht modifiziert, um sie zum Produzieren eines erhöhten Niveaus an Zytokin fähig zu machen. Statt dessen wird Zytokin durch einige andere bekannte Mittel bereitgestellt. Beispielsweise können Zellen der Melanomzellinie mit Zytokin, das in Mikrokugeln (siehe beispielsweise Golumbek et al., Cancer Research, 53, 1–4 (1993)) oder Liposomen (siehe beispielsweise Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11307–11 (1993)) eingekapselt ist, verabreicht werden.
Verabreichung der Melanomzellinie
Die „Verabreichung" von Zellen der Melanomzellinie einem Säugerwirt bezieht sich auf die tatsächliche physikalische Einbringung der Melanomzellen, insbesondere den modifizierten (d. h. Zytokin-produzierenden) Melanomzellen in den Wirt. Ein beliebiges und alle Verfahren zum Einbringen der Melanomzellen in den Wirt werden gemäß der Erfindung in Betracht gezogen; das Verfahren ist von keinem speziellen Mittel zur Einbringung abhängig und sollte nicht so aufgefaßt werden. Mittel zur Einbringung sind dem Fachmann allgemein bekannt, und mehrere solcher Einbringungsmittel werden hierin veranschaulicht.
Während erwartet wird, daß die verabreichte Melanomzellinie einige MHC-Antigene gemeinsam mit dem Wirtsmelanom aufweisen kann, ist es für den Zweck dieser Erfindung nicht notwendig, daß die verabreichte Melanomzelle und der Wirt irgendwelche MHC-Antigene gemeinsam haben. Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung die Verabreichung einer Melanomzellinie, die allogen (d. h. aus einem anderen Individuum) zu einem Wirt ist, und die nicht notwendigerweise an den Wirt MHC-angepaßt ist. Gemäß dieser Erfindung ist eine Melanomzellinie an einen Wirt „nicht MHC-angepaßt", wenn sie keine MHC-Antigene gemeinsam mit dem Wirt teilt, oder wenn sie keines der MHC-Antigene mit dem Wirt teilt, die typischerweise MHC-angepaßt sind, wenn allogene Melanomzellimpfstoffe verwendet werden (beispielsweise MHC-Antigene der Klasse I, insbesondere HLA-A2).
Ebenso wird vorzugsweise die Melanomzellinie (beispielsweise die modifizierte Melanomzellinie) vor der Verabreichung bestrahlt, um die Zellreplikation und mögliche Melanombildung in vivo zu verhindern. Zur Bestrahlung von Melanomzellen werden die Melanomzellen typischerweise geerntet, zu einem Teströhrchen in flüssigem Medium überführt und bei Raumtemperatur unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle bestrahlt. Vorzugsweise werden die Zellen bei einer Dosisrate von etwa 50 bis etwa 200 rd/min, bevorzugter etwa 120 bis etwa 140 rd/min bestrahlt. Vorzugsweise werden die Zellen mit einer Gesamtdosis, die ausreichend ist, um die Mehrheit von Zellen zu inhibieren, vorzugsweise etwa 100% der Zellen, aus der Vermehrung in vitro bestrahlt. Daher werden die Zellen wünschenswerterweise mit einer Gesamtdosis von etwa 10.000 bis 30.000 rd bestrahlt.
Außerdem wird die Melanomzellinie (beispielsweise die modifizierte Melanomzellinie) vor der Verabreichung behandelt, um ihre Immunogenität zu verstärken. Vorzugsweise umfaßt diese Behandlung, wie hierin beschrieben, eine weitere Genmanipulation, wie beispielsweise die Einbringung von anderem Zytokin oder immuncostimulierenden Funktionen oder beispielsweise Mischung mit nicht-spezifischen Hilfsmitteln, einschließlich komplettem oder inkomplettem Freund'schen Adjuvans, Emulsionen, die aus bakteriellen und mycobakteriellen Zellwandkomponenten bestehen, und dergleichen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Folglich können die allogenen Melanomzellinien verwendet werden, um die Patienten mit Melanomen für den Zweck der Erzeugung einer systemischen Antimelanomimmunantwort gegen das eigene Melanom des Patienten zu impfen. In dem Maße, daß MAGE-3 ebenso in anderen nicht-melanotischen Tumoren, wie SCLC, Nicht-SCLC, SCCHN, Dickdarmkrebs und Brustkrebs, produziert wird und daß MAGE-1 ebenso bei Brustkrebs, Glioblastoma, Neuroblastoma, SCLC und medullärem Karzinom der Schilddrüse hergestellt wird, können allogene Melanomzellinien gemäß der Erfindung, die MAGE-3- und/oder MAGE-1-Antigene exprimieren, ebenfalls zur Behandlung dieser anderen nicht-melanotischen Tumore eingesetzt werden.
Um die Verabreichung zu erleichtern, kann eine allogene Melanomzelline gemäß der Erfindung, insbesondere eine modifizierte allogene Melanomzellinie, die vor der Verabreichung behandelt worden ist, um ihre Immunogenität zu verstärken, zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemacht werden oder zur Verabreichung in vivo mit entsprechenden Trägern oder Verdünnungsmitteln geeignet implantiert werden, die außerdem pharmazeutisch akzeptabel sein können. Die Mittel zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung oder eines Implantats sind in der Technik beschrieben worden (siehe beispielsweise Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Mack, Hrg. (1980)). Wo geeignet, kann eine Melanomzellinie zu einem Präparat in halbfester oder flüssiger Form, wie Kapseln, Lösung, Injektion, Inhalationsmittel oder Aerosol, auf die übliche Weise für ihre jeweilige Verabreichungsweise formuliert werden. Mittel, die in der Technik bekannt sind, können genutzt werden, um die Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung zu verhindern oder zu minimieren, bis das Zielgewebe oder -organ erreicht wird, oder um die Zeitfreisetzung der Zusammensetzung zu gewährleisten. Vorzugsweise wird jedoch eine pharmazeutisch akzeptable Form eingesetzt, die die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nicht nachteilig beeinflußt. Daher kann die Melanomzellinie wünschenswerterweise zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemacht werden, die ein Mineralsalzmedium, vorzugsweise Hank'sche Mineralsalzlösung oder normale Salzlösung, umfaßt.
Daher stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und Zellen einer Melanomzellinie gemäß der Erfindung oder irgendeiner anderen Melanomzellinie, die ein oder mehrere geteilte immundominante Antigene exprimiert, wie hierin beschrieben, umfaßt. Vorzugsweise stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Melanomzellinie umfaßt, wobei die Melanomzellinie insbesondere 526-MEL oder 624-MEL ist, das modifiziert worden ist, um ein erhöhtes Niveau an Zytokin, optimalerweise GM-CSF, zu produzieren. Die Erfindung stellt ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und Zellen von einer Vielzahl der Melanomzellinien gemäß der Erfindung umfaßt. Beispielsweise umfaßt die Zusammensetzung vorzugsweise Zellen von mehr als einer Zellinie gemäß der Erfindung und umfaßt optimalerweise Zellen von mehr als einer Zellinie, umfaßt beispielsweise 526-MEL- und 624-MEL-Zellen, oder umfaßt Zellen, die aus der Gruppe, bestehend aus 526-MEL, 624-MEL und einer anderen Zellinie, ausgewählt sind.
Bei der pharmazeutischen Dosierungsform kann eine Zusammensetzung allein oder in geeigneter Verbindung sowie in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen und Verfahren zur Behandlung verwendet werden. Beispielsweise kann bei der Anwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Krebs, insbesondere zur Behandlung von Melanom, diese Behandlung zusammen mit anderen Mitteln zur Behandlung von Krebs, insbesondere Melanom, eingesetzt werden, beispielsweise der chirurgischen Amputation, Bestrahlung, Chemotherpahie und dergleichen. In bezug auf die Chemotherapie kann eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung zusätzlich zur Verwendung von Dacarbazin, Dactinomycin, Carmustin, Procarbazin, Vinblastin und Interferon sowie anderen Arzneimitteln, die zur Behandlung von Melanom verwendet werden, eingesetzt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mittels verschiedener Wege und an verschiedenen Stellen eines Säugerkörpers, insbesondere beim Menschen, zugeführt werden, um eine spezielle Wirkung zu erreichen. Ein Fachmann wird erkennen, daß, obwohl mehr als ein Weg zur Verabreichung verwendet werden kann, ein spezieller Weg eine unmittelbare und effektivere Reaktion als ein anderer Weg bereitstellen kann. Lokale oder systemische Zufuhr kann durch die Verabreichung, umfassend die Auftragung oder Instillation der Formulierung in Körperhöhlen, Inhalation oder Insufflation eines Aerosols, oder durch parenterale Einführung, umfassend intramuskuläre, intravenöse, intraportale, intrahepatische, peritoneale, subkutane oder intradermale Verabreichung, erreicht werden. Vorzugsweise wird die Zufuhr durch subkutane oder intradermale Verabreichung erreicht.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einer Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden, wobei jede Dosierungseinheit, beispielsweise eine Injektion, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Wirkstoffen enthält. Der Ausdruck „Einheitsdosierungsform", wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch einzelne Einheiten, die als Einheitsdosierungen für Menschen und Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, berechnet in einer Menge, die ausreichend ist, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel, wo geeignet, enthält. Die Beschreibungen für die neuen Einheitsdosierungsformen der vorliegenden Erfindung hängen von der speziellen Pharmakodynamik ab, die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung in dem speziellen Wirt verbunden ist.
Vorzugsweise liegt eine ausreichende Anzahl der modifizierten Melanomzellen in der Zusammensetzung vor und wird in den Wirt eingeführt, so daß die Expression von Zytokin durch die Wirtszelle und anschließende Rekrutierung von APCs an der Melanomstelle zu einer größeren Immunantwort des vorhandenen Wirtsmelanoms führt, als es sonst in Abwesenheit der Behandlung führen würde, wie hierin weiter erläutert. Folglich sollte die Menge an verabreichten Impfstoffzellen den Verabreichungsweg berücksichtigen und sollte so sein, daß eine ausreichende Anzahl der Melanomzellen eingebracht wird, um so die gewünschte therapeutische (d. h. immunpotenzierende) Antwort zu erreichen. Außerdem können die Mengen von jedem Wirkstoff, der in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen enthalten ist (beispielsweise die Menge pro jede Zelle, die kontaktiert werden soll, oder die Menge pro bestimmtes Körpergewicht), bei unterschiedlichen Anwendungen variieren. Im allgemeinen sollte die Konzentration von modifizierten Melanomzellen vorzugsweise ausreichend sein, um in dem Wirt, der behandelt wird, mindestens etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ Melanomzellen, noch stärker bevorzugt etwa 1 × 10⁷ bis etwa 5 × 10⁸ Melanomzellen bereitzustellen, obwohl jede geeignete Menge auch darüber, beispielsweise mehr als 5 × 10⁸, oder darunter, beispielsweise weniger als 1 × 10⁷ Zellen, genutzt werden kann.
Diese Werte stellen die allgemeine Führung des Bereiches von jeder Komponente bereit, die von dem praktischen Arzt beim Optimieren des Verfahrens der vorliegenden Erfindung für die Praxis der Erfindung genutzt wird. Die Angabe hierin von diesen Bereichen schließt keineswegs die Verwendung einer höheren oder niedrigeren Menge einer Komponente aus, wie es bei einer speziellen Anwendung garantiert wird. Beispielsweise kann die tatsächliche Dosis und der Plan in Abhängigkeit davon, ob die Zusammensetzungen zusammen mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder in Abhängigkeit der zwischenindividuellen Unterschiede der Pharmakokinetik, der Arzneimitteldisposition und des Stoffwechsels variieren. Ein Fachmann kann ohne weiteres irgendwelche notwendigen Einstellungen gemäß der Dringlichkeit der speziellen Situation vornehmen. Außerdem kann sich die effektive Menge der Zusammensetzungen durch die Analogie zu anderen Verbindungen, die dafür bekannt sind, das Wachstum von Krebszellen, insbesondere Melanomzellen, zu inhibieren, weiter angleichen.
Ein Fachmann kennt ebenso Mittel, um eine therapeutische (d. h. systemische Immun-) Antwort auf die Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu überwachen. Insbesondere kann die therapeutische Antwort durch Überwachung der Abschwächung des Melanomwachstums und/oder der Melanomrückbildung beurteilt werden. Die Abschwächung des Melanomwachstums oder die Melanomrückbildung als Antwort auf die Behandlung kann unter Verwendung mehrerer Endpunkte, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich beispielsweise der Anzahl an Melanomen, der Melanommasse oder -größe oder der Reduktion/Verhinderung der Metastase, überwacht werden. Diese beschriebenen Ausführungsformen umfassen keineswegs alles, wobei weitere Wege zur Durchführung der Erfindung, um die spezielle Anwendung anzupassen, dem Fachmann offensichtlich sein werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung weiter dar, aber sollen natürlich ihren Umfang in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1
Dieses Beispiel stellt das Verfahren zur Erhaltung und Kultivierung der Melanomzellinien dar, die mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimieren.
Melanomzellinien wurden aus chirurgischen Resektionsproben erhalten. Standardmittel, wie zuvor beschrieben und wie einem Fachmann bekannt, wurden eingesetzt, um die Zellinien zu isolieren (siehe beispielsweise Freshney, Culture of Animal Cells (3. Auflage) Wiley-Liss, Inc., NY (1993)). Insbesondere wurden die Tumoren in Einzellsuspensionen durch enzymatischen Aufschluß mit Kollagenase, DNAse und Hyaluronidase über Nacht dispergiert, und wurden in RPMI 1640, das 10% fetales Rinderserum (FKS) enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden dann in Kultur unter Anwendung der sterilen Standardgewebekulturtechnik vermehrt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt eine Charakterisierung der Melanomzellinien, die mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimieren.
Die Gegenwart von geteilten immundominanten Antigenen in einer Melanomzellinie kann bestätigt werden, indem gezeigt wird, daß T-Zellen von Patienten mit Melanom, die das eigene Melanom des Patienten erkennen, ebenso die spezielle in Frage stehende allogene Melanomzellinie erkennen werden. Um diese Bestimmung durchzuführen, muß Teilen von mindestens einem MHC-Antigen der Klasse I zwischen dem Patienten, von dem die T-Zellen stammen, und der Melanomlinie, die getestet werden soll, stattfinden. Eines der besten MHC-Antigene, das für diese Zwecke verwendet wird, ist HLA-A2, da es in ungefähr 50% der Kaukasier exprimiert wird.
Daher wurden frische Tumorsuspensionen über Ficoll-Hypaque-Gradienten (Lymphocyte Separation Medium, Organon Technical Corporation, Durham, North Carolina) geleitet, um T-Zell-Populationen zu isolieren und wachsen zu lassen, die das Melanom erkennen. Die Gradientengrenzflächen, die lebensfähige Tumorzellen und Lymphozyten enthalten, wurden gewaschen, auf eine Gesamtzellkonzentration von etwa 2,5 bis etwa 5,0 × 10⁵ Zellen pro ml eingestellt und in Vollmedium kultiviert. Vollmedium besteht aus RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem humanem Serum vom Typ AB, 50 IU/ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin (Biofluids, Rockville, MD), 50 mg/ml Gentamicin (GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH), 10 mM HEPES-Puffer (Biofluids) und 2 mM L-Glutamin (MA Bioproducts, Walkersville, MD). Das Medium wurde mit 6000 IU/ml IL-2 und dem Überstand aus LAK-Zellkulturen angereichert. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten 5%igen CO₂-Atmosphäre in einer Vielzahl von Gewebekulturbehältern, einschließlich 24-Lochplatten und 175 cm² Kolben, gehalten. Unter diesen Umständen wuchsen tumorinfiltrierende T-Zellen selektiv. Tumorinfiltrierende Lymphozyt-(TIL)-Kulturen wurden in IL-2 für mindestens vier Wochen vermehrt.
Für die Analyse der TIL-Erkennung der Melanomzellinien (Topalian et al., J. Immunol., 142, 3714 (1989)) wurde die zytolytische Aktivität des kultivierten TIL gegen diese Zellinien unter Verwendung der vierstündigen ⁵¹Cr-Release-Assays bewertet. Abwechselnd wurde die spezifische Sekretion von Zytokinen durch TIL, das mit Tumorzellen cokultiviert wurde, überwacht. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2. Lyse von HLA-A2⁺-Melanomen durch HLA-A2-eingeschränktes Melanom TIL
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden TIL-Kulturen von acht unterschiedlichen HLA-A2⁺-Patienten (d. h. TIL 620, TIL 1073, TIL 1143, TIL 1235, TIL 501, TIL 660, TIL 1074 und TIL 1128) gegen sieben unterschiedliche bestehende Melanomzellinien (d. h. 526-MEL, 553-MEL, 624-MEL, 677-MEL, 697-MEL, 1102-MEL und 1011-MEL) sowie eine bestehende Fibroblastzellinie (560-Fibro) und die Daudi-Lymphom-Zellinie getestet. Zwei der Tumorzellinien, d. h. 526-MEL und 624-MEL, wurden durch alle der TIL-Kulturen erkannt, wie durch die spezifische Lyse in einem Chrom-Release-Assay von > 10% bei einem Verhältnis von Wirkung zu Targettumorzelle (E : T) von 40 bestimmt. Andere der Melanomzellinien, außer 1011-MEL (HLA-A2 negativ), wurden durch die Mehrheit oder von mindestens einer der TIL-Kulturen erkannt.
526-MEL und 624-MEL wurden durch Umkehrtranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder Northern-Blot für die Expression der MZ2-E- (oder MAGE-1-), MZ2-D- (oder MAGE-3-), MART-1/Melan-A-, GP100- und GP75-Antigene getestet. Die Zellinien wurden hinsichtlich der Tyrosinaseproduktion mittels Erkennung durch eine Tyrosinase-spezifische Helfer-T-Zellinie bewertet. Die Zellinien wurden ebenso hinsichtlich der Expression von GD3 durch Färbung mit einem speziellen monoklonalen Antikörper bewertet. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3. Expression von geteilten Melanomantigenen durch Melanomzellkulturen
Beide Zellinien exprimierten alle gemeinsamen geteilten Antigene, die durch diese Assays mit der Ausnahme von MAGE-1-Antigen getestet wurden, wie in Tabelle 3 dargestellt.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß die 526-MEL- und 624-MEL-Melanomzellinien die Mehrheit der immundominanten geteilten Melanomantigene exprimieren. Die Ergebnisse bestätigen außerdem, daß die hierin beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können, um eine Melanomzellinie zu erhalten und/oder zu identifizieren, welche ein oder mehrere geteilte immundominante Melanomantigene exprimiert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel stellt das Verfahren zum Modifizieren einer Melanomzellinie dar, welche mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimiert, um eine erhöhte Menge an Zytokin zu erhalten. Der Zytokin-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF) ist möglicherweise wirksamer als andere Zytokine beim Erzeugen einer systemischen Antimelanomantwort in vorklinischen Melanommodellen (siehe beispielsweise Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3539– 42 (1993)). Folglich wurden die Melanomzellinien modifiziert, um GM-CSF zu sekretieren. Die Melanomzellinien 526-MEL und 624-MEL, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden als Vertreter einer allogenen Melanomzellinie eingesetzt, die mehr als ein geteiltes immundominantes Melanomantigen exprimiert.
Um die Manipulation der Zellinien zu erleichtern, wurde ein rekombinantes humanes GM-CSF-Gen zu pcDNA3/Neo (Invitrogen) kloniert. Der resultierende rekombinante Vektor wird fortan als pcDNA3/Neo-GM-CSF bezeichnet. Alle Klonierungsreaktionen und DNA-Manipulationen wurden unter Verwendung von Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, und die in der Technik beschrieben worden sind (siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982))). Enzyme, die bei diesen Reaktionen eingesetzt werden, wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten (beispielsweise New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA; Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN; usw.) und wurden gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet.
Das Plasmid pcDNA3/Neo-GM-CSF enthält die humane GM-CSF-Zytokin-Codierungssequenz unter der Kontrolle des Zytomegalovirus-Promotors (CMV), und enthält ebenso das Neomycin-resistente Gen, das durch einen separaten CMV-Promotor kontrolliert wird. Der CMV-Promotor wurde eingesetzt, da er fähig ist, ein relativ hohes Niveau an Genexpression in den meisten eukaryontischen Zellen anzutreiben (Boshart et al., Cell, 41, 521–30 (1985)). Anfängliche Studien unter Verwendung dieses Vektors zur Genübertragung zu einer humanen Melanomzellinie bestätigen, daß nach der Selektion hinsichtlich der Neomycinbeständigkeit sekretierte Niveaus von GM-CSF von mehr als 36 ng/10⁶ Zellen/Tag erreicht wurden. Diese anfänglichen Studien bestätigen, daß das pcDNA3/Neo-GM-CSF-Plasmid in eukaryontischen Zellen funktionell ist. Außerdem ist dies die Dosis von GM-CSF, die erforderlich ist, um eine genaue Antimelanom-Immunantwort in einem Mausmodell zu erzeugen. Verdünnungsexperimente unter Verwendung von unterschiedlichen Konzentrationen der Melanomzellen, die entweder mit einem von Retroviren stammenden Vektor, der ein GM-CSF-Gen trägt, transduziert wurden oder nicht, bestätigen, daß in dem B16-F10-Melanomsystem die GM-CSF-Sekretion unter 36 ng/10⁶ Zellen/Tag die wirksame Antimelanomimmunität nicht erzeugt, die bei Sekretionsniveaus über diesem Schwellenwert gesehen wurden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit der Zufuhr von hohen und anhaltenden Niveaus von GM-CSF direkt an der Stelle der Impfmelanomzellen, die die Quelle des relevanten Melanomantigens sind.
Die 526-MEL- und 624-MEL-Zellinien wurden mit pcDNA3/Neo-GM-CSF durch die Calciumphosphatverfahrensweise transfiziert. Für diese Experimente wurde 526-MEL beim Kulturdurchgang 32 transfiziert, und 624-MEL wurde beim Kulturdurchgang 28 transfiziert. Die GM-CSF-Niveaus wurden durch ELISA bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4. GM-CSF-Sekretion durch transfizierte Melanomzellinien
Das GM-CSF-Sekretionsniveau, das für die 526-MEL-Zellinie beobachtet wurde, betrug weniger als 10 ng/10⁶ Melanomzellen/Tag. Es ist möglich, daß die GM-CSF-Sekretion für die 526-MEL-Zellinie unter Verwendung eines unterschiedlichen Expressionsvektors zur Transfektion oder durch Selektieren der Melanomzellinien mit höheren Expressionsniveaus erhöht werden kann. Im Vergleich dazu betrug das GM-CSF-Sekretionsniveau, das für die Melanomzellinie 624-MEL beobachtet wurde, über 80 ng/10⁶ Melanomzellen/Tag. Nicht-transfizierte Melanome sekretierten keine meßbaren Mengen an GM-CSF.
Die Verfahren, die in diesem Beispiel eingesetzt werden, können auch angewendet werden, um Melanomzellinien zu erzeugen, die zum Produzieren erhöhter Mengen an anderen Zytokinen fähig sind, und mit anderen Melanomzellinien angewendet werden können, wobei alle auch als Impfstoffe eingesetzt werden können.
Beispiel 4
Dieses Beispiel stellt weitere Studien dar, die die GM-CSF-Verabreichung an einen Wirt betreffen.
Weitere Studien bestätigen, daß die GM-CSF-Sekretion der bekannten Paracrinphysiologie dieses Zytokins entsprechen muß. Insbesondere muß die Sekretion an der Stelle der relevanten Antigene (d. h. der Melanomzellen) vorliegen, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, und hohe Niveaus müssen für mehrere Tage anhalten (siehe beispielsweise Dranoff et al., supra; Golumbek et al., supra). Jedoch scheint es, daß die Melanomzelle selbst nicht die Quelle der GM-CSF-Sekretion sein muß (Golumbek et al., supra). Immunologischer Schutz und histologische Infiltrate, die ähnlich denen sind, die mit retroviral-transduzierten Zytokin-exprimierenden Melanomzellen gesehen wurden, können erzeugt werden, wenn GM-CSF langsam aus biologisch abbaubaren Polymeren, die mit der Melanomzelle coinjiziert werden, freigesetzt wird. Wenn außerdem ein zweiter nicht-kreuzreagierender Tumor mit dem GM-CSF-sekretierenden Melanom coinjiziert wird, kann der immunologische Schutz gegen beide Tumoren erzeugt werden. Einfache Injektion von löslichem GM-CSF zusammen mit Melanomzellen stellt jedoch keine anhaltenden lokalen Niveaus dieses Zytokins bereit, und erzeugt keine systemische Immunität (Golumbek et al., supra). Daher wurde die Wirksamkeit der Verwendung einer allogenen Melanomzelle, die nicht an die Wirtszelle zur Zufuhr von Zytokin in vivo MHC-angepaßt wurde, untersucht.
Bei Mäusemodellen wurde demonstriert, daß die Antimelanomimmunität, die mit der Zufuhr von GM-CSF durch umstehende allogene Melanomzellen erzeugt wird, mit der vergleichbar ist, die erreicht wird, wenn GM-CSF durch die Targetmelanomzelle selbst zugeführt wird. Speziell wurden in diesen Experimenten BALB/c-Mäuse subkutan mit bestrahlten CT26-Kolonkarzinomzellen, mit GM-CSF, zugeführt durch entweder retroviral-transduzierte CT26-Zellen oder durch retroviral-transduzierte alloge ne B16-F10-Zellen, geimpft. Zwei Wochen später wurden die Mäuse mit Injektionen des Wildtyp-Stammes CT26 erneut angeregt. Die CT26-Kolonkarzinomzellinie verfügt über eine gewisse innere Immunogenität; jedoch wurde ein größerer Schutzgrad gesehen, wenn GM-CSF an der Impfstelle sekretiert wurde, ob nun durch die syngenetischen oder allogenen Zellen. Während unklar ist, zu welchem Grad oder durch welchen Mechanismus die allogenen Melanomzellen die Anti-CT26-Immunität verstärken können, lassen diese Daten stark darauf schließen, daß die allogene Zufuhr von GM-CSF im Rahmen der vorliegenden Erfindung wahrscheinlich mindestens genauso effektiv wie die autologe Melanomzufuhr ist.
Beispiel 5
Dieses Beispiel stellt die erfindungsgemäße Behandlung von Krebs durch Verabreichen einer Melanomzellinie, welche ein oder mehrer geteilte immundominante Melanomantigene exprimiert, und vorzugsweise allogen ist und nicht notwendigerweise an den Wirt MHC-angepaßt ist, an einen Wirt dar.
Melanomzellinien, die GM-CSF vorzugsweise bei Niveaus größer als 36 ng/10⁶ Melanomzellen/Tag sekretieren, werden erhalten und eingesetzt. Die modifizierten Melanomzellen werden aus den Gewebekulturkolben durch Trypsinierung geerntet. Die Zellen werden unter Verwendung normaler Salzlösung gewaschen, pelletiert und in Hank'scher Mineralsalzlösung oder einer anderen Salzlösung, die zur Einbringung in vivo geeignet ist, resuspendiert. Die Zellen werden bei einer Konzentration von etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁸ Melanomzellen/ml resuspendiert. Etwa 0,1 bis etwa 0,5 ml dieses Resuspensionsgemisches werden als ein Impfstoff eingesetzt. Daher werden vorzugsweise etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ Melanomzellen injiziert und optimalerweise etwa 1 × 10⁷ bis etwa 5 × 10⁸ Melanomzellen werden in toto injiziert. Während die modifizierten Melanomzellen subkutan in die Maus injiziert werden, werden die Zellen beim Menschen vorzugsweise intradermal injiziert.
Vor der Injektion können die modifizierten Melanomzellen bestrahlt werden, beispielsweise unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle. Eine solche Bestrahlung verhindert die Replikation der Tumorzellen, ermöglicht es aber den Zellen, GM-CSF zu se kretieren und für mindestens eine Woche in Kultur stoffwechselaktiv zu bleiben. Vorzugsweise kann die Bestrahlung unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle bei einer Dosisrate von etwa 120 bis 140 rd/min durchgeführt werden, um eine Gesamtdosis von etwa 15.000 rd zuzuführen. Die modifizierten Melanomzellen können ebenso verändert werden, um ihre Immunogenität zu verstärken. Beispielsweise können die Zellen außerdem genetisch manipuliert werden (beispielsweise durch Einfügen eines anderen Zytokins oder anderen Immun-stimulierenden Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise ein anderes Zytokin als oder zusätzlich zu GM-CSF) oder können mit nicht-spezifischen Hilfsmitteln gemischt werden (beispielsweise komplettem oder inkompletten Freund'schen Adjuvans, Emulsionen, die aus bakteriellen und mycobakteriellen Zellwandkomponenten bestehen, und dergleichen).
Die Erfindung kann bei Säugern (insbesondere bei Menschen) mit Melanom oder denen, die in bezug auf die Entwicklung von Melanom gefährdet sind, verwendet werden. Es wird ebenso erwartet, daß der Patient vor oder zusätzlich zur (d. h. gleichzeitig oder unmittelbar nach) Immuntherapie, wie hierin beschrieben, mit einer Anzahl von Verfahren behandelt werden kann, wie sie zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, beispielsweise der chirurgischen Resektion, Bestrahlung, Chemotherapie und dergleichen.

Claims

Verwendung einer modifizierten Melanomzelle in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder zum Schutz gegen Melanom in einem Säugerwirt, wobei die modifizierte Melanomzelle: (a) mehr als ein geteiltes immundominantes Melanom-Antigen exprimiert; (b) zum Produzieren einer erhöhten Menge an Zytokin relativ zu einer unmodifizierten Melanomzelle fähig ist; und (c) allogen zum Säugerwirt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die modifizierte Melanomzelle mindestens drei geteilte immundominante Melanom-Antigene exprimiert.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die geteilten immundominanten Melanom-Antigene ausgewählt sind aus Melanozyten-spezifischen Differenzierungsantigenen und Tumor-spezifischen geteilten Antigenen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die geteilten immundominanten Melanom-Antigene ein oder mehrere Melanozyten-spezifische Differenzierungsantigene und ein oder mehrere Tumor-spezifische geteilte Antigene umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die geteilten immundominanten Melanom-Antigene ausgewählt sind aus MAGE-1, MAGE-3, MART-1/Melan-A, Tyrosinase, gp75, gp100, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, GnT-V und p15.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Melanomzelle MAGE-3, Tyrosinase, MART-1/Melan-A, gp75- und gp100-Antigene exprimiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die modifizierte Melanomzelle 526-MEL oder 624-MEL ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die modifizierte Melanomzelle vor der Verabreichung bestrahlt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die modifizierte Melanomzelle vor der Verabreichung behandelt wird, um ihre Immunogenität zu steigern.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Behandlung eine genetische Manipulation oder die Beimengung eines nicht-spezifischen Adjuvans oder eines Zytokins umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die modifizierte Melanomzelle eine rekombinante Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die rekombinante Zelle einen Nukleinsäure-Vektor, der ein Zytokin codiert, umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die modifizierte Melanomzelle mit dem Säugerwirt MHC-fehlgepaart ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zytokin GM-CSF ist.
Verwendung einer modifizierten Melanomzelle in der Herstellung eines Medikaments zur Anwendung mit einem Zytokin in der Behandlung von oder dem Schutz gegen Melanom in einem Säugerwirt, wobei die modifizierte Melanomzelle: (a) mehr als ein geteiltes immundominantes Melanom-Antigen exprimiert; (b) allogen zum Säugerwirt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine modifizierte Melanomzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
Modifizierte Melanomzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15.